Trzecia dyrektywa ustalająca wspólnotowe metody analiz do celów urzędowej kontroli pasz.

Dzienniki UE

Dz.U.UE.L.1972.123.6

Akt utracił moc

Wersja od: 3 marca 2008 r.

TRZECIA DYREKTYWA KOMISJI

z dnia 27 kwietnia 1972 r.

ustalająca wspólnotowe metody analiz do celów urzędowej kontroli pasz

(72/199/EWG)

(Dz.U.UE L z dnia 29 maja 1972 r.)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Europejską Wspólnotę Gospodarczą,

uwzględniając dyrektywę Rady z dnia 20 lipca 1970 r.⁽¹⁾ w sprawie wprowadzenia wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy do celów urzędowej kontroli pasz, w szczególności jej art. 2,

a także mając na uwadze, co następuje:

dyrektywa wymaga, aby urzędowa kontrola pasz była przeprowadzona z użyciem wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy, w celu sprawdzenia zgodności z wymaganiami wynikającymi z przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych dotyczących jakości i składu pasz;

dyrektywa Komisji nr 71/250/EWG z dnia 15 czerwca 1971 r.⁽²⁾ i dyrektywa nr 71/393/EWG z dnia 18 listopada 1971 r.⁽³⁾ ustaliły pewną liczbę wspólnotowych metod analizy. Biorąc pod uwagę postęp, jaki dokonał się w czasie później prowadzonych prac, powinien zostać przyjęty trzeci zestaw metod;

środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Pasz,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł  1 ¹

Państwa Członkowskie wymagają, aby analizy do celów urzędowej kontroli pasz w zakresie poziomu skrobi, surowych białek, surowych białek rozpuszczonych w pepsynie i kwasie solnym, wolnego i całkowitego gossypolu oraz aktywności pepsyny, były przeprowadzone z użyciem metod opisanych w załączniku I do niniejszej dyrektywy.

Artykuł  2 ²

Państwa Członkowskie wymagają, aby analizy do celów urzędowej kontroli pasz w celu oraz w celu wykrycia poziomu tylozyny i wirginiamycyny w paszach były przeprowadzane z użyciem metod opisanych w załączniku II do niniejszej dyrektywy.

Artykuł  3

Państwa Członkowskie wprowadzają w życie przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy najpóźniej do dnia 1 lipca 1973 r. i niezwłocznie powiadamiają o tym Komisję.

Artykuł  4

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 27 kwietnia 1972 r.

	W imieniu Komisji
	S.L. MANSHOLT
	Przewodniczący

______

⁽¹⁾ Dz.U. L 170 z 3.8.1970, str. 2.

⁽²⁾ Dz.U. L 155 z 12.7.1971, str. 13.

⁽³⁾ Dz.U. L 279 z 20.12.1971, str. 7.

ZAŁĄCZNIKI

ZAŁĄCZNIK  I ³

1.

OZNACZANIE SKROBI

METODA POLARYMETRYCZNA

1. Cel i zakres

Metoda ta umożliwia oznaczenie zawartości skrobi i produktów rozkładu skrobi o wysokiej masie cząsteczkowej w paszach, w celu sprawdzenia zgodności z dyrektywą Komisji 86/174/EWG i dyrektywą Rady 96/25/WE.

2. Zasada

Metoda składa się z dwóch oznaczeń. W pierwszym, podgrzana próbka jest poddawana działaniu rozcieńczonego kwasu solnego. Po sklarowaniu i przefiltrowaniu roztworu dokonuje się pomiaru jego skręcalności optycznej metodą polarymetryczną.

W drugim oznaczeniu próbka jest ekstrahowana roztworem 40 % alkoholu etylowego. Po zakwaszeniu filtratu kwasem solnym, sklarowaniu i przefiltrowaniu mierzy się skręcalność optyczną, tak samo jak w pierwszym oznaczaniu.

Różnica między dwoma pomiarami, pomnożona przez znany współczynnik, daje zawartość skrobi w próbce.

3. Odczynniki

3.1. 25 % (m/m) kwasu solnego, d: 1,126 g/ml.

3.2. 1,128 % (m/v) kwasu solnego.

Stężenie należy sprawdzić przez miareczkowanie, wykorzystując roztwór wodorotlenku sodu 0,1 mol/l w obecności 0,1 % (m/v) roztworu czerwieni metylowej w 94 % (v/v) alkoholu etylowego. 10 ml = 30,94 ml NaOH 0,1 mol/l.

3.3. Roztwór Carreza I: rozpuścić 21,9 g octanu cynku Zn(CH₃COO)₂·2H₂O i 3 g lodowatego kwasu octowego w wodzie. Uzupełnić wodą do objętości 100 ml.

3.4. Roztwór Carreza II: rozpuścić 10,6 g żelazocyjanku potasu [K₄(Fe(CN)₆]·3H₂0 w wodzie. Uzupełnić wodą do objętości 100 ml.

3.5. 40 % (v/v) etanolu, d: 0,948 g/ml w temperaturze 20 °C.

4. Aparatura

4.1. Kolba Erlenmeyera ze standardowym szklanym szlifowanym złączem i chłodnicą zwrotną o pojemności 250 ml.

4.2. Polarymetr lub sacharymetr.

5. Procedura

5.1. Przygotowanie próbki

Rozdrobnić próbkę, aż wszystkie cząstki będą mogły przejść przez sito o średnicy otworów 0,5 mm.

5.2. Określenie całkowitej skręcalności optycznej (P lub S) (patrz ppkt 7.1)

Odważyć 2,5 g rozdrobnionej próbki z dokładnością do 1 mg i umieścić ją w szklanej kolbie pomiarowej o pojemności 100 ml. Dodać 25 ml kwasu solnego (3.2), wymieszać i dodać następne 25 ml kwasu solnego (3.2). Umieścić kolbę w gorącej łaźni wodnej, wstrząsając nią mocno i równomiernie przez trzy minuty, celem zapobieżenia wytworzeniu się skupień. Ilość wody musi być wystarczająca, tak aby pozostała ona w stanie wrzenia, kiedy kolba zostanie do niej włożona. Podczas mieszania kolba musi pozostać w wodzie. Dokładnie po 15 minutach wyciągnąć z łaźni, dodać 30 ml zimnej wody i niezwłocznie schłodzić do 20 °C.

Dodać 5 ml roztworu Carreza I (3.3) i wstrząsać przez minutę. Następnie dodać 5 ml roztworu Carreza II (3.4) i znowu wstrząsać przez minutę. Dopełnić do objętości wodą, wymieszać i przefiltrować. Jeśli filtrat nie jest idealnie klarowny (co zdarza się rzadko), powtórzyć oznaczanie używając większej ilości roztworów Carreza I i II, (na przykład po 10 ml każdego).

Za pomocą polarymetru lub sacharymetru zmierzyć skręcalność optyczną roztworu w rurce polarymetrycznej o długości 200 mm.

5.3. Oznaczenie skręcalności optycznej (P' lub S') substancji rozpuszczalnych w 40 % roztworze alkoholu etylowego

Odważyć 5 g próbki z dokładnością do 1 mg, umieścić w szklanej kolbie pomiarowej o pojemności 100 ml i dodać 80 ml alkoholu etylowego (3.5) (patrz uwaga 7.2). Pozostawić kolbę na godzinę w temperaturze pokojowej; w tym czasie wstrząsać mocno sześć razy, tak aby badana próbka była dobrze wymieszana z alkoholem etylowym. Dopełnić etanolem (3.5), wymieszać i przefiltrować. Odpipetować 50 ml filtratu (= 2,5 g próbki) i umieścić w kolbie Erlenmeyera o objętości 250 ml, dodać 2,1 ml kwasu solnego (3.1) i mocno potrząsnąć. Przymocować chłodnicę zwrotną do kolby Erlenmeyera i włożyć ją do wrzącej łaźni wodnej. Dokładnie po 15 min. wyciągnąć kolbę Erlenmayera z łaźni, przełożyć zawartość do szklanej kolby pomiarowej o pojemności 100 ml skrapiając ją lekko zimną wodą i ostudzić do temp. 20°C. Klarować, używając roztworów Carreza I (3.3) i II (3.4), dopełnić wodą, wymieszać, przefiltrować i zmierzyć skręcalność optyczną, stosownie do wskazań w akapicie drugim i trzecim ppkt 5.2.

6. Obliczanie wyników

Zawartość skrobi ( %) oblicza się w następujący sposób:

6.1. Pomiar przeprowadzone polarymetrem

zawartość skrobi

P = całkowita skręcalność optyczna w stopniach kątowych

P' = skręcalność optyczna w stopniach kątowych substancji rozpuszczalnych w 40 % (v/v) alkoholu etylowego

= szczególna skręcalność optyczna czystej skrobi. Wartości numeryczne przyjmowane zwyczajowo za

współczynniki są następujące:

+ 185,9°: skrobia ryżowa

+ 185,4°: skrobia ziemniaczana

+ 184,6°: skrobia kukurydziana

+ 182,7°: skrobia pszeniczna

+ 181,5°: skrobia jęczmienna

+ 181,3°: skrobia owsiana

+ 184,0°: inne rodzaje skrobi i mieszanek skrobi w mieszankach paszowych

6.2. Pomiary przeprowadzone sacharymetrem

Zawartość skrobi

S = całkowita skręcalność optyczna w stopniach sacharymetrycznych

S' = skręcalność optyczna w stopniach sacharymetrycznych substancji rozpuszczalnych w 40 % (v/v) alkoholu etylowym

N = masa (w g) sacharozy w 100 ml wody wytrzymująca skręcalność optyczną 100 stopni sacharymetrycznych podczas pomiaru rurką o grubości 200 mm

16,29 g dla sacharymetrów francuskich

26,00 g dla sacharymetrów niemieckich

20,00 g dla sacharymetrów mieszanych.

= szczególna skręcalność optyczna czystej skrobi (patrz ppkt 6.1)

6.3 Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce nie może przekraczać 0,4 wartości bezwzględnej dla zawartości skrobi niższej niż 40 % i 1,1 % odpowiednio dla zawartości skrobi równej lub wyższej niż 40 %.

7. Uwagi

7.1. Jeśli próbka zawiera więcej niż 6 % węglanów, wyrażonych jako węglan wapnia, to muszą one zostać związane poprzez dodanie odpowiedniej ilości rozcieńczonego kwasu siarkowego, jeszcze przed przystąpieniem do oznaczania całkowitej skręcalności optycznej.

7.2. W przypadku produktów o dużej zawartości laktozy, takich jak na przykład sproszkowane mleko lub odtłuszczone mleko w proszku, należy postępować w niżej opisany sposób: po dodaniu 80 ml etanolu (3.5), nałożyć chłodnicę zwrotną na kolbę i zanurzyć ją na 30 minut w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C. Pozostawić do wystygnięcia. Dalej postępować jako opisano w ppkt 5.3.

7.3. W przypadku gdy następujące materiały paszowe występują w dużych ilościach w paszach mogą one powodować zakłócenia w czasie oznaczania zawartości skrobi metodą polarymetryczną i w związku z tym uzyskane wyniki mogą być niewłaściwe:

– (cukier) produkty z buraków, takie jak (cukier) wysłodki buraczane, (cukier) melasa, (cukier) wysłodki buraczane melasowane, (cukier) wywar melasowy, (burak) cukier,

– wysłodki owoców cytrusowych,

– siemię lniane; siemię ekspeler, siemię ekspeler ekstrahowane,

– ziarna rzepaku; prasa rzepakowa, poekstrakcyjna prasa rzepakowa; łuski rzepaku,

– ziarna słonecznika; ekstrahowane ziarno słonecznika; ziarno słonecznika częściowo obłuszczone, ekstrahowane,

– kopra ekspeler; kopra ekstrahowana,

– pulpa ziemniaczana,

– drożdże suszone,

– produkty bogate w inulinę (np. chrupki i mączka z bulwy (topinamburu);

– skwarki.

2.

OZNACZANIE SUROWEGO BIAŁKA

1. Cel i zakres

Metoda ta umożliwia oznaczanie zawartości surowego białka w paszach na podstawie zawartości azotu oznaczanego zgodnie z metodą Kjeldahla.

2. Zasada

Próbka jest roztwarzana kwasem siarkowym w obecności katalizatora. Roztwór kwasu staje się roztworem alkalicznym pod wpływem wodorotlenku sodu. Amoniak jest destylowany i zbierany odmierzoną ilością kwasu siarkowego, którego nadmiar jest miareczkowany za pomocą roztworu mianowanego wodorotlenku sodu.

3. Odczynniki

3.1. Siarczan potasu.

3.2. Katalizator: tlenek miedzi (II) CuO lub pentahydrat siarczanu miedzi(II) CuSO₄ · 5H₂O.

3.3. Cynk granulowany.

3.4. Kwas siarkowy, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Kwas siarkowy c(½H₂SO₄) = 0,5 mol/l.

3.6. Kwas siarkowy c(½H₂SO₄) = 0,1 mol/l.

3.7. Wskaźnik czerwieni metylowej; rozpuścić 300 mg czerwieni metylowej w 100 ml etanolu, δ = 95-96 % (v/v).

3.8. Roztwór wodorotlenku sodu (można zastosować czysty chemicznie) β = 40 g/100 ml (m/v 40 %).

3.9. Roztwór wodorotlenku sodu c = 0,25 mol/l.

3.10. Roztwór wodorotlenku sodu c = 0,1 mol/l.

3.11 Pumeks granulowany, płukany w kwasie chlorowodorowym (= kwasie solnym) i ogrzewany.

3.12. Acetanilid (m.p. = 114 °C, N = 10,36 %).

3.13. Sacharoza (pozbawiona azotu).

4. Aparatura

Aparatura odpowiednia do przeprowadzania roztwarzania, destylacji i miareczkowania zgodnie z procedurą Kjeldahla.

5. Procedura

5.1. Roztwarzanie

Odważyć 1 g próbki z dokładnością do 0,001 g i przenieść do kolby aparatury roztwarzającej. Dodać 15 g siarczanu potasu (ppkt 3.1), odpowiednią ilość katalizatora (ppkt 3.2) (0,3-0,4 g tlenku miedzi (II) lub 0,9-1,2 g pentahydratu siarczanu miedzi (II)), 25 ml kwasu siarkowego (ppkt 3.4) i kilka granulek pumeksu (ppkt 3.11), wymieszać. Najpierw powoli podgrzewać kolbę, jeśli to konieczne, mieszając od czasu do czasu, dopóki masa nie ulegnie karbonizacji i zniknie piana, wtedy należy podgrzać intensywniej, aż ciecz zacznie równomiernie wrzeć. Podgrzewanie jest odpowiednie, jeśli kwas w temperaturze wrzenia skrapla się na ściankach kolby. Należy zapobiec przegrzaniu bocznych ścianek i przyklejaniu się do nich cząstek organicznych. Gdy roztwór staje się klarowny, o barwie lekko zielonej, kontynuować proces wrzenia przez kolejne 2 godziny, następnie pozostawić do schłodzenia.

5.2. Destylacja

Ostrożnie dodać wystarczającą ilość wody w celu zapewnienia całkowitego rozpuszczanie się siarczanów. Pozostawić do schłodzenia, a następnie dodać kilka granulek cynku (ppkt 3.3).

Umieścić w zbiorczej kolbie aparatu destylacyjnego dokładnie odmierzoną ilość 25 ml kwasu siarkowego (ppkt 3.5) lub (ppkt 3.6), w zależności od przypuszczalnej zawartości azotu. Dodać kilka kropli wskaźnika czerwieni metylowej (ppkt 3.7).

Połączyć kolbę przeznaczoną do roztwarzania ze skraplaczem aparatu destylacyjnego, zanurzyć koniec skraplacza w cieczy znajdującej się w kolbie zbiorczej na głębokość co najmniej 1 cm (patrz: uwaga 8.3). W celu uniknięcia strat powoli wlewać 100 ml roztworu wodorotlenku sodu (ppkt 3.8) do kolby przeznaczonej do roztwarzania (patrz: uwaga 8.1).

Podgrzewać kolbę do momentu przedestylowania amoniaku.

5.3. Miareczkowanie

Miareczkować nadwyżkę kwasu siarkowego w kolbie zbiorczej, stosując roztwór wodorotlenku sodu (ppkt 3.9) lub (ppkt 3.10), w zależności od stężenia stosowanego kwasu siarkowego, aż do osiągnięcia punktu końcowego.

5.4. Próba ślepa

W celu potwierdzenia, że odczynniki są wolne od azotu, przeprowadzić próbę ślepą (roztwarzanie, destylacja i miareczkowanie), stosując 1 g sacharozy (ppkt 3.13) zamiast próbki.

6. Obliczanie wyników

Zawartość surowego białka oblicza się według następującego wzoru:

(V₀ - V₁) × c × 0,014 × 100 × 6,25

-------------------------------------

m

gdzie:

V0 = objętość (ml) NaOH (ppkt 3.9 lub 3.10) wykorzystywana w próbie ślepej

V1 = objętość (ml) NaOH (ppkt 3.9 lub 3.10) wykorzystywana w próbie ślepej

C = stężenie (mol/l) wodorotlenku sodu (ppkt 3.9 lub 3.10)

M = masa g) próbki.

7. Sprawdzanie metody

7.1. Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równolegle przeprowadzonych oznaczeń na tej samej próbce nie może przekroczyć:

0,2 % wartości bezwzględnej, dla zawartości surowego białka mniejszej niż 20 %;

1,0 % odpowiednio do wyższej wartości w odniesieniu do zawartości białka surowego 20-40 %;

0,4 % wartości bezwzględnej, dla zawartości surowego białka większej niż 40 %.

7.2. Dokładność

Przeprowadzić analizę (roztwarzanie, destylacja i miareczkowanie), stosując 1,5-2,0 g acetanilidu (ppkt 3.12) w obecności 1 g sacharozy (ppkt 3.13); 1 g acetanilidu pochłania 14,80 ml kwasu siarkowego (ppkt 3.5). Odzyskanie musi wynosić przynajmniej 99 %.

8. Uwagi

8.1. Aparatura może być typu: obsługiwana ręcznie, półautomatyczna lub automatyczna. Jeżeli między etapem roztwarzania i destylacji aparatura wymaga przenoszenia substancji, należy dokonać tego przeniesienia bez żadnych strat. Jeżeli kolba aparatu destylacyjnego nie jest wyposażona we wkraplacz, dodać wodorotlenek sodu bezpośrednio przed podłączeniem kolby do skraplacza, wlewając ciecz powoli po bocznej ściance.

8.2. Jeżeli roztwarzanie powoduje krzepnięcie, ponownie rozpocząć oznaczanie, wykorzystując większą ilość kwasu siarkowego (ppkt 3.4) niż określono powyżej.

8.3. W odniesieniu do produktów o niskiej zawartości azotu objętość kwasu siarkowego (ppkt 3.6), która ma zostać umieszczona w kolbie zbiorczej, może zostać w miarę potrzeb zmniejszona do 10 lub 15 ml i uzupełniona wodą do objętości 25 ml.

3.

OZNACZENIE SUROWYCH BIAŁEK ROZPUSZCZONYCH W PEPSYNIE I KWASIE SOLNYM

1. Cel i zakres

Metoda pozwala na oznaczenie frakcji surowych białek rozpuszczonych w pepsynie i kwasie solnym w określonych warunkach. Można ją stosować do badania wszystkich rodzajów pasz.

2. Zasada

Próbkę ogrzewać przez 48 godzin w temperaturze 40 °C w roztworze chlorowodorku pepsyny. Zawiesinę filtruje się, a następnie oznacza zawartość azotu w filtracie, zgodnie z metodą opisaną dla oznaczenia tego pierwiastka w surowych białkach.

3. Odczynniki

3.1. Kwas solny, d: 1,125

3.2. 0,075 N kwas solny

3.3. 2.0 U/mg pepsyny. Aktywność enzymatyczna pepsyny jest oznaczana według metody zawartej w części czwartej tego załącznika i musi być wykonana zgodnie z zamieszczonym tam metodą.

3.4. Około 0,2 % (w/obj) świeżo przygotowanego roztworu pepsyny w kwasie solnym (3:2); aktywność 400 U/l

3.5. Emulsja zapobiegająca spienianiu (np. krzemionka)

3.6. Wszystkie odczynniki wymienione w pkt 3 metody pozwalającej na oznaczenie surowych białek

4. Aparatura

4.1. Łaźnia wodna lub inkubator nastawiona na temperaturę 40 ± 1 °C

4.2. Aparat Kjeldahla

5. Metoda

5.1. Przygotowanie roztworu (patrz uwaga 7.2)

Odważyć 2 g próbki z dokładnością do miligrama i umieścić ją w kolbie z podziałką o pojemności 500 ml. Dodać 450 ml roztworu chlorowodorku pepsyny (ppkt 3.4), ogrzanego wcześniej do temperatury 40 °C. Wytrząsnąć, co zapobiegnie tworzeniu się skupień. Sprawdzić, czy odczyn zawiesiny jest niższy niż 1,7. Umieścić kolbę w łaźni wodnej lub inkubatorze (ppkt 4.1) i pozostawić na 48 godzin, wstrząsając po 8, 24 i 32 godzinach. Po 48 godzinach dodać 15 ml kwasu solnego (ppkt 3.1), schłodzić do temperatury 20 °C, dopełnić wodą do 500 ml i filtrować.

5.2. Rozkład

250 ml filtratu umieścić w kolbie aparatu do destylacji (ppkt 4.2). Dodać odczynniki niezbędne do przeprowadzenia reakcji wymienione w zdaniu drugim ppkt 5.1 metody oznaczania surowych białek. Wymieszać i doprowadzić do wrzenia. Jeśli pojawi się piana, dodać kilka kropli emulsji zapobiegającej spienianiu (ppkt 3.5). Gotować do momentu, aż prawie cała woda wyparuje. Obniżyć temperaturę i dokładnie usunąć resztki wody.

Kiedy roztwór stanie się przezroczysty i bezbarwny (lub jasnozielony, w przypadku użycia katalizatora miedziowego), kontynuować gotowanie przez następną godzinę. Pozostawić do wystygnięcia.

5.3. Destylacja i miareczkowanie

Postępować według opisu z ppkt 5.2 i 5.3 metody oznaczania surowych białek.

5.4. Próba ślepa

Przeprowadzić próbę ślepą, stosując tę sama procedurę, jak opisano powyżej, bez dodawania próbki.

6. Obliczenie wyników

Odjąć objętość kwasu solnego użytego w próbie ślepej od objętości zużytej przy badaniu próbki. 1 ml 0,1 N kwasu solnego odpowiada 1,4 mg azotu.

Pomnożyć ilość uzyskaną dla azotu przez współczynnik 6,25. Wyniki przedstawić jako zawartość procentową próbki.

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń prowadzonych dla tej samej próbki, nie może przekraczać:

- 0,4 w wartości bezwzględnej dla zawartości niższej niż 20 %;

- 2,0 % w wartości względnej dla zawartości nie niższej niż 20 % i nie wyższej niż 40 %;

- 0,8 w wartości bezwzględnej, dla zawartości wyższej niż 40 %

7. Uwagi

7.1. Wartości uzyskane przy zastosowaniu niniejszej metody nie mają bezpośredniego odniesienia do procesów rozkładu in vivo.

7.2. Produkty o zawartości oleju lub tłuszczu przekraczającej 10 % muszą najpierw zostać poddane odtłuszczeniu przez ekstrakcję frakcją ropy naftowej (temp. wrzenia 40-60 °C)

4.

OZNACZENIE AKTYWNOŚCI ENZYMATYCZNEJ PEPSYNY

1. Cel i zakres

Metoda ta pozwala na ustalenie enzymatycznej aktywności pepsyny wykorzystywanej w oznaczaniu surowych białek rozpuszczonych w pepsynie i kwasie solnym.

2. Zasada

Hemoglobina poddawana jest działaniu pepsyny w środowisku kwasu solnego w ściśle określonych warunkach. Frakcja niehydrolizujących białek jest wytrącana kwasem trichlorooctowym. Do filtratu dodawany jest wodorotlenek sodu i odczynnik Folina-Ciocalteu. Gęstość optyczną tego roztworu mierzy się przy długości fali 750 nm. Odpowiadającą mu ilość tyrozyny odczytuje się z krzywej wzorcowej.

Definicja: Jednostka pepsyny jest to taka ilość enzymu, która w warunkach wymaganych przez metodę powoduje uwolnienie w ciągu minuty takiej ilości grup hydroksyarylowych, które wybarwione odczynnikiem Folina-Ciocalteu mają wartość absorpcji odpowiadającą gęstości optycznej 1 μmola tyrozyny poddanej takiej samej reakcji barwnej.

3. Odczynniki

3.1. 0,2N kwas solny,

3.2. 0,06N kwas solny,

3.3. 0,025N kwas solny,

3.4. 5-procentowy (w/obj) roztwór kwasu trichlorooctowego,

3.5. 0,5N roztwór wodorotlenku sodu,

3.6. Odczynnik Folina-Ciocalteu: umieścić 100 g tetraoksowolframinianu sodu (Na₂WO₄ · 2H₂O), 25 g molibdenianu sodu (Na₂MOO₂ · 2H₂O) i 700 ml wody w kolbie okrągłodennej o pojemności dwóch litrów z dopasowanym złączem szlifowym. Dodać 50 ml kwasu fosforowego (d: 1,71) i 100 ml stężonego kwasu solnego (d: 1,19). Do kolby podłączyć chłodnicę zwrotną. Doprowadzić roztwór do wrzenia. Gotować na małym ogniu przez 10 godzin. Pozostawić do wystygnięcia. Odłączyć chłodnicę, dodać 175 g siarczanu litu (Li₂SO₄ · 2H₂O), 50 ml wody i 1 ml bromu. Gotować przez 15 minut w celu pozbycia się nadmiaru bromu. Pozostawić do wystygnięcia. Przenieść roztwór do kolby pomiarowej o pojemności 1litra. Dopełnić wodą, wymieszać i filtrować. Roztwór nie może mieć zielonego zabarwienia. Przed użyciem rozcieńczyć 1 objętość odczynnika z 2 objętościami wody.

3.7. Roztwór hemoglobiny: odważyć ilość hemoglobiny (średnio 2 g substratu białkowego oznaczonego zgodnie z metodą Ansona), odpowiadającą 354 mg azotu ⁽¹⁾ i umieścić w kolbie o pojemności 200 ml z dopasowanym złączem szlifowym. Dodać kilka kropli kwasu solnego (ppkt 3.2). Podłączyć kolbę do pompki próżniowej i wytrząsać, dopóki hemoglobina nie rozpuści się całkowicie. Odłączyć pompkę i nadal wytrząsając roztwór, dopełnić go kwasem solnym (ppkt 3.2) do objętości 100 ml. Przygotowywać bezpośrednio przed użyciem.

3.8. Wzorcowy roztwór tyrozyny: rozpuścić 181,2 mg tyrozyny w kwasie solnym (ppkt 3.1). Dopełnić tym samym kwasem do objętości 1 litra (roztwór podstawowy). Pobrać 20,0 ml i rozcieńczyć do 100 ml kwasem solnym (ppkt 3.1). 1 ml tego roztworu zawiera 0,2 μmola tyrozyny.

4. Aparatura

4.1. Łaźnia wodna nastawiona na temperaturę 25 ± 1 °C, wyposażona w ultratermostat.

4.2. Spektrofotometr

4.3. Chronometr, dokładność: 1 sekunda

4.4. Pehametr

5. Metoda

5.1. Przygotowanie roztworu (patrz: uwaga 7.1)

Rozpuścić 150 mg pepsyny w 100 ml kwasu solnego (ppkt 3.2). Odpipetować 2 ml roztworu do kolby pomiarowej o pojemności 50 ml i dopełnić do kreski kwasem solnym (ppkt 3.3). Sprawdzić odczyn pehametrem. Powinien wynosić 1,6 ± 0,1. Zanurzyć kolbę w łaźni wodnej.

5.2. Hydroliza

Do probówki odpipetować 0,5 ml roztworu hemoglobiny (ppkt 3.7). Podgrzać do 25 °C w łaźni wodnej (ppkt 4.1). Dodać 1,0 ml roztworu pepsyny przygotowanego według przepisu w ppkt 5.1 i wymieszać szklaną bagietką, rozszerzoną na jednym końcu (około 10 ruchów do przodu i do tyłu). Pozostawić probówkę w łaźni wodnej, w temperaturze 25 stopni dokładnie na 10 minut, licząc od momentu dodania roztworu pepsyny (dokładnie kontrolować czas i temperaturę). Następnie dodać 10,0 ml roztworu kwasu trichlorooctowego (ppkt 3.4), ogrzanego uprzednio do temperatury 25 °C. Wymieszać i filtrować przez suchy filtr.

5.3. Reakcja barwna i pomiar gęstości optycznej

Do kolby stożkowej o pojemności 50 ml odpipetować 5,0 ml filtratu. Dodać 10,0 ml roztworu wodorotlenku sodu (ppkt 3.5) i wytrząsać. Nie przerywając wytrząsania dodać 3,0 ml rozcieńczonego odczynnika Folin-Ciocalteu (ppkt 3.6). Po 5-10 minutach mierzyć gęstość optyczna roztworu za pomocą spektrofotometru, przy długości fali 750 nm w kuwecie 1 cm, wobec wody.

5.4. Próba ślepa

Dla każdego oznaczenia przeprowadzić następującą próbę ślepą:

Do probówki odpipetować 0,5 ml roztworu hemoglobiny (ppkt 3.7). Ogrzewać w łaźni wodnej (ppkt 4.1) w temperaturze 25 °C. Dodać 10,0 ml roztworu kwasu trichlorooctowego (ppkt 3.4) podgrzanego uprzednio do tej samej temperatury. Wymieszać, a następnie dodać 1,0 ml roztworu pepsyny przygotowanego według przepisu w ppkt 5.1. Wymieszać szklaną bagietką. Pozostawić probówkę w łaźni wodnej (ppkt 4.1) na dokładnie 10 minut, w temperaturze 25 °C. Wymieszać i filtrować przez suchy filtr. Dalej postępować według przepisu z ppkt 5.3

5.5. Krzywa wzorcowa

Odmierzyć do kolb stożkowych o pojemności 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml i 5,0 ml wzorcowego roztworu tyrozyny (ppkt 3.8), co odpowiada 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 i 1,0 μmola tyrozyny. Uzupełnić serię o roztwór porównawczy wolny od tyrozyny. Dopełnić kolby kwasem solnym (ppkt 3.1) do objętości 0,5 ml. Dodać 10,0 ml roztworu wodorotlenku sodu (ppkt 3.5), a następnie, cały czas wytrząsając - 3,0 ml rozcieńczonego roztworu odczynnika Folina-Ciocalteu (ppkt 3.6). Mierzyć gęstość optyczną, jak podano w ostatnim zdaniu ppkt 5.3. Wyznaczyć krzywą wzorcową, nanosząc na osie układu współrzędnych kolejne poziomy tyrozyny i odpowiadające im wartości gęstości optycznej.

6. Obliczenie wyników

Odczytać na krzywej wzorcowej ilość tyrozyny, w mikromolach, odpowiadającą gęstości optycznej roztworu barwnika, korygowanego ślepą próbą.

Aktywność pepsyny, w mikromolach tyrozyny, w mg i na minutę, w 25° C, podaje się następującym równaniem

0,32 a

jednostki na miligram (U/mg) = -------

p

w którym:

a = ilość tyrozyny, w μmolach, odczytana na krzywej wzorcowej;

p = waga w mg ilości pepsyny dodanej w ppkt 5.2.

7. Uwagi

7.1. Ilość rozpuszczonej pepsyny musi być tak dobrana, aby podczas ostatecznego pomiaru fotometrycznego otrzymać gęstość optyczną wynoszącą 0,35 ± 0,035

7.2. Dwie jednostki na miligram uzyskane za pomocą tej metody odpowiadają

3,64 jednostki Ansona na miligram (μmol tyrozyny/mg/min przy temperaturze 35,5°C) lub

36.400 jednostkom handlowym (przemysłowym) na gram (μmol tyrozyny/g/10 min w temperaturze 35,5°C)

5.

OZNACZANIE WOLNEGO I CAŁKOWITEGO GOSSYPOLU

1. Cel i zakres

Metoda ta umożliwia oznaczenie poziomu wolnego gossypolu, całkowitego gossypolu i pokrewnych mu chemiczne substancji w nasionach bawełny, mące z nasion bawełny i wytłokach oraz w paszach mieszanych zawierających te substancje (gossypol wolny i całkowity) w ilości wyższej niż 20 ppm.

2. Zasada

Gossypol jest ekstrahowany w obecności 3-aminopropano-1-olu lub mieszaniny 2-propanolu i heksanu - w przypadku oznaczania jego wolnego związku - lub też w obecności dimetyloformamidu, gdy oznaczany jest poziom całkowitego gossypolu. Gossypol reaguje z aniliną tworząc gossypolo-dianilinę, której gęstość optyczna mierzona jest przy długości fali 440 nm.

3. Odczynniki

3.1. Mieszanina 2-propanolu i heksanu: zmieszać 60 części 2-propanolu (cz.d.a.) z 40 częściami n-heksanu

3.2. Rozpuszczalnik A: do kolby pomiarowej o pojemności jednego litra wlać 500 ml mieszaniny 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1). Dodać 2 ml 3-aminopropan-1-olu, 8 ml kwasu octowego lodowatego i 50 ml wody. Dopełnić do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1). Odczynnik zachowuje stabilność przez tydzień.

3.3. Rozpuszczalnik B: odpipetować 2 ml 3-aminopropano-1-olu i 10 ml kwasu octowego lodowatego do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml. Ochłodzić do temperatury pokojowej i dopełnić do kreski n,n-dimetyloformamidem. Odczynnik zachowuje stabilność przez tydzień.

3.4. Anilina cz.d.a.: jeśli gęstość optyczna ślepej próby przekracza 0,022, poddać anilinę destylacji nad proszkiem cynkowym, odrzucając pierwsze i ostatnie 10 % frakcji destylatu. Przechowywać w lodówce, w butelce z brązowego szkła ze szczelnym szklanym korkiem. Odczynnik nadaje się do użytku przez kilka miesięcy.

3.5. Wzorcowy roztwór gossypolu A: w kolbie pomiarowej o pojemności 250 ml umieścić 27,9 mg octanu gossypolu. Rozpuścić i dopełnić do kreski rozpuszczalnikiem A (ppkt 3.2). Odpipetować 50 ml roztworu do kolby pomiarowej o pojemności 250 ml i ponownie dopełnić do kreski rozpuszczalnikiem A (ppkt 3.2). Stężenie gossypolu w tym roztworze wynosi 0,02 mg/ml. Przed użyciem pozostawić na godzinę w temperaturze pokojowej.

3.6. Wzorcowy roztwór gossypolu B: w kolbie pomiarowej o objętości 50 ml umieścić 27,9 g octanu gossypolu. Rozpuścić i dopełnić do kreski rozpuszczalnikiem B (ppkt 3.3). Stężenie gossypolu w tym roztworze wynosi 0,5 mg/ml.

Wzorcowe roztwory gossypolu A i B zachowują stabilność przez 24 godziny, jeśli są chronione przed światłem.

4. Aparatura

4.1. Mikser (bęben obrotowy):około 35 obrotów/min

4.2. Spektrofotometr

5. Metoda

5.1. Próbka badana

Wielkość użytej w oznaczeniu próbki uzależniona jest od zakładanej zawartości gossypolu. Zalecana jest praca z możliwie niewielką próbką i relatywnie dużą objętościowo ilością filtratu. Pozwala to na otrzymanie wystarczającej ilości gossypolu do precyzyjnego oznaczenia fotometrycznego. W przypadku oznaczania wolnego gossypolu w nasionach bawełny, mące z nasion lub wytłokach, masa próbki nie powinna przekraczać 1 g. W przypadku mieszanek paszowych może wynosić ona 5 g. W większości przypadków wystarczy użyć 10 ml otrzymanego filtratu. Powinien on zawierać od 50 μg do 100 μg gossypolu. Przy oznaczaniu całkowitego gossypolu masa próbki powinna wynosić od 0,5 g do 5,0 g. 2 ml pobrane z uzyskanego filtratu będą zawierać od 40 μg do 200 μg gossypolu.

Analizę należy prowadzić w temperaturze pokojowej (około 20 °C).

5.2. Oznaczanie wolnego gossypolu

W kolbie o pojemności 250 ml ze szlifowaną szyjką umieścić badaną próbkę. Dno kolby powinno być wysypane pokruszonym szkłem. Za pomocą pipety dodać 50 ml rozpuszczalnika A (ppkt 3.2), zamknąć kolbę i mieszać przez godzinę w mikserze. Filtrować przez suchy filtr i zebrać filtrat w małej kolbie ze szlifowaną szyjką. W czasie filtrowania przykryć lejek szkiełkiem zegarkowym. Do dwóch kolb pomiarowych o pojemności 25 ml każda (A i B), odpipetować identyczną objętość filtratu zawierającą od 50 μg do 100 μg gossypolu. Jeśli to konieczne dopełnić do objętości 10 ml rozpuszczalnikiem A (ppkt 3.2). Następnie dopełnić zawartość kolby A do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1). Ta mieszanina będzie roztworem porównawczym względem którego będą dokonywane pomiary.

Do kolejnych dwóch kolb pomiarowych (C i D) o pojemności 25 ml każda, odpipetować 10 ml rozpuszczalnika A (ppkt 3.2). Roztwór w kolbie C dopełnić do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1). Ten roztwór zostanie wykorzystany jako roztwór porównawczy względem której zostanie dokonany pomiar próby ślepej.

Do kolb D i B dodać po 2 ml aniliny (ppkt 3.4). Ogrzewać przez 30 minut we wrzącej łaźni wodnej, aby pojawiło się zabarwienie. Kolby schłodzić do temperatury pokojowej, dopełnić do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1), wymieszać i pozostawić na godzinę.

Oznaczyć gęstość optyczną próby ślepej D, prowadząc pomiar względem roztworu odniesienia C oraz gęstość optyczną roztworu B, dokonując pomiaru względem roztworu odniesienia A. Długość fali 440 nm w kuwecie szklanej 1cm.

Odjąć wynik gęstości optycznej uzyskany z próby D od wyniku gęstości optycznej uzyskanego z próby B (= skorygowana gęstość optyczna). Korzystając z tej wartości, wyliczyć zawartość wolnego gossypolu, jak wskazano w pkt 6.

5.3. Oznaczenie całkowitego gossypolu

W kolbie pomiarowej o pojemności 50 ml umieścić próbkę zawierającą od 1 mg do 5 mg gossypolu. Dodać 10 ml rozpuszczalnika B (ppkt 3.3). W tym samym czasie przygotować próbę ślepą, umieszczając 10 ml rozpuszczalnika B (ppkt 3.3) w drugiej kolbie pomiarowej o pojemności 50 ml. Podgrzewać obydwie kolby przez 30 minut we wrzącej łaźni wodnej. Schłodzić do temperatury pokojowej i dopełnić zawartość każdej z kolb do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1). Wymieszać i pozostawić na 10-15 minut. Następnie filtrować i zebrać filtrat do dwóch kolb ze szlifowanymi szyjkami.

Do dwóch kolb pomiarowych o pojemności 25 ml odpipetować po 2 ml filtratu uzyskanego z próbki. Do dwóch innych kolb pomiarowych o pojemności 25 ml odpipetować po 2 ml filtratu z próby ślepej. Zawartość jednej kolby z każdej pary dopełnić do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1) - ich zawartość będzie roztworem porównawczym.

Do pozostałych dwóch kolb dodać po 2 ml aniliny (ppkt 3.4). Podgrzać przez 30 minut we wrzącej łaźni wodnej, do pojawienia się zabarwienia. Ochłodzić do temperatury pokojowej, dopełnić do 25 ml mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1), wymieszać i odstawić na godzinę.

Oznaczyć gęstość optyczną tak, jak opisano dla wolnego gossypolu w ppkt 5.2. Korzystając z otrzymanych wartości obliczyć całkowitą zawartość gossypolu, jak wskazano w pkt 6.

6. Obliczenie wyników

Obliczenia wyników można dokonać albo za pomocą gęstości optycznej (ppkt 6.1), albo odnosząc się do krzywej wzorcowej (ppkt 6.2).

6.1. Obliczanie za pomocą szczególnej gęstości optycznej

W warunkach opisanych szczególne gęstości optyczne są następujące:

1 %

Wolny gossypol: E ------ = 625

1 cm

1 %

Całkowity gossypol: E ------ = 600

1 cm

Zawartość gossypolu wolnego lub całkowitego w próbce wyraża się następującym równaniem:

E · 1.250

gossypol % = ---------------

1 %

E · p · a

1 cm

W którym:

E = gęstość optyczna skorygowana, określona jak w ppkt 5.2,

P = pobieranie próbki w g,

a = podzielnik filtratu w ml.

6.2. Za pomocą krzywej wzorcowej

6.2.1. Wolny gossypol

Przygotować 2 serie w 5 kolbach pomiarowych o pojemności 25 ml. W każdej serii wprowadzić pipetą do kolb pomiarowych odpowiednio wielkości 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 i 10,0 ml roztworu wzorcowego A gossypolu (ppkt 3.5). Dopełnić objętości do 10 ml za pomocą rozpuszczalnika A (ppkt 3.2). Dopełnić każdą serię próbką w kolbie pomiarowej o pojemności 25 ml zawierającą jedynie 10 ml rozpuszczalnika A (ppkt 3.2).

Dopełnić do 25 ml objętość kolb pomiarowych pierwszej serii (włącznie z próbką) mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1) (seria odniesienia).

Dodać 2 ml aniliny (ppkt 3.4) w każdej kolbie drugiej serii (włącznie z próbką). Podgrzewać przez 30 minut we wrzącej łaźni wodnej, aby pojawiło się zabarwienie. Schłodzić do temperatury pokojowej i dopełnić do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1), wymieszać i pozostawić na 1 godzinę (seria wzorca).

Oznaczyć w warunkach określonych w ppkt 5.2 gęstość optyczną roztworów serii wzorca przez porównanie z odpowiadającymi roztworami serii odniesienia. Na papierze milimetrowym wyznaczyć krzywą wzorcową nanosząc gęstości optyczne względem ilości gossypolu (w μg).

6.2.2. Całkowity gossypol

Przygotować 6 kolb pomiarowych o pojemności 50 ml. W pierwszej kolbie umieścić 10 ml rozpuszczalnika B (ppkt 3.3), a w pozostałych odpowiednio 2,0 - 4,0 - 6,0 -8,0 i 10,0 ml roztworu wzorcowego B gossypolu (ppkt 3.6). Dopełnić zawartość każdej kolby do 10 ml rozpuszczalnikiem B (ppkt 3.3). Podgrzewać przez 30 minut we wrzącej łaźni wodnej. Schłodzić do temperatury pokojowej i dopełnić do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1) i wymieszać.

Umieścić 2,0 ml tych roztworów odpowiednio w dwóch seriach 6 kolb pomiarowych o pojemności 25 ml. Dopełnić do 25 ml zawartość kolb pomiarowych pierwszej serii mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1) (seria odniesienia).

Dodać 2 ml aniliny (ppkt 3.4) w każdej kolbie drugiej serii. Podgrzewać przez 30 minut we wrzącej łaźni wodnej. Schłodzić do temperatury pokojowej i dopełnić do kreski mieszaniną 2-propanolu i heksanu (ppkt 3.1), wymieszać i pozostawić na 1 godzinę (seria wzorca).

Oznaczyć w warunkach określonych w ppkt 5.2 gęstość optyczną roztworów serii wzorca przez porównanie z odpowiadającymi roztworami serii odniesienia. Na papierze milimetrowym wyznaczyć krzywą wzorcową nanosząc gęstości optyczne względem ilości gossypolu (w μg).

6.3. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń prowadzonych dla tej samej próbki, nie może przekraczać:

- 15 %, w wartości względnej, dla zawartości gossypolu niższej niż 500 ppm,

- 75 ppm, w wartości bezwzględnej, dla zawartości między 500 a 750 ppm,

- 10 %, w wartości względnej, dla zawartości wyższej niż 750 ppm.

______

⁽¹⁾ Obliczyć zawartość azotu mikrometodą Kjeldahla (zawartość teoretyczna: 17,7 % azotu).

ZAŁĄCZNIK  II ⁴

1.

(skreślony)

2.

(skreślony)

3.

(skreślony)

4.

OZNACZENIE TYLOZYNY

- przez dyfuzję w agarze -

1. Cel i zakres

Metoda ta pozwala na oznaczenie zawartości tylozyny w paszach, koncentratach i premiksach, przy jej zawartości wyższej niż 2,0 ppm.

2. Zasada

Próbka jest rozpuszczana w buforze fosforanowym o pH 8, ogrzanym do temperatury 80 °C, a następnie ekstrahowana metanolem i odwirowywana. Po odwirowaniu ekstrakt zostaje rozcieńczony, a aktywność tylozyny oznaczona na drodze dyfuzji w pożywce agarowej zaszczepionej bakterią Sarcina lutea. O procesie dyfuzji informuje powstanie stref inhibicji w pożywce zawierającej drobnoustroje. Średnica stref inhibicji jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku.

3. Drobnoustroje: Sarcina lutea ATTC nr 9341

3.1. Szczep macierzysty

Zaszczepić Sarcina lutea na agarze z pożywką (ppkt 4.1), w skośnie ustawionej probówce i doprowadzonego do pH 7,0. Inkubować przez noc w temperaturze około 35 °C. Przechowywać w lodówce. Ponownie szczepić agar co miesiąc.

3.2. Przygotowanie zawiesiny bakterii

Zebrać kolonie bakterii z ostatnio szczepionego agaru (ppkt 3.1), używając 2 ml-3 ml roztworu soli fizjologicznej (ppkt 4.4). Tą zawiesiną zaszczepić 250 ml pożywki (ppkt 4.1) umieszczonej w kolbie Roux i doprowadzonej do pH 7,0. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 35 °C. Następnie zebrać bakterie do 25 ml roztworu soli fizjologicznej (ppkt 4.4). Wymieszać i rozcieńczyć do uzyskania roztworu wykazującego transmitancję światła 75 % przy długości fali 650 nm.

Zawiesina przechowywana w lodówce zachowuje trwałość przez okres jednego tygodnia.

Przeprowadzić wstępne badania na płytkach z pożywką (ppkt 4.1). Pozwolą one na ustalenie ilości zawiesiny bakterii niezbędnej do zaszczepienia pożywki do oznaczeń, która, dla różnych stężeń antybiotyku, da największą możliwą strefę inhibicji. Pożywkę należy szczepić zarodnikami w temperaturze 48-50 °C.

4. Pożywka i odczynniki

4.1. Pożywka podstawowa dla oznaczeń ⁽⁴⁾

Glukoza 1 g

Pepton trypsynowy 10 g

Ekstrakt mięsny 1,5 g

Ekstrakt drożdżowy 3 g

Agar - w zależności od jakości 10 g do 20 g

Woda destylowana do uzupełnienia objętości do 1.000 ml

Przed użyciem doprowadzić pH do wartości 7,0, co jest potrzebne do przygotowania szczepu macierzystego i zawiesiny bakterii. Pożywka przeznaczona do przeprowadzenia oznaczenia musi mieć odczyn wynoszący 8,0.

4.2. Bufor fosforanowy, pH 8

Diwodorofosforan potasu KH₂PO₄ (cz.d.a.) 0,523 g

Wodorofosforan potasu K₂HPO₄ (cz.d.a.) 16,730 g

Woda destylowana - dopełnić

do objętości 1.000 ml

4.3. Bufor fosforanowy, pH 7

Diwodorofosforan potasu KH₂PO₄ (cz.d.a.) 5,5g

Wodorofosforan potasu K₂HPO₄ (cz.d.a.) 13,6g

Woda destylowana - dopełnić do objętości 1 000 ml

4.4. Sterylny roztwór soli fizjologicznej

4.5. Czysty metanol

4.6. 40-procentowy (obj/obj) roztwór metanolu

4.7. Mieszanina buforu fosforanowego (ppkt 4.2) i czystego metanolu, w stosunku objętościowym 60/40

4.8. Substancja podstawowa: tylozyna o znanej aktywności

5. Roztwory wzorcowe

Suszyć substancję podstawową (ppkt 4.8) przez 3 godziny w temperaturze 60 °C w piecu próżniowym (ciśnienie 5 mm słupa rtęci). Odważyć do kolby pomiarowej

10-50 mg. Rozpuścić w 5 ml metanolu (ppkt 4.5) i dopełnić buforem fosforanowym o pH 7 (ppkt 4.3) do takiej objętości, aby otrzymać roztwór o stężeniu tylozyny wynoszącym 1.000 μg/ml.

Z otrzymanego roztworu podstawowego przygotować roztwór roboczy S₈ zawierający 2,0 μg tylozyny/ml, rozcieńczając roztworem (ppkt 4.7).

Następnie, używając roztworu (ppkt 4.7), przygotować kolejne roztwory (1 + 1) o następujących stężeniach:

S₄ 1,0 μg/ml

S₂ 0, 5 μg/ml

S₁ 0, 25 μg/ml

6. Ekstrakcja

W przypadku koncentratu przygotować próbkę o wadzie 10 g, w przypadku premiksu lub paszy - masa próbki powinna wynosić 20 g. Dodać 60 ml buforu fosforanowego o pH 8,0 (ppkt 4.2), ogrzanego do temperatury 80 °C i mieszać przez 2 minuty (używając kuchennego miksera lub innego, podobnego urządzenia).

Po wymieszaniu pozostawić na 10 minut. Dodać 40 ml metanolu (ppkt 4.5) i mieszać kolejne 5 minut. Zawiesinę odwirować i część cieczy sklarowanej nad osadem rozcieńczyć mieszaniną (ppkt 4.7) w celu otrzymania przypuszczalnego stężenia tylozyny wynoszącego 2,0 μg/ml (U₈). Następnie przygotować stężenia U₄, U₂ i U₁, przez stopniowe rozcieńczanie (1 + 1) roztworem (ppkt 4.7).

Dla stężeń niższych niż 10 ppm całkowicie odparować ekstrakt na wyparce obrotowej w temperaturze 35 °C, a następnie rozpuścić pozostałości w 40-procentowym metanolu (ppkt 4.6)

7. Metoda oznaczania

7.1. Szczepienie pożywki

Szczepić pożywkę do oznaczeń (ppkt 4.1) doprowadzoną do pH 8, zawiesiną bakterii (ppkt 3.2) w temperaturze 48-50 °C.

7.2. Przygotowanie tacek

Dyfuzja w agarze odbywa się na tackach z użyciem czterech stężeń roztworu wzorcowego (S₈, S₄, S₂, S₁) i czterech stężeń ekstraktu badanej próbki (U₈, U₄, U₂, U₁). Na każdej tacce muszą znaleźć się 4 stężenia roztworu wzorcowego i ekstraktu.

Należy wybrać tacki, które będą wystarczająco duże, aby zmieściło się na nich przynajmniej 8 otworów o średnicy 10-13 mm, wykonanych w agarze. Obliczyć ilość zaszczepionej pożywki (ppkt 7.1) potrzebną do jednolitego pokrycia tacki warstwą o grubości około 2 mm. Badanie najlepiej prowadzić na tackach złożonych ze szklanych płytek zaopatrzonych w idealnie dopasowany aluminiowy lub plastikowy pierścień o średnicy 200 mm i wysokości 20 mm.

Odpipetować do każdego otworu dokładnie odmierzoną ilość (między 0,10 ml a 0,15 ml) roztworu antybiotyku, w zależności od średnicy otworu.

Dla każdej próbki powtarzać dyfuzję przynajmniej 4 razy z każdym ze stężeń, tak aby każde oznaczenie było wypadkową wyników uzyskanych z 32 stref inhibicji.

7.3. Inkubacja

Inkubować tacki przez noc w temperaturze 35-37 °C.

8. Ocena

Zmierzyć średnicę każdej ze stref inhibicji, najlepiej metodą rzutowania. Nanieść wyniki na papier półlogarytmiczny, zaznaczając na układzie współrzędnych logarytmy stężeń i odpowiadające im średnice stref inhibicji. Wyznaczyć linie dla roztworu wzorcowego i dla ekstraktu. Linie nie powinny w żadnym punkcie stykać się ze sobą, muszą przebiegać równolegle.

Logarytm aktywności względnej oblicza się stosując następujący wzór:

(U₁ + U₂ + U₄ + U₈ -S₁ -S₂ -S₄ -S₈) · 0,602

-------------------------------------------------

U₄ + U₈ + S₄ + S₈ -U₁ -U₂ -S₁ -S₂

Aktywność rzeczywista = aktywność przypuszczalna x aktywność względna.

9. Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych pomiarów przeprowadzonych dla tej samej próbki nie może przekraczać 10 % w wartości względnej.

5.

Oznaczanie wirginiamycyny

- przez dyfuzję na podłożu agarowym -

1. Cel i zakres

Metoda ta pozwala na oznaczenie zawartości wirginiamycyny w paszach i premiksach. Dolna granica oznaczenia wynosi 2 mg/kg (2 ppm)⁽⁵⁾.

2. Zasada

Próbka jest ekstrahowana roztworem Tween 80 w metanolu. Ekstrakt jest zlewany lub odwirowywany i rozcieńczany. Jego czynność antybiotyczną oznacza się przez dyfuzję wirginiamycyny w pożywce agarowej, zaszczepionej bakterią Micrococcuc luteus. O procesie dyfuzji informuje powstanie stref inhibicji w pożywce zawierającej drobnoustroje. Średnica stref inhibicji jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku.

3. Drobnoustroje: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)

3.1. Utrzymanie kultury bakteryjnej

Zaszczepić Micrococcus luteus na agarze z pożywką (4.1) w skośnie ustawionej probówce i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 30 ºC. Kulturę bakteryjną należy przechowywać w lodówce w temperaturze około 4 ºC. Ponownie szczepić co 2 tygodnie.

3.2. Przygotowanie zawiesiny bakterii^(a)

Zebrać kolonie bakterii z ostatnio szczepionego agaru (3.1) przy użyciu 2 do 3 ml roztworu chlorku sodu (4.3). Zawiesinę tą należy zaszczepić w 250 ml pożywki, umieszczonej w kolbie Roux, inkubować przez 18 do 20 godzin w temperaturze 30 ºC. Zebrać bakterie do 25 ml roztworu chlorku sodu (4.3) i wymieszać. Rozcieńczyć zawiesinę w stosunku 1/10 przy użyciu roztworu chlorku sodu (4.3). Transmitancja światła przez zawiesinę, mierzona przy 650 nm w celce o grubości 1 cm, powinna wynosić około 75 % w stosunku do roztworu chlorku sodu (4.3). Zawiesina ta może być przechowywana przez 1 tydzień w temperaturze około 4 ºC.

4. Pożywka i odczynniki

4.1. Pożywka podstawowa dla oznaczenia^(b)

Pepton mięsny 6,0 g

Trypton 4,0 g

Ekstrakt z drożdży 3,0 g

Ekstrakt z mięsa 1,5 g

Glukoza 1,0 g

Agar 10,0-20,0 g

Woda 1.000 ml

ph 6,5 (po sterylizacji)

4.2. Bufor fosforanowy, pH 6

Wodorofosforan potasu, K₂HPO₄ 2,0 g

Diwodorofosforan potasu, KH₂PO₄ 8,0 g

Woda do 1.000 ml

4.3. 0,8-procentowy roztwór chlorku sodu (m/v): rozpuścić 8 g chlorku sodu w wodzie i rozcieńczyć do 1.000 ml; wysterylizować.

4.4 Metanol.

4.5. Mieszanina buforu fosforanowego (4.2) z metanolem (4.4): 80/20 (v/v).

4.6. Roztwór metanolowy Tween 80 0,5 % (m/v): rozpuścić 5 g Tween 80 w metanolu (4.4) i rozcieńczyć metanolem do 1.000 ml.

4.7. Substancja podstawowa: wirginiamycyna o znanej aktywności.

5. Roztwory wzorcowe

Rozpuścić dokładnie zważoną ilość substancji podstawowej (4.7) w metanolu (4.4) i rozcieńczyć metanolem (4.4), aby otrzymać roztwór wzorcowy zawierający 1.000 μg wirginiamycyny w 1 ml.

Tak przygotowany roztwór, przechowywany w zamkniętej kolbie w temperaturze 4 ºC, ma trwałość do pięciu dni.

Z roztworu wzorcowego, metodą kolejnych rozcieńczeń z mieszaniną (4.5), przygotować następujące roztwory:

s8	1	μg/ml
s4	0,5	μg/ml
s2	0,25	μg/ml
s1	0,125	μg/ml

6. Przygotowanie ekstraktu i roztworów badanych

6.1. Ekstrakcja

6.1.1. Produkty o zawartości wirginiamycyny do 100 mg/kg

Odważyć z próbki ilość 50 g, dodać 200 ml roztworu (4.6) i wstrząsać przez 30 minut. Zostawić do opadnięcia lub odwirować, pobrać 20 ml roztworu sklarowanego nad osadem i odparować na wyparce obrotowej do objętości około 5 ml w temperaturze nieprzekraczającej 40 ºC. Pozostałość rozpuścić przy użyciu mieszaniny (4.5) w celu uzyskania oczekiwanej zawartości wirginiamycyny 1 μg/ml (= u₈).

6.1.2. Produkty o zawartości wirginiamycyny większej niż 100 mg/kg

Odważyć z próbki ilość nieprzekraczającą 10,0 g i zawierającą między 1 a 50 mg wirginiamycyny, dodać 100 ml roztworu (4.6) i wstrząsać przez 30 minut. Zostawić do opadnięcia lub odwirować, następnie rozcieńczyć roztwór sklarowany nad osadem przy użyciu mieszaniny (4.5) w celu uzyskania oczekiwanej zawartości wirginiamycyny 1 μg/ml (= u₈).

6.2. Roztwory badane

Z roztworu u₈ przygotować roztwór u₄ (zakładana zawartość: 0,5 μg/ml), u₂ (zakładana zawartość: 0,25 μg/ml) i u₁ (zakładana zawartość: 0,125 μg/ml), metodą kolejnych rozcieńczeń (1 + 1) przy użyciu mieszaniny (4.5).

7. Procedura oznaczania

7.1. Szczepienie pożywki do oznaczenia

Szczepić pożywkę do oznaczania (4.1) za pomocą zawiesiny bakterii (3.2) w temperaturze około 50 ºC. Przy pomocy wstępnych prób na płytkach z odczynnikiem do oznaczania (4.1) oznaczyć ilość zawiesiny bakterii wymaganej do uzyskania największych i najczytelniejszych stref inhibicji przy różnych stężeniach wirginiamycyny.

7.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzję w agarze przeprowadza się na płytkach z użyciem czterech stężeń roztworu wzorcowego (s₈, s₄, s₂ i s₁) i czterech stężeń roztworu badanego (u₈, u₄, u₂ i u₁). Te cztery stężenia ekstraktu i wzorca muszą być koniecznie umiejscowione na każdej płytce. Aby osiągnąć taki efekt, należy wybrać wystarczająco duże płytki, aby możliwe było zrobienie w podłożu agarowym co najmniej ośmiu otworów o średnicy od 10 do 13 mm, leżących od siebie w odległości nie mniejszej niż 30 mm, licząc od środka otworów. Badanie może być przeprowadzone na płytkach składających się ze szklanej podstawy i aluminiowego lub plastikowego pierścienia umieszczonego na płytce, o średnicy 200 mm i wysokości 20 mm.

Rozlać na płytki taką objętość pożywki (4.1), zaszczepionej jak przedstawiono w ppkt 7.1, aby uzyskać warstwę o grubości ok. 2 mm (60 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Zostawić do zastygnięcia w poziomym położeniu, wywiercić otwory i umieścić w nich dokładnie odmierzoną objętość roztworów badanego i wzorcowego (między 0,10 a 0,15 ml na otwór, w zależności od w zależności od średnicy). Należy użyć roztworu o każdym stężeniu, co najmniej cztery razy, aby każde oznaczenie było wykonane na podstawie oceny 32 stref inhibicji.

7.3. Inkubacja

Inkubować płytki przez 16-18 godzin w temperaturze 30 ± 2 ºC.

8. Ocena

Zmierzyć średnicę stref inhibicji z dokładnością do 0,1 mm. Nanieść wyniki na papier półlogarytmiczny, zaznaczając na układzie współrzędnych logarytmy kolejnych stężeń i odpowiadające im średnice stref inhibicji. Nakreślić proste o najlepszej zgodności zarówno dla roztworu wzorcowego jak i dla ekstraktu, postępując np. tak, jak poniżej:

Wyznaczyć punkt "o najlepszej zgodności" dla najniższego poziomu roztworu wzorcowego (SL), używając wzoru:

7s₁ + 4s₂ + s₄ - 2s₈

(a) SL = ----------------------

10

Wyznaczyć punkt "o najlepszej zgodności" dla najwyższego poziomu roztworu wzorcowego (SH), używając wzoru:

7s₈ + 4s₄ + s₂ - 2s₁

(b) SH = ----------------------

10

Podobnie obliczyć punkty "o najlepszej zgodności" dla najniższego poziomu ekstraktu (UL) oraz dla najwyższego poziomu ekstraktu (UH), podstawiając u₁, u₂, u₄ i u₈ zamiast s₁, s₂, s₄ i s₈ do powyższych wzorów.

Zapisać obliczone wartości SL i SH na tym samym papierze milimetrowym i połączyć je uzyskując prostą "o najlepszej zgodności" dla roztworu wzorcowego. Podobnie zaznaczyć wartości UL i UH i połączyć je uzyskując prostą "o najlepszej zgodności" w celu uzyskania odpowiedniej prostej dla ekstraktu.

Jeśli oznaczenie przebiega bez zakłóceń, proste powinny być równoległe. W praktyce proste mogą być uznane za równoległe, jeśli średnie wartości (SH-SL) i (UH-UL) nie różnią się więcej niż o 10 %.

Jeśli okaże się, że proste nie są równoległe, w obliczeniach można pominąć zarówno u₁ i s₁, jak również u₈ i s₈. Do obliczenia wartości SL, SH, UL i UH można użyć alternatywnych wzorów, aby otrzymać alternatywne proste "o najlepszej zgodności":

5s₁ + 2s₂ - s₄ 5s₂ + 2s₄ - s₈

(a') SL = ---------------- lub ----------------

6 6

5s₄ + 2s₂ - s₁ 5s₈ + 2s₄ - s₂

(b') SH = ---------------- lub ----------------

6 6

oraz podobnie dla UL i UH. Zadowalające są takie kryteria równoległości, jakie zastosowano powyżej. W sprawozdaniu końcowym należy odnotować fakt, że wynik uzyskano przy użyciu trzech poziomów.

Jeśli proste zostały uznane za równoległe, należy obliczyć logarytm względnej aktywności (log A) za pomocą jednego z poniższych wzorów, w zależności, czy do oceny równoległości prostych użyto trzech, czy czterech poziomów.

Dla czterech poziomów

(u₁ + u₂ + u₄ + u₈ - s₁ - s₂ - s₄ - s₈) × 0,602

(c) Log A = ---------------------------------------------

u₄ + u₈ + s₄ + s₈ - u₁ - u₂ - s₁ - s₂

Dla trzech poziomów

(u₁ + u₂ + u₄ - s₁ - s₂ - s₄) × 0,401

(d) Log A = ---------------------------------------

u₄ + s₄ - u₁ - s₁

lub

(u₂ + u₄ + u₈ - s₂ - s₄ - s₈) × 0,401

(d') Log A = ---------------------------------------

u₈ + s₈ - u₂ - s₂

Aktywność ekstraktu próbnego = aktywność odpowiedniego wzorca × A

(u₈ = s₈ × A)

Jeśli względna aktywność nie mieści się w zakresie 0,5-2,0, należy powtórzyć próbę odpowiednio dostosowując stężenia ekstraktu, lub, jeśli nie jest to możliwe, dostosowując stężenia roztworów wzorcowych. Jeśli względna aktywność nadal nie mieści się w wymaganym zakresie, wszystkie otrzymane wyniki należy uznać za przybliżone. Należy to odnotować w sprawozdaniu końcowym.

Jeśli uznano, że proste nie są równoległe, należy powtórzyć oznaczenie. Jeśli proste nadal nie są równoległe, oznaczenie należy uznać za niezadowalające.

Wynik należy wyrazić w miligramach wirginiamycyny na kilogram paszy.

9. Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń, przeprowadzanych dla tej samej próbki przez tego samego analityka, nie powinna przekraczać:

- 2 mg/kg, w wartości bezwzględnej, dla zawartości wirginiamycyny do 10 mg/kg,

- 20 % względem wartości najwyższej, dla zawartości 10-25 mg/kg,

- 5 mg/kg, w wartości bezwzględnej, dla zawartości 25-50 mg/kg,

- 10 % względem wartości najwyższej, dla zawartości powyżej 50 mg/kg.

______

⁽¹⁾ Do oznaczeń można wykorzystać każdy rodzaj pożywki dostępny w handlu, pozwalający na uzyskanie takich samych wyników.

⁽²⁾ Czerni amidowej używa się, aby strefy inhibicji roztworów wzorcowych były lepiej widoczne (błękitne pierścienie).

⁽³⁾ Ten szczep, wyizolowany przez Lufę i Kiela, namnaża się znacznie szybciej niż S. aureus ATTC 6538 P.

⁽⁴⁾ Szczep wyizolowany przez Lufę i Kiela.

⁽⁵⁾ 1 mg wirginiamycyny odpowiada 1.000 jednostek UK.

^(a) Mogą być stosowane inne metody, pod warunkiem iż uznano, że dają podobne zawiesiny bakterii.

^(b) Może być stosowany każdy rodzaj pożywki dostępny w handlu, pozwalający na uzyskanie takich samych wyników.

¹ Art. 1:

- zmieniony przez art. 3 dyrektywy nr 81/680/EWG z dnia 30 lipca 1981 r. (Dz.U.UE.L.81.246.32) zmieniającej nin. dyrektywę z dniem 19 sierpnia 1981 r.

- zmieniony przez art. 1 rozporządzenia nr 121/2008 z dnia 11 lutego 2008 r. (Dz.U.UE.L.08.37.3) wprowadzającego odstępstwo od jego stosowania z dniem 3 marca 2008 r.

² Art. 2:

- zmieniony przez art. 3 dyrektywy nr 81/680/EWG z dnia 30 lipca 1981 r. (Dz.U.UE.L.81.246.32) zmieniającej nin. dyrektywę z dniem 19 sierpnia 1981 r.

- zmieniony przez art. 2 pkt 1 dyrektywy nr 98/54/WE z dnia 16 lipca 1998 r. (Dz.U.UE.L.98.208.49) zmieniającej nin. dyrektywę z dniem 13 sierpnia 1998 r.

³ Załącznik I:

-zmieniony przez art. 1 dyrektywy nr 93/28/EWG z dnia 4 czerwca 1993 r. (Dz.U.UE.L.93.179.8) zmieniającej nin. dyrektywę z dniem notyfikacji.

- zmieniony przez art. 1 dyrektywy nr 1999/79/WE z dnia 27 lipca 1999 r. (Dz.U.UE.L.99.209.23) zmieniającej nin. dyrektywę z dniem 27 sierpnia 1999 r.

⁴ Załącznik II:

-zmieniony przez art. 2 dyrektywy nr 84/4/EWG z dnia 20 grudnia 1983 r. (Dz.U.UE.L.84.15.28) zmieniającej nin. dyrektywę z dniem 20 grudnia 1983 r.

- zmieniony przez art. 2 pkt 2 dyrektywy nr 98/54/WE z dnia 16 lipca 1998 r. (Dz.U.UE.L.98.208.49) zmieniającej nin. dyrektywę z dniem 13 sierpnia 1998 r.