Rozporządzenie 2568/91 w sprawie właściwości oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn oliwek oraz w sprawie odpowiednich metod analizy
Dz.U.UE.L.1991.248.1
Akt utracił mocROZPORZĄDZENIE KOMISJI (EWG) NR 2568/91
z dnia 11 lipca 1991 r.
w sprawie właściwości oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn oliwek oraz w sprawie odpowiednich metod analizy
Notka Redakcji Systemu Informacji Prawnej LEX
Tekst niniejszego aktu prawnego nie uwzględnia wszystkich zmian, ponieważ niektóre akty zmieniające nie zostały opublikowane w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej - polskim wydaniu specjalnym. Jedynie zmiany wprowadzone przez akty nieopublikowane w ww. wydawnictwie, które nie zostały pochłonięte przez zmiany zawarte w aktach opublikowanych w kolejnych tomach tego wydawnictwa, znajdują odzwierciedlenie w tekście niniejszego aktu prawnego. Jednostki redakcyjne tekstu zmienione przez te akty wyróżniono kursywą, a ich aktualną treść podano w wersji anglojęzycznej w przypisie znajdującym się przy zmienionej jednostce.
Grafiki zostały zamieszczone wyłącznie w Internecie. Obejrzenie grafik podczas pracy z programem Lex wymaga dostępu do Internetu.
.................................................
uwzględniając Traktat ustanawiający Europejską Wspólnotę Gospodarczą,
uwzględniając rozporządzenie Rady nr 136/66/EWG z dnia 22 września 1966 r. w sprawie ustanowienia wspólnej organizacji rynku olejów i tłuszczów 1 , ostatnio zmienione rozporządzeniem (EWG) nr 3577/90 2 , w szczególności jego art. 35a,
a także mając na uwadze, co następuje:
załącznik do rozporządzenia nr 136/66/EWG zawiera opisy i definicje oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn oliwek, wprowadzanych do obrotu w każdym Państwie Członkowskim, w handlu wewnątrzwspólnotowym oraz w handlu z państwami trzecimi;
w celu zróżnicowania rodzajów oliwy z oliwek należy określić ich fizyczne i chemiczne właściwości oraz właściwości organoleptyczne oliwy z pierwszego tłoczenia, aby zagwarantować czystość i jakość danych produktów, bez uszczerbku dla innych istniejących przepisów;
charakterystyczne właściwości różnych rodzajów oliwy należy określać w sposób jednolity na terytorium całej Wspólnoty; w tym celu należy ustalić wspólnotowe metody analizy chemicznej i oceny organoleptycznej; należy zezwolić na stosowanie w okresie przejściowym innych metod analiz stosowanych w Państwach Członkowskich, pod warunkiem, że w razie występowania różnic w wynikach, wynikami ostatecznymi są wyniki uzyskane wspólną metodą;
definicja fizycznych i chemicznych właściwości oliwy z oliwek i metod analizy pociąga za sobą zmiany dodatkowych uwag do rozdziału 15 Nomenklatury Scalonej;
metoda oceny właściwości organoleptycznych oliwy z pierwszego tłoczenia obejmuje ustanowienie zespołów wybranych i wyszkolonych degustatorów; w związku z tym należy wyznaczyć niezbędny termin dla utworzenia takiej struktury;
mając na względzie trudności, które niektóre Państwa Członkowskie napotkają w związku z powoływaniem zespołów degustatorów, należy zezwolić na korzystanie z zespołów innych Państw Członkowskich;
w celu zapewnienia, że system opłat stosowanych w odniesieniu do przywozu wytłoczyn z oliwek funkcjonuje w sposób prawidłowy, należy wprowadzić jednolitą metodę oznaczania zawartości oleju w tych produktach;
aby nie zakłócać handlu, należy ustanowić przepis dla oleju zapakowanego przed wejściem w życie niniejszego rozporządzenia, który ma być zbyty w określonym czasie;
konieczne jest uchylenie rozporządzenia Komisji (EWG) nr 1058/77 3 , ostatnio zmienionego rozporządzeniem (EWG) nr 1858/88 4 ;
Komitet Zarządzający ds. Olejów i Tłuszczów nie wydał opinii w terminie ustalonym przez przewodniczącego,
PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZĄDZENIE:
Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich Państwach Członkowskich.
| W imieniu Komisji | |
| RAY MAC SHARRY | |
| Członek Komisji |
ZAŁĄCZNIK II 32
OZNACZANIE WOLNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH, METODA NA ZIMNO
OZNACZANIE WOLNYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH, METODA NA ZIMNO
Kwasowość wyrażona jako procent masowy kwasu oleinowego wynosi:
gdzie:
V = objętość użytego do miareczkowania roztworu wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu) w mililitrach;
c = dokładne stężenie molowe użytego do miareczkowania roztworu wodorotlenku potasu (lub wodorotlenku sodu);
M = 282 g/mol, molowa masa w gramach na mol kwasu oleinowego;
m = masa próbki w gramach.
Kwasowość oleju podaje się następująco:
ZAŁĄCZNIK III 33
OZNACZANIE LICZBY NADTLENKOWEJ
OZNACZANIE LICZBY NADTLENKOWEJ
Tego samego dnia przed użyciem roztworu przygotować świeży roztwór tiosiarczanu sodu 0,01 mol/l z mianowanego roztworu tiosiarczanu sodu 0,1 mol/l, lub ustalić dokładne stężenie molowe. Doświadczenie pokazuje, że stabilność jest ograniczona i zależy od wartości pH i zawartości wolnego ditlenku węgla. Do rozcieńczania stosować wyłącznie świeżo przegotowaną wodę, najlepiej przepłukaną azotem.
W celu określenia dokładnego stężenia molowego roztworu tiosiarczanu sodu zalecana jest następująca procedura:
Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, od 0,27 do 0,33 g jodanu potasu mKIO3) do kolby miarowej (250 ml lub 500 ml) i rozcieńczyć, napełniając do kreski świeżo przegotowaną wodą (V2), schłodzoną do temperatury pokojowej. Za pomocą pipety przenieść 5 ml lub 10 ml tego roztworu jodanu potasu (V1) do kolby stożkowej o pojemności 250 ml. Dodać 60 ml świeżo przegotowanej wody, 5 ml kwasu chlorowodorowego 4 mol/l oraz od 25 do 50 mg jodku potasu lub 0,5 ml nasyconego roztworu jodku potasu. Miareczkować roztwór przy użyciu roztworu tiosiarczanu sodu (V3) w celu określenia dokładnego stężenia molowego roztworu tiosiarczanu sodu.
gdzie:
mKIO3 - masa jodanu potasu, w g;
V1 - objętość roztworu jodanu potasu, w ml (5 lub 10 ml);
V2 - całkowita objętość roztworu jodanu potasu, w ml (250 lub 500 ml);
V3 - objętość roztworu tiosiarczanu sodu, w ml;
wKIO3 - czystość jodanu potasu, w g/100 g;
MKIO3 - masa cząsteczkowa jodanu potasu (214 g/mol);
T - dokładne stężenie molowe roztworu tiosiarczanu sodu (mol/l);
Liczba nadtlenkowa (LN) wyrażona w milirównoważnikach aktywnego tlenu na kilogram określana jest wzorem:
gdzie:
V = ilość ml mianowanego roztworu tiosiarczanu sodu (5.4) użytego w badaniu, skorygowana w celu uwzględnienia ślepej próby;
T = dokładne stężenie molowe użytego roztworu tiosiarczanu sodu (5.4), w mol/l;
m = masa naważki w g;
Jako wynik przyjąć średnią arytmetyczną dwóch oznaczeń.
Informować o wyniku z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.
ZAŁĄCZNIK IV 34
OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WOSKÓW METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ Z UŻYCIEM KOLUMNY KAPILARNEJ
OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WOSKÓW METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ Z UŻYCIEM KOLUMNY KAPILARNEJ
Niniejsza metoda stanowi opis procedury analitycznej oznaczania zawartości wosków w oliwie z oliwek. Woski rozdziela się w zależności od liczby atomów węgla. Metodę można w szczególności stosować do rozróżniania oliwy z oliwek uzyskanej z tłoczenia od oliwy z oliwek uzyskanej z ekstrakcji (oliwy z wytłoczyn).
2. ZASADA
Dodanie odpowiedniego wzorca wewnętrznego do tłuszczu, następnie frakcjonowanie metodą chromatografii w kolumnie z uwodnionym żelem krzemionkowym, odzyskanie frakcji wymytej uprzednio w warunkach testowych (której biegunowość jest mniejsza niż w przypadku triglicerydów), następnie przeprowadzenie bezpośredniej analizy metodą chromatografii gazowej z użyciem kolumny kapilarnej.
3. MATERIAŁY
3.1. Kolba Erlenmeyera o pojemności 25 ml.
3.2. Szklana kolumna do chromatografii gazowej, średnica wewnętrzna 15,0 mm, wysokość 30-40 cm, wyposażona w kranik.
3.3. Odpowiedni chromatograf gazowy z kolumną kapilarną, wyposażony w system do bezpośredniego wprowadzania do kolumny, składający się z:
3.3.1. komory z termostatem do kolumn, wyposażonej w programator temperatury;
3.3.2. zimnego dozownika do bezpośredniego wprowadzania do kolumny;
3.3.3. detektora płomieniowo-jonizacyjnego i konwertera-wzmacniacza;
3.3.4. rejestrującego integratora współpracującego z konwerterem-wzmacniaczem (3.3.3), o szybkości odpowiedzi poniżej 1 sekundy, ze zmienną szybkością przesuwu papieru. (Można również zastosować systemy informatyczne przewidujące uzyskiwanie danych z chromatografii gazowej przy użyciu komputera osobistego);
3.3.5. Kolumny kapilarnej, ze szkła lub z topionej krzemionki, o długości 8-12 m, średnicy wewnętrznej 0,25- 0,32 mm, pokrytej od środka płynem rozdzielającym, o jednolitej grubości 010-0,30 μm. (Płyny rozdzielające nadające się do użycia typu SE52 lub SE 54, dostępne w handlu).
3.4. Mikrostrzykawka umożliwiająca bezpośrednie wstrzyknięcie do kolumny porcji 10 μl, wyposażona w igłę o utwardzonej powierzchni.
3.5. Wibrator elektryczny.
3.6. Wyparka rotacyjna.
3.7. Piec muflowy.
3.8. Waga analityczna zapewniająca precyzję pomiaru ± 0,1 mg.
3.9. Zwykłe szkło laboratoryjne.
4. ODCZYNNIKI
4.1. Żel krzemionkowy o granulometrii w zakresie od 60 do 200 μm.
Żel krzemionkowy należy umieścić w piecu w temperaturze 500 °C na co najmniej 4 godziny. Schłodzić, następnie dodać 2 % wody względem ilości pobranego żelu krzemionkowego. Dobrze wstrząsnąć do otrzymania jednolitej zawiesiny. Trzymać w zaciemnionym miejscu przez co najmniej 12 godzin przed użyciem.
4.2. n-heksan, do chromatografii.
4.3. Eter etylowy, do chromatografii.
4.4. n-heptan, do chromatografii.
4.5. Roztwór wzorca arachidynianu laurylowego o stężeniu 0,1 % (m/V) w heksanie (wzorzec wewnętrzny). (Można również zastosować palmitynian palmitylu lub stearynian mirystylu).
4.5.1. Sudan 1 (1-fenylo-azo-2-naftol).
4.6. Gaz nośny: czysty wodór lub hel, do chromatografii gazowej.
4.7. Gazy pomocnicze:
- czysty wodór, do chromatografii gazowej,
- czyste powietrze, do chromatografii gazowej.
5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA
5.1. Przygotowanie kolumny chromatograficznej
Sporządzić zawiesinę 15 g żelu krzemionkowego (4.1) w n-heksanie (4.2) i wprowadzić do kolumny (3.2). Po spontanicznym wytrącaniu osadu zakończyć ten proces przy użyciu wytrząsarki elektrycznej (3.5), tak aby warstwa chromatograficzna była bardziej jednolita. Przesączyć 30 ml n-heksanu, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Odważyć dokładnie, przy użyciu wagi (3.8), 500 mg próbki do kolby Erlenmeyera o pojemności 25 ml (3.1) i dodać właściwą ilość wzorca wewnętrznego (4.5), zależnie od przypuszczalnej zawartości wosków. Dodać na przykład 0,1 mg arachidynianu laurylowego w przypadku oliwy z oliwek i 0,25-0,5 mg w przypadku oliwy z wytłoczyn oliwek. Do tak przygotowanej próbki dodać dwie porcje po 2 ml n-heksanu (4.2) i przenieść do kolumny chromatograficznej.
Wprowadzić próbkę, tak aby rozpuszczalnik napłynął do wysokości 1 mm powyżej górnego poziomu absorbentu, następnie przesączyć dodatkowych 70 ml n-heksanu, tak aby usunąć naturalnie obecne n-alkany. Rozpocząć wymywanie chromatograficzne, pobierając 180 ml mieszaniny n-heksanu/eteru etylowego w proporcji 99/1, przy przepływie około 15 kropli w ciągu 10 sekund. Wymywanie próbki należy prowadzić w temperaturze pokojowej 22 °C ± 4.
Uwagi:
- Mieszaninę n-heksanu/eteru etylowego (99/1) należy przygotowywać codziennie.
- W celu wzrokowego skontrolowania prawidłowości wymywania wosków można dodać do próbki 100 μl roztworu 1 % Sudanu w mieszaninie wymywającej. Ponieważ wartość retencji tego barwnika jest pośrednia pomiędzy wartościami retencji wosków i triglicerydów, należy zatrzymać wymywanie, gdy barwnik dotrze do dna kolumny chromatograficznej, ponieważ wszystkie woski zostały już wymyte.
Otrzymaną w ten sposób frakcję suszy się w wyparce rotacyjnej (3.6) aż do niemal całkowitego wyeliminowania rozpuszczalnika. Usuwa się ostatnie 2 ml rozpuszczalnika przy użyciu słabego strumienia azotu; a następnie dodaje 2-4 ml n-heptanu.
5.2. Analiza metodą chromatografii gazowej
5.2.1. Procedura wstępna
Umieścić kolumnę w chromatografie gazowym (3.3), łącząc szczelinę wlotową z systemem kolumnowym, a wylotową z detektorem. Wykonać ogólne kontrole aparatury do chromatografii gazowej (działanie pętli gazowych, sprawność detektora i systemu rejestracyjnego itp.).
Jeżeli kolumna używana jest po raz pierwszy, zaleca się jej kondycjonowanie. Przepuścić przez kolumnę gaz o małym natężeniu przepływu, następnie uruchomić aparaturę do chromatografii gazowej. Stopniowo podgrzewać do uzyskania, po około 4 godzinach, temperatury 350 °C. Utrzymać tę temperaturę przez co najmniej 2 godziny, a następnie ustawić aparaturę według zadanych warunków pracy (zadać natężenie przepływu gazu, zapalić płomień, podłączyć do elektronicznego przyrządu rejestrującego (3.3.4), ustawić temperaturę komory kolumny, detektora itd.) oraz rejestrować sygnał z czułością co najmniej dwukrotnie wyższą niż czułość przewidziana do przeprowadzenia analizy. Przebieg linii podstawowej powinien mieć charakter liniowy, bez jakichkolwiek pików, i linia ta nie powinna wykazywać nachylenia.
Prostoliniowe, ujemne nachylenie linii wskazuje na to, że połączenia kolumn są nieprawidłowe; nachylenie dodatnie oznacza, że kolumna nie została poddana wystarczającemu kondycjonowaniu.
5.2.2. Dobór warunków roboczych
Ogólnie należy przestrzegać następujących warunków roboczych:
- temperatura kolumny:
| 20 | °C/minutę | 5 °C/minutę | 20 °C/minutę | ||||
| Początkowa 80 °C (1') | → | 240 °C | → | 325 °C (6') | → | 340 °C (10') |
- temperatura detektora: 350 °C,
- porcja wstrzykiwana: 1 μl roztworu (2-4 ml) n-heptanu,
- gaz nośny: hel lub wodór z szybkością liniową optymalną dla wybranego gazu (patrz: dodatek),
- czułość urządzenia: taka, aby były spełnione warunki określone poniżej:
Warunki te mogą być modyfikowane w sposób dostosowany do charakterystyk kolumn i aparatów do chromatografii gazowej, tak aby uzyskano oddzielenie wszystkich wosków i zadowalającą rozdzielczość pików (patrz: rysunek), przy czym czas retencji wzorca wewnętrznego C32 powinien wynosić 18 ± 3 minut. Pik najbardziej reprezentatywny dla wosków musi mierzyć co najmniej 60 % od dołu skali.
Ustalić parametry całkowania pików w taki sposób, by uzyskać dokładną wartość pól powierzchni rozpatrywanych pików.
Uwaga: Ze względu na wysoką temperaturę końcową przyjmuje się dodatnie nachylenie, które nie może przekraczać 10 % od dołu skali.
5.3. Przeprowadzenie analizy
Pobrać 1 μl roztworu za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl; odciągnąć tłoczek, aż igła zostanie całkowicie opróżniona. Wprowadzić igłę do układu nastrzykowego i szybko wstrzyknąć po upływie jednej do dwóch sekund. Po upływie około 5 sekund powoli wyciągnąć igłę.
Przeprowadzić rejestrację danych aż do momentu całkowitego wymycia wosków.
Linia podstawowa musi przez cały czas spełniać ustalone wymagania.
5.4. Identyfikacja pików
Zidentyfikować piki po czasach retencji, porównując je z mieszaninami wosków o znanych czasach retencji, analizowanymi w takich samych warunkach.
Rysunek przedstawia chromatogram wosków oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia.
5.5. Analiza ilościowa
Ustalić za pomocą integratora pola powierzchni pików odpowiadające wzorcowi wewnętrznemu i estrom alifatycznym od C40 do C46.
Obliczyć zawartość wosków każdego z estrów, w mg/kg tłuszczu, zgodnie ze wzorem:
gdzie:
Ax = pole pod pikiem każdego estru, w milimetrach kwadratowych;
As = pole pod pikiem wzorca wewnętrznego, w milimetrach kwadratowych;
Ms = masa dodanego wzorca wewnętrznego, w miligramach;
M = masa próbki pobranej do oznaczenia, w gramach.
6. PREZENTACJA WYNIKÓW
Podać zawartość poszczególnych wosków od C40 do C46, w mg/kg tłuszczu (ppm).
Uwaga: Oznaczane składniki odpowiadają pikom o liczbie par węglowych zawartych pomiędzy estrami C40 a C46, zgodnie z przykładowym chromatogramem wosków oliwy z oliwek przedstawionym na rysunku poniżej. Jeżeli ester C46 pojawi się podwójnie, w celu jego identyfikacji zaleca się analizę frakcji wosków oliwy z wytłoczyn oliwek, gdzie C46 łatwo jest zidentyfikować, ponieważ wykazuje wyraźną przewagę ilościową.
Wynik należy podać z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.
Rysunek
Chromatogram wosków oliwy z oliwek(*)
Objaśnienie:
I.S. = Arachidynian laurylowy
1 = Estry diterpenowe
2 + 2' = Estry C40
3 + 3' = Estry C42
4 + 4' = Estry C44
5. = Estry C46
6 = Estry steroli i alkohole triterpenowe.
(*) Po wymyciu estrów steroli w zapisie chromatograficznym nie powinny być widoczne istotne piki (triglicerydy).
Dodatek
Oznaczenie prędkości liniowej gazu
Do chromatografu gazowego ustawionego na normalne warunki robocze wprowadzić 1-3 μl metanu (lub propanu). Mierzyć chronometrem czas potrzebny na przejście gazu przez kolumnę, począwszy od momentu wstrzyknięcia do spadku wartości szczytowej (tM).
Prędkość liniowa, w cm/s, jest określona na podstawie wzoru L/tM, gdzie L jest długością kolumny w centymetrach, a tM - czasem zmierzonym w sekundach.
ZAŁĄCZNIK VII 37
OZNACZANIE ZAWARTOŚCI PROCENTOWEJ 2-MONOPALMITYNIANU GLICEROLU
OZNACZANIE ZAWARTOŚCI PROCENTOWEJ 2-MONOPALMITYNIANU GLICEROLU
Niniejsza metoda stanowi opis procedury analitycznej oznaczania zawartości procentowej kwasu palmitynowego w pozycji 2 triglicerydów metodą oznaczania 2-monopalmitynianu glicerolu.
Niniejsza metoda dotyczy olejów roślinnych płynnych w temperaturze pokojowej (20 °C).
2. ZASADA
Po przygotowaniu próbkę oleju poddaje się działaniu lipazy trzustkowej: częściowa i swoista hydroliza w pozycjach 1 i 3 cząsteczki triglicerydu powoduje pojawienie się monoglicerydów w pozycji 2. Zawartość
procentowa 2-monopalmitynianu glicerolu we frakcji monoglicerydów jest oznaczana, po sililowaniu,
metodą chromatografii gazowej na kolumnie kapilarnej.
3. APARATURA I MATERIAŁY EKSPLOATACYJNE
3.1. Kolba Erlenmeyera o pojemności 25 ml.
3.2. Zlewki o pojemności 100, 250 i 300 ml.
3.3. Szklana kolumna chromatograficzna (wewnętrzna średnica: 21-23 mm, długość: 400 mm), wyposażona w płytkę ze spieku szklanego i kranik.
3.4. Cylindry miarowe o pojemności 10, 50, 100 i 200 ml.
3.5. Kolby o pojemności 100 i 250 ml.
3.6. Wyparka obrotowa.
3.7. Probówki do wirowania o pojemności 10 ml, ze szlifowanym korkiem.
3.8. Wirówka do probówek o pojemności 10 i 100 ml.
3.9. Termostat umożliwiający utrzymanie temperatury na poziomie 40 °C ± 0,5 °C.
3.10. Biurety z podziałką co 1 i 2 ml.
3.11. Strzykawka podskórna o pojemności 1 ml.
3.12. Mikrostrzykawka o pojemności 100 μl.
3.13. Lejek, 1.000 ml.
3.14. Chromatograf gazowy do kolumn kapilarnych, wyposażony w dozownik do nastrzykiwania "na kolumnę" na zimno w celu bezpośredniego wprowadzania próbki do kolumny oraz w piecyk zapewniający utrzymanie wybranej temperatury z dokładnością do 1 °C.
3.15. Układ nastrzykowy "na kolumnę" na zimno, w celu bezpośredniego wprowadzenia próbki do kolumny.
3.16. Detektor płomieniowo-jonizacyjny i elektrometr.
3.17. Rejestrujący integrator współpracujący z elektrometrem, z szybkością odpowiedzi poniżej 1 sekundy, ze zmienną szybkością przesuwu papieru.
3.18. Kolumna kapilarna ze szkła lub z topionej krzemionki, o długości 8-12 m i średnicy wewnętrznej 0,25-0,32 mm, pokryta 5 % polimetylosiloksanem lub polifenylo-metylosiloksanem, o grubości 0,10-0,30 μm, którą można stosować w temperaturze 370 °C.
3.19. Mikrostrzykawka o pojemności 10 μl, wyposażona w igłę o utwardzonej powierzchni, o długości co najmniej 7,5 cm, przeznaczona do wykonywania bezpośrednich nastrzyków na kolumnę.
4. ODCZYNNIKI
4.1. Żel krzemionkowy o granulometrii w zakresie od 0,063 do 0,200 mm (70/280 mesh), przygotowany następująco: umieścić żel krzemionkowy w kapsule porcelanowej, suszyć w suszarce w temperaturze 160 °C przez 4 godziny, schłodzić do temperatury pokojowej w eksykatorze. Dodać objętość wody równoważną 5 % masy żelu krzemionkowego, w następujący sposób: do kolby Erlenmeyera o pojemności 500 ml odważyć 152 g żelu krzemionkowego i dodać 8 g wody destylowanej, zatkać kolbę i delikatnie wstrząsać do uzyskania równomiernego rozprowadzenia wody. Odstawić na co najmniej 12 godzin przed użyciem.
4.2. n-heksan (o klasie czystości do chromatografii). Heksan można zastąpić izooktanem (2,2,4-trimetylopentanem o klasie czystości do chromatografii), o ile osiągnięto porównywalne wartości precyzji.
4.3. Izopropanol.
4.4. Izopropanol, roztwór wodny 1/1 (V/V).
4.5. Lipaza trzustkowa. Użyta lipaza musi wykazywać aktywność w zakresie od 2,0 do 10 jednostek lipazy na mg (W handlu dostępne są lipazy trzustkowe o aktywności w zakresie od 2 do 10 jednostek na mg enzymu).
4.6. Roztwór buforowy tris-hydroksymetyloaminometan: roztwór wodny 1 M doprowadzony do pH 8 (kontrola potencjometryczna) stężonym HCI (1/1 V/V).
4.7. Cholan sodu, jakości enzymatycznej, roztwór wodny o stężeniu 0,1 % (roztwór ten należy wykorzystać w ciągu 15 dni od sporządzenia).
4.8. Chlorek wapnia, 22 % roztwór wodny.
4.9. Eter dietylowy do chromatografii.
4.10. Rozpuszczalnik rozwijający: mieszanina n-heksanu/eteru dietylowego (87/13) (V/V).
4.11. Wodorotlenek sodu, roztwór 12 % wagowo.
4.12. Fenoloftaleina, roztwór 1 % w etanolu.
4.13. Gaz nośny: wodór lub hel do chromatografii gazowej.
4.14. Gazy pomocnicze: - wodór w stężeniu minimum 99 %, pozbawiony wilgoci i substancji organicznych - oraz powietrze do chromatografii gazowej o takiej samej czystości.
4.15. Odczynnik wywołujący reakcję sililowania: mieszanina pirydyna/heksametylodisilazan/trimetylochlorosilan w proporcji 9/3/1 (V/V/V) (W handlu dostępne są roztwory gotowe do użycia. Można zastosować również inne odczynniki wywołujące reakcję sililowania, jak np. bis-trimetylosilyltrifluoraocetamid + 1 % trimetylochlorosilan, rozcieńczone taką samą objętością bezwodnika pirydyny).
4.16. Próbki wzorcowe: czyste monoglicerydy lub mieszaniny monoglicerydów o znanym składzie procentowym podobnym do występującego w próbce badanej.
5. PROCEDURA
5.1. Przygotowanie próbki
5.1.1. Oleje o wolnej kwasowości poniżej 3 % nie wymagają zobojętnienia przed wykonaniem chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym. Oleje o wolnej kwasowości powyżej 3 % muszą być zobojętnione zgodnie z ppkt 5.1.1.1.
5.1.1.1. Do lejka o pojemności 1.000 ml (3.13) wlać 50 g oleju i 200 ml n-heksanu. Dodać 100 ml izopropanolu i ilość roztworu wodorotlenku sodu o stężeniu 12 % (4.11) odpowiadającą wolnej kwasowości oleju powiększonej o 5 %. Wstrząsać energicznie przez jedną minutę. Dodać 100 ml wody destylowanej, ponownie wstrząsnąć i odstawić.
Po dekantacji usunąć dolną warstwę mydła. Usunąć także wszystkie pośrednie warstwy (śluzy, substancje nierozpuszczalne). Płukać roztwór heksanu i zobojętnionego oleju kolejnymi porcjami 50-60 ml roztworu izopropanol/woda w proporcji 1/1 (V/V) (4.4), aż zniknie różowa barwa fenoloftaleiny.
Usunąć większość heksanu za pomocą destylacji w próżni (wykorzystać do tego celu na przykład wyparkę obrotową) i przenieść olej do kolby o pojemności 100 ml (3.5). Suszyć olej w próżni do całkowitego usunięcia rozpuszczalnika.
Pod koniec tej czynności kwasowość oleju musi wynosić poniżej 0,5 %.
5.1.2. Wprowadzić 1,0 g oleju przygotowanego w sposób wskazany powyżej do kolby Erlenmeyera o pojemności 25 ml (3.1) i rozpuścić go w 10 ml mieszaniny rozwijającej (4.10). Odstawić roztwór na co najmniej 15 minut przed wykonaniem chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym.
Jeżeli roztwór jest mętny, odwirować go w celu zapewnienia optymalnych warunków wykonywania chromatografii. (Można zastosować gotowe do użycia wkłady żelu krzemionkowego SPE o masie 500 mg).
5.1.3. Przygotowanie kolumny chromatograficznej
Nanieść na kolumnę (3.3) około 30 ml rozpuszczalnika rozwijającego (4.10), za pomocą szklanej pałeczki wprowadzić wacik do dolnej części kolumny; przycisnąć w celu usunięcia powietrza.
Przygotować w zlewce zawiesinę 25 g żelu krzemionkowego (4.1) w około 80 ml rozpuszczalnika rozwijającego i przelać ją do kolumny przy użyciu lejka.
Sprawdzić, czy cały żel krzemionkowy został wprowadzony do kolumny; przemyć rozpuszczalnikiem rozwijającym (4.10), otworzyć kranik i poczekać, aż poziom płynu osiągnie wysokość około 2 mm poniżej górnego poziomu żelu krzemionkowego.
5.1.4. Chromatografia na kolumnie
Do kolby Erlenmeyera o pojemności 25 ml (3.1) odważyć dokładnie 1,0 g próbki przygotowanej zgodnie z ppkt 5.1.
Rozpuścić próbkę w 10 ml rozpuszczalnika rozwijającego (4.10). Wlać roztwór do kolumny chromatograficznej przygotowanej zgodnie z ppkt 5.1.3. Starać się nie poruszyć powierzchni kolumny.
Otworzyć kranik i zlać roztwór próbki, aż osiągnie poziom żelu krzemionkowego. Rozwinąć poprzez dodanie 150 ml rozpuszczalnika rozwijającego. Ustawić szybkość przepływu na 2 ml/min (tak aby 150 ml przeszło przez kolumnę w ciągu około 60-70 minut).
Zebrać odciek z kolumny do wcześniej wytarowanej kolby o pojemności 250 ml. Odparować rozpuszczalnik w próżni i usunąć jego resztkowe pozostałości pod strumieniem azotu.
Zważyć kolbę i obliczyć ilość zebranego ekstraktu.
(W przypadku korzystania z gotowych do użytku wkładów krzemionkowych SPE postępować następująco: wprowadzić 1 ml roztworu (5.1.2) do wkładów przygotowanych wcześniej przy użyciu 3 ml n-heksanu.
Po perkolacji roztworu rozwinąć chromatogram poprzez dodanie 4 ml n-heksanu/eteru dietylowego w proporcji 9/1 (V/V).
Zebrać odciek z kolumny do probówki o pojemności 10 ml i poddać go odparowywaniu do sucha pod strumieniem azotu.
Poddać suchą pozostałość działaniu lipazy trzustkowej (5.2). Bezwzględnie konieczne jest sprawdzenie składu kwasów tłuszczowych przed przepuszczeniem i po przepuszczeniu przez wkład SPE).
5.2. Hydroliza przez lipazę trzustkową
5.2.1. Do probówki do wirowania odważyć 0,1 g oleju przygotowanego zgodnie z ppkt 5.1. Dodać 2 ml roztworu buforowego (4.6), 0,5 ml roztworu cholanu sodu (4.7) i 0,2 ml roztworu chlorku wapnia, dobrze wstrząsając po dodaniu każdej z tych substancji. Zamknąć probówkę szlifowanym korkiem i umieścić ją w termostacie o temperaturze 40 ± 0,5 °C.
5.2.2. Dodać 20 mg lipazy, ostrożnie wstrząsać (nie dopuszczając do zwilżenia korka) i włożyć probówkę do termostatu na dokładnie 2 minuty, następnie wyjąć ją, wstrząsać energicznie i dokładnie przez 1 minutę i odstawić do schłodzenia.
5.2.3. Dodać 1 ml eteru dietylowego, zatkać korkiem i wstrząsać energicznie, następnie odwirować i przenieść roztwór eteru do czystej i suchej probówki przy użyciu mikrostrzykawki.
5.3. Przygotowanie pochodnych silanizowanych i chromatografii gazowej
5.3.1. Przy użyciu mikrostrzykawki wprowadzić 100 μl roztworu (5.2.3) do probówki ze stożkowym dnem o pojemności 10 ml.
5.3.2. Usunąć rozpuszczalnik pod słabym strumieniem azotu, dodać 200 μl odczynnika wywołującego reakcję sililowania (4.15), zatkać probówkę i odstawić na 20 minut.
5.3.3. Po 20 minutach dodać od 1 do 5 ml n-heksanu (zależnie od warunków chromatografowania): uzyskany roztwór jest gotowy do chromatografii gazowej.
5.4. Chromatografia gazowa
Warunki robocze są następujące:
- temperatura urządzenia nastrzykującego (nastrzyk "na kolumnę") niższa od temperatury wrzenia roztworu (68 °C),
- temperatura detektora: 350 °C,
- temperatura kolumny: zaprogramowanie temperatury pieca: 60 °C przez 1 minutę, ze zwiększaniem temperatury o 15 °C na minutę aż do 180 °C, następnie o 5 °C na minutę do 340 °C, następnie 340 °C przez 13 minut,
- gaz nośny: wodór lub hel, z regulacją do odpowiedniej liniowej szybkości przepływu w celu uzyskania rozdzielczości przedstawionej na rysunku 1. Czas retencji triglicerydu C54 musi wynosić 40 ± 5 minut (patrz: rysunek 2); (Wskazane powyżej warunki robocze zostały zaproponowane orientacyjnie. Każdy operator musi je zoptymalizować w celu uzyskania pożądanej rozdzielczości. Wysokość piku odpowiadającego 2-monopalmitynianowi glicerolu musi wynosić minimum 10 % skali rejestratora),
- ilość nastrzykiwanej substancji: 0,5-1 μl roztworu (5 ml) n-heksanu (5.3.3.).
5.4.1. Identyfikacja pików
Poszczególne monoglicerydy są identyfikowane według czasów retencji oraz przez porównanie z pikami uzyskanymi ze standardowymi mieszaninami monoglicerydów analizowanymi w tych samych warunkach.
5.4.2. Ocena ilościowa
Oblicza się pole pod każdym pikiem przy użyciu elektronicznego integratora.
6. PREZENTACJA WYNIKÓW
Zawartość procentową monopalmitynianu glicerolu oblicza się na podstawie stosunku pola pod odpowiednim pikiem do sumy pól pod pikami wszystkich monoglicerydów (patrz: rysunek 2), na podstawie wzoru:
Glyceril monopalmitate (%):
gdzie:
Ax = pole pod pikiem odpowiadającym monopalmitynianowi glicerolu
ΣA = suma pól pod wszystkimi pikami monoglicerydów
Wynik należy podać z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.
7. SPRAWOZDANIE Z ANALAIZY
Sprawozdanie z testu powinno zawierać:
- odwołanie do niniejszej metody,
- wszelkie informacje niezbędne do pełnej identyfikacji próbki,
- wynik analizy,
- wszelkie odchylenia od metody będące wynikiem decyzji zainteresowanych stron lub zaistniałe z innego powodu,
- dane identyfikujące laboratorium, datę analizy i podpisy osób odpowiedzialnych za tę ostatnią.
Rysunek 1
Chromatogram produktów reakcji sililowania uzyskanych po zadziałaniu lipazą na rafinowaną oliwę z oliwek, do której dodano 20 % zestryfikowanego oleju (100 %)
Objaśnienie: "Acides gras libres" = Wolne kwasy tłuszczowe; "Huile d'olive raffinée" = Rafinowana oliwa z oliwek - "+ 20 % huile estérifiée" = + 20 % oliwa z oliwek estryfikowana; "1-2 monopalmitine" = 1-2 monopalmityn - "1-2 monopalmitoléine" = 1-2 monopalmitoleina; "1-2 mono C18 insat." = 1-2 mono C18 nenasyc.; Squalène = Skwalen
Rysunek 2
Chromatogram:
A) nie estryfikowanej oliwy z oliwek, po zadziałaniu na nią lipazą; po sililowaniu; w podanych warunkach (kolumna kapilarna 8-12 m) frakcja wosków ulega elucji równocześnie z frakcją diglicerydów lub nieco później.
Po zadziałaniu lipazą zawartość triglicerydów nie powinna przekraczać 15 %.
Objaśnienie:
1 = Wolne kwasy tłuszczowe
2 = Monoglicerydy
3 = Diglicerydy
4 = Triglicerydy
* = 2-monopalmityn
** = Trigliceryd C54
Chromatogram:
B) oliwy estryfikowanej po zadziałaniu lipazą; po sililowaniu; w tych warunkach (kolumna kapilarna 8-12 m) frakcja wosków ulega elucji równocześnie z frakcją diglicerydów lub nieco później.
Po zadziałaniu lipazą zawartość triglicerydów nie powinna przekraczać 15 %.
Objaśnienie:
1 = Wolne kwasy tłuszczowe
2 = Monoglicerydy
3 = Diglicerydy
4 = Triglicerydy
* = 2-monopalmityn
** = Trigliceryd C54
8. UWAGI
Uwaga 1. PRZYGOTOWANIE LIPAZY
W handlu dostępne są lipazy o zadowalającej aktywności. Możliwe jest również ich przygotowanie w laboratorium w następujący sposób:
Schłodzić w 0 °C 5 kg świeżej trzustki wieprzowej. Usunąć tłuszcz stały i otaczającą go tkankę łączną i utrzeć w młynku do uzyskania płynnej pasty. Wymieszać tę pastę z 2,5 litra bezwodnego acetonu w czasie od 4 do 6 godzin, następnie odwirować. Poddać pozostałość jeszcze trzykrotnej ekstrakcji taką samą objętością bezwodnego acetonu, a następnie dwukrotnej ekstrakcji mieszaniną acetonu i eteru dietylowego w stosunku 1 do 1 (V/V) i dwukrotnej ekstrakcji eterem dietylowym.
Suszyć pozostałość w próżni przez 48 godzin w celu uzyskania stabilnego proszku nadającego się do przechowywania przez dłuższy czas w lodówce, w miejscu chronionym przed wilgocią.
Uwaga 2. KONTROLA DZIAŁANIA LIPAZY
Przygotować emulsję oliwy z oliwek w następujący sposób:
Wstrząsać przez 10 minut w mieszadle mieszaninę składającą się ze 165 ml roztworu gumy arabskiej o stężeniu 100 g/l, 15 g skruszonego lodu i 20 ml wcześniej zobojętnionej oliwy z oliwek.
Do zlewki o pojemności 50 ml wlać 10 ml tej emulsji, a następnie 0,3 ml roztworu cholanu sodu o stężeniu 0,2 g/ml i 20 ml wody destylowanej.
Umieścić zlewkę w termostacie, którego temperatura utrzymywana jest na poziomie 37 °C; umieścić w nim elektrody pH-metru i mieszadło spiralne.
Za pomocą biurety dodawać kroplami 0,1 N roztwór wodorotlenku sodu, aż pH osiągnie wartość 8,3.
Dodać dostateczną objętość wodnej zawiesiny lipazy w proszku (0,1 g/ml lipazy). Z chwilą gdy pH-metr wskaże 8,3, włączyć stoper i rozpocząć wkraplanie roztworu wodorotlenku sodu z prędkością umożliwiającą utrzymanie pH na poziomie 8,3. Co minutę zapisywać objętość zużytego roztworu.
Nanieść zanotowane wartości na diagram, zaznaczając na osi odciętych czas, a na osi rzędnych liczby mililitrów 0,1 N roztworu zasadowego zużytego w celu utrzymania stałego pH. W wyniku tego powinno się otrzymać linię prostą.
Aktywność lipazy wyrażoną w jednostkach lipazowych na mg oblicza się według następującego wzoru:
gdzie:
A oznacza aktywność w jednostkach lipazowych/mg
V oznacza liczbę mililitrów 0,1 N roztworu wodorotlenku sodu na minutę (obliczoną na podstawie wykresu)
N oznacza normalność roztworu wodorotlenku sodu
M oznacza masę w mg oznaczanej lipazy.
Jednostkę lipazową definiuje się jako ilość enzymu uwalniającą 10 mikroekwiwalentów kwasu na minutę.
ZAŁĄCZNIK IX 39
BADANIE SPEKTROFOTOMETRYCZNE W ULTRAFIOLECIE
BADANIE SPEKTROFOTOMETRYCZNE W ULTRAFIOLECIE
Dzięki badaniu spektrofotometrycznemu w ultrafiolecie można uzyskać informacje o jakości substancji tłuszczowej, jej stanie zachowania i zmianach wywołanych procesami technologicznymi. Efekty absorpcji fal o długości ustalonej w tej metodzie wywołane są obecnością sprzężonych systemów dienowych i trienowych wynikającą z utleniania lub rafinacji. Wielkość takiej absorpcji jest wyrażana jako właściwa gęstość optyczna E11 %cm (gęstość optyczna 1 % w/v roztworu substancji tłuszczowej w określonym rozpuszczalniku w ogniwie 10 mm) oznaczona zgodnie z konwencją jako K (zwana również "współczynnikiem ekstynkcji").
1. ZAKRES
W niniejszym załączniku opisuje się procedurę przeprowadzania badania spektrofotometrycznego oliwy z oliwek w zakresie ultrafioletu.
2. PODSTAWOWA ZASADA METODY
Próbkę rozpuszcza się w wymaganym rozpuszczalniku, a następnie mierzy się absorbancję roztworu dla określonych długości fal w porównaniu z czystym rozpuszczalnikiem.
Właściwą gęstość optyczną oblicza się przy 232 nm i 268 nm w izooktanie lub przy 232 nm i 270 nm w cykloheksanie dla stężenia 1 % w/v w ogniwie 10 mm.
3. URZĄDZENIA
3.1. Spektrofotometr odpowiedni do pomiarów długości fal ultrafioletowych (220 nm do 360 nm) z możliwością odczytu pojedynczych jednostek nanometrycznych. Zaleca się regularną kontrolę dokładności i odtwarzalności skal absorbancji i długości fal, a także kontrolę światła rozproszonego.
3.1.1. Skala długości fal: Można ją sprawdzić poprzez zastosowanie materiału wzorcowego złożonego z filtra ze szkła optycznego zawierającego tlenek holmu lub roztwór tlenku holmu (zamkniętego hermetycznie lub nieherme-tycznie) o wyraźnych pasmach absorpcyjnych. Materiały wzorcowe służą do weryfikacji i kalibracji skali długości fal w spektrofotometrach w świetle widzialnym i ultrafiolecie o nominalnej spektralnej szerokości wiązki do 5 nm. Pomiary są wykonywane względem próbki wzorcowej z powietrzem otoczenia w zakresie długości fal od 640 do 240 nm, według instrukcji załączonej do materiałów wzorcowych. Przeprowadzana jest korekta bazowa przy pustym torze wiązki dla każdej zmiany szerokości szczeliny. Długości fal dla normy są wymienione w certyfikacie materiału wzorcowego.
3.1.2. Skala absorbancji: Można ją sprawdzić z użyciem dostępnych w sprzedaży hermetycznie zamkniętych materiałów wzorcowych złożonych z kwasowych roztworów dichromianu potasu o określonych stężeniach i certyfikowanych wartościach absorbancji przy λmax (4 roztwory dichromianu potasu w kwasie nadchlorowym szczelnie zamkniętych w czterech kwarcowych ogniwach ultrafioletowych do pomiaru wartości referencyjnej liniowości i dokładności fotometrycznej w ultrafiolecie). Pomiary roztworów dichromianu potasu są wykonywane względem próbki wzorcowej użytego kwasu, po dokonaniu korekty bazowej, według instrukcji załączonej do materiału wzorcowego. Wartości absorbancji są wymienione w certyfikacie materiału wzorcowego.
Inną możliwością sprawdzenia reakcji ogniwa fotoelektrycznego i powielacza fotoelektrycznego jest następująca procedura: odważyć 0,2000 g czystego chromianu potasu do badań spektrofotometrycznych, rozpuścić w roztworze 0,05 N wodorotlenku potasu i dopełnić do kreski w kolbie o pojemności 1 000 ml. Następnie pobrać dokładnie 25 ml otrzymanego roztworu i przenieść do kolby miarowej o pojemności 500 ml, po czym uzupełnić do kreski tym samym roztworem wodorotlenku potasu.
Zmierzyć gęstość optyczną otrzymanego w ten sposób roztworu dla długości fali 275 nm, używając roztworu wodorotlenku potasu jako wzorca. Gęstość optyczna zmierzona przy użyciu kuwety o grubości 1 cm powinna wynosić 0,200 ± 0,005.
3.2. Prostokątne kuwety kwarcowe z pokrywą, odpowiednie do pomiarów przy długości fal ultrafioletowych (220- 360 nm) o długości drogi optycznej 10 mm. Po napełnieniu ich wodą lub innym odpowiednim rozpuszczalnikiem kuwety nie powinny się różnić między sobą o więcej niż 0,01 jednostki gęstości optycznej.
3.3. Kolby miarowe z miarką, pojemność 25 ml, klasa A.
3.4. Waga analityczna z dokładnością odczytu do najbliższego 0,0001 g.
4. ODCZYNNIKI
W trakcie analizy, jeżeli nie ma innych wskazań, stosuje się jedynie odczynniki o uznanej klasie analitycznej oraz wodę destylowaną lub demineralizowaną lub wodę o równorzędnej czystości.
Rozpuszczalnik: izooktan (2,2,4-trimetylopentan) do pomiarów przy 232 nm i 268 nm i cykloheksan do pomiarów przy 232 nm i 270 nm, przy czym absorbancja wynosi mniej niż 0,12 przy 232 nm i mniej niż 0,05 przy 270 nm w stosunku do wody destylowanej; pomiar w ogniwie 10 mm.
5. PROCEDURA
5.1. Próbka musi być całkowicie jednorodna i pozbawiona wszelkich zanieczyszczeń występujących w postaci zawiesiny. W przeciwnym razie musi zostać przefiltrowana przez filtr papierowy w temperaturze około 30 °C.
5.2. Odważyć około 0,25 g (z dokładnością do najbliższego 1 mg) przygotowanej w ten sposób próbki w kolbie miarowej o pojemności 25 ml, uzupełnić wskazanym rozpuszczalnikiem do kreski i poddać homogenizacji. Uzyskany roztwór musi być idealnie przezroczysty. W razie wystąpienia opalizacji lub mętnienia przefiltrować szybko przez filtr papierowy.
UWAGA: Zasadniczo próbka 0,25-0,30 g jest wystarczająca do pomiarów absorbancji oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia i oliwy z oliwek najwyższej jakości z pierwszego tłoczenia przy 268 nm i 270 nm. Dla pomiarów 232 nm zazwyczaj wymaga się próbki 0,05 g, przygotowuje się zatem dwa oddzielne roztwory. W pomiarach absorbancji oliwy z wytłoczyn z oliwek, rafinowanej oliwy z oliwek oraz fałszowanej oliwy z oliwek potrzebna jest zazwyczaj mniejsza próbka, np. 0,1 g, ze względu na większą absorbancję tych oliw.
5.3. Jeżeli jest to konieczne, przeprowadzić korektę bazową (220-290 nm) rozpuszczalnikiem w obu ogniwach kwarcowych (próbka i materiał wzorcowy), a następnie wypełnić ogniwo kwarcowe próbki badanym roztworem i zmierzyć gęstość optyczną przy 232, 268 lub 270 nm względem rozpuszczalnika wzorcowego.
Zarejestrowane wartości gęstości optycznej muszą mieścić się w przedziale od 0,1 do 0,8 lub w przedziale liniowości spektrofotometru, którą należy zweryfikować. Jeżeli się nie mieszczą, należy powtórzyć pomiary, stosując odpowiednio silniejsze lub słabsze roztwory.
5.4. Po dokonaniu pomiaru absorbancji przy 268 lub 270 nm, zmierzyć absorbancję przy λmax, λmax+4 i λmax-4. Uzyskanych wartości absorbancji używa się do określenia zmienności właściwej gęstości optycznej (ΔΚ).
UWAGA: λmax jest przyjmowane za 268 nm dla izooktanu używanego jako rozpuszczalnik i 270 nm dla cykloheksanu.
6. PREZENTACJA WYNIKÓW
6.1. Należy zarejestrować właściwe gęstości optyczne (współczynniki ekstynkcji) dla różnych długości fal, obliczając je w następujący sposób:
gdzie:
Kλ = właściwa gęstość optyczna przy długości fali λ;
Eλ = gęstość optyczna zmierzona przy długości fali λ;
c = stężenie roztworu w g/100 ml;
s = droga optyczna ogniwa kwarcowego w cm;
z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku.
6.2. Zmienność właściwej gęstości optycznej (ΔΚ)
Zmienność wartości bezwzględnej gęstości (ΔΚ) oblicza się według wzoru:
gdzie Km oznacza właściwą gęstość optyczną przy długości fali dla maksymalnej absorpcji 270 nm i 268 nm w zależności od zastosowanego rozpuszczalnika.
Wynik należy podać z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku.
ZAŁĄCZNIK XII 41
METODA MIĘDZYNARODOWEJ RADY DS. OLIWY SŁUŻĄCA DO ORGANOLEPTYCZNEJ OCENY OLIWY Z OLIWEK Z PIERWSZEGO TŁOCZENIA
METODA MIĘDZYNARODOWEJ RADY DS. OLIWY SŁUŻĄCA DO ORGANOLEPTYCZNEJ OCENY OLIWY Z OLIWEK Z PIERWSZEGO TŁOCZENIA
Celem międzynarodowej metody opisanej w niniejszym załączniku jest określenie procedury oceny organoleptycznych cech charakterystycznych oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia w rozumieniu pkt 1 w części VIII załącznika VII do rozporządzenia Parlamentu Europejskiego i Rady (UE) nr 1308/2013 42 oraz ustanowienie metody jej klasyfikacji w oparciu o wspomniane cechy charakterystyczne. Metoda ta zawiera również wskazania w zakresie nieobowiązkowego etykietowania.
Opisywana metoda ma zastosowanie jedynie do oliw z oliwek z pierwszego tłoczenia oraz do klasyfikacji lub etykietowania takich rodzajów oliwy, uwzględniając intensywność dostrzeżonych wad oraz owocowości, określaną przez grupę wybranych, przeszkolonych i nadzorowanych degustatorów tworzących zespół.
Normy IOC wymienione w niniejszym załączniku stosowane są w ich najnowszej dostępnej wersji.
2. OGÓLNE SŁOWNICTWO PODSTAWOWE STOSOWANE DO CELÓW ANALIZY SENSORYCZNEJ
W celu uzyskania szczegółów zob. norma IOC/T.20/Doc. No 4 "Sensory Analysis: General Basic Vocabulary".
3. SŁOWNICTWO SPECJALNE
3.1. Cechy negatywne
Zleżały/błotnisty osad charakterystyczny smak lub zapach oliwy uzyskanej z oliwek ułożonych w stosach lub przechowywanych w takich warunkach, jakie panują w zaawansowanym stadium fermentacji beztlenowej, lub oliwy, która miała bezpośredni kontakt z osadem powstającym w podziemnych zbiornikach i kadziach i która także przeszła proces fermentacji beztlenowej.
Stęchło-wilgotn-oziemisty charakterystyczny smak lub zapach oliwy uzyskanej z owoców zaatakowanych przez znaczne ilości grzybów i drożdży na skutek przechowywania ich w wilgoci przez kilka dni lub oliwy uzyskanej z oliwek zabrudzonych ziemią lub błotem i nieumytych.
Winno-octowo-kwaśno-kwaskowy charakterystyczny smak lub zapach niektórych rodzajów oliwy przypominający wino lub ocet. Ten smak i zapach jest głównie efektem procesu fermentacji tlenowej oliwek lub rozgniecionych oliwek pozostawionych na niedokładnie oczyszczonych matach służących do ich wyciskania, na skutek czego powstał kwas octowy, octan etylu i etanol.
Zjełczały smak lub zapach oliwy, która uległa intensywnemu utlenianiu.
Przemrożone oliwki (wilgotne drewno) charakterystyczny smak lub zapach oliwy pozyskanej z oliwek, które przemarzły na drzewie.
3.1.1. Pozostałe cechy negatywne
| Zapach gotowania lub spalenizny | charakterystyczny zapach oliwy spowodowany nadmiernym lub długotrwałym podgrzewaniem podczas przetwarzania, w szczególności podczas termougniatania masy, jeżeli proces ten prowadzony jest w niewłaściwych warunkach termicznych. |
| Zapach siana i drewna | charakterystyczny zapach niektórych rodzajów oliwy wyprodukowanych z wysuszonych oliwek. |
| Szorstkie wrażenie | charakterystyczne wrażenie, jakie dają niektóre rodzaje starszej oliwy, których degustacja pozostawia w ustach uczucie gęstości i maziowatości. |
| Zapach smaru | zapach oliwy przypominający zapach oleju napędowego, smaru lub oleju mineralnego. |
| Zapach wody pochodzenia roślinnego | zapach, którego oliwa nabrała na skutek długotrwałego kontaktu z wodą pochodzenia roślinnego, która przeszła proces fermentacji. |
| Smak solanki | smak oliwy pozyskanej z oliwek zakonserwowanych w solance. |
| Metaliczny | smak lub zapach przypominający metal. Jest charakterystyczny dla oliwy, która miała długotrwały kontakt z powierzchniami metalicznymi w trakcie rozdrabniania, ugniatania, wyciskania lub przechowywania. |
| Zapach ostnicy | charakterystyczny zapach oliwy uzyskanej z oliwek wyciskanych przy pomocy nowych matwykonanych z ostnicy. Zapach ten może różnić się w zależności od tego, czy maty te wykonane są ze świeżej, czy z suchej ostnicy. |
| Zapach robaczywych owoców | zapach oliwy uzyskanej z oliwek silnie zaatakowanych przez larwy muszki oliwnej (Bactrocera oleae). |
| Smak ogórka | smak oliwy powstający w wyniku zbyt długiego przechowywania w zamkniętym hermetycznie opakowaniu, w szczególności w pojemnikach z blachy cynowanej, przypisywany powstawaniu 2,6-nonadienalu. |
3.2. Cechy pozytywne
Owocowy charakterystyczny dla oliwy ogół doznań węchowych, zależnych od odmiany oliwek, właściwych dla oliwy z oliwek uzyskanej ze zdrowych i świeżych oliwek, dojrzałych lub niedojrzałych. Doznania te odbierane są bezpośrednio lub poprzez jamę nosowo-gardłową.
Gorzki charakterystyczny, podstawowy smak oliwy uzyskanej z oliwek zielonych lub będących na etapie dojrzewania. Wyczuwalny jest za pomocą brodawek okolonych układających się w tylnej części języka w kształt litery V.
Ostry wrażenie szczypania charakterystyczne dla rodzajów oliwy produkowanych na początku roku posadzenia, w szczególności z oliwek jeszcze niedojrzałych. Wrażenie to daje się odczuć w całej jamie ustnej, a w szczególności w gardle.
3.3. Nieobowiązkowa terminologia stosowana do celów etykietowania
Na żądanie kierownik zespołu degustatorów może potwierdzić, że oceniane oliwy są zgodne z definicjami i przedziałami odpowiadającymi wyłącznie następującym określeniom, w zależności od stopnia intensywności i percepcji cech oliwy.
Cechy pozytywne (owocowy, gorzki i ostry): w odniesieniu do intensywności percepcji:
- określenie mocny stosuje się, jeżeli mediana danej cechy jest wyższa niż 6,0;
- określenie średni stosuje się, jeżeli mediana danej cechy jest wyższa niż 3,0 oraz nie wyższa niż 6,0;
- określenie lekki stosuje się, jeżeli mediana danej cechy jest nie wyższa niż 3,0.
Owocowy charakterystyczny dla oliwy ogół doznań węchowych, zależnych od odmiany oliwek, właściwych dla oliwy z oliwek uzyskanej ze zdrowych i świeżych oliwek, niezdominowanej zapachem ani zielonych, ani dojrzałych oliwek. Doznania te odbierane są bezpośrednio lub poprzez jamę nosowo-gardłową.
Owocowy niedojrzały charakterystyczny dla oliwy ogół doznań węchowych przypominających zapach niedojrzałych owoców, zależnych od odmiany oliwek i właściwych dla oliwy z oliwek uzyskanej z zielonych, zdrowych i świeżych oliwek. Doznania te odbierane są bezpośrednio lub poprzez jamę nosowo-gardłową.
Owocowy dojrzały charakterystyczny dla oliwy ogół doznań węchowych przypominających zapach dojrzałych owoców, zależnych od odmiany oliwek, właściwych dla oliwy z oliwek uzyskanej ze zdrowych i świeżych oliwek. Doznania te odbierane są bezpośrednio lub poprzez jamę nosowo-gardłową.
Oliwa zrównoważona oliwa, która nie wykazuje braku równowagi, co oznacza wrażenie węchowo-smakowe i dotykowe, w którym mediana goryczy i mediana ostrego smaku są co najwyżej o dwa punkty wyższe od mediany owocowego smaku/zapachu.
Oliwa łagodna oliwa, w odniesieniu do której mediana goryczy i ostrego smaku jest niższa lub równa 2,0.
Wykaz określeń w odniesieniu do intensywności percepcji:
| Określenia pod warunkiem przedstawienia świadectwa badania organoleptycznego | Mediana danej cechy |
| Owocowy | - |
| Owocowy dojrzały | - |
| Owocowy niedojrzały | - |
| Lekko owocowy | ≤ 3,0 |
| Średnio owocowy | 3,0 < Me ≤ 6,0 |
| Mocno owocowy | > 6,0 |
| Owocowy lekko dojrzały | ≤ 3,0 |
| Owocowy średnio dojrzały | 3,0 < Me ≤ 6,0 |
| Owocowy mocno dojrzały | > 6,0 |
| Owocowy lekko niedojrzały | ≤ 3,0 |
| Owocowy średnio niedojrzały | 3,0 < Me ≤ 6,0 |
| Owocowy mocno niedojrzały | > 6,0 |
| Lekko gorzki | ≤ 3,0 |
| Średnio gorzki | 3,0 < Me ≤ 6,0 |
| Mocno gorzki | > 6,0 |
| Lekko ostry | ≤ 3,0 |
| Średnio ostry | 3,0 < Me ≤ 6,0 |
| Mocno ostry | > 6,0 |
| Oliwa zrównoważona | Mediana goryczy i mediana ostrego smaku są co najwyżej o dwa punkty wyższe od mediany owocowego smaku/zapachu. |
| Oliwa łagodna | Mediana goryczy i mediana ostrego smaku nie przekraczają 2,0." |
4. POJEMNIK SZKLANY PRZEZNACZONY DO DEGUSTACJI OLIWY
W celu uzyskania szczegółów zob. norma IOC/T.20/Doc. No 5 "Glass for Oil Tasting".
5. POMIESZCZENIE DO BADANIA
W celu uzyskania szczegółów zob. norma IOC/T.20/Doc. No 6 "Guide for the Installation of a Test Room".
6. WYPOSAŻENIE
W każdej kabinie należy zapewnić następujące wyposażenie, niezbędne dla degustatorów, aby mogli poprawnie wykonywać swoje zadanie, oraz łatwy dostęp do tego wyposażenia:
- szklanki (standardowe) oznaczone kodem liczbowym, zawierające próbki, przykryte szkłem zegarkowym i przechowywane w temperaturze 28 ° ± 2 °C;
- formularz oceny (zob. rysunek 1) w wersji drukowanej lub elektronicznej, pod warunkiem że spełnia ona wymogi dotyczące formularza oceny, w razie potrzeby wraz z instrukcją wypełniania tego formularza;
- długopis lub nieścieralny tusz;
- tace z pokrojonym jabłkiem lub z wodą, wodą gazowaną lub sucharkami;
- szklanka wody o temperaturze otoczenia;
- formularz zawierający ogólne zasady wymienione w sekcjach 8.4 i 9.1.1;
- spluwaczki.
7. KIEROWNIK ZESPOŁU I DEGUSTATORZY
7.1. Kierownik zespołu
Kierownik zespołu musi być osobą starannie wyszkoloną, posiadającą szczegółową wiedzę na temat różnych rodzajów oliwy, jakie będą poddawane ocenie w trakcie pracy zespołu. Kierownik jest najważniejszą osobą w zespole i jest on odpowiedzialny za jego organizację i funkcjonowanie.
Praca kierownika zespołu wymaga podstawowego szkolenia w zakresie narzędzi analizy sensorycznej, umiejętności sensorycznych, skrupulatności w przygotowywaniu, organizacji i przeprowadzaniu badań oraz umiejętności i cierpliwości niezbędnych do planowania i wykonywania badań w sposób naukowy.
Kierownik zespołu jest jedyną osobą odpowiedzialną za wybór, szkolenie i nadzorowanie degustatorów celem ustalenia poziomu ich zdolności. Jest on zatem odpowiedzialny za ocenę degustatorów, która zawsze musi być obiektywna i w odniesieniu do której musi on opracować szczegółowe procedury oparte na badaniach oraz rzetelne kryteria przyjmowania i odrzucania. Zob. norma IOC/T.20/Doc. No 14 "Guide for the selection, training and monitoring of skilled virgin olive oil tasters".
Kierownicy zespołu są odpowiedzialni za efektywność pracy zespołu, a co za tym idzie za jej ocenę, której rzetelny i obiektywny dowód muszą przedstawić. W każdym przypadku muszą zawsze wykazać, że metoda i degustatorzy znajdują się pod kontrolą. Zaleca się okresowe dobieranie zespołu (IOC/T.20/Doc. No 14, § 5).
Ponoszą oni ostateczną odpowiedzialność za prowadzenie rejestrów zespołu. Rejestry te muszą zawsze być identyfikowalne. Kierownicy muszą przestrzegać wymogów w zakresie zapewnienia jakości, określonych w międzynarodowych normach dotyczących analizy sensorycznej oraz w każdym przypadku gwarantować anonimowość próbek.
Są oni odpowiedzialni za inwentaryzację i zapewnienie dokładnego czyszczenia i konserwacji aparatury i sprzętu niezbędnych do przestrzegania specyfikacji tej metody oraz przechowują pisemne dowody potwierdzające to oraz dowody zgodności z wymogami dotyczącymi analizy.
Są odpowiedzialni za odbiór i przechowywanie próbek po ich dostarczeniu do laboratorium oraz za ich przechowywanie po przeprowadzeniu badania. W ten sposób kierownicy zapewniają każdorazowo anonimowość i odpowiednie przechowywanie próbek, przy czym do tego celu muszą opracować pisemne procedury, aby zapewnić identyfikowalność procesu i gwarancje jego prawidłowości.
Ponadto są odpowiedzialni za przygotowywanie, kodowanie i podawanie próbek degustatorom, zgodnie z odpowiednim doświadczalnie ustalonym schematem dostosowanym do wcześniej ustanowionych protokołów oraz za gromadzenie danych uzyskanych przez degustatorów i ich statystyczne przetwarzanie.
Kierownicy odpowiadają za opracowywanie i sporządzanie projektów pozostałych procedur, które mogą być konieczne dla uzupełnienia tej normy oraz zapewnienia poprawnego funkcjonowania zespołu.
Muszą poszukiwać sposobów porównywania wyników zespołu z wynikami otrzymywanymi przez inne zespoły zajmujące się analizą oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia w celu ustalenia, czy zespół funkcjonuje poprawnie.
Obowiązkiem kierownika zespołu jest motywowanie jego członków poprzez stymulowanie ich zainteresowania, ciekawości i atmosfery konkurencyjności między nimi. W związku z tym zdecydowanie zaleca się kierownikom, aby zapewniali sprawny przepływ informacji między sobą a członkami zespołu, informując ich o wszystkich wykonywanych przez nich zadaniach i otrzymywanych wynikach. Ponadto kierownicy dbają, aby ich opinia nie była znana i nie dopuszczają, aby ewentualni kierownicy narzucali swoje kryteria pozostałym degustatorom.
Kierownicy wzywają degustatorów z odpowiednim wyprzedzeniem i udzielają im odpowiedzi na wszelkie pytania dotyczące przeprowadzania oceny, ale powstrzymują się od sugerowania swoich opinii na temat próbek.
7.1.1. Zastępca kierownika zespołu
Kierownik zespołu degustatorów może, w uzasadnionych przypadkach, być zastępowany przez zastępcę kierownika zespołu, który może zastępować go w obowiązkach związanych z przeprowadzaniem badań. Zastępca musi mieć wszystkie niezbędne umiejętności wymagane od kierownika zespołu.
7.2. Degustatorzy
Osoby pełniące funkcje degustatorów w ocenie organoleptycznych właściwości oliwy z oliwek wykonują swoje zadania dobrowolnie. Zaleca się zatem kandydatom składanie wniosków w formie pisemnej. Kandydaci są wybierani, szkoleni i nadzorowani przez kierownika zespołu, z uwzględnieniem ich umiejętności w zakresie rozróżniania podobnych próbek; należy pamiętać, że ich dokładność ulegnie poprawie dzięki szkoleniom.
Degustatorzy muszą zachowywać się jak prawdziwi obserwatorzy sensoryczni, odkładając na bok swoje osobiste gusty i przedstawiając jedynie wrażenia, jakie odbierają. W związku z tym muszą zawsze pracować w ciszy, w sposób nierestrykcyjny i bez pośpiechu, w pełni skupiając swoją sensoryczną uwagę na poddawanej degustacji próbce.
Każde badanie wymaga obecności 8-12 degustatorów, warto jest jednak mieć kilku dodatkowych degustatorów w rezerwie, w razie potrzeby zastąpienia nieobecnych degustatorów.
8. WARUNKI BADANIA
8.1. Prezentacja próbki
Próbki oliwy poddawanej analizie podaje się w standardowych szklankach do degustacji spełniających wymagania normy IOC/T.20/Doc. No 5 "Glass for oil tasting".
Szklanka zawiera 14-16 ml oliwy lub, jeżeli szklanki mają być ważone, 12,8-14,6 g oliwy i jest zakryta szkłem zegarkowym.
Każda szklanka oznaczona jest kodem składającym się z cyfr lub kombinacji losowo wybranych liter i cyfr. Oznaczenia kodem dokonuje się za pomocą bezwonnego systemu.
8.2. Badanie i temperatura próbek
Podczas badania próbki oliwy przeznaczone do degustacji przechowywane są w szklankach w temperaturze 28 °C ± 2 °C. Temperaturę taką wybrano, ponieważ obserwowanie różnic organoleptycznych w tej temperaturze jest łatwiejsze niż w temperaturze otoczenia i ponieważ w niższych temperaturach związki aromatyczne charakterystyczne dla tych rodzajów oliwy są słabo uwalniane, natomiast wyższe temperatury prowadzą do powstawania substancji lotnych, charakterystycznych dla ogrzewanych olejów. W celu uzyskania informacji na temat metody, którą należy stosować do ogrzewania próbek w szklankach, zob. norma IOC/T.20/Doc. No 5 "Glass for Oil Tasting".
Temperatura w pomieszczeniu, w którym odbywa się badanie, musi wynosić 20-25 °C (zob. norma IOC/T.20/ Doc. No 6).
8.3. Czas badania
Najlepszą porą na przeprowadzanie degustacji oliwy są godzinny ranne. Udowodniono, że w ciągu dnia występują optymalne okresy percepcji zmysłu smaku i zapachu. Posiłki są poprzedzone okresem, w którym wrażliwość zapachowosmakowa wzrasta, natomiast po posiłku percepcja ta maleje.
Kryterium to nie powinno jednak być traktowane w sposób absolutny, ponieważ uczucie głodu może rozpraszać degustatorów, wpływając niekorzystnie na ich zdolność dyskryminacyjną; zaleca się zatem, aby degustacje odbywały się między godziną 10:00 rano a 12:00 w południe.
8.4. Degustatorzy: ogólne zasady postępowania
Poniższe zalecenia mają zastosowanie do postępowania degustatorów podczas ich pracy.
W przypadku wezwania przez kierownika zespołu do uczestniczenia w ocenie organoleptycznej, degustatorzy powinni być w stanie stawić się w uprzednio ustalonym terminie oraz powinni uwzględnić następujące zalecenia:
- nie palić papierosów ani nie pić kawy co najmniej na 30 minut przed ustalonym terminem oceny;
- nie używać żadnych substancji zapachowych, kosmetyków lub mydła, których zapach mógłby utrzymać się do czasu badania; używać bezzapachowego mydła do mycia rąk, które należy następnie opłukiwać i suszyć tak często, jak wymaga tego wyeliminowanie wszystkich zapachów;
- nie jeść niczego co najmniej na godzinę przed przeprowadzeniem oceny;
- w przypadku złego samopoczucia, w szczególności jeżeli ma ono wpływ na ich zmysł węchu lub smaku lub na skutek efektu psychologicznego uniemożliwiającego skupienie się na pracy, degustatorzy muszą powstrzymać się od przeprowadzenia degustacji i poinformować o tym kierownika zespołu;
- jeżeli degustatorzy spełniają powyższe wymagania, zajmują przydzielone im miejsca w kabinach w sposób zdyscyplinowany, zachowując ciszę.
- muszą ostrożnie przeczytać instrukcje znajdujące się w formularzu oceny i nie przystępować do badania próbki, dopóki nie będą w pełni przygotowani do wykonania tego zadania (zrelaksowani i spokojni). W przypadku pojawienia się jakichkolwiek wątpliwości degustatorzy powinni na osobności zasięgnąć rady kierownika zespołu;
- podczas wykonywania swoich zadań muszą zachować milczenie;
- aby nie zakłócać koncentracji i pracy swoich koleżanek i kolegów, degustatorzy zawsze wyłączają swoje telefony komórkowe.
9. PROCEDURA OCENY ORGANOLEPTYCZNEJ I KLASYFIKACJA OLIWY Z OLIWEK Z PIERWSZEGO TŁOCZENIA
9.1. Metoda degustacji
9.1.1. Degustatorzy podnoszą szklankę, nie zdejmując z niej szkła zegarkowego, i lekko ją przechylają; następnie w tej pozycji wykonują pełny obrót szklanki, tak aby wnętrze szklanki było w jak największym stopniu zwilżone. Po zakończeniu tego etapu degustatorzy zdejmują szkło zegarkowe i wąchają próbkę, wykonując powolne, głębokie oddechy w celu dokonania oceny oliwy. Wąchanie oliwy nie powinno trwać dłużej niż 30 sekund. Jeżeli w tym czasie degustator nie wyciągnie żadnego wniosku, musi zrobić krótką przerwę zanim podejmie kolejną próbę.
Po zakończeniu badania zapachu degustatorzy oceniają wrażenie podpoliczkowe (ogólne retronosowe wrażenie zapachu, smaku i dotyku). Aby dokonać takiej oceny, degustatorzy biorą do ust. mały łyk oliwy o objętości około 3 ml. Niezwykle ważne jest rozprowadzenie oliwy na całej powierzchni jamy ustnej, od przedniej części ust. i języka, poprzez boczne obszary jamy ustnej, do tylnej części jamy oraz podniebienia i gardła, ponieważ wiadomo jest, że intensywność percepcji smaków i wrażeń dotykowych różni się w zależności od obszaru języka, podniebienia i gardła.
Należy podkreślić, że istotne jest bardzo powolne rozprowadzenie dostatecznej ilości oliwy na tylnej części języka w kierunku podniebienia i jednoczesne koncentrowanie się na kolejności, w jakiej pojawiają się wrażenia goryczy i cierpkości. Jeżeli degustator nie postąpi w taki sposób, w przypadku niektórych rodzajów oliwy oba te bodźce smakowe mogą umknąć jego uwadze lub cierpkość może zagłuszyć gorycz.
Krótkie, następujące po sobie oddechy i wciąganie powietrza ustami pozwala degustatorowi nie tylko na rozprowadzenie w pełni próbki w całej jamie ustnej, ale także na wyczucie lotnych substancji aromatycznych poprzez jamę gardłowo-nosową poprzez wymuszenie użycia tej części jamy ustnej.
N.B. Kiedy degustatorzy nie wyczuwają owocowego smaku w próbce a intensywność decydującej o zaklasyfikowaniu cechy negatywnej wynosi co najwyżej 3,5, wówczas kierownik zespołu degustatorów może podjąć decyzję, aby degustatorzy zbadali próbkę jeszcze raz w temperaturze otoczenia (COI/T.20/Doc. No 6/Rev. 1, wrzesień 2007 r., sekcja 3 - Ogólne wskazówki dotyczące urządzenia pomieszczenia, w którym odbywa się badanie), określając jednocześnie pojęcie "temperatura otoczenia" i jego kontekst. Kiedy próbka osiągnie temperaturę pomieszczenia, degustatorzy badają ją ponownie jedynie w celu sprawdzenia, czy wyczuwają w niej smak/zapach owocowy. Jeśli tak, powinni oznaczyć jego intensywność na skali.
Należy także uwzględnić wrażenie dotykowe związane z cierpkością. W tym celu zaleca się połknięcie oliwy.
9.1.2. Dokonując organoleptycznej oceny oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia, zaleca się, aby podczas jednej sesji poddawać ocenie nie więcej niż CZTERY PRÓBKI oraz aby przeprowadzać maksymalnie trzy sesje w ciągu dnia w celu uniknięcia efektu kontrastu, jaki mógłby wystąpić w przypadku bezpośredniej degustacji pozostałych próbek.
Ponieważ następujące po sobie degustacje powodują zmęczenie lub utratę wrażliwości spowodowaną degustacją wcześniejszych próbek, konieczne jest stosowanie produktu, który usuwa z jamy ustnej pozostałości oliwy z poprzedniej degustacji.
Zaleca się użycie małego plasterka jabłka, który po przeżuciu można wypluć do spluwaczki. Następnie zaleca się wypłukanie jamy ustnej niewielką ilością wody o temperaturze otoczenia. Między zakończeniem jednej sesji a rozpoczęciem kolejnej należy odczekać co najmniej 15 minut.
9.2. Korzystanie z formularza oceny przez degustatorów
Na rys. 1 w niniejszym załączniku przedstawiono wzór formularza oceny przeznaczonego do użytku przez degustatorów.
Każdy degustator wchodzący w skład zespołu musi powąchać oliwę będącą przedmiotem badania, a następnie dokonać jej degustacji 43 . Następnie musi zaznaczyć na dziesięciocentymetrowej skali udostępnionego formularza intensywność wrażeń doznanych w odniesieniu do cech negatywnych i pozytywnych.
Jeżeli doznane przez degustatorów wrażenie odnosi się do cechy negatywnej niewymienionej w sekcji 4, podają to w rubryce "inne" przy użyciu terminu lub terminów opisujących te cechy z jak największą precyzją.
9.3. Wykorzystanie danych przez kierowników zespołu degustatorów
Kierownik zespołu zbiera formularze wypełnione przez każdego z degustatorów i dokonuje przeglądu stopni intensywności przypisanych do różnych cech. W przypadku stwierdzenia jakiejkolwiek nieprawidłowości kierownicy zwracają się do degustatora z prośbą o wprowadzanie poprawek w jego formularzu oceny oraz, w razie potrzeby, o powtórzenie badania.
Kierownik zespołu wprowadza dane z oceny dostarczone przez każdego z degustatorów do programu komputerowego, takiego jak program przewidziany w normie (IOC/T.20/Doc. No 15) w celu statystycznego obliczenia wyników analizy w oparciu o obliczenie median tych wyników. Zob. pkt 9.4 i dodatek do niniejszego załącznika. Wprowadzenie danych dotyczących jednej próbki odbywa się przy pomocy matrycy składającej się z 9 kolumn odpowiadających 9 cechom sensorycznym i n linijek odpowiadających liczbie n członków zespołu.
Jeżeli co najmniej 50 % członków zespołu odbierze daną cechę negatywną i odnotuje ją w rubryce »inne«, kierownik zespołu oblicza medianę takiej wady i otrzymuje odpowiednią klasyfikację.
Wartość odpornego współczynnika zmienności określającego klasyfikację (wada, której cechą jest największa intensywność, i owocowy charakter) musi być niższa lub równa 20 %.
W przeciwnym wypadku kierownik zespołu musi powtórzyć ocenę danej próbki, przeprowadzając drugą degustację.
W przypadku częstego występowania takiej sytuacji zaleca się, aby kierownik zespołu przeprowadził wśród degustatorów dodatkowe szczegółowe szkolenie (IOC/T.20/Doc. No 14, § 5) oraz aby skorzystał ze wskaźnika powtarzalności i wskaźnika odchyleń w celu sprawdzenia efektywności zespołu (IOC/T.20/Doc. No 14, § 6).
9.4. Klasyfikacja oliwy
Oliwa klasyfikowana jest zgodnie z wymienionymi poniżej kategoriami, w zależności od mediany wad i mediany aromatu owoców. Medianę wad określa się jako medianę wady odebranej z największą intensywnością. Mediana wad i mediana aromatu owoców przedstawiane są z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.
Klasyfikacji oliwy dokonuje się poprzez porównanie wartości mediany wad i mediany aromatu owoców z przedstawionymi poniżej przedziałami odniesienia. Ponieważ przy ustalaniu poziomów przedziałów uwzględniono błąd metody, uznaje się, iż poziomy te są ostateczne. Pakiety oprogramowania umożliwiają przedstawienie klasyfikacji w formie tabeli danych statystycznych lub w formie wykresu.
a) Oliwa z oliwek najwyższej jakości z pierwszego tłoczenia: mediana wad jest równa 0,0, a mediana aromatu owoców jest wyższa niż 0,0.
b) Oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia: mediana wad jest wyższa niż 0,0 ale nie przekracza 3,5, a mediana aromatu owoców jest wyższa niż 0,0.
c) Oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia typu lamparte: mediana wad jest wyższa niż 3,5 lub mediana wad jest niższa lub równa 3,5, a mediana aromatu owoców jest równa 0,0.
Uwaga 1: Jeżeli mediana cech dotyczących goryczy lub ostrego smaku jest wyższa niż 5,0, kierownik zespołu zaznacza to na świadectwie badania oliwy z oliwek.
W przypadku analiz przeprowadzonych w ramach kontroli zgodności przeprowadza się jeden test. W przypadku sprzeczności ocen należy zorganizować przeprowadzenie dwóch ocen w różnych sesjach. Wyniki ocen z obu sesji muszą być statystycznie jednorodne (zob. pkt 9.5). Jeśli tak nie jest, próbkę należy zbadać ponownie na dwóch sesjach. Ostateczną wartość mediany cech decydujących o zaklasyfikowaniu oblicza się, stosując średnią obu median.
9.5. Kryteria przyjmowania i odrzucania podwójnych oznaczeń
Zdefiniowany poniżej błąd znormalizowany należy wykorzystywać w celu ustalenia, czy dwa wyniki wykonanej dwa razy analizy są statystycznie jednorodne lub dopuszczalne:
Gdzie Me1 i Me2 to mediany otrzymane w wyniku dwóch analiz (odpowiednio pierwszej i drugiej) a U1 i U2 to niepewności rozszerzone uzyskane dla tych dwóch wartości, obliczone w sposób następujący, zgodnie z dodatkiem:
Dla niepewności rozszerzonej, c = 1,96; stąd
U1 = 0,0196 × CVr × Me1
gdzie CVr jest odpornym współczynnikiem zmienności.
Aby można było stwierdzić, że dwie otrzymane wartości nie różnią się pod względem statystycznym, Ennie może być większe od 1,0.
Rysunek 1
FORMULARZ OCENY OLIWY Z OLIWEK Z PIERWSZEGO TŁOCZENIA
Intensywność percepcji wad
Dodatek
Metoda obliczania mediany i przedziałów ufności
Mediana
Me = [p (X < xm) < ½ ^ p (X < xm) > ½]
Medianę określa się jako liczbę rzeczywistą Xm, scharakteryzowaną w ten sposób, że prawdopodobieństwo (p) przyjęcia przez zmienną losową o rozkładzie (X) wartości poniżej tej liczby (Xm) jest mniejsze lub równe 0,5 i jednocześnie prawdopodobieństwo (p) przyjęcia przez zmienną losową o rozkładzie (X) wartości mniejszej lub równej Xm jest równe lub większe niż 0,5. Bardziej praktyczna definicja określa medianę jako 50. percentyl rozkładu zestawu liczb uszeregowanych w porządku rosnącym. Ujmując prościej, mediana określa wartość środkową w uporządkowanym zbiorze liczb o nieparzystej ilości elementów lub wartość średnią dwóch wartości środkowych w uporządkowanym zbiorze liczb o parzystej ilości elementów.
Odporne odchylenie standardowe
Aby uzyskać wiarygodne oszacowanie zmienności wokół mediany, należy zastosować metodę szacowania odpornego odchylenia standardowego Stuarta i Kendalla (4). Przedstawiony poniżej wzór wskazuje asymptotyczne odchylenie standardowe, tj. odporną wartość szacunkową zmienności rozważanych danych, gdzie N jest liczbą obserwacji, a IQR przedziałem międzykwartylowym, który pokrywa dokładnie 50 % przypadków losowania z danego rozkładu prawdopodobieństwa:
Przedział międzykwartylowy oblicza się jako wielkość różnicy pomiędzy 75. a 25. percentylem.
IQR = 75. percentyl - 25. percentyl
gdzie percentyl to wartość Xpc określona w taki sposób, że prawdopodobieństwo (p) przyjęcia przez zmienną losową wartości poniżej Xpc jest nie większe niż określona setna część i jednocześnie prawdopodobieństwo (p) przyjęcia przez zmienną losową wartości niższej lub równej X jest większe lub równe danej setnej części. Setna określa przyjęty stopień rozkładu. W przypadku mediany jest to 50/100.
Ze względów praktycznych percentyl jest wartością rozkładu odpowiadającą określonej powierzchni pod wykresem rozkładu lub jego funkcji gęstości. Na przykład 25. percentyl reprezentuje wartość rozkładu odpowiadającą polu równemu 0,25 lub 25/100.
W tej metodzie percentyle obliczane są na podstawie wartości rzeczywistych, które znajdują się w macierzy danych (procedura obliczania percentyli).
Odporny współczynnik zmienności (%)
Odporny współczynnik zmienności CVr% odpowiada wielkości niemianowanej, która wskazuje procentową zmienność zbioru analizowanych liczb. Z tego powodu jest wielkością bardzo użyteczną przy sprawdzaniu wiarygodności oceniających będących członkami zespołu.
Przedziały ufności mediany na poziomie 95 %
Przedziały ufności na poziomie 95 % (wartość błędu pierwszego rodzaju równa jest 0,05 lub 5 %) odpowiadają zakresowi, w którym wartość mediany mogłaby się zmieniać, gdyby było możliwe powtarzanie doświadczenia nieskończoną liczbę razy. W praktyce oznacza to zakres zmienności testu w przyjętych warunkach operacyjnych, wychodząc z założenia, że możliwe jest wielokrotne powtarzanie oceny. Przedział ufności pomaga ocenić wiarygodność oceny, tak jak w przypadku odpornego współczynnika zmienności.
C.I.górny = Me + (c × s*)
C.I.dolny = Me - (c × s*)
gdzie C = 1,96, w przypadku przedziału ufności na poziomie 95 %.
Przykład zestawienia obliczeń przedstawiono w załączniku I do normy IOC/T 20/Doc. No 15.
Źródła
1) Wilkinson, L., Systat: The system for statistics, SYSTAT Inc., Evanston, IL., 1990.
2) Cicchitelli, G., Probabilità e Statistica, Maggioli Editore, Rimini, 1984.
3) Massart, D. L., Vandeginste, B.G.M., Deming, Y., Michotte, L., Chemometrics. A textbook, Elsevier, Amsterdam, 1988.
4) Kendall, M. G., Stuart, A., The advanced theory of statistics. Vol. 1, Hafner Publishing Co., 1967.
5) McGill, R., Tukey, J. W., Larsen, W. A., Variation of Box Plots. The American Statistician, tom 32, (2), 1978, s. 12-16.
6) IOC/T.28/Doc. No 1, Guidelines for the accreditation of sensory testing laboratories with particular reference to virgin olive oil according to standard ISO/IEC 17025:2005, wrzesień 2007.
7) IOC/T.20/Doc. No 14.
8) IOC/T.20/Doc. No 15.
9) ISO/IEC 17025:05.
ZAŁĄCZNIK XV
ZAWARTOŚĆ OLEJU W POZOSTAŁOŚCI Z OLIWEK
ZAWARTOŚĆ OLEJU W POZOSTAŁOŚCI Z OLIWEK
1.1. Aparatura
- odpowiednia aparatura ekstrakcyjna wyposażona w kolbę stożkową z okrągłym dnem o pojemności 200- 250 ml,
- elektrycznie podgrzewana łaźnia (np. łaźnia piaskowa, łaźnia wodna) lub płytka grzejna,
- waga analityczna,
- piec regulowany do maksymalnie 80 °C,
- elektrycznie podgrzewany piec wyposażony w urządzenie termostatyczne regulowane do 103 ± 2 °C, który można omiatać strumieniem powietrza lub obsługiwać pod obniżonym ciśnieniem,
- młynek mechaniczny, łatwy do czyszczenia, który umożliwia zmielenie wytłoczków oliwkowych bez podwyższenia ich temperatury i bez jakiejkolwiek innej stwierdzanej zmiany zawartości w ich wilgoci, substancji lotnych lub substancji ulegających ekstrakcji przy użyciu heksanu,
- gilza do ekstrakcji i bawełna lub bibuła filtracyjna, z których usunięto już substancje ulegające ekstrakcji heksanem,
- suszarka laboratoryjna,
- sito o otworach o średnicy 1 mm,
- małe cząstki wcześniej wysuszonego pumeksu,
1.2. Odczynnik
Normalny heksan, czystości technicznej, po którym zostaje mniej niż 0,002 g pozostałości na 100 ml po pełnym odparowaniu.
2. PROCEDURA
2.1. Przygotowanie próbki do badania
W razie potrzeby wykorzystać młynek mechaniczny, który został uprzednio odpowiednio oczyszczony, do zmielenia próbki laboratoryjnej w celu rozdrobnienia jej do cząstek, które mogą całkowicie przejść przez sito.
Wykorzystać około jednej dwudziestej próbki, aby dokończyć proces czyszczenia młynka, odrzucić zmielony materiał, zemleć pozostałość i zebrać ją, starannie wymieszać i niezwłocznie poddać analizie.
2.2. Badana porcja
Natychmiast po zakończeniu operacji mielenia odważyć około 10 g próbki do zbadania z dokładnością do 0,01 g.
2.3. Przygotowanie gilzy do ekstrakcji
Umieścić porcję badaną w gilzie i zatkać tę ostatnią bawełną. W razie stosowania bibuły filtracyjnej owinąć nią porcję badaną.
2.4. Wstępne suszenie
W przypadku, gdy wytłoczki oliwkowe są bardzo wilgotne (tj. ilość zawartej w nich wilgoci i substancji lotnych przekracza 10 %), przeprowadzić wstępne suszenie przez umieszczenie napełnionej gilzy do ekstrakcji (lub bibuły filtracyjnej) w piecu podgrzewanym przez odpowiedni czas do nie więcej niż 80 °C w celu zmniejszenia zawartości wilgoci i substancji lotnych do mniej niż 10 %.
2.5. Przygotowanie kolby stożkowej z okrągłym dnem
Odważyć z dokładnością do 1 mg kolbę stożkową zawierającą jedną lub dwie cząstki pumeksu, wcześniej wysuszoną w piecu w temperaturze 103 ± 2 °C i schłodzoną w suszarce laboratoryjnej przez nie mniej niż jedną godzinę.
2.6. Wstępna ekstrakcja
Do aparatury ekstrakcyjnej wprowadzić gilzę (lub bibułę filtracyjną) zawierającą porcję badaną. Wlać do kolby stożkowej wymaganą ilość heksanu. Podłączyć kolbę do aparatury ekstrakcyjnej i umieścić całość na elektrycznie podgrzewanej łaźni. Wyregulować szybkość podgrzewania w taki sposób, aby szybkość odcieku nie była niższa od trzech kropli na sekundę (umiarkowane, nie gwałtowne podgrzewanie). Po ekstrakcji przez cztery godziny pozostawić całość do schłodzenia. Usunąć gilzę z aparatury ekstrakcyjnej i umieścić ją w strumieniu powietrza, aby odprowadzić większość impregnującego rozpuszczalnika.
2.7. Druga ekstrakcja
Wsypać zawartość gilzy do mikromłynka i zemleć jak najdrobniej. Zwrócić zmieloną mieszaninę do gilzy bez straty i umieścić ją z powrotem w aparaturze ekstrakcyjnej.
Kontynuować ekstrakcję przez następne dwie godziny przy użyciu tej samej okrągłodennej kolby stożkowej zawierającej wstępny ekstrakt.
Roztwór powstały w kolbie ekstrakcyjnej musi się sklarować. Jeżeli tak się nie stanie, należy go kilka razy przefiltrować przez bibułę filtracyjną i kilka razy wymyć pierwotną kolbę i bibułę filtracyjną kilka razy przy pomocy heksanu. Zebrać filtrat i rozpuszczalnik zastosowany do przemywania do drugiej okrągłodennej kolby stożkowej, która została uprzednio wysuszona i wytarowana z dokładnością do 1 mg.
2.8. Usunięcie rozpuszczalnika i odważenie ekstraktu
Usunąć większą część rozpuszczalnika przez destylację na elektrycznie podgrzewanej łaźni. Usunąć ostatnie ślady rozpuszczalnika przez podgrzewanie kolby stożkowej w piecu w temperaturze 103 ± 2 °C przez 20 minut. Pomóc procesowi eliminacji przez wdmuchiwanie w pewnych odstępach czasu albo powietrza albo - w najkorzystniejszej sytuacji - gazu obojętnego, bądź też przy użyciu obniżonego ciśnienia.
Pozostawić kolbę stożkową w suszarce laboratoryjnej do schłodzenia, przez co najmniej jedną godzinę i zważyć z dokładnością do 1 mg.
Ponownie podgrzewać przez 10 minut na takich samych zasadach, schłodzić w suszarce laboratoryjnej i zważyć jeszcze raz.
Różnica między dwoma ważeniami nie może przekroczyć 10 mg. W razie takiego przekroczenia podgrzewać substancję ponownie przez okresy do 10 minut, po czym należy ją schłodzić i zważyć do uzyskania różnicy masy 10 mg lub mniejszej. Odnotować ostatnią masę kolby stożkowej.
Przeprowadzić dwa oznaczenia próbki badanej.
3. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW
3.1. Metoda obliczeń i wzór
a) Ilość ekstraktu jako odsetek masy otrzymanego produktu wynosi:
gdzie: S jest odsetkiem masowym otrzymanego produktu,
m0 = jest masą, w gramach, porcji badanej,
m1 = jest masą, w gramach, ekstraktu po wysuszeniu.
Jako wynik przyjąć średnią arytmetyczną z dwóch oznaczeń, pod warunkiem spełnienia warunków powtarzalności.
Przedstawić wynik z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.
b) Ilość ekstraktu wyraża się w odniesieniu do suchej substancji zgodnie z następującym wzorem:
gdzie: S = to odsetek ekstraktu na podstawie otrzymanego produktu (patrz a),
U = jest zawartością wilgoci i substancji lotnych.
3.2. Powtarzalność
Różnica między dwoma oznaczeniami wykonanymi równocześnie lub szybko jedno po drugim przez tego samego analityka nie może przekraczać 0,2 g ekstraktu heksanu na 100 g próbki.
W razie niespełnienia tego warunku powtórzyć analizę na dwóch innych porcjach badanych. Jeżeli także w tym przypadku różnica przekracza 0,2 g, przyjąć wynik jako średnią arytmetyczną z czterech wykonanych oznaczeń.
ZAŁĄCZNIK XVI
OZNACZENIE LICZBY JODOWEJ
OZNACZENIE LICZBY JODOWEJ
Niniejsza norma międzynarodowa określa metodę oznaczania liczby jodowej tłuszczów i olejów zwierzęcych i roślinnych, zwanych dalej tłuszczami.
2. DEFINICJA
Do celów niniejszej normy międzynarodowej ma zastosowanie następująca definicja:
2.1. liczba jodowa Masa jodu wchłonięta przez próbkę, w warunkach postępowania określonych w niniejszej normie międzynarodowej.
Liczbę jodową wyraża się jako liczbę gramów jodu na 100 g próbki.
3. ZASADA
Rozpuszczanie porcji badanej w rozpuszczalniku i dodanie odczynnika Wijsa. Po określonym czasie dodanie roztworu jodku potasu i wody oraz miareczkowanie uwolnionego jodu przy użyciu roztworu tiosiarczanu sodu.
4. ODCZYNNIKI
Wszystkie odczynniki muszą być odczynnikami o uznanej czystości do analiz:
4.1. woda spełniająca wymagania normy ISO 3696, stopień 3.
4.2. jodek potasu, roztwór 100 g/l, niezawierający jodanu ani wolnego jodu.
4.3. skrobia, roztwór.
Zmieszać 5 g skrobi rozpuszczalnej z 30 ml wody, dodać tę mieszaninę do 1.000 ml wrzącej wody, gotować przez trzy minuty i odstawić do schłodzenia.
4.4. tiosiarczan sodu, mianowany roztwór objętościowy c (Na2S2O3 · 5H2O) = 0,1 mol/l, standaryzowany nie wcześniej niż siedem dni przed użyciem.
4.5. rozpuszczalnik, przygotowany przez zmieszanie równych ilości cykloheksanu i kwasu octowego.
4.6. odczynnik Wijsa, zawierający monochlorek jodu w kwasie octowym. Należy zastosować odczynnik Wijsa dostępny w handlu.
5. APARATURA
Zwykła aparatura laboratoryjna, w szczególności następująca:
5.1. szklane szufelki do odważania substancji, nadające się do pobrania porcji badanej i wprowadzenia jej do kolb (6.2).
5.2. kolby stożkowe, o pojemności 500 ml, wyposażone w szlifowane korki szklane i całkowicie suche.
6. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI BADANEJ
Homogenizowaną próbkę suszy się nad siarczanem sodowym i filtruje.
7. PROCEDURA
7.1. Porcja badana Masa porcji badanej zmienia się w zależności od spodziewanej liczby jodowej, jak przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1
| Oczekiwana liczba jodowa | Masa badanej próbki |
| poniżej 5 | 3,00 |
| 5 do 20 | 1,00 |
| 21 do 50 | 0,40 |
| 51 do 100 | 0,20 |
| 101 to 150 | 0,13 |
| 151 do 200 | 0,10 |
Badaną próbkę należy odważyć z dokładnością do 0,1 mg na szklanej szalce (5.1).
7.2. Oznaczanie
Badaną próbkę umieścić w kolbie o pojemności 500 ml (6.2). Dodać 20 ml rozpuszczalnika (4.5), w celu rozpuszczenia tłuszczu. Dodać dokładnie 25 ml odczynnika Wijs'a (4.6), zakorkować, zawartość zawirować i umieścić kolbę w ciemni. Do odczynnika Wijs'a nie wolno używać pipety doustnej.
Podobnie należy przygotować ślepą próbę z rozpuszczalnikiem i odczynnikiem, lecz z pominięciem badanej próbki.
W przypadku próbek o liczbie jodowej poniżej 150, kolby należy pozostawić na godzinę w ciemni; próbki o liczbie jodowej powyżej 150 oraz produkty poddane polimeryzacji lub utlenione w znacznym stopniu należy pozostawić na dwie godziny.
Pod koniec określonego czasu, do każdej kolby należy dodać 20 ml roztworu jodku potasu (4.2) oraz 150 ml wody (4.1).
Miareczkować przy pomocy standardowego roztworu pomiarowego tiosiarczanu sodu (4.4) aż do momentu, kiedy żółte zabarwienie od jodyny stanie się prawie niewidoczne. Dodać kilka kropli roztworu skrobiowego (4.3) i kontynuować miareczkowanie do chwili, w której niebieskie zabarwienie zniknie po bardzo energicznym wstrząśnięciu.
Uwaga: Dopuszczalne jest oznaczanie potencjometryczne punktu końcowego.
7.3. Liczba oznaczeń
Jedną próbkę analityczną oznacza się dwukrotnie.
8. Wyrażanie wyników
Liczbę jodową podaje się za pomocą wzoru
gdzie:
c = wartość liczbowa dokładnego stężenia użytego standardowego roztworu pomiarowego tiosiarczanu sodu (4.4), wyrażona w molach na litr;
V1 = wartość liczbowa objętości standardowego roztworu pomiarowego tiosiarczanu sodu (4.4) użytego do ślepej próby, wyrażona w mililitrach;
V2 = wartość liczbowa objętości standardowego roztworu pomiarowego tiosiarczanu sodu (4.4) użytego do oznaczenia, wyrażona w mililitrach;
m = wartość liczbowa masy badanej próbki (7.1), wyrażona w gramach.
Wynik będzie średnią arytmetyczną z dwóch oznaczeń, pod warunkiem spełnienia wymogu w zakresie powtarzalności (9.2).
ZAŁĄCZNIK XIX 49
OZNACZANIE SKŁADU I ZAWARTOŚCI STEROLI ORAZ ZWIĄZKÓW ALKOHOLOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ NA KOLUMNACH KAPILARNYCH
OZNACZANIE SKŁADU I ZAWARTOŚCI STEROLI ORAZ ZWIĄZKÓW ALKOHOLOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ NA KOLUMNACH KAPILARNYCH
CZĘŚĆ 3
ANALIZA FRAKCJI ZWIĄZKÓW ALKOHOLOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ
ANALIZA FRAKCJI ZWIĄZKÓW ALKOHOLOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ
Powierzchnie pików 1-eikozanolu i alkoholi alifatycznych C22, C24, C26 i C28 oblicza się za pomocą systemu odbioru danych. Współczynnik odpowiedzi w przypadku 1-eikozanolu przyjmuje się jako równy 1.
Obliczyć powierzchnie pików α-cholestanolu i steroli oraz dialkoholi triterpenowych za pomocą systemu obliczeniowego. Pominąć związki, które nie są ujęte w tabeli 1 (nie należy uwzględniać w obliczeniach ergosterolu). Współczynnik odpowiedzi w przypadku α-cholestanolu przyjmuje się jako równy 1.
Obliczyć stężenie każdego poszczególnego związku alkoholowego w mg/kg substancji tłuszczowej w następujący sposób:
gdzie:
Ax = powierzchnia piku w przypadku związku alkoholowego x, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym.
As = powierzchnia piku 1-eikozanolu/α-cholestanolu, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym.
ms = masa dodanego 1-eikozanolu/α-cholestanolu, w miligramach.
m = masa próbki użytej do oznaczenia, w gramach.
Podać stężenie poszczególnych alkoholi alifatycznych i triterpenowych w mg/kg substancji tłuszczowej i ich sumę jako »całkowitą zawartość alkoholi alifatycznych«. Całkowita zawartość to suma C22, C24, C26 i C28.
Skład każdego z poszczególnych związków alkoholowych należy podać z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.
Całkowite stężenie steroli musi być podane jako liczba całkowita bez przecinka dziesiętnego.
Procentową zawartość każdego sterolu obliczyć na podstawie stosunku powierzchni odpowiedniego piku do sumy powierzchni pików steroli:
gdzie:
Ax = powierzchnia piku dla sterolu x. ΣA = suma powierzchni pików dla steroli.
APP β -sitosterol: Δ5,23-stigmastadienol + klerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-awenasterol + Δ5,24-stigmastadienol.
Obliczyć procentową zawartość erytrodiolu i uwaolu:
gdzie:
AEr = powierzchnia erytrodiolu, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym.
AUv = powierzchnia uwaolu, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym.
ΣΑΤ = suma powierzchni piku dla steroli + erytrodiolu + uwaolu, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym.
Oprócz obliczenia względnego procentowego udziału poszczególnych steroli i dialkoholi triterpenowych oraz całkowitego stężenia steroli należy - zgodnie z poniższymi wzorami - obliczyć stężenie erytrodiolu i uwaolu oraz ich sumę w mg/kg substancji tłuszczowej:
gdzie:
AEr = powierzchnia piku erytrodiolu, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym.
AUv = powierzchnia uwaolu, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym.
As = powierzchnia piku α-cholestanolu, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym.
ms = masa dodanego α-cholestanolu, w miligramach.
m = masa próbki użytej do oznaczenia, w gramach.
ZAŁĄCZNIK XX 50
Metoda oznaczania zawartości wosków, metylowych estrów kwasu tłuszczowego i etylowych estrów kwasu tłuszczowego metodą kapilarnej chromatografii gazowej
Metoda oznaczania zawartości wosków, metylowych estrów kwasu tłuszczowego i etylowych estrów kwasu tłuszczowego metodą kapilarnej chromatografii gazowej
Niniejsza metoda służy do oznaczania zawartości wosków, metylowych i etylowych estrów kwasu tłuszczowego w różnych rodzajach oliwy z oliwek. Poszczególne woski i estry alkilowe rozdziela się w zależności od liczby atomów węgla. Zaleca się stosowanie tej metody do rozróżnienia oliwy z oliwek od oliwy z wytłoczyn oliwek oraz jako wskaźnik jakości w przypadku oliwy z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia, który umożliwia wykrycie oszukańczych mieszanin oliwy z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia z rodzajami oliw o niższej jakości, takim jak oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia, oliwa z oliwek typu lampante lub niektóre rodzaje oleju dezodoryzowanego.
2. ZASADA
Dodanie odpowiednich wzorców wewnętrznych do oleju, następnie frakcjonowanie z wykorzystaniem metody chromatografii w kolumnie z uwodnionym żelem krzemionkowym. Odzyskanie frakcji wymytej uprzednio w warunkach testowych (której biegunowość jest mniejsza niż w przypadku triglicerydów), następnie przeprowadzenie bezpośredniej analizy metodą kapilarnej chromatografii gazowej.
3. APARATURA
3.1. Kolba Erlenmeyera o pojemności 25 ml.
3.2. Szklana kolumna do chromatografii cieczowej, średnica wewnętrzna 15 mm, wysokość 30-40 cm, wyposażona w odpowiedni kranik.
3.3. Chromatograf gazowy, który można stosować razem z kolumną kapilarną, wyposażony w system do bezpośredniego wprowadzania do kolumny, składający się z:
3.3.1. kontrolowanego termostatem piecyka z możliwością programowania temperatury;
3.3.2. zimnego dozownika do bezpośredniego wprowadzania do kolumny;
3.3.3. detektora płomieniowo-jonizacyjnego i konwertera - wzmacniacza;
3.3.4. współpracującego ze wzmacniaczem-konwerterem (pkt. 3.3.3) rejestratora-integratora (Uwaga 1), którego czas reakcji nie przekracza jednej sekundy, ze zmienną szybkością przesuwu papieru;
Uwaga 1: można również zastosować systemy informatyczne w przypadku wprowadzania danych z chromatografii gazowej przy użyciu komputera osobistego
3.3.5. kolumny kapilarnej, z topionej krzemionki (dla celów analizy wosków oraz metylowych i etylowych estrów), o wysokości 8-12 m, średnicy wewnętrznej 0,25-0,32 mm, pokrytej od środka płynem rozdzielającym (Uwaga 2), o jednolitej grubości 0,10-0,30 μm;
Uwaga 2: ogólnodostępne, odpowiednie do tego celu płyny rozdzielające typu SE52 lub SE 54, dostępne w handlu, itp.
3.4. Mikrostrzykawka umożliwiająca wstrzyknięcie do kolumny porcji 10 μl, wyposażona w igłę o utwardzonej powierzchni.
3.5. Wstrząsarka elektryczna.
3.6. Wyparka rotacyjna.
3.7. Piec muflowy.
3.8. Waga analityczna zapewniająca precyzję pomiaru ± 0,1 mg.
3.9. Zwykłe szkło laboratoryjne.
4. ODCZYNNIKI
4.1. Żel krzemionkowy o granulometrii w zakresie od 60 do 200 μm. Umieścić żel krzemionkowy w piecu muflowym w temp. 500 °C na co najmniej 4 godziny. Po ostudzeniu dodać 2 % wody względem zastosowanej ilości żelu krzemionkowego. Dobrze wstrząsnąć do otrzymania jednolitej zawiesiny i umieścić w suszarce laboratoryjnej na nie mniej niż 12 godzin przed zastosowaniem.
4.2. n-heksan o klasie czystości do chromatografii lub do wykrywania pozostałości. Heksan można zastąpić izooktanem (2,2,4-trimetylopentanem o klasie czystości do chromatografii), o ile osiągnięto porównywalne wartości precyzji. Rozpuszczalniki o temperaturze wrzenia wyższej niż n-heksan odparowują dłużej. Są jednak preferowane ze względu na toksyczność heksanu. Należy sprawdzić czystość; na przykład można kontrolować pozostałości po odparowaniu 100 ml rozpuszczalnika.
UWAGA - Opary mogą ulec samozapłonowi. Należy trzymać z daleka od źródeł ciepła, iskier lub nieosłoniętego płomienia. Należy upewnić się zawsze, że pojemniki są zawsze dobrze zamknięte. Należy zapewnić odpowiednią wentylację podczas użytkowania. Należy unikać nagromadzenia oparów i usunąć wszelkie możliwe źródła zagrożenia pożarowego takie jak grzejniki czy aparatura elektryczna wyprodukowana z materiałów innych niż materiały niepalne. Wdychanie oparów może mieć szkodliwe skutki, ponieważ może prowadzić do uszkodzenia komórek nerwowych. Nie należy wdychać oparów. Należy w razie potrzeby zastosować odpowiednie urządzenia umożliwiające oddychanie. Chronić oczy i skórę przed kontaktem.
Izooktan jest substancją ciekłą łatwopalną stanowiącą zagrożenie pożarowe. Granice palności w powietrzu wynoszą 1,1-6,0 % (ułamek objętościowy). Jest on toksyczny w przypadku jego spożywania i wdychania. Pracując z tym rozpuszczalnikiem, należy korzystać z wentylowanego dygestorium w dobrym stanie technicznym.
4.3. Eter etylowy o klasie czystości do chromatografii.
UWAGA - bardzo łatwopalny i umiarkowanie toksyczny. Podrażnia skórę. Wdychanie oparów może mieć, szkodliwe skutki, ponieważ może prowadzić do uszkodzenia komórek nerwowych. Może powodować uszkodzenia oczu. Skutki mogą być odczuwalne z opóźnieniem. Może tworzyć nadtlenki o właściwościach wybuchowych. Opary mogą ulec samozapłonowi. Należy trzymać z daleka od źródeł ciepła, iskier lub nieosłoniętego płomienia. Należy upewnić się każdorazowo, że pojemniki są zawsze dobrze zamknięte. Należy zapewnić odpowiednią wentylację podczas użytkowania. Należy unikać nagromadzenia oparów i usunąć wszelkie możliwe źródła zagrożenia pożarowego, takie jak grzejniki czy aparatura elektryczna wyprodukowana z materiałów innych niż materiały niepalne. Nie odparowywać do sucha lub prawie do sucha. Dodanie wody lub odpowiedniego czynnika redukującego może ograniczyć tworzenie nadtlenków. Nie pić. Nie należy wdychać oparów. Należy unikać przedłużonego lub powtarzalnego kontaktu ze skórą.
4.4. n-heptan, do chromatografii, lub izooktan.
UWAGA - łatwopalny. Wdychanie oparów może mieć, szkodliwe skutki, ponieważ może prowadzić do uszkodzenia komórek nerwowych. Należy trzymać z daleka od źródeł ciepła, iskier lub nieosłoniętego płomienia. Należy upewnić się każdorazowo, że pojemniki są zawsze dobrze zamknięte. Należy zapewnić odpowiednią wentylację podczas użytkowania. Nie należy wdychać oparów. Należy unikać przedłużonego lub powtarzalnego kontaktu ze skórą.
4.5. Roztwór wzorca arachidynianu laurylowego (Uwaga 3) o stężeniu 0,05 % (m/V) w heptanie (wzorzec wewnętrzny dla wosków).
Uwaga 3: można również zastosować palmitynian palmitylu, stearynian mirystylu lub arachidynian laurylowy.
4.6. Roztwór wzorca estru metylowego kwasu heptadekanowego o stężeniu 0,02 % (m/V) w heptanie (wzorzec wewnętrzny dla estrów metylowych i etylowych).
4.7. Sudan 1 (1-fenylo-azo-2-naftol).
4.8. Gaz nośny: czysty wodór lub hel, do chromatografii gazowej.
UWAGA
Wodór Bardzo łatwopalny, pod ciśnieniem. Należy trzymać z daleka od źródeł ciepła, iskier lub nieosłoniętego płomienia lub aparatury elektrycznej wyprodukowanej z materiałów innych niż niepalne. Należy upewnić się, że zawór butli jest zamknięty na czas przerwy w użytkowaniu. Stosować zawsze razem z reduktorem ciśnienia. Należy zmniejszyć nacisk na sprężynę reduktora przed otwarciem zaworu butli. Nie należy stać naprzeciw ujścia butli w momencie otwierania zaworu. Należy zapewnić odpowiednią wentylację podczas użytkowania. Nie należy przemieszczać wodoru z jednej butli do drugiej. Nie należy mieszać gazu w butli. Należy zapewnić stabilność butli. Należy przechowywać z dala od światła słonecznego i źródeł ciepła. Przechowywać w warunkach wolnych od czynników korozyjnych. Nie należy używać butli, jeśli są one uszkodzone lub pozbawione etykiet.
Hel Gaz sprężony pod ciśnieniem. Zmniejsza ilość tlenu dostępnego do oddychania. Należy przechowywać butlę zamkniętą. Należy zapewnić odpowiednią wentylację podczas użytkowania. Nie należy przebywać w pomieszczeniach, w których przechowywane są butle, jeżeli pomieszczenia te nie są odpowiednio wentylowane. Stosować zawsze razem z reduktorem ciśnienia. Należy zmniejszyć nacisk na sprężynę reduktora przed otwarciem zaworu butli. Nie należy przemieszczać gazu z jednej butli do drugiej. Należy zapewnić stabilność butli. Nie należy stać naprzeciw ujścia butli w momencie otwierania zaworu. Należy przechowywać z dala od światła słonecznego i źródeł ciepła. Przechowywać w warunkach wolnych od czynników korozyjnych. Nie należy używać butli, jeśli są one uszkodzone lub pozbawione etykiet. Nie wdychać. Wykorzystywać jedynie do celów technicznych.
4.9. Gazy pomocnicze:
- Czysty wodór, w postaci gazowej, do chromatografii gazowej.
- Czyste powietrze, w postaci gazowej, do chromatografii gazowej.
UWAGA
Powietrze Gaz sprężony pod ciśnieniem. Należy stosować przy zachowaniu środków ostrożności w obecności substancji palnych, ponieważ temperatura samozapłonu większości organicznych składników powietrza jest znacznie niższa w warunkach wysokiego ciśnienia. Należy upewnić się, że zawór butli jest zamknięty na czas przerwy w użytkowaniu. Stosować zawsze razem z reduktorem ciśnienia. Należy zmniejszyć nacisk na sprężynę reduktora przed otwarciem zaworu butli. Nie należy stać naprzeciw ujścia butli w momencie otwierania zaworu. Nie należy przemieszczać gazu z jednej butli do drugiej. Nie należy mieszać gazu w butli. Należy zapewnić stabilność butli. Należy przechowywać z dala od światła słonecznego i źródeł ciepła. Przechowywać w warunkach wolnych od czynników korozyjnych. Nie należy używać butli, jeśli są one uszkodzone lub pozbawione etykiet. Powietrze przeznaczone dla celów technicznych nie może być wykorzystywane do wdychania lub w urządzeniach umożliwiających oddychanie.
5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA
5.1. Przygotowanie kolumny chromatograficznej
Sporządzić zawiesinę 15 g żelu krzemionkowego (pkt. 4.1) w n-heksanie (pkt. 4.2) i wprowadzić do kolumny (pkt. 3.2). Po spontanicznym wytrąceniu osadu zakończyć ten proces przy użyciu wstrząsarki elektrycznej, tak aby warstwa chromatograficzna stała się bardziej jednolita.. Przesączyć 30 ml n-heksanu, by usunąć wszelkie zanieczyszczenia. Odważyć dokładnie 500 mg próbki do kolby 25-ml (pkt. 3.1) posługując się wagą analityczną (pkt. 3.8) i dodać odpowiednią ilość wzorca wewnętrznego (pkt. 4.5), w zależności od założonej zawartości wosku, np. dodać 0,1 mg arachidynianu laurylowego w przypadku oliwy z oliwek, 0,25-0,50 mg w przypadku oliwy z wytłoczyn z oliwek i 0,05 mg w przypadku estru metylowego kwasu heptadekanowego dla oliwy z oliwek (pkt. 4.6).
Do tak przygotowanej próbki dodać dwie porcje po 2 ml n-heksanu (pkt. 4.2) i przenieść do kolumny chromatograficznej.
Wprowadzić próbkę, tak aby rozpuszczalnik napłynął do wysokości 1 mm powyżej górnego poziomu absorbentu. Następnie przesączyć resztę n-heksanu/eteru etylowego (99:1) i pobrać 220 ml przy przepływie około 15 kropli w ciągu 10 sekund. (Ta frakcja zawiera estry metylowe i etylowe oraz woski). (Uwaga 4) (Uwaga 5).
Uwaga 4: codziennie należy przygotowywać świeżą mieszaninę n-heksanu/eteru etylowego (99/1).
Uwaga 5: w celu wzrokowego skontrolowania prawidłowości wymywania wosków można dodać do próbki 100 μl roztworu 1 % barwnika Sudan I w mieszaninie wymywającej.
Wartość retencji tego barwnika jest pośrednia pomiędzy wartościami retencji wosków i triglicerydów. Z tego względu należy zatrzymać wymywanie gdy barwnik dotrze do dna kolumny chromatograficznej, ponieważ wszystkie woski zostały już wymyte.
Otrzymaną w ten sposób frakcję suszy się w wyparce rotacyjnej do niemal całkowitego wyeliminowania rozpuszczalnika. Usuwa się ostatnie 2 ml rozpuszczalnika przy użyciu słabego strumienia azotu. Frakcję zawierającą estry metylowe i etylowe pobiera się z wykorzystaniem 2-4 ml n-heptanu lub izooktanu jako rozpuszczalnika.
5.2. Analiza metodą chromatografii gazowej
5.2.1. Procedura wstępna
Umieścić kolumnę w chromatografie gazowym (pkt. 3.3), łącząc szczelinę wlotową z systemem kolumnowym, a wylotową z detektorem. Wykonać ogólne kontrole aparatury do chromatografii gazowej (działanie pętli gazowych, sprawność detektora i systemu rejestracyjnego itp.).
Jeżeli kolumna używana jest po raz pierwszy, zaleca się jej kondycjonowanie. Przepuścić przez kolumnę gaz o małym natężeniu przepływu, następnie uruchomić aparaturę do chromatografii gazowej. Stopniowo podgrzewać do uzyskania, po około 4 godzinach, temperatury 350 °C.
Utrzymać tę temperaturę przez co najmniej 2 godziny, a następnie ustawić aparaturę według zadanych warunków pracy (ustawić natężenie przepływu gazu, zapalić płomień, podłączyć do elektronicznego przyrządu rejestrującego (pkt. 3.3.4), ustawić temperaturę pieca kolumny, ustawić detektor itd.). Rejestrować sygnał z czułością co najmniej dwukrotnie wyższą niż czułość wymagana do przeprowadzenia analizy. Przebieg linii podstawowej powinien mieć charakter liniowy, bez jakichkolwiek pików, i linia ta nie powinna wykazywać nachylenia.
Prostoliniowe, ujemne nachylenie linii wskazuje na to, że połączenia kolumn są nieprawidłowe; nachylenie dodatnie oznacza, że kolumna nie została poddana wystarczającemu kondycjonowaniu.
5.2.2. Dobór warunków roboczych dla wosków i estrów metylowych i etylowych (Uwaga 6). Ogólnie należy przestrzegać następujących warunków roboczych:
- Temperatura kolumny:
20 °C/min 5 °C/min
Początkowo 80 °C (1') -----140 °C -----335 °C (20)
- Temperatura detektora: 350 °C.
- Porcja wstrzykiwana: 1 μl roztworu (2-4 ml) n-heptanu.
- Gaz nośny: hel lub wodór z szybkością liniową optymalną dla wybranego gazu (patrz: dodatek A).
- Czułość urządzenia: taka, aby były spełnione warunki określone powyżej.
Uwaga 6: Ze względu na wysoką temperaturę końcową przyjmuje się dodatnie nachylenie, które nie może przekraczać 10 % objętościowych wartości pełnego zakresu skali.
Warunki te mogą być modyfikowane w sposób dostosowany do charakterystyk kolumny i aparatu do chromatografii gazowej, tak aby zostały oddzielone wszystkie woski i metylowe i etylowe estry kwasu tłuszczowego oraz aby uzyskać zadowalającą rozdzielczość pików (zob. rysunki 2, 3 i 4) oraz czas retencji 18 ± 3 minut dla wewnętrznego wzorca arachidynianu laurylowego. Najbardziej reprezentatywny pik dla wosków musi wynosić ponad 60 % wartości pełnego zakresu skali, a wewnętrzny wzorzec estru metylowego kwasu heptadekanowego dla estrów metylowych i etylowych musi osiągnąć górny zakres skali.
Należy ustalić parametry całkowania pików w taki sposób, by uzyskać dokładną wartość pola powierzchni rozpatrywanego piku.
5.3. Przeprowadzenie analizy
Pobrać 10 μl roztworu za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 10 μl, odciągnąć tłoczek, aż igła zostanie całkowicie opróżniona. Wprowadzić igłę do układu nastrzykowego i szybko wstrzyknąć po upływie jednej do dwóch sekund. Po upływie około 5 sekund powoli wyciągnąć igłę.
Przeprowadzać rejestrację danych aż do momentu całkowitego wymycia wosków lub stigmastadienów, w zależności od analizowanej frakcji.
Linia podstawowa musi przez cały czas spełniać ustalone wymagania.
5.4. Identyfikacja pików
Zidentyfikować piki po czasach retencji, porównując je z mieszaninami wosków o znanych czasach retencji, analizowanymi w takich samych warunkach. Estry alkilowe identyfikuje się po mieszaninach metylowych i etylowych estrów podstawowych kwasów tłuszczowych w oliwie z oliwek (palmitynowego i oleinowego).
Rysunek 1 przedstawia chromatogram wosków oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia. Rysunki 2 i 3 przedstawiają chromatogramy dwóch oferowanych w sprzedaży detalicznej rodzajów oliwy z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia, jeden z estrami metylowymi i etylowymi, a drugi bez nich. Rysunek 4 przedstawia chromatogram najwyżej jakości oliwy z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia oraz tej samej oliwy z dodatkiem 20 % oleju dezodoryzowanego.
5.5. Analiza ilościowa wosków
Ustalić za pomocą integratora pola powierzchni pików odpowiadające wzorcowi wewnętrznemu arachidynianu laurylowego i estrom alifatycznym od C40 do C46.
Obliczyć zawartość całkowitą wosków dodając poszczególne woski, w mg/kg tłuszczu, zgodnie ze wzorem:
gdzie:
Ax = pole odpowiadające pikowi każdego z estrów, zgodnie z wyliczeniami programu komputerowego dostosowanego do obliczania pola powierzchni pod pikiem
As = pole odpowiadające pikowi wewnętrznego wzorca arachidynianu laurylowego, zgodnie z wyliczeniami programu komputerowego dostosowanego do obliczania pola powierzchni pod pikiem
ms = masa dodanego wewnętrznego wzorca arachidynianu laurylowego, w miligramach;
m = masa próbki pobranej do oznaczenia, w gramach.
5.5.1. Analiza ilościowa estrów metylowych i etylowych
Ustalić za pomocą integratora pola powierzchni pików odpowiadające wewnętrznemu wzorcowi estru metylowego kwasu heptadekanowego, estrom metylowym kwasów tłuszczowych C16 i C18 oraz estrom etylowym kwasów tłuszczowych C16 i C18.
Obliczyć zawartość poszczególnych estrów alkilowych, w mg/kg, zgodnie ze wzorem:
gdzie:
Ax = pole odpowiadające pikowi poszczególnych estrów C16 i C18, zgodnie z wyliczeniami programu komputerowego dostosowanego do obliczania pola powierzchni pod pikiem
As = pole odpowiadające pikowi wewnętrznego wzorca estru metylowego kwasu heptadekanowego, zgodnie z wyliczeniami programu komputerowego dostosowanego do obliczania pola powierzchni pod pikiem
ms = masa dodanego wewnętrznego wzorca estru metylowego kwasu heptadekanowego, w miligramach;
m = masa próbki pobranej do oznaczenia, w gramach.
6. PREZENTACJA WYNIKÓW
Podać sumę zawartości różnych wosków od C40 do C46 (Uwaga 7) w miligramach na kilogram tłuszczu.
Podać sumę zawartości estrów metylowych i estrów etylowych od C16 do C18 oraz wartość całkowitą obydwu.
Wynik należy podać z dokładnością do mg/kg.
Uwaga 7: Składniki dla celów kwantyfikacji odnoszą się do pików o parzystej liczbie atomów węgla estrów C40 - C46, zgodnie z przykładowym chromatogramem wosków w oliwie z oliwek przedstawionym na załączonym rysunku. Dla celów identyfikacji, jeśli ester C46 jest rozdzielony, zaleca się przeprowadzić analizę frakcji wosków oliwy z wytłoczyn oliwek, w której pik C46 jest możliwy do odróżnienia ponieważ wyraźnie dominuje.
Podać stosunek estrów etylowych do estrów metylowych.
Rysunek 1
Przykład chromatografii gazowej frakcji wosków oliwy z oliwek(*)
Rysunek 2
Estry metylowe, estry etylowe i woski w oliwie z oliwek z pierwszego tłoczenia
Rysunek 3
Estry metylowe, estry etylowe i woski w oliwie z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia
Rysunek 4
Część chromatogramu oliwy z oliwek ekstra z pierwszego tłoczenia oraz tej samej oliwy z dodatkiem oleju dezodoryzowanego
Appendix A
Oznaczenie prędkości liniowej gazu
Wstrzyknąć 1:3 μl metanu (lub propanu) do chromatografu gazowego ustawionego na normalne warunki robocze. Mierzyć czas potrzebny na przejście gazu przez kolumnę, począwszy od momentu wstrzyknięcia do momentu osiągnięcia wartości szczytowej (tM).
Prędkość liniową w cm/sek. oblicza się zgodnie ze wzorem L/tM, gdzie L jest wysokością kolumny w cm, a tM jest czasem mierzonym w sekundach.
- zmieniona przez art. 1 pkt 1 lit. a ppkt ii) rozporządzenia nr (UE) 2015/1830 z dnia 8 lipca 2015 r. (Dz.U.UE.L.2015.266.9) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 16 października 2015 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 1 lit. a rozporządzenia nr 1604/2019 z dnia 27 września 2019 r. (Dz.U.UE.L.2019.250.14) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 20 października 2019 r.
- dodany przez art. 1 pkt 4 rozporządzenia nr 1989/2003 z dnia 6 listopada 2003 r. (Dz.U.UE.L.03.295.57) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 listopada 2003 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 1 rozporządzenia nr 299/2013 z dnia 26 marca 2013 r. (Dz.U.UE.L.13.90.52) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 stycznia 2014 r.
- dodany przez art. 1 pkt 2 rozporządzenia nr 3288/92 z dnia 12 listopada 1992 r. (Dz.U.UE.L.92.327.28) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 listopada 1992 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 6 rozporządzenia nr 796/2002 z dnia 6 maja 2002 r. (Dz.U.UE.L.02.128.8) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 września 2002 r. Zmiany nie zostały naniesione na tekst, gdyż przywoływany akt zmieniający nie został opublikowany w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej - polskim wydaniu specjalnym. Według wersji anglojęzycznej art. 3b został przenumerowany na art. 3.
"1. The Member States may approve assessment panels so that national authorities or their representatives can assess and verify organoleptic characteristics.
The terms of approval shall be set by Member States and ensure that:
- the requirements of Annex XII.4 are met,
- the panel head is given training recognised for this purpose by the Member State,
- continued approval depends on performance in annual checks arranged by the Member State.
Member States shall notify to the Commission a list of approved panels and the action taken under this paragraph."
- zmieniony przez art. 1 rozporządzenia nr 3682/91 z dnia 17 grudnia 1991 r. (Dz.U.UE.L.91.349.36) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 21 grudnia 1991 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 4 rozporządzenia nr 3288/92 z dnia 12 listopada 1992 r. (Dz.U.UE.L.92.327.28) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 listopada 1992 r.
- zmieniony przez art. 1 rozporządzenia nr 1429/92 z dnia 26 maja 1992 r. (Dz.U.UE.L.92.150.17) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 5 czerwca 1992 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 3 rozporządzenia nr 183/93 z dnia 29 stycznia 1993 r. (Dz.U.UE.L.93.22.58) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 20 lutego 1993 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 2 rozporządzenia nr 656/95 z dnia 28 marca 1995 r. (Dz.U.UE.L.95.69.1) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 28 maja 1995 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 2 rozporządzenia nr 2472/97 z dnia 11 grudnia 1997 r. (Dz.U.UE.L.97.341.25) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 10 lutego 1998 r. Zmiany nie zostały naniesione na tekst, gdyż przywoływany akt zmieniający nie został opublikowany w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej - polskim wydaniu specjalnym. Zgodnie z wersją przepisu zmieniającego opublikowaną pierwotnie w wydaniu angielskim Dziennika Urzędowego Wspólnot Europejskich (obecnie Dziennika Urzędowego Unii Europejskiej) załącznik I zastępuje się w całości nową treścią.
- zmieniony przez art. 1 pkt 9 rozporządzenia nr 796/2002 z dnia 6 maja 2002 r. (Dz.U.UE.L.02.128.8) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 września 2002 r. Zmiany nie zostały naniesione na tekst, gdyż przywoływany akt zmieniający nie został opublikowany w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej - polskim wydaniu specjalnym. Zgodnie z wersją przepisu zmieniającego opublikowaną pierwotnie w wydaniu angielskim Dziennika Urzędowego Wspólnot Europejskich (obecnie Dziennika Urzędowego Unii Europejskiej) załącznik I zastępuje się w całości nową treścią.
- zmieniony przez art. 1 pkt 6 rozporządzenia nr 1989/2003 z dnia 6 listopada 2003 r. (Dz.U.UE.L.03.295.57) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 listopada 2003 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 2 rozporządzenia nr 702/2007 z dnia 21 czerwca 2007 r. (Dz.U.UE.L.07.161.11) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 stycznia 2008 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 1 rozporządzenia nr 640/2008 z dnia 4 lipca 2008 r. (Dz.U.UE.L.08.178.11) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 października 2008 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 3 rozporządzenia nr 61/2011 z dnia 24 stycznia 2011 r. (Dz.U.UE.L.11.23.1) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 kwietnia 2011 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 2 rozporządzenia nr 1348/2013 z dnia 16 grudnia 2013 r. (Dz.U.UE.L.2013.338.31) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 marca 2014 r.
- zmieniony przez art. 1 rozporządzenia nr (UE) 2015/1830 z dnia 8 lipca 2015 r. (Dz.U.UE.L.2015.266.9) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 16 października 2015 r.
- zmieniony przez art. 1 rozporządzenia nr (UE) 2016/2095 z dnia 26 września 2016 r. (Dz.U.UE.L.2016.326.1) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 4 grudnia 2016 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 4 rozporządzenia nr 1604/2019 z dnia 27 września 2019 r. (Dz.U.UE.L.2019.250.14) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 20 października 2019 r.
- dodany przez art. 1 pkt 3 rozporządzenia nr 455/2001 z dnia 6 marca 2001 r. (Dz.U.UE.L.01.65.9) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 lipca 2001 r. Zmiany nie zostały naniesione na tekst, gdyż przywoływany akt zmieniający nie został opublikowany w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej - polskim wydaniu specjalnym.
- zmieniony przez art. 1 pkt 6 rozporządzenia nr 1989/2003 z dnia 6 listopada 2003 r. (Dz.U.UE.L.03.295.57) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 listopada 2003 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 3 rozporządzenia nr 1348/2013 z dnia 16 grudnia 2013 r. (Dz.U.UE.L.2013.338.31) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 marca 2014 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 5 rozporządzenia nr 1604/2019 z dnia 27 września 2019 r. (Dz.U.UE.L.2019.250.14) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 20 października 2019 r.
- dodany przez art. 1 pkt 6 rozporządzenia nr 1989/2003 z dnia 6 listopada 2003 r. (Dz.U.UE.L.03.295.57) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 listopada 2003 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 2 rozporządzenia nr 702/2007 z dnia 21 czerwca 2007 r. (Dz.U.UE.L.07.161.11) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 stycznia 2008 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 4 rozporządzenia nr 1348/2013 z dnia 16 grudnia 2013 r. (Dz.U.UE.L.2013.338.31) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 marca 2014 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 3 rozporządzenia nr (UE) 2015/1830 z dnia 8 lipca 2015 r. (Dz.U.UE.L.2015.266.9) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 16 października 2015 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 6 rozporządzenia nr 1604/2019 z dnia 27 września 2019 r. (Dz.U.UE.L.2019.250.14) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 20 października 2019 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 3 rozporządzenia nr 183/93 z dnia 29 stycznia 1993 r. (Dz.U.UE.L.93.22.58) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 20 lutego 1993 r. Zmiany nie zostały naniesione na tekst ze względu na swą bezprzedmiotowość.
- zmieniony przez art. 1 pkt 2 rozporządzenia nr 702/2007 z dnia 21 czerwca 2007 r. (Dz.U.UE.L.07.161.11) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 stycznia 2008 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 1 rozporządzenia nr (UE) 2016/1227 z dnia 27 lipca 2016 r. (Dz.U.UE.L.2016.202.7) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 4 sierpnia 2016 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 3 rozporządzenia nr 183/93 z dnia 29 stycznia 1993 r. (Dz.U.UE.L.93.22.58) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 20 lutego 1993 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 3 rozporządzenia nr 183/93 z dnia 29 stycznia 1993 r. (Dz.U.UE.L.93.22.58) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 maja 1993 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 1 rozporządzenia nr 177/94 z dnia 28 stycznia 1994 r. (Dz.U.UE.L.94.24.33) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 5 lutego 1994 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 2 rozporządzenia nr 702/2007 z dnia 21 czerwca 2007 r. (Dz.U.UE.L.07.161.11) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 stycznia 2008 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 2 rozporządzenia nr 702/2007 z dnia 21 czerwca 2007 r. (Dz.U.UE.L.07.161.11) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 stycznia 2008 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 8 rozporządzenia nr 1604/2019 z dnia 27 września 2019 r. (Dz.U.UE.L.2019.250.14) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 20 października 2019 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 3 rozporządzenia nr 183/93 z dnia 29 stycznia 1993 r. (Dz.U.UE.L.93.22.58) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 20 lutego 1993 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 5 rozporządzenia nr 299/2013 z dnia 26 marca 2013 r. (Dz.U.UE.L.13.90.52) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 stycznia 2014 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 5 rozporządzenia nr (UE) 2015/1830 z dnia 8 lipca 2015 r. (Dz.U.UE.L.2015.266.9) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 16 października 2015 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 5 rozporządzenia nr 3288/92 z dnia 12 listopada 1992 r. (Dz.U.UE.L.92.327.28) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 listopada 1992 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 2 rozporządzenia nr 177/94 z dnia 28 stycznia 1994 r. (Dz.U.UE.L.94.24.33) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 5 lutego 1994 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 9 rozporządzenia nr 796/2002 z dnia 6 maja 2002 r. (Dz.U.UE.L.02.128.8) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 września 2002 r. Zmiany nie zostały naniesione na tekst, gdyż przywoływany akt zmieniający nie został opublikowany w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej - polskim wydaniu specjalnym. Zgodnie z wersją przepisu zmieniającego opublikowaną pierwotnie w wydaniu angielskim Dziennika Urzędowego Wspólnot Europejskich (obecnie Dziennika Urzędowego Unii Europejskiej) załącznik XII zastępuje się w całości nową treścią.
- zmieniony przez art. 1 pkt 2 rozporządzenia nr 640/2008 z dnia 4 lipca 2008 r. (Dz.U.UE.L.08.178.11) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 października 2008 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 7 rozporządzenia nr 1348/2013 z dnia 16 grudnia 2013 r. (Dz.U.UE.L.2013.338.31) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 marca 2014 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 7 rozporządzenia nr (UE) 2015/1830 z dnia 8 lipca 2015 r. (Dz.U.UE.L.2015.266.9) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 16 października 2015 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 2 rozporządzenia nr (UE) 2016/1227 z dnia 27 lipca 2016 r. (Dz.U.UE.L.2016.202.7) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 4 sierpnia 2016 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 9 rozporządzenia nr 1604/2019 z dnia 27 września 2019 r. (Dz.U.UE.L.2019.250.14) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 20 października 2019 r.
- dodany przez art. 1 pkt 2 rozporządzenia nr 656/95 z dnia 28 marca 1995 r. (Dz.U.UE.L.95.69.1) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 28 maja 1995 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 10 rozporządzenia nr 1604/2019 z dnia 27 września 2019 r. (Dz.U.UE.L.2019.250.14) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 20 października 2019 r.
- dodany przez art. 1 pkt 2 rozporządzenia nr 2472/97 z dnia 11 grudnia 1997 r. (Dz.U.UE.L.97.341.25) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 10 lutego 1998 r. Zmiany nie zostały naniesione na tekst, gdyż przywoływany akt zmieniający nie został opublikowany w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej - polskim wydaniu specjalnym.
- zmieniony przez art. 1 rozporządzenia nr 282/98 z dnia 3 lutego 1998 r. (Dz.U.UE.L.98.28.5) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 10 lutego 1998 r. Zmiany nie zostały naniesione na tekst ze względu na swą bezprzedmiotowość.
- zmieniony przez art. 1 pkt 6 rozporządzenia nr 299/2013 z dnia 26 marca 2013 r. (Dz.U.UE.L.13.90.52) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 stycznia 2014 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 11 rozporządzenia nr 1604/2019 z dnia 27 września 2019 r. (Dz.U.UE.L.2019.250.14) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 20 października 2019 r. Zmiany nie zostały naniesione na tekst.
- dodany przez art. 1 pkt 9 rozporządzenia nr 796/2002 z dnia 6 maja 2002 r. (Dz.U.UE.L.02.128.8) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 września 2002 r. Zmiany nie zostały naniesione na tekst, gdyż przywoływany akt zmieniający nie został opublikowany w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej - polskim wydaniu specjalnym.
- zmieniony przez art. 1 pkt 8 rozporządzenia nr (UE) 2015/1830 z dnia 8 lipca 2015 r. (Dz.U.UE.L.2015.266.9) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 16 października 2015 r. Zmiany nie zostały naniesione na tekst ze względu na brak pierwotnej treści nin. załącznika.
- zmieniony przez art. 1 pkt 12 rozporządzenia nr 1604/2019 z dnia 27 września 2019 r. (Dz.U.UE.L.2019.250.14) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 20 października 2019 r.
- dodany przez art. 1 pkt 4 rozporządzenia nr 61/2011 z dnia 24 stycznia 2011 r. (Dz.U.UE.L.11.23.1) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 1 kwietnia 2011 r.
- zmieniony przez art. 1 pkt 13 rozporządzenia nr 1604/2019 z dnia 27 września 2019 r. (Dz.U.UE.L.2019.250.14) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 20 października 2019 r.