Szczegółowe sposoby postępowania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzeniania się bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.
Dz.U.2004.75.709
Akt utracił mocROZPORZĄDZENIE
MINISTRA ROLNICTWA I ROZWOJU WSI 1
z dnia 13 kwietnia 2004 r.
w sprawie szczegółowych sposobów postępowania przy zwalczaniu i zapobieganiu rozprzestrzeniania się bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus 2
ZAŁĄCZNIK
I.
Metody diagnozowania, wykrywania i identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus
Metody diagnozowania, wykrywania i identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus
Standardowa próba składa się z co najmniej 200 bulw pobranych z partii bulw ziemniaka o masie 25 ton, jednakże badanie można również wykonać dla mniejszych prób:
1) myje się 200 bulw pod bieżącą wodą; za pomocą regularnie dezynfekowanego skalpela lub skrobaczki do ziemniaków usuwa się skórkę wokół piętki każdej bulwy; dezynfekcję narzędzi przeprowadza się przez ich zanurzenie w 70 % alkoholu i ich opalenie;
2) z części przystolonowej każdej bulwy pobiera się niewielki fragment tkanki, obejmujący wiązki przewodzące, ograniczając ilość tkanki innej niż przewodząca do minimum, następnie tkankę poddaje się badaniom w ciągu 24 godzin, określonych w ust. 3 lub przechowuje się w temperaturze minus 20 °C do dwóch tygodni w sposób określony w ust. 3.
2. Badanie makroskopowe na obecność objawów chorobowych
Po pobraniu tkanki z części przystolonowej każdą bulwę kroi się w poprzek i bada na obecność objawów bakteriozy pierścieniowej 3 . W tym celu ściska się bulwę i sprawdza, czy z wiązek przewodzących nie wydostają się zmacerowane tkanki.
3. Przygotowanie prób do testu Grama, testu immunofluorescencji (IF) oraz testu oberżynowego
1) tkankę pobraną z części przystolonowej bulw homogenizuje się w środku nietoksycznym dla bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (na przykład 0,05 M bufor fosforanowy /PBS/ o pH 7,0), w temperaturze poniżej 30 °C; zaleca się dodanie nietoksycznego środka rozdrabniającego; może być również niezbędne dodanie nietoksycznego środka zapobiegającego powstawaniu piany, o którym mowa w części II ust. 1; nie można dopuścić do nadmiernej maceracji;
2) zmacerowaną tkankę:
a) odwirowuje się z zastosowaniem parametru: 180 g/10 minut; uzyskany supernatant odwirowuje się z zastosowaniem parametru: 4.000 g/10 minut, następnie zlewa się i usuwa supernatant albo
b) odstawia się na 30 minut w celu osadzenia się resztek roślinnych; zlewa się supernatant bez naruszania osadu, a następnie przefiltrowuje przez bibułę filtracyjną (Whatman nr 1) umieszczoną na filtrze szklanym (nr 2 = 40-100 µm), z zastosowaniem wodnej pompy próżniowej; filtrat zbiera się do probówki wirówkowej, a następnie przepłukuje sterylnym buforem PBS, tak aby uzyskać maksymalnie 35 ml filtratu, który odwirowuje się z zastosowaniem parametru 4.000 g/20 minut;
3) osad zawiesza się w sterylnym buforze fosforanowym 0,01 M o pH 7,2, o którym mowa w części II ust. 2, w taki sposób, aby uzyskać całkowitą objętość około 1 ml, a następnie dzieli się na dwie równe części, jedną z nich pozostawia jako materiał referencyjny, zamrażając w temperaturze -20 °C lub liofilizując; pozostałą część dzieli się na połowę; jedną używa się do testu IF i barwienia Grama, drugą do testu oberżynowego;
4) wszystkie pozytywne kontrole bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus i próby traktuje się oddzielnie w celu uniknięcia kontaminacji; ma to zastosowanie w odniesieniu do preparatów IF i testu oberżynowego; w czasie wykonywania testu IF i testu oberżynowego należy oddzielać od siebie kontrole pozytywne i badane próby w celu uniknięcia kontaminacji.
4. Test Grama
1) przygotowuje się preparaty Grama ze wszystkich rozcieńczeń osadu, o których mowa w ust. 5 pkt 2, i ze wszystkich przeciętych bulw, o których mowa w ust. 2, które na przekroju wykazują szklistość, zgniliznę czy inne podejrzane objawy; materiał do analiz pobiera się z brzegu porażonych tkanek;
2) przygotowuje się preparaty Grama ze znanych kultur bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus oraz, w miarę możliwości, z naturalnie porażonych tkanek, o których mowa w ust. 5 pkt 1;
3) określa się, które próby zawierają typowe, Gram dodatnie, maczugowate komórki; komórki bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus mają na ogół długość 0,8 do 1,2 µm i szerokość 0,4-0,6 µm 4 ; procedura barwienia jest określona w części 2 ust. 3.
5. Test IF
1) w teście IF używa się przeciwciał na znany szczep bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus - ATCC 33113 (NCPPB 2137) lub NCPPB 2140, o mianie powyżej 1:600; w preparacie z badaną próbą uwzględnia się kontrolę PBS w celu sprawdzenia, czy koniugat izotiocyjanianu fluoresceiny przeciw immunoglobulinom króliczym (FITC) nie łączy się niespecyficznie z komórkami bakterii; jako kontrolę pozytywną na oddzielnym szkiełku stosuje się kulturę bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (ATCC 33113 /NCPPB 2137/NCPPB 2140) oraz w miarę możliwości umieszcza się naturalnie zainfekowaną tkankę (zachowaną w formie zliofilizowanej lub zamrożoną w temperaturze -20 °C), zgodnie ze schematem 2;
2) sposób wykonania badania:
a) przygotowuje się trzy seryjne dziesięciokrotne rozcieńczenia (1:10, 1:100 i 1:1.000) osadu w wodzie destylowanej (schemat 1),
b) na okienka wielopunktowego szkiełka mikroskopowego nanosi się za pomocą pipety odmierzoną standardową objętość każdego rozcieńczenia osadu lub zawiesiny bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (średnio 106 komórek/ml), wystarczającą do pokrycia okienka (średnio 25 µl),
Schemat 1
Preparaty z próby i kontrola PBS
Schemat 2
Preparat z kontrolą pozytywną
c) preparat suszy się w temperaturze około 37 °C, a następnie utrwala z użyciem etanolu lub przez opalenie,
d) okienka pokrywa się przeciwciałami na bakterię Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus rozcieńczonymi w 0,01 M buforze PBS o pH 7,2, o którym mowa w części II ust. 2, jak pokazano na schemacie 1; używa się PBS jako kontrolę FITC; rozcieńczenie robocze przeciwciał stanowi zwykle połowę miana; w przypadku użycia innych rozcieńczeń przeciwciał, dla każdego rozcieńczenia przygotowuje się oddzielne preparaty,
e) preparat inkubuje się w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 30 minut,
f) po inkubacji preparat ostrożnie spłukuje się 0,01 M buforem PBS o pH 7,2, a następnie moczy się trzy razy po 5 minut w 0,01 M buforze PBS o pH 7,2,
g) ostrożnie usuwa się nadmiar wilgoci,
h) każde okienko preparatu pokrywa się koniugatem FITC w takim rozcieńczeniu, jakie było stosowane do określania miana, i inkubuje się w ciemnej, wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej,
i) preparat spłukuje się i moczy, tak jak w lit. f,
j) na każde okienko nanosi się średnio od 5 do 10 µl 0,1 M buforu fosforanowego z gliceryną o pH 7,6, o którym mowa w części II ust 2 (lub podobnego utrwalacza o pH nie niższym niż 7,6) i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym,
k) przygotowany preparat przegląda się w mikroskopie zaopatrzonym w źródło światła epifluorescencyjnego i filtry przeznaczone do pracy z FITC; stosuje się powiększenie 400 do 1.000; okienka w powtórzeniach przegląda się w poprzek dwóch średnic pod kątem prostym oraz wokół obwodu okienka.
Poszukuje się fluoryzujących komórek w kontrolach pozytywnych i określa się miano przeciwciał. Następnie poszukuje się fluoryzujących komórek w okienku kontrolnym FITC/PBS i, jeżeli się ich nie stwierdzi, przechodzi się do przeglądania okienek z badaną próbą. W minimum 10 polach mikroskopu określa się średnią liczbę morfologicznie typowych, fluoryzujących komórek w polu widzenia i oblicza się ich liczbę w mililitrze nierozcieńczonego osadu według wzoru określonego w części II ust. 4.
Przy ocenie peparatów bierze się pod uwagę możliwość wystąpienia reakcji krzyżowych. W osadzie ziemniaka mogą występować populacje fluoryzujących komórek o nietypowej dla bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus morfologii oraz bakterie saprofityczne dające reakcje krzyżowe, o wymiarach i morfologii podobnych do bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, dlatego też bierze się pod uwagę tylko fluoryzujące komórki o typowych wymiarach i morfologii. Ze względu na możliwość występowania reakcji krzyżowych, próby, w przypadku których uzyskano pozytywne wyniki testu IF, poddaje się powtórnym badaniom z zastosowaniem innych przeciwciał.
Techniczna granica wykrywalności określona dla tego testu zawiera się w przedziale 103-104 komórek/ml nierozcieńczonego osadu. Próby, w których stwierdza się ilość typowych fluorescencyjnych komórek na granicy wykrywalności, są zwykle wolne od Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, ale mogą być poddane testowi oberżynowemu.
Wynik testu IF traktuje się jako negatywny w przypadku prób, w których nie stwierdza się morfologicznie typowych fluoryzujących komórek. Próby takie uznaje się za "nieporażone" przez bakterie Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Test oberżynowy nie jest wymagany.
Wynik testu IF traktuje się jako pozytywny w przypadku prób, w których obecne są morfologicznie typowe, fluoryzujące komórki.
Próby, w przypadku których uzyskuje się pozytywny wynik testu IF z zastosowaniem obydwu rodzajów przeciwciał, uznaje się za "potencjalnie porażone" przez bakterie Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.
W przypadku wszystkich prób uznanych za "potencjalnie porażone" wykonuje się test oberżynowy.
6. Test oberżynowy
Sposób uprawy oberżyny określony jest w części II ust. 5.
Test oberżynowy przeprowadza się w następujący sposób:
1) osadem, który otrzymano w sposób określony w ust 3 pkt 3, inokuluje się co najmniej 25 roślin oberżyny w stadium trzeciego liścia uzyskanych w sposób określony w części II ust. 5, za pomocą jednej z metod, o których mowa w ust. 6 pkt 2, 3 i 4;
2) inokulacji przez nacięcie na łodydze - pierwszy sposób:
a) każdą doniczkę umieszcza się poziomo w bloczku z polistyrenu (w przypadku doniczki o średnicy 10 cm odpowiedni jest bloczek z polistyrenu z wydrążonym z jednej strony miejscem o głębokości 5 cm, szerokości 10 cm i długości 15 cm), w sposób przedstawiony na schemacie 3; pomiędzy łodygą a bloczkiem, dla każdej próby, umieszcza się pasek sterylnej folii aluminiowej; roślinę można zabezpieczyć za pomocą gumowej opaski nałożonej wokół bloczka,
Schemat 3
b) pomiędzy liścieniami i pierwszym liściem, wykonuje się za pomocą skalpela podłużne lub lekko ukośne nacięcie o długości 0,5-1,0 cm i głębokości średnio 3/4 średnicy łodygi,
c) nacięcie rozchyla się za pomocą skalpela i wprowadza do niego inokulum cienkim pędzelkiem zanurzonym w osadzie. Pozostały osad rozdziela się pomiędzy rośliny oberżyny,
d) powstałą ranę zabezpiecza się 2 ml sterylnej wazeliny naniesionej za pomocą strzykawki;
3) inokulacja przez nacięcie na łodydze - drugi sposób:
a) trzymając roślinę pomiędzy dwoma palcami, w miejscu pomiędzy liścieniami i pierwszym liściem nanosi się kroplę (średnio od 5 do 10 µl) zawiesiny osadu,
b) za pomocą sterylnego skalpela wykonuje się podłużne (pod kątem około 5 °) nacięcie, o długości 1,0 cm i głębokości średnio 2/3 grubości łodygi, rozpoczynając od miejsca naniesienia kropli osadu,
c) powstałą ranę zabezpiecza się sterylną wazeliną ze strzykawki;
4) inokulacja za pomocą strzykawki - trzeci sposób:
a) nie podlewa się roślin oberżyny przez jeden dzień przed inokulacją w celu obniżenia ciśnienia turgorowego,
b) łodygi oberżyny powyżej liścieni inokuluje się za pomocą strzykawki z igłą do iniekcji podskórnej (nie mniejszej niż 23 G); osad rozdziela się pomiędzy rośliny oberżyny;
5) inokuluje się 25 roślin oberżyny kulturą bakterii zidentyfikowaną wcześniej jako kultura bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus i, w miarę możliwości, naturalnie zainfekowaną tkanką ziemniaka, o której mowa w ust. 5 pkt 1, za pomocą tej samej metody inokulacji;
6) inokuluje się 25 roślin sterylnym 0,05 M buforem PBS za pomocą tej samej metody inokulacji;
7) rośliny inkubuje się w odpowiednich warunkach, o których mowa w części II ust. 5, przez 40 dni; po 8 dniach obserwuje się rośliny w celu stwierdzenia, czy nie występują na nich objawy choroby 5 oraz notuje się liczbę roślin wykazującą objawy;
8) przygotowuje się preparaty Grama, o których mowa w ust. 4, dla wszystkich partii oberżyny wykazujących objawy, wykonując przekroje przez tkankę zwiędłego liścia lub łodygi rośliny, oraz dokonuje się izolacji na odpowiednie podłoże odżywcze, o którym mowa w ust. 7; liście i łodygi oberżyny dezynfekuje się powierzchniowo przez zwilżenie ich 70 % etanolem;
9) przy ocenie roślin testowych bierze się pod uwagę możliwość wystąpienia infekcji latentnej, szczególnie gdy uprawa nie jest prowadzona w optymalnych warunkach, nawet po 40-dniowej inkubacji. Infekcje takie mogą prowadzić do zahamowania wzrostu i braku wigoru inokulowanych roślin; jeżeli wynik testu IF uznany jest za pozytywny, koniecznym może być przeprowadzenie dodatkowych badań, dlatego też należy dokonać porównania tempa wzrostu wszystkich badanych roślin oberżyny z roślinami kontrolnymi inokulowanymi sterylnym 0,05 M PBS oraz monitorowanie warunków środowiska szklarni; dalszą ocenę prowadzi się w następujący sposób:
a) odcina się łodygi powyżej miejsca inokulacji i usuwa się liście,
b) łodygi maceruje się w 0,05 M buforze PBS o pH 7,0 w sposób określony w ust. 3 pkt 1 i 2,
c) połowę osadu używa się do wykonania testu Grama i testu IF,
d) drugą połowę osadu używa się do przeprowadzenia dodatkowego testu oberżynowego, zgodnie z ust. 6, jeżeli uzyskano wyniki pozytywne testu Grama lub testu IF; stosuje się kontrolę pozytywną, którą stanowi zidentyfikowaną wcześniej kulturę bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, oraz kontrolę negatywną w postaci sterylnego 0,05 M buforu PBS; jeżeli w kolejnych testach nie są obserwowane objawy, próbę uznaje się jako negatywną.
7. Izolacja bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus
Ostateczną diagnozę stawia się wyłącznie po przeprowadzeniu identyfikacji wyizolowanych kultur bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, o której mowa w ust. 8. Bakterię Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus można wyizolować z tkanek wykazujących objawy chorobowe. Bezpośrednia izolacja bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus z osadu uzyskanego z tkanki ziemniaka, o którym mowa w ust. 3 pkt 3, nie jest zalecana.
Rośliny oberżyny stanowią swoiste podłoże umożliwiające namnożenie się bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus, jak również są najlepszą testową rośliną żywicielską. Bakterię izoluje się ze wszystkich bulw ziemniaka i roślin oberżyny wykazujących objawy, o których mowa w ust. 4 i 6. Macerację łodyg oberżyny, o ile jest to konieczne, wykonuje się zgodnie z ust. 3 i 6 pkt 9:
1) zawiesinę posiewa się na jedno z następujących podłoży, określonych w części II ust. 6:
- Nutrient dextrose agar (agar odżywczy z glukozą) (tylko do przeszczepiania),
- Yeast peptone glucose agar (agar drożdżowo-peptonowo-glukozowy),
- Nutrient yeast dextrose agar (agar odżywczy drożdżowo-glukozowy),
- Yeast extract mineral salts agar (agar z wyciągiem drożdżowym wzbogacony solami mineralnymi).
Szalki inkubuje się w temperaturze 21 °C do 20 dni, a następnie obserwuje się, czy na podłożu obecne są kolonie bakterii o morfologii typowej dla bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. 6 Następnie bakterię Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus przeszczepia się w celu uzyskania czystej kultury.
8. Identyfikacja wyizolowanych kultur bakterii
Ze zdrowych lub porażonych ziemniaków i oberżyny można wyizolować wiele Gram dodatnich, maczugowatych bakterii, wytwarzających kolonie podobne do tych produkowanych przez bakterie Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Z tego względu dokonuje się identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus w oparciu o następujące testy:
1) test IF;
2) test oberżynowy;
3) testy biochemiczne i fizjologiczne, o których mowa w części II ust. 7:
a) test oksydacyjno-fermentacyjny (O/F),
b) test na obecność oksydazy,
c) wzrost w temperaturze 37 °C,
d) produkcja ureazy,
e) hydroliza eskuliny,
f) hydroliza skrobi,
g) tolerancja w stosunku do 7 % NaCl,
h) produkcja indolu,
i) test na obecność katalazy,
j) produkcja H2S,
k) wykorzystanie cytrynianu,
l) hydroliza żelatyny,
m) wytwarzanie kwasu z: glicerolu, laktozy, ramnozy i salicyny,
n) barwienie Grama.
W każdym teście uwzględnia się zidentyfikowaną wcześniej kulturę bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. W testach biochemicznych i fizjologicznych wykorzystuje się kultury wyhodowane na agarze odżywczym. Cechy morfologiczne bakterii ocenia się na podstawie kultur wyrosłych na agarze z glukozą.
Test IF wykonuje się z wykorzystaniem zawiesiny bakterii o stężeniu 106 komórek/ml. Wartość miana przeciwciał powinna być zbliżone do miana określonego w badaniu i użyciem zidentyfikowanej kultury bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus. Test oberżynowy wykonuje się z wykorzystaniem zawiesiny bakterii o stężeniu 107 komórek/ml. Do testu używa się 10 roślin dla każdej próby, stosując znaną kulturę bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus oraz wodę sterylną jako kontrole pozytywną i negatywną.
W przypadku czystych kultur typowe objawy więdnięcia uzyskuje się w ciągu 20 dni, lecz rośliny niewykazujące objawów po upływie tego czasu inkubuje się do końca 30-dniowego okresu w temperaturze optymalnej dla uprawy oberżyny, lecz nieprzekraczającej 30 °C. Jeżeli po 30 dniach objawy nie wystąpią, kultura nie może być uznana za patogeniczną formę bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus.
Test | Bakteria Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus |
O/F | obojętna lub słabo utleniająca |
oksydaza | - |
katalaza | + |
redukcja azotanów | - |
aktywność ureazy | - |
produkcja H2S | - |
produkcja indolu | - |
wykorzystanie cytrynianu | - |
hydroliza skrobi | - lub słaba |
wzrost w temperaturze 37 °C | - |
wzrost w obecności 7 % NaCl | - |
hydroliza żelatyny | - |
hydroliza eskuliny | + |
produkcja kwasu z: | |
- glicerolu | - |
- laktozy | - lub słaba |
- ramnozy | - |
- salicyny | - |
II.
Odczynniki, podłoża i testy stosowane przy diagnozowaniu, wykrywaniu i identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus
Odczynniki, podłoża i testy stosowane przy diagnozowaniu, wykrywaniu i identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus
D C silicone antifoam MS A compound
(Hopkins & Williams Ltd, nr kat. 9964 - 25,
Chadwell Heath, Essex, England) - środek
przeciwpieniący 10 ml
Lubrol W w płatkach (ICI Ltd) 0,5 g
pirofosforan czterosodowy 1 g
0,05 M bufor fosforanowy, pH 7,0 1 litr
2. Bufory
1) 0,05 M bufor fosforanowy o pH 7,0 stosowany do maceracji tkanek ziemniaka, o której mowa w części I ust. 3 pkt 1
Na2HPO4 4,26 g
KH2PO4 2,72 g
NaCl 8,00 g
woda destylowana - uzupełnia się do 1 litra
2) 0,01 M bufor fosforanowy o pH 7,2 stosowany do rozcieńczania przeciwciał i płukania preparatów w metodzie IF
Na2HPO4 x 12 H2O 2,70 g
NaH2PO4 x 2 H2O 0,40 g
NaCl 8,00 g
woda destylowana uzupełnia się do 1 litra
3) 0,1 M bufor fosforanowy z gliceryną o pH 7,6 stosowany do zamykania preparatów, utrwala efekt fluorescencji
Na2HPO4 x 12 H2O 3,20 g
NaH2PO4 x 2 H2O 0,15 g
glicerol 50 ml
woda destylowana 100 ml
3. Test Grama (modyfikacja Huckera)
1) Roztwór fioletu krystalicznego
2 g fioletu krystalicznego rozpuszcza się w 20 ml 95 % etanolu
0,8 g kwaśnego węglanu sodu rozpuszcza się w 80 ml wody destylowanej
Miesza się obydwa roztwory.
2) Płyn Lugola
jod 1 g
jodek potasu 2 g
woda destylowana 300 ml
Substancje stałe rozdrabnia się razem w moździerzu. Dodaje się wodę i miesza w zamkniętym naczyniu do rozpuszczenia.
3) Roztwór barwnika kontrastowego - safraniny
Roztwór podstawowy:
safranina O 2,5 g
95 % etanol 100 ml
Miesza się oba roztwory i przechowuje. W celu uzyskania roztworu roboczego, mieszaninę rozcieńcza się w stosunku 1:10.
4) Procedura barwienia:
a) przygotowuje się rozmaz, suszy się go powietrznie i utrwala termicznie,
b) preparat zalewa się fioletem krystalicznym na 1 minutę,
c) krótko przepłukuje się wodą z kranu,
d) zalewa się płynem Lugola na 1 minutę,
e) przepłukuje się wodą z kranu i osusza bibułą,
f) preparat odbarwia się 95 % etanolem dodawanym kroplami aż do momentu, gdy rozmaz przestanie uwalniać barwnik, lub zanurza się w alkoholu na 30 sekund lekko poruszając preparatem,
g) przepłukuje się wodą z kranu i osusza bibułą,
h) zalewa się roztworem safraniny na 10 sekund,
i) preparat przepłukuje się wodą z kranu i osusza bibułą.
Bakterie Gram dodatnie barwią się na kolor niebieskofioletowy, bakterie Gram ujemne na różowoczerwony.
4. Określanie populacji komórek pozytywnych w teście immunofluorescencji
Powierzchnia (S) okienka na szkiełku wielopunktowym
(1)
gdzie:
D = średnica okienka.
Powierzchnia (s) pola widzenia obiektywu
(2)
gdzie:
d = średnica pola widzenia.
d określa się na podstawie bezpośredniego pomiaru lub według następującego wzoru:
(3)
gdzie:
i = współczynnik pola (zależy od typu okularu i zawiera się w granicach od 8 do 24),
K = współczynnik tubusa (1 lub 1,25)
G = powiększenie 100x, 40x obiektywu,
na podstawie (2)
na podstawie (3) (4)
Liczy się typowe fluoryzujące komórki w polu widzenia (c).
Określa się liczbę typowych fluoryzujących komórek w okienku (C).
Określa się liczbę typowych fluoryzujących komórek w ml osadu (N)
gdzie:
y = objętość osadu naniesionego na okienko,
F = współczynnik rozcieńczenia osadu.
5. Uprawa oberżyny
Nasiona oberżyny (Solanum melongena odmiana Black Beauty) wysiewa się do pasteryzowanego kompostu. Siewki z w pełni rozwiniętymi liścieniami (10-14-dniowe) przesadza się do pasteryzowanego kompostu w doniczkach. Do badań używa się oberżynę w stadium trzeciego liścia, gdy dwa, lecz nie więcej niż trzy liście, są w pełni rozwinięte. Oberżynę hoduje się w szklarni w następujących warunkach środowiska:
- długość dnia: 14 godzin lub naturalna długość dnia w przypadku dnia dłuższego;
- temperatura: dzień: 21-24 °C, noc: 15 °C.
Bakteria Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus nie rośnie w temperaturze powyżej 30 °C. Jeżeli temperatura nocą nie spada do 15 °C, może wystąpić uszkodzenie chromatoforów, co uwidoczni się w postaci srebrzystej nekrozy. Uszkodzeniom korzeni przez larwy ziemiórek zapobiega się przez zastosowanie odpowiedniego insektycydu.
6. Podłoża do hodowli i izolacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus
1) Nutrient agar (NA) - agar odżywczy
Difco Bacto Nutrient Agar rozpuszcza się w wodzie destylowanej według proporcji podanych przez producenta, a następnie sterylizuje w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
2) Nutrient dextrose agar (NDA) - agar odżywczy z glukozą
Pożywkę agarową Difco Bacto Nutrient Agar zawierającą 1 % D(+) glukozy (jednowodna), po przygotowaniu według zaleceń producenta, sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 20 minut.
3) Yeast peptone glucose agar (YPGA) - agar drożdżowo-peptonowo-glukozowy
Difco Bacto Yeast Extract (nr 0127) (wyciąg drożdżowy) 5 g
Difco Bacto Peptone (nr 0118) 5 g
D(+)-glukoza (jednowodna) 10 g
Difco Bacto Purified Agar (nr 0560) (agar oczyszczony) 15 g
woda destylowana 1 litr
Pożywkę w porcjach półlitrowych sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 20 minut.
4) Yeast extract mineral salts medium (YGM) - pożywka z wyciągiem drożdżowym wzbogacona solami mineralnymi
Difco Bacto Yeast Extract
(wyciąg drożdżowy) 2,00 g
D(+)-glukoza (jednowodna) 2,50 g
K2HPO4 0,25 g
KH2PO4 0,25 g
MgSO4 x 7H2O 0,10 g
MnSO4 x H2O 0,015 g
NaCl 0,05 g
FeSO4 x 7H2O 0,005 g
Difco Bacto Purified Agar (agar oczyszczony) 18,0 g
woda destylowana 1 litr
Pożywkę w porcjach półlitrowych sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 20 minut.
7. Testy biochemiczne i fizjologiczne do identyfikacji bakterii Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus
Wszystkie podłoża inkubuje się w temperaturze 21 °C i przegląda się po 6 dniach. Jeżeli nie obserwuje się wzrostu bakterii, inkubuje się podłoża dalej do 20 dni.
1) Test oksydacyjno-fermentacyjny test O/F
Pożywka podstawowa:
KCl 0,2 g
MgSO4 x 7H2O 0,2 g
NH4H2PO4 1,0 g
Difco bacto pepton 1,0 g
Difco Bacto Purified Agar (agar oczyszczony) 3,0 g
D(+) glukoza (jednowodna) 10,0 g
błękit bromotymolowy 0,03 g
woda destylowana 1 litr
Miesza się składniki i ustala pH na poziomie 7,0-7,2 za pomocą 1N KOH. Rozdziela się po 5 ml i 10 ml do probówek bakteryjnych o wymiarach 16 mm x 100 mm (objętość 12 ml). Probówki z pożywką sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 10 minut. Każdą kulturą inokuluje się podłoże w 5 ml i 10 ml probówkach metodą nakłucia. Do probówki 10 ml dodaje się aseptycznie 1-2 ml sterylnej, ciekłej parafiny, a następnie inkubuje się.
Odczyt wyniku:
Probówka | Kolor | Interpretacja |
otwarta | żółty | metabolizm |
zamknięta | żółty | fermentacyjny |
otwarta | żółty | metabolizm |
zamknięta | niebieskozielony | oksydacyjny |
otwarta | zielonkawy | metabolizm |
zamknięta | niebieskozielony | oksydacyjny lub obojętny |
2) Test na obecność oksydazy
Odczynnik Kovacsa stanowi 1 % roztwór wodny dwuhydrochlorku tetrametylparafenylenodwuaminy (BDH nr 30386) w wodzie destylowanej.
Odczynnik ten sporządza się na bieżące potrzeby w objętościach 1 ml lub przechowuje się go w ciemnej, szklanej butelce w temperaturze 5 °C przez 1-4 tygodni. Kroplę odczynnika nanosi się na bibułę filtracyjną w czystej płytce Petriego. Jednocześnie pobiera się badaną kulturę z agaru odżywczego za pomocą platynowej ezy.
Reakcję pozytywną stwierdza się na podstawie wystąpienia purpurowego zabarwienia w ciągu 10 sekund. Reakcja taka uzyskana w ciągu 10-30 sekund daje wynik słabo dodatni.
Przy przeprowadzaniu testu należy stosować platynową ezę i kulturę z agaru odżywczego, gdyż śladowe ilości żelaza lub duża zawartość cukru w podłożu wzrostowym może wpływać na fałszywie pozytywne wyniki.
3) Produkcja kwasu z laktozy, ramnozy, salicyny, glicerolu
Przygotowuje się podłoże O/F Hugh i Leifsona bez glukozy, a następnie rozlewa do probówek po 5 ml. Probówki wraz z podłożem sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 10 minut. Do płynnego podłoża podstawowego o temperaturze 45 °C dodaje się, aseptycznie przez filtr, 0,5 ml 10 % roztworu wodnego glicerolu lub laktozy lub ramnozy lub salicyny. Ostrożnie miesza się.
Reakcję pozytywną stwierdza się na podstawie zmiany zabarwienia z niebieskozielonego na żółte, wskazującego na produkcję kwasu.
4) Test na obecność katalazy
Kroplę nadtlenku wodoru (30 objętości) umieszcza się na czystym szkiełku przedmiotowym i miesza z kulturą bakterii za pomocą platynowej ezy.
Reakcję pozytywną stwierdza się na podstawie wydzielanych pęcherzyków gazu, wskazujących na obecność katalazy.
5) Aktywność reduktazy azotanowej i denitryfikacja
Podłoże hodowlane:
KNO3 (bez azotynu) 1 g
Difco bacto yeast extract 1 g
K2HPO4 5 g
woda destylowana 1 litr
Rozlewa się po 10 ml do butelek o pojemności 20 ml, a następnie sterylizuje w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
Odczynnik A:
H2SO4 8 g
5 N kwas octowy 1 litr
Odczynnik B:
naftyloamina 5 g
5 N kwas octowy 1 litr
Podłoże azotanowe inokuluje się w dwóch powtórzeniach, a następnie bada po 10 i 20 dniach przez dodanie 1 kropli płynu Lugola, 0,5 ml odczynnika A i 0,5 ml odczynnika B. Jeżeli podłoże nie zmieni barwy na czerwonawą, dodaje się około 50 mg sproszkowanego cynku i obserwuje reakcję barwną.
Reakcja pozytywna | Reakcja barwna | |
stadium 1 | stadium 2 | |
brak redukcji azotanów | bezbarwna | czerwona |
redukcja azotanów do azotynów (tylko reduktaza azotanowa) | czerwona | - |
redukcja azotanów poniżej azotynów (denitryfikacja - reduktaza azotanowa i azotynowa) | bezbarwna | bezbarwna |
6) Produkcja ureazy
Podłoże podstawowe:
Oxoid urea agar base (CM53) 2,4 g
woda destylowana 95 ml
Podłoże podstawowe sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 20 minut, następnie schładza do temperatury 50 °C, dodaje się, aseptycznie przez filtr, 5 ml 40 % roztworu wodnego mocznika (Oxoid SR20) i dokładnie miesza się.
Pożywkę rozlewa się po 6 ml do sterylnych probówek (16 x 100 mm) i pozostawia do zastygnięcia w postaci skosów.
Reakcję pozytywną, w przypadku aktywności ureazy, stwierdza się na podstawie zmiany barwy podłoża z żółtopomarańczowej na barwę wiśniowoczerwoną lub karmazynoworóżową.
7) Wykorzystanie cytrynianu
Citrate agar base (Merck 2503) 23 g
woda destylowana 1 litr
Wymienione składniki miesza się i rozpuszcza przez podgrzanie, a następnie rozlewa po 6 ml, tak jak w przypadku podłoża z mocznikiem. Pożywkę sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut i pozostawia do zastygnięcia w postaci skosów.
Reakcję pozytywną stwierdza się na podstawie zmiany zabarwienia podłoża z pomarańczowego na czerwone.
8) Wytwarzanie siarkowodoru
Podłoże:
Difco bacto tryptone (nr 0123) 10 g
K2HPO4 1 g
NaCl 5 g
woda destylowana 1 litr
Składniki rozpuszcza się i rozlewa po 6 ml do probówek o wymiarach 16 x 100 ml, a następnie sterylizuje w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 10 minut. Podłoże zaszczepia się badaną kulturą bakterii, a z brzegu probówki zawiesza się aseptycznie papierek nasycony octanem ołowiowym i mocuje się za pomocą korka. Inkubuje się do 20 dni.
Reakcję pozytywną, będącą dowodem na produkcję H2S z tryptonu, stwierdza się na podstawie przebarwienia papierka testowego na kolor czarnobrązowy.
9) Wytwarzanie indolu
Podłoże przygotowuje się tak, jak w teście na wytwarzanie H2S.
Usuwa się papierek nasycony octanem ołowiu, dodaje 1-2 ml eteru dwuetylowego i delikatnie wstrząsa. Odstawia się probówkę w celu rozdzielenia warstw (5 minut), a następnie dodaje 0,5 ml odczynnika Kovacsa, wprowadzając do wnętrza przechylonej probówki.
Reakcją pozytywną, świadczącą o obecności indolu, jest pojawienie się czerwonej barwy w żółtej warstwie pomiędzy eterem i frakcjami wodnymi.
10) Wzrost w temperaturze 37 °C
Podłoże:
Difco bacto nutrient broth (nr 0003) 8 g
woda destylowana 1 litr
Miesza się składniki, rozpuszcza i rozlewa do probówek po 6 ml, a następnie sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut. Probówkę wraz z podłożem inokuluje się badaną kulturę bakterii i inkubuje w temperaturze 37 °C.
Reakcję pozytywną stwierdza się na podstawie wzrostu bakterii.
11) Wzrost w obecności 7 % chlorku sodu
Podłoże:
Difco bacto nutrient broth 8 g
NaCl 70 g
woda destylowana 1 litr
Składniki miesza się, rozpuszcza i rozlewa do probówek po 6 ml. Następnie sterylizuje w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
Reakcję pozytywną stwierdza się na podstawie wzrostu bakterii.
12) Hydroliza żelatyny
Podłoże:
Difco bacto gelatine (nr 0143) 120 g
woda destylowana 1 litr
Składniki miesza się, rozpuszcza przez podgrzanie i rozlewa do probówek po 6 ml. Następnie sterylizuje się w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.
Reakcję pozytywną stwierdza się na podstawie rozpuszczonej żelatyny, nawet w przypadku utrzymywania jej w temperaturze 5 °C przez 30 minut.
13) Hydroliza skrobi
Podłoże:
Difco Bacto Nutrient Agar (płynny agar odżywczy) 1 litr
Difco bacto soluble starch (nr 0178) (skrobia rozpuszczalna) 2 g
Składniki miesza się, sterylizuje w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 10 minut, a następnie rozlewa do płytek. Płytki inokuluje się punktowo badaną kulturą bakterii. Po uzyskaniu obfitego wzrostu bakterii (inkubuje 10 do 20 dni), usuwa się częściowo bakterie z pożywki i płytkę zalewa się płynem Lugola.
Reakcję pozytywną stwierdza się na podstawie wystąpienia strefy przejaśnienia wokół kolonii bakterii i zabarwieniu pozostałej części pożywki na purpurowo.
14) Aktywność hydrolazy eskuliny
Podłoże:
Difco Bacto Peptone 10 g
Eskulina 1 g
cytrynian żelazowy (Merck 3862) 0,05 g
cytrynian sodowy 1 g
woda destylowana 1 litr
Składniki miesza się i rozlewa do probówek po 6 ml, a następnie sterylizuje w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 10 minut. Pożywka jest przezroczysta, wykazuje jednak niebieskawą fluorescencję.
Reakcję pozytywną, będącą dowodem na hydrolizę eskuliny, stwierdza się na podstawie brązowego zabarwienia połączonego z zanikiem fluorescencji. Zjawisko to można sprawdzić stosując lampę ultrafioletową.
- Dyrektywy Rady 93/85/EEC z dnia 4 października 1993 r. w sprawie zwalczania bakteriozy pierścieniowej ziemniaka (Dz. Urz. WE, L 259 z 18.10.1993 r.).
Dane dotyczące ogłoszenia aktu prawa Unii Europejskiej, zamieszczone w niniejszym rozporządzeniu, z dniem uzyskania przez Rzeczpospolitą Polską członkostwa w Unii Europejskiej, dotyczą ogłoszenia tego aktu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej - wydanie specjalne.
Dokumenty powiązane
Jeżeli chcesz mieć dostęp do wszystkich dokumentów powiązanych, zaloguj się do LEX-a Nie korzystasz jeszcze z programów LEX? Zamów dostęp testowy »