Dyrektywa 2006/63/WE zmieniająca załączniki II–VII do dyrektywy Rady 98/57/WE w sprawie kontroli organizmu Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al
Dz.U.UE.L.2006.206.36
Akt jednorazowyDYREKTYWA KOMISJI 2006/63/WE
z dnia 14 lipca 2006 r.
zmieniająca załączniki II-VII do dyrektywy Rady 98/57/WE w sprawie kontroli organizmu Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al.
uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,
uwzględniając dyrektywę Rady 98/57/WE z dnia 20 lipca 1998 r- .(1) w sprawie kontroli Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., w szczególności jej art. 11,
a także mając na uwadze, co następuje:
(1) Jednym z głównych organizmów szkodliwych dla ziemniaka i pomidora jest bakteria Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. (zwana dalej "organizmem"), powodująca chorobę zwaną śluzakiem.
(2) Organizm wciąż występuje w niektórych częściach terytorium Wspólnoty.
(3) Dyrektywa 98/57/WE ustanowiła szczegółowe środki do podjęcia przez państwa członkowskie przeciwko organizmowi dla jego zlokalizowania i określenia zasięgu jego występowania; niedopuszczenia do jej wystąpienia i rozprzestrzeniania się oraz - w przypadku stwierdzenia obecności tego organizmu - zabezpieczenia przed jego rozprzestrzenianiem się i jego zniszczenia przez usunięcie roślin z korzeniami.
(4) Od tamtego czasu poczyniono znaczne postępy w rozumieniu biologii, procedurach wykrywania i identyfikacji organizmu; ponadto doświadczenie praktyczne uzyskane w trakcie kontroli organizmu wymaga rewizji kilku przepisów technicznych związanych ze środkami kontroli.
(5) W wyniku wspomnianych postępów wydaje się, że należy zrewidować i zaktualizować środki będące przedmiotem niektórych załączników do dyrektywy 98/57/WE.
(6) W odniesieniu do procedur wykrywania i identyfikacji uwzględniono nowoczesną metodę wykrywania: test FISH, czyli fluorescencyjną hybrydyzację in situ. Uwzględniono również udoskonalony test PCR oraz ulepszone różne techniczne elementy aktualnej procedury wykrywania i identyfikacji, a także metody wykrywania i identyfikacji organizmu w roślinach żywicielskich innych niż ziemniaki oraz w wodzie i glebie.
(7) Jeśli chodzi o techniczne elementy środków zwalczania choroby, zmieniono przepisy dotyczące: sposobu przechowywaia badanych prób, dla zapewnienia śledzenia porażenia, elementów potrzebnych do określenia zasięgu prawdopodobnego porażenia, szczegółów powiadamiania o wszelkich potwierdzonych przypadkach występowania organizmu oraz o strefach porażenia, środków, które należy wprowadzić w miejscach produkcji określonych jako porażone, a znajdujących się w obrębie wyznaczonych stref. Ponadto dołączono pewne postanowienia dotyczące pomidorów, tak aby w większym stopniu uwzględniać znaczenie tej rośliny jako żywiciela organizmu.
(8) Środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Zdrowia Roślin,
PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:
| W imieniu Komisji | |
| Markos KYPRIANOU | |
| Członek Komisji |
______
(1) Dz.U. L 235 z 21.8.1998, str. 1.
ZAŁĄCZNIK
SCHEMAT BADANIA DIAGNOSTYCZNEGO, WYKRYWANIA ORAZ IDENTYFIKACJI RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.
ZAKRES BADANIA
Przedstawiony schemat opisuje różne procedury odnoszące się do:
i) diagnostyki śluzaka w bulwach ziemniaka oraz w roślinach ziemniaka i pomidora i niektórych innych roślinach żywicielskich;
ii) wykrywania Ralstonia solanacearum w próbach bulw ziemniaka, roślinach ziemniaka, pomidora i w innych roślinach żywicielskich, oraz w wodzie i glebie;
iii) identyfikacji Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).
ZASADY OGÓLNE
Dodatki zawierają zoptymalizowane protokoły dla różnych metod, zatwierdzonych odczynników i danych szczegółowych dotyczących przygotowania badania i materiałów kontrolnych. Dodatek 1 zawiera spis laboratoriów uwzględnionych w optymalizacji i zatwierdzeniu protokołów.
W związku z tym, że protokoły obejmują wykrywanie organizmu poddanego kwarantannie i wykorzystanie kultur żywych R. solanacearum jako materiału kontrolnego, konieczne będzie wykonanie procedur w odpowiednich warunkach kwarantanny przy użyciu odpowiednich urządzeń do usuwania odpadów oraz będąc w posiadaniu odpowiednich pozwoleń wydanych przez władze urzędowe odpowiedzialne za kwarantannę roślin.
Parametry badania muszą zapewnić zgodne i dające się odtworzyć wykrycie różnych poziomów R. solanacearum przy użyciu określonych wartości progowych wybranych metod.
Niezbędne jest dokładne przygotowanie pozytywnych kontroli
Przeprowadzanie badań zgodnie z wymaganymi wartościami progowymi zakłada również właściwe ustawienia, utrzymanie oraz kalibrację urządzeń, ostrożne obchodzenie się i przechowywanie odczynników i wszystkie środki niezbędne dla zapobiegnięcia kontaminacji próbek, np. oddzielenie kontroli pozytywnych od prób badanych. Dla uniknięcia błędów administracyjnych i innych błędów należy przestrzegać norm kontroli jakości, zwłaszcza dotyczących etykietowania i dokumentacji.
Podejrzenie o wystąpienie opisane w art. 4 ust. 2 dyrektywy 98/57/WE oznacza pozytywny wynik badań diagnostycznych lub przesiewowych wykonanych na próbie zgodnie z tym, co określono na poniższych schematach blokowych. Pozytywne pierwsze badanie przesiewowe (badanie IF, PCR/FISH, izolacja selektywna) musi zostać potwierdzone drugim badaniem przesiewowym w oparciu o inną zasadę biologiczną.
Jeżeli pierwsze badanie przesiewowe da wynik pozytywny, wówczas istnieje podejrzenie porażenia R. solanacearum i należy wykonać drugie badanie przesiewowe. Jeżeli drugie badanie przesiewowe da wynik pozytywny, wówczas podejrzenie zostaje potwierdzone (podejrzenie występowania) i należy wykonywać badania zgodnie ze schematem. Jeśli drugie badanie przesiewowe da wynik negatywny, wówczas próbę uznaje się za nieporażoną R. solanacearum.
Potwierdzenie obecności porażenia, o której mowa w art. 5 ust. 1 dyrektywy 98/57/WE, oznacza wyizolowanie i zidentyfikowanie czystej kultury R. solanacearum z potwierdzeniem patogeniczności.
SEKCJA I
SCHEMAT BADANIA
1. Schemat diagnozowania śluzaka w bulwach ziemniaka oraz R. solanacearum w bulwach ziemniaka oraz w roślinach ziemniaka, pomidora lub innych roślinach żywicielskich z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego
Procedura badania jest przeznaczona dla bulw ziemniaka i roślin z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego. Procedura ta obejmuje szybkie badanie przesiewowe, izolację patogenu z porażonej tkanki naczyniowej na pożywkę diagnostyczną (selektywną) oraz, w przypadku wyniku pozytywnego, identyfikację kultury jako Ralstonia solanacearum.
Notka Wydawnictwa Prawniczego "Lex"
Grafiki zostały zamieszczone wyłącznie w Internecie. Obejrzenie grafik podczas pracy z programem Lex wymaga dostępu do Internetu.
..................................................
2. Schemat wykrywania oraz identyfikacji Ralstonia solanacearum w bezobjawowych próbach bulw ziemniaka
Zasada:
Procedura badania przeznaczona jest do wykrywania utajonych infekcji bulw ziemniaka. W przypadku wyniku pozytywnego przynajmniej dwóch badań przesiewowych3, w oparciu o różne zasady biologiczne, procedura musi zostać uzupełniona izolacją patogenu, po której wykonane zostaje - w przypadku izolacji typowych kolonii - potwierdzenie czystej kultury jako R. solanacearum. Pozytywny wynik tylko jednego badania przesiewowego nie jest wystarczający dla stwierdzenia, że próba jest podejrzana.
Badania przesiewowe i badania izolacji muszą pozwolić na wykrycie od 103 do 104 komórek/ml zawieszonego osadu, w kontroli pozytywnej załączonej do każdej serii badań.
3. Schemat wykrywania oraz identyfikacji Ralstonia solanacearum w bezobjawowych próbach roślin ziemniaka, pomidora lub innych roślin żywicielskich.
SEKCJA II
SZCZEGÓŁOWE METODY WYKRYWANIA RALSTONIA SOLANACEARUM W BULWACH ZIEMNIAKA I ROŚLINACH ZIEMNIAKA, POMIDORA LUB INNYCH ROŚLINACH ŻYWICIELSKICH Z OBJAWAMI ŚLUZAKA LUB WIĘDNIĘCIA BAKTERYJNEGO
1. Objawy (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)
1.1. Objawy na ziemniaku
Roślina ziemniaka. Wczesnym stadium infekcji w polu jest więdnięcie liści od podstawy w kierunku wierzchołka rośliny w wysokiej temperaturze panującej w ciągu dnia oraz poprawa ich stanu w ciągu nocy. We wczesnych stadiach więdnięcia liście pozostają zielone, lecz później żółkną i rozwijają się nekrozy. Występuje również epinastia. W szybkim czasie więdnięcie jednego pędu lub całej rośliny staje się nieodwracalne i prowadzi do śmierci całej rośliny. Tkanka naczyniowa w łodygach przeciętych w poprzek więdnącej rośliny zwykle brązowieje, a z przeciętej powierzchni wypływa mleczny śluz bakteryjny lub można go wycisnąć z rośliny. Gdy uciętą łodygę wstawi się pionowo do wody, z wiązek naczyniowych będzie wypływać śluz.
Bulwa ziemniaka. Bulwy ziemniaka należy przecinać poprzecznie w pobliżu części przystolonowej lub podłużnie poprzez stolon. Wczesne stadium infekcji objawia się odbarwieniem szklistożółtym do lekko brązowego pierścienia naczyniowego, na którym po kilku minutach samoistnie zacznie pojawiać się kremowy wyciek. Później przebarwienie wiązek naczyniowych staje się bardziej brązowe, a nekrozy mogą objąć tkankę parenchymatyczną. W zaawansowanych stadiach choroby infekcja rozprzestrzenia się i obejmuje nie tylko części przystolonowej oraz oczka, z których mogą wypływać bakterie, co powoduje przyleganie cząstek glebowych. Mogą pojawić się czerwonawobrązowe, lekko zapadnięte zmiany na naskórku z powodu wewnętrznego zapadania się tkanek naczyniowych. W zaawansowanych stadiach choroby częste jest występowanie wtórnego rozwoju zgnilizny grzybowej i bakteryjnej.
1.2. Objawy na pomidorze
Roślina pomidora. Pierwszym widocznym objawem jest zwiędły wygląd najmłodszych liści. W korzystnych dla patogenu warunkach środowiska (temperatura gleby około 25 °‹C, wysoka wilgotność powietrza) w ciągu kilku dni następuje epinastia oraz więdnięcie jednej strony lub całej rośliny, co prowadzi do pokładania się rośliny. W warunkach mniej korzystnych (temperatura gleby niższa od 21 °‹C) więdnięcie jest mniejsze, lecz na łodydze może rozwinąć się wiele nowych korzeni. Można zaobserwować tłustawy pasek dookoła łodygi, który świadczy o martwicy układu naczyniowego. Po przecięciu łodygi w poprzek odbarwione brązowe tkanki naczyniowe wydzielają krople białego lub żółtawego śluzu bakteryjnego.
1.3. Objawy na innych roślinach żywicielskich
Rośliny Solanum dulcamara oraz S. nigrum. W warunkach naturalnych objawy więdnięcia u tych żywicieli obserwuje się rzadko, chyba że temperatura gleby przekracza 25 °‹C lub poziomy inokulum są bardzo wysokie (np. jak dla S. nigrum rosnącej w pobliżu chorej rośliny ziemniaka lub pomidora). Gdy nie występuje więdnięcie, objawy są takie jak w przypadku pomidora. Rośliny S. dulcamara, które nie więdną, rosnące z łodygami i korzeniami w wodzie, mogą wykazywać wewnętrzne lekkie brązowawe przebarwienie wiązek przewodzących na przekroju poprzecznym podstawy łodygi lub na częściach znajdujących się pod wodą. Z przeciętych wiązek przewodzących mogą wydostawać się bakterie lub smugi śluzu, jeśli przecięta łodyga zostanie ustawiona pionowo w wodzie, nawet przy braku objawów więdnięcia.
2. Szybkie testy przesiewowe
Szybkie testy przesiewowe mogą ułatwić wstępną diagnozę, ale nie są niezbędne. Należy zastosować jeden lub kilka z poniższych zatwierdzonych testów:
2.1. Badanie na obecność wycieków z wiązek przewodzących łodygi
(Patrz: sekcja VI.A.1)
2.2. Wykrywanie granulek poli - Ŕ - hydroksymaślanu (PHB)
Charakterystyczne granulki PHB w komórkach R. solanacearum można zobaczyć, wybarwiając je na szkiełku przedmiotowym błękitem Nilu A lub czernią sudanową w utrwalonych termicznie rozmazach śluzu bakteryjnego z porażonej tkanki (patrz: sekcja VI.A.2).
2.3. Test aglutynacji serologicznej
(Patrz: sekcja VI.A.3.)
2.4. Inne testy
Dalsze odpowiednie badania przesiewowe to test IF (patrz: sekcja VI.A.5), Test FISH (patrz: sekcja VI.A.7), testy ELISA (patrz: sekcja VI.A.8) oraz test PCR (patrz: sekcja VI.A.6).
3. Posiew na podłoża selektywne
a) Pobrać wyciek z tkanki lub fragmenty przebarwionej tkanki z pierścienia wiązek przewodzących bulwy ziemniaka albo z wiązek łodygi rośliny ziemniaka, pomidora lub innych więdnących roślin żywicielskich. Zawiesić je w niewielkiej ilości sterylnej wody destylowanej lub 50 mM buforu fosforanowego (dodatek 4) i pozostawić na 5-10 minut.
b) Przygotować serię dziesięciokrotnych rozcieńczeń zawiesiny.
c) Przenieść 50-100 Ęl zawiesiny i jej rozcieńczeń na pożywkę uniwersalną (NA, YPGA lub SPA; patrz: dodatek 2) i/lub na pożywkę tetrazolową Kelmana (dodatek 2) i/lub na zatwierdzoną selektywną pożywkę (np. SMSA; patrz: dodatek 2). Nanieść i rozprowadzić zawiesinę na płytce. W razie potrzeby przygotować oddzielne płytki z rozcieńczoną zawiesiną R. solanacearum biowaru 2 jako kontrolę pozytywną.
d) Inkubować płytki przez 2-6 dni w temperaturze 28 °‹C.
- Na pożywkach uniwersalnych wirulentne szczepy R. solanacearum rosną w postaci kolonii perłowo-białych, płaskich, nieregularnych i ciekłych, często z charakterystycznymi spiralami w środku. Awirulentne postacie R. solanacearum rosną jako małe, okrągłe, nieciekłe kolonie całkowicie kremowo-białe.
- Na pożywce tetrazolowej Kelmana i SMSA spirale mają krwistoczerwony kolor. Awirulentne postacie R. solanacearum rosną jako małe, okrągłe, nieciekłe kolonie całe o głęboko czerwonej barwie oraz o maślanej konsystencji.
4. Testy identyfikacyjne dla R. solanacearum
Badania potwierdzające wstępną identyfikację szczepów R. solanacearum pokazano w sekcji VI.B.
SEKCJA III
1. Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych bulw ziemniaka
1.1. Przygotowanie próby
Uwaga:
- Standardowa wielkość próby wynosi 200 bulw. Bardziej intensywne badania wymagają większej ilości testów na próbach tej wielkości. Większa liczba bulw w próbie będzie uniemożliwiać lub utrudniać interpretację wyników. Jednak gdy dostępna jest mniejsza niż 200 liczba bulw, procedurę tę można stosować z powodzeniem.
- Zatwierdzenie wszystkich opisanych niżej metod wykrywania oparte było na testowaniu prób złożonych z 200 bulw.
- Opisany poniżej ekstrakt z ziemniaków może być także wykorzystany do wykrywania bakterii bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.
Fakultatywne czynności wstępne przed przygotowaniem próby:
a) Inkubować próby w temperaturze 25-30 °‹C przez okres do dwu tygodni przed badaniem, aby pomóc w namnożeniu populacji R. solanacearum.
b) Umyć bulwy. Użyć właściwych środków odkażających (związki chloru, gdy zastosowane ma być badanie PCR dla usunięcia DNA patogenu) i detergentów pomiędzy każda próbą. Wysuszyć bulwy na powietrzu. Ta procedura mycia jest szczególnie przydatna (lecz niewymagana) przy próbach z nadmiarem ziemi i w przypadku wykonywania testu PCR lub procedury bezpośredniej izolacji.
1.1.1. Usunąć czystym i zdezynfekowanym skalpelem lub nożem do warzyw skórkę z części przystolonowej każdej bulwy, w taki sposób, by odsłonić tkanki przewodzące. Starannie wyciąć mały stożek z tkanki przewodzącej z części przystolonowej i ograniczyć ilość tkanki innej niż przewodząca do minimum. (Patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Uwaga: Odłożyć na bok wszystkie (gnijące) bulwy z objawami śluzaka przechowywać i badać oddzielnie.
Jeżeli w czasie pobierania tkanki przystolonowej obserwuje się objawy nasuwające podejrzenie śluzaka, należy przeprowadzić wzrokowe badanie bulwy i przeciąć bulwę w części przystolonowej. Wszystkie przekroje bulw z podejrzanymi objawami powinny być pozostawione co najmniej przez dwie doby w temperaturze pokojowej, aby umożliwić korkowacenie i przechowywane w lodówce (w temperaturze 4-10 °‹C) we właściwych warunkach kwarantanny. Wszystkie bulwy, włącznie z tymi przejawiającymi podejrzane objawy, należy przechowywać zgodnie z załącznikiem III.
1.1.2. Fragmenty części przystolonowych umieścić w nieużywanych wcześniej pojemnikach jednorazowego użytku, które można szczelnie zamknąć (w przypadku powtórnego użycia pojemników należy je starannie oczyścić i zdezynfekować przy użyciu związków chloru). Pobrane fragmenty części przystolonowych najlepiej poddać obróbce niezwłocznie. Jeżeli jednak nie będzie to możliwe, przechować je w pojemniku bez dodatku roztworu buforowego w lodówce nie dłużej niż 72 godziny lub nie dłużej niż 24 godziny w temperaturze pokojowej.
Z pobranymi fragmentami części przystolonowych postępować według jednej z następujących procedur:
a) fragmenty tkanki przystolonowej pokryć dostateczną objętością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 4) i mieszać na wytrząsarce obrotowej (50-100 obr./min) przez 4 godziny, utrzymując temperaturę poniżej 24 °‹C lub przez 16-24 godzin w lodówce;
lub
b) fragmenty tkanki przystolonowej homogenizować z odpowiednią ilością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 4) albo z użyciem miksera (np. Waring lub Ultra Thurax), albo przez rozdrabnianie w szczelnie zamkniętej jednorazowej torebce do maceracji (np. Stomacher lub Bioreba z polietylenu o dużej wytrzymałości, 150 x 250 mm; sterylizowane promieniowaniem), używając gumowego młotka lub odpowiedniego aparatu do rozdrabniania (np. Homex).
Uwaga/ jeśli próby są homogenizowane przy użyciu miksera, ryzyko kontaminacji między próbami jest znaczne. Należy podjąć odpowiednie środki ostrożności, aby nie dopuścić do powstania aerozolu lub rozlania w czasie procesu ekstrakcji. Należy się upewnić, że do każdej próby używane są świeżo wysterylizowane ostrza i naczynia miksera. Jeśli ma być stosowany test PCR, unikać przeniesienia DNA na pojemniki lub aparaty do rozdrabniania. JeFśli ma być zastosowany test PCR, zleca się rozdrabnianie w torebkach i stosowanie jednorazowych probówek.
1.1.3. Zdekantować supernatant. Jeśli jest zbyt mętny, sklarować - albo przez odwirowanie przy niskiej liczbie obrotów (przy nie więcej niż 180 g przez 10 minut w temperaturze 4-10 °‹C) lub przez filtrację w próżni (40-100 Ęm), myjąc filtr dodatkowym (10 ml) buforem do ekstrakcji.
1.1.4. Zagęścić frakcję bakterii przez odwirowanie przy 7 000 g przez 15 minut (lub 10.000 g przez 10 minut) w temperaturze 4-10 °‹C i odrzucić supernatant bez naruszania osadu
1.1.5. Zawiesić powtórnie osad w 1,5 ml buforu do zawieszania osadu (dodatek 4). Stosować 500 Ęl do badań na obecność R. solanacearum, 500 Ęl na obecność Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus i 500 Ęl do celów porównawczych. Dodać sterylną glicerynę aż do uzyskania ostatecznego stężenia 10-25 % (obj./obj.) i dodać do 500 Ęl zawiesiny porównawczej i do pozostałej zawiesiny testowej, zworteksować i przechowywać w temperaturze od - 16 do - 24 °‹C (tygodnie) lub od - 68 do - 86 °‹C (miesiące). W czasie wykonywania testu przechowywać zawiesiny testowe w temperaturze 4-10 °‹C.
Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie nie jest wskazane.
Jeśli konieczny jest transport ekstraktu, zapewnić dostawę w przenośnej lodówce w ciągu 24 lub 48 godzin.
1.1.6. Jest niezwykle ważne, aby w celu uniknięcia kontaminacji wszystkie kontrole pozytywne R. solanacearum i próby badać osobno. Odnosi się to zarówno do szkiełek IF, jak i do wszystkich testów.
1.2. Badanie
Patrz: schemat blokowy i opis testów i protokołów zoptymalizowanych znajdujące się w odpowiednich dodatkach:
Posiew na podłoża selektywne (patrz: sekcja VI.A.4)
Test IF (patrz: sekcja VI.A.5)
Test PCR (patrz: sekcja VI.A.6)
Test FISH (patrz: sekcja VI.A.7)
Testy ELISA (patrz: sekcja VI.A.8)
Test biologiczny (patrz: sekcja VI.A.9)
2. Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych roślin ziemniaka, pomidora lub innych roślin żywicielskich
2.1. Przygotowanie próby
Uwaga: Przy wykrywaniu utajonych populacji R. solanacearum zaleca się przebadanie prób złożonych. Procedurę tę można łatwo zastosować do prób złożonych o wielkości do 200 części łodygi. Przy wykonywaniu badań powinny się one opierać o statystycznie reprezentatywną próbę badanej populacji rośliny.
2.1.1. Pobrać fragmenty łodygi o wielkości 1-2 cm do zamkniętego sterylnego pojemnika zgodnie z poniższą procedurą próbobrania:
Sadzonki pomidora w szkółce: Przy pomocy czystego zdezynfekowanego noża pobrać 1 cm fragment u podstawy każdej łodygi, tuż nad glebą.
Rośliny pomidora hodowane na polu lub w szklarni: Przy pomocy czystego zdezynfekowanego noża pobrać najniższy pęd boczny z każdej rośliny, ucinając go tuż nad połączeniem z łodygą główną. Z każdego pędu bocznego odciąć najniższy 1 cm fragment.
Inni żywiciele: Przy pomocy czystego zdezynfekowanego noża lub sekatora pobrać 1 cm fragment u podstawy każdej łodygi, tuż nad glebą. W przypadku S. dulcamara lub innych roślin żywicielskich rosnących w wodzie, pobrać 1-2 cm fragmenty z łodygi znajdującej się pod wodą lub rozłogi z korzeniami wodnymi.
Podczas próbobrania w danym miejscu zaleca się przebadanie statystycznie reprezentatywnej próby składającej się z przynajmniej 10 roślin z miejsca próbobrania każdego potencjalnego żywiciela. Wykrycie patogenu będzie najbardziej wiarygodne późną wiosną, latem i jesienią, choć u wieloletnich Solanum dulcamara rosnących w ciekach wodnych porażenie naturalne można wykrywać przez cały rok. Znani żywiciele to samosiewy ziemniaka (groundkeeper), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium i inni członkowie rodziny Solanaceae. Inni żywiciele to Pelargonium spp. oraz Portulaca oleracea. Niektóre gatunki chwastów europejskich, których korzenie lub ich rizosfera w pewnych szczególnych warunkach środowiskowych mogą potencjalnie stanowić rezerwuar populacji R. solanacearum biowar 2/rasa 3, to: Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra oraz Urtica dioica.
Uwaga: Na tym etapie można zastosować wizualne badanie na obecność wewnętrznych objawów (przebarwienie wiązek naczyniowych lub wyciek śluzu bakteryjnego). Odłożyć na bok wszystkie fragmenty łodygi wykazujące objawy i przebadać je oddzielnie (patrz: sekcja II).
2.1.2. Zdezynfekować fragmenty łodygi krótko przy pomocy 70 % alkoholu etylowego i natychmiast wytrzeć je do sucha przy pomocy bibuły. Po czym poddać fragmenty łodyg jednej z następujących procedur:
a) fragmenty pokryć dostateczną objętością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 4) i mieszać na wytrząsarce obrotowej (50-100 obr./min) przez 4 godziny, utrzymując temperaturę poniżej 24 °‹C lub przez 16-24 godzin w lodówce; lub
b) rozpocząć procedurę bezzwłocznie, miażdżąc odcinki w mocnej torebce do maceracji (np. Stomacher lub Bioreba) z odpowiednią ilością buforu ekstrakcyjnego (dodatek 4), używając gumowego młotka lub odpowiedniego urządzenia do rozdrabniania (np. Homex). Jeśli nie jest to możliwe, przechowywać odcinki łodyg nie dłużej niż 72 godziny w lodówce lub nie dłużej niż 24 godziny w temperaturze pokojowej.
2.1.3. Zdekantować supernatant po ustaleniu się przez 15 minut.
2.1.4. Dalsze klaryfikowanie ekstraktu lub zagęszczanie frakcji bakteryjnej zwykle nie jest wymagane, ale można je osiągnąć przez filtrację i/lub odwirowanie, jak opisano w częściach III.1.1.3-1.1.5.
2.1.5. Podzielić czysty lub stężony ekstrakt z próby na dwie równe części. W czasie przeprowadzania testu jedną połowę trzymać w temperaturze 4-10 °‹C, a drugą połowę - z 10-25 % (obj./obj.) - sterylnego glicerolu przechowywać w temperaturze - 16 do - 24 °‹C (tygodnie) lub - 68 do - 86 °‹C (miesiące), jeśli wymagane są dalsze testy.
2.2. Badanie
Patrz: schemat blokowy i opis testów i protokołów zoptymalizowanych znajdujące się w odpowiednich dodatkach:
Posiew na podłoża selektywne (patrz: sekcja VI.A.4)
Test IF (patrz: sekcja VI.A.5)
Test PCR (patrz: sekcja VI.A.6)
Test FISH (patrz: sekcja VI.A.7)
Testy ELISA (patrz: sekcja VI.A.8)
Test biologiczny (patrz: sekcja VI.A.9)
SEKCJA IV
1. Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie
2. Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie
Zasada
Zatwierdzony schemat wykrywania opisany w tej sekcji dotyczy wykrywania patogenu w próbach wód powierzchniowych i można go zastosować do badania prób ścieków z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych. Ważne jest jednak, aby pamiętać, że oczekiwana czułość wykrywania zmienia się w zależności od substratu. Na czułość badania izolacji wpływ mają populacje konkurujących bakterii saprofitycznych, które są na ogół o wiele większe przy przetwarzaniu ziemniaków i w ściekach niż w wodzie powierzchniowej. Zakłada się, że poniższy schemat wykryje zaledwie 103 komórek na litr w wodzie powierzchniowej, natomiast czułość wykrywania przy przetwarzaniu ziemniaków lub w ściekach będzie prawdopodobnie znacznie niższa. Z tego powodu zaleca się badać ścieki po ich utylizacji (np. sedymentacji lub przefiltrowaniu), w czasie których to operacji zmniejszają się populacje saprofityczne. Ograniczenia czułości schematu badania powinno się wziąć pod uwagę przy ocenie wiarygodności wszelkich uzyskanych wyników negatywnych. Schemat ten był z powodzeniem stosowany w pracach badawczych dla ustalenia występowania lub braku patogenu w wodzie powierzchniowej, jednak należy pamiętać o jego ograniczeniach przy używaniu go do podobnych badań ścieków pochodzących z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych.
2.1. Przygotowanie próby
Uwaga:
- Wykrycie R. solanacearum w wodzie powierzchniowej jest najbardziej pewne późną wiosną, latem i jesienią, gdy temperatura wody przekracza 15 °‹C.
- Wielokrotne próbobranie w różnych okresach w powyższym terminie w wyznaczonych punktach zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia dzięki zmniejszeniu skutków zmian klimatycznych.
- Pod uwagę należy wziąć skutki ulewnych deszczów i lokalizację cieków wodnych dla uniknięcia skutków nadmiernego rozwodnienia, co może wpływać na zamaskowanie obecności patogenu.
- Próby wody należy pobrać w sąsiedztwie roślin żywicielskich, jeśli takie występują.
2.1.1. W wybranych punktach próbobrania pobrać próby wody, wypełniając nią jednorazowe sterylne probówki lub butelki na głębokości, o ile to możliwe, poniżej 30 cm i w promieniu 2 m od brzegu. W przypadku ścieków pochodzących z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych, próby należy pobrać z punktu usuwania ścieków. Zaleca się stosowanie prób o wielkości do 500 ml na punkt próbobrania. Jeśli preferowane są próby mniejsze, zaleca się pobieranie prób przynajmniej 3 razy z każdego punktu próbobrania, z czego każda próba składa się z 2 podprób, każda o objętości minimum 30 ml. Przy intensywnych badaniach należy wybrać przynajmniej 3 punkty próbobrania na odcinku cieku wodnego o długości 3 km i zagwarantować, że zostaną pobrane próby również z dopływów.
2.1.2. Próby transportować w niskiej temperaturze (4-10 °‹C), bez dostępu światła i przebadać w ciągu 24 godzin.
2.1.3. W miarę potrzeby przy pomocy jednej z poniższych metod można zagęścić frakcję bakteryjną:
a) wirować 30-50 ml podpróby w 10.000 g przez 10 minut (lub 7 000 g przez 15 minut), najlepiej w temperaturze 4-10 °‹C, usunąć zawiesinę i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do zawieszania osadu (dodatek 4);
b) przeprowadzić filtrację membranową (minimalny rozmiar porów 0,45 Ęm), po której przemyć filtr 5-10 ml buforu do zwieszania osadu i zebrać popłuczyny. Metoda ta ma zastosowanie do większych objętości wody zawierającej małą ilość saprofitów.
Zagęszczania nie poleca się zazwyczaj dla prób ścieków pochodzących z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych, ponieważ zwiększona populacja konkurujących bakterii saprofitycznych hamuje wykrywanie Ralstonia solanacearum.
2.2. Badanie
Patrz: schemat blokowy i opis badań we właściwych protokołach.
SEKCJA V
1. Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie
2. Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie
Zasada
Zatwierdzony schemat wykrywania opisany w tej sekcji dotyczy wykrywania patogenu w próbach gleby, lecz można go również wykorzystać do badania prób stałego lub ciekłego odpadu z obróbki ziemniaka. Ważne jest jednak, aby pamiętać, że metody te nie są wystarczająco czułe do zagwarantowania wykrywania nisko i/lub nieregularnie rozproszonych populacji Ralstonia solanacearum, które mogą występować w naturalnie porażonych próbach tych substratów.
Przy ocenie wiarygodności wszelkich uzyskanych wyników negatywnych, jak również przy badaniu w celu określenia obecności lub nieobecności patogenu w glebie i odpadach powinno się wziąć pod uwagę ograniczenia czułości schematu badania. Najbardziej wiarygodnym badaniem obecności patogenu w glebie jest posadzenie żywiciela podatnego na chorobę i kontrolowanie go pod względem porażenia, lecz nawet przy tej metodzie niskie poziomy porażenia nie zostaną wykryte.
2.1. Przygotowanie próby
2.1.1. Próbobranie gleby z pola powinno być wykonane zgodnie ze standardowymi zasadami stosowanymi dla prób nicieniowych. Należy pobrać 0,5-1 kg ziemi dla każdej próby z 60 miejsc na każde 0,3 ha z głębokości 10-20 cm (lub w siatce 7 x 7 metrów). Jeśli istnieje podejrzenie występowania patogenu, należy zwiększyć liczbę punktów poboru do 120 na 0,3 ha. Przed badaniem próby trzymać w temperaturze 12-15 °‹C. Próby osadów z obróbki ziemniaków i ścieków należy sporządzić, pobierając łącznie 1 kg z punktów próbobrania, tak aby były reprezentatywne dla całkowitej wielkości badanego osadu. Przed badaniem dobrze wymieszać każdą próbę.
2.1.2. Podpróby 10-25 g ziemi lub osadu zawiesić w 60-150 ml buforu ekstrakcyjnego (dodatek 4) i wytrząsać na wstrząsarce obrotowej (250 obr./min) przez okres do 2 godzin. W razie potrzeby w rozdrobnieniu może pomóc dodanie 0,02 % sterylnego Tween-20 i 10-20 g sterylnego żwiru.
2.1.3. W czasie badania utrzymywać zawiesinę w temperaturze 4 °‹C.
2.2. Badanie
Patrz: schemat blokowy i opis badań we właściwych protokołach.
SEKCJA VI
ZOPTYMALIZOWANE PROTOKOŁY WYKRYWANIA I IDENTYFIKACJI R. SOLANACEARUM
A. TESTY DIAGNOSTYCZNE I WYKRYWANIE
1. Badanie na obecność wycieków z wiązek przewodzących łodygi
Obecność R. solanacearum w więdnących łodygach ziemniaka lub pomidora lub innych roślin żywicielskich można stwierdzić, wykonując poniższe proste badanie wstępne: uciąć łodygę tuż nad poziomem gleby. Umieścić odciętą powierzchnię łodygi w probówce napełnionej czystą wodą. Po kilku minutach można zaobserwować charakterystyczny samoczynny wypływ śluzu bakteryjnego z przeciętych wiązek przewodzących.
2. Badanie na obecność granulek poly-Ŕ-hydroksymaślanu
1. Przygotować rozmaz śluzu bakteryjnego z porażonej tkanki albo rozmaz z 48-godzinnej hodowli na pożywce YPGA lub SPA (dodatek 2) na szkiełku mikroskopowym.
2. Przygotować rozmazy kontroli pozytywnej ze szczepu biowar 2 R. solanacearum, oraz jeśli konieczne, przygotować rozmaz kontroli negatywnej PHB sp.
3. Pozostawić rozmazy do wyschnięcia i przesunąć dolną część szkiełka kilkakrotnie w płomieniu palnika, w celu utrwalenia rozmazu.
4. Preparat wybarwić błękitem nilu lub czernią sudanowa i obserwować pod mikroskopem zgodnie z poniższym opisem.
Badanie z błękitem Nilu:
a) Zanurzyć utrwalony rozmaz w 1 % wodnym roztworze błękitu nilu A i inkubować przez 10 minut w temperaturze 55 °‹C.
b) Zlać roztwór barwiący. Opłukać krótko pod kranem z bieżącą wodą. Usunąć nadmiar wody bibułą.
c) Zanurzyć rozmaz w 8 % wodnym roztworze kwasu octowego i inkubować przez 1 minutę w temperaturze otoczenia.
d) Opłukać krótko pod kranem z bieżącą wodą. Usunąć nadmiar wody bibułą.
e) Ponownie zwilżyć rozmaz kroplą wody i nałożyć szkiełko przykrywkowe.
f) Oglądać rozmaz pod mikroskopem epifluorescencyjnym w świetle 450 nm, pod warstwą oleju immersyjnego, przy powiększeniu 600-1.000 razy, używając do tego celu obiektywu olejowego lub wodnego.
g) Sprawdzić, czy pojawi się jasna, pomarańczowa fluorescencja granulek PHB. Sprawdzić także w świetle normalnym, czy wewnątrz komórek znajdują się granulki i czy morfologia komórek ma cechy typowe dla R. solanacearum.
Badanie z czernią sudanową:
a) Zanurzyć utrwalony rozmaz w 0,3 % roztworze czerni sudanowej B w 70 % alkoholu etylowym i inkubować przez 10 minut w temperaturze otoczenia.
b) Zlać roztwór barwiący i krótko płukać pod bieżącą wodą z kranu, usuwając nadmiar wody bibułą.
c) Zanurzyć szkiełka na chwilę w ksylenie i osuszyć na bibule. Uwaga: Ksylen jest substancją szkodliwą dla zdrowia, dlatego należy przedsięwziąć odpowiednie środki bezpieczeństwa i pracować w dygestorium.
d) Zanurzyć szkiełka w 0,5 % (w/v) wodnym roztworze safraniny i pozostawić na 10 sekund w temperaturze otoczenia. Uwaga: Safranina jest substancją szkodliwą dla zdrowia, dlatego należy przedsięwziąć odpowiednie środki bezpieczeństwa i pracować w dygestorium.
e) Wypłukać delikatnie wodą z kranu, osuszyć na bibule i nałożyć szkiełko przykrywkowe.
f) Oglądać wybarwiony rozmaz pod mikroskopem, stosując światło przechodzące, pod warstwą olejku immersyjnego, przy powiększeniu 1 000 razy z użyciem obiektywu olejowego.
g) Granulki PHB w komórkach R. solanacearum wybarwiają się na kolor czarno-niebieski, a ściany komórkowe na różowo.
3. Test aglutynacji serologicznej
Aglutynacja komórek R. solanacearum w śluzie bakteryjnym lub ekstrakcie z tkanek symptomatycznych jest najlepiej widoczna przy użyciu zatwierdzonych przeciwciał (patrz: dodatek 3) oznaczonych odpowiednio zabarwionymi markerami, takimi jak czerwone komórki Staphylococcus aureus lub zabarwione elementy lateksowe. Używając zestawu dostępnego w obrocie handlowym (patrz: dodatek 3), należy postępować zgodnie ze wskazówkami producenta. W przeciwnym razie należy wykonać następującą procedurę:
a) Wymieszać krople zawiesiny przeciwciał i śluzu bakteryjnego (ok. 5 Ęl każdej) na okienkach szkiełek z wieloma zagłębieniami.
b) Przygotować kontrolę pozytywną i negatywną przy użyciu zawiesin R. solanacearum biowar 2 i szczepu heterogenicznego.
c) Mieszając delikatnie przez 15 sekund, można zaobserwować aglutynację w próbach pozytywnych.
4. Izolacja selektywna
4.1. Izolacja na podłoże selektywne
Uwaga: Przed użyciem tej metody po raz pierwszy, należy wykonać wstępne badania mające zagwarantować odtwarzalność wykrywania rzędu 103 do 104 jednostek R. solanacearum tworzących kolonie na ml dodany do ekstraktu prób, które uprzednio zostały przetestowane jako negatywne.
Należy użyć właściwie zatwierdzonej pożywki selektywnej, takiej jak SMSA (zmodyfikowanej przez Elphinstone et al., 1996; patrz: dodatek 2).
Należy uważać, aby odróżnić R. solanacearum od innych bakterii będących w stanie rozwinąć kolonie na pożywce. Poza tym, kolonie R. solanacearum mogą wykazywać morfologię nietypową, jeśli płytki są przepełnione lub obecne są również bakterie antagonistyczne. Jeśli podejrzewa się występowanie skutków konkurencji lub antagonizmu, próby należy ponownie przebadać z użyciem innego testu.
Najwyższej czułości wykrywania przy użyciu tej metody można oczekiwać przy użyciu świeżo przygotowanych ekstraktów. Jednak metoda ta jest używana również w odniesieniu do ekstraktów przechowywanych w glicerynie w temperaturze - 68 do - 86 °‹C.
Jako kontrole pozytywne należy przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia zawiesiny 106 cfu na ml wirulentnego szczepu biowar 2 R. solanacearum (np. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Dla uniknięcia ewentualnej kontaminacji kontrole pozytywne należy przygotować w ścisłej separacji od badanych prób.
W przypadku każdej nowo przygotowanej partii pożywki selektywnej przed użyciem jej do przebadania rutynowych prób należy sprawdzić jej przydatność do wzrostu patogenu.
Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).
4.1.1. Zastosować odpowiednią technikę rozcieńczeń płytkowych w celu zapewnienia, że wszelkie saprofityczne populacje tworzące kolonie zostają rozcieńczone. Nanieść 50-100 Ęl na płytkę ekstraktu i każdego rozcieńczenia.
4.1.2. Inkubować płytki w temperaturze 28 °‹C. Oglądanie płytek rozpocząć po 48 godzinach, a potem kontynuować codziennie do 6 dni. Typowe kolonie R. solanacearum na pożywce SMSA są mlecznobiałe, płaskie, nieregularne oraz ciekłe, a po 3 dniach inkubacji ich środek staje się od różowego do krwistoczerwonego z wewnętrznymi smugami lub spiralami. (Patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
Uwaga: Na tej pożywce tworzą się czasami nietypowe kolonie R. solanacearum. Mogą być małe, okrągłe, całkiem czerwone i nieciekłe lub tylko częściowo ciekłe i w związku z tym mogą występować problemy z odróżnieniem ich od bakterii saprofitycznych tworzących kolonie.
4.1.3. W celu uzyskania pojedynczych kolonii oczyścić kolonie wstępne przez pasażowanie lub metodą rozcieńczeń płytkowych R. solanacearum na pożywce odżywczej (patrz: dodatek 2).
4.1.4. W celu krótkotrwałego przechowywania trzymać kultury w sterylnej wodzie (pH 6-8, bez chloru) w temperaturze pokojowej w ciemności lub w celu długotrwałego przechowywania w odpowiedniej pożywce krioochronnej lub w temperaturze - 68 do - 86 °‹C lub w postaci liofilizowanej.
4.1.5. Zidentyfikować czyste kultury (patrz: sekcja VI.B.) i wykonać test patogeniczności (patrz: sekcja VI. C).
Interpretacja wyników posiewu na podłoże selektywne
Wynik posiewu na podłoże selektywne jest negatywny w przypadku, gdy po 6 dniach nie obserwuje się żadnych kolonii bakteryjnych, albo jeżeli nie odnaleziono żadnych kolonii o morfologii charakterystycznej dla R. solanacearum, pod warunkiem że nie podejrzewa się inhibicji kolonii wskutek konkurencji lub antagonizmu przez inne bakterie i że na płytkach z kontrolą pozytywną potwierdzono obecność kolonii charakterystycznych dla R. solanacearum.
Wynik posiewu na podłoże selektywne jest pozytywny, jeżeli wyizolowano kolonie o morfologii charakterystycznej dla R. solanacearum.
4.2. Procedura wzbogacenia
Należy użyć zatwierdzonej pożywki wzbogacającej, takiej jak zmodyfikowana pożywka Wilbrink (patrz: dodatek 2).
Procedurę tę można wykorzystywać do selektywnego zwiększania populacji R. solanacearum w ekstraktach i zwiększenia czułości wykrywania. Procedura ta również skutecznie rozcieńcza inhibitory reakcji PCR (1:100). Należy jednak pamiętać, że wzbogacenie R. solanacearum może się nie udać wskutek konkurencji lub antagonizmu ze strony organizmów saprofitycznych, które często są równocześnie wzbogacane. Z tego powodu izolacja R. solanacearum ze wzbogaconych kultur pożywki może okazać się trudna. Poza tym, jako że można zwiększyć populację serologicznie zbliżonych saprofitów, zaleca się stosowanie konkretnych przeciwciał monoklinalnych raczej niż przeciwciał poliklonalnych, gdy stosowany ma być test ELISA.
4.2.1. Przy wzbogacaniu do testu PCR przenieść 100 Ęl ekstraktu do 10 ml pożywki wzbogaconej (dodatek 2) uprzednio umieszczonej w zlewkach lub kolbach pozbawionych DNA. Przy wzbogacaniu do testu ELISA można użyć większych proporcji ekstraktu do pożywki (np. 100 Ęl w 1,0 ml pożywki wzbogaconej).
4.2.2. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze od 27 do 30 °‹C w hodowli wstrząsanej lub statycznej, a przykrywka powinna luźno przylegać do probówki, tak by umożliwić dostęp do powietrza.
4.2.3. Dobrze wymieszać przed użyciem w teście ELISA lub teście PCR.
4.2.4. Ze wzbogaconą pożywką postępować w taki sam sposób, jak z próbą w powyższych testach.
Uwaga: Jeśli przewiduje się zahamowanie procesu wzbogacenia R. solanacearum z powodu wysokich populacji niektórych konkurujących bakterii saprofitycznych, lepsze wyniki może dać wzbogacenie ekstraktów przed odwirowaniem lub innymi sposobami zagęszczania patogenu.
5. Test IF
Zasada
Stosowanie testu IF jako głównego testu przesiewowego jest zalecane z uwagi na wykazaną zdolność osiągania wymaganych progów wykrywalności.
Kiedy test IF jest stosowany jako główny test przesiewowy, a wynik IF jest dodatni, konieczne jest zastosowanie izolacji, testu PCR lub FISH jako drugiego testu przesiewowego. Kiedy test IF jest stosowany jako drugi test przesiewowy, a odczyt IF jest dodatni, do zakończenia analizy wymagane jest przeprowadzanie dalszych testów, zgodnie ze schematem blokowym.
Uwaga: Należy używać zatwierdzonego źródła przeciwciał przeciw r. solanacearum (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Zaleca się, aby dla każdej nowej partii przeciwciał określać miano. Miano jest określane jako największe rozcieńczenie, przy którym zachodzi optymalna reakcja w czasie testowania zawiesiny od 105do 106 komórek na ml homologicznego szczepu R. solanacearum i przy użyciu odpowiedniego koniugatu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), zgodnie z zaleceniami producenta. Stężone przeciwciała poliklonalne powinny mieć miano IF przynajmniej 1:2 000. W czasie przeprowadzania testu przeciwciała powinny być stosowane przy stężeniu roboczym (WD) bliskim lub równym mianu.
Test powinien być przeprowadzany na świeżo przygotowanych ekstraktach z prób. Jeśli to konieczne, może być z powodzeniem przeprowadzany na ekstraktach przechowywanych w temperaturze od - 68 do - 86 °‹C w glicerolu. Glicerol może być usunięty z próby przez dodanie 1 ml buforu do zawieszania osadu (dodatek 4), powtórne odwirowanie przez 15 minut przy 7.000 g i powtórne zawieszenie w równej objętości buforu do zawieszania osadu. Często nie jest to konieczne, zwłaszcza jeśli preparaty z prób były utrwalane na szkiełkach przy pomocy opalania.
Przygotować oddzielne szkiełka kontroli pozytywnej szczepu homologicznego lub innego szczepu odniesienia R. solanacearum zawieszonego w ekstrakcie z ziemniaka, jak szczegółowo opisano w dodatku 3B, oraz ewentualnie w buforze.
W miarę możliwości na to samo szkiełko należy nanieść jako podobną kontrolę naturalnie zainfekowane tkanki (zachowane w formie liofilizowanej lub zamrożone w temperaturze od - 16 do - 24 °‹C). Jako kontrolę negatywną na R. solanacearum stosować ekstrakty prób, które wcześniej dały w teście wynik ujemny.
Standaryzowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne do wykorzystania w teście są wymienione w dodatku 3.
Używać wielopunktowych szkiełek mikroskopowych, najlepiej z 10 okienkami, o średnicy co najmniej 6 mm.
Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).
5.1. Przygotować szkiełka do badań , stosując jedną z poniższych procedur:
i) dla prób zawierających stosunkowo niewiele skrobi:
Odmierzyć pipetą standardową objętość (15 l odpowiada 6 mm średnicy okienka - dla większych okienek odmierzyć odpowiednio większą objętość) w rozcieńczeniu 1/100 zawieszonego osadu ziemniaka na pierwsze okienko. Następnie odmierzyć pipetą podobną objętość nierozcieńczonego osadu (1/1) na pozostałe okienka w szeregu. Drugi szereg można wykorzystać do powtórzenia badania lub można go przeznaczyć do analizy drugiej próby, patrz: rysunek 1;
ii) dla innych osadów:
Przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia (1/10, 1/100) zawieszonego osadu w buforze do zawieszania osadu. Odmierzyć standardową objętość (15 l odpowiada 6 mm średnicy okienka - dla większych okienek odmierzyć proporcjonalnie większą objętość) zawiesiny na szereg okienek. Drugi szereg można wykorzystać do powtórzenia badania lub można go przeznaczyć do analizy drugiej próby, patrz: rysunek 2.
5.2. Wysuszyć krople w temperaturze otoczenia lub ogrzewając je w temperaturze od 40 do 45 °‹C. Utrwalić komórki bakteryjne na szkiełku przez ogrzanie (15 minut w temp. 60 °‹C), albo umieszczenie w płomieniu, lub też za pomocą 95 % alkoholu etylowego zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami dostawcy przeciwciał.
W miarę potrzeby utrwalone szkiełka można przechowywać zamrożone w suchym pojemniku przez jak najkrótszy okres (maksymalnie przez 3 miesiące) przed dalszym badaniem.
5.3. Procedura IF
i) Przygotować szkiełka tak jak opisano w ust. 5.1 ppkt i): Przygotować zestaw dwukrotnych rozcieńczeń.
Pierwsze okienko powinno mieć 1/2 miana (T/2), pozostałe 1/4 miana (T/4), 1/2 miana (T/2), miano (T) i dwukrotność miana (2T).
ii) Przygotować szkiełka do badania, jak opisano w ust. 5.1 ppkt ii):
Przygotować rozcieńczenie robocze (WD) przeciwciał w buforze IF. Rozcieńczenie robocze ma wpływ na specyficzność.
Rysunek 1 Przygotowanie szkiełka roboczego według 5.1 i) i 5.3 i)
Rysunek 2 Przygotowanie szkiełka roboczego według ust. 5.1 ppkt ii) i 5.3 ppkt ii)
5.3.1. Ułożyć szkiełka na wilgotnej bibule. Pokryć całkowicie każde okienko rozcieńczonymi przeciwciałami. Objętość nakładanej surowicy musi być równa objętości nakładanego ekstraktu.
W przypadku braku szczegółowych instrukcji od dostawcy przeciwciał należy zastosować następującą procedurę:
5.3.2. Inkubować szkiełka na wilgotnym papierze pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze otoczenia (18-25 °‹C).
5.3.3. Strząsnąć krople surowicy ze szkiełek i przepłukać szkiełka starannie buforem IF. Zanurzyć je na 5 minut w buforze IF - Tween (dodatek 4), a następnie w buforze IF. Unikać powstawania aerozoli i przenoszenia kropelek, co mogłoby doprowadzić do kontaminacji miedzy próbami. Ostrożnie usunąć nadmiar wilgoci przez delikatne osuszanie bibułą.
5.3.4. Ułożyć szkiełka na wilgotnym papierze. Pokryć okienka do badań oraz okienko FTIC rozcieńczonym koniugatem FTIC, stosowanym do oznaczania miana. Objętość koniugatu nałożonego na okienka musi być identyczna z objętością zastosowanych przeciwciał.
5.3.5. Inkubować szkiełka na wilgotnym papierze pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze otoczenia (18-25 °‹C).
5.3.6. Strząsnąć krople surowicy ze szkiełek. Obmyć i przepłukać tak jak poprzednio (5.3.3).
Ostrożnie usunąć nadmiar wilgoci.
5.3.7. Na każde okienko nanieść po 5-10 l 0,1 M buforu fosforanowego-glicerynowego (dodatek 4) albo podobną ilością dostępnego w obrocie utrwalacza i przykryć je szkiełkiem nakrywkowym.
5.4. Odczytywanie testu IF
5.4.1. Sprawdzić szkiełka pod mikroskopem epifluorescencyjnym z filtrem właściwym dla wzbudzenia FITC, pod olejkiem imersyjnym lub wodą, przy powiększeniu 500-1 000 razy. Okienka przeglądać wzdłuż dwóch średnic pod kątem prostym oraz dookoła obwodu. Sprawdzić przynajmniej 40 pól mikroskopowych w okienkach niezawierających komórek lub zawierających ich małą ilość.
Sprawdzić najpierw okienko z kontrolą pozytywną. Komórki muszą fluoryzować jasno i być zupełnie wybarwione przy określonym mianie przeciwciał lub rozcieńczeniu roboczym. Badanie IF (sekcja VI.A.5) należy powtórzyć, jeżeli wybarwienie nie jest właściwe.
5.4.2. Poszukiwać w okienkach szkiełek testowych jaskrawo fluoryzujących komórek, o charakterystycznej dla R. solanacearum morfologii (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensywność fluorescencji musi być równoważna intensywności wykazywanej przez pozytywny szczep kontrolny przy tym samym rozcieńczeniu surowicy. Komórki niecałkowicie wybarwione lub komórki o słabej fluorescencji należy odrzucić.
W przypadku podejrzenia kontaminacji badanie należy powtórzyć. Tak może być w przypadku gdy wszystkie szkiełka w partii wykazują komórki pozytywne z powodu kontaminacji buforu lub jeśli komórki pozytywne zostają odnalezione (poza okienkami szkiełek) na powierzchni szkiełka.
5.4.3. Ze specyficznością testu immunofluorescencyjnego wiąże się nieodłącznie kilka problemów. W osadzie z części przystolonowych bulw ziemniaka i odcinka łodygi prawdopodobne jest występowanie w tle populacji fluoryzujących komórek o nietypowej morfologii oraz bakterii saprofitycznych o wielkości i morfologii podobnej do R. solanacearum i dających reakcje krzyżowe.
5.4.4. Uwzględniać wyłącznie fluoryzujące komórki o typowych wymiarach i morfologii przy mianie lub rozcieńczeniu roboczym, takim jak w 5.3.
5.4.5. Interpretacja wyników testu IF:
i) Jeżeli stwierdzono obecność fluoryzujących komórek o charakterystycznej morfologii, trzeba oszacować średnią liczbę typowych komórek w polu widzenia mikroskopu oraz obliczyć liczbę komórek typowych przypadająca na ml ponownie zawieszonego osadu (dodatek 5).
Wynik IF jest dodatni dla prób z przynajmniej 5 x 103 komórek na ml zawieszonego osadu. Próba uznawana jest za potencjalnie porażoną i wymagane są dalsze testy.
ii) Odczyt IF jest negatywny dla prób o liczbie komórek mniejszej niż 5 x 103 na ml zawieszonego osadu, a próba uznawana jest za negatywną. Kolejne testy nie są wymagane.
6. Test PCR
Zasada
Przy wykorzystaniu testu PCR jako podstawowego badania przesiewowego i uzyskaniu w nim pozytywnego wyniku jako drugie badanie przesiewowe należy wykonać izolację lub test IF. Gdy test PCR jest stosowany jako drugie badanie przesiewowe, a odczyt jest pozytywny, dla zakończenia diagnozy wymagane jest dalsze badanie zgodne ze schematem blokowym.
Pełne wykorzystanie tej metody jako głównego badania przesiewowego zaleca się tylko wtedy, jeśli posiada się specjalistyczną, fachową wiedzę na ten temat.
Uwaga: Wstępne badanie przy użyciu tej metody powinno pozwolić na uzyskanie odtwarzalnego wykrywania rzędu od 103 do 104 komórek R. solanacearum przypadających na ml dodanych do ekstraktów prób, które w poprzednim badaniu wypadły negatywnie. Dla uzyskania maksymalnych poziomów czułości i specyficzności we wszystkich laboratoriach wymagane może być przeprowadzenie eksperymentów optymalizujących.
Należy używać zatwierdzonych odczynników PCR i protokołów (patrz: dodatek 6). Zaleca się wybór metody z kontrolą wewnętrzną.
Należy zastosować odpowiednie środki bezpieczeństwa w celu uniknięcia kontaminacji próbki docelowym DNA. Test PCR powinni wykonywać doświadczeni technicy w wyspecjalizowanych laboratoriach biologii molekularnej, tak aby zminimalizować możliwość kontaminacji docelowym DNA.
Kontrola negatywna (dla ekstrakcji DNA i procedur PCR) powinna być zawsze wykonywana jako ostatnia próba w procedurze tak, aby jasno stwierdzić, czy pojawiło się jakiekolwiek przeniesienie DNA.
W badaniu PCR należy zawrzeć następujące kontrolę negatywne:
- ekstrakt próby, który poprzednio został uznany za negatywny dla R. solanacearum,
- próby kontrolne buforu używanego do ekstrakcji bakterii i DNA z próby,
- mieszaninę do reakcji PCR.
Należy zawrzeć następujące kontrole pozytywne::
- zawiesiny osadu, do którego dodano R. solanacearum (przygotowanie patrz: dodatek 3 B),
- zawiesinę 106 komórek przypadających na ml wirulentnego izolatu R. solanacearum zawieszonego w wodzie (np. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; patrz: dodatek 3 B),
- w miarę możliwości korzystać również z ekstraktów DNA z kontroli pozytywnych DNA otrzymanych z testu PCR.
Dla uniknięcia potencjalnej kontaminacji, kontrole pozytywne przygotować w miejscu oddzielonym od prób, które mają być badane.
Ekstrakty stanowiące próby powinny być w jak największym stopniu pozbawione ziemi. W pewnych warunkach radzi się więc, aby ekstrakty przygotować z mytych ziemniaków, jeśli mają zostać zastosowane protokoły PCR.
Standaryzowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne do wykorzystania w teście są wymienione w dodatku 3.
6.1. Metody oczyszczania DNA
Użyć opisanych powyżej kontroli pozytywnych i negatywnych (patrz: dodatek 3).
Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).
Dostępnych jest wiele metod oczyszczania docelowego DNA, ze złożonych substratów próby, które usuwają inhibitory PCR i inne reakcje enzymatyczne i koncentrują docelowe DNA w ekstrakcie próby. Metoda przedstawiona poniżej została zoptymalizowana do użytku z zatwierdzoną metodą PCR przedstawioną w dodatku 6.
a) Metoda zgodnie z Pastrik (2000)
1. Odmierzyć pipetą 220 Ęl buforu do lizy (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) do 1,5 ml probówki Eppendorfa.
2. Dodać 100 Ęl ekstraktu i umieścić w jednostce grzewczej lub łaźni wodnej w temp. 95 °‹C na 10 min.
3. Trzymać probówkę w lodzie przez 5 min.
4. Dodać 80 Ęl roztworu lizozymowego (50 mg lizozymu przypadających na ml w 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) i inkubować w temp. 37 °‹C przez 30 min.
5. Dodać 220 Ęl roztworu Easy DNA® A (Invitrogen), dobrze wymieszać przez worteksowanie i inkubować w temp. 65 °‹C przez 30 min.
6. Dodać 100 Ęl roztworu Easy DNA® B (Invitrogen), energicznie wymieszać przez worteksowanie, aż w probówce uwolni się osad i próbka będzie równomiernie lepka.
7. Dodać 500 Ęl chloroformu i wymieszać przez worteksowanie, aż lepkość spadnie i mieszanina będzie jednorodna.
8. Odwirować przy 15.000 g przez 20 min w temp. 4 °‹C, aby wytrącić fazy i utworzyć międzyfazę.
9. Przenieść górną fazę do świeżej probówki typu Eppendorf.
10. Dodać 1 ml 100 % alkoholu etylowego (- 20 °‹C), krótko wymieszać przez worteksowanie i inkubować na lodzie przez 10 min.
11. Wirować przy 15.000 g przez 20 min w temp. 4 °‹C i usunąć alkohol etylowy z osadu.
12. Dodać 500 Ęl 80 % alkoholu etylowego (- 20 °‹C) i wymieszać przez odwracanie probówki.
13. Wirować przy 15.000 g przez 10 min w temp. 4 °‹C, zostawić osad i usunąć etanol.
14. Zostawić osad do wysuszenia powietrzem lub w wirówce do suszenia DNA.
15. Zawiesić ponownie osad w 100 Ęl sterylnej UPW i zostawić w temperaturze pokojowej przez przynajmniej 20 minut.
16. Przechowywać w temp. - 20 °‹C, aż będzie potrzebny do badania PCR.
17. Oddzielić wszelki biały osad, wirując i użyć 5 Ęl zawiesiny zawierającej DNA do testu PCR.
b) Inne metody
Można zastosować inne metody ekstrakcji DNA, np. Qiagen DNeasy Plant Kit, pod warunkiem że dowiedzione zostało, że są równie skuteczne w oczyszczaniu DNA pochodzącego z prób kontrolnych zawierających od 103 do 104 komórek patogenu przypadających na ml.
6.2. PCR
6.2.1. Przygotować matryce testowe i kontrolne dla PCR według zatwierdzonych protokołów (sekcja VI.A.6). Przygotować jedno dziesięciokrotne rozcieńczenie DNA z ekstraktu próby (1:10 w UPW).
6.2.2. Przygotować odpowiednią mieszaninę reakcyjną PCR i wymieszać w nieskażonym środowisku zgodnie z opublikowanymi protokołami (dodatek 6). W miarę możliwości radzi się użyć multipleksowego protokołu PCR zawierającego również wewnętrzną kontrolę PCR.
6.2.3. Dodać 2-5 Ęl ekstraktu DNA przypadającego na 25 Ęl objętości reakcji PCR w sterylnych probówkach do PCR według protokołów PCR (patrz: dodatek 6).
6.2.4. Dodać negatywną kontrolę zawierającą tylko mieszaninę reakcyjną PCR. Wymieszać i w miejsce próby dodać to samo źródło UPW, które było używane w mieszaninie PCR.
6.2.5. Umieścić probówki w tym samym termocyklerze, który używany był do badań wstępnych i uruchomić właściwie zoptymalizowany program PCR (dodatek 6).
6.3. Analiza produktu PCR
6.3.1. Rozdzielić produkty PCR metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Użyć przynajmniej 12 Ęl zwielokrotnionej mieszaniny reakcyjnej DNA z każdej próby zmieszanej z 3 Ęl buforu obciążającego (dodatek 6) w 2,0 % (w/v) żelu agarozowym w buforze trisacetate-EDTA (TAE) (dodatek 6) przy 5-8 V przypadających na cm. Użyć odpowiedniego markera DNA, np. 100 bp ladder.
6.3.2. Uwidocznić paski DNA odbarwiając żel w bromku etydyny (0,5 mg/l) przez 30-60 min, stosując właściwe środki ostrożności przy obchodzeniu się z tym mutagenem.
6.3.3. Oglądać wybarwiony żel w transiluminatorze UV (É = 302 nm), szukając zamplifikowanych produktów PCR o oczekiwanym rozmiarze (dodatek 6) i udokumentować wyniki.
6.3.4. Dla wszystkich nowych wyników/przypadków weryfikować autentyczność amplikonu PCR, przeprowadzając analizę z użyciem enzymów restrykcyjnych na próbce pozostałego zamplifikowanego DNA przez inkubację w optymalnej temperaturze i przez odpowiedni czas z właściwym enzymem i buforem (patrz: dodatek 6). Rozdzielić strawione fragmenty za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym jak wcześniej i oglądać charakterystyczny układ fragmentów strawionych przez enzymy restrykcyjne w transiluminatorze UV po uprzednim barwieniu bromkiem etydyny. Porównać z niestrawioną i strawioną kontrolą pozytywną
Interpretacja wyników testu PCR:
Wynik testu PCR jest negatywny, jeśli nie wykryto specyficznego dla R. solanacearum fragmentu amplikonu PCR o oczekiwanym rozmiarze w danej próbie, a taki fragment znaleziono we wszystkich kontrolach pozytywnych (w przypadku multipleksowego PCR ze specyficznymi dla rośliny starterami kontroli wewnętrznej: drugi produkt PCR o oczekiwanym rozmiarze musi zostać zamplifikowany w danej próbie).
Wynik testu PCR jest pozytywny, jeżeli wykryto specyficzny amplikon dla R. solanacearum o oczekiwanym rozmiarze i wzorze restrykcyjnym (jeśli taki jest wymagany), pod warunkiem, że nie jest on namnożony z jakiejkolwiek negatywnej próby kontrolnej. Wiarygodne potwierdzenie pozytywnego wyniku można również uzyskać, powtarzając badanie przy pomocy drugiego zestawu primerów PCR (dodatek 6).
Uwaga: Może istnieć podejrzenie inhibicji PCR, jeśli oczekiwany amplikon zostanie uzyskany z kontroli pozytywnej zawierającej R. solanacearum w wodzie, lecz z pozytywnych prób kontrolnych z R. solanacearum w ekstrakcie z ziemniaka uzyskano wyniki negatywne. W multipleksowych protokołach PCR z wewnętrznymi kontrolami PCR, na inhibicję reakcji wskazuje fakt, że nie został uzyskany żaden z dwóch amplikonów.
Jeśli z jednej lub większej ilości kontroli negatywnych uzyskano oczekiwany amplikon, wówczas można podejrzewać kontaminację.
7. Test FISH
Zasada
Jeżeli test FISH używany jest jako pierwsze badanie przesiewowe, a wynik jego jest pozytywny, należy wykonać izolację lub badanie IF jako drugie, obowiązkowe badanie przesiewowe. Gdy test FISH jest stosowany jako drugie badanie przesiewowe, a odczyt jest pozytywny, dla zakończenia diagnozy wymagane jest dalsze badanie zgodne ze schematem blokowym.
Uwaga: Użyć zatwierdzonych, specyficznych dla R. solanacearum sond oligonukleotydowych (patrz: dodatek 7). Badanie wstępne przy użyciu tej metody powinno pozwolić na odtwarzalne wykrywanie przynajmniej 103-104 komórek R. solanacearum przypadających na ml dodanych do ekstraktów prób, w stosunku do których uprzednio uzyskano wynik negatywny.
Następującą procedurę najlepiej jest stosować w przypadku świeżo przygotowanego ekstraktu z próby, lecz można ją stosować również w odniesieniu do ekstraktu przechowywanego w glicerynie w temperaturze od - 16 do - 24 °‹C lub od - 68 do - 86 °‹C.
Jako kontroli negatywnej użyć ekstraktu próby, w stosunku do której uprzednio uzyskano wynik negatywny dla R. solanacearum.
Jako kontrole pozytywne przygotować zawiesiny zawierające 105 do 106 komórek przypadających na ml R. solanacearum biowar 2 (np. szczep NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, patrz: dodatek 3) w buforze fosforanowym 0,01M (PB) z 3-5-dniowej hodowli). Przygotować oddzielne szkiełka kontroli pozytywnej z homogenicznego szczepu lub innego szczepu referencyjnego R. solanacearum, zawieszonego w ekstrakcie z ziemniaka, zgodnie z opisem w dodatku 3 B.
Stosowanie znakowanej FITC eubakteryjnej sondy oligonukleotydowej daje możliwość kontrolowania procesu hybrydyzacji, ponieważ barwione będą wszystkie eubakterie obecne w próbie.
Znormalizowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne dostępne do użycia przy tym badaniu wymieniono w dodatku 3 A).
Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).
7.1. Utrwalanie ekstraktu z ziemniaka
Poniższa procedura oparta jest na pracy Wullings et al., (1998):
7.1.1. Przygotować roztwór utrwalający (patrz: dodatek 7).
7.1.2. Odmierzyć pipetą 100 Ęl ekstraktu z każdej próby do probówki Eppendorfa i odwirować przez 7 min przy 7 000 g.
7.1.3. Usunąć supernatant i rozpuścić osad w 200 Ęl utrwalacza przygotowanego < 24 godzin wcześniej. Odwirować i inkubować przez 1 godzinę w lodówce.
7.1.4. Odwirować przez 7 min przy 7 000 g, usunąć supernatant i zawiesić ponownie osad w 75 Ęl 0,01M PB (patrz: dodatek 7).
7.1.5. Nanieść po 16 Ęl utrwalonych zawiesin na czyste szkiełko wielopunktowe tak, jak pokazano na rys. 7.1. Na szkiełko nakładać dwie różne próby, nierozcieńczone i w rozcieńczeniu 1:100, używając 10 Ęl ekstraktu, aby uzyskać rozcieńczenie 1:100 (w 0,01M PB). Pozostały roztwór próby (49 Ęl) może być przechowywany w - 20 °‹C po dodaniu 1 objętości 96 % etanolu. W przypadku jeśli test FISH wymaga powtórzenia, usunąć etanol przez wirowanie i dodać tę samą ilość 0,01M PB (zworteksować).
Rysunek 7.1. Rozkład na szkiełku FISH
7.1.6. Wysuszyć szkiełka na powietrzu (lub na płycie do suszenia szkiełek w temperaturze 37 °‹C) i utrwalić w płomieniu.
W tym momencie procedurę można przerwać i kontynuować hybrydyzację w dniu następnym. Szkiełka powinny być przechowywane w suchym miejscu pozbawionym kurzu. w temperaturze pokojowej.
7.2. Hybrydyzacja
7.2.1. Odwodnić komórki w serii rozcieńczeń alkoholu etylowego o stężeniach 50 %, 80 % i 96 % przez 1 minutę w każdym. Wysuszyć szkiełka na powietrzu w statywie na szkiełka.
7.2.2. Przygotować wilgotną komorę do inkubacji wykładając dno hermetycznego pojemnika bibułą lub papierem filtracyjnym nasączonym w 1x mieszaninie hybrydyzacyjnej (hybmix) (dodatek 7). Wstępnie inkubować pojemnik w cieplarce do hybrydyzacji w temperaturze 45 °‹C przez przynajmniej 10 minut.
7.2.3. Nanieść po 10 Ęl roztworu do hybrydyzacji (dodatek 7) na 8 okienek (okienka 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 oraz 10; patrz: rys. 7.1) z każdego szkiełka, pozostawiając dwa okienka środkowe (3 i 8) puste.
7.2.4. Przykryć szkiełkami nakrywkowymi (24 x 24 mm) pierwsze i ostatnie 4 okienka, tak aby nie uwięzić przy tym powietrza. Umieścić szkiełka we wstępnie ogrzanej wilgotnej komorze i hybrydyzować przez 5 godzin w cieplarce w 45 °‹C w ciemności.
7.2.5. Przygotować 3 zlewki zawierające 1 l Milli Q (stopień molekularny) wody, 1 l 1x mieszaniny hybrydyzacyjnej (334 ml 3x hybmix i 666 ml Milli Q wody) oraz 1 l 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix oraz 958 ml Milli Q wody). Inkubować wstępnie każdą z nich w łaźni wodnej w 45 °‹C.
7.2.6. Usunąć szkiełka nakrywkowe ze szkiełek i umieścić szkiełka w statywie.
7.2.7. Usunąć nadmiar sondy, inkubując przez 15 min w zlewce z 1x mieszaniny hybrydyzacyjnej w temperaturze 45 °‹C.
7.2.8. Przenieść statyw do szkiełek do 1/8 hybmix roztworu wymywającego i inkubować przez następne 15 min.
7.2.9. Zanurzyć szkiełka na krótko w Milli Q wodzie i umieścić na bibule filtracyjnej. Usunąć nadmiar wilgoci pokrywając powierzchnie delikatnie bibułą filtracyjną. Odmierzyć pipetą 5-10 Ęl roztworu utrwalającego zapobiegającego odbarwieniu (np. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA lub równoważny) na każde okienko i nałożyć duże szkiełko nakrywkowe (24 x 60 mm) na powierzchnię całego szkiełka.
7.3. Odczyt testu FISH
7.3.1. Oglądać szkiełka natychmiast, używając mikroskopu dostosowanego do mikroskopii epifluoroscencyjnej pod powiększeniem 630 lub 1 000 x, pod olejkiem imersyjnym. Przy filtrze odpowiednim dla izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), komórki eubakteryjne (w tym większość komórek Gram ujemnych) są zabarwione na kolor fluorescencyjno zielony. Przy stosowaniu filtra do 5-izotiocyjanianu tetrametylorodaminy barwione komórki Cy3 R. solanacearum są fluoryzująco czerwone. Porównać morfologię komórek z tą w kontroli pozytywnej. W przypadku niewłaściwego zabarwienia test FISH (sekcja VI.A.7) należy powtórzyć. Okienka przeglądać wzdłuż dwóch średnic pod kątem prostym oraz dookoła obwodu. Sprawdzić przynajmniej 40 pól mikroskopowych w okienkach niezawierających komórek lub zawierających ich małą ilość.
7.3.2. Poszukiwać w okienkach szkiełek testowych jaskrawo fluoryzujących komórek, o charakterystycznej dla R. solanacearum morfologii (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensywność fluorescencji musi być taka sama lub większa niż szczepu użytego jako kontrola pozytywna. Komórki niecałkowicie wybarwione lub komórki o słabej fluorescencji należy odrzucić.
7.3.3. W przypadku podejrzenia kontaminacji badanie należy powtórzyć. Tak może być w przypadku gdy wszystkie szkiełka w partii pokazują komórki pozytywne z powodu kontaminacji buforu lub jeśli odnalezione zostaną komórki pozytywne (poza okienkami szkiełek) na powierzchni szkiełka.
7.3.4. Ze specyficznością testu FISH wiąże się nieodłącznie kilka problemów. W osadzie z części przystolonowych bulw ziemniaka i fragmentów łodygi prawdopodobne jest występowanie w tle populacji fluoryzujących komórek o nietypowej morfologii oraz dających reakcje krzyżowe bakterii saprofitycznych o wielkości i budowie podobnej do R. solanacearum choć znacznie rzadziej niż w przypadku testu IF.
7.3.5. Pod uwagę brać należy jedynie fluoryzujące komórki o typowym rozmiarze i morfologii.
7.3.6. Interpretacja wyników testu FISH:
i) Prawidłowe wyniki testu FISH uzyskuje się, jeśli przy użyciu filtra FITC zaobserwuje się jasne zielone komórki fluorescencyjne o rozmiarze i morfologii typowej dla R. solanacearum i jeśli zaobserwuje się jasne fluorescencyjne czerwone komórki przy użyciu filtra rodaminowego we wszystkich kontrolach pozytywnych, a nie zaobserwuje się ich w żadnej kontroli negatywnej. Jeżeli stwierdzono obecność fluoryzujących komórek o charakterystycznej morfologii, trzeba oszacować średnią liczbę typowych komórek w polu widzenia mikroskopu oraz obliczyć liczbę komórek typowych przypadająca na ml ponownie zawieszonego osadu (dodatek 4). Próbki o odczycie 5 x 103 typowych komórek przypadających na ml ponownie zawieszonego osadu uznaje się za potencjalnie porażone. Konieczne wykonanie jest dalszych badań. Odczyt jest negatywny przy mniej niż 5 x 103 komórek typowych przypadających na ml zawieszonego osadu.
ii) Test FISH jest negatywny, jeśli fluoryzujące czerwone komórki o rozmiarze i morfologii typowej dla R. solanacearum nie zostaną wykryte przy użyciu filtra rodaminy, pod warunkiem zaobserwowania typowych fluoryzujących na czerwono komórek w preparatach kontroli pozytywnych przy użyciu filtra rodaminowego.
8. Testy ELISA
Zasada
Test ELISA możne być używany wyłącznie jako badanie fakultatywne wraz z badaniem IF, PCR lub FISH ponieważ ma ono niską czułość. Przy użyciu testu DAS ELISA, konieczne jest zastosowanie wzbogacenia i przeciwciał monoklonalnych (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Wzbogacenie prób przed użyciem w teście ELISA może okazać się pomocne dla zwiększenia czułości tego badania, lecz może się nie powieść z powodu konkurencji ze strony innych organizmów obecnych w próbie.
Uwaga: Należy używać zatwierdzonego źródła przeciwciał przeciw R. solanacearum (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Zaleca się, aby dla każdej nowej partii przeciwciał określać miano. Miano określa się jako największe rozcieńczenie, przy którym pojawia się optymalna reakcja w trakcie badania zawiesiny zawierającej 105 do 106 komórek przypadających na ml szczepu homogenicznego R. solanacearum i przy użyciu właściwych koniugatów przeciwciał zgodnie z zaleceniami producenta. Podczas badań rutynowych używa się dostępnych w handlu przeciwciał w rozcieńczeniu roboczym zbliżonym do wartości miana.
Określić miano przeciwciał na zawiesinie 105 do 106 komórek przypadających na ml homogenicznego szczepu R. solanacearum.
Dołączyć ekstrakt z próby, w przypadku którego uprzednie badanie wykazało negatywne wyniki na R. solanacearum i zawiesinę niereagujących krzyżowo bakterii w buforze fosforanowym (PBS) jako kontrolę negatywną.
Jako kontroli pozytywnej użyć ekstraktu próby, w przypadku którego uprzednie badanie dało negatywne wyniki, wymieszanego z 103 do 104 komórek przypadających na ml R. solanacearum biowar 2 (np. szczep NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, patrz: dodatek 2 A i B). Dla porównania wyników na każdej płytce wykorzystać standardową zawiesinę zawierającą 105 do 106 komórek przypadających na ml w PBS R. solanacearum. Należy upewnić się, że na płytce titracyjnej kontrole pozytywne są właściwie oddzielone od prób badanych.
Znormalizowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne dostępne do użycia przy tym badaniu wymieniono w dodatku 3 A.
Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny jak próbę(-y).
Zatwierdzone zostały dwa protokoły testu ELISA:
a) Pośredni test ELISA (Elphinstone i wsp., 1995)
1. Użyć 100-200 Ęl ekstraktu próby. (Ogrzewanie przez 4 minuty w temperaturze 100 °‹C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym może w pewnych wypadkach zredukować niespecyficzne wyniki).
2. Dodać tę samą objętość podwójnie stężonego buforu powlekającego (dodatek 4) i zworteksować.
3. Nałożyć po 100 l do każdej z co najmniej dwóch studzienek na płytce (np. Nunc-Polysorp lub równoważny). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °‹C lub przez noc w temperaturze 4 °‹C.
4. Usunąć ekstrakty ze studzienek. Przepłukać studzienki trzykrotnie buforem PBS-Tween (dodatek 4), pozostawiając w studzience ostatni roztwór używany do płukania na przynajmniej 5 minut.
5. Przygotować stosowne rozcieńczenia przeciwciał przeciw R. solanacearum w buforze blokującym (dodatek 4). W przypadku zatwierdzonych komercyjnych przeciwciał, użyć zalecanych rozcieńczeń (zazwyczaj o stężeniu dwukrotnie większym niż miano).
6. Nałożyć po 100 l do każdej studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °‹C.
7. Usunąć roztwór przeciwciał ze studzienek i wypłukać jak poprzednio (pkt 4).
8. Przygotować właściwe rozcieńczenia drugich przeciwciał koniugatu alkalicznej fosfatazy w buforze blokującym. Nałożyć po 100 l do każdej studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °‹C.
9. Usunąć koniugaty przeciwciał ze studzienek i wypłukać jak poprzednio (pkt 4).
10. Dodać 100 Ęl roztworu substratu fosfatazy alkalicznej (dodatek 4) do każdej studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze otoczenia i odczytać absorbancję przy 405 nm w regularnych odstępach, w ciągu 90 minut.
b) DASI ELISA
1. Przygotować stosowne rozcieńczenia przeciwciał poliklonalnych przeciw R. solanacearum w buforze powlekającym pH 9,6 (dodatek 4). Dodać 200 Ęl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °‹C przez 4-5 godz. lub przy 4 °‹C przez 16 godz.
2. Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4).
Dodać 190 Ęl ekstraktu próby do co najmniej 2 studzienek. Dodać także kontrolę pozytywną i negatywną do dwóch studzienek przypadających na płytkę. Inkubować przez 16 godz. w temperaturze 4 °‹C.
3. Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4).
4. Przygotować stosowne rozcieńczenia specyficznych dla R. solanacearum przeciwciał monoklonalnych w PBS (dodatek 4) zawierających również 0,5 % albuminy z surowicy bydlęcej (BSA) oraz dodać 190 Ęl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °‹C przez 2 godz.
5. Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4).
6. Przygotować stosowne rozcieńczenie koniugatu anty-mysich immunoglobin z fosfatazą alkaliczną w PBS. Dodać 190 Ęl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °‹C przez 2 godz.
7. Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4).
8. Przygotować roztwór substratu alkalicznej fosfatazy zawierający 1 mg fosfatazy p-nitrofenylu przypadającego na ml buforu substratowego (dodatek 4). Dodać 200 Ęl do każdej studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze otoczenia i odczytać absorbancję przy 405 nm w regularnych odstępach, w ciągu 90 minut.
Interpretacja wyników testu ELISA
Wynik testu ELISA jest negatywny, gdy średnia gęstość optyczna (OD) odczytywana w dwóch powtórzeniach ze studzienek próby wynosi < 2x OD dla studzienki kontroli negatywnej, pod warunkiem że OD dla kontroli pozytywnych studzienek kontrolnych wynosi powyżej 1,0 (po 90 minutach inkubacji z substratem) i więcej niż podwójna OD uzyskana dla negatywnych ekstraktów prób.
Wynik testu ELISA jest pozytywny, gdy odczyty średniej gęstości optycznej OD próby w dwóch powtórzeniach wynoszą > 2x OD w negatywnym ekstrakcie próby pod warunkiem, że odczyt OD dla wszystkich kontroli pozytywnych wynosi < 2x tych w studzienkach kontroli pozytywnych.
Negatywne odczyty testu ELISA w studzienkach kontroli pozytywnych wskazują, że badanie nie zostało wykonane poprawnie lub że zostało zahamowane. Pozytywne odczyty testu ELISA w studzienkach kontroli negatywnych wskazują na kontaminację lub pojawienie się niespecyficznego wiązania przeciwciał.
9. Test biologiczny
Uwaga: Wstępne testy przy użyciu tej metody powinny pozwolić na powtarzalne wykrywanie od 103 do 104 jednostek tworzących kolonie R. solanacearum. na ml dodanych do ekstraktów prób, które we wcześniejszych testach dały wyniki ujemne (sposób przygotowania opisano w dodatku 3).
Najwyższej czułości wykrywania można oczekiwać, kiedy stosuje się świeżo przygotowane ekstrakty i zapewnia się optymalne warunki wzrostu. Metodę tę można jednak z powodzeniem stosować do ekstraktów, które były przechowywane pod glicerolem w temp. od - 68 do - 86 °‹C.
Protokół ten oparty jest o publikację Janse (1988):
9.1. Dla każdej próby użyć 10 roślin testowych wrażliwej odmiany pomidora (np. »Moneymaker« lub odmiany o podobnej podatności określonej w badaniu laboratoryjnym) w stadium trzeciego właściwego liścia. Szczegóły hodowli zamieszczono w dodatku 8. Alternatywnie można użyć roślin oberżyny (np. odmiany »Black Beauty« lub odmian o podobnej podatności), używać wyłącznie roślin w stadium 2-3 liści do pełnego rozwoju trzeciego liścia właściwego. Wykazano, że w przypadku użycia oberżyny obserwowane symptomy były słabsze i rozwijały się wolniej. W miarę możliwości zaleca się używanie sadzonek pomidora.
9.2. Rozdzielić po 100 Ęl ekstraktu próby pomiędzy rośliny testowe.
9.2.1. Inokulacja za pomocą strzykawki
Inokulować łodygi roślin powyżej liścieni za pomocą strzykawki z igłą do iniekcji podskórnej (nie mniejszej niż 23 G). Próbę rozdzielić między rośliny testowe.
9.2.2. Inokulacja przez nacięcie
Trzymając roślinę między dwoma palcami, nanieść na łodygę kroplę (średnio 5-10 Ęl) zawieszonego osadu w miejscu między liścieniami i pierwszym liściem.
Za pomocą sterylnego skalpela wykonać ukośne nacięcie, o długości 1,0 cm i na głębokość średnio 2/3 grubości łodygi, rozpoczynając od miejsca naniesienia kropli osadu.
Ranę zamknąć sterylną wazeliną ze strzykawki.
9.3. Stosując tę samą technikę, zainokulować 5 sadzonek zawiesiną wodną 105 do 106 komórek przypadających na ml, przygotowaną z 48 godz. kultury wirulentnego biowar 2 szczepu R. solanacearum jako kontrolę pozytywną oraz buforem do zawieszania osadu (dodatek 4) jako kontrolę negatywną. W celu uniknięcia kontaminacji oddzielić kontrolę pozytywną i negatywną od pozostałych roślin testowych.
9.4. Utrzymywać rośliny testowe w warunkach kwarantanny przez okres do 4 tygodni, w temperaturze 25-30 °‹C w wilgotności względnej z właściwym podlewaniem, aby zapobiec podtopieniu lub więdnięciu z powodu braku wody. Dla uniknięcia kontaminacji inkubować rośliny zainokulowanej kontroli pozytywnej i negatywnej na wyraźnie oddzielonych stołach w szklarni lub komorze wzrostu lub, w przypadku ograniczonej przestrzeni, zapewnić restrykcyjne oddzielenie pomiędzy procesami. Jeśli rośliny należące do różnych prób muszą być inkubowane w pobliżu, oddzielić je odpowiednimi ekranami. Przy nawożeniu, podlewaniu, kontrolowaniu i innych procedurach, należy bardzo uważać, aby unikać kontaminacji. Bardzo ważne jest, aby w szklarni lub komorze hodowlanej nie było żadnych owadów, ponieważ mogą one z próby na próbę przenosić bakterie.
Obserwować objawy więdnięcia, epinastii, chlorozy i/lub zahamowania rozwoju.
9.5. Wyizolować z porażonych roślin (sekcja II.3) i zidentyfikować oczyszczone kultury typowe dla R. solanacearum (sekcja VI. B).
9.6. Jeśli w okresie 3 tygodni nie zaobserwuje się żadnych objawów, wykonać IF/PCR/izolację na próbie zbiorczej złożonej z 1 cm fragmentów łodyg każdej badanej rośliny wziętej z odcinka powyżej miejsca inokulacji. Jeśli wynik testu jest pozytywny, wykonać posiew metodą rozcieńczeń płytkowych (sekcja 4.1).
9.7. Zidentyfikować wszelkie oczyszczone kultury typowe dla R. solanacearum (sekcja VI. B).
Interpretacja wyników testu biologicznego:
Prawidłowe wyniki testu biologicznego są uzyskiwane, kiedy rośliny stanowiące kontrolę pozytywną wykazują typowe objawy, bakterie z tych roślin mogą być reizolowane, a na roślinach będących kontrolą negatywną nie występują objawy.
Test biologiczny daje wynik negatywny, jeżeli rośliny nie zostały porażone przez R. solanacearum, pod warunkiem że obecność kultury R. solanacearum wykryto w kontrolach pozytywnych.
Test biologiczny daje wynik pozytywny, gdy rośliny testowe są porażone przez R. solanacearum.
B. TESTY IDENTYFIKACYJNE
Zidentyfikować czyste kultury typowe dla R. solanacearum przy użyciu co najmniej dwóch z poniższych testów opartych na różnych zasadach biologicznych.
Dołączyć znane szczepy referencyjne, tam gdzie to stosowne, dla każdego wykonywanego badania (patrz: dodatek 3).
1. Testy fizjologiczne i biochemiczne
Określić następujące właściwości fenotypu, które standardowo występują lub nie w R. solanacearum, zgodnie z metodami Lelliotta i Steada (1987), Klementa et al. (1990), Schaad (2001).
| Test | Oczekiwany wynik |
| Produkcja barwnika fluorescencyjnego | - |
| Obecność poli-Ŕ -hydroksymaślanu | + |
| Test oksydacyjno/fermentacyjny (O/F) | O+/F- |
| Katalaza | + |
| Aktywność oksydazy | + |
| Redukcja azotanu | + |
| Wykorzystywanie cytrynianu | + |
| Wzrost przy 40 °‹C | - |
| Wzrost w 1 % NaCl | + |
| Wzrost w 2 % NaCl | - |
| Aktywność hydrolazy argininy | - |
| Upłynnianie żelatyny | - |
| Hydroliza skrobi | - |
| Hydroliza esuliny | - |
| Produkcja lewanu | - |
2. Test IF
2.1. Przygotować zawiesinę około 106 komórek przypadających na ml w buforze IF (dodatek 4).
2.2. Przygotować serię dwukrotnych rozcieńczeń odpowiedniej surowicy (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).
2.3. Zastosować procedurę IF (sekcja VI.A.5).
2.4. Wynik testu IF jest dodatni, jeśli miano IF badanej kultury jest równoważne mianu z kontroli pozytywnej.
3. Test ELISA
Uwaga: Jeżeli wykonywane są tylko 2 testy identyfikacyjne, poza tą metodą, nie należy używać kolejnego badania serologicznego.
3.1. Przygotować zawiesinę około 108 komórek przypadających na ml 1X PBS (dodatek 4).
3.2. Zastosować odpowiednią procedurę testu ELISA ze specyficznymi przeciwciałami monoklonalnymi przeciw R. solanacearum.
3.3. Wynik testu ELISA jest dodatni, jeśli odczyt ELISA uzyskany z badanej kultury wynosi przynajmniej połowę tego uzyskanego dla kontroli pozytywnej.
4. Test PCR
4.1. Przygotować zawiesinę około 106 komórek przypadających na ml w sterylnej wodzie o stopniu molekularnym.
4.2. Podgrzać 100 Ęl zawiesiny komórek w zamkniętych probówkach w bloku grzejnym lub wrzącej łaźni wodnej w temperaturze 100 °‹C przez 4 minuty. Próbki mogą być następnie przechowywane do momentu, kiedy będą potrzebne w temp. od - 16 do - 24 °‹C.
4.3. Użyć właściwych procedur PCR dla namnożenia specyficznych dla R. solanacearum amplikonów (np. Seal et al. (1993); Pastrik i Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999).
4.4. Pozytywna identyfikacja R. solanacearum następuje, jeśli amplikony PCR są tego samego rozmiaru i posiadają te same polimorfizmy restrykcyjne długości fragmentu, co dla szczepu kontroli pozytywnej.
5. Test FISH
5.1. Przygotować zawiesinę około 106 komórek przypadających na ml w UPW.
5.2. Zastosować procedurę FISH (sekcja VI.A.7) przynajmniej z dwoma pozytywnymi specyficznymi dla R. solanacearum sondami oligonukleotydowymi (dodatek 7).
5.3. Wynik testu FISH jest dodatni, jeśli takie same reakcje uzyskuje się z kultury badanej oraz kontroli pozytywnej.
6. Analiza kwasów tłuszczowych (FAP)
6.1. Hodować kulturę na trypticase soy agar (Oxoid) przez 48 godzin w temperaturze 28 °‹C.
6.2. Zastosować odpowiednią metodę FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).
6.3. Badanie FAP daje wynik pozytywny, gdy profil kultury badanej jest identyczny z profilem dla kontroli pozytywnej. Obecność charakterystycznych kwasów tłuszczowych takich jak 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH oraz 18:1 2OH, a brak 16:0 3OH w dużym w stopniu wskazuje na występowanie Ralstonia sp.
7. Metoda oznaczania szczepu
Wykonanie oznaczenia szczepu przy użyciu z jednej z następujących metod zaleca się dla każdego nowego przypadku izolacji R. solanacearum.
Dołączyć znane szczepy referencyjne, tam gdzie to stosowne, dla każdego wykonywanego badania (patrz: dodatek 3).
7.1. Określenie biowaru
R. solanacearum dzieli się na biowary ze względu na ich zdolność do wytwarzania i/lub utleniania trzech cukrów i trzech alkoholi heksozowych (Hayward, 1964 i Hayward et al., 1990). Podłoże wzrostowe do badania browarów opisano w dodatku 2. Badanie można z powodzeniem wykonać szczepiąc podłoże czystymi kulturami R. solanacearum i inkubując w temperaturze 28 °‹C. Jeśli podłoże rozdzieli się do sterylnych 96 studzienek płytki (200 Ęl na studzienkę), w ciągu 72 godzin można zaobserwować zmianę barwy z oliwkowo zielonej na żółtą, co wskazuje na pozytywny wynik badania.
| Biowar | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Wykorzystanie: | |||||
| Maltozy | - | + | + | - | + |
| Laktozy | - | + | + | - | + |
| D (+) celobiozy | - | + | + | - | + |
| Mannitolu | - | - | + | + | + |
| Sorbitolu | - | - | + | + | - |
| Dulcytolu | - | - | + | + | - |
Dodatkowe badania różnicujące biowar 2 na podfenotypy
| Biovar 2A (Na całym świecie) | Biovar 2A (W Chile i Kolumbii) | Biovar 2T (W obszarach tropikalnych) | |
| Wykorzystanie trehalozy | - | + | + |
| Wykorzystanie mezoinozytolu | + | - | + |
| Wykorzystanie D-rybozy | - | - | + |
| Aktywność pektolityczna(1) | niska | niska | wysoka |
| (1) Patrz: Lelliott and Stead (1987) | |||
7.2. Genomowe fingerprinting
Różnicowanie molekularne szczepów kompleksu R. solanacearum można zrealizować na drodze kilku technik, w tym:
7.2.1. Analizą restrykcyjnego polimorfizmu długości fragmentu (RFLP) (Cook et al., 1989).
7.2.2. Powtarzanego sekwencjonowania PCR przy użyciu REP, BOX i starterów ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al. (1995).
7.2.3. Analizą mnożonego polimorfizmu długości fragmentu (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998).
7.3. Metody PCR
Specyficzne startery PCR (Pastrik et al., 2002; patrz: dodatek 6) można użyć do rozróżnienia szczepów należących do działu 1 (biowary 3, 4 i 5) i działu 2 (biowary 1, 2A i 2T) R. solanacearum, zgodnie z pierwotną definicją analizy RFLP (Cook et al., 1989) oraz 16S sekwencjonowania rDNA (Taghavi et al., 1996).
C. TESTY POTWIERDZAJĄCE
Test patogeniczności musi być wykonany jako końcowe potwierdzenie diagnozy występowania R. solanacearum oraz do określania wirulencji kultur zidentyfikowanych jako R. solanacearum.
1. Przygotować inokulum 106 komórek na 1 ml z badanej kultury hodowanej przez 24-48 godzin i szczep kontroli pozytywnej R. solanacearum (np. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; patrz: dodatek 3).
2. Zainokulować 5-10 wrażliwych sadzonek pomidora lub oberżyny w stadium trzeciego właściwego liścia (Patrz: sekcja VI.A.9).
3. Inkubować przez okres do 2 tygodni w temperaturze 25-28 °‹C w wysokiej wilgotności względnej z właściwym podlewaniem, aby zapobiec powstaniu stresu z powodu podtopienia lub zbytniego wysuszenia. Przy czystych kulturach, typowe więdnięcie powinno się uzyskać w ciągu 15 dni. Jeśli po tym okresie nie ma objawów, nie można potwierdzić, że kultura jest patogeniczną formą R. solanacearum.
4. Izolacji dokonywać z roślin wykazujących objawy porażenia w następujący sposób.
5. Pobrać wycinek tkanki z łodygi, 2 cm powyżej punktu inokulacji. Rozdrobnić ją i zawiesić w małej objętości sterylnej wody destylowanej lub 50 mM buforu fosforanowego (dodatek 4). Izolować z zawiesiny poprzez naniesienie rozcieńczenia na odpowiednią pożywkę, najlepiej na pożywkę selektywną (dodatek 2), inkubować przez 48-72 godzin w temperaturze 28 °‹C i sprawdzić, czy pojawiły się typowe kolonie R. solanacearum.
Dodatek 1
Laboratoria zajmujące się optymalizacją i zatwierdzeniem protokołów
| Laboratorium(1) | Miasto | Państwo |
| Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit | Wiedeń i Linz | Austria |
| Departement Gewasbescherming | Merelbeke | Belgia |
| Plantedirektoratet | Lyngby | Dania |
| Central Science Laboratory | York | Anglia |
| Scottish Agricultural Science Agency | Edynburg | Szkocja |
| Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie | Angers | Francja |
| Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre | Le Rheu | Francja |
| Biologische Bundesanstalt | Kleinmachnow | Niemcy |
| Pflanzenschutzamt Hannover | Hannover | Niemcy |
| State Laboratory | Dublin | Irlandia |
| Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali | Bolonia | Włochy |
| Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari | Werona | Włochy |
| Nederlandse Algemene Keuringsdienst | Emmeloord | Holandia |
| Plantenziektenkundige Dienst | Wageningen | Holandia |
| Direcção-Geral de Protecção das Culturas | Lizbona | Portugalia |
| Centro Diagnostico de Aldearrubia | Salamanca | Hiszpania |
| Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias | Walencja | Hiszpania |
| Swedish University of Agricultural Sciences | Uppsala | Szwecja |
| (1) Naukowcy będący osobami kontaktowymi: patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main. | ||
Dodatek 2
Pożywki do izolacji i hodowli R. solanacearum
a) Ogólne pożywki do hodowli
Pożywka agarowa (NA)
Nutrient Agar (Difco) 23,0 g
Woda destylowana 1,0 l
Rozpuścić składniki i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °‹C przez 15 min
Agar drożdżowo-peptonowo-glukozowy (YPGA)
Yeast extract (Difco) 5,0 g
Bacto-Peptone (Difco) 5,0 g
Monohydrat D(+) glukozy 10,0 g
Bacto-Agar (Difco) 15,0 g
Woda destylowana 1,0 l
Rozpuścić składniki i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °‹C przez 15 minut.
Agar sacharozowo-peptonowy (SPA)
Sacharoza 20,0 g
Bacto-Peptone (Difco) 5,0 g
K2HPO4 0,5 g
MgSO4.7H2O 0,25 g
Bacto-Agar (Difco) 15,0 g
Woda destylowana 1,0 l
pH 7,2-7,4
Rozpuścić składniki i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °‹C przez 15 minut.
Pożywka tetrazolowa Kelmana
Casamino acids (Difco) 1,0 g
Bacto-Peptone (Difco) 10,0 g
Dekstroza 5,0 g
Bacto-Agar (Difco) 15,0 g
Woda destylowana 1,0 l
Rozpuścić składniki i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °‹C przez 15 minut.
Oziębić do 50oC i dodać sterylizowany przez filtr roztwór wodny 2,3,5 chlorku trifenylo-tetrazolowego (Sigma), tak
by otrzymać stężenie końcowe 50 mg/l.
b) Zatwierdzone pożywki selektywne do hodowli
Pożywka SMSA (Englebrecht, 1994 zmodyfikowane przez Elphinstone et al., 1996)
Pożywka podstawowa
Casamino acids (Difco) 1,0 g
Bacto-Peptone (Difco) 10,0 g
Gliceryna 5,0 ml
Bacto-Agar (Difco) (patrz: Uwaga 2) 15,0 g
Woda destylowana 1,0 l
Rozpuścić składniki i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °‹C przez 15 minut
Oziębić do 50 °‹C i dodać sterylizowany przez filtr roztwór wodny następujących składników w celu uzyskania określonych stężeń końcowych:
| Fiolet krystaliczny (Sigma) | 5 mg na l |
| Siarczan polimyksyny B | (Sigma P-1004) 600.000 U (około 100 mg) na l |
| Bacytracyna (Sigma B-0125) | 1.250 U (około 25 mg) na l |
| Chloroamfenikol (Sigma C-3175) | 5 mg na l |
| Penicylina-G (Sigma P-3032) | 825 U (około 0,5 mg) na l |
| 2,3,5 chlorek trifenylo-tetrazolowy (Sigma) | 50 mg na l |
Uwaga:
1. Używanie odczynników innych niż wskazane powyżej może mieć wpływ na hodowlę R. solanacearum.
2. Oxoid Agar #1 można użyć zamiast Bacto-agar (Difco). W tym wypadku, wzrost R. solanacearum będzie wolniejszy, choć można zmniejszyć też wzrost konkurujących saprofitów. Typowe dla R. solanacearum kolonie mogą formować się 1-2 dni dłużej, a czerwony kolor może być jaśniejszy i bardziej rozproszony niż na Bacto-Agar.
3. Zwiększenie stężenia bacytracyny do 2 500 U/l może zredukować populacje konkurujących bakterii bez wpływu na wzrost R. solanacearum.
Pożywki i roztwory antybiotyków przechowywać w temperaturze 4 °‹C w ciemnym miejscu i wykorzystać w ciągu miesiąca.
Przed użyciem z płytek należy usunąć skropliny, jakie wytwarzają się na powierzchni.
Należy unikać nadmiernego wysuszenia płytek.
Kontrolę jakości powinno się wykonać po przygotowaniu każdej nowej partii pożywki poprzez nałożenie na płytki zawiesiny kultury referencyjnej R. solanacearum (patrz: dodatek 3) i obserwowanie formowania się typowych kolonii po inkubacji w temperaturze 28 °‹C przez 2-5 dni.
c) Zatwierdzona pożywka do wzbogacenia
Pożywka SMSA (Elphinstone et al., 1996)
Przygotować tak jak pożywkę agarową selektywną SMSA, lecz pominąć Bacto-Agar i 2,3,5 chlorek trójfenylo-tetrazolowy.
Zmodyfikowana pożywka Wilbrink (Caruso et al., 2002)
Sacharoza 10 g
Proteose peptone 5 g
K2HPO4 0,5 g
MgSO4 0,25 g
NaNO3 0,25 g
Woda destylowana 1 l
Sterylizować pożywkę w autoklawie, w temp. 121 °‹C, przez 15 minut i ochłodzić do 50 °‹C
Dodać roztwory antybiotyków jak dla pożywki SMSA.
Dodatek 3
A. Dostępne w handlu znormalizowane materiały kontrolne
a) Szczepy bakterii
Do użycia jako standardowy materiał referencyjny zaleca się następujący szczep bakteryjny do przygotowania kontroli pozytywnych (tabela 1) lub w trakcie optymalizacji badań dla uniknięcia reakcji krzyżowych (tabela 2). Wszystkie szczepy są ogólno dostępne w handlu w następujących podmiotach:
1. National Collection of Plant Pathogenic Bacteria (NCPPB), Central Science Laboratory, York, UK.
2. Culture Collection of the Plant Protection Service (PD), Wageningen, Niderlandy.
3. Collection Française de Bactéries Phytopathogènes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, Francja.
Tabela 1 Panel referencyjny SMT szczepów R. solanacearum
| Kod NCPPB | SMT # | Pozostałe kody | Kraj pochodzenia | Biowar |
| NCPPB 4153 | 6 | CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 | Egipt | 2 |
| NCPPB 4154 | 10 | CFBP 4585, 550, EURS21 | Turcja | 2 |
| NCPPB 3857 | 12 | CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 | Anglia | 2 |
| NCPPB 1584 | 23 | CFBP 4598, EURS49 | Cypr | 2 |
| NCPPB 2505 | 24 | CFBP 4599, EURS50 | Szwecja | 2 |
| NCPPB 4155 | 26 | CFBP 4601, 502, EURS55 | Belgia | 2 |
| NCPPB 4156(*) | 71(*) | PD 2762, CFBP 3857 | Holandia | 2 |
| NCPPB 4157 | 66 | LNPV 15.59 | Francja | 2 |
| NCPPB 4158 | 39 | CFBP 4608, Port 448, EURS80 | Portugalia | 2 |
| NCPPB 4160 | 69 | IVIA-1632-2 Hiszpania | 2 | |
| NCPPB 4161 | 76 | B3B Niemcy | 2 | |
| NCPPB 325 | 41 | CFBP 2047, KEL60-1, R842 | USA | 1 |
| NCPPB 3967 | 42 | CFBP 4610, R285, GONg7 | Kostaryka | 1 |
| NCPPB 4028 | 43 | CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 | Kolumbia | 2 |
| NCPPB 3985 | 44 | CFBP 4612, R578, CIP312 | Peru | 2T |
| NCPPB 3989 | 45 | CFBP 4613, R568, CIP226 | Brazylia | 2T |
| NCPPB 3996 | 46 | CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 | Peru | 3 |
| NCPPB 3997 | 47 | CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a | Australia | 3 |
| NCPPB 4029 | 48 | CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 | Sri Lanka | 4 |
| NCPPB 4005 | 49 | CFBP 4616, R470 | Filipiny | 4 |
| NCPPB 4011 | 50 | CFBP 4617, R288, HEmps2 | Chiny | 5 |
| (*) Stosować jako standardowe szczepy referencyjne R. solanacearum biowar 2 (rasa 3). | ||||
Uwaga: Autentyczność powyższych szczepów może być zagwarantowana tylko wówczas, gdy zostały one pozyskane z autentycznego zbioru hodowli.
Tabela 2 Panel referencyjny SMT i związanych serologicznie lub genetycznie bakterii do stosowania przy optymalizacji badań wykrywania.
| Kod NCPPB | SMT # | Pozostałe kody | Identyfikacja |
| NCPPB 4162 | 51 | CFBP 1954 | Bacillus polymyxa(1) |
| NCPPB 4163 | 52 | CFBP 1538 | Pseudomonas marginalis pv. marginalis(1) |
| NCPPB 4164 | - | CFBP 2227 | Burkholderia cepacia(2) |
| NCPPB 4165 | - | CFBP 2459 | Ralstonia pickettii(2) |
| NCPPB 4166 | 58 | CFBP 3567 CSL Pr1150 | Ralstonia pickettii(1) |
| NCPPB 4167 | 60 | CFBP 4618 PD 2778 | Ralstonia sp.(1) |
| NCPPB 1127 | 53 | CFBP 3575 | Burkholderia andropogonis(1) |
| NCPPB 353 | 54 | CFBP 3572 | Burkholderia caryophylli(1) |
| NCPPB 945 | 55 | CFBP 3569 | Burkholderia cepacia(1) |
| NCPPB 3708 | 56 | CFBP 3574 | Burkholderia glumae(1) |
| NCPPB 3590 | 57 | CFBP 3573 | Burkholderia plantarii(1) |
| NCPPB 3726 | 59 | CFBP 3568 | Banana Blood Disease Bacterium(1)(2)(3) |
| NCPPB 4168 | 61 | CFBP 4619 IPO S339 | Enterobacter sp.(1) |
| NCPPB 4169 | 62 | IPO 1695 | Enterobacter sp.(1) |
| NCPPB 4170 | 63 | CFBP 4621 IPO S306 | Ochrobactrum anthropi(1)(2) |
| NCPPB 4171 | 64 | CFBP 4622 IPO 1693 | Curtobacterium sp.(1)(2) |
| NCPPB 4172 | 65 | IPO 1696a | Pseudomonas sp.(1) |
| NCPPB 4173 | - | PD 2318 | Aureobacterium sp.(2) |
| NCPPB 4174 | 81 | IVIA 1.844,06 | Flavobacterium sp.(1)(2) |
| (1) Potencjalny szczep reagujący krzyżowo w badaniach serologicznych (IF i/lub ELISA) z antysurowicą poliklonalną. | |||
| (2) Szczep, z którego można rozmnożyć produkt PCR w pewnych laboratoriach o podobnym rozmiarze do tego, jakiego się oczekuje przy użyciu specyficznych primerów OLI-1 oraz Y-2 (patrz: dodatek 6). | |||
| (3) Prawdopodobna reakcja krzyżowa w większości badań, lecz znany z występowania tylko na bananach w Indonezji. | |||
b) Dostępne w handlu znormalizowane materiały kontrolne
Następujące standardowe materiały kontrolne są dostępne ze zbiorów hodowlanych NCPPB.
Zamrozić wysuszony osad ekstraktu ziemniaka z 200 zdrowych bulw jako kontrolę negatywną dla wszystkich testów.
Zamrozić wysuszony osad ekstrakt ziemniaka z 200 zdrowych bulw zawierających od 103 do 104 i 104 do 106 komórek R. solanacearum biowar 2 (szczep NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) jako pozytywne kontrole dla testu serologicznego i testu PCR. Jako że żywotność komórek jest w trakcie zamrażania i suszenia obniżana, nie nadają się one jako standardowe próby kontrolne do badań izolacji lub testów biologicznych.
Zawiesiny utrwalane w formalinie R. solanacearum biowar 2 (szczep NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) przy 106 komórek przypadających na ml jako pozytywne kontrole do testów serologicznych.
B. Przygotowanie kontroli pozytywnych i negatywnych testów przesiewowych PCR/IF i FISH
Wytworzyć kulturę 48-godzinną wirulentnego szczepu R. solanacearum rasa3/biowar2 (np. szczep NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) na uniwersalnej pożywce SMSA i zawiesić w 10 mM buforze fosforanowym dla uzyskania gęstości około 2 ×~ 108 cfu przypadających na ml. Uzyskuje się zwykle lekko mętną zawiesinę odpowiadającą gęstości optycznej 0,15 przy 600 nm.
Pobrać części przystolonowe z 200 bulw ziemniaków odmiany o białej skórce, o których wiadomo, że są wolne od R. solanacearum.
Z pobranymi częściami przystolonowymi postępować jak zwykle i zawiesić osad w 10 ml.
Przygotować 10 sterylnych mikrofiolek 1,5 ml z 900 Ęl zawieszonego osadu.
Przenieść 100 Ęl zawiesiny R. solanacearum do pierwszej mikrofiolki. Zworteksować.
Ustalić dziesiętne poziomy porażenia przez dalsze rozcieńczanie w następnych pięciu mikrofiolkach.
Sześć porażonych mikrofiolek należy wykorzystać jako kontrolę pozytywną. Cztery nieporażone mikrofiolki należy wykorzystać jako kontrolę negatywną. Należy zaopatrzyć mikrofiolki w odpowiednie etykiety.
Rozdzielić uzyskane zawiesiny po 100 Ęl do sterylnych 1,5 ml mikrofiolek otrzymując 9 powtórzeń każdego rozcieńczenia. Przechowywać w temp. - 16 do - 24 °‹C do chwili użycia.
Obecność i liczebność R. solanacearum w próbach kontrolnych należy najpierw potwierdzić przez test IF.
W przypadku testu PCR dla każdej serii prób testowych dokonać ekstrakcji DNA z prób kontroli pozytywnej i negatywnej.
W przypadku testów IF i FISH dla każdej serii prób testowych przeprowadzić badania na próbach kontroli pozytywnej i negatywnej.
W przypadku testów IF, FISH i PCR R. solanacearum musi zostać wykryty w przynajmniej 106 i 104 komórek/ml kontroli pozytywnej i nie wykryty w żadnej kontroli negatywnej.
Dodatek 4
Skład buforów i sposób ich przygotowania
UWAGI OGÓLNE: Zamknięte sterylne bufory można przechowywać do jednego roku
1. Bufory do ekstrakcji
1.1. Bufor ekstrakcyjny (50 mM bufor fosforanowy, pH 7,0)
Ten bufor jest używany do ekstrakcji bakterii z tkanek rośliny poprzez homogenizację lub wstrząsanie.
Na2HPO4 (bezwodny) 4,26 g
KH2PO4 2,72 g
Woda destylowana 1,00 l
Rozpuścić składniki, sprawdzić wartość pH i wysterylizować przy użyciu autoklawu w temperaturze 121 °‹C przez 15 min.
Przydatne mogą być następujące dodatkowe składniki:
| Cel | Ilość (na l) | |
| Lubrol w płatkach | Czynnik deflokulacyjny(*) | 0,5 g |
| Czynnik antypieniący (Silicone DC) | Czynnik antypieniący(*) | 1,0 ml |
| Pirofosforan czterosodowy | Antyutleniacz | 1,0 g |
| Poliwinylopirolidon-40000 (PVP-40) | Wiązane inhibitorów PCR | 50 g |
______
(*) Do stosowania w przypadku metody ekstrakcji przez homogenizacji.
1.2. Bufor do zawieszania osadu (10 mM bufor fosforanowy, pH 7,2)
Bufor jest używany do zawieszania i rozcieńczania ekstraktów z bulw ziemniaka po zagęszczeniu przez wirowanie.
Na2HPO4.12H2O 2,7 g
NaH2PO4.2H2O 0,4 g
Woda destylowana 1,0 l
Rozpuścić składniki, sprawdzić wartość pH i wysterylizować przy użyciu autoklawu w temperaturze 121 °‹C przez 15 min.
2. Bufory do testu IF
2.1. Bufor IF (10 mM bufor fosforanowy (PBS), pH 7,2)
Bufor jest używany do rozpuszczania przeciwciał
Na2HPO4.12H2O 2,7 g
NaH2PO4.2H2O 0,4 g
NaCL 8,0 g
Woda destylowana 1,0 l
Rozpuścić składniki, sprawdzić wartość pH i wysterylizować przy użyciu autoklawu w temperaturze 121 °‹C przez 15 min.
2.2. Bufor IF-Tween
Bufor ten stosowany jest do płukania szkiełek.
Dodać 0,1 % Tween 20 do buforu IF.
2.3. Bufor glicerynowo-fosforanowy, pH 7,6
Bufor ten jest dodawany na okienka szkiełek IF, w celu zwiększenia fluorescencji.
Na2HPO4.12H2O 3,2 g
NaH2PO4.2H2O 0,15 g
Gliceryna 50 ml
Woda destylowana 100 ml
Roztwory utrwalające o działaniu przeciwodbarwiającym są dostępne np. w Vectashield® (Vector Laboratories) lub Citifluor® (Leica).
3. Bufory do pośredniego testu ELISA
3.1. Podwójnie stężony bufor powlekający, pH 9,6
Na2CO3 6,36 g
NaHCO3 11,72 g
Woda destylowana 1,00 l
Rozpuścić składniki, sprawdzić wartość pH i wysterylizować przy użyciu autoklawu w temperaturze 121 °‹C przez 15 min.
Można dodać siarczek sodu jako antyutleniacz dla wyeliminowania nagromadzenia się utlenionych związków substancji aromatycznych.
3.2. 10 X bufor fosforanowy (PBS), pH 7,4
NaCl 80,0 g
KH2PO4 2,0 g
Na2HPO4.12H2O 29,0 g
KCl 2,0 g
Woda destylowana 1,0 l
3.3. PBS-Tween
10X PBS 100 ml
10 % Tween 20 5 ml
Woda destylowana 895 ml
3.4. Bufor blokujący (przeciwciała) (należy go przygotowywać na krótko przed wykorzystaniem)
10X PBS 10,0 ml
Poliwinylopirolidon-44000 (PVP-44) 2,0 g
10 % Tween 20 0,5 ml
Mleko w proszku 0,5 g
Woda destylowana uzupełnić do 100 ml
3.5. Roztwór substratu alkalicznej fosfatazy buforze fosforanowym, pH 9,8
Dietanoloamina 97 ml
Woda destylowana 800 ml
Mieszać i ustawić pH na 9,8 za pomocą stężonego roztworu HCl
Uzupełnić wodą destylowaną do 1 l.
Dodać 0,2 g MgCl2.
Rozpuścić po dwie tabletki substratu fosfatazy po 5 mg (Sigma) w 15 ml roztworu.
4. Bufory do testu DASI ELISA
4.1. Bufor powlekający, pH 9,6
Na2CO3 1,59 g
NaHCO3 2,93 g
Woda destylowana 1.000 ml
Rozpuścić składniki i sprawdzić pH.
4.2. 10 X bufor fosforanowy (PBS), pH 7,2-7,4
NaCl 80,0 g
NaH2PO4.2 H2O 4,0 g
Na2HPO4.12H2O 27,0 g
Woda destylowana 1.000 ml
4.3. PBS-Tween
10X PBS 50 ml
10 % Tween 20 5 ml
Woda destylowana 950 ml
4.4. Bufor substratowy, pH 9,8
Dietanoloamina 100 ml
Woda destylowana 900 ml
Mieszać i ustawić pH na 9,8 za pomocą stężonego roztworu HCl.
Dodatek 5
Określenie poziomu porażenia w testach IF i FISH
1. Policzyć średnią liczbę typowych komórek fluorescencyjnych przypadających na pole widzenia (c).
2. Obliczyć liczbę typowych komórek fluorescencyjnych przypadających na okienko szkiełka mikroskopu (C).
C = c ×~ S/s
gdzie S = pole powierzchni okienka szkiełka wielopunktowego;
oraz s = pole powierzchni obiektywu;
gdzie i = współczynnik pola (zależy od rodzaju okularu i zmienia się od 8 do 24);
K = współczynnik tubusa (1 lub 1,25);
G = powiększenie obiektywu (100x, 40x itd.).
3. Obliczyć liczbę typowych komórek fluorescencyjnych przypadających na ml zawieszonego osadu (N).
N = C ×~ 1 000/y ×~ F
gdzie y = objętość ponownie zawieszonego osadu w każdym okienku;
oraz F = współczynnik rozcieńczenia zawieszonego osadu.
Dodatek 6
Zatwierdzone protokoły PCR i odczynniki
Uwaga: Wstępne badanie powinno pozwolić na odtwarzalne wykrywanie od 103 do 104 komórek R. solanacearum przypadających na ml ekstraktu.
Wstępne badanie powinno wykazać również brak fałszywie pozytywnych wyników przy panelu wybranych szczepów bakteryjnych (patrz: dodatek 3).
1. Protokół PCR Seal et al. (1993)
1.1. Primery oligonukleotydowe
Primer przedni OLI-1 5'-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3'
Primer tylny Y-2 5'-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3'
Oczekiwany rozmiar amplikonu z R. solanacearum matrycy DNA = 288 bp
1.2. Mieszanina reakcji PCR
| Odczynnik | Ilość przypadająca na reakcję | Stężenie końcowe |
| Sterylna woda ultra czysta (UPW) | 17,65 Ęl | |
| 10X PCR bufor(1) (15 mM MgCl2) | 2,5 Ęl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| Mieszania dNTP (20mM) | 0,25 Ęl | 0,2 mM |
| Starter OLI-1 (20ĘM) | 1,25 Ęl | 1 ĘM |
| Starter Y-2 (20ĘM) | 1,25 Ęl | 1 ĘM |
| Polimeraza Taq (5U/Ęl) (1) | 0,1 Ęl | 0,5 U |
| Objętość próby | 2,0 Ęl | |
| Objętość całkowita | 25 Ęl | |
| (1) Metoda została zatwierdzona przy użyciu polimerazy Taq od Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL. | ||
1.3. Warunki reakcji PCR
Przeprowadzić następujący program:
| 1 cykl: | i) | 2 minuty w temperaturze 96 °‹C: (denaturacja matrycy DNA) |
| 35 cykli: | ii) | 20 sekund w temperaturze 94 °‹C(denaturacja matrycy DNA) |
| iii) | 20 sekund w temperaturze 68 °‹C (dołączanie primerów) | |
| iv) | 30 sekund w temperaturze 72 °‹C (wydłużanie kopii) | |
| 1 cykl: | v) | 10 minut w temperaturze 72 °‹C (końcowe wydłużanie) |
| vi) | trzymać w temperaturze 4 °‹C. |
Uwaga: Program ten został zoptymalizowany do stosowania z termocyklerem Perkin Elmer 9600. Przy używaniu z innymi modelami konieczna może okazać się zmiana czasu trwania etapów cykli ii), iii) oraz iv).
1.4. Analiza amplikonu przy użyciu enzymów restrykcyjnych
Produkty PCR namnożone z DNA R. solanacearum wytwarzają odmienny polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych z enzymem Ava II po inkubacji w temperaturze 37 °‹C.
2. Protokół PCR wg Pastrik i Maiss (2000)
2.1. Primery oligonukleotydowe
Primer przedni Ps-1 5'-agt cga acg gca gcg ggg g-3'
Primer tylny Ps-2 5'-ggg gat ttc aca tcg gtc ttg ca-3'
Oczekiwany rozmiar amplikonu z R. solanacearum matrycy DNA = 553 bp.
2.2. Mieszanina reakcji PCR
| Odczynnik | Ilość przypadająca na reakcję | Stężenie końcowe |
| Sterylna woda ultra czysta (UPW) | 16,025 Ęl | |
| 10X PCR bufor(1) | 2,5 Ęl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcja V) (10 %) | 0,25 Ęl | 0,1 % |
| Mieszania d-nTP (20mM) | 0,125 Ęl | 0,1 mM |
| Starter Ps-1 (10ĘM) | 0,5 Ęl | 0,2 ĘM |
| Starter Ps-2 (10ĘM) | 0,5 Ęl | 0,2 ĘM |
| Polimeraza Taq (5U/Ęl)(1) | 0,1 Ęl | 0,5 U |
| Objętość próby | 5,0 Ęl | |
| Objętość całkowita: | 25,0 Ęl | |
| (1) Metoda została zatwierdzona przy użyciu polimerazy Taq od Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL. | ||
| Uwaga: Pierwotnie zoptymalizowano dla termocyklera MJ Research PTC 200 z Gibco Taq Polymerase. Perkin Elmer AmpliTaq i bufor można również wykorzystać w tych samych stężeniach. | ||
2.3. Warunki reakcji PCR
Przeprowadzić następujący program:
| 1 cykl: | i) | 5 minuty w temperaturze 95 °‹C: (denaturacja matrycy DNA) |
| 35 cykli: | ii) | 30 sekund w temperaturze 95 °‹C (denaturacja matrycy DNA) |
| iii) | 30 sekund w temperaturze 68 °‹C (dołączanie primerów) | |
| iv) | 45 sekund w temperaturze 72 °‹C (wydłużanie kopii) | |
| 1 cykl: | v) | 5 minut w temperaturze 72 °‹C (końcowe wydłużanie) |
| vi) | trzymać w temperaturze 4 °‹C. |
Uwaga: Program ten został zoptymalizowany do stosowania z termocyklerem MJ Research PTC 200. Przy używaniu z innymi modelami konieczna może okazać się zmiana czasu trwania etapów cykli ii), iii) oraz iv).
2.4. Analiza amplikonu przy użyciu enzymów restrykcyjnych
Produkty PCR namnożone z DNA R. solanacearum wytwarzają odmienny polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych uzyskanych za pomocą enzymu Taq I po inkubacji w temperaturze 65 °‹C przez 30 minut. Fragmenty restrykcyjne uzyskane z R. solanacearum mają wielkość 457 bp oraz 96 bp.
3. Protokół testu multipleks PCR z kontrolą wewnętrzną PCR (Pastrik et al., 2002)
3.1. Primery oligonukleotydowe
Starter forward RS-1-F 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
Starter reverse RS-1-R 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
Starter forward NS-5-F 5'-AAC TTA AAG GAA TTG ACG GAA G-3'
Starter reverse NS-6-R 5'-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3'
Oczekiwany rozmiar amplikonu z R. solanacearum matrycy DNA = 718 bp (zestaw RS primer).
Oczekiwany rozmiar amplikonu z 18S rRNA z wewnętrzną kontrolą PCR = 310 bp (zestaw NS primer).
3.2. Mieszanina reakcji PCR
| Odczynnik | Ilość przypadająca na reakcję | Stężenie końcowe |
| Sterylna woda ultra czysta (UPW) | 12,625 Ęl | |
| 10X PCR bufor(1) (15 mM MgCl2) | 2,5 Ęl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcja V) (10 %) | 0,25 Ęl | 0,1 % |
| Mieszania d-nTP (20mM) | 0,125 Ęl | 0,1 mM |
| Starter RS-1-F(10ĘM) | 2,0 Ęl | 0,8 ĘM |
| Starter RS-1-R(10ĘM) | 2,0 Ęl | 0,8 ĘM |
| Starter NS-5-F (10ĘM)(2) | 0,15 Ęl | 0,06 ĘM |
| Starter NS-6-R (10ĘM)(2) | 0,15 Ęl | 0,06 ĘM |
| Polimeraza Taq (5U/Ęl)(1) | 0,2 Ęl | 1,0 U |
| Objętość próby | 5,0 Ęl | |
| Objętość całkowita | 25,0 Ęl | |
| (1) Metoda została zatwierdzona przy użyciu polimerazy Taq od Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL. | ||
| (2) Stężenie primerów NS-5-F oraz NS-6-R zoptymalizowano do ekstrakcji części przystolonowych przy pomocy metody homogenizacji i oczyszczania DNA według Pastrik (2000) (Patrz: sekcja VI.A.6,1.a). Ponowna optymalizacja stężeń odczynnika będzie wymagana, jeśli zostanie użyta metoda ekstrakcji przez wstrząsanie lub inna metoda izolacji DNA. | ||
3.3. Warunki reakcji PCR
Przeprowadzić następujący program:
| 1 cykl: | i) | 5 minuty w temperaturze 95 °‹C: (denaturacja matrycy DNA) |
| 35 cykli: | ii) | 30 sekund w temperaturze 95 °‹C (denaturacja matrycy DNA) |
| iii) | 30 sekund w temperaturze 58 °‹C (dołączanie primerów) | |
| iv) | 45 sekund w temperaturze 72 °‹C (wydłużanie kopii) | |
| 1 cykl: | v) | 5 minut w temperaturze 72 °‹C (końcowe wydłużanie) |
| vi) | trzymać w temperaturze 4 °‹C. |
Uwaga: Program ten został zoptymalizowany do stosowania z termocyklerem MJ Research PTC 200. Przy używaniu z innymi modelami, konieczna może okazać się zmiana czasu trwania etapów cykli ii), iii) oraz iv).
3.4. Analiza amplikonu przy użyciu enzymów restrykcyjnych
Produkty PCR namnożone z DNA R. solanacearum wytwarzają odmienny polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych z enzymem Bsm I lub Isoschizomere (np. Mva 1269 I) po inkubacji w temperaturze 65 °‹C przez 30 minut.
4. Protokół testu PCR specyficzny dla biowaru R. solanacearum (Pastrik et al., 2001)
4.1. Primery oligonukleotydowe
Starter forward Rs-1-F 5'-ACT AAC GAA GCA GAG ATG CAT TA-3'
Starter reverse Rs-1-R 5'-CCC AGT CAC GGC AGA GAC T-3'
Starter reverse Rs-3-R 5'-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3'
Oczekiwany rozmiar amplikonu z R. solanacearum matrycy DNA:
z Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp
z Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp.
4.2. Mieszanina reakcji PCR
a) Biowar 1/2 specyficzny dla PCR
| Odczynnik | Ilość przypadająca na reakcję | Stężenie końcowe |
| Sterylna woda ultra czysta (UPW) | 12,925 Ęl | |
| 10X PCR bufor(1) | 2,5 Ęl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcja V) (10 %) | 0,25 Ęl | 0,1 % |
| Mieszania d-NTP (20mM) | 0,125 Ęl | 0,1 mM |
| Starter Rs-1-F (10ĘM) | 2 Ęl | 0,8 ĘM |
| Starter Rs-1-R (10ĘM) | 2 Ęl | 0,8 ĘM |
| Polimeraza Taq (5U/Ęl)(1) | 0,2 Ęl | 1 U |
| Objętość próby | 5,0 Ęl | |
| Objętość całkowita: | 25,0 Ęl | |
| (1) Metoda została zatwierdzona przy użyciu polimerazy Taq z Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL. | ||
b) PCR specyficzny dla biowaru 3/4/5
| Odczynnik | Ilość przypadająca na reakcję | Stężenie końcowe |
| Sterylna woda ultra czysta (UPW) | 14,925 Ęl | |
| 10X PCR bufor(1) | 2,5 Ęl | 1X (1,5 mM MgCl2) |
| BSA (frakcja V) (10 %) | 0,25 Ęl | 0,1 % |
| Mieszania dNTP (20mM) | 0,125 Ęl | 0,1 mM |
| Starter Rs-1-F (10ĘM) | 1 Ęl | 0,4 ĘM |
| Starter Rs-3-R (10ĘM) | 1 Ęl | 0,4 ĘM |
| Polimeraza Taq (5U/Ęl) (1) | 0,2 Ęl | 1 U |
| Objętość próby | 5,0 Ęl | |
| Objętość całkowita | 25,0 Ęl | |
| (1) Metoda została zatwierdzona przy użyciu polimerazy Taq z Perkin Elmer (AmpliTaq) i Gibco BRL. | ||
4.3. Warunki reakcji PCR
Przeprowadzić następujący program dla reakcji specyficznej dla biowaru 1/2 i biowaru 3/4/5:
| 1 cykl: | i) | 5 minut w temperaturze 95 °‹C: (denaturacja matrycy DNA) |
| 35 cykli: | ii) | 30 sekund w temperaturze 95 °‹C(denaturacja matrycy DNA) |
| iii) | 30 sekund w temperaturze 58 °‹C (dołączanie primerów) | |
| iv) | 45 sekund w temperaturze 72 °‹C (wydłużanie kopii) | |
| 1 cykl: | v) | 5 minut w temperaturze 72 °‹C (końcowe wydłużanie) |
| vi) | trzymać w temperaturze 4 °‹C. |
Uwaga: Program ten został zoptymalizowany do stosowania z termocyklerem MJ Research PTC 200. Przy używaniu z innymi modelami, konieczna może okazać się zmiana czasu trwania etapów cykli ii), iii) oraz iv).
4.4. Analiza amplikonu przy użyciu enzymów restrykcyjnych
Produkty PCR namnożone z DNA R. solanacearum przy użyciu primerów Rs-1-F oraz Rs-1-R wytwarzają odmienny polimorfizm długości fragmentu z enzymem Bsm I lub Isoschizomere (np. Mva 1269 I) po inkubacji w temperaturze 65 °‹C przez 30 minut. Produkty PCR namnożone z DNA R. solanacearum przy pomocy primerów Rs-1-F oraz Rs-3-R nie posiadają miejsc restrykcji.
5. Przygotowanie buforu obciążającego
5.1. Błękit bromofenolowy (roztwór 10 %)
Błękit bromofenolowy 5 g
Woda destylowana (bidest) 50 ml
5.2 Bufor obciążający
Gliceryna (86 %) 3,5 ml
Błękit bromofenolowy (5,1) 300 Ęl
Woda destylowana (bidest) 6,2 ml
6. Bufor 10X Tris Acetate EDTA (TAE), pH 8.0
Bufor Tris 48,40 g
Kwas octowy lodowaty 11,42 ml
EDTA (sól dwusodowa) 3,72 g
Woda destylowana 1,00 l
Przed użyciem rozcieńczyć 1X.
Wszystkie dostępne w handlu (np. Invitrogen lub równoważne).
Dodatek 7
Zatwierdzone odczynniki do testu FISH
1. Sondy oligonukleotydowe
Sonda specyficzna dla R. solanacearum OLI-1-CY3: 5'-ggc agg tag caa gct acc ccc-3'
Sonda niespecyficzna eubakteryjna EUB-338-FITC: 5'-gct gcc tcc cgt agg agt-3'
2. Roztwór utrwalający
[UWAGA! UTRWALACZ ZAWIERA TOKSYCZNY PARAFORMALDEHYD. NALEŻY NOSIĆ RĘKAWICE I NIE WDYCHAĆ. ZALECA SIĘ PRACĘ W DYGESTORIUM]
i) Ogrzać 9 ml wody o stopniu molekularnym (np. Ultra czysta woda (UPW)) do około 60 °‹C i dodać 0,4 g paraformaldehydu. Paraformaldehyd rozpuszcza się po dodaniu 5 kropli 1N NaOH i wymieszaniu na mieszadle magnetycznym.
ii) Ustawić pH na 7,0 dodając 1 ml 0,1M buforu fosforanowego (PB; pH 7,0) i 5 kropli 1N HCl. Sprawdzić pH papierkiem lakmusowym i dostosować jeśli zachodzi taka potrzeba przy pomocy HCl lub NaOH. [UWAGA! NIE UŻYWAĆ PH-METRU W ROZTWORACH Z PARAFORMALEDHYDEM]
iii) Przefiltrować roztwór przez filtr membranowy 0,22 Ęm i przechowywać do czasu użycia w temperaturze 4 °‹C, zabezpieczywszy przed kurzem.
3. 3X Hybmix
NaCl 2,7 M
Tris-HCl 60 mM (pH 7,4)
EDTA (sterylizowany na filtrze i autoklawowany) 15 mM
W miarę potrzeby rozcieńczyć do 1X.
4. Roztwór do hybrydyzacji
1X Hybmix
Siarczan dodecylu sodu (SDS) 0,01 %
Formamid 30 %
Sonda EUB 338 5 ng/Ęl
Sonda OLI-1 lub OLI-2 5 ng/Ęl
Przygotować ilości roztworu do hybrydyzacji według obliczeń w tabeli 1. Dla każdego szkiełka (zawierającego 2 różne próby w powtórzeniu) wymagane jest 90 Ęl roztworu do hybrydyzacji. UWAGA: FORMAMID JEST BARDZO TOKSYCZNY, DLATEGO NALEŻY NOSIĆ RĘKAWICE I ZASTOSOWAĆ WŁAŚCIWE ŚRODKI BEZPIECZEŃSTWA!
Tabela 1 Sugerowane ilości przygotowania mieszaniny do hybrydyzacji
| Liczba szkiełek | 1 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| Sterylna woda ultra czysta (UPW) | 23,1 | 92,4 | 138,6 | 184,8 | 231,0 |
| 3x Hybmix | 30,0 | 120,0 | 180,0 | 240,0 | 300,0 |
| 1 % SDS | 0,9 | 3,6 | 5,4 | 7,2 | 9,0 |
| Formamid | 27,0 | 108,0 | 162,0 | 216,0 | 270,0 |
| Sonda EUB 338 (100 ng/Ęl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Sonda OLI-1 lub OLI-2 (100 ng/Ęl) | 4,5 | 18,0 | 27,0 | 36,0 | 45,0 |
| Całkowita objętość (Ęl) | 90,0 | 360,0 | 540,0 | 720,0 | 900,0 |
| Uwaga: Przechowywać wszystkie roztwory zawierające wrażliwe na światło sondy oligonukleotydowe w ciemności, w temperaturze - 20 °‹C. | |||||
| Chronić przed bezpośrednim padaniem promieni słonecznych lub światła elektrycznego. | |||||
5. 0,1M bufor fosforanowy, pH 7,0
Na2HPO4 8,52 g
KH2PO4 5,44 g
Woda destylowana 1,00 l
Rozpuścić składniki, sprawdzić wartość pH i wysterylizować przy użyciu autoklawu w temperaturze 121 °‹C przez 15 min.
Dodatek 8
Hodowla roślin oberżyny i pomidora
Wysiać nasiona pomidora (Lycopersicon esculentum) lub oberżyny (Solanum melongena) do pasteryzowanego kompostu stosowanego do nasion. Siewki z pełni rozwiniętymi liścieniami (od 10 do 14 dni) przesadzić do pasteryzowanego kompostu doniczkowego.
Przed inokulacją, rośliny oberżyny lub pomidorów powinno hodować się w szklarni w następujących warunkach środowiskowych:
Długość dnia: 14 godzin lub naturalna długość dnia, w przypadku dnia dłuższego
Temperatura: dzień: 21 do 24 °‹C,
noc: 14 do 18 °‹C.
Wrażliwa odmiana pomidora: »Moneymaker«
Wrażliwa odmiana oberżyny: »Black Beauty«
Dostawcy: patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main
LITERATURA
1. Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770.
2. Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the European Communities L235, 1-39.
3. Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. Labarre and B. Jouan. 1999. Design of division specific primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Journal of Plant Pathology 105; 373-380.
4. Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclonal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia solanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638.
5. Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: detection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hypersensitive response. Molecular Plant-Microbe Interactions 1:113-121.
6. Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Ralstonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO Bulletin 26; 663-678.
7. Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a semi-selective medium for the isolation and quantification of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, Australia.
8. Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 27; 265-277.
9. Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate metabolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Journal of Applied Bacteriology 69; 269-280.
10. Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. Detection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR technique. J. Phytopathology 146; 379-384.
11. Janse, J.D. (1988) A detection method for Pseudomonas solanacearum in symptomless potato tubers and some data on its sensitivity and specificity. Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351.
12. Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific classification of Pseudomonas solanacaerum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Microbiology 14; 335-345.
13. Kelman, A. 1954. The relationship of pathogenicity of Pseudomonas solanacearum to colony appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology 44; 693-695.
14. Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Budapest, 568 pp.
15. Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Blackwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp.
16. Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cubero, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enrichment improves selective isolation, serological and molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. pp. 117-121.
17. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic fingerprints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudomonas pathovars and strains generated with repetitive sequences and PCR. Applied and Environmental Microbiology, 60, 2286-2295.
18. Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopathology 85; 528-536.
19. Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Holloway, J.N. Timmis. 1997. A novel method for development of species and strain-specific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33.
20. Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection of R. solanacearum in potato tubers by polymerase chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626.
21. Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control. European Journal of Plant Pathology 108, 831-842.
22. Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibodies to Pseudomonas solanacearum, the causative agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immunology 7, 67-79.
23. Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. - 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp.
24. Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas pickettii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA sequencing: construction of oligonucleotide primers for sensitive detection by polymerase chain reaction. J. Gen. Microbiol. 139: 1587-1594.
25. Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbiology 61; 4262-4268.
26. Stead, D.E. 1992. Grouping of plant pathogenic and some other Pseudomonas spp. using cellular fatty-acid profiles. International Journal of Systematic Bacteriology 42; 281-295.
27. Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomonas syzygii, and the blood disease bacterium of banana based on 16S rRNA gene sequences. International Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15.
28. Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Genetic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecological Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49.
29. Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Ralstonia solanacearum strains using an automated and quantitative flourogenic 5' nuclease TaqMan assay. Applied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858.
30. Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Janse and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. solanacearum, which causes brown rot of potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554.
ZAŁĄCZNIK III
1. We wszystkich przypadkach podejrzenia wystąpienia organizmu, gdy uzyskano pozytywny wynik badania przesiewowego dla wyszczególnionego materiału roślinnego i dla innych przypadków, stosując właściwą metodę określoną w załączniku II, gdy oczekuje się na potwierdzenie lub wykluczenie wyniku po zakończeniu stosowanych badań, należy we właściwy sposób zachować i zabezpieczyć:
- wszystkie próby bulw oraz, gdy tylko jest to możliwe, wszystkie próby roślin,
- wszelkie pozostałe ekstrakty oraz przygotowany do badań przesiewowych materiał, np. szkiełka do immunofluorescencji, oraz
wszelkie stosowne dokumenty
- aż do zakończenia opisywanych badań.
Zatrzymanie bulw umożliwi wykonanie różnorodnych badań, w razie wystąpienia takiej potrzeby.
2. W przypadku potwierdzenia wystąpienia organizmu należy zachować i we właściwy sposób zabezpieczyć:
- materiał wyszczególniony w pkt. 1,
oraz
- próbę zainfekowanego materiału z pomidora lub oberżyny zainokulowanej ekstraktem z bulwy lub rośliny, tam gdzie stosowne, a także kulturę wyizolowanego organizmu.
- przez co najmniej jeden miesiąc po procedurze powiadomienia, zgodnie z art. 5 ust. 2.
ZAŁĄCZNIK IV
Elementy składające się na postępowanie, do których odnosi się art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt i) obejmują odpowiednio:
i) miejsca produkcji:
- gdzie są lub były uprawiane rośliny ziemniaka, które są klonalnie spokrewnione z roślinami ziemniaka porażonymi przez organizm,
- gdzie są lub były uprawiane rośliny pomidora, które pochodzą z tego samego źródła, co rośliny pomidora porażone przez organizm,
- gdzie są lub były uprawiane rośliny ziemniaka lub pomidora, które zostały objęte urzędową kontrolą w związku z podejrzeniem wystąpienia organizmu,
- gdzie są lub były uprawiane rośliny ziemniaka, które są klonalnie spokrewnione z roślinami ziemniaka rosnącymi w miejscach produkcji porażonych organizmem,
- gdzie są uprawiane rośliny ziemniaka lub pomidora, zlokalizowane w pobliżu porażonych miejsc produkcji, łącznie z takimi miejscami produkcji, w których wspólnie był lub jest, bezpośrednio lub pośrednio, użytkowany sprzęt lub urządzenia,
- w których stosuje się do nawadniania lub opryskiwania wody powierzchniowe ze źródła, o którym wiadomo lub podejrzewa się, że zostało skażone organizmem,
- w których wykorzystuje się te same wody powierzchniowe do nawadniania lub opryskiwania, co w porażonych lub podejrzanych o porażenie organizmem miejscach produkcji,
- które są lub były zalewane wodami powierzchniowymi, o których wiadomo, lub podejrzewa się, że zostały skażone organizmem;
oraz
ii) wody powierzchniowe, stosowane do nawadniania lub opryskiwania, lub takie wody, które zalewają pole(-a) lub miejsce(-a) produkcji, o których wiadomo, że zostały porażone organizmem.
ZAŁĄCZNIK V
1. Elementy brane pod uwagę w celu określenia zasięgu prawdopodobnego porażenia, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iii) oraz 5 ust. 1 lit. c) ppkt iii), obejmują:
- wyszczególniony materiał roślinny rosnący w miejscu produkcji, uznanym za porażone na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii),
- miejsce(-a) produkcji związane w jakikolwiek sposób z produkcją wyszczególnionego materiału roślinnego, uznanego za porażony, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), łącznie z tymi miejscami, w których wspólnie był lub jest, bezpośrednio lub pośrednio, użytkowany sprzęt lub urządzenia,
- wyszczególniony materiał roślinny, wytworzony w miejscu(-ach) produkcji, do których odnosi się poprzednie tiret, lub obecny w takim miejscu(ach) produkcji, w okresie, gdy wyszczególniony materiał roślinny, uznany za porażony na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), był obecny w miejscu produkcji, do którego odnosi się tiret pierwsze,
- miejsca, w których znajdował się wyszczególniony materiał roślinny, pochodzący z miejsc produkcji omawianych w powyższych tiret,
- wszelkie maszyny, urządzenia, sprzęt, pojazdy, pojemniki, magazyny, lub ich części, a także wszelkie inne przedmioty, łącznie z materiałami używanymi do pakowania, które mogły mieć kontakt z wyszczególnionym materiałem roślinnym uznanym za porażony, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii),
- cały wyszczególniony materiał roślinny, przechowywany, lub będący w kontakcie, z wszelkimi obiektami lub przedmiotami, wyszczególnionymi w poprzednim tiret, przed ich oczyszczeniem i zdezynfekowaniem,
- w wyniku postępowania i badań, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt i), w przypadku ziemniaka, bulwy lub rośliny pochodzące z tego samego rozmnożenia klonalnego (powiązane siostrzanie lub matecznie), a w przypadku pomidora, rośliny pochodzące z tego samego źródła, co wyszczególniony materiał roślinny, uznany za porażony na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), i w przypadku którego istnieje prawdopodobieństwo porażenia ze względu na pokrewieństwo klonalne, pomimo uzyskania negatywnych wyników badań. Celem identyfikacji porażonych i klonalnie spokrewnionych bulw lub roślin, można zastosować testowanie odmian,
- miejsce(-a) produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego, przedstawione w poprzednim tiret,
- miejsce(-a) produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego, w którym stosuje się do nawadniania lub opryskiwania wodę, która została uznana za skażoną, na mocy art. 5 ust. 1 lit. c) ppkt ii),
- wyszczególniony materiał roślinny, produkowany na polach zalewanych wodami powierzchniowymi, uznanymi za skażone.
2. Elementy brane pod uwagę w celu ustalenia zasięgu możliwego rozprzestrzeniania się organizmu, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iv) oraz art. 5 ust. 1 lit. c) ppkt iii) obejmują:
i) w przypadkach objętych art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iv):
- bliskość innych miejsc produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego,
- wspólną produkcję i używanie tego samego materiału wyjściowego sadzeniaka ziemniaka,
- miejsca produkcji, w których wykorzystuje się wody powierzchniowe do nawadniania lub opryskiwania wyszczególnionego materiału roślinnego, w przypadkach, gdy istnieje ryzyko, że wody te spłynęły, lub zalewały miejsca(-ch) produkcji, uznane za porażone na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) punkt ii).
ii) w przypadkach gdy wody powierzchniowe zostały uznane za skażone, na mocy art. 5 ust. 1 lit. c) ppkt ii):
- miejsce(-a) produkcji wyszczególnionego materiału roślinnego, sąsiadujące lub narażone na ryzyko zalania przez wody powierzchniowe uznane za skażone,
- dowolne, oddzielnie umiejscowione zbiorniki nawadniające, łączące się z wodą uznaną za skażoną,
- jakikolwiek odosobniony zbiornik irygacyjny połączony z wodami powierzchniowymi uznanymi za skażone, z uwzględnieniem:
- kierunku i natężenia przepływu wody uznanej za skażoną,
- obecności dzikich żywicielskich roślin z rodziny psiankowatych.
3. Informacje zawarte w powiadomieniu, wskazanym w art. 5 ust. 2, obejmują:
- natychmiast po potwierdzeniu obecności organizmu na podstawie badania laboratoryjnego, przy wykorzystaniu metod określonych w załączniku II, przynajmniej:
- dla ziemniaków:
a) nazwę odmiany dla każdej partii;
b) typ (sadzeniaki, ziemniaki inne niż sadzeniaki, itp.) oraz, tam, gdzie właściwe, kategorię dla sadzeniaków ziemniaka,
- dla roślin pomidorów - nazwę odmiany dla każdej partii oraz, tam gdzie właściwe, kategorię,
- bez uszczerbku dla wymogów odnośnie powiadamiania o podejrzewanym wystąpieniu w art. 4 ust. 3, państwo członkowskie, w którym potwierdzono występowanie, w sytuacji, w której istnieje ryzyko porażenia objętego wykazem materiału roślinnego z innego lub w innym państwie członkowskim, natychmiast przekaże zainteresowanemu państwu członkowskiemu informacje konieczne dla zapewnienia zgodności z art. 5 ust. 3, takie jak:
a) nazwa odmiany partii ziemniaka lub pomidora;
b) nazwa i adres wysyłającego i odbiorcy;
c) data dostawy partii ziemniaków lub pomidorów;
d) wielkość dostarczonej partii ziemniaków lub pomidorów;
e) kopia paszportu roślin lub przynajmniej jego numer, tam gdzie ma to zastosowanie, lub, tam gdzie ma to zastosowanie, numer rejestracyjny producenta lub handlowca i kopia dokumentu dostawczego.
Komisja zostanie natychmiast powiadomiona o dostarczeniu takich informacji.
4. Szczegółowe informacje zawarte w dodatkowym powiadomieniu, przedstawionym w art. 5 ust. 2 akapit drugi, obejmują:
po zakończeniu postępowania, dla każdego przypadku:
a) datę potwierdzenia porażenia;
b) krótki opis postępowania prowadzonego w celu określenia źródła i zasięgu możliwego rozprzestrzenienia się porażenia, łącznie z informacją o poziomie próbobrania;
c) informacje na temat rozpoznanych lub podejrzewanych źródeł(-a) porażenia;
d) szczegółowe informacje na temat określonego zasięgu porażenia, wraz z liczbą miejsc produkcji, a w przypadku ziemniaków liczbą partii ze wskazaniem odmiany oraz, w przypadku sadzeniaków, kategorii;
e) szczegółowe informacje na temat wyznaczonej strefy, wraz z liczbą miejsc produkcji, nieoznaczonych jako porażone, lecz znajdujących się w tej strefie;
f) szczegółowe informacje na temat wyznaczonych wód, wraz z nazwą i lokalizacją zbiornika wodnego i wyznaczonym zasięgiem/zakazem nawadniania;
g) w przypadku wszelkich przesyłek lub partii roślin pomidora uznanych za porażone - świadectwa zalecane w art. 13 ust. 1 ppkt ii) dyrektywy 2000/29/WE oraz numer paszportu, zgodnie z wykazem przedstawionym w załączniku V, część A sekcja I.2.2 do dyrektywy 2000/29/WE;
h) inne informacje dotyczące potwierdzonego przypadku wystąpienia, jakich może zażądać Komisja.
ZAŁĄCZNIK VI
1. Przepisy, o których mowa w art. 6 ust. 1, obejmują:
- zastosowanie jako pasza dla zwierząt po uprzedniej obróbce cieplnej, która zabezpieczy przed ryzykiem przeżycia organizmu,
lub
- złożenie na urzędowo zatwierdzonym specjalnym składowisku odpadów, gdzie nie istnieje możliwe do zidentyfikowania ryzyko przedostania się organizmu do środowiska np. poprzez przesączanie na użytki rolne lub kontakt ze źródłami wody, która mogłaby być wykorzystywana do nawadniania użytków rolnych,
lub
- spalenie,
lub
- przetwórstwo przemysłowe, poprzez bezpośrednie i natychmiastowe przesłanie do zakładu przetwórczego posiadającego urzędowo zaakceptowane urządzenia do utylizacji odpadów, dla których ustalono, że nie występuje możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzeniania się organizmu wraz z systemem oczyszczania i dezynfekcji przynajmniej pojazdów wyjeżdżających,
lub
- podjęcie innych środków, pod warunkiem, że nie niosą one ze sobą możliwego do zidentyfikowania ryzyka rozprzestrzeniania się organizmu; o tych środkach wraz z ich uzasadnieniem należy powiadamiać Komisję i pozostałe państwa członkowskie.
Jakiekolwiek pozostałe odpady powstałe w wyniku wyżej opisanych procedur należy usuwać za pomocą urzędowo zatwierdzonych metod zgodnie z załącznikiem VII do niniejszej dyrektywy.
2. Właściwe wykorzystanie lub składowanie wyszczególnionego materiału roślinnego, o którym mowa w art. 6 ust. 2, pod kontrolą właściwych organów urzędowych danego(-ych) państwa(-w) członkowskiego(-ich), przy zapewnieniu właściwej komunikacji pomiędzy tymi organami w celu utrzymania stałego poziomu kontroli oraz przy akceptacji właściwych organów państwa członkowskiego, w którym ziemniaki są pakowane lub przetwarzane, w związku z wymienionymi w pierwszym i drugim tiret urządzeniami do usuwania odpadów, obejmuje:
i) w stosunku do bulw ziemniaka:
- wykorzystanie ich jako ziemniaki inne niż sadzeniaki przeznaczone do konsumpcji, pakowane jako gotowe do bezpośredniej dostawy i zastosowania bez przepakowywania w miejscach, w których są urządzenia przeznaczone do usuwania odpadów. Ziemniaki przeznaczone do sadzenia można przetwarzać lub przechowywać w tym samym miejscu tylko wówczas, jeśli odbywa się to w oddzieleniu lub po oczyszczeniu i dezynfekcji,
lub
- wykorzystanie ich jako ziemniaki inne niż sadzeniaki, przeznaczone do przetwórstwa przemysłowego oraz przeznaczone do bezpośredniej i natychmiastowej dostawy do zakładu przetwórczego, wyposażonego w odpowiednie urządzenia do usuwania odpadów oraz system oczyszczania i dezynfekcji przynajmniej pojazdów wyjeżdżających,
lub
- inne sposoby wykorzystania lub usunięcia, pod warunkiem że ustalono, iż nie istnieje możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzeniania się organizmu i po uzyskaniu akceptacji właściwych organów urzędowych;
ii) w odniesieniu do innych części roślin, łącznie z łodygą oraz resztkami liści:
- zniszczenie,
lub
- inny sposób wykorzystania lub usunięcia, pod warunkiem że nie niesie on ze sobą możliwego do zidentyfikowania ryzyka rozprzestrzeniania się organizmu; oraz po uzyskaniu akceptacji wyżej wymienionych właściwych organów urzędowych.
3. Właściwymi metodami odkażania przedmiotów lub obiektów, określonych w art. 6 ust. 3, jest oczyszczanie oraz - w przypadkach uzasadnionych - dezynfekcja, tak aby nie powstało możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzeniania się organizmu. Metody te należy stosować pod nadzorem właściwych organów urzędowych państw członkowskich.
4. Szereg środków, które państwa członkowskie wprowadzą w wyznaczonej strefie(-ach), na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iv) oraz art. 5 ust. 1 lit. c) ppkt iii), określonych w art. 6 ust. 4, obejmuje:
4.1. W miejscach produkcji uznanych za porażone, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii):
a) na polu lub w miejscu uprawy pod osłonami, które na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii) zostało oznaczone jako porażone, albo:
i) w ciągu co najmniej czterech lat uprawy, następujących po stwierdzeniu porażenia,
- podjęte zostaną środki, prowadzące do wyeliminowania samosiewów ziemniaka oraz pomidora, a także innych roślin żywicielskich dla organizmu, łącznie z chwastami z rodziny psiankowatych,
oraz
- zakazuje się sadzenia:
- bulw, roślin i nasion ziemniaka,
- roślin i nasion pomidora,
- uwzględniając biologię organizmu,
- innych roślin żywicielskich,
- roślin z rodzaju Brassica, w stosunku do których istnieje zidentyfikowane ryzyko przetrwania tego organizmu.
- innych roślin, dla których istnieje możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzeniania się organizmu,
- w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora, następującym po okresie opisanym w poprzednim tiret, jeżeli sprawdzono w czasie urzędowych kontroli, że na polu nie ma ani samosiewów ziemniaka lub pomidora, ani innych roślin żywicielskich organizmu, łącznie z chwastami z rodziny psiankowatych, przez dwa kolejne lata uprawy przed sadzeniem,
- w przypadku ziemniaka zezwala się na produkcję jedynie ziemniaków innych niż sadzeniaki,
- w przypadku ziemniaka i pomidora, zebrane bulwy ziemniaka lub rośliny pomidora, w odpowiednich przypadkach są badane zgodnie z procedurą opisaną w załączniku II;
- w sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora, następującym bezpośrednio po sezonie, o którym mowa w poprzednim tiret, oraz po zastosowaniu właściwego zmianowania, które obejmuje co najmniej dwa lata, jeśli mają być uprawiane sadzeniaki ziemniaka, przeprowadza się urzędową kontrolę zgodnie z art. 2 ust. 1;
albo
ii) podczas pięciu lat uprawy następujących po stwierdzeniu porażenia:
- powinny być podejmowane działania, zmierzające do eliminacji samosiewów ziemniaka oraz pomidora i innych naturalnie występujących roślin żywicielskich organizmu, łącznie z chwastami z rodziny psiankowatych,
oraz
- pole w ciągu pierwszych trzech lat należy: albo pozostawić odłogiem, albo uprawiać na nim zboża w zależności od ocenionego stopnia ryzyka, albo przeznaczyć na stałe pastwisko stosując częste niskie koszenie lub intensywny wypas, albo przeznaczyć na produkcję nasienną traw, po czym przez kolejne dwa lata uprawiać tam rośliny niebędące żywicielami organizmu i niestwarzające możliwego do zidentyfikowania ryzyka przetrwania lub rozprzestrzeniania się tego organizmu,
- w pierwszym sezonie uprawy ziemniaka lub pomidora, następującym po okresie opisanym w poprzednim tiret, jeżeli sprawdzono w czasie urzędowych kontroli, że na polu nie ma ani samosiewów ziemniaka lub pomidora, ani innych roślin żywicielskich organizmu, łącznie z chwastami z rodziny psiankowatych, przez dwa kolejne lata uprawy przed sadzeniem:
- w przypadku ziemniaków dopuszcza się uprawę sadzeniaków ziemniaka lub innych ziemniaków,
- zbierane bulwy ziemniaka lub rośliny pomidora są badane zgodnie z procedurą opisaną w załączniku II;
b) na wszystkich pozostałych polach porażonego miejsca produkcji, pod warunkiem że właściwe organy urzędowe mają pewność, że wyeliminowane zostało ryzyko występowania samosiewów ziemniaków lub pomidorów i innych naturalnie występujących roślin żywicielskich organizmu łącznie z chwastami z rodziny psiankowatych:
- w roku uprawy następującym bezpośrednio po roku, w którym stwierdzono porażenie:
- nie uprawia się bulw, roślin ani nasion ziemniaka lub innych roślin żywicielskich organizmu,
lub
- w odniesieniu do bulw ziemniaka, sadzi się wyłącznie urzędowo kwalifikowane sadzeniaki ziemniaka, przeznaczone na ziemniaki inne niż sadzeniaki,
- w przypadku roślin pomidora mogą być uprawiane tylko rośliny pomidora uzyskane z nasion, które spełniają wymogi dyrektywy 2000/29/WE, z przeznaczeniem na produkcję owoców,
- w drugim roku uprawy następującym po roku, w którym stwierdzono porażenie:
- w odniesieniu do ziemniaków, można sadzić wyłącznie urzędowo kwalifikowane sadzeniaki ziemniaka lub ziemniaki urzędowo przebadane pod katem występowania organizmu, które były uprawiane pod kontrolą urzędową w miejscach produkcji inne niż te, o których mowa w pkt 4.1, z przeznaczeniem na sadzeniaki lub ziemniaki inne niż sadzeniaki,
- w przypadku pomidorów można sadzić wyłącznie rośliny uzyskane z nasion, które spełniają wymogi dyrektywy 2000/29/WE lub w przypadku roślin rozmnażanych wegetatywnie, z roślin uzyskanych z takich nasion i rosnących pod urzędową kontrolą w miejscach produkcji innych niż te, o których mowa w pkt 4.1, z przeznaczeniem na produkcję roślin lub owoców,
- przynajmniej przez trzeci rok uprawy następujący po roku w którym stwierdzono porażenie:
- w przypadku ziemniaków, można sadzić wyłącznie urzędowo kwalifikowane sadzeniaki ziemniaka lub ziemniaki, które były uprawiane pod urzędową kontrolą z urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka, z przeznaczeniem na sadzeniaki lub ziemniaki inne niż sadzeniaki,
- w przypadku pomidorów, można sadzić wyłącznie rośliny uzyskane z nasion spełniających wymogi dyrektywy 2000/29/WE lub rośliny uzyskane pod urzędową kontrolą z takich roślin, z przeznaczeniem na produkcję roślin lub owoców,
- w każdym roku uprawy, o którym mowa w poprzednich tiret, podejmuje się środki w celu wyeliminowania samosiewnych roślin ziemniaka i innych naturalnie występujących roślin żywicielskich organizmu jeśli zostanie stwierdzona ich obecność, oraz przeprowadza się urzędową kontrolę uprawy w odpowiednim czasie, a w przypadku każdego pola ziemniaków zebrane bulwy są badane zgodnie z procedurą opisaną w załączniku II;
c) niezwłocznie po stwierdzeniu porażenia, na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), a także po pierwszym kolejnym roku uprawy:
- wszelkie maszyny, urządzenia, sprzęt i miejsca przechowywania znajdujące się w miejscu produkcji oraz wykorzystywane do produkcji ziemniaka lub pomidora, są oczyszczone i w razie potrzeby, są poddawane dezynfekcji, przy użyciu właściwych metod, wyszczególnionych w ust. 3,
- urzędowe kontrole programów nawadniania i opryskiwania, łącznie z zakazem tych czynności, zostaną wprowadzone jako zabezpieczenie przed rozprzestrzenianiem się organizmu;
d) w miejscach uprawy pod osłonami uznanych za porażone na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt ii), w przypadkach, w których możliwa jest całkowita wymiana podłoża uprawowego:
- nie sadzi się bulw, roślin ani nasion ziemniaka, ani też nie uprawia się innych roślin żywicielskich organizmu, łącznie z roślinami i nasionami pomidora, dopóki dane miejsce nie zostanie poddane urzędowo uznanym środkom, prowadzącym do wyeliminowania organizmu i usunięcia pozostałości roślin żywicielskich, łącznie co najmniej z całkowitą wymianą podłoża uprawowego i oczyszczeniem, a w razie potrzeby, dezynfekcją tego miejsca oraz wszelkiego sprzętu, w wyniku czego właściwe organy urzędowe wyrażają zgodę na produkcję roślin ziemniaka lub pomidora,
oraz
- w przypadku produkcji ziemniaka odbywa się ona z wykorzystaniem urzędowo kwalifikowanego sadzeniaka ziemniaka, albo minibulw lub mikroroślin, pochodzących z przebadanych źródeł,
- w przypadku produkcji pomidorów odbywa się ona z wykorzystaniem roślin uzyskanych z nasion, które spełniają wymogi dyrektywy 2000/29/WE, lub w wypadku roślin rozmnażanych wegetatywnie z roślin pomidora uzyskanych z takich nasion i rosnących pod urzędową kontrolą,
- wprowadza się urzędowe kontrole programów nawadniania i opryskiwania, oraz - w razie potrzeby - ich zakaz, w celu zapobieżenia rozprzestrzenianiu się danego organizmu.
4.2. W obrębie wyznaczonej strefy, bez uszczerbku dla środków podjętych zgodnie z pkt 4.1, państwa członkowskie:
a) niezwłocznie po stwierdzeniu porażenia zapewniają oczyszczenie i dezynfekcję wszystkich maszyn, urządzeń, sprzętu i miejsc przechowywania związanych z produkcją ziemniaków lub pomidorów na takim terenie w odpowiedni sposób i przy użyciu właściwych metod zgodnie z pkt 3;
b) niezwłocznie i przez co najmniej trzy lata uprawy po stwierdzeniu porażenia:
ba) w przypadkach wyznaczenia strefy na mocy art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iv):
- zapewniają nadzór, sprawowany przez właściwe organy urzędowe, miejsc produkcji, magazynowania, przeładunku lub innych miejsc związanych z bulwami ziemniaka lub pomidorami, łącznie z miejscami w których wspólnie użytkowane są maszyny, urządzenia, sprzęt do produkcji ziemniaka lub pomidora,
- wymagają sadzenia jedynie urzędowo kwalifikowanych sadzeniaków ziemniaka lub ziemniaków, uprawianych pod urzędową kontrolą w stosunku do wszystkich ziemniaków uprawianych w tej strefie, a także badania po zbiorze sadzeniaków uprawianych w miejscach produkcji określonych zgodnie z art. 5 ust. 1 lit. a) ppkt iii) jako prawdopodobnie porażone,
- wymagają separowania czynności w jakikolwiek sposób związanych ze zbiorem, przechowywaniem, przemieszczaniem, pakowaniem zebranych sadzeniaków ziemniaka, od takich czynności wykonywanych przy ziemniakach innych niż sadzeniaki, na terenie wszystkich miejsc w obrębie strefy lub zapewnienia systemu oczyszczania i, gdzie to stosowne, dezynfekcji, pomiędzy sadzeniakami i ziemniakami innymi niż sadzeniaki,
- wymagają, aby uprawiane były jedynie rośliny pomidora uzyskane z nasion, które spełniają wymogi dyrektywy 2000/29/WE, lub w przypadku roślin rozmnażanych wegetatywnie z roślin uzyskanych z takich nasion i rosnących pod urzędową kontrolą, we wszystkich uprawach pomidorów w strefie,
- przeprowadzają urzędowe kontrole, jak szczegółowo określono w art. 2 ust. 1;
bb) w przypadkach uznania wód powierzchniowych za skażone na mocy art. 5 ust. 1 lit. c) ppkt ii) lub za drogę możliwego rozprzestrzeniania się organizmu, zgodnie z załącznikiem V pkt 2:
- prowadzą coroczną kontrolę we właściwym czasie, łącznie z pobraniem prób wód powierzchniowych oraz w odpowiednich przypadkach roślin żywicielskich z rodziny psiankowatych, rosnących w sąsiedztwie tych wód, oraz wykonują badania zgodnie z właściwymi metodami wymienionymi w załączniku II dla wyszczególnionego materiału roślinnego i w innych przypadkach,
- przeprowadzają urzędowe kontrole programów nawadniania i opryskiwania, łącznie z zakazem stosowania wody uznanej za skażoną do nawadniania lub opryskiwania wyszczególnionego materiału roślinnego, oraz w miarę potrzeb, innych roślin żywicielskich, dla zapobieżenia rozprzestrzeniania się organizmu. Zakaz można zweryfikować na podstawie wyników wspominanych wyżej corocznych kontroli, a uznanie skażenia może zostać zniesione, jeśli właściwe organy urzędowe uznają, że wody powierzchniowe nie są skażone. Użycie wody podlegającej zakazowi może być dozwolone, pod urzędowym nadzorem, dla nawadniania i opryskiwania roślin żywicielskich, przy wykorzystaniu urzędowo zatwierdzonych technik eliminowania organizmu i zapobiegania jego rozprzestrzenianiu,
- w przypadkach stwierdzenia skażenia odpadów płynnych należy wprowadzić kontrole urzędowe usuwania odpadów stałych lub płynnych powstałych podczas przetwórstwa przemysłowego lub z miejsc pakowania, związanych z wyszczególnionym materiałem roślinnym,
c) w miarę potrzeb ustanawiają program wymiany sadzeniaków ziemniaka w określonym czasie.
ZAŁĄCZNIK VII
Urzędowo zatwierdzone metody usuwania odpadów, określone w ust. 1 załącznika VI, są zgodne z następującymi przepisami, wykluczającymi możliwe do zidentyfikowania ryzyko rozprzestrzeniania się danego organizmu:
i) stałe odpady z przetwórstwa przemysłowego ziemniaka oraz pomidora (łącznie z odrzuconymi ziemniakami i pomidorami oraz z obierzynami ziemniaków) oraz wszelkie inne stałe odpady związane z ziemniakami lub pomidorami (w tym gleba, kamienie i inne resztki), powinny być utylizowane następująco:
- składowane na urzędowo zatwierdzonym specjalnym składowisku odpadów, gdzie nie istnieje możliwe do zidentyfikowania ryzyko przedostania się organizmu do środowiska, np. poprzez przesączanie na użytki rolne lub kontakt ze źródłami wody, która mogłaby być używana do ich nawadniania. Odpady należy przewieźć bezpośrednio na składowisko w warunkach wykluczających ryzyko ich rozniesienia się,
lub
- spalone,
lub
- usunięte za pomocą innych środków, pod warunkiem, że nie niosą one ze sobą możliwego do zidentyfikowania ryzyka rozprzestrzeniania się organizmu; Komisja i inne państwa członkowskie muszą być powiadomione o takich środkach;
ii) w odniesieniu do odpadów płynnych: przed ich utylizacją, odpady płynne zawierające zawieszone cząstki stałe należy poddać filtrowaniu lub procesowi osiadania w celu usunięcia tych cząstek. Cząstki te należy usuwać jak określono w ppkt i).
Następnie odpady płynne należy:
- podgrzewać w całej objętości do temperatury co najmniej 60 °‹C przez przynajmniej 30 minut przed ich usunięciem,
lub
- za zgodą odpowiednich władz i pod urzędową kontrolą usunąć w taki sposób, by nie zaistniało możliwe do zidentyfikowania ryzyko, że odpady te wejdą w kontakt z glebą użytków rolnych lub ze źródłami wody, która mogłaby być użyta do ich nawadniania. Komisja i pozostałe państwa członkowskie są powiadamiane szczegółowo o przeprowadzonych działaniach.
Opcje opisane w niniejszym załączniku stosuje się również w odniesieniu do odpadów powstałych podczas przetwarzania, przewożenia lub usuwania porażonych partii."