Rozporządzenie 440/2008 ustalające metody badań zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH)
Dz.U.UE.L.2008.142.1
Akt obowiązującyROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 440/2008
z dnia 30 maja 2008 r.
ustalające metody badań zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH)
(Tekst mający znaczenie dla EOG)
uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,
uwzględniając rozporządzenie (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 18 grudnia 2006 r. w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH), utworzenia Europejskiej Agencji Chemikaliów, zmieniające dyrektywę 1999/45/WE oraz uchylające rozporządzenie Rady (EWG) nr 793/93 i rozporządzenie Komisji (WE) nr 1488/94, jak również dyrektywę Rady 76/769/EWG i dyrektywy Komisji 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/WE i 2000/21/WE 1 , w szczególności jego art. 13 ust. 3,
(1) Zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1907/2006, jeżeli dla wygenerowania informacji o swoistych właściwościach substancji wymagane są badania, przeprowadza się je przy użyciu metod badań określonych na poziomie Wspólnoty.
(2) Dyrektywa Rady 67/548/EWG z dnia 27 czerwca 1967 r. w sprawie zbliżenia przepisów ustawodawczych, wykonawczych i administracyjnych odnoszących się do klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych 2 ustanawia w załączniku V metody określania właściwości fizyko-chemicznych, toksyczności oraz ekotoksyczności substancji i preparatów. Załącznik V do dyrektywy 67/548/EWG został skreślony dyrektywą 2006/121/WE Parlamentu Europejskiego i Rady ze skutkiem od dnia 1 czerwca 2008 r.
(3) Należy włączyć do niniejszego rozporządzenia metody badań zawarte w załączniku V do dyrektywy 67/548/EWG.
(4) Niniejsze rozporządzenie nie wyklucza stosowania innych metod badań, pod warunkiem że ich stosowanie jest zgodne z art. 13 ust. 3 rozporządzenia 1907/2006.
(5) Przy opracowywaniu metod badań należy w pełni uwzględnić zasady zastępowania badań na zwierzętach innymi metodami, ograniczania skali badań na zwierzętach i doskonalenia metod tego rodzaju badań, zwłaszcza jeśli dostępne są odpowiednie zatwierdzone metody zastępowania, ograniczania i doskonalenia badań na zwierzętach.
(6) Przepisy niniejszego rozporządzenia są zgodne z opinią Komitetu powołanego na mocy art. 133 rozporządzenia (WE) nr 1907/2006,
PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZĄDZENIE:
| W imieniu Komisji | |
| Stavros DIMAS | |
| Członek Komisji |
ZAŁĄCZNIK 3
Przed zastosowaniem którejkolwiek z poniższych metod badawczych w celu zbadania substancji wieloskładnikowej, substancji o nieznanym lub zmiennym składzie, złożonego produktu reakcji lub materiału biologicznego (UVCB), lub mieszaniny oraz w przypadkach, gdy zastosowanie metody badawczej do badania substancji wieloskładnikowej, UVCB lub mieszanin nie zostało określone w danej metodzie badawczej, należy rozważyć, czy dana metoda jest adekwatna do zamierzonego celu regulacyjnego.
Jeżeli daną metodę badawczą stosuje się do badania substancji wieloskładnikowej, UVCB lub mieszaniny, należy w miarę możliwości udostępnić wystarczające informacje na temat jej składu, np. nazwę chemiczną jej składników, ich ilości oraz istotne właściwości jej składników.
CZĘŚĆ 0
MIĘDZYNARODOWE METODY BADAŃ UZNANE ZA ODPOWIEDNIE DO GENEROWANIA INFORMACJI NA TEMAT SWOISTYCH WŁAŚCIWOŚCI SUBSTANCJI DO CELÓW ROZPORZĄDZENIA (WE) NR 1907/2006
MIĘDZYNARODOWE METODY BADAŃ UZNANE ZA ODPOWIEDNIE DO GENEROWANIA INFORMACJI NA TEMAT SWOISTYCH WŁAŚCIWOŚCI SUBSTANCJI DO CELÓW ROZPORZĄDZENIA (WE) NR 1907/2006
| Punkt końcowy | Metoda badania | Odpowiedni rozdział w części A niniejszego załącznika, zawierający pełny opis metody badania (numeracja w nawiasach oznacza, że pełny opis metody badania został usunięty z części A; puste pole: brak odpowiedniej metody badania w części A niniejszego załącznika) |
| Temperatura topnienia/ krzepnięcia | OECD Test Guideline 102: Melting Point/Melting Range (1995) | A.1. |
| Temperatura wrzenia | OECD Test Guideline 103: Boiling point (1995) | A.2. |
| Gęstość względna | OECD Test Guideline 109: Density of Liquids and Solids (2012) | (A.3.) |
| Ciśnienie pary | OECD Test Guideline 104: Vapour Pressure (2006) | (A.4.) |
| Napięcie powierzchniowe | OECD Test Guideline 115: Surface Tension of Aqueous Solutions (1995) | A.5. |
| Rozpuszczalność w wodzie | OECD Test Guideline 105: Water Solubility (1995) | A.6. |
| Współczynnik podziału n-oktanol/woda | OECD Test Guideline 107: Partition Coefficient (n-octanol/water): Shake-Flask Method (1995) | (A.8.) |
| OECD Test Guideline 123: Partition Coefficient (1-Octanol/Water): Slow-Stirring Method (2022) | A.23. | |
| OECD Test Guideline 117: Partition Coefficient (n-octanol/water): HPLC Method (2022) | A.24. | |
| Stała dysocjacji | OECD Test Guideline 112: Dissociation Constants in Water. (1981) | A.25. |
| Lepkość | OECD Test Guideline 114: Viscosity of Liquids (2012) | |
| Temperatura zapłonu | Test methods according to table 2.6.3 of Annex I, Part 2 of Regulation (EC) No 1272/2008 | |
| Dolna i górna granica wybuchowości | EN 1839:2017 - Determination of the explosion limits and the limiting oxygen concentration (LOC) for flammable gases and vapours | |
| Zapalność | Test methods according to section 2.2.4.1. of Annex I, Part 2 of Regulation (EC) No 1272/2008 | |
| Test L.2: sustained combustibility test, Part III, section 32 of the UN RTDG Manual of Tests and Criteria | ||
| Test N.1: test method for readily combustible solids, Part III, subsection 33.2.4 of the UN RTDG Manual of Tests and Criteria | ||
| Test N.5: test method for substances which in contact with water emit flammable gases, Part III, sub-section 33.5.4 of the UN RTDG Manual of Tests and Criteria | ||
| Temperatura samozapłonu (ciała stałe) | Test N.4: test method for self-heating substances, Part III, sub-section 33.4.6 of the UN RTDG Manual of Tests and Criteria | |
| EN 15188:2020 - Determination of the spontanous ignition behaviour of dust accumulations | ||
| Temperatura samozapłonu (ciecze i gazy) | ISO/IEC 80079-20-1:2017 - Explosive atmospheres - Part 20-1: Material characteristics for gas and vapour classification - Test methods and data | |
| Temperatura rozkładu | Test Series H, part II, section 28, of the UN RTDG Manual of Tests and Criteria | |
| Właściwości wybuchowe | Test methods according to Test series 1-3, Part I, sections 11-13 of the UN RTDG Manual of Tests and Criteria | |
| EU Test method A.14 Explosive Properties | A.14 | |
| Właściwości utleniające | Test method according to section 2.4.4. of Annex I, Part 2 of Regulation (EC) No 1272/2008 | |
| Test O.2: test for oxidizing liquids, Part III, sub-section 34.4.2 of the UN RTDG Manual of Tests and Criteria | ||
| Test O.1: Test for oxidizing solids, Part III, sub-section 34.4.1 of the UN RTDG Manual of Tests and Criteria | ||
| Test O.3 Gravimetric test for oxidizing solids, Part III, sub-section 34.4 3 of the UN RTDG Manual of Tests and Criteria | ||
| Właściwości piroforyczne | Test N.3: test method for pyrophoric liquids, Part III, sub-section 33.3.1.5 of the UN RTDG Manual of Tests and Criteria | |
| Test N.2: test method for pyrophoric solids, Part III, sub-section 33.3.1.4 of the UN RTDG Manual of Tests and Criteria | ||
| Granulometria/cechy charakterystyczne cząstek | EU test method A.22. Length Weighted Geometric Mean Diameter of Fibres | A.22. |
| ISO 13318 - Determination of Particle Size Distribution by Centrifugal Liquid Sedimentation Methods | ||
| ISO 21501 - Determination of Particle Size Distribution - Single Particle Light Interaction Methods | ||
| OECD Test Guideline 124: Determination of the Volume Specific Surface Area of Manufactured Nanomaterials (2022) | ||
| OECD Test Guideline 125: Particle Size and Particle Size Distribution of Nanomaterials (2022) | ||
| pH | OECD Test Guideline 122: Determination of pH, Acidity and Alkalinity (2013) | |
| Właściwości polimerów | OECD Test Guideline 118: Determination of the Number-Average Molecular Weight and the Molecular Weight Distribution of Polymers using Gel Permeation Chromatography (1996) | A.18. |
| OECD Test Guideline 119: Determination of the Low Molecular Weight Content of a Polymer Using Gel Permeation Chromatography (1996) | A.19. | |
| OECD Test Guideline 120: Solution/Extraction Behaviour of Polymers in Water (2000) | (A.20.) |
TABELA 2: METODY BADANIA WŁAŚCIWOŚCI TOKSYKOLOGICZNYCH
| Punkt końcowy | Metoda badania | Odpowiedni rozdział w części B niniejszego załącznika, zawierający pełny opis metody badania (numeracja w nawiasach oznacza, że rozdział zawierający pełny opis metody badania został usunięty z części B; puste pole: brak odpowiedniej metody badania UE w części B niniejszego załącznika) |
| Działanie żrące/draż- niące na skórę | In vitro: | |
| OECD Test Guideline 430: In vitro Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical Resistance Test Method (TER) (2015) | B.40. | |
| OECD Test Guideline 431: In vitro Skin Corrosion: Reconstructed Human Epidermis (RhE) Test Method (2019) | (B.40 bis.) | |
| OECD Test Guideline 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion (2015) | B.65. | |
| OECD Test Guideline 439: In vitro Skin Irritation: Reconstructed Human Epidermis Test Method (2021) | (B.46.) | |
| In vivo: | ||
| OECD Test Guideline 404: Acute Dermal Irritation/Corrosion (2015) | B.4. | |
| Poważne uszkodzenie oczu/dzia- łanie drażniące na oczy | In vitro: | |
| OECD Test Guideline 437: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage (2020) | (B.47.) | |
| OECD Test Guideline 438: Isolated Chicken Eye Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage (2018) | (B.48.) | |
| OECD Test Guideline 460: Fluorescein Leakage Test Method for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants (2017) | (B.61.) | |
| OECD Test Guideline 491: Short Time Exposure In Vitro Test Method for Identifying i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and ii) Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage (2020) | (B.68.) | |
| OECD Test Guideline 492: Reconstructed Human Cornea-Like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage (2019) | (B.69.) | |
| OECD Test Guideline 492B: Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RHCE) Test Method for Eye Hazard Identification (2022) | ||
| OECD Test Guideline 494: Vitrigel-Eye Irritancy Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage (2021) | ||
| OECD Test Guideline 496: In vitro Macromolecular Test Method for Identifying Chemicals Inducing Serious Eye Damage and Chemicals Not Requiring Classification for Eye Irritation or Serious Eye Damage (2019) | ||
| OECD Test Guideline 467: Defined Approaches for Serious Eye Damage and Eye Irritation (2022) | ||
| In vivo: | ||
| OECD Test Guideline 405: Acute Eye Irritation/Corrosion (2021) | (B.5.) | |
| Działanie uczulające na skórę | In vitro: | |
| OECD Test Guideline 442C: In Chemico Skin Sensitisation: Direct Peptide Reactivity Assay (DPRA) (2022) | (B.59.) | |
| OECD Test Guideline 442D: In Vitro Skin Sensitisation Assays Addressing the AOP Key Event on Keratinocyte Activation (2022) | (B.60.) | |
| OECD Test Guideline 442E: In Vitro Skin Sensitisation: In Vitro Skin Sensitisation Assays Addressing the Key Event on Activation of Dendritic Cells on the Adverse Outcome Pathway for Skin Sensitisation (2022) | (B.71.) | |
| OECD Test Guideline 497: Defined Approaches on Skin Sensitisation (2021) | ||
| In vivo: | ||
| OECD Test Guideline 429: Skin Sensitisation - Local Lymph Node Assay (2010) | B.42. | |
| OECD Test Guideline 442 A: Skin Sensitisation - Local Lymph Node Assay: DA (2010) | B.50. | |
| OECD Test Guideline 442B: Skin Sensitisation - Local Lymph Node Assay: BrdU-ELISA or -FCM (2018) | (B.51.) | |
| OECD Test Guideline 406: Skin Sensitisation Guinea Pig Maximisation Test and Buehler Test (2022) | (B.6.) | |
| Mutagenność | In vitro: | |
| OECD Test Guideline 471: Bacterial Reverse Mutation Test (2020) | (B.13./14.) | |
| OECD Test Guideline 476: In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test Using the Hprt and xprt Genes (2016) | (B.17.) | |
| OECD Test Guideline 490: In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Tests Using the Thymidine Kinase Gene (2016) | B.67. | |
| OECD Test Guideline 473: In vitro Mammalian Chromosome Aberration Test (2016) | B.10. | |
| OECD Test Guideline 487. In vitro Mammalian Cell Micronucleus Test (2016) | B.49. | |
| In vivo: | ||
| OECD Test Guideline 475: Mammalian Bone Marrow Chromosome Aberration Test (2016) | B.11. | |
| OECD Test Guideline 474: Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test (2016) | B.12. | |
| OECD Test Guideline 483: Mammalian Spermatogonial Chromosome Aberration Test (2016) | B.23. | |
| OECD Test Guideline 488: Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays (2022) | (B.58.) | |
| OECD Test Guideline 489: In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay (2016) | B.62. | |
| OECD Test Guideline 470: Mammalian Erythrocyte Pig-a Gene mutation Assay (2022) | ||
| Toksyczność ostra | Oral: | |
| OECD Test Guideline 420: Acute Oral Toxicity: Fixed Dose Procedure (2002) | B.1 bis. | |
| OECD Test Guideline 423: Acute Oral Toxicity: Acute Toxic Class Method (2002) | B.1 ter. | |
| OECD Test Guideline 425: Acute Oral Toxicity: Up-and-Down Procedure (2022) | ||
| Dermal: | ||
| OECD Test Guideline 402: Acute Dermal Toxicity - Fixed Dose Procedure (2017) | (B.3.) | |
| Inhalation: | ||
| OECD Test Guideline 403: Acute Inhalation Toxicity (2009) | B.2. | |
| OECD Test Guideline 436: Acute Inhalation Toxicity - Acute Toxic Class Method (2009) | B.52. | |
| OECD Test Guideline 433: Acute Inhalation Toxicity: Fixed Concentration Procedure (2018) | ||
| Toksyczność wywołana powtarzanym dawkowaniem | OECD Test Guideline 407: Repeated Dose 28-Day Oral Toxicity Study in Rodents (2008) | B.7. |
| OECD Test Guideline 412: Subacute Inhalation Toxicity: 28-Day Study (2018) | (B.8.) | |
| OECD Test Guideline 410: Repeated Dose Dermal Toxicity: 21/28-Day Study (1981) | B.9. | |
| OECD Test Guideline 422: Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Reproduction/Developmental Toxicity Screening Test (2016) | B.64. | |
| OECD Test Guideline 408: Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Rodents (2018) | (B.26.) | |
| OECD Test Guideline 409: Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Non-Rodents (1998) | B.27. | |
| OECD Test Guideline 413: Subchronic Inhalation Toxicity: 90-Day Study (2018) | (B.29.) | |
| OECD Test Guideline 411: Subchronic Dermal Toxicity: 90-Day Study (1981) | B.28. | |
| OECD Test Guideline 452: Chronic Toxicity Studies (2018) | (B.30.) | |
| OECD Test Guideline 453: Combined Chronic Toxicity/ Carcinogenicity Studies (2018) | (B.33.) | |
| Toksyczność reprodukcyjna/ rozwojowa | OECD Test Guideline 443: Extended One-Generation Reproduction Toxicity Study (2018) | (B.56.) |
| OECD Test Guideline 421: Reproduction/Developmental Toxicity Screening Test (2016) | B.63. | |
| OECD Test Guideline 422: Combined Repeated Dose Toxicity Study with the Reproduction/Developmental Toxicity Screening Test (2016) | B.64. | |
| OECD Test Guideline 414: Prenatal Developmental Toxicity Study (2018) | (B.31.) | |
| Toksykokinetyka | OECD Test Guideline 417: Toxicokinetics (2010) | B.36. |
| OECD Test Guideline 428: Skin Absorption: In Vitro Method (2004) | B.45. | |
| OECD Test Guideline 427: Skin Absorption: In Vivo Method (2004) | B.44. | |
| Rakotwórczość | OECD Test Guideline 451: Carcinogenicity Studies (2018) | (B.32.) |
| OECD Test Guideline 453: Combined Chronic Toxicity/ Carcinogenicity Studies (2018) | (B.33.) | |
| EU test method B.21. In Vitro Mammalian Cell Transformation Test | B.21. | |
| Neurotoksyczność (rozwojowa) | OECD Test Guideline 424: Neurotoxicity Study in Rodents (1997) | B.43. |
| OECD Test Guideline 426: Developmental Neurotoxicity Study (2007) | B.53. | |
| OECD Test Guideline 418: Delayed Neurotoxicity of Organophosphorus Substances Following Acute Exposure (1995) | B.37. | |
| OECD Test Guideline 419: Delayed Neurotoxicity of Organophosphorus Substances: 28-day Repeated Dose Study (1995) | B.38. | |
| Właściwości zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego | In vitro | |
| OECD Test Guideline 455: Performance-Based Test Guideline for Stably Transfected Transactivation In Vitro Assays to Detect Estrogen Receptor Agonists and Antagonistsals (2021) | (B.66.) | |
| OECD Test Guideline 456: H295R Steroidogenesis Assay (2022) | B.57. | |
| OECD Test Guideline 458: Stably Transfected Human Androgen Receptor Transcriptional Activation Assay for Detection of Androgenic Agonist and Antagonist Activity of Chemicals (2020) | ||
| OECD Test Guideline 493: Performance-Based Test Guideline for Human Recombinant Estrogen Receptor (hrER) In Vitro Assays to Detect Chemicals with ER Binding Affinity (2015) | B.70. | |
| In vivo | ||
| OECD Test Guideline 440: Uterotrophic Bioassay in Rodents A shortterm screening test for oestrogenic properties (2007) | B.54. | |
| OECD Test Guideline 441: Hershberger Bioassay in Rats, A Shortterm Screening Assay for (Anti)Androgenic Properties (2009) | B.55. | |
| Fototoksyczność | OECD Test Guideline 432: In Vitro 3T3 NRU Phototoxicity Test (2019) | (B.41.) |
| OECD Test Guideline 495: Ros (Reactive Oxygen Species) Assay for Photoreactivity (2019) | ||
| OECD Test Guideline 498: In Vitro Phototoxicity Test Method Using the Reconstructed Human Epidermis (RhE) (2021) | ||
TABELA 3: METODY BADANIA WŁAŚCIWOŚCI EKOTOKSYKOLOGICZNYCH
| Punkt końcowy | Metoda badania | Odpowiedni rozdział w części C niniejszego załącznika, zawierający pełny opis metody badania (numeracja w nawiasach oznacza, że rozdział zawierający pełny opis metody badania został usunięty z części C; puste pole: brak odpowiedniej metody badania UE w części C niniejszego załącznika) |
| Toksyczność dla organizmów wodnych | OECD Test Guideline 201: Freshwater Alga and Cyanobacteria, Growth Inhibition Test (2011) | C.3. |
| OECD Test Guideline 209: Activated Sludge, Respiration Inhibition Test (Carbon and Ammonium Oxidation) (2010) | C.11. | |
| OECD Test Guideline 224: Determination of the Inhibition of the Activity of Anaerobic Bacteria (2007) | C.34. | |
| OECD Test Guideline 244: Protozoan Activated Sludge Inhibition Test (2017) | ||
| OECD Test Guideline 221: Lemna sp. Growth Inhibition Test (2006) | C.26. | |
| OECD Test Guideline 202: Daphnia sp. Acute Immobilisation Test (2004) | C.2. | |
| OECD Test Guideline 211: Daphnia magna Reproduction Test (2012) | C.20. | |
| OECD Test Guideline 203: Fish, Acute Toxicity Test (2019) | (C.1.) | |
| OECD Test Guideline 210: Fish, Early-life Stage Toxicity Test (2013) | C.47. | |
| OECD Test Guideline 215: Fish, Juvenile Growth Test (2000) | C.14. | |
| OECD Test Guideline 236: Fish Embryo Acute Toxicity (FET) Test (2013) | C.49. | |
| OECD Test Guideline 249: Fish Cell Line Acute Toxicity - the RTgill-W1 Cell Line Assay (2021) | ||
| OECD Test Guideline 242: Potamopyrgus antipodarum Reproduction Test (2016) | ||
| OECD Test Guideline 243: Lymnaea stagnalis Reproduction Test (2016) | ||
| Rozkład | OECD Test Guideline 111: Hydrolysis as a Function of pH (2004) | C.7. |
| OECD Test Guideline 301: Ready Biodegradability (1992) | C.4. | |
| OECD Test Guideline 302 A: Inherent Biodegradability: Modified SCAS Test (1981) | C.12. | |
| OECD Test Guideline 302B: Inherent Biodegradability: Zahn- Wellens/EMPA Test (1992) | (C.9.) | |
| OECD Test Guideline 302C: Inherent Biodegradability: Modified MITI Test (II) (2009) | ||
| OECD Test Guideline 303: Simulation Test - Aerobic Sewage Treatment - A: Activated Sludge Units; B: Biofilms (2001) | C.10. | |
| OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (1981) | ||
| OECD Test Guideline 306: Biodegradability in Seawater (1992) | C.42. | |
| OECD Test Guideline 307: Aerobic and Anaerobic Transformation in Soil (2002) | C.23. | |
| OECD Test Guideline 308: Aerobic and Anaerobic Transformation in Aquatic Sediment Systems (2002) | C.24. | |
| OECD Test Guideline 309: Aerobic Mineralisation in Surface Water - Simulation Biodegradation Test (2004) | C.25. | |
| OECD Test Guideline 310: Ready Biodegradability - CO2 in sealed vessels (Headspace Test) (2014) | C.29. | |
| OECD Test Guideline 311: Anaerobic Biodegradability of Organic Compounds in Digested Sludge: by Measurement of Gas Production (2006) | C.43. | |
| OECD Test Guideline 314: Simulation Tests to Assess the Biodegradability of Chemicals Discharged in Wastewater (2008) | ||
| OECD Test Guideline 316: Phototransformation of Chemicals in Water - Direct Photolysis (2008) | ||
| EU test method C.5. Degradation - Biochemical Oxygen Demand | C.5. | |
| EU test method C.6. Degradation - Chemical Oxygen Demand | C.6. | |
| Losy i zachowanie w środowisku | OECD Test Guideline 305: Bioaccumulation in Fish: Aqueous and Dietary Exposure (2012) | C.13. |
| OECD Test Guideline 315: Bioaccumulation in Sediment-Dwelling Benthic Oligochaetes (2008) | C.46. | |
| OECD Test Guideline 317: Bioaccumulation in Terrestrial Oligochaetes (2010) | C.30. | |
| OECD Test Guideline 318: Dispersion Stability of Nanomaterials in Simulated Environmental Media (2017) | ||
| OECD Test Guideline 121: Estimation of the Adsorption Coefficient (Koc) on Soil and on Sewage Sludge using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) (2001) | C.19. | |
| OECD Test Guideline 106: Adsorption - Desorption Using a Batch Equilibrium Method (2000) | C.18. | |
| OECD Test Guideline 312: Leaching in Soil Columns (2004) | C.44. | |
| OECD Test Guideline 313: Estimation of Emissions from Preservative - Treated Wood to the Environment (2007) | C.45. | |
| OECD Test Guideline 319 A: Determination of In Vitro Intrinsic Clearance Using Cryopreserved Rainbow Trout Hepatocytes (RT-HEP) (2018) | ||
| OECD Test Guideline 319B: Determination of In Vitro Intrinsic Clearance Using Rainbow Trout Liver S9 Sub-Cellular Fraction (RT-S9) (2018) | ||
| OECD Test Guideline 320: Anaerobic Transformation of Chemicals in Liquid Manure (2022) | ||
| Skutki działania na organizmy lądowe | OECD Test Guideline 216: Soil Microorganisms: Nitrogen Transformation Test (2000) | C.21. |
| OECD Test Guideline 217: Soil Microorganisms: Carbon Transformation Test (2000) | C.22. | |
| OECD Test Guideline 207: Earthworm, Acute Toxicity Tests (1984) | C.8. | |
| OECD Test Guideline 222: Earthworm Reproduction Test (Eisenia fetida/Eisenia andrei) (2016) | (C.33.) | |
| OECD Test Guideline 220: Enchytraeid Reproduction Test (2016) | (C.32.) | |
| OECD Test Guideline 226: Predatory Mite (Hypoaspis (Geolaelaps) aculeifer) Reproduction Test in Soil (2016) | (C.36.) | |
| OECD Test Guideline 232: Collembolan Reproduction Test in Soil (2016) | (C.39.) | |
| OECD Test Guideline 208: Terrestrial Plant Test: Seedling Emergence and Seedling Growth Test (2006) | C.31. | |
| OECD Test Guideline 227: Terrestrial Plant Test: Vegetative Vigour Test (2006) | ||
| Skutki działania na organizmy osadowe | OECD Test Guideline 218: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Sediment (2004) | C.27. |
| OECD Test Guideline 219: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Water (2004) | C.28. | |
| OECD Test Guideline 233: Sediment-Water Chironomid Life-Cycle Toxicity Test Using Spiked Water or Spiked Sediment (2010) | C.40. | |
| OECD Test Guideline 235: Chironomus sp., Acute Immobilisation Test (2011) | ||
| OECD Test Guideline 225: Sediment-Water Lumbriculus Toxicity Test Using Spiked Sediment (2007) | C.35. | |
| OECD Test Guideline 238: Sediment-Free Myriophyllum Spicatum Toxicity Test (2014) | C.50. | |
| OECD Test Guideline 239: Water-Sediment Myriophyllum Spicatum Toxicity Test (2014) | C.51. | |
| Skutki działania na ptaki | OECD Test Guideline 205: Avian Dietary Toxicity Test (1984) | |
| OECD Test Guideline 206: Avian Reproduction Test (1984) | ||
| OECD Test Guideline 223: Avian Acute Oral Toxicity Test (2016) | ||
| Skutki działania na owady | OECD Test Guideline 213: Honeybees, Acute Oral Toxicity Test (1998) | C.16. |
| OECD Test Guideline 214: Honeybees, Acute Contact Toxicity Test (1998) | C.17. | |
| OECD Test Guideline 237: Honey Bee (Apis Mellifera) Larval Toxicity Test, Single Exposure (2013) | ||
| OECD Test Guideline 245: Honey Bee (Apis Mellifera L.), Chronic Oral Toxicity Test (10-Day Feeding) (2017) | ||
| OECD Test Guideline 246: Bumblebee, Acute Contact Toxicity Test (2017) | ||
| OECD Test Guideline 247: Bumblebee, Acute Oral Toxicity Test (2017) | ||
| OECD Test Guideline 228: Determination of Developmental Toxicity to Dipteran Dung Flies (Scathophaga stercoraria L. (Scathophagidae), Musca autumnalis De Geer (Muscidae)) (2016) | ||
| Właściwości zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego | OECD Test Guideline 230: 21-Day Fish Assay (2009) | C.37. |
| OECD Test Guideline 229: Fish Short Term Reproduction Assay (2012) | C.48. | |
| OECD Test Guideline 231: Amphibian Metamorphosis Assay (2009) | C.38. | |
| OECD Test Guideline 234: Fish Sexual Development Test (2011) | C.41. | |
| OECD Test Guideline 240: Medaka Extended OneGeneration Reproduction Test (MEOGRT) (2015) | C.52. | |
| OECD Test Guideline 241: The Larval Amphibian Growth and Development Assay (LAGDA) (2015) | C.53." | |
| OECD Test Guideline 248: Xenopus Eleutheroembryonic Thyroid Assay (XETA) (2019) | ||
| OECD Test Guideline 250: EASZY assay - Detection of Endocrine Active Substances, Acting Through Estrogen Receptors, Using Transgenic tg(cyp19a1b:GFP) Zebrafish embrYos (2021)' | ||
| OECD Test Guideline 251: Rapid Androgen Disruption Activity Reporter (RADAR) Assay (2022) |
CZĘŚĆ A: METODY USTALANIA WŁAŚCIWOŚCI FIZYKO-CHEMICZNYCH
A.1. TEMPERATURA TOPNIENIA/KRZEPNIĘCIA
1. METODA
Większość opisanych metod oparto na wytycznych OECD dotyczących badań (1). Podstawowe zasady podano w pozycjach bibliograficznych (2) i (3).
1.1. WPROWADZENIE
Opisane metody i urządzenia powinny być stosowane do ustalania temperatury topnienia substancji, bez ograniczeń związanych z ich stopniem czystości.
Wybór metody zależy od charakteru badanej substancji. W konsekwencji, czynnikiem ograniczającym będzie to, czy substancja łatwo, z trudnością czy też wcale nie poddaje się sproszkowaniu.
W przypadku niektórych substancji bardziej właściwe jest oznaczanie temperatury zamarzania lub krzepnięcia, przy czym w wytycznych uwzględniono także normy dla tych oznaczeń.
Jeżeli z powodu szczególnych właściwości substancji żaden z powyższych parametrów nie może być zmierzony w sposób konwencjonalny, może być stosowne określenie temperatury płynięcia.
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI
Temperaturę topnienia definiuje się jako temperaturę, w której przejście fazowe ze stanu stałego do stanu ciekłego zachodzi pod ciśnieniem atmosferycznym i niniejsza temperatura idealnie odpowiada temperaturze krzepnięcia.
Ponieważ przechodzenie z jednego stanu skupienia do drugiego w przypadku wielu substancji zachodzi w szerokim zakresie temperatury, często opisuje się go jako zakres temperatury topnienia.
Jednostki konwersji (ze stopni K na oC)
t = T - 273,15
t: temperatura Celsjusza, stopień Celsjusza (oC)
T: temperatura termodynamiczna, stopień Kelwina (K)
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Nie ma konieczności stosowania substancji odniesienia za każdym razem, gdy przeprowadzane są badania nowej substancji. Powinny one służyć głównie sprawdzeniu od czasu do czasu wydajności metody i pozwolić na porównanie wyników z innymi metodami.
Niektóre substancje kalibracyjne wymieniono w pozycji bibliograficznej (4).
1.4. ZASADA METODY BADANIA
Temperatura (zakres temperatur) przejścia fazowego ze stanu stałego do stanu ciekłego lub ze stanu ciekłego w stan stały jest ustalona. W praktyce podczas podgrzewania/schładzania próbki substancji badanej pod ciśnieniem atmosferycznym ustalane są temperatury etapu początkowego topnienia/krzepnięcia i końcowego etapu topnienia/krzepnięcia. Opisano pięć rodzajów metod, mianowicie metodę kapilarną, metody ze stolikami grzewczymi, ustalanie temperatur krzepnięcia, metody analiz termicznych, i ustalanie temperatury płynięcia (według rozwiniętych opracowań dla olejów naftowych).
W niektórych przypadkach wygodniejsze jest zmierzenie temperatury krzepnięcia w miejsce temperatury topnienia.
1.4.1. Metoda kapilarna
1.4.1.1. Przyrządy do oznaczania temperatury topnienia z łaźnią cieczową
Niewielką ilość drobno zmielonej substancji umieszcza się w rurce kapilarnej i ciasno upakowuje. Rurkę podgrzewa się łącznie z termometrem, regulując wzrost temperatury w ten sposób, aby wynosił mniej niż 1 K/min w trakcie topnienia. Oznacza się początkową i końcową temperaturę topnienia.
1.4.1.2. Przyrządy do oznaczania temperatury topnienia z blokiem metalu
Zgodnie z opisem w ppkt 1.4.1.1, z tym że rurka kapilarna i termometr są umieszczone w podgrzewanym bloku metalu, przy czym można je obserwować przez znajdujące się w nim otwory.
1.4.1.3. Wykrywanie przy pomocy komórki fotoelektrycznej
Próbka w rurce kapilarnej jest automatycznie podgrzewana w cylindrze metalowym. Wiązka światła jest automatycznie kierowana przez substancję, poprzez dziurę w cylindrze, do precyzyjnie skalibrowanej komórki fotoelektrycznej. Właściwości optyczne większości substancji zmieniają się z nieprzezroczystych na przezroczyste podczas topnienia. Natężenie światła docierającego do komórki fotoelektrycznej zwiększa się, w wyniku czego wysyłany jest sygnał zatrzymania do cyfrowego wskaźnika odczytującego temperaturę z platynowego termometru oporowego umieszczonego w komorze grzejnej. Metoda ta nie ma zastosowania do niektórych intensywnie zabarwionych substancji.
1.4.2. Płyty grzewcze
1.4.2.1. Płyta grzewcza Koflera
W metodzie płyty grzewczej Koflera wykorzystuje się dwa kawałki metalu o różnym przewodnictwie cieplnym, podgrzewane elektrycznie, przy czym stolik jest zaprojektowany w taki sposób, aby gradient temperatury był prawie liniowy wzdłuż jego długości. Temperatura rozgrzanej płyty może dochodzić od 283 do 573 K, przy czym odczytywana jest ona przy pomocy specjalnego urządzenia do odczytywania temperatury, składającego się z suwaka ze wskaźnikiem i klapki przeznaczonej dla odpowiedniego stolika. W celu ustalenia temperatury topnienia, substancję umieszcza się cienką warstwą bezpośrednio na powierzchni gorącej płyty. W ciągu kilku sekund pokazuje się ostra linia oddzielająca ciecz od fazy stałej. Temperaturę na wysokości linii dzielącej odczytuje się przez ustawienie wskaźnika w taki sposób, aby spoczywał na tej linii.
1.4.2.2. Mikroskop do badania topnienia
Szereg mikroskopowych płyt grzewczych wykorzystuje się do ustalania temperatury przy użyciu bardzo małych ilości materiału. W większości płyt grzewczych temperaturę mierzy się przy pomocy czułego termoogniwa, jednak czasem wykorzystywane są także termometry rtęciowe. Typowy przyrząd mikroskopowy do oznaczania temperatury topnienia metodą podgrzewania płyty jest wyposażony w komorę grzewczą, która zawiera płytkę metalową, na której umieszczana jest próbka na szkiełku. W środku płytki metalowej znajduje się otwór, przez którą wchodzi światło z lusterka oświetlającego mikroskopu. W trakcie użycia, komora jest zamknięta przez szklaną płytę w celu odcięcia powietrza od obszaru próbki.
Podgrzewanie próbki jest regulowane za pomocą reostatu. Dla bardzo precyzyjnych pomiarów dla substancji optycznie anizotropowych, stosuje się światło spolaryzowane.
1.4.2.3. Metoda menisku
Metodę tę wykorzystuje się głównie w odniesieniu do poliamidów.
W sposób wizualny oznacza się temperaturę, przy której zachodzi przemieszczenie menisku oleju silikonowego, zawartego między płytą grzewczą i szklaną przykrywką opartą na próbce badanego poliamidu.
1.4.3. Metoda oznaczania temperatury krzepnięcia
Próbkę umieszcza się w specjalnej probówce i umieszcza w przyrządzie dla oznaczania temperatury krzepnięcia. Próbka jest delikatnie i ciągle mieszana w trakcie chłodzenia, a temperatura jest mierzona w odpowiednich przedziałach. Gdy tylko temperatura pozostaje na stałym poziomie podczas kilku kolejnych odczytów (skorygowanych o błąd termometru), zapisuje się ją jako temperaturę krzepnięcia.
Należy zapobiegać szybkiemu schładzaniu przez utrzymywanie równowagi między fazą stałą i fazą ciekłą.
1.4.4. Analiza termiczna
1.4.4.1. Różnicowa analiza termiczna (DTA)
Niniejsza technika rejestruje różnicę w temperaturach między daną substancją i materiałem odniesienia w funkcji temperatury, w trakcie poddawania danej substancji i materiału odniesienia temu samemu programowi kontrolowania temperatury. W momencie gdy próbka ulega przemianie pociągającej zmianę entalpii, zmiana ta jest wskazywana przez odchylenie endotermiczne (topnienie) lub egzotermiczne (krzepnięcie) od linii bazowej zapisu temperatury.
1.4.4.2. Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC)
Niniejsza technika rejestruje różnicę w energii pobranej przez daną substancję i materiał odniesienia, w funkcji temperatury, w trakcie poddawania danej substancji i materiału odniesienia temu samemu programowi kontrolowania temperatury. Niniejsza energia jest energią konieczną do osiągnięcia zerowej różnicy temperatury między daną substancją a materiałem odniesienia. W momencie, gdy próbka ulega przemianie pociągającej zmianę entalpii, zmiana ta jest wskazywana przez odchylenie endotermiczne (topnienie) lub egzotermiczne (krzepnięcie) od linii bazowej zapisu przepływu ciepła.
1.4.5. Temperatura płynięcia
Niniejsza metoda została opracowana dla olejów naftowych i jest właściwa do zastosowania dla substancji olejowych o niskich temperaturach topnienia.
Po ogrzaniu wstępnym próbka jest chłodzona z właściwą szybkością i badane są w odstępach co 3 K charakterystyki przepływu. Najniższa temperatura, przy której jest obserwowany ruch substancji, jest odczytywana jako temperatura płynięcia.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCI
Stosowalność i dokładność różnych metod wykorzystywanych do oznaczania temperatury topnienia/zakres temperatur topnienia przedstawiono w poniższej tabeli:
TABELA: STOSOWALNOŚĆ METOD
A. Metody kapilarne
| Metoda pomiaru | Substancje łatwo proszkowalne | Substancje trudno proszkowalne | Zakres temperatury | Założona dokładność(1) | Istniejąca norma |
| Przyrządy do pomiaru temperatury topnienia z łaźnią cieczową | tak | Tylko niektóre | 273 do 573 K | ± 0,3 K | JIS K 0064 |
| Przyrządy do pomiaru temperatury topnienia z blokiem metalu | tak | Tylko niektóre | 293 do > 573 K | ± 0,5 K | ISO 1218 (E) |
| Wykrywanie przy pomocy komórki fotoelektrycznej | tak | Poszczególne z zastosowaniem urządzeń | 253 do 573 K | ± 0,5 K |
| (1) W zależności od typu przyrządu i stopnia czystości substancji. |
B. Metody temperaturowe i schładzania
| Metoda pomiaru | Substancje łatwo proszkowalne | Substancje trudno proszkowalne | Zakres temperatury | Założona dokładność(1) | Istniejąca norma |
| Płyta grzewcza Koflera | tak | nie | 283 do > 573 K | ±1K | ANSI/ASTM D 3451-76 |
| Mikroskop do badania topnienia | tak | Tylko niektóre | 273 do > 573 K | ±0,5K | DIN 53736 |
| Metoda menisku | nie | Specyficzna dla poliamidów | 293 do > 573 K | ±0,5K | ISO 1218 (E) |
| Metody badania temperatur krzepnięcia | tak | tak | 223 do 573 K | ±0,5K | e.g. BS 4695 |
| (1) W zależności od typu przyrządu i stopnia czystości substancji. |
C. Analizy termiczne
| Metoda pomiaru | Substancje łatwo proszkoalne | Substancje trudno proszkowalne | Zakres temperatury | Założona dokładnoś(1) | Istniejąca norma |
| Różnicowa analiza termiczna | tak | tak | 173 do 1.273 K | do 600 K ± 0,5 K do 1273K ±2,0K | ASTM E 537-76 |
| Rożnicowa kalorymetria skaningowa | tak | tak | 173 do 1.273 K | do 600 K ± 0,5 K do1.273 K ±2,0K | ASTM E 537-76 |
| (1) W zależności od typu przyrządu stopnia czystości substancji. |
D. Temperatura płynięcia
| Metoda pomiaru | Substancje latwo proszkowalne | Substancje trudno proszkowalne | Zakres temperatury | Założona dokładnoś(1) | Istniejąca norma |
| Temperatura płynięcia | Dla olejów naftowych i substancji oleistych | Dla olejów naftowych i substancji oleistych | 223 do 323 K | ±0,3K | ASTM D 97-66 |
| (1) W zależności od typu przyrządu i stopnia czystości substancji. |
1.6. OPIS METOD
Procedury przeprowadzenia oznaczeń według prawie wszystkich metod opisano w normach międzynarodowych i krajowych (zob. dodatek 1).
1.6.1. Metody z wykorzystaniem rurki kapilarnej
Drobno sproszkowane substancje poddawane powolnemu wzrostowi temperatury, zwykle wykazują etapy topnienia przedstawione na rys. 1.
Rysunek 1
1.6.1.1. Przyrząd do badania temperatury topnienia z łaźnią cieczową
Na rysunku 2 przedstawiono rodzaj znormalizowanego przyrządu do badania temperatury topnienia wykonanego ze szkła (JTS K 0064); wszystkie wymiary podano w milimetrach.
Rysunek 2
Łaźnia cieczowa:
Należy wybrać odpowiednią ciecz. Wybór cieczy zależy od temperatury topnienia, która ma być oznaczona, na przykład ciekła parafina dla temperatur topnienia nie wyższych od 473 K, olej silikonowy dla temperatur topnienia nie wyższych niż 573 K.
Dla temperatur topnienia powyżej 523 K można wykorzystać mieszaninę składającą się z trzech części kwasu siarkowego i dwóch części siarczanu potasu (wagowo). Należy podjąć stosowne środki ostrożności przy stosowaniu mieszaniny takiej jak niniejsza.
Termometr:
Należy używać wyłącznie termometrów spełniających wymagania następujących norm lub norm równoważnych:
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.
Procedura:
Suchą substancję należy drobno sproszkować w moździerzu i wprowadzić do rurki kapilarnej zatopionej na końcu, tak aby poziom napełnienia wynosił około 3 mm po ciasnym upakowaniu. Aby uzyskać jednolicie upakowaną próbkę, należy spuścić rurkę kapilarną z wysokości około 700 mm przez rurkę szklaną, pionowo na szkiełko zegarkowe.
Napełnioną rurkę kapilarną umieszcza się w łaźni tak, by środkowa część rtęciowej bańki termometru stykała się z rurką kapilarną w części, w której umieszczona jest próbka. Zwykle rurkę kapilarną wprowadza się do przyrządu o temperaturze o około 10 K niższej od temperatury topnienia.
Ciecz łaźni jest podgrzewana w ten sposób, aby temperatura rosła o około 3 K/min. Ciecz należy mieszać. Przy około 10 K poniżej oczekiwanej temperatury topnienia szybkość przyrostu temperatury ustawia się na maksimum 1 K/min.
Obliczenie:
Temperaturę topnienia oblicza się na podstawie następującego wzoru:
T = TD + 0,00016 (TD - TE) n
gdzie:
T = skorygowana temperatura topnienia w stopniach K,
TD = odczyt temperatury z termometru D w stopniach K,
TE = odczyt temperatury z termometru E w stopniach K,
n = = liczba kresek podziałki słupka rtęci na termometrze D przy rurce wyjściowej.
1.6.1.2. Przyrządy do pomiaru temperatury topnienia z metalowym blokiem Przyrząd: Składa się z:
- cylindrycznego bloku metalowego, którego górna część jest wydrążona i tworzy komorę (zob. rysunek 3),
- zatyczki metalowej z dwiema lub większą liczbą dziur, która pozwala na montowanie probówek na bloku metalowym,
- systemu grzejnego do podgrzewania bloku metalowego, wyposażonego na przykład w grzałki oporowe elektryczne zamknięty w bloku,
- reostatu do regulacji zasilania, jeżeli stosowane jest podgrzewanie elektryczne,
- czterech okienek ze szkła żaroodpornego na poprzecznych ścianach komory, zorientowanych pod kątem prostym względem siebie. Przed każdym z okienek zamontowany jest okular do obserwacji rurki kapilarnej. Pozostałe trzy okienka są wykorzystywane do oświetlania wnętrza zamknięcia przy pomocy lamp,
- rurki kapilarnej ze szkła żaroodpornego, zamkniętej na jednym końcu (zob. ppkt 1.6.1.1).
Zob. normy wspomniane w ppkt 1.6.1.1. Stosuje się także termoelektryczne przyrządy pomiarowe o porównywalnej dokładności.
Rysunek 3
1.6.1.3. Wykrywanie przy pomocy komórki fotoelektrycznej Przyrząd i procedura:
Przyrząd składa się z komory metalowej z automatycznym systemem grzewczym. Trzy rurki kapilarne są napełniane zgodnie z ppkt 1.6.1.1 i umieszczane w piecu.
Możliwych jest kilka liniowych ustawień narastania temperatury w celu skalibrowania przyrządu, przy czym właściwy wzrost temperatury jest regulowany elektrycznie na z góry określoną stałą i szybkość liniową. Rejestratory pokazują rzeczywistą temperaturę pieca i temperaturę substancji w rurkach kapilarnych.
1.6.2. Płyty grzewcze
1.6.2.1. Płyta grzewcza Koflera Zob. dodatek.
1.6.2.2. Mikroskop do badania topnienia Zob. dodatek.
1.6.2.3. Metoda menisku (poliamidy) Zob. dodatek.
Szybkość grzania w obrębie temperatury topnienia powinna być mniejsza niż 1 K/min.
1.6.3. Metody oznaczania temperatury krzepnięcia
Zob. dodatek.
1.6.4. Analiza termiczna
1.6.4.1. Różnicowa analiza termiczna Zob. dodatek.
1.6.4.2. Różnicowa kalorymetria skaningowa Zob. dodatek.
1.6.5. Oznaczanie temperatury płynięcia Zob. dodatek.
2. DANE
W niektórych przypadkach konieczna jest korekcja termometru.
3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:
- zastosowana metoda,
- precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia) i wstępny etap oczyszczenia, jeśli wykonano,
- ocena dokładności.
Jako temperaturę topnienia przedstawia się średnią z co najmniej dwóch pomiarów znajdujących się w granicach oszacowanej dokładności pomiarowej (zob. tabele).
Jeżeli różnica między temperaturą na początku i na końcowym etapie topnienia znajduje się w granicach dokładności metody, za temperaturę topnienia przyjmuje się temperaturę na końcowym etapie topnienia; w innym przypadku podaje się obie temperatury.
Jeżeli substancja przed osiągnięciem temperatury topnienia rozkłada się lub sublimuje, podawana jest temperatura, w której obserwowane są te efekty.
Należy podać wszystkie informacje i uwagi istotne dla interpretacji wyników, w szczególności w odniesieniu do zanieczyszczeń i stanu skupienia substancji.
4. LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Council C(81) 30 final.
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II, 803-834.
(3) R. Weissberger éd.: Technique of organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, 505-515.
Dodatek
W celu uzyskania dodatkowych szczegółów technicznych można zapoznać się na przykład z następujymi normami.
1. Metody kapilarne
1.1. Urządzenia do pomiaru temperatury topnienia z łaźnią cieczową
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial and final melting points and the melting range of organic chemicals
BS 4634 Method for the determination of melting point and/or melting range
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles von Harzen nach Kapilarverfarehn
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of chemical products.
1.2. Urządzenia do pomiaru temperatury topnienia z blokiem metalowym
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen
ISO 1218 (E) Plastics- polyamides -determination of 'melting point'
2. Płyty grzewcze
2.1. Płyta grzewcza Koflera
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for testing polymeric powder coatings
2.2. Mikroskop do badania topnienia
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztemperatur von teilkristallinen Kunststoffen
2.3. Metoda menisku (dla poliamidów)
ISO 1218 (E) Plastics - polyamides - determination of 'melting point'
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin injection moulding and extrusion materials
NF T 51-050 Resines de polyamides. Determination du 'point de fusion' méthode du menisque
3. Metody ustalania temperatury krzepnięcia
BS 4633 Method for the determination of crystallizing point
BS 4695 Method for Determination of Melting Point of petroleum wax (Cooling Curve)
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und Motorenbenzolen
ISO 2207 Cires de petrole: determination de la température de figeage
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes von Fettsiiuren
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines
NF T 20-051 Méthode de détermination du point de cristallisation (point de congélation)
ISO 1392 Method for the determination of the freezing point
4. Analiza termiczna
4.1. Różnicowa analiza termiczna
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods
of differential thermal analysis
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
4.2. Różnicowa kalorymetria skaningowa
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods
of differential thermal analysis
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
5. Oznaczanie temperatury płynięcia
NBN 52014 Echantillonnage et analyse des produits du petrole: Point de trouble et point d'ecoulement limite - Monsterneming en ontleding van aardolieproducten: Troebelingspunt en vloeipunt
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of petroleum oils
ISO 3016 Petroleum oils - Determination of pour point
A.2. TEMPERATURA WRZENIA
1. METODA
Większość opisanych metod oparto na wytycznych OECD dotyczących badań (1). Podstawowe zasady podano w (2) i (3).
1.1. WPROWADZENIE
Urządzenia i metody tutaj opisane stosuje się do cieczy i nisko topliwych substancji, pod warunkiem że nie ulegają one reakcji chemicznej poniżej ich temperatury wrzenia (jak na przykład: samoutlenieniu, wtórnemu przekształceniu, rozkładowi i tak dalej). Metody te mogą być stosowane do czystych i zanieczyszczonych ciekłych substancji.
Kładzie się nacisk na metody wykorzystujące wykrywanie za pomocą komórki fotoelektrycznej i analizę termiczną, ponieważ metody te pozwalają na oznaczenie zarówno temperatury topnienia jak i temperatury wrzenia. Ponadto, pomiary mogą być wykonywane w sposób automatyczny.
"Metoda dynamiczna" ma tę zaletę, że można ją także wykorzystywać do oznaczenia ciśnienia pary i nie jest konieczna korekcja temperatury wrzenia do ciśnienia normalnego (101,325 kPa), gdyż można regulować ciśnienie normalne podczas pomiaru.
Uwagi:
Wpływ zanieczyszczeń na oznaczanie temperatury wrzenia w dużym stopniu zależy od charakteru zanieczyszczenia. Jeżeli w próbce znajdują się lotne zanieczyszczenia mogące wpływać na wyniki, badaną substancję należy oczyścić.
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI
Temperatura wrzenia normalna jest zdefiniowana jako temperatura, przy której prężność pary cieczy wynosi 101,325 kPa.
Jeżeli temperatura wrzenia nie jest mierzona w normalnym ciśnieniu atmosferycznym, zależność prężności pary od temperatury opisuje się równaniem Clausiusa - Clapeyrona:
gdzie:
P = prężność pary substancji w paskalach,
ΔHV = jej ciepło parowania w J mol-1,
R = uniwersalna molowa stała gazowa = 8,314 J mol-1 K-1,
T = temperatura termodynamiczna w stopniach K.
Temperatura wrzenia jest ustalona w odniesieniu do ciśnienia otoczenia w czasie trwania pomiaru.
Konwersje
Ciśnienie (jednostki: kPa)
100 kPa = bar=0,1MPa
(jednostka "bar" jest wciąż dozwolona, ale nie jest zalecana)
133 Pa = 1mmHg=1tor
(jednostki "mm H" i "Torr" nie są dozwolone)
1 atm = standardowa atmosfera = 101.325 Pa (jednostka "atm" jest niedozwolona)
Temperatura (jednostki: K) t = T - 273,15
t: temperatura Celsjusza, stopień Celsjusza (oC)
T: temperatura termodynamiczna, Kelwin (K)
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Nie ma konieczności stosowania substancji odniesienia za każdym razem, gdy przeprowadzane są badania nowej substancji. Powinny one służyć głównie sprawdzeniu od czasu do czasu wydajności metody i pozwolić na porównanie wyników z innymi metodami.
Niektóre substancje kalibracyjne wymieniono w opisach metod wymienionych w dodatku.
1.4. ZASADA METODY BADANIA
Pięć metod ustalania temperatury wrzenia (zakresu wrzenia) jest oparte na pomiarze temperatury wrzenia, dwie inne oparte są o analizę termiczną.
1.4.1. Wyznaczanie za pomocą ebuliometru
Ebuliometry zostały pierwotnie opracowane w celu oznaczania masy cząsteczkowej poprzez podwyższanie temperatury wrzenia, jednak nadają się także do dokładnych pomiarów tej temperatury. Bardzo prosty przyrząd opisano w ASTM D 1120-72 (zob. dodatek). Ciecz jest podgrzewana w tym przyrządzie w warunkach równowagi, pod ciśnieniem atmosferycznym, do wrzenia.
1.4.2. Metoda dynamiczna
Metoda ta obejmuje pomiar temperatury ponownej kondensacji pary przy pomocy właściwego termometru w wykroplinach podczas wrzenia. Podczas stosowania tej metody ciśnienie może być zmienne.
1.4.3. Metoda destylacji dla wyznaczania temperatury wrzenia
Metoda ta obejmuje destylację cieczy i pomiar temperatury ponownej kondensacji pary oraz oznaczenie ilości destylatu.
1.4.4. Metoda według Siwolobowa
Próbkę podgrzewa się w probówce, która jest zanurzona w cieczy w gorącej łaźni. W probówce zanurzona jest z kolei zatopiona na końcu rurka kapilarna, zawierająca pęcherzyk powietrza w dolnej części.
1.4.5. Wykrywanie przy pomocy komórki fotoelektrycznej
Zgodnie z zasadą według Siwolobowa wykonuje się automatyczny pomiar fotoelektryczny z wykorzystaniem unoszących się pęcherzyków.
1.4.6. Różnicowa analiza termiczna
Niniejsza technika rejestruje różnicę w temperaturach między substancją i materiałem odniesienia jako funkcję temperatury, gdy substancja oraz materiał odniesienia podlegają temu samemu programowi kontrolowania temperatury. W momencie gdy próbka podlega przejściu pociągającym za sobą zmianę entalpii, zmiana ta jest wskazywana przez endotermiczne odchylenie (wrzenie) od linii bazowej zapisu temperatury.
1.4.7. Różnicowa kalorymetria skaningowa
Niniejsza technika rejestruje różnicę w energii pobranej przez substancję oraz materiał odniesienia, jako funkcję temperatury, gdy substancja oraz materiał odniesienia podlegają temu samemu programowi kontrolowania temperatury. Niniejsza energia jest energią konieczną do ustalenia zerowej różnicy temperatury między substancją i materiałem odniesienia. W momencie gdy próbka podlega przejściu pociągającym za sobą zmianę entalpii, zmiana ta jest wskazywana przez endotermiczne odchylenie (wrzenie) od linii bazowej zapisu przepływu ciepła.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCI
Zastosowanie i dokładność różnych metod wykorzystywanych do ustalania temperatury wrzenia/zakres temperatury wrzenia przedstawiono w tabeli 1.
Tabela 1
Porównanie metod
| Metoda pomiaru | Założona dokładność | Istniejąca norma |
| Ebuliometr Metody dynamiczne Proces destylacji (zakres wrzenia) | ± 1,4 K (do 313 K)(1)(2) ± 2,5 K (do 600 K)(1)(2) ± 0,5 K (do 600 K)(2) ± 0,5 K (do 600 K) | ASTM D 1120-72(1) ISO/R 918, DIN 53171, BS 4591/ 71 |
| Według Siwolobowa Wykrywanie za pomocą komórki fotoelektrycznej | ± 2 K (do 600 K)(2) ±0,3K(do373K)(2) | |
| Różnicowa kalorymetria termiczna | ± 0,5 K (do 600 K) ± 2,0 K (do 1.273 K) | ASTM E 537-76 |
| Różnicowa kalorymetria skaningowa | ± 0,5 K (do 600 K) ± 2,0 K (do 1.273 K) | ASTM E 537-76 |
| (1) Niniejsza dokładność obowiązuje tylko dla prostego urządzenia, jak na przykład opisano w ASTM Dl 120-72; można ją poprawić bardziej złożonymi urządzeniami ebuliometru. (2) Ważna jedynie dla czystych substancji. Użycie w innych okolicznościach powinno być uzasadnione. |
1.6. OPIS METOD
Procedury dotyczące niektórych metod badania opisano w normach międzynarodowych i krajowych (zob. dodatek).
1.6.1. Ebuliometr Zob. dodatek
1.6.2. Metoda dynamiczna
Zob. metoda badania A.4 dla oznaczania prężności pary.
Odnotowuje się temperaturę wrzenia stwierdzoną pod przyłożonym ciśnieniem 101,325 kPa.
1.6.3. Proces destylacji (zakres wrzenia) Zob. dodatek.
1.6.4. Metoda według Siwolobowa
Próbka jest podgrzewana w przyrządzie do oznaczania temperatury topnienia w probówce o średnicy około 5 mm (rysunek 1).
Rysunek 1 pokazuje rodzaj znormalizowanego przyrządu do badania temperatury topnienia i wrzenia (JIS K 0064) (wykonanego ze szkła, wszystkie wymiary w milimetrach).
Rysunek 1
Rurkę kapilarną (kapilara do badania wrzenia), zatopioną na wysokości około 1 cm powyżej dolnego końca, umieszcza się w probówce. Badaną substancję wprowadza się w ten sposób, aby zatopiony odcinek kapilary znalazł się poniżej powierzchni cieczy. Probówkę zawierającą kapilarę albo przymocowuje się do termometru przy pomocy taśmy gumowej, albo umocowuje z boku na wsporniku (zob. rysunek 2).
Ciecz do łaźni należy wybrać w zależności od temperatury wrzenia. Przy temperaturach do 573 K stosuje się olej silikonowy. Ciekła parafina jest stosowana tylko do 473 K. Początkowo grzanie łaźni cieczowej ustawia się na wzrost temperatury 3 K/min. Ciecz łaźni musi być mieszana. W temperaturze około 10 K poniżej spodziewanej temperatury wrzenia szybkość wzrostu temperatury ustawia się na maksimum 1 K/min. Przy zbliżaniu się do temperatury wrzenia z wrzącej zawartości kapilary zaczynają unosić się pęcherzyki.
Temperatura wrzenia to temperatura, w której przy chwilowym schłodzeniu łańcuszek pęcherzyków przestaje powstawać i ciecz w kapilarze nagle zaczyna się unosić. Odpowiadający temu odczyt temperatury to temperatura wrzenia substancji.
W zmodyfikowanej zasadzie pomiaru (rysunek 3) temperatura wrzenia jest oznaczana w kapilarze od ustalania temperatury topnienia. Jest ona wyciągnięta do przewężenia o długości około 2 cm (a) i zassana jest w niej mała ilość próbki. Otwarty koniec cienkiej kapilary jest zamknięty poprzez obtopienie w taki sposób, że na jej końcu znajduje się mały pęcherzyk powietrza. Podczas ogrzewania w aparacie do ustalania temperatury topnienia (b), pęcherzyk powietrza rozszerza się. Temperaturze wrzenia odpowiada taka temperatura, przy której zatyczka z substancji badanej osiąga poziom powierzchni cieczy łaźni (c).
1.6.5. Wykrywanie za pomocą komórki fotoelektrycznej
Próbka jest ogrzewana w rurce kapilarnej umieszczonej wewnątrz podgrzewanego bloku metalowego.
Wiązka światła przechodzi poprzez odpowiednie otwory w bloku, poprzez badaną substancję na precyzyjnie skalibrowaną komórkę fotoelektryczną.
W czasie wzrostu temperatury próbki pojedyncze pęcherzyki powietrza pojawiają się w kapilarze. Gdy osiągnięta jest temperatura wrzenia, ilość pęcherzyków gwałtownie wzrasta. Powoduje to zmianę intensywności światła rejestrowanego przez komórkę fotoelektryczną i powoduje wysłanie sygnału zatrzymania do wskaźnika odczytującego temperaturę z platynowego termometru rezystancyjnego umieszczonego w bloku.
Niniejsza metoda jest szczególnie użyteczna, gdyż pozwala na oznaczania poniżej temperatury pokojowej do 253,15 K (-20 oC) bez żadnych zmian w przyrządzie. Przyrząd umieszcza się jedynie w łaźni chłodzącej.
1.6.6. Analiza termiczna
1.6.6.1. Różnicowa analiza termiczna Zob. dodatek.
1.6.6.2. Różnicowa kalorymetria skaningowa Zob. dodatek.
2. DANE
Przy niewielkich odchyleniach od ciśnienia normalnego (maksimum ± 5 kPa) temperaturę wrzenia normalizuje się do Tn na podstawie następującego wzoru równania Sidneya-Younga:
Tn = T + (fT × Δp)
gdzie:
Δp = (101,325 - p) [uwaga na znak],
P = pomiar ciśnienia w kPa,
fT = szybkość zmian temperatury wrzenia z ciśnieniem w K/Kpa,
T = zmierzona temperatura wrzenia w K,
Tn = temperatura wrzenia skorygowana do ciśnienia normalnego w K.
Współczynniki korekcji temperatury, fT, i wzory na ich przybliżone obliczanie zawarto we wspomnianych wyżej normach międzynarodowych i krajowych dla wielu substancji.
Na przykład w metodzie DIN 53171 wymieniono następujące, przybliżone poprawki dla rozpuszczalników zawartych w farbach:
Tabela 2
Temperatura - współczynniki korekcji fT
| Temperatura T (K) | Współczynnik korekcji fT (K/kPa) |
| 323,15 | 0,26 |
| 348,15 | 0,28 |
| 373,15 | 0,31 |
| 398,15 | 0,33 |
| 423,15 | 0,35 |
| 448,15 | 0,37 |
| 473,15 | 0,39 |
| 498,15 | 0,41 |
| 523,15 | 0,44 |
| 548,15 | 0,45 |
| 573,15 | 0,47 |
3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:
- zastosowana metoda,
- precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia) i wstępny etap oczyszczenia, jeśli wykonano,
- ocena dokładności.
Średnią co najmniej dwóch pomiarów znajdujących się w zakresie oszacowanej dokładności (zob. tabela 1) przedstawia się jako temperaturę wrzenia.
Należy podać zmierzone temperatury wrzenia i ich średnią, a także ciśnienie (ciśnienia), w którym (których) były wykonywane pomiary, w kPa. Najkorzystniej jest, gdy ciśnienie jest zbliżone do normalnego ciśnienia atmosferycznego.
Należy podać wszystkie informacje i uwagi istotne dla interpretacji wyników, w szczególności w odniesieniu do zanieczyszczeń i stanu skupienia substancji.
4. LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Council C (81) 30 final.
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, editions. Experimental thermodynamics, Butterworths, London 1975, vol. II.
(3) R. Weissberger edition: Technique of organic chemistry, Physical methods of organic chemistry, Third Edition, Interscience Publications, New York, 1959, vol. I, part I, chapter VIII.
Dodatek
W celu uzyskania dodatkowych szczegółów technicznych można zapoznać się na przykład z następującymi normami.
1. Ebuliometr
1.1. Urządzenia do pomiaru temperatury topnienia z łaźnią cieczową
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of engine anti-freezes
2. Proces destylacji (zakres wrzenia)
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation Yield and Distillation Range)
BS 4349/68 Method for determination of distillation of petroleum products
BS 4591/71 Method for the determination of distillation characteristics
DIN 53171 Losungsmittel fur Anstrichstoffe, Bestimmung des Siedeverlaufes
NF T 20-608 Distillation: determination du rendement et de l'intervalle de distillation
3. Różnicowa analiza termiczna i różnicowa kalorymetria skaningowa
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal stability of chemicals by methods of differential thermal analysis
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to thermal analysis
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoanalytical data
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe
A.3. GĘSTOŚĆ WZGLĘDNA
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania lub inne metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 1.
A.4. Ciśnienie pary
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania lub inne metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 1.
A.5. NAPIĘCIE POWIERZCHNIOWE
1. METODA
Większość opisanych metod oparto na wytycznych OECD dotyczących badań (1). Podstawowe zasady podano w pozycji bibliograficznej (2).
1.1. WPROWADZENIE
Opisywane metody są stosowane do pomiarów napięcia powierzchniowego roztworów wodnych.
Przed przeprowadzeniem tych badań dobrze jest mieć wstępne informacje na temat rozpuszczalności w wodzie, budowy, właściwości hydrolitycznych i stężenia krytycznego dla tworzenia się micelli substancji.
Poniższe metody można stosować w odniesieniu do większości substancji chemicznych, bez jakichkolwiek ograniczeń związanych z ich stopniem czystości.
Pomiar napięcia powierzchniowego metodą tensjometru pierścieniowego jest zastrzeżony wyłącznie dla roztworów wodnych o lepkości dynamicznej mniejszej niż około 200 mPa s.
1.2. DEFINICJE IJEDNOSTKI
Jako napięcie powierzchniowe określa się entalpię wolnej powierzchni na jednostkę pola powierzchni.
Napięcie powierzchniowe jest podawane jako:
N/rn (układ SI) lub
mN/m (układ SI)
1 N/m = 103 dyn/cm
1 mN/m = 1 dyna/cm w nieważnym systemie CGS
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Nie ma konieczności stosowania substancji odniesienia za każdym razem, gdy przeprowadzane są badania nowej substancji. Powinny one służyć głównie sprawdzeniu od czasu do czasu wydajności metody i pozwolić na porównanie wyników z innymi metodami.
Substancje odniesienia, które obejmują szeroki zakres napięć powierzchniowych, podano w pozycjach bibliograficznych (1) i (3).
1.4. ZASADA METOD
Metody te opierają się na pomiarach maksymalnej siły, jaką trzeba wywierać pionowo na mieszadło lub pierścień w kontakcie z powierzchnią badanej cieczy umieszczonej naczyniu miarowym, aby oddzielić ją od tej powierzchni, bądź też na płytkę, której krawędź wchodzi w kontakt z powierzchnią, aby pociągnąć do góry utworzoną błonkę.
Substancje o rozpuszczalności w wodzie przynajmniej w stężeniu 1 mg/l badane są w roztworach wodnych w pojedynczych stężeniach.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCI
Metody te zapewniają większą precyzję niż wymagana na ogół do ocen przy przeglądach środowiskowych.
1.6. OPIS METOD
Roztwór substancji przygotowuje się w wodzie destylowanej. Stężenie tego roztworu powinno wynosić 90 % rozpuszczalności nasycenia w wodzie, jeżeli to stężenie przekracza 1 g/l, do badania stosuje się stężenie 1 g/l. Nie podlegają badaniu substancje, których rozpuszczalność w wodzie jest mniejsza niż 1 mg/l.
1.6.1. Metoda płytkowa
Zob. ISO 304 i NF T 73-060 (Surface active agents - determination of surface tension by drawing up liąuid films).
1.6.2. Metoda zawieszki
Zob. ISO 304 and NF T 73-060 (Surface active agents - determination of surface tension by drawing up liąuid films).
1.6.3. Metoda pierścieniowa
Zob. ISO 304 and NF T 73-060 (Surface active agents - determination of surface tension by drawing up liąuid films).
1.6.4. Zharmonizowana metoda pierścieniowa OECD
1.6.4.1. Pnyrząd
Do tego pomiaru można wykorzystać dostępne w handlu tensjometry Składają się one z następujących elementów:
- ruchomy stół próbki,
- system pomiaru siły,
- ciało pomiarowe (pierścień),
- naczynie pomiarowe.
1.6.4.1.1. Ruchomy stół próbki
Ruchomy stół z próbką jest wykorzystywany jako wspornik dla naczynia pomiarowego z kontrolowaną temperaturą, w którym znajduje się badana ciecz. Razem z układem do pomiaru siły stół ten jest montowany na stojaku.
1.6.4.1.2. System pomiaru siły
Układ do pomiaru siły (zob. rysunek) mieści się ponad stołem z próbką. Błąd pomiaru siły nie może przekraczać ± 10"6 N, co odpowiada granicy błędu wynoszącej ±0,1 mg w przypadku pomiaru masy. W większości przypadków skalę pomiarową dostępnych na rynku tensjometrów kalibruje się w mN/m, tak aby napięcie powierzchniowe można było odczytywać bezpośrednio w mN/m, z dokładnością do 0,1 mN/m.
1.6.4.1.3. Ciało pomiarowe (pierścień)
Pierścień na ogół jest wykonany z drutu platynowo-irydowego o grubości około 0,4 mm i średnim obwodzie 60 mm. Pierścień drutu zwiesza się horyzontalnie z metalowego sworznia i drucianego wspornika, tak aby stworzyć połączenie z układem do pomiaru siły (zob. rysunek).
Rysunek
Ciało pomiarowe
(Wszystkie wymiary w milimetrach)
1.6.4.1.4. Naczynie pomiarowe
Naczynie pomiarowe z badanym roztworem musi być naczyniem szklanym z kontrolowaną temperaturą. Musi być tak zaprojektowane, aby w trakcie pomiaru temperatura roztworu badanego i fazy gazowej nad jego powierzchnią pozostały stałe, a próbka nie mogła wyparować. Dopuszczalne są cylindryczne, szklane naczynia o średnicy wewnętrznej nie mniejszej niż 45 mm.
1.6.4.2. Przygotowanie przyrządu
1.6.4.2.1. Czyszczenie
Szklane naczynia muszą być starannie oczyszczone. W razie potrzeby należy je przepłukać gorącym kwasem chromowo-siarkowym, a następnie kwasem fosforowym o konsystencji syropu (od 83 do 98 % wagowo H3PO4), potem starannie przepłukać pod wodą z kranu, a wreszcie umyć dwukrotnie destylowaną wodą do uzyskania reakcji obojętnej, a na końcu wysuszyć lub przepłukać częścią płynnej próbki mierzonej.
Pierścień należy najpierw starannie opłukać w wodzie w celu usunięcia wszelkich substancji rozpuszczalnych w tej cieczy, następnie na krótki czas zanurzyć w kwasie chromowo-siarkowym, później umyć dwukrotnie destylowaną wodą do uzyskania reakcji obojętnej, a na końcu krótko podgrzać nad płomieniem metanolowym.
Uwaga:
Zanieczyszczenia substancjami, które nie ulegają rozpuszczeniu ani zniszczeniu wskutek oddziaływania kwasu chromo-siarkowego lub fosforowego, takimi jak silikony, należy usunąć przy pomocy odpowiedniego rozpuszczalnika organicznego.
1.6.4.2.2. Kalibracja przyrządu
Weryfikacja przyrządu polega na sprawdzeniu punktu zerowego i takim jego wyregulowaniu, aby wskazania instrumentu pozwalały na niezawodne oznaczenia w mN/m.
Montaż:
Przyrząd musi być wypoziomowany, na przykład przy pomocy poziomnicy alkoholowej, u podstawy tensjometru, przez wyregulowanie śrub poziomujących u podstawy.
Ustawienie punktu zero:
Po zamontowaniu pierścienia na przyrządzie, przed jego zanurzeniem w cieczy, wskazania tensjometru należy wyregulować do zera i sprawdzić, czy pierścień jest ustawiony równolegle do powierzchni cieczy. W tym celu powierzchnię cieczy można wykorzystać jako lustro.
Kalibracje:
Kalibrację przy pomocy rzeczywistego badania można dokonać przy pomocy jednej z dwóch procedur:
a) używając masę: procedura wykorzystująca koniki wagi o znanej masie od 0,1 do 1,0 g umieszczane na pierścieniu. Współczynnik kalibracyjny Φa, przez który należy pomnożyć wszystkie wskazania instrumentu, należy ustalić według następującego wzoru (1):
gdzie:
m = masa konika wagi (g),
g = przyspieszenie grawitacyjne (981 cm/sek-2 na wysokości poziomu morza),
b = średni obwód pierścienia (cm),
σa = odczyt tensjometru po umieszczeniu konika na pierścieniu (mN/m);
b) używając wodę: procedura stosująca czystą wodę, której napięcie powierzchniowe przy na przykład 23 oC jest równe 72,3 mN/m. Niniejsza procedura jest wykonywana szybciej niż kalibracja wagowa, lecz występuje przy niej zawsze niebezpieczeństwo, że napięcie powierzchniowe wody jest zafałszowane śladowymi zanieczyszczeniami związków powierzchniowo czynnych.
Współczynnik kalibracyjny Φb, przez który należy pomnożyć wszystkie wskazania instrumentu, należy ustalić według następującego wzoru (2):
gdzie:
σo = cytowana w literaturze wartość napięcia powierzchniowego wody (mN/m),
σg = zmierzona wartość napięcia powierzchniowego wody (mN/m), obie w tej samej temperaturze.
1.6.4.3. Przygotowanie próbek
Należy sporządzić roztwory wodne badanych substancji, używając odpowiednich stężeń w wodzie. Nie mogą one zawierać substancji w stanie nierozpuszczonym.
Roztwór należy utrzymywać w stałej temperaturze (± 0,5 oC). Ponieważ napięcie powierzchniowe roztworu w naczyniu pomiarowym zmienia się w czasie, należy wykonać kilka pomiarów w różnych momentach i nakreślić krzywą pokazującą napięcie powierzchniowe w funkcji czasu. Brak jakichkolwiek dalszych zmian oznacza, że osiągnięto stan równowagi.
Zanieczyszczenie pyłami i gazami innych substancji przeszkadza w pomiarze. Dlatego badanie musi być prowadzone pod przykrywą ochronną.
1.6.5. Warunki badania
Pomiar należy przeprowadzić w temperaturze około 20 oC, która musi być kontrolowana w ten sposób, aby utrzymywała się w zakresie ± 0,5 oC.
1.6.6. Wykonanie badania
Roztwory do pomiaru należy wprowadzić do starannie wyczyszczonego naczynia pomiarowego, dokładając wszelkich starań, aby uniknąć wytwarzania piany, a następnie naczynie umieszcza się na stoliku przyrządu do badań. Blat stolika z naczyniem pomiarowym należy unieść do momentu zanurzenia pierścienia poniżej powierzchni roztworu badanego. Następnie blat stolika opuszcza się stopniowo i równo (z szybkością około 0,5 cm/min), tak aby oddzielić pierścień od powierzchni, do momentu osiągnięcia maksymalnej siły. Warstwa cieczy dołączona do pierścienia nie może się od niego oddzielić. Po wykonaniu pomiarów pierścień należy ponownie zanurzyć poniżej powierzchni i powtórzyć pomiary, aż zostanie osiągnięta stała wartość napięcia powierzchniowego. W przypadku każdego oznaczenia należy zapisać czas odprzeniesienia roztworu do naczynia pomiarowego. Odczyty należy wykonywać przy maksymalnej sile potrzebnej do oderwania pierścienia od powierzchni cieczy.
2. DANE
W celu obliczenia napięcia powierzchniowego wartość odczytaną w mN/m na przyrządzie należy na początku pomnożyć przez współczynnik kalibracyjny Φa lub Φb (zależnie od zastosowanej procedury kalibracyjnej). Da to wartość jedynie przybliżoną, dlatego wymaga korekcji.
Harkins i Jordan (4) empirycznie ustalili współczynniki korekcji dla wartości napięcia powierzchniowego zmierzonych metodą pierścienia. Zależą one od wymiarów pierścienia, gęstości cieczy i napięcia powierzchniowego tej ostatniej.
Ponieważ ustalanie współczynnika korekcji dla każdego kolejnego pomiaru na podstawie tabel Harkinsa i Jordana jest pracochłonne, do obliczenia napięcia powierzchniowego roztworów wodnych można wykorzystać procedurę uproszczoną wykonywania odczytów skorygowanych wartości napięcia powierzchniowego bezpośrednio z tabeli. (W przypadku gdy odczytane wartości znajdują się między tymi, które podano w tabeli, należy zastosować interpolację).
Tabela
Korekcja zmierzonego napięcia powierzchniowego
Tylko dla roztworów wodnych, ρ ≅ 1 g/cm3
| r | = 9,55 mm (średni promień pierścienia) |
| r | = 0,185 mm (promień drutu pierścienia) |
| Wartość doświadczalna (mN/m) | Wartość skorygowana (mN/m) | |
| Kalibracja wagowa (zob. 1.6.4.2.2 lit. a)) | Kalibracja wodą (zob. 1.6.4.2.2 lit.b)) | |
| 20 | 16,9 | 18,1 |
| 22 | 18,7 | 20,1 |
| 24 | 20,6 | 22,1 |
| 26 | 22,4 | 24,1 |
| 28 | 24,3 | 26,1 |
| 30 | 26,2 | 28,1 | |
| 32 | 28,1 | 30,1 |
| 34 | 29,9 | 32,1 |
| 36 | 31,8 | 34,1 |
| 38 | 33,7 | 36,1 |
| 40 | 35,6 | 38,2 |
| 42 | 37,6 | 40,3 |
| 44 | 39,5 | 42,3 |
| 46 | 41,4 | 44,4 |
| 48 | 43,4 | 46,5 |
| 50 | 45,3 | 48,6 |
| 52 | 47,3 | 50,7 |
| 54 | 49,3 | 52,8 |
| 56 | 51,2 | 54,9 |
| 58 | 53,2 | 57,0 |
| 60 | 55,2 | 59,1 |
| 62 | 57,2 | 61,3 |
| 64 | 59,2 | 63,4 |
| 66 | 61,2 | 65,5 |
| 68 | 63,2 | 67,7 |
| 70 | 65,2 | 69,9 |
| 72 | 67,2 | 72,0 |
| 74 | 69,2 | - |
| 76 | 71,2 | - |
| 78 | 73,2 | - |
Niniejsza tabela została zestawiona na podstawie poprawki Harkinsa-Jordana. Jest ona zbliżona do tej w normie (DIN 53914) dla wody i roztworów wodnych (gęstość p = 1 g/cm3) i dla dostępnych w handlu pierścieni o wymiarach R = 9,55 mm (średni promień pierścienia) i r = 0,185 mm (promień drutu pierścienia). W tabeli podano skorygowane wartości pomiarów napięcia powierzchniowego wykonanych po kalibracji odważnikowej lub przy pomocy wody.
Alternatywnie, bez poprzednio opisanej kalibracji, napięcie powierzchniowe można obliczyć na podstawie następującego wzoru:
gdzie:
F = siła zmierzona dynamometrem przy zerwaniu błonki,
R = promień pierścienia,
f = współczynnik korekcji (1).
3. SPORZĄDZENIE SPRAWOZDANIA
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badania zawiera w miarę możliwości następujące informacje:
- zastosowana metoda,
- rodzaj zastosowanej wody lub zastosowanego roztworu,
- precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia),
- wyniki pomiaru: napięcie powierzchniowe (odczyt), z podaniem zarówno poszczególnych odczytów, jak i ich średniej arytmetycznej oraz skorygowanej średniej (z wzięciem pod uwagę współczynnika przyrządu i tabeli korekcji),
- stężenie roztworu,
- temperatura badania,
- wiek zastosowanego roztworu; w szczególności czas od przygotowania do zmierzenia właściwości roztworu,
- opis zależności napięcia powierzchniowego od czasu po przeniesieniu roztworu do naczynia pomiarowego,
- należy podać wszystkie informacje i uwagi istotne dla interpretacji wyników, w szczególności w odniesieniu do zanieczyszczeń i stanu skupienia substancji.
3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW
Zważywszy że destylowana woda posiada napięcie powierzchniowe 72,75 mN/m w 20 oC, substancje wykazujące napięcie powierzchniowe niższe niż 60 mN/m zgodnie z warunkami niniejszej metody należy uznać za materiały będące powierzchniowo czynnymi.
4. LITERATURA
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Council C(81) 30 final.
(2) R. Weissberger ed.: Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, part I, chapter XIV.
(3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, 511.
(4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 52, 1751.
A.6. ROZPUSZCZALNOŚĆ W WODZIE
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD nr 105 (OECD TG 105) (1995). Niniejsza metoda badawcza stanowi zmienioną wersję pierwotnej metody opisanej w OECD TG 105, przyjętej w 1981 r. Pomiędzy aktualną wersją a wersją z 1981 r. nie ma zasadniczych różnic. Zmiany dotyczyły przede wszystkim formatu. Przegląd był oparty o metodę badawczą UE "Water solubility" (Rozpuszczalność w wodzie)(1).
ZAŁOŻENIA WSTĘPNE
2. Na rozpuszczalność substancji w wodzie w sposób istotny może wpłynąć obecność zanieczyszczeń. Niniejsza metoda badawcza dotyczy oznaczania rozpuszczalności w wodzie substancji zasadniczo czystych, które w wodzie są stabilne i nie mają charakteru lotnego. Przed oznaczeniem rozpuszczalności w wodzie przydatne jest posiadanie pewnych wstępnych informacji na temat substancji badanej, takich jak wzór strukturalny, ciśnienie pary, stała dysocjacji i hydroliza jako funkcja pH.
3. W niniejszym opisie metody badawczej podano dwie metody: metodę wymywania, służącą do oznaczania rozpuszczalności niższej niż 10-2 g/l, i metodę wytrząsania w kolbie, służącą do wyznaczania rozpuszczalności wyższej. Opisano również proste badanie wstępne. Umożliwia ono wyznaczenie w przybliżeniu odpowiedniej ilości próbki, jaka ma być użyta w ostatecznym badaniu, jak również czasu niezbędnego do uzyskania roztworu nasyconego.
DEFINICJE I JEDNOSTKI
4. Rozpuszczalność substancji w wodzie jest to stężenie masowe substancji w nasyconym roztworze wodnym w określonej temperaturze.
5. Rozpuszczalność w wodzie wyraża się jako masę substancji rozpuszczonej na objętość roztworu. Jednostką w układzie SI jest kg/m3, można również stosować jednostkę g/l.
SUBSTANCJE ODNIESIENIA
6. Nie ma konieczności stosowania substancji odniesienia przy określaniu rozpuszczalności substancji badanej.
OPIS METOD
Warunki badania
7. Najkorzystniej jest przeprowadzić badanie w temperaturze 20 ± 0,5 °C. Wybrana temperatura powinna być utrzymywana na stałym poziomie we wszystkich istotnych częściach sprzętu.
Badanie wstępne
8. Stosowana jest procedura sekwencyjna. Do ok. 0,1 g próbki (substancje stałe należy sproszkować) znajdującej się w cylindrze miarowym o pojemności 10 ml, zamkniętym korkiem szklanym, dodaje się w temperaturze pokojowej kolejne jednostki objętości wody. Po każdym dodaniu jednostki wody mieszaninę wstrząsa się przez 10 minut i kontroluje wzrokowo pod kątem jakichkolwiek nierozpuszczonych części próbki. Jeżeli po dodaniu 10 ml wody próbka lub jej część pozostają nierozpuszczone, doświadczenie kontynuuje się przy użyciu cylindra miarowego o objętości 100 ml. Przybliżoną rozpuszczalność podano w tabeli 1 poniżej pod taką objętością wody, w jakiej dochodzi do pełnego rozpuszczenia próbki. Jeżeli rozpuszczalność jest mała, do rozpuszczenia substancji badanej może być potrzebne dużo czasu i należy ją pozostawić na co najmniej 24 godziny. Jeżeli po 24 godzinach substancja badana pozostaje nierozpuszczona, należy ją pozostawić na dłużej (do 96 godzin) lub poczynić próbę dalszego rozcieńczenia w celu stwierdzenia, czy należy zastosować metodę wymywania, czy metodę wytrząsania w kolbie.
Tabela 1
| ml wody na 0,1 g substancji rozpuszczalnej | 0,1 | 0,5 | 1 | 2 | 10 | 100 | > 100 |
| Przybliżona rozpuszczalność w g/l | > 1 000 | 1 000-200 | 200-100 | 100-50 | 50-10 | 10-1 | < 1 |
Metoda wymywania
Zasady ogólne
9. Niniejsza metoda jest oparta na wymywaniu wodą substancji badanej z mikrokolumny wypełnionej obojętnym nośnikiem pokrytym uprzednio nadmiarem badanej substancji (2). Rozpuszczalność w wodzie podawana jest jako stężenie masowe eluatu po osiągnięciu wartości plateau w funkcji czasu.
Przyrząd
10. Przyrząd składa się z mikrokolumny (rysunek 1) utrzymywanej w stałej temperaturze. Połączona jest ona z pompą recyrkulacyjną (rysunek 2) lub z naczyniem poziomującym (rysunek 3). Mikrokolumna zawiera obojętny nośnik utrzymywany na miejscu małą zatyczką z waty szklanej, która służy także do odfiltrowywania cząstek. Jako nośnik można zastosować szklane kulki, ziemię okrzemkową lub inny obojętny materiał.
11. Mikrokolumna przedstawiona na rysunku 1 nadaje się do zestawu z pompą recyrkulacyjną. W górnej części kolumny znajduje się przestrzeń mieszcząca pięć objętości złoża (ilość usuwaną na początku doświadczenia) i pięć próbek (pobieranych do analizy podczas doświadczenia). Alternatywnie jej rozmiar może być zmniejszony, jeżeli do układu można dodawać wody podczas doświadczenia w celu zastąpienia pięciu objętości złoża usuniętych wraz z zanieczyszczeniami. Kolumna jest połączona rurką z obojętnego materiału z pompą recyrkulacyjną o wydajności około 25 ml/godz. Pompa recyrkulacyjna może być na przykład pompą perystaltyczną lub membranową. Należy uważać, aby nie doszło do zanieczyszczenia lub adsorpcji na materiale rurki.
12. Schematyczny układ obejmujący naczynie poziomujące przedstawiono na rysunku 3. W tym przypadku mikro-kolumna wyposażona jest w zawór jednostronnie odcinający. Podłączenie do naczynia poziomującego składa się ze szlifowanego złącza szklanego i rurki z obojętnego materiału. Prędkość wypływu z naczynia poziomującego powinna wynosić w przybliżeniu 25 ml/godz.
Rysunek 1
Wymiary w mm
A. Połączenie szlifowanego złącza szklanego
B. Przestrzeń nadpowierzchniowa
C. Wewnętrz 5
D. Zewnętrz 19
E. Zatyczka z waty szklanej
F. Zawór odcinający
Rysunek 2
A. Wyrównywanie ciśnienia do atmosferycznego
B. Przepływomierz
C. Mikrokolumna
D. Pompa cyrkulacyjna kontrolowana termostatycznie
E. Pompa recyrkulacyjna
F. Zawór dwudrożny do próbkowania
Rysunek 3
A. Naczynie poziomujące (np. 2,5-litrowa kolba)
B. Kolumna
C. Odbiornik frakcji
D. Termostat
E. Rurka teflonowa
F. Szlifowane złącze szklane
G. Linia wodna (pomiędzy termostatem i kolumną, średnica wewnętrzna około 8 mm)
13. Około 600 mg materiału nośnika przenieść do kolby okrągłodennej o pojemności 50 ml. Stosowną ilość substancji badanej rozpuścić w lotnym rozpuszczalniku o czystości analitycznej i dodać odpowiednią ilość tego roztworu do nośnika. Rozpuszczalnik poddać całkowitemu odparowaniu, np. w wyparce obrotowej, ponieważ w innym razie nośnik nie zostanie całkowicie nasycony wodą podczas etapu wymywania z powodu podziału faz na powierzchni nośnika. Upakowany nośnik pozostawić do nasączenia na dwie godziny w około 5 ml wody, a następnie zawiesinę wlać do mikrokolumny. Alternatywnie można wsypać suchy, upakowany nośnik do mikrokolumny wypełnionej wodą i pozostawić na dwie godziny do ustalenia stanu równowagi.
14. Upakowanie nośnika może stwarzać problemy prowadzące do błędnych wyników, np. jeżeli substancja badana osadza się jako olej. Problemy te należy zbadać, a szczegóły zamieścić w sprawozdaniu.
Procedura z zastosowaniem pompy recyrkulacyjnej
15. Uruchomić przepływ przez kolumnę. Zalecane jest stosowanie szybkości przepływu około 25 ml/godz. - odpowiada to 10 objętościom złoża na godzinę dla opisanej tu kolumny. Odrzucić co najmniej pięć pierwszych wypełnień złoża w celu usunięcia rozpuszczalnych w wodzie zanieczyszczeń. Następnie uruchomić pompę aż do uzyskania równowagi, definiowanej poprzez wyniki pomiarów dla pięciu kolejnych próbek, w których stężenie nie różni się o więcej niż ± 30 % przy losowym rozkładzie różnic. Próbki te powinny zostać od siebie oddzielone w odstępach czasowych odpowiadających przejściu eluentu w ilości co najmniej dziesięciokrotnej objętości złoża. W zależności od zastosowanej metody analitycznej lepszą metodą może być wykreślenie krzywej zależności stężenia od czasu w celu wykazania osiągnięcia stanu równowagi.
Procedura z zastosowaniem naczynia poziomującego
16. Zebrać kolejne frakcje eluatu i wykonać analizę wybraną metodą. Do oznaczenia rozpuszczalności wykorzystuje się frakcje ze środkowego zakresu eluatu, gdzie stężenia są stałe w granicach ± 30 % w co najmniej pięciu kolejnych frakcjach.
17. Preferowanym eluentem jest woda podwójnie destylowana. Można również użyć wody zdejonizowanej o rezystywności powyżej 10 ΜΩ/cm i całkowitej zawartości węgla organicznego poniżej 0,01 %.
18. W obu procedurach wykonuje się drugą serię pomiarów przy połowie prędkości przepływu zastosowanej w pierwszej serii. Jeżeli wyniki obu serii są zgodne, badanie należy uznać za zadowalające. Jeżeli zmierzona rozpuszczalność przy niższej prędkości przepływu jest większa, wtedy należy powtarzać procedurę zmniejszania tej prędkości o połowę tak długo, dopóki w dwóch kolejnych seriach nie uzyska się takiej samej rozpuszczalności.
19. W obu procedurach należy kontrolować frakcje pod kątem obecności zawiesin koloidalnych przez sprawdzenie, czy nie występuje efekt Tyndalla. Obecność takich cząstek powoduje nieważność badania i po poprawieniu działania filtrującego kolumny należy je powtórzyć.
20. Należy zmierzyć pH każdej próbki, najlepiej przy użyciu specjalnych pasków wskaźnikowych.
Metoda wytrząsania w kolbie
Zasady ogólne
21. Substancję badaną (ciała stałe muszą zostać sproszkowane) rozpuścić w wodzie w temperaturze nieco wyższej od temperatury badania. Po uzyskaniu nasycenia mieszaninę schłodzić i utrzymywać w temperaturze badania. Alternatywnie, jeżeli za pomocą właściwego pobierania próbek upewniono się co do osiągnięcia stanu równowagi nasycenia, pomiar może być wykonywany bezpośrednio w temperaturze badania. Następnie przy pomocy odpowiedniej metody analitycznej oznaczyć stężenie masowe substancji badanej w roztworze wodnym, który nie może zawierać żadnych nierozpuszczonych cząstek (3).
Przyrząd
22. Potrzebne są następujące materiały:
- zwykłe szkło laboratoryjne i instrumenty,
- urządzenie służące do mieszania roztworów w kontrolowanej, stałej temperaturze,
- o ile jest potrzebna w przypadku emulsji - wirówka (najlepiej z termostatem), oraz
- sprzęt do wykonywania analiz.
Procedura
23. Na podstawie badania wstępnego oszacować ilość substancji badanej niezbędną do nasycenia pożądanej objętości wody. Odważyć około pięciokrotność tej ilości do każdego z trzech naczyń szklanych wyposażonych w korki szklane (np. probówek wirówkowych, kolb). Do każdego naczynia dodać pewną objętość wody zależną od wybranej metody analitycznej i zakresu rozpuszczalności. Następnie mocno zatkane korkiem naczynia wytrząsać w temperaturze 30 °C. Należy użyć wytrząsarki lub mieszarki, która może działać w stałej temperaturze, np. mieszadła magnetycznego w łaźni wodnej z temperaturą kontrolowaną termostatem. Po jednym dniu jedno z naczyń pozostawić do ustalenia stanu równowagi na 24 godziny w temperaturze badania, przy czym od czasu do czasu należy je wstrząsnąć. Zawartość naczynia poddać następnie wirowaniu w temperaturze badania i oznaczyć stężenie substancji badanej w klarownej fazie wodnej za pomocą odpowiedniej metody analitycznej. Z pozostałymi dwiema kolbami postąpić podobnie po początkowym ustaleniu stanu równowagi w temperaturze 30 °C przez, odpowiednio, dwa i trzy dni. Jeżeli wyniki oznaczenia stężenia w co najmniej dwóch ostatnich naczyniach nie różnią się o więcej niż 15 %, badanie należy uznać za zadowalające. Jeżeli wyniki dla naczyń 1, 2 i 3 wykazują tendencję do wzrastających wartości, całe badanie należy powtórzyć, stosując dłuższe okresy ustalania równowagi.
24. Badanie można również wykonać bez wstępnej inkubacji w 30 °C. W celu oceny szybkości ustalania się równowagi nasycenia próbki pobiera się do momentu, gdy czas mieszania nie wywiera już wpływu na mierzone stężenie.
25. Należy zmierzyć pH każdej próbki, najlepiej przy użyciu specjalnych pasków wskaźnikowych.
Oznaczenia analityczne
26. Najkorzystniejsza jest metoda specyficzna dla substancji, gdyż małe ilości rozpuszczalnych zanieczyszczeń mogą spowodować duże błędy wyników pomiarów rozpuszczalności. Przykładami takich metod są: chromatografia gazowa lub cieczowa, miareczkowanie, fotometria, woltamperometria.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Dane
Metoda wymywania
27. W każdej serii należy obliczyć wartość średnią i odchylenie standardowe dla co najmniej pięciu kolejnych próbek pobranych przy plateau nasycenia. Wartości średnie uzyskane w dwóch badaniach przy różnych prędkościach przepływu nie powinny się różnić o więcej niż 30 %.
Metoda wytrząsania w kolbie
28. Wyniki pomiarów dla każdej z trzech kolb, które nie powinny się różnić o więcej niż 15 %, uśrednia się.
Sprawozdanie z badania
Metoda wymywania
29. Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
- wyniki badania wstępnego,
- nazwa chemiczna i informacje o zanieczyszczeniach (oczyszczanie wstępne, jeżeli zostało przeprowadzone),
- stężenia, prędkości przepływu i pH dla każdej próbki,
- średnie i odchylenia standardowe dla co najmniej pięciu próbek przy plateau nasycenia dla każdej serii,
- średnia z co najmniej dwóch kolejnych serii,
- temperatura wody w czasie procesu nasycania,
- metoda analityczna,
- charakter nośnika,
- upakowanie nośnika,
- zastosowany rozpuszczalnik,
- dowody niestabilności chemicznej substancji w trakcie badania,
- wszystkie informacje istotne dla interpretacji wyników, szczególnie w odniesieniu do zanieczyszczeń i stanu fizycznego substancji badanej.
Metoda wytrząsania w kolbie
30. Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
- wyniki badania wstępnego,
- nazwa chemiczna i informacje o zanieczyszczeniach (oczyszczanie wstępne, jeżeli zostało przeprowadzone),
- poszczególne oznaczenia analityczne, a w przypadku gdy dla każdej kolby była oznaczana więcej niż jedna wartość, ich średnia,
- pH każdej próbki,
- średnia wartości dla różnych kolb, które były zgodne,
- temperatura badania,
- metoda analityczna,
- dowody na jakąkolwiek niestabilność chemiczną substancji w trakcie badania,
- wszystkie informacje istotne dla interpretacji wyników, szczególnie w odniesieniu do zanieczyszczeń i stanu fizycznego substancji badanej.
BIBLIOGRAFIA:
(1) Dyrektywa Komisji 92/69/EWG z dnia 31 lipca 1992 r. dostosowująca po raz siedemnasty do postępu technicznego dyrektywę 67/548/EWG w sprawie zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych odnoszących się do klasyfikacji i etykietowania substancji niebezpiecznych (Dz.U. L 383 z 29.12.1992, s. 113).
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility - Column elution method.
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (September 1985). Chemical products for industrial use - Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility - Flask method.
______
(1) Informacje te podano tylko dla wygody użytkowników. Można korzystać z innych, równoważnych programów komputerowych, jeżeli da się wykazać, że wyniki obliczeń są takie same.
A.8. WSPÓŁCZYNNIK PODZIAŁU
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania lub inne metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 1.
A.9. TEMPERATURAZAPŁONU
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania lub inne metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 1.
A.10. ZAPALNOŚĆ (CIAŁA STAŁE)
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania lub inne metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 1.
A.11. ZAPALNOŚĆ (GAZY)
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania lub inne metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 1.
A.12. ZAPALNOŚĆ (W KONTAKCIE Z WODĄ)
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania lub inne metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 1.
A.13. WŁAŚCIWOŚCI PIROFORYCZNE CIAŁ STAŁYCH I CIECZY
1. METODA
1.1. WPROWADZENIE
Procedura badań ma zastosowanie do stałych lub ciekłych substancji, które w małych ilościach samorzutnie zapalają się w krótkim czasie po wejściu z powietrzem w temperaturze pokojowej (około 20 oC).
Substancje, które wymagają wystawienia na powietrze na okres godzin lub dni w temperaturze pokojowej lub w podwyższonej temperaturze, zanim zajdzie zapłon nie są objęte niniejszą metodą badania.
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI
Substancje uważa się za posiadające właściwości piroforyczne, jeżeli zapalają się lub ulegają zwęglaniu zgodnie z warunkami opisanymi w 1.6.
Samozapalność cieczy może wymagać również zbadania za pomocą metody A.15 Temperatura samozapłonu (ciecze i gazy).
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Nie wyszczególniono.
1.4. ZASADA METODY
Substancja, czy w postaci ciała stałego czy cieczy, jest dodawana do obojętnego nośnika i poddawana kontaktowi z powietrzem w temperaturze otoczenia na okres pięciu minut. Jeżeli substancje nie zapalają się, absorbuje się je na bibule filtracyjnej i wystawia na powietrze w temperaturze otoczenia (około 20 oC) na czas pięciu minut. Jeżeli ciało stałe lub ciecz zapala się, lub ciecz zapala się lub zwęgla bibułę filtracyjną, wtedy substancję uważa się za piroforyczną.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCI
Powtarzalność: ze względów istotnych dla bezpieczeństwa pojedynczy pozytywny wynik jest wystarczający do uznania substancji za piroforyczną.
1.6. OPIS METODY BADANIA
1.6.1. Przyrząd
Tygiel porcelanowy o średnicy około 10 cm napełnia się ziemią okrzemkową do wysokości około 5 mm w temperaturze pokojowej.
Uwaga:
Ziemię okrzemkową lub dowolną inną porównywalną, obojętną substancję, która jest powszechnie dostępna, bierze się jako reprezentacyjną dla gleby, na którą badana substancja może się uwolnić w razie wypadku.
Do badania cieczy, które nie zapalają się w kontakcie z powietrzem, gdy poddaje się je kontaktowi z obojętnym nośnikiem, wymagana jest sucha bibuła filtracyjna.
1.6.2. Przeprowadzenie badania
a) Sproszkowane ciała stałe
Od 1 do 2 cm3 badanej substancji w proszku sypie się z wysokości około 1 m na niepalną powierzchnię i obserwuje się, czy substancja ta ulegnie zapaleniu podczas spadania lub w ciągu pięciu minut od opadnięcia.
Badanie przeprowadza się sześć razy, niezależnie od wystąpienia zapalenia się.
b) Ciecze
Około 5 cm3 badanej cieczy wlewa się do przygotowanego tygla porcelanowego i obserwuje się, czy substancja zapali się w ciągu pięciu minut.
Jeżeli w sześciu badaniach nie nastąpi zapłon, należy przeprowadzić następujące badania:
0,5 ml badanej próbki za pomocą strzykawki przenosi się na wgniecioną bibułę filtracyjną i obserwuje się, czy nastąpi zapalenie się lub zwęglenie bibuły filtracyjnej w czasie pięciu minut po naniesieniu cieczy. Niezależnie od tego, czy zachodzi zapalenie się lub zwęglenie, badanie przeprowadza się trzy razy.
2. DANE
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW
Wykonywania badań można zaprzestać, gdy tylko w jednym z nich uzyska się dodatni wynik.
2.2. OCENA
Jeżeli substancja zapala się w czasie pięciu minut od dodania obojętnego nośnika i wystawienia na powietrze, lub ciekła substancja zwęgla lub zapala bibułę filtracyjną w czasie pięciu minut po naniesieniu i wystawieniu na powietrze, jest uważana za piroforyczną.
3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:
- precyzyjna specyfikacja substancji (tożsamość i zanieczyszczenia),
- wyniki badań,
- wszystkie dodatkowe uwagi dotyczące interpretacji wyników.
4. LITERATURA
(1) NF T 20-039 (SEPT 85). Chemical products for industrial use. Determination of the spontaneous flammability of solids and liquids.
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test and criteria, 1990, United Nations, New York.
A.14. WŁAŚCIWOŚCI WYBUCHOWE
1. METODA
1.1. WPROWADZENIE
Metoda dostarcza schematu badania do określenia, czy ciało stałe lub substancja pastopodobna przedstawia niebezpieczeństwo wybuchu, gdy poddaje się ją działaniu płomienia (wrażliwość cieplna) lub uderzeniu lub tarciu (wrażliwość na bodźce mechaniczne), i czy ciekła substancja przedstawia niebezpieczeństwo wybuchu, gdy podda się ją działaniu płomienia lub uderzeniu.
Metoda składa się z trzech części:
a) badanie wrażliwości cieplnej (1);
b) badanie wrażliwości mechanicznej na uderzenia (1);
c) badanie wrażliwości mechanicznej na tarcie (1).
Metoda pozwala uzyskać dane pozwalające na ocenę prawdopodobieństwa zainicjowania wybuchu przy pomocy niektórych powszechnie występujących bodźców. Metoda nie jest przeznaczona do stwierdzenia, czy substancja jest zdolna do wybuchu w każdych warunkach.
Metoda jest właściwa do określenia, czy substancja może przedstawiać niebezpieczeństwo wybuchu (wrażliwość cieplna i mechaniczna) w szczególnych warunkach określonych w dyrektywie. Jest oparta o pewną ilość typów przyrządów, które są szeroko międzynarodowo stosowane (1) i które zwykle dają w pełni znaczące wyniki. Uznane jest, że metoda nie jest ostateczna. Można stosować alternatywne przyrządy do tych celów, zapewniając że są znane międzynarodowo i wyniki mogą być stosownie skorelowane z tymi z wymaganych przyrządów.
Nie ma potrzeby przeprowadzania badań, gdy dostępne są informacje termodynamiczne (np. ciepło tworzenia, ciepło rozkładu) i/lub nieobecne są pewne reaktywne grupy (2) we wzorze strukturalnym, ustanawiające poza wszelkimi wątpliwościami, że substancja jest niezdolna do gwałtownego rozkładu z wydzieleniem gazów lub uwolnieniem ciepła (to jest, materiał nie przedstawia żadnego ryzyka wybuchu). Badanie wrażliwości mechanicznej w odniesieniu do tarcia nie jest wymagane dla cieczy.
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI
Materiały wybuchowe:
Substancje, które wybuchają pod działaniem płomienia lub które są wrażliwe na uderzenie lub tarcie w wymaganych przyrządach (lub bardziej wrażliwe mechanicznie niż 1,3-dinitrobenzen w alternatywnym przyrządzie).
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
1,3-dinitrobenzen, techniczny, krystaliczny, przesiany przez sito 0,5 mm, dla metod tarcia i uderzenia.
Perhydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyna (RDX, heksogen, cyklonit-CAS 121-82-4), rekrystalizowany z wodnego cykloheksanonu, przesiewany na mokro przez sito 250 mikrometrów (μm) i zatrzymywany na sicie 150 μm oraz suszony w 103 ± 2 oC (przez 4 godziny) do drugiej serii badań na tarcie i uderzenia.
1.4. ZASADA METODY
Badania wstępne są konieczne dla ustalenia bezpiecznych warunków przeprowadzenia trzech badań wrażliwości.
1.4.1. Badania bezpiecznego postępowania z substancją (3)
Ze względów bezpieczeństwa, przed przeprowadzeniem głównych badań, bardzo małe próbki (około 10 mg) substancji są poddawane ogrzaniu bez zamknięcia w płomieniu gazu, wstrząsowi w dogodnym przyrządzie i tarciu przez użycie młotka i kowadła lub jakiejkolwiek maszyny ciernej. Celem jest stwierdzenie, czy substancja jest tak wrażliwa i wybuchowa, że przepisane badania wrażliwości, szczególnie wrażliwość cieplna, powinny być prowadzone ze specjalnymi środkami bezpieczeństwa, by zapobiec zranieniu operatora.
1.4.2. Wrażliwość cieplna
Metoda obejmuje podgrzewanie substancji w stalowej rurze, zamkniętej kryzami z otworami o różnej średnicy, dla określenia, czy substancja jest podatna na wybuch w warunkach intensywnego ogrzewania pod określonym przykryciem.
1.4.3. Wrażliwość mechaniczna (uderzenie)
Metoda obejmuje poddawanie substancji uderzeniu spowodowanemu przez zrzucenie określonej masy z określonej wysokości.
1.4.4. Wrażliwość mechaniczna (tarcie)
Metoda obejmuje poddawanie ciała stałego lub substancji pastopodobnych tarciu między znormalizowanymi powierzchniami w określonych warunkach obciążenia i ruchu względnego.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCI Nie ustalono.
1.6. OPIS METODY
1.6.1. Wrażliwość cieplna (działanie płomienia)
1.6.1.1. Przyrząd
Przyrząd składa się z nienadającej się do ponownego zastosowania rury stalowej z zamknięciami wielokrotnego użytku (rysunek 1), zainstalowanej w urządzeniu do podgrzewania i zabezpieczającym. Każda rura jest wykonana z arkusza stali głęboko tłoczonej (zob. dodatek) i posiada wewnętrzną średnicę 24 mm, długość 75 mm i grubość ścianek 0,5 mm. Rury są kołnierzowane na otwartych końcach dla umożliwienia ich zamknięcia przez zestaw płyty kryzowej. Składa się on z odpornej na ciśnienie płyty kryzy, z centralnie położonym otworem, przykręconej mocno do rury za pomocą dwuczęściowych złącz śrubowych (nakrętka i gwintowany pierścień). Nakrętka i gwintowany pierścień są wykonane ze stali chromomanganowej (zob. dodatek), beziskrowej do temperatury 800 oC. Kryzy są grubości 6 mm, wykonane ze stali żaroodpornej (zob. dodatek), i są dostępne w zakresie różnych średnic otworów.
1.6.1.2. Warunki badania
Zwykle substancje są badane tak jak je otrzymano, chociaż w niektórych przypadkach, na przykład gdy są sprasowane, odlewane lub w inny sposób skondensowane, może być konieczne badanie substancji po skruszeniu. Dla ciał stałych masa materiału użytego w każdym badaniu jest określana w dwuetapowej procedurze przebiegu próbnego. Wytarowana rura jest napełniana 9 cm3 substancji i substancja jest ubijana siłą 80 N przyłożoną w poprzek całkowitego przekroju rury. Z powodów bezpieczeństwa lub w przypadkach, gdzie postać fizyczna próbki zmienia się przez ściśnięcie, można użyć inną procedurę napełniania; przykładowo, gdy substancja jest bardzo wrażliwa na tarcie, wtedy ubijanie nie jest odpowiednie. Jeżeli materiał jest ściśliwy, wtedy dodaje się go więcej i ubija do momentu wypełnienia rury do 55 mm od góry. Całkowita masa użyta do wypełnienia rury do poziomu 55 mm jest określona i dodaje się następnie dwie dodatkowe porcje, każda ubijana z siłą 80 N. Następnie materiał jest albo dodawany z ubijaniem, albo wyjmowany, w zależności od wymagań, celem pozostawienia rury wypełnionej do poziomu 15 mm od góry. Wykonuje się drugi przebieg próbny, rozpoczynając z ubitą ilością trzeciej masy całkowitej znalezionej w pierwszym etapie przebiegu próbnego. Do tych przyrostów dodaje się dwa więcej z ubijaniem o sile 80 N i poziomem substancji w rurze ustawionym na 15 mm od góry, poprzez dodawanie lub ujmowanie materiału zgodnie z wymaganiem. Ilość ciała stałego ustalona w drugim etapie przebiegu próbnego jest stosowana do każdej próby. Napełnianie przeprowadzono w trzech równych ilościach, każdej ściśniętej do 9 cm3 z konieczną siłą (można to uprościć przez zastosowanie pierścieni dystansowych).
Ciecze i żele są ładowane do rury na wysokość 60 mm, zwracając szczególną uwagę na żele, by zapobiec tworzeniu się pustych przestrzeni. Gwintowany pierścień jest wsuwany w rurę od dołu, umieszcza się stosowną płytę kryzową i dokręca nakrętkę po nasmarowaniu małą ilością smaru na bazie disiarczku molibdenu. Jest podstawową
zasadą sprawdzenie, czy nie uwięziono substancji między kołnierzem i płytą, lub w gwincie.
Podgrzewanie jest prowadzone za pomocą propanu pobieranego z butli przemysłowej, wyposażonej w zawór regulacyjny ciśnienia (60 do 70 mbar), poprzez miernik i równomiernie rozprowadzany (co wskazuje wizualna obserwacja płomieni z palników) poprzez dysze do czterech palników. Palniki są umieszczone dookoła komory badawczej, jak pokazano na rysunku 1. Cztery palniki posiadają łączne zużycie około 3,2 litra propanu na minutę. Można zastosować alternatywne gazy palne i palniki, ale szybkość ogrzewania musi być jak wyspecyfikowano na rysunku 3. Dla wszystkich przyrządów szybkość ogrzewania musi być okresowo sprawdzana używając rury wypełnione ftalanem dibutylu, jak wskazano na rysunku 3.
1.6.1.3. Przeprowadzenie badania
Każde badanie jest przeprowadzane do momentu albo rozerwania rury, albo ogrzania w czasie pięciu minut. Badanie, wynikiem którego jest fragmentacja rury na trzy lub więcej części, które w niektórych przypadkach mogą być połączone jedna do drugiej wąskimi tasiemkami metalu jak pokazano na rysunku 2, ocenia się jako dające wybuch. Badanie wynikiem którego jest mniej fragmentów lub wcale, jest uważane jako niedające wybuchu.
Wpierw wykonuje się serie trzech badań z płytą kryzową o średnicy 6,0 mm, jeśli nie uzyska się wybuchów, przeprowadza się drugą serię trzech badań z płyta kryzową o średnicy 2,0 mm. Jeżeli wybuch zachodzi w jednej z dwóch serii badań, niewymagane są następne badania.
1.6.1.4. Ocena
Wynik badania jest uważany za pozytywny, jeżeli wybuch zachodzi w jednej z dwóch powyższych serii badań.
1.6.2. Wrażliwość mechaniczna (uderzenie)
1.6.2.1. Przyrząd (rysunek 4)
Podstawowe części przyrządu spadowego młota są wykonane z bloku ze staliwa z podstawą, kowadła, kolumny, prowadnic, bijaków, mechanizmu zwalniającego i uchwytu próbki. Kowadło stalowe 100 mm (średnica) × 70 mm (wysokość) jest przykręcone do góry bloku stalowego 230 mm (długość) × 250 mm (szerokość) × 200 mm (wysokość) z podstawą staliwną 450 mm (długość) × 450 mm (szerokość) × 60 mm (wysokość). Kolumna wykonana z bezszwowej ciągnionej rury stalowej, jest zabezpieczona w uchwycie przykręconym do tylnej ściany bloku stalowego. Cztery śruby mocują przyrząd do stałego betonowego bloku 60 × 60 × 60 cm w taki sposób, że szyny prowadnicy są całkowicie pionowe i bijak opada swobodnie. Stosownymi do użycia są bijaki 5 oraz 10 kg, wykonane z stali uspokojonej. Głowica uderzeniowa każdego bijaka jest z utwardzonej stali HRC 60 do 63, i posiada minimalną średnicę 25 mm.
Próbka podlegająca badaniu jest zawarta w przyrządzie uderzeniowym składającym się z dwóch współosiowych cylindrów ze stali uspokojonej, jeden powyżej drugiego, w wydrążonym stalowym pierścieniu prowadzącym. Cylindry ze stali uspokojonej powinny posiadać średnicę 10 (- 0,003, - 0,005) mm i wysokość 10 mm oraz posiadać polerowane powierzchnie, zaokrąglone krawędzie (promień krzywizny 0,5 mm) i twardość HRC 58 do 65. Drążony cylinder musi posiadać zewnętrzną średnicę 16 mm, polerowany otwór wiertniczy 10 (+ 0,005, + 0,010) mm i wysokość 13 mm. Przyrząd uderzeniowy jest wyposażony w pośrednie kowadło (średnica 26 mm i 26 mm wysokość) wykonane ze stali i centrowane pierścieniem z otworami, pozwalającymi na ucieczkę dymów.
1.6.2.2. Warunki badania
Objętość próbki powinna wynosić 40 mm3 lub objętość właściwą dla dowolnego alternatywnego przyrządu. Stałe substancje powinny być badane w stanie suchym i przygotowywane, jak następuje:
a) sproszkowane substancje należy przesiać (wielkość oczek sita: 0,5 mm); do badania wykorzystuje się całą ilość substancji, która przeszła przez sito;
b) sprasowane, odlewane lub w inny sposób skondensowane substancje są kruszone w małe kawałki i przesiewane; przesiane frakcje średnicy od 0,5 do 1 mm są używane do badania i muszą być reprezentatywne dla substancji oryginalnej.
Substancje zwykle dostarczane jako pasty, powinny być badane w stanie suchym, tam gdzie to możliwe, lub w każdym razie, po usunięciu maksymalnie możliwej ilości rozpuszczalnika. Ciekłe substancje są badane ze szczeliną 1mm między dolnym i górnym stalowym cylindrem.
1.6.2.3. Przeprowadzenie badań
Przeprowadza się serie sześciu badań, spuszczając masę 10 kg z wysokości 0,40 m (40 J). Jeżeli w trakcie sześciu badań przy 40 J uzyska się wybuch, należy wykonać serię dalszych sześciu badań, spuszczając masę 5 kg z 0,15 m (7,5 J). W innym przyrządzie próbka jest porównywana z wybraną substancją odniesienia, stosując ustaloną procedurę (np. technikę w górę-w dół itd.).
1.6.2.4. Ocena
Wynik badania uważa się za pozytywny, jeżeli zachodzi wybuch (zapalenie się gwałtownym płomieniem jest równoważne wybuchowi i przedstawiane w sprawozdaniu) przynajmniej raz we wszystkich badaniach z określonym przyrządem uderzeniowym lub próbka jest bardziej wrażliwa niż 1,3-dinitrobenzen lub RDX w alternatywnym badaniu na uderzenie.
1.6.3. Wrażliwość mechaniczna (tarcie)
1.6.3.1. Przyrząd (rysunek 5)
Przyrząd do tarcia składa się z płyty bazowej staliwnej, na której zamocowany jest przyrząd tarcia. Składa się on z umocowanych porcelanowych prętów i ruchomej porcelanowej płyty. Płyta porcelanowa jest umieszczona w wózku poruszającym się w dwóch prowadnicach. Wózek jest dołączony do silnika elektrycznego poprzez korbowód, krzywkę mimośrodową i odpowiednią przekładnię, tak że porcelanowa płyta przesuwa się tylko raz, w tył i naprzód poniżej porcelanowego pręta w odległości 10 mm. Pręt porcelanowy może być obciążony przykładowo 120 lub 360 N.
Płaska porcelanowa płyta jest wykonana z porcelany technicznej (chropowatość 9 do 32 μm) i posiada wymiary 25 mm (długość) × 25 mm (szerokość) × 5 mm (wysokość). Cylindryczny pręt porcelanowy jest również wykonany z białej technicznej porcelany i ma długość 15 mm, średnicę 10 mm oraz schropowaconą końcową powierzchnię sferyczną o promieniu krzywizny 10 mm.
1.6.3.2. Warunki badania
Objętość próbki powinna wynosić 10 mm3 lub objętość odpowiednią dla każdego przyrządu alternatywnego.
Stałe substancje powinny być badane w stanie suchym i przygotowywane jak następuje:
a) sproszkowane substancje należy przesiać (wielkość oczek sita: 0,5 mm); do badania wykorzystuje się całą ilość substancji, która przeszła przez sito;
b) sprasowane, odlewane lub w inny sposób skondensowane substancje są kruszone w małe kawałki i przesiewane; do badań używane są przesiane frakcje średnicy mniejszej od 0,5 mm.
Substancje zwykle dostarczane jako pasty powinny być badane w stanie suchym, tam gdzie to możliwe. Jeżeli substancja nie może być przygotowana w stanie suchym, pasta (po usunięciu maksymalnie możliwej ilości rozpuszczalnika) jest badana jako warstwa 0,5 mm grubości, 2 mm szerokości, 10 mm długości, przygotowana przy użyciu szablonu.
1.6.3.3. Przeprowadzenie badań
Pręt porcelanowy jest położony na badaną próbkę i obciążany. Podczas przeprowadzania badania ślady gąbki na płytce porcelanowej muszą być położone poprzecznie w stosunku do kierunku ruchu. Należy uważać, aby pręt spoczywał na próbce, aby wystarczająco dużo materiału badanego znajdowało się pod prętem i aby płytka poruszała się prawidłowo pod prętem. Dla substancji w postaci past do nanoszenia substancji na płytę stosuje się szablon o grubości 0,5 mm ze szczeliną 2 × 10 mm. Porcelanowa płyta przesuwa się o 10 mm wprzód i do tyłu pod porcelanowym prętem w czasie 0,44 sekundy. Każda część powierzchni płyty i pręta używana jest tylko raz; dwa końce każdego pręta służą dla dwóch prób, a dwie powierzchnie płyty służą każda do trzech prób.
Serię sześciu badań przeprowadza się z obciążeniem 360 N. Jeżeli uzyskuje się pozytywne zdarzenie w czasie trwania tych sześciu badań, następną serię sześciu badań należy wykonać z obciążeniem 120 N. W innych przyrządach, próbka jest porównywana z wybraną substancją odniesienia, stosując ustaloną procedurę (np. technikę "w górę-w dół" itp.).
1.6.3.4. Ocena
Wynik badania jest uważany za pozytywny, jeżeli zaszedł wybuch (zapalenie się gwałtownym płomieniem jest równoważne wybuchowi i przedstawiane w sprawozdaniu) przynajmniej raz w jakimkolwiek z badań przy użyciu wyspecyfikowanego przyrządu do tarcia lub odpowiada kryteriom równoważności w alternatywnym badaniu przez tarcie.
2. DANE
W zasadzie, w sensie dyrektywy, substancja jest uważana za przedstawiając niebezpieczeństwo wybuchu, jeżeli uzyskano pozytywny wynik w badaniach wrażliwości na ciepło, uderzenie i tarcie.
3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:
- tożsamość, skład, czystość, zawartość wilgoci itd., badanej substancji,
- postać fizyczna próbki i czy lub nie była kruszona, rozdrabniana i/lub przesiewana,
- obserwacje z czasu trwania badań wrażliwości cieplnej (np. masa próbki, ilość fragmentów itp.),
- obserwacje z czasu trwania badań wrażliwości mechanicznej (np. tworzenie znacznych ilości dymu lub całkowity rozkład bez detonacji, płomienie, iskry, detonacja, gwałtowne zapalenie itp.),
- wyniki każdego rodzaju badania,
- w przypadku gdy wykorzystano alternatywny przyrząd, należy podać uzasadnienie naukowe oraz dowody na korelację między wynikami uzyskanymi przy pomocy podanego przyrządu i przyrządu równoważnego,
- wszelkie użyteczne uwagi, takie jak odniesienie do badań produktów podobnych, które mogą być istotne dla prawidłowej interpretacji wyników.
- wszelkie dodatkowe uwagi istotne dla interpretacji wyników.
3.2. INTERPRETACJA I OCENA WYNIKÓW
W sprawozdaniu z badań należy podać wszelkie wyniki uznane za fałszywe, stanowiące anomalię lub niereprezentatywne. W przypadku gdyby którykolwiek z wyników powinien zostać odrzucony, należy podać wszelkie alternatywne lub dodatkowe badania. Pomimo wytłumaczenia anomalnych wyników muszą być zaakceptowane ich wartość nominalne i zastosowane do zgodnej z nimi klasyfikacji substancji.
4. LITERATURA
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests and criteria, 1990, United Nations, New York.
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th edition, Butterworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.
(3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, vol. 3, 6-13 and 30-42.
(4) NF T 20-038 (September 85). Chemical products for industrial use -Determination of explosion risk.
Dodatek
Przykłady specyfikacji materiałowych do badania wrażliwości cieplnej (zob. DIN 1623)
(1) Tube: Material specification No 1.0336.505 g
(2) Orifice plate: Material specification No 1.4873
(3) Threaded collar and nut: Material specification No 1.3817
Rysunek 1
Przyrząd badawczy do wrażliwości cieplnej
(wszystkie wymiary w mm)
Rysunek 2
Badanie wrażliwości cieplnej
(przykłady fragmentacji)
Rysunek 3
Kalibracja szybkości podgrzewania dla badania wrażliwości cieplnej
Rysunek 4
Przyrząd do badania wrażliwości na uderzenie (wszystkie wymiary w mm)
Rysunek 4
Ciąg dalszy
Rysunek 5
Przyrząd do badania wrażliwości na tarcie
A.15. TEMPERATURA SAMOZAPŁONU (CIECZE I GAZY)
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania lub inne metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 1.
A.16. WZGLĘDNA TEMPERATURA SAMOZAPŁONU DLA CIAŁSTAŁYCH
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania lub inne metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 1.
A.17. WŁAŚCIWOŚCI UTLENIAJĄCE (CIAŁA STAŁE)
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania lub inne metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 1.
A18. ŚREDNIA LICZBOWA MASA CZĄSTECZKOWA I ROZKŁAD MASY CZĄSTECZKOWEJ POLIMERÓW
1. METODA
Niniejsza metoda chromatografii żelowo-permeacyjnej (GPC) jest powtórzeniem OECD TG 118 (1996). Podstawowe zasady i dalsze informacje techniczne są podane w pozycji bibliograficznej (1).
1.1. WPROWADZENIE
Skoro właściwości polimerów są tak zróżnicowane, nie istnieje możliwość opisania jednej metody ustalającej dokładnie warunki rozdzielania i oceny która obejmuje wszystkie ewentualności i specyficzne przypadki występujące przy rozdzielaniu polimerów. W szczególności złożone systemy polimerów nie ulegają często chromatografii żelowo-permeacyjnej (GPC). Jeśli GPC nie jest praktykowana, masa cząsteczkowa może być oznaczona za pomocą innych metod (zob. załącznik). W takich przypadkach powinny zostać podane pełne dane szczegółowe i uzasadnienia dla wykorzystanych metod.
Opisana metoda oparta jest na normie DIN 55672 (1). Szczegółowe informacje o tym, wjaki sposób mają być przeprowadzane doświadczenia oraz w jaki sposób oceniać dane, można znaleźć w powyższej normie DIN. W przypadku gdy niezbędne są modyfikacje warunków doświadczalnych, zmiany te muszą być uzasadnione. Inne normy mogą być używane jedynie, gdy istnieją do nich pełne odniesienia. Opisana metoda wykorzystuje próbki polistyrenu o znanej polidyspersyjności do kalibracji i może istnieć konieczność zmodyfikowania jej, aby była odpowiednia dla niektórych polimerów, np. rozpuszczalnych w wodzie oraz polimerów o długich rozgałęzionych łańcuchach.
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI
Średnia liczbowo masa cząsteczkowa Mn i średnia wagowo masa cząsteczkowa Mw są oznaczane, wykorzystując następujące równania:
gdzie:
Hi jest poziomem sygnału detektora z linii podstawowej dla objętości retencji Vi,
Mi jest masą cząsteczkową polimerowej frakcji przy objętości retencji Vi, oraz
n jest liczbą punktów pomiarowych.
Rozpiętość rozkładu masy cząsteczkowej, która jest miarą stopnia dyspersji systemu, jest podana na podstawie stosunku Mw/Mn.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
GPC jest metodą względną i w związku z tym musi zostać podjęta kalibracja. Zwykle do tego celu jest wykorzystywany polistyren w niewielkim stopniu rozproszony, o liniowej budowie, posiadający średnie masy cząsteczkowe Mn i Mw oraz znany rozkład masy cząsteczkowej. Krzywa kalibracji może być wykorzystywana w oznaczaniu masy cząsteczkowej nieznanej próbki wyłącznie, jeżeli warunki rozdzielenia próbki oraz wzorce zostały wybrane w identyczny sposób.
Określony związek między masą cząsteczkową oraz objętością elucji jest ważny wyłącznie w specyficznych warunkach, w których przeprowadzane jest konkretne doświadczenie. Warunki obejmują przede wszystkim temperaturę, rozpuszczalnik (lub mieszaninę rozpuszczalników), warunki chromatografii oraz kolumnę rozdzielającą lub systemy kolumn.
Masy cząsteczkowe próbki oznaczone w ten sposób są odpowiednimi wartościami oraz są opisane jako "ciężar równoważnikowy polistyrenu". Oznacza to, że w zależności od strukturalnych i chemicznych różnic między próbką a wzorcami masy cząsteczkowe mogą odchylać się od wartości absolutnych/całkowitych w większym lub mniejszym stopniu. Jeżeli wykorzystywane są inne wzorce, np. glikolu polietylenowego, tlenku polietylenu, metaakrylanu polimetylu, kwasu poliakrylowego, należy podać odpowiednie przyczyny.
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Zarówno rozkład masy cząsteczkowej próbki jak i średnie masy cząsteczkowe (Mn Mw) mogą być oznaczane, wykorzystując GPC. GPC jest szczególnym rodzajem chromatografii cieczowej, w której próbka jest rozdzielana według hydrodynamicznych objętości pojedynczych składników (2).
Rozdzielenie następuje, kiedy próbka przechodzi przez kolumnę, która jest wypełniona porowatym materiałem - zazwyczaj organicznym żelem. Małe cząsteczki mogą wnikać w pory, podczas gdy duże cząsteczki są wykluczane. Droga dużych cząsteczek jest z tego względu krótsza i to one są poddane procesowi elucji w pierwszej kolejności. Średnich rozmiarów cząsteczki wnikają w niektóre pory i są później poddawane elucji. Najmniejsze cząsteczki o średnim hydrodynamicznym promieniu, mniejszym niż pory żelu, mogą wnikać we wszystkie pory. Poddawane są elucji na końcu.
W sytuacji idealnej rozdzielanie jest kontrolowane wyłącznie przez wielkość czasteczki gatunku, ale w praktyce trudno jest uniknąć co najmniej niewielkich zakłócających efektów absorbcyjnych. Nierówne wypełnienia kolumny oraz objętości martwe mogą pogorszyć sytuację (2).
Detekcji dokonuje się przez np. współczynnik załamania światła lub pochłaniania promieni UV i daje w wyniku nieskomplikowaną krzywą rozkładu. Jednakże w celu przypisania rzeczywistych wartości masy cząsteczkowej do krzywej niezbędne jest poddanie kolumny kalibracji przez przepuszczanie polimerów o znanej masie cząsteczkowej oraz, w idealnym przypadku, o podobnej strukturze, np. różnych wzorców polistyrenowych. Krzywa Gaussa, powstająca zazwyczaj w ten sposób, czasami wypaczona jest małymi "ogonami" skierowanymi w stronę małych mas cząsteczkowych, oś pionowa wskazuje jakość w masie różnych wyeluowanych odmian polistyrenu, a oś pozioma wskazuje logarytm z masy cząsteczkowej.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE
Powtarzalność (względne odchylenie standardowe: RSD) objętości eluowania powinna być lepsza niż 0,3 %. Wymagana powtarzalność analizy musi być zapewniona przez korektę dokonywaną poprzez wzorce wewnętrzne, jeżeli chromatogram jest uzyskiwany w zależności od czasu i nie odpowiada wyżej wspomnianym kryteriom (1). Polidyspersyjności są zależne od mas cząsteczkowych wzorców. W przypadku wzorców polistyrenowych typowe wartości to:
Mp < 2.000 Mw/Mn < 1,20
2.000<Mp<106 Mw/Mn<1,05
Mp > 106 Mw/Mn < 1,20
(Mp jest masą cząsteczkową wzorca w maksimum piku)
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.6.1. Przygotowanie roztworów wzorcowych polistyrenu
Wzorce polistyrenu są rozpuszczane przez ostrożne mieszanie w wybranym eluencie. Zalecenia wytwórcy muszą być uwzględnione w trakcie przygotowania roztworu.
Stężenia wybranych wzorców są zależne od wielu czynników, np. od objętości wstrzykiwanej substancji, lepkości roztworu oraz czułości detektora analitycznego. Maksymalna objętość injekcji musi być dostosowana do długości kolumny, w celu uniknięcia przeładowania. Typowe objętości injekcji dla analitycznego rozdzielenia przy użyciu GPC z kolumną o wymiarach 30 cm × 7,8 mm wynoszą na ogół 40-100 ul. Wyższe objętości są możliwe, ale nie powinny przekraczać 250 ul. Optymalny stosunek między objętością injekcji a stężeniem musi być określony przed rzeczywistą kalibracją kolumny.
1.6.2. Przygotowywanie roztworu próbki
Zasadniczo te same wymagania stosuje się do przygotowywania roztworów próbek. Próbka jest rozpuszczana w odpowiednim rozpuszczalniku, np. tetrahydrofuranie (THF), przez lekkie wstrząsanie. W żadnym okolicznościach nie powinno się rozpuszczać próbki w wannie ultradźwiękowej. W razie konieczności próbka roztworu jest oczyszczana poprzez membranowy filtr posiadający pory o wymiarach między 0,2 a 2um.
Obecność nierozpuszczalnych cząstek musi być zapisana w sprawozdaniu końcowym, ponieważ może to być odpowiednie dla próbek o dużej masie cząsteczkowej. Powinna zostać wykorzystana odpowiednia metoda w celu określenia udziału procentowego w masie rozpuszczonych cząstek. Roztwór powinien zostać wykorzystany w ciągu 24 godzin.
1.6.3. Aparatura:
- zbiornik na rozpuszczalnik,
- odgazowywacz (w danym przypadku),
- pompa,
- nawilżacz pulsowy (w danym przypadku),
- system wtryskowy,
- kolumny chromatograficzne,
- detektor,
- przepływomierz (w danym przypadku),
- urządzenie rejestrujące dane,
- naczynie na odpady.
Należy zapewnić, że system GPC jest obojętny w odniesieniu do stosowanych rozpuszczalników (np. przez wykorzystanie stalowych kapilar w przypadku rozpuszczalnika THF).
1.6.4. System wtryskowy i system dostarczający rozpuszczalnik
Określona objętość roztworu próbki jest umieszczona w kolumnie albo wykorzystując automatyczny próbnik, albo ręcznie w ściśle określonej strefie. Zbyt szybkie wycofywanie lub zniżanie tłoka nurnikowego, jeśli jest wykonywane ręcznie, może spowodować zmiany w obserwowanym rozkładzie masy cząsteczkowej. System dostarczający rozpuszczalnik, na ile jest to możliwe, powinien być wolny od pulsacji, co można osiągnąć przez wbudowanie do niego tłumika pulsacji. Szybkość przepływu wynosi 1 ml/min.
1.6.5. Kolumna
W zależności od próbki właściwości polimeru oznacza się albo za pomocą prostej kolumny, albo kilku kolumn połączonych w sekwencję. Pewna ilość materiałów porowatych kolumn o określonych właściwościach dostępna jest w ogólnej sprzedaży (np. rozmiar porów, granica ekskluzji). Wybór żelu rozdzielającego lub długość kolumny jest uzależniona zarówno od właściwości próbki (objętości hydrodynamiczne, rozkład masy cząsteczkowej), jak i od specyficznych warunków rozdzielania, takich jak rozpuszczalnik, temperatura i prędkość przepływu (1) (2) (3).
1.6.6. Półki teoretyczne
Kolumna lub połączenie kolumn wykorzystywanych do rozdzielania musi być scharakteryzowana przez ilość półek teoretycznych. Obejmuje to, w przypadku THF jako rozpuszczalnika eluencyjnego, umieszczenie roztworu etylobenzenu lub innych odpowiednich niepolarnych substancji rozpuszczonych w kolumnie o znanej długości. Liczba półek teoretycznych jest uzyskiwana na podstawie następującego równania:
gdzie:
N = jest liczbą półek teoretycznych,
Ve = jest objętością eluecyjną w maksimum piku,
W = jest podstawową szerokością piku,
W1/2 = jest szerokością piku w połowie wysokości.
1.6.7. Wydajność rozdzielania
Oprócz liczby półek teoretycznych, która jest określającą ilościowo szerokością pasma, ważną rolę odgrywa także wydajność rozdzielenia, będąca określana przez nachylenie krzywej kalibracyjnej. Wydajność rozdzielania kolumny jest uzyskiwana z następującego stosunku:
gdzie:
Ve mx = jest objętością elucyjną dla polistyrenu o masie cząsteczkowej Mx,
Ve,(10.Mx) = jest objętością elucyjną dla polistyrenu o 10-krotnie większej masie cząsteczkowej Mx.
Rozkład systemu jest zwykle określany w następujący sposób:
Gdzie:
Ve1, Ve2 = są objętościami eluencyjnymi dwóch wzorców polistyrenowych w maksimum piku,
W1, W2 = są szerokościami piku linii podstawowej,
M1, M2 = są masami cząsteczkowymi w maksimum piku (powinny różnić się współczynnikiem o 10).
Wartość R dla systemu kolumn powinna być większa niż 1, 7 (4).
1.6.8. Rozpuszczalniki
Wszystkie rozpuszczalniki muszą posiadać wysoką czystość (dla THF używana jest czystość 99,5 %). Zbiornik na rozpuszczalnik (o ile jest to konieczne - w atmosferze gazu obojętnego) musi być odpowiednio duży dla kalibracji kolumny i analiz wielu próbek. Rozpuszczalnik musi być odgazowany zanim zostanie przeniesiony do kolumny za pomocą pompy.
1.6.9. Kontrola temperatury
Temperatura krytycznych komponentów wewnętrznych (pętla wtryskowa, kolumny, detektor i przewody) powinna być stała i zgodna z wyborem rozpuszczalnika.
1.6.10. Detektor
Zadaniem detektora jest rejestracja ilościowa stężenia próbki eluowanej z kolumny. W celu uniknięcia niepotrzebnego poszerzenia pików, objętość kuwety komórki detektora musi być tak mała, jak to tylko jest możliwe. Nie powinna być większa niż 10 ul, z wyjątkiem detektorów mierzących światło rozproszone oraz lepkość. W celu detekcji zazwyczaj używana jest refraktometria różnicowa. Jednakże jeżeli wymagają tego właściwości próbki lub właściwości eluacyjne rozpuszczalnika, mogą być używane inne rodzaje detektora, np. UV/VIS, IR, detektory lepkości itd.
2. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDAŃ
2.1. DANE
Powinno nastąpić odniesienie do normy DIN (1) w celu uzyskania szczegółowych kryteriów oceny, jak również do wymogów odnoszących się do zbierania i przetwarzania danych.
Dla każdej próbki muszą zostać przeprowadzone dwa niezależne doświadczenia. Próbki muszą być analizowane pojedynczo.
Dla każdego pomiaru muszą być zapewnione Mn, Mw Mw/Mn, Mp. Niezbędne jest wyraźne wskazanie, że zmierzone wartości są wartościami względnymi, równoważnymi masom cząsteczkowym użytych wzorców.
Po określeniu objętości retencji lub czasów retencji (możliwie poprawionych, wykorzystując wzorzec wewnętrzny) wartości logarytmu Mp (Mp będącego maksymalną wartością piku wzorca kalibracji) są wykreślane w oparciu o jedną z tych wielkości. Niezbędne są co najmniej dwa punkty kalibracji na dekadę masy cząsteczkowej oraz wymagane jest co najmniej pięć punktów pomiarowych dla całkowitej krzywej, która powinna obejmować oszacowaną masę cząsteczkową próbki. Niska wartość punktu końcowego masy cząsteczkowej krzywej wzorcowania jest oznaczana za pomocą n-heksylobenzenu lub innego odpowiedniego niepolarnego roztworu. Średnia liczbowo i średnia wagowo masa cząsteczkowa są zwykle określane za pomocą przetwarzania danych elektronicznych, w oparciu o wzory z sekcji 1.2. W przypadku gdy używana jest ręczna digitalizacji, można powołać się na ASTMD 3536-91 (3).
Krzywa rozkładu musi być dostarczona w formie tabeli lub ilustracji (różnicowa częstotliwość lub procent sumy w oparciu o logarytm M). Na wizerunku graficznym jedna dekada masy cząsteczkowej powinna mieć normalnie około 4 cm szerokości, a maksymalna wartość szczytowa około 8 cm wysokości. W przypadku krzywych całkowego rozkładu różnica w rzędnych między 0 a 100 % powinna wynosić około 10 cm.
2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
2.2.1. Substancja badana:
- dostępne informacje dotyczące substancji badanej (tożsamość, dodatki, zanieczyszczenia),
- opis przetwarzania próbki, uwagi, problemy.
2.2.2. Oprzyrządowanie:
- zbiornik z eluentem, obojętny gaz, odgazowywanie eluenta, skład eluenta, zanieczyszczenia,
- pompa, pulsowy tłumik, system wtryskowy,
- kolumny rozdzielające (wytwórca, wszystkie informacje dotyczące właściwościach kolumn, takie jak rozmiar poru, rodzaj rozdzielającego materiału itd., liczba, długość oraz kolejność użytych kolumn),
- liczba teoretycznych półek kolumny (lub połączonych kolumn), wydajność rozdzielania, (rozdzielczość tego systemu),
- informacja dotycząca symetrii pików,
- temperatura kolumny, rodzaj sterowania temperaturą,
- detektor (zasada pomiarów, rodzaj, objętość kuwety),
- przepływomierz w przypadkach, kiedy jest używany (wytwórca, zasada pomiarów),
- system umożliwiający rejestrację i przetwarzanie danych (osprzęt i oprogramowanie).
2.2.3. Kalibracja systemu:
- szczegółowy opis metody używanej w celu skonstruowania krzywej kalibracji,
- informacja dotycząca kryteriów jakościowych dla tej metody (np. współczynnik korelacji, błąd sumy kwadratów itd.),
- informacje dotyczące ekstrapolacji, założenia i przybliżenia, poczynione w trakcie procedury doświadczalnej oraz szacowania i przetwarzania danych,
- wszystkie pomiary przeprowadzone w celu konstrukcji krzywej kalibracji powinny być udokumentowane w tabelach, które zawierają następujące informacje dla każdego z punktów kalibracji:
- nazwa próbki,
- wytwórca próbki,
- wartości charakterystyczne wzorców: Mp, Mn, Mw oraz Mw/Mn, dostarczone przez wytwórcę lub na podstawie odpowiednich pomiarów, razem ze szczegółami dotyczącymi metody oznaczania,
- objętość oraz stężenie wstrzykiwanej próbki,
- wartość Mp używana dla kalibracji,
- objętość eluencyjna lub poprawiony czas retencji, mierzony przy maksimach piku,
- Mp obliczone przy maksimum piku,
- błąd procentowy wyliczonej Mp oraz wartość kalibracyjna.
2.2.4. Ocena:
- ocena na podstawie czasu: wszystkie metody mające na celu zapewnienie wymaganej odtwarzalności (metoda poprawiania, wzorce wewnętrzne itd.)
- informacja dotycząca tego, czy ocena została przeprowadzona na podstawie objętości eluencyjnej lub czasu retencji,
- informacja dotycząca ograniczeń oceny, jeżeli pik nie został poddany analizie w całości,
- opis metod wygładzających, jeżeli są wykorzystywane,
- procedury przygotowawcze oraz wstępnego przetworzenia próbki,
- obecność nierozpuszczalnych cząstek, jeżeli istnieją,
- objętość wtrysku (μl) oraz stężenie wtrysku (mg/ml),
- uwagi wskazujące skutki, które prowadzą do odchyleń od idealnego profilu GPC,
- szczegółowy opis wszystkich zmian w procedurach badawczych,
- szczegóły dotyczące zakresów błędów,
- wszystkie inne informacje oraz uwagi istotne w odniesieniu do interpretacji wyników.
3. BIBLIOGRAFIA
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tertrahydrofuran (THF) als Elution-smittel, Teil 1.
(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and MolecularWeight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
Dodatek
Przykłady innych metod określania średniej liczbowo masy cząsteczkowej (Mn) w odniesieniu do polimerów
Chromatografia żelowo-permeacyjna (GPC) jest preferowaną metodą określania Mn, w szczególności kiedy dostępny jest zestaw wzorców, których struktura jest porównywalna ze strukturą polimerów. Jednakże, w przypadku gdy istnieją trudności praktyczne w wykorzystywaniu GPC lub już istnieje przypuszczenie, że substancja nie będzie podlegała kryterium regulującym Mn (a które wymaga potwierdzenia), dostępne są metody alternatywne, takie jak:
1. Wykorzystywanie własności koligatywnych
1.1. Ebuliometria/kriometria:
obejmuje pomiar podwyższenia temperatury wrzenia (ebuliometria) lub spadku temperatury zamarzania (kriometria) rozpuszczalnika, kiedy dodany zostaje polimer. Metoda oparta jest na fakcie, że skutek rozpuszczonego polimeru na temperaturę wrzenia/zamarzania płynu zależy od masy cząsteczkowej polimeru (1) (2).
Zastosowanie: Mn < 20.000.
1.2. Zmniejszanie ciśnienia pary:
obejmuje pomiar ciśnienia pary wybranego płynu odniesienia przed i po dodaniu znanych ilości polimeru (1) (2).
Zastosowanie: Mn < 20.000 (teoretycznie; jednakże w praktyce wartości są ograniczone).
1.3. Osmometria membranowa:
opiera się na zasadzie osmozy, tzn. naturalnej skłonności cząsteczek rozpuszczalnika do przenikania przez półprzepuszczalną membranę z rozcieńczonego do stężonego roztworu aż do osiągnięcia równowagi. W trakcie badania rozcieńczony roztwór posiada zerowe stężenie polimeru, natomiast stężony roztwór zawiera polimer. Skutkiem przepuszczenia rozpuszczalnika przez membranę jest zróżnicowanie ciśnienia, które zależne jest od stężenia i masy cząsteczkowej polimeru (1) (3)(4).
Zastosowanie: Mn w zakresie 20.000-200.000.
1.4. Osmometria fazy parowania:
obejmuje porównanie wskaźnika parowania czystego rozpuszczalnika aerozolu do co najmniej trzech aerozoli zawierających polimer o różnych stężeniach (1) (5) (6).
Zastosowanie: Mn < 20.000.
2. Analiza grupy końcowej
W celu wykorzystania tej metody potrzeba wiedzy zarówno o całkowitej strukturze polimeru, jak i o charakterze łańcucha kończącego grupy końcowe (która musi być możliwa do odróżnienia od głównego szkieletu, np. przez NMR lub miareczkowanie/różniczkowanie). Oznaczenie stężenia cząsteczkowego grup końcowych obecnych w polimerze może prowadzić do wyprowadzenia wartości masy cząsteczkowej (7) (8) (9).
Zastosowanie, Mn do 50.000 (ze zmniejszającą się wiarygodnością).
3. Bibliografia
(1) Billmeyer, F.W. Jr., Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York, 1984.
(2) Glover, C.A., Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P.E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York, 1975.
(3) ASTM D 3750-79, Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania, 1979.
(4) Coll, H., Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, 1989, pp. 25-52.
(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure osmometry. In: Determinationn of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley and Sons.
(7) Schröder, E., Müller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.
(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.
(9) Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.
A19. ZAWARTOŚĆ POLIMERÓW O MAŁEJ MASIE CZĄSTECZKOWEJ
1. METODA
Niniejsza metoda chromatografii żelowo-permeacyjnej jest powtórzeniem OECD TG 119 (1996). Podstawowe zasady i dalsze informacje techniczne są podane w odniesieniach.
1.1. WPROWADZENIE
Ze względu na to, że właściwości polimerów są tak zróżnicowane, nie istnieje możliwość opisania pojedynczej metody ustalającej dokładnie warunki rozdzielenia i oceny, która obejmuje wszystkie ewentualności i właściwości pojawiające się w trakcie rozdzielania polimerów. W szczególności złożone systemy polimerów często nie ulegają często chromatografii żelowo-permeacyjnej (GPC). Jeśli GPC nie jest stosowane, masa cząsteczkowa może być ustalona za pomocą innych metod (zob. załącznik). W takich przypadkach powinny zostać podane wszystkie szczegóły i uzasadnienia dla wykorzystanych metod.
Opisana metoda oparta jest na normie DIN 55672 (1). Szczegółowe informacje dotyczące tego, w jaki sposób przeprowadzać doświadczenia oraz w jaki sposób oceniać dane, można znaleźć w niniejszej normie DIN. W przypadku gdy niezbędne są zmiany warunków doświadczeń, wspomniane zmiany muszą być uzasadnione. Inne normy mogą być wykorzystywane tylko w przypadku, gdy istnieją do nich pełne odniesienia. Opisana metoda wykorzystuje próbki polistyrenu o znanej polidyspersyjności w odniesieniu do kalibracji oraz może wystąpić konieczność jej zostać zmodyfikowania, tak aby była odpowiednia dla niektórych polimerów, np. polimerów rozpuszczalnych w wodzie i polimerów o długich rozgałęzieniach łańcucha.
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI
Mała masa cząsteczkowa jest arbitralnie określana jako masa cząsteczkowa poniżej 1.000 daltonów
Średnia liczbowo masa cząsteczkowa Mn i średnia wagowo masa cząsteczkowa Mw jest określana przy użyciu następujących równań::
gdzie:
HI = jest poziomem detektora sygnału z linii podstawowej dla objętości retencyjnej Vi,
Mi = jest masą cząsteczkową polimerowej frakcji przy objętości retencyjnej Vi, i n jest liczbą punktów pomiarowych.
Szerokość rozkładu masy cząsteczkowej, który jest miarą dyspersyjności systemu, jest podana na podstawie stosunku Mw/Mn.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Ze względu na to, że GPC jest metodą względną, musi zostać podjęta kalibracja. Zwykle do tego celu używane są wzorce polistyrenowe mało rozproszone, o linearnej budowie, posiadające średnie masy cząsteczkowe Mn i Mw oraz znany rozkład masy cząsteczkowej. Krzywa kalibracji może być wykorzystywana wyłącznie w celu określania masy cząsteczkowej nieznanej próbki, jeżeli warunki rozdzielenia próbki oraz wzorca zostały dobrane w identyczny sposób.
Ustalony związek między masą cząsteczkową oraz objętością elucji jest ważny wyłącznie w specyficznych warunkach danego doświadczenia. Warunki obejmują przede wszystkim temperaturę, rozpuszczalnik (lub mieszaninę rozpuszczalników), warunki chromatografii oraz kolumnę rozdzielającą lub systemy kolumn.
Masy cząsteczkowe próbki ustalone w ten sposób są względnymi wartościami oraz są opisane jako równoważnik mas cząsteczkowych polistyrenowych. Oznacza to, że w zależności od strukturalnych i chemicznych różnic między próbką a wzorcami, masy cząsteczkowe mogą odchylać się od wartości absolutnych w większym lub mniejszym stopniu. Jeśli wykorzystywane są inne wzorce, np. glikolu polietylenu, tlenku polietylenu, metaakrylanu polimetylu czy kwasu poliakrylowego, powinny zostać podane odpowiednie przyczyny.
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Zarówno rozkład masy cząsteczkowej próbki, jak i średnie masy cząsteczkowe (Mn, Mw) mogą być ustalane, wykorzystując GPC. GPC jest szczególnym rodzajem chromatografii cieczowej, w której próbka jest oddzielana według hydrodynamicznych wielkości pojedynczych składników (2).
Rozdzielenie następuje wówczas, gdy próbka przechodzi przez kolumnę, która jest wypełniona porowatym materiałem - jest to zazwyczaj organiczny żel. Małe cząsteczki mogą wnikać w pory, podczas gdy duże cząsteczki są wykluczane. Ścieżka dużych cząsteczek jest niniejszym krótsza i to one są najpierw poddane procesowi eluacji. Średnie cząsteczki wnikają w niektóre pory i są później poddawane eluacji. Najmniejsze cząsteczki o średnim hydrodynamicznym promieniu, mniejszym niż pory żelu, mogą wnikać we wszystkie pory. Są poddawane eluacji na końcu.
W sytuacji idealnej oddzielanie jest kontrolowane całkowicie rozmiarem odmian cząsteczkowych, ale w praktyce trudno jest uniknąć co najmniej niewielkich efektów absorbcyjnych. Nierówne wypełnienie kolumny oraz objętość martwa mogą tylko pogorszyć sytuację (2).
Na detekcję ma wpływ np. współczynnik załamania lub pochłanianie promieni UV oraz wydajności nieskomplikowanej krzywej rozkładu. Jednakże w celu przypisania rzeczywistych wartości masy cząsteczkowej do krzywej niezbędne jest poddanie kolumny kalibracji przez przepuszczanie polimerów o znanej masie cząsteczkowej oraz, w idealnym przypadku, o podobnej strukturze, np. różnych wzorców polistyrenowych. Krzywa Gaussa, powstająca zazwyczaj w ten sposób, czasami wypaczona jest małymi "ogonami" skierowanymi w stronę małych mas cząsteczkowych, oś pionowa wskazuje jakość w masie różnych wyeluowanych odmian polistyrenu, a oś pozioma wskazuje logarytm z masy cząsteczkowej.
Zawartość niskich mas cząsteczkowych jest uzyskiwana na podstawie krzywej. Obliczenia mogą być tylko wtedy dokładne, gdy odmiany o małych masach cząsteczkowych odpowiadają polimerowi jako całości.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE
Powtarzalność (względne odchylenie standardowe: RSD) objętości eluowania powinna być lepsza niż 0,3 %. Wymagana powtarzalność analizy musi być zapewniona przez korektę dokonywaną poprzez wewnętrzne wzorce, jeżeli chromatogram jest oceniany w oparciu o czas i nie odpowiada wyżej wspomnianym kryteriom (1). Polidyspersyjności są zależne od mas cząsteczkowych wzorców. W przypadku wzorców polistyrenowych typowe wartości to:
Mp < 2.000Mw/Mn < 1,20
2.000 < Mp < 106Mw/Mn < 1,05
Mp > 106Mw/Mn < 1,20
(Mp jest masą cząsteczkową wzorca w maksimum piku)
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.6.1. Przygotowanie wzorcowych roztworów polistyrenu
Wzorce polistyrenu są rozpuszczane przez ostrożne mieszanie w wybranym eluencie. Zalecenia wytwórcy muszą zostać uwzględnione w trakcie przygotowywania roztworów.
Stężenia wybranych wzorców są zależne od wielu czynników, np. od objętości injekcji, lepkości roztworu oraz czułości detektora analitycznego. Maksymalna objętość injekcji musi być dostosowana do długości kolumny, w celu uniknięcia przeładowania. Typowe objętości injekcji dla analitycznych rozdzieleń, wykorzystując GPC z kolumną o wymiarach 30 cm × 7,8 mm, wynoszą zazwyczaj 40-100 ul. Wyższe objętości są możliwe, ale nie powinny przekraczać 250 ul. Optymalny stosunek między objętością injekcji oraz stężeniem musi być określony przed rzeczywistą kalibracją kolumny.
1.6.2. Przygotowywanie roztworu próbki
Zasadniczo te same wymagania stosuje się do przygotowywania roztworów próbek. Próbka jest rozpuszczana w odpowiednim rozpuszczalniku, np. tetrahydrofuranie (THF), przez lekkie wstrząsanie. W żadnych okolicznościach nie powinno się rozpuszczać próbki w wannie ultradźwiękowej. W razie konieczności, próbka roztworu jest oczyszczana przez membranowy filtr posiadający pory o wymiarach między 0,2 i 2 µm.
Obecność nierozpuszczalnych cząstek musi być uwzględniona w sprawozdaniu końcowym, jako że może być to ważne w odniesieniu do próbek o wysokiej masie cząsteczkowej. Powinna zostać wykorzystana odpowiednia metoda w celu określenia procentu wagowego nierozpuszczonych cząstek. Roztwór musi zostać wykorzystany w ciągu 24 godzin.
1.6.3. Korekta w odniesieniu do zawartości zanieczyszczeń oraz dodatków
Zazwyczaj niezbędna jest korekta udziału zawartości odmian M < 1.000 w odniesieniu do udziału niepolimerowych szczególnych obecnych składników (np. zanieczyszczenia i/lub dodatki), chyba że zmierzona zawartość wynosi już < 1 %. Osiągane jest to przez bezpośrednią analizę roztworu polimerowego lub eluentu metodą GPC.
W przypadkach gdy eluent po przejściu przez kolumnę jest za bardzo rozcieńczony, aby można go było poddać dalszej analizie, musi zostać zagęszczony. Może okazać się niezbędne odparowanie eluentu do sucha oraz ponowne jego rozpuszczenie. Stężenie eluentu musi zostać uzyskane w warunkach, które zapewniają, że nie pojawią się żadne zmiany w eluencie. Obróbka eluentu po fazie GPC jest zależna od wykorzystanej metody analitycznej wykorzystywanej do oznaczania ilościowego.
1.6.4. Aparatura
Aparatura GPC składa się z następujących części składowych:
- zbiornik na rozpuszczalnik,
- odgazowywacz (w miarę potrzeb),
- pompa,
- nawilżacz pulsowy (w miarę potrzeb),
- system wtryskowy,
- kolumny chromatograficzne,
- detektor,
- przepływomierz (w miarę potrzeb),
- urządzenia rejestrujące dane,
- naczynie na odpady.
Musi zostać zapewnione, że system GPC będzie jest obojętny w odniesieniu do stosowanych rozpuszczalników (np. przez wykorzystanie stalowych kapilar w przypadku rozpuszczalnika THF).
1.6.5. System wtryskowy i system dostarczający rozpuszczalnik
Określona objętość roztworu próbki jest umieszczona w kolumnie albo przy użyciu automatycznego próbnika, albo ręcznie do ściśle określonej strefy. Zbyt szybkie wstrzykiwanie, jeśli jest wykonywane ręcznie, może spowodować zmiany w obserwowalnym rozkładzie masy cząsteczkowej. System dostarczający rozpuszczalnik, na ile jest to możliwe, powinien być wolny od pulsacji, co można osiągnąć poprzez wbudowanie do niego tłumika pulsacji. Prawidłowa prędkość przepływu wynosi 1 ml/min.
1.6.6. Kolumna
W zależności od próbki właściwości polimeru określa się albo za pomocą prostej kolumny, albo kilku kolumn połączonych w sekwencję. Pewna ilość materiałów porowatych kolumn o określonych właściwościach dostępna jest w ogólnej sprzedaży (np. rozmiar porów, granica ekskluzji). Wybór żelu rozdzielającego lub długość kolumny jest uzależniona zarówno od właściwości próbki (objętości hydrodynamiczne, rozkład masy cząsteczkowej), jak i od specyficznych warunków rozdzielania, takich jak rozpuszczalnik, temperatura i prędkość przepływu (1) (2) (3).
1.6.7. Półki teoretyczne
Kolumna lub połączenie kolumn wykorzystywanych do rozdzielania musi być scherakteryzowana przez ilość półek teoretycznych. Obejmuje to, w przypadku THF jako rozpuszczalnika eluencyjnego, umieszczenie roztworu etylobenzenu lub innych odpowiednich niepolarnych substancji rozpuszczonych w kolumnie o znanej długości. Liczba półek teoretycznych jest uzyskiwana na podstawie następującego równania:
gdzie:
N = jest liczbą półek teoretycznych,
Ve = jest objętością eluencyjną w maksimum piku,
W = jest wyjściową szerokością piku,
W1/2 = jest szerokością piku w połowie wysokości.
1.6.8. Wydajność rozdzielania
Oprócz liczby półek teoretycznych, która jest określającą ilościowo szerokością pasma, ważną rolę odgrywa także wydajność rozdzielenia, będąca określana przez nachylenie krzywej kalibracyjnej. Wydajność rozdzielania kolumny jest uzyskiwana z następującego stosunku:
gdzie:
Ve, Mx = jest objętością eluencyjną dla polistyrenu o masie cząsteczkowej Mx,
Ve, (10.Mx) = jest objętością eluencyjną dla polistyrenu o 10-krotnie większej masie cząsteczkowej.
Rozdzielczość systemu jest zwykle określana w następujący sposób:
gdzie:
Ve1, Ve2 = są objętościami eluencyjnymi dwóch wzorców polistyrenowych w maksimum piku;
W1, W2 = są największymi szerokościami piku w lini podstawowej;
M1, M2 = są masami cząsteczkowymi przy maksimum piku (powinny różnić się współczynnikiem o 10).
Wartość R w odniesieni do systemu kolumn powinna być wyższa niż 1,7 (4).
1.6.9. Rozpuszczalniki
Wszystkie rozpuszczalniki muszą posiadać wysoką czystość (dla THF używana jest czystość 99,5 %). Zbiornik na rozpuszczalnik (o ile jest to konieczne - w atmosferze gazu obojętnego) musi być odpowiednio duży dla kalibracji kolumny i analiz wielu próbek. Rozpuszczalnik musi być odgazowany zanim zostanie przeniesiony do kolumny za pomocą pompy.
1.6.10. Kontrola temperatury
Temperatura krytycznych komponentów wewnętrznych (pętla wtryskowa, kolumny, detektor i przewody) powinna być stała i zgodna z wyborem rozpuszczalnika.
1.6.11. Detektor
Zadaniem detektora jest rejestracja ilościowa stężenia próbki eluowanej z kolumny. W celu uniknięcia niepotrzebnego poszerzenia pików objętość kuwety komórki detektora musi być tak mała, jak to tylko jest możliwe. Nie powinna być większa niż 10 ul, z wyjątkiem detektorów mierzących światło rozproszone oraz
lepkość. W celu detekcji zazwyczaj używana jest refraktometria różnicowa. Jednakże jeżeli wymagają tego właściwości próbki lub właściwości eluacyjne rozpuszczalnika, mogą być używane inne rodzaje detektora, np. UV/VIS, IR, detektory lepkości itd.
2. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDAŃ
2.1. DANE
Powinno nastąpić odniesienie do normy DIN (1) w celu uzyskania szczegółowych kryteriów oceny, jak również do wymogów odnoszących się do zbierania i przetwarzania danych.
Dla każdej próbki muszą zostać przeprowadzone dwa niezależne doświadczenia. Próbki muszą być analizowane pojedynczo. We wszystkich przypadkach zasadnicze jest ustalenie danych również z prób ślepych, poddawanych przetworzeniu w takich samych warunkach co próbka.
Niezbędne jest wyraźne wskazanie, że zmierzone wartości są wartościami względnymi, równoważnymi masom cząsteczkowym użytych wzorców.
Po określeniu objętości retencji lub czasów retencji (możliwie poprawionych wykorzystując wzorzec wewnętrzny) wartości logarytmu Mp (Mp będącego maksymalną wartością piku wzorca kalibracji) są wykreślane w oparciu o jedną z tych wielkości. Niezbędne są co najmniej dwa punkty kalibracji na dekadę masy cząsteczkowej oraz wymagane jest co najmniej pięć punktów pomiarowych dla całkowitej krzywej, która powinna obejmować oszacowaną masę cząsteczkową próbki. Niska wartość punktu końcowego masy cząsteczkowej krzywej wzorcowania jest określana za pomocą n-heksylobenzenu lub innego odpowiedniego niepolarnego roztworu. Część krzywej odpowiadająca masom cząsteczkowym poniżej 1.000 jest ustalana i korygowana w razie konieczności w odniesieniu do zanieczyszczeń oraz dodatków. Krzywe eluacji są zazwyczaj oceniane za pomocą elektronicznego przetwarzania danych W przypadku gdy używana jest ręczna digitalizacja, można powołać się na ASTMD 3536-91 (3).
Jeśli jakikolwiek nierozpuszczalny polimer jest zachowany w kolumnie, jego masa cząsteczkowa może być wyższa niż masa cząsteczkowa frakcji rozpuszczalnej, a jeśli nie jest brana pod uwagę może skutkować nadmiernym oszacowaniem zawartości niskiej masy cząsteczkowej. Wskazówki w odniesieniu do korygowania zawartości niskiej masy cząsteczkowej w odniesieniu do nierozpuszczalnego polimeru są przewidziane w załączniku.
Krzywa rozkładu musi być przewidziana w formie tabeli lub ilustracji (różnicowa częstotliwość lub procent sumy w oparciu o logarytm M). Na wizerunku graficznym jedna dekada masy cząsteczkowej powinna mieć normalnie około 4 cm szerokości, a maksymalna wartość szczytowa około 8 cm wysokości. W przypadku krzywych całkowego rozkładu różnica w rzędnych między 0 a 100 % powinna wynosić około 10 cm.
2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
2.2.1. Substancja badana:
- dostępne informacje dotyczące badanej substancji (tożsamość, dodatki, zanieczyszczenia),
- opis przetwarzania próbki, uwagi, problemy.
2.2.2. Oprzyrządowanie:
- zbiornik z eluentem, obojętny gaz, odgazowywanie eluentu, skład eluentu, zanieczyszczenia,
- pompa, pulsowy tłumik, system wtryskowy,
- kolumny rozdzielające (wytwórca, wszystkie informacje dotyczące właściwości kolumn, takie jak rozmiar poru, rodzaj rozdzielającego materiału itd., liczba, długość oraz kolejność użytych kolumn),
- liczba półek teoretycznych kolumny (lub połączonych), wydajność rozdzielania, (rozdzielczość systemu),
- informacja dotycząca symetrii pików,
- temperatura kolumny, rodzaj sterowania temperaturą,
- detektor (zasada pomiarów, rodzaj, objętość kuwetowa),
- przepływomierz w przypadkach, gdy jest używany (wytwórca, zasada pomiarów),
- system umożliwiający rejestrację i przetwarzanie danych (osprzęt i oprogramowanie).
2.2.3. Kalibracja systemu
- szczegółowy opis metody używanej do przygotowania krzywej kalibracji,
- informacja dotycząca kryteriów jakościowych dla niniejszej metody (np. współczynnik korelacji, błąd sumy kwadratów itd.),
- informacja dotycząca ekstrapolacji, założenia i przybliżenia poczynione w trakcie procedury doświadczalnej oraz oszacowanie i przetwarzanie danych,
- wszystkie pomiary przeprowadzone w celu przygotowania krzywej kalibracji powinny być udokumentowane w tabelach, które zawierają następujące informacje dla każdego punktu kalibracji:
- nazwa próbki,
- producent próbki,
- właściwości wartości wzorców Mp, Mn, Mw oraz Mw/Mn, jak przewidziano przez wytwórcę lub uzyskane na podstawie kolejnych pomiarów, razem ze szczegółami dotyczącymi metody wyznaczania,
- objętość wtrysku oraz stężenie wtrysku,
- wartość Mp używanej dla kalibracji,
- objętość eluencyjna lub poprawiony czas retencji, mierzony przy maksimach piku,
- Mp obliczone przy maksimum piku,
- błąd procentowy wyliczonej Mp oraz wartość kalibracji.
2.2.4. Informacja dotycząca zawartości polimerów o niskiej masie cząsteczkowej:
- opis metod stosowanych w analizach i sposobie, w jaki przeprowadzone zostały doświadczenia,
- informacja dotycząca zawartości procentowej frakcji o małej masie cząsteczkowej w odniesieniu do masy całkowitej próbki,
- informacja dotycząca zanieczyszczeń, dodatków i innych niepolimerowych składnikach w procentach w odniesieniu do masy całkowitej próbki.
2.2.5. Ocena:
- ocena na podstawie czasu: wszystkie metody mające na celu zapewnienie wymaganej odtwarzalności (metoda poprawiania, wzorce wewnętrzne itd.),
- informacja dotycząca tego, czy ocena została przeprowadzona na podstawie objętości eluencyjnej lub czasu retencji,
- informacja dotycząca ograniczeń oceny, jeżeli pik nie został poddany analizie w całości,
- opis metod wygładzających, jeżeli są wykorzystywane,
- procedury przygotowawcze oraz wstępnego przetworzenia próbki,
- obecność nierozpuszczalnych cząstek, jeżeli istnieją,
- objętość wtrysku (μl) oraz stężenie wtrysku (mg/ml),
- uwagi wskazujące skutki, które prowadzą do odchyleń od idealnego profilu GPC,
- szczegółowy opis wszystkich zmian w procedurach badawczych,
- szczegóły dotyczące zakresów błędów,
- wszystkie inne informacje oraz uwagi istotne w odniesieniu do interpretacji wyników.
3. BIBLIOGRAFIA
(1) DIN 55672 (1995) Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.
(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
Załącznik
Wytyczne dotyczące korygowania zawartości związków o niskiej masie cząsteczkowej w odniesieniu do obecności nierozpuszczalnych polimerów
Jeśli w próbce obecny jest nierozpuszczalny polimer, skutkiem tego jest utrata masy podczas analizy GPC. Nierozpuszczalny polimer pozostaje nieodwracalnie w kolumnie lub na filtrze próbkowym, podczas gdy rozpuszczalna część próbki przechodzi przez kolumnę. W przypadku gdy inkrement współczynnika załamania światła (dn/dc) polimeru może zostać oszacowany lub zmierzony, można oszacować utratę masy próbki na kolumnie. W takim przypadku przeprowadza się korektę, wykorzystując zewnętrzną kalibrację wzorcowymi materiałami o znanym stężeniu oraz dn/dc w celu kalibracji reakcji refraktometru. W poniższym przykładzie wykorzystywany jest wzorzec metaakrylanu polimetylu (pMMA).
W zewnętrznej kalibracji, w celu analizy akrylowych polimerów, wzorzec pMMA, o znanym stężeniu w tetrahydrofuranie, jest analizowany przez GPC, a otrzymane dane są wykorzystywane w celu znalezienia stałej refraktometru zgodnie ze wzorem:
K = R/(C × V × dn/dc)
gdzie:
K = stała refraktometru (w mikrowoltosekundach/ml),
R = wskaźnik wzorca pMMA (w mikrowoltosekundach),
C = stężenie wzorca pMMA (w mg/ml),
V = objętość dozowana (w ml), oraz
dn/dc = inkrement współczynnika załamania światła dla pMMA w tetrahydrofuranie (w ml/mg)
Następujące dane są typowe dla wzorca pMMA:
R = 2937 891 C = 1,07 mg/ml
V = 0,1 ml
dn/dc = 9 × 10-5 ml/mg
Uzyskana wartość K, 3,05 × 1011, jest następnie wykorzystywana w celu obliczania teoretycznej reakcji detektora, jeżeli 100 % wtryśniętego polimeru eluowało przez detektor.
A.20. ZACHOWANIE POLIMERÓW W WODZIE - ROZPUSZCZANIE/EKSTRAKCJA
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania lub inne metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 1.
A.21. WŁAŚCIWOŚCI UTLENIAJĄCE (CIECZE)
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania lub inne metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 1.
A.22. WAŻONA DŁUGOŚCIĄ ŚREDNIA GEOMETRYCZNA ŚREDNICA WŁÓKIEN
1. METODA
1.1. WSTĘP
W opisie metody przedstawiono procedurę stosowaną do określenia ważonej długością średniej geometrycznej średnicy włókna (LWGMD) sztucznych włókien mineralnych luzem (MMMF). Ponieważ LWGMD populacji z prawdopodobieństwem 95 % znajdzie się między dwoma 95 % poziomami ufności (LWGMD ± dwa błędy standardowe) próby, wartością przedstawianą (wartością testową) będzie niższy przedział ufności próby (tj. LWGMD - 2 błędy standardowe). Metoda opiera się na aktualizowanej (czerwiec 1994) wstępnej wersji procedury HSE w przemyśle, uzgodnionej na spotkaniu ECFIA z HSE w Chester 26.09.1993 i opracowanej dla i na podstawie wyników drugiego testu międzylaboratoryjnego (1, 2). Ta metoda pomiaru może być stosowana do charakteryzowania średnicy włókien substancji luzem lub produktów zawierających MMMF, w tym ogniotrwałych włókien ceramicznych (RCF), sztucznych włókien szklistych (MMVF), włókien krystalicznych i polikrystalicznych.
Ważenie długością jest sposobem kompensowania efektu rozkładu średnicy włókien, spowodowanego łamaniem się długich włókien w czasie pobierania próbek lub manipulowania materiałem. Do pomiaru rozkładu średnic MMMF stosuje się parametry statystyczne (średnia geometryczna), ponieważ średnice te mają zwykle rozkład wielkości zbliżony do lognormalnego.
Pomiar długości, a także średnicy, jest żmudny i czasochłonny, ale jeśli mierzone są tylko te włókna, które dotykają nieskończenie cienkiej linii w polu widzenia skaningowego mikroskopu elektronowego, to prawdopodobieństwo wybrania danego włókna jest proporcjonalne do jego długości. Ponieważ w obliczeniach ważonych długością uwzględniona jest długość, to jedyną wymaganą miarą jest średnica i LWGMD-2SE może być obliczana, jak opisano.
1.2. DEFINICJE
Cząstka: obiekt o stosunku długości do szerokości mniejszym niż 3:1.
Włókno: obiekt o stosunku długości do szerokości (wydłużenie) co najmniej 3:1.
1.3. ZAKRES I OGRANICZENIA
Metoda ta została opracowana w celu obserwacji rozkładu średnic, które charakteryzują się medianą od 0,5 μm do 6 μm. Większe średnice mogą być mierzone przy zastosowaniu mniejszego powiększenia mikroskopu, ale zastosowanie metody jest coraz bardziej ograniczone w miarę zmniejszania się włókien i dla mediany średnic poniżej 0,5 μm zaleca się stosowanie TEM (transmisyjny mikroskop elektronowy).
1.4. ZASADA METODY TESTOWEJ
Z włókniny lub włókien luzem pobierana jest pewna liczna reprezentatywnych próbek rdzeniowych. W procedurze kruszenia zmniejsza się długość włókien luzem i reprezentatywna podpróbka jest rozprowadzana w wodzie. Alikwoty są ekstrahowane i filtrowane przez filtry poliwęglanowe o otworach 0,2 μm i przygotowywane do badań przy zastosowaniu techniki skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Średnice włókien są mierzone przy powiększeniu × 10.000 lub większym(1) przy zastosowaniu metody przecięcia linii, aby otrzymać nieprzekłamaną szacunkową wielkość średnicy. Obliczany jest niższy 95 % przedział ufności (na podstawie testu jednostronnego) w celu uzyskania szacunkowej najniższej wartości średniej geometrycznej średnicy włókien materiału.
1.5. OPIS METODY TESTOWEJ
1.5.1. Bezpieczeństwo/środki ostrożności
Należy ograniczać kontakt z zawieszonymi w powietrzu włóknami i przy manipulowaniu suchymi włóknami należy stosować wyciąg lub komorę rękawicową. Należy przeprowadzać okresowy monitoring ekspozycji w celu określenia skuteczności zastosowanych metod zabezpieczenia. Przy pracy z MMMF należy używać rękawic jednorazowych, aby zmniejszyć podrażnienie skóry i zapobiec skażeniu krzyżowemu.
1.5.2. Aparatura/sprzęt
- Prasa (o nacisku co najmniej 10 MPa) i formy,
- poliwęglanowy filtr o porach kapilarnych średnicy 0,2 μm (średnica filtra 25 mm),
- celulozowy filtr membranowy stosowany jako filtr wstępny,
- szklana aparatura filtracyjna (lub jednorazowe systemy filtracyjne) do umocowania filtrów (np. szklany zestaw do mikroanalizy Millipore, typ nr XX10.025 00),
- świeżo destylowana woda, która została przefiltrowana przez filtr o średnicy porów 0,2 μm w celu usunięcia mikroorganizmów,
- napylarka do napylania złotem lub złotem/palladem,
- skaningowy mikroskop elektronowy o rozdzielczości do 10 nm i mogący pracować przy powiększeniu × 10.000,
- dodatkowe: szpatułki, ostrza skalpeli typ 24, pincety, rurki SEM, klej węglowy lub węglowa taśma klejąca, srebro koloidalne,
- sonda ultradźwiękowa lub podręczna myjka ultradźwiękowa,
- urządzenie do pobierania próbek rdzeniowych lub korkociąg do pobierania próbek rdzeniowych z włókniny MMMF.
1.5.3. Procedura testowa
1.5.3.1. Pobieranie próbek
W przypadku włókniny i płatów materiału do pobierania prób przekroju stosuje się 25 mm urządzenie do pobierania prób rdzeniowych lub korkociąg. Próbki powinny być pobierane z miejsc rozmieszczonych równomiernie na całej szerokości włókniny, jeśli ma ona niewielką długość lub miejsc losowych w przypadku długich płatów włókniny. Te same urządzenia mogą być używane do pobierania losowych próbek z włókien luzem. Jeśli to możliwe należy pobierać sześć próbek, aby uwzględnić zróżnicowanie przestrzenne materiału luzem.
Sześć próbek rdzeniowych należy pokruszyć w formie o średnicy 50 mm, stosując nacisk 10 MPa. Materiał mieszany jest szpatułką i powtórnie prasowany przy zastosowaniu nacisku 10 MPa. Materiał następnie wyjmuje się z formy i umieszcza w szczelnej szklanej butelce.
1.5.3.2. Przygotowanie próby
Jeśli to konieczne, można usunąć organiczny środek wiążący przez umieszczenie włókien na około 1 godzinę w piecu o temperaturze 450 °C.
Próby podzielić przez stożkowanie i ćwiartkowanie (należy to zrobić w komorze odpylającej).
Szpatułką dodać niewielką ilość (< 0,5 g) próbki do 100 ml świeżo destylowanej wody, która została przefiltrowana przez filtr membranowy 0,2 μm (można użyć alternatywnych źródeł ultraczystej wody, jeśli wykazano, że są zadowalającej jakości). Rozprowadzić dokładnie sondą ultradźwiękową przy mocy roboczej 100 W, ustawionej tak, aby zachodziła kawitacja. (Jeśli nie ma sondy zastosować następującą metodę: wytrząsać wielokrotnie i odwrócić na 30 sekund; umieścić w myjce ultradźwiękowej na pięć minut; następnie wielokrotnie wytrząsać i odwrócić ponownie na 30 sekund).
Natychmiast po rozproszeniu włókien pobrać kilka alikwot (np. trzy alikwoty 3, 6 i 10 ml) przy użyciu szerokiej pipety (pojemności 2-5 ml).
Każdą alikwotę przefiltrować próżniowo przez 0,2 μm filtr poliwęglanowy z dodatkowym filtrem wstępnym MEC o średnicy porów 5 µm, stosując 25 mm szklany lejek z cylindrycznym zbiornikiem. Do lejka należy wlać 5 ml przefiltrowanej wody destylowanej, a alikwotę należy wolno pipetować do wody, przy czym jej końcówka powinna znajdować się poniżej menisku. Po pipetowaniu należy dokładnie spłukać pipetę i zbiorniczek, ponieważ cienkie włókna często zalegają na powierzchni.
Uważnie wyjąć filtr i przed umieszczeniem w naczyniu do suszenia oddzielić go od dodatkowego filtra.
Odciąć ćwiartkę lub połowę przekroju filtru przefiltrowanego osadu ostrzem skalpela typu 24, stosując ruch wahadłowy. Ostrożnie przymocować odcięty przekrój do stolika SEM, stosując klej węglowy lub węglową taśmę klejącą. Srebro koloidalne należy nałożyć przynajmniej w trzech miejscach, aby zapewnić lepszy kontakt elektryczny na krawędziach filtra i stolika. Po wyschnięciu kleju/srebra koloidalnego napylić ok. 50 nm warstwę złota lub złota/palladu na powierzchnię osadu.
1.5.3.3. Kalibracja i obsługa SEM
1.5.3.3.1. Kalibracja
Kalibracja SEM powinna być sprawdzana przynajmniej raz w tygodniu (najlepiej codziennie) przy użyciu certyfikowanej siatki kalibracyjnej. Kalibracja powinna być porównywana z certyfikowanym wzorcem i jeśli zmierzona wartość (SEM) nie mieści się w granicach ± 2 % wartości wzorcowej, należy przeprowadzić kalibrację SEM i powtórzyć kontrolę.
Mikroskop SEM powinien mieć rozdzielczość wystarczającą co najmniej do zidentyfikowania widzialnej średnicy 0,2 µm przy użyciu prawdziwego materiału próbki przy powiększeniu × 2.000.
1.5.3.3.2. Obsługa
SEM powinien działać przy powiększeniu 10.000 razy(2) w warunkach, które zapewniają dobrą rozdzielczość, przy możliwej do przyjęcia jakości obrazu i przy niskiej prędkości skanowania, na przykład 5 sekund na obraz. Wprawdzie wymagania operacyjne mogą się różnić w przypadku poszczególnych SEM, ale generalnie, aby otrzymać najlepszą widzialność i rozdzielczość z materiałami o stosunkowo niskiej masie atomowej powinno się stosować napięcia przyspieszające 5-10 keV, przy stosunkowo małej średnicy plamki i niewielkiej odległości roboczej. Ponieważ przeprowadzane jest przesuwanie liniowe, należy zastosować pochylenie 0°, aby zminimalizować konieczność ponownego ustawienia ogniskowej lub, jeśli SEM wyposażony jest w stolik eucentryczny, należy zastosować eucentryczną odległość roboczą. Mniejsze powiększenia można stosować, jeśli materiał nie zawiera małych (pod względem średnicy) włókien i wszystkie średnice włókien są > 5 μm.
1.5.3.4. Rozmiary
1.5.3.4.1. Badanie przy małym powiększeniu, aby ocenić próbkę
Najpierw należy obejrzeć próbkę przy małym powiększeniu, aby sprawdzić, czy występują skupienia dużych włókien i ocenić gęstość włókien. W przypadku nadmiernej grudkowatości zaleca się przygotowanie nowej próbki.
Aby zapewnić statystyczną dokładność konieczne jest zmierzenie minimalnej liczby włókien, a wysoka gęstość włókien może zostać uznana za przydatną właściwość, ponieważ badanie pustych pól jest czasochłonne i niewiele wnosi do analizy. Jeśli jednak filtr jest przeładowany, dokonanie pomiaru wszystkich możliwych do zmierzenia włókien staje się trudne, a ponieważ małe włókna mogą być zasłaniane przez większe, można je przeoczyć.
Tendencja do popełniania błędu przeszacowania LWGMD może wynikać z gęstości włókien powyżej 150 włókien na milimetr liniowego przesunięcia. Z drugiej strony niskie zagęszczenie włókien wydłuża czas analizy i często przygotowanie próbki z zagęszczeniem włókien bliższym optimum jest bardziej ekonomiczne niż poleganie na zliczeniach na filtrach o niskim zagęszczeniu. Przy optymalnym zagęszczeniu, na pole widzenia przy powiększeniu 5.000 razy powinno przypadać średnio jedno lub dwa policzalne włókna. Optymalne zagęszczenie zależy jednak od wielkości (średnicy) włókien, tak więc konieczne jest, aby operator korzystał ze specjalistycznych ocen, które pozwolą mu stwierdzić czy zagęszczenie włókien jest bliskie optymalnemu czy nie.
1.5.3.4.2. Ważenie długością średnic włókien
Liczone są tylko te włókna, które dotykają (lub przecinają) (nieskończenie) cienkiej linii na ekranie SEM. Z tego powodu przez środek ekranu przebiega pozioma (lub pionowa) linia.
Alternatywną możliwością jest umieszczenie jednego punktu na środku ekranu i stałe skanowanie przez filtr w jednym kierunku. Średnica każdego włókna o współczynniku smukłości większym niż 3:1 i dotykającym tego punktu lub go przecinającym jest mierzona, a wyniki są rejestrowane.
1.5.3.4.3. Wyznaczanie wielkości włókien
Zaleca się, aby zmierzyć co najmniej 300 włókien. Każde włókno mierzone jest tylko raz w punkcie przecięcia z linią lub punktem narysowanym na obrazie (lub blisko punktu przecięcia, jeśli brzegi włókna są niewyraźne). Jeśli napotyka się włókna o niejednorodnym przekroju, należy stosować miarę mówiącą o średniej średnicy włókna. Należy zachować ostrożność przy wyznaczaniu krawędzi i mierzeniu najmniejszej odległości między brzegami włókien. Pomiary mogą być przeprowadzane on-line lub off-line na zapisanych obrazach lub fotografiach. Zaleca się stosowanie półautomatycznych systemów pomiarów obrazu, które ładują dane bezpośrednio do arkusza kalkulacyjnego, ponieważ oszczędzają one czas, eliminują błędy transkrypcji, a obliczenia mogą być zautomatyzowane.
Końce długich włókien powinny być sprawdzane przy małych powiększeniach, aby upewnić się, że włókna te nie zwijają się z powrotem, nie wracają do pola widzenia i że są mierzone tylko raz.
2. DANE
2.1. POSTĘPOWANIE Z WYNIKAMI
Zwykle średnice włókien nie odbiegają od rozkładu normalnego. Dokonując jednak przekształcenia logarytmicznego, możliwe jest uzyskanie rozkładu, który w przybliżeniu odpowiada normalnemu.
Obliczyć średnią arytmetyczną (średnia lnD) i odchylenie standardowe (SDlnD) wartości logarytmu logarytmu naturalnego (lnD) średnic n włókien (D).
(1)
(2)
Odchylenie standardowe dzieli się przez pierwiastek kwadratowy liczby pomiarów (n) w celu obliczenia błędu standardowego (SElnD).
(3)
Odjąć dwa błędy standardowe od średniej i obliczyć wykładnik dla tej wartości (średnia minus dwa błędy standardowe), aby otrzymać średnią geometryczną minus dwa błędy standardowe.
(4)
3. RAPORTOWANIE
RAPORT Z TESTU
Raport z przeprowadzonego testu musi zawierać przynajmniej następujące informacje:
- wartość LWGMD-2SE,
- wszelkie odstępstwa od procedury, a w szczególności te, które mogą mieć wpływ na precyzję lub dokładność wyników, z odpowiednimi wyjaśnieniami.
4. LITERATURA
(1) B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 1999.
(2) G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weighted geometric mean fibre diameter: Results of the Second interlaboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994.
______
(1) Ta skala powiększenia jest wskazana dla włókien 3 µm, dla włókien 6 µm właściwsze może być powiększenie × 5.000.
(2) W przypadku włókien 3 μm zob. poprzedni przypis.
A.23. WSPÓŁCZYNNIK PODZIAŁU (1-OKTANOL/WODA): METODA POWOLNEGO MIESZANIA
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD nr 123 (2006). Wartości współczynnika podziału 1-oktanol/woda (POW) aż do log POW = 8,2 wyznaczono w sposób dokładny za pomocą metody powolnego mieszania (1). Jest to zatem podejście eksperymentalne odpowiednie do bezpośredniego wyznaczania POW dla silnie hydrofobowych substancji.
2. Inne metody wyznaczania współczynnika podziału 1-oktanol/woda (POW) to metoda wytrząsania w kolbie (2) oraz wyznaczanie POW za pomocą badania retencji w wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconymi fazami (3). Metoda wytrząsania w kolbie jest podatna na artefakty związane z przechodzeniem mikro-kropelek oktanolu do fazy wodnej. W miarę wzrostu POW obecność tych kropelek w fazie wodnej prowadzi do coraz większego przeszacowywania stężenia substancji badanej w wodzie. Zastosowanie metody jest zatem ograniczone do substancji o log POW < 4. Druga metoda oparta jest na wiarygodnych, bezpośrednio wyznaczonych wartościach POW, które służą do kalibracji zależności pomiędzy retencją w HPLC a mierzonymi wartościami POW. Dostępny był projekt wytycznych OECD w sprawie wyznaczania współczynników podziału 1-oktanol/woda dla substancji podatnych na dysocjację (4), ale nie należy już z nich korzystać.
3. Niniejszą metodę badawczą opracowano w Niderlandach. Precyzja opisanej tutaj metody została zwalidowana i zoptymalizowana w międzylaboratoryjnym badaniu walidacyjnym, w którym brało udział 15 laboratoriów (5).
ZAŁOŻENIA WSTĘPNE
Znaczenie i zastosowanie
4. Wykazano, że dla obojętnych substancji organicznych występuje bardzo istotna zależność pomiędzy współczynnikiem podziału 1-oktanol/woda (POW) a ich bioakumulacją w rybach. Wykazano ponadto, że POW jest skorelowany z toksycznością dla ryb, jak również z sorpcją substancji chemicznych przez ciała stałe takie jak gleby i osady. Wyczerpujący przegląd tych zależności znajduje się w pozycji literaturowej (6).
5. Określono wiele różnorodnych zależności pomiędzy współczynnikiem podziału 1-oktanol/woda a innymi właściwościami substancji mającymi znaczenie dla toksykologii i chemii środowiska. W rezultacie współczynnik podziału 1-oktanol/woda stał się kluczowym parametrem w szacowaniu ryzyka stosowania chemikaliów dla środowiska, jak również w przewidywaniu losów chemikaliów w środowisku.
Zakres
6. Doświadczenie oparte na powolnym mieszaniu w założeniach ma na celu ograniczenie tworzenia mikrokropelek 1-oktanolu w fazie wodnej. W rezultacie nie dochodzi do przeszacowania stężenia w roztworze wodnym będącego skutkiem obecności cząsteczek substancji badanej w takich kropelkach. Metoda powolnego mieszania nadaje się zatem szczególnie do wyznaczania POW dla substancji, dla których oczekiwana wartość log POW wynosi 5 i więcej i dla których metoda wytrząsania w kolbie (2) może dawać błędne wyniki.
DEFINICJA I JEDNOSTKI
7. Współczynnik podziału substancji między wodę a rozpuszczalnik lipofilowy (1-oktanol) jest miarą podziału w stanie równowagi danej substancji między dwie fazy. Współczynnik podziału między wodę a 1-oktanol (POW) definiuje się jako stosunek stężeń w stanie równowagi substancji badanej w 1-oktanolu nasyconym wodą (CO) i w wodzie nasyconej 1-oktanolem (CW).
POW = CO/CW
Jako stosunek stężeń jest to wielkość bezwymiarowa. Najczęściej podawana jest w formie logarytmu dziesiętnego (log POW). Współczynnik POW zależy od temperatury i podawane dane powinny obejmować temperaturę pomiaru.
ZASADA METODY
8. Aby wyznaczyć współczynnik podziału, ustala się stan równowagi dla wody, 1-oktanolu i substancji badanej zmieszanych ze sobą w stałej temperaturze. Następnie wyznacza się stężenia substancji badanej w obu fazach.
9. W proponowanym tutaj doświadczeniu metodą powolnego mieszania można ograniczyć problemy związane z tworzeniem mikrokropelek w doświadczeniu metodą wytrząsania w kolbie. W doświadczeniu metodą powolnego mieszania stan równowagi dla wody, 1-oktanolu i substancji badanej ustala się w reaktorze z termostatem, w którym zachodzi mieszanie. Przyspiesza ono wymianę pomiędzy fazami. Mieszanie wprowadza niewielkie turbulencje zwiększające stopień wymiany między 1-oktanolem a wodą bez tworzenia mikrokropelek (1).
ZAKRES ZASTOSOWANIA METODY BADANIA
10. Ponieważ na współczynnik aktywności substancji badanej może wpłynąć obecność innych substancji, należy badać substancję w formie czystej. Do wyznaczania współczynnika podziału 1-oktanol/woda należy użyć substancji o największym stopniu czystości, jaka jest dostępna w handlu.
11. Niniejsza metoda ma zastosowanie do substancji czystych, które nie ulegają dysocjacji ani asocjacji i nie wykazują znaczącej aktywności na granicy faz. Metodę można stosować do wyznaczania współczynnika podziału 1-oktanol/woda takich substancji oraz mieszanin. W przypadku stosowania tej metody do mieszanin wyznaczone współczynniki podziału 1-oktanol/woda są warunkowe i zależą od składu chemicznego badanej mieszaniny oraz od składu elektrolitowego fazy wodnej. Metodę można również zastosować, pod warunkiem podjęcia dodatkowych kroków, do związków dysocjujących lub asocjujących (pkt 12).
12. Ponieważ przy podziale substancji dysocjujących, takich jak kwasy organiczne i fenole oraz zasady organiczne i związki metaloorganiczne, w wodzie i 1-oktanolu występuje wiele stanów równowagi, współczynnik podziału 1-oktanol/woda jest w takich przypadkach stałą warunkową, której wartość jest silnie zależna od składu elektrolitowego (7) (8). Wyznaczenie współczynnika podziału 1-oktanol/woda wymaga zatem kontrolowania i podania w sprawozdaniu wartości pH oraz składu elektrolitowego podczas doświadczenia. Do oceny tych współczynników podziału wymagana jest specjalistyczna wiedza. Na podstawie stałej (stałych) dysocjacji należy wybrać odpowiednie wartości pH, takie, aby wyznaczyć współczynnik podziału dla każdego stopnia jonizacji. Przy badaniu związków metaloorganicznych wymagane jest stosowanie takich substancji buforowych, które nie tworzą kompleksów (8). Należy dobrać warunki doświadczenia, uwzględniając aktualny stan wiedzy na temat chemii roztworów wodnych (stałych trwałości kompleksów, stałych dysocjacji), w taki sposób, aby można było oszacować specjację chemiczną substancji badanej w fazie wodnej. Należy zapewnić identyczną moc jonową we wszystkich doświadczeniach poprzez zastosowanie elektrolitu podstawowego.
13. Przy badaniu substancji o bardzo małej rozpuszczalności w wodzie lub wysokim POW mogą pojawić się problemy w związku ze stężeniami substancji w wodzie tak niskimi, że ich dokładne oznaczenie będzie trudne. Niniejsza metoda badawcza obejmuje wytyczne w zakresie rozwiązywania tego problemu.
INFORMACJE NA TEMAT SUBSTANCJI BADANEJ
14. Należy stosować odczynniki czyste do analizy lub o wyższej klasie czystości. Zaleca się stosowanie nieznakowanych substancji badanych o znanym składzie chemicznym i preferowanej czystości co najmniej 99 % lub znakowanych izotopowo substancji badanych o znanym składzie chemicznym i czystości radiochemicznej. W przypadku użycia znacznika o krótkim czasie połowicznego rozpadu należy zastosować poprawki na rozpad. W przypadku substancji badanych znakowanych izotopowo należy zastosować specyficzną chemicznie metodę analityczną w celu zagwarantowania, że mierzona promieniotwórczość jest bezpośrednio związana z substancją badaną.
15. Oszacowanie log POW można uzyskać za pomocą dostępnego w handlu oprogramowania do szacowania log POW lub też przy pomocy stosunku rozpuszczalności w obu rozpuszczalnikach.
16. Przed wyznaczeniem POW metodą powolnego mieszania powinny być znane następujące informacje na temat substancji badanej:
a) wzór strukturalny;
b) metody analityczne odpowiednie do oznaczenia stężenia danej sunstancji w wodzie i w 1-oktanolu;
c) stała (stałe) dysocjacji substancji podatnych na dysocjację (wytyczna OECD nr 112 (9));
d) rozpuszczalność w wodzie (10);
e) hydroliza abiotyczna (11);
f) szybka biodegradowalność (12);
g) prężność pary (13).
OPIS METODY
Wyposażenie i przyrząd
17. Wymagane jest standardowe wyposażenie laboratoryjne, w szczególności następujące sprzęty:
- mieszadła magnetyczne i pokryte teflonem mieszadła magnetyczne służące do mieszania fazy wodnej,
- instrumenty analityczne odpowiednie do oznaczania stężenia substancji badanej na oczekiwanych poziomach stężenia,
- naczynie do mieszania z zaworem w dolnej części. W zależności od oszacowania log POW i granicy wykrywalności (LOD) związku badanego należy rozważyć zastosowanie naczynia reakcyjnego o takiej samej geometrii i pojemności większej niż litr, tak aby można było uzyskać wystarczającą objętość wody do celów ekstrakcji i analizy chemicznej. Dzięki temu uzyskane zostanie wyższe stężenie w wyciągu wodnym i oznaczenie analityczne będzie bardziej wiarygodne. Tabela z podanymi oszacowaniami minimalnej potrzebnej objętości, LOD dla danego związku, szacowanej dla niego wartości log POW oraz rozpuszczalności w wodzie znajduje się w dodatku 1. Dane w tabeli podano na podstawie zależności pomiędzy log POW a stosunkiem rozpuszczalności w oktanolu i wodzie zgodnie z publikacją Pinsuwan et al. (14):
log POW = 0,88 log SR + 0,41
gdzie:
SR = Soct/Sw (wyrażone jako stężenia molowe);
oraz podanej przez Lymana (15) zależności pozwalającej przewidywać rozpuszczalność w wodzie. Rozpuszczalność w wodzie obliczoną według równania podanego w dodatku 1 trzeba traktować jako pierwsze oszacowanie. Należy zauważyć, że użytkownik ma swobodę w szacowaniu rozpuszczalności w wodzie dowolną metodą, którą uznaje się za lepsze odzwierciedlenie zależności między hydrofobowością a rozpuszczalnością. W przypadku związków stałych zaleca się na przykład uwzględnienie temperatury topnienia w przewidywaniu rozpuszczalności. Jeżeli stosuje się równanie zmodyfikowane, należy się upewnić, czy równanie służące do obliczania rozpuszczalności w oktanolu nadal jest poprawne. Schematyczny rysunek naczynia z płaszczem szklanym do termostatowania z mieszadłem, o objętości ok. 1 litra znajduje się w dodatku 2. Proporcje naczynia przedstawionego w dodatku 2 okazały się korzystne i należy je utrzymać w przypadku używania przyrządu o innych rozmiarach,
- podczas doświadczenia wykonywanego metodą powolnego mieszania konieczny jest sprzęt do utrzymywania temperatury na stałym poziomie.
18. Naczynia powinny być wykonane z obojętnego materiału, tak aby efekt adsorpcji na powierzchni naczynia był nieznaczny.
Przygotowanie roztworów do badania
19. Wyznaczenie POW należy przeprowadzać przy użyciu 1-oktanolu o najwyższej czystości, jaka jest dostępna w handlu (co najmniej +99 %). Zaleca się oczyszczanie 1-oktanolu poprzez ekstrakcję kwasem, zasadą i wodą, a następnie osuszanie. Do oczyszczania 1-oktanolu można ponadto zastosować destylację. Oczyszczony 1-oktanol służy do przygotowania standardowych roztworów substancji badanych. Woda wykorzystywana w wyznaczeniu POW powinna być destylowana w destylatorze szklanym lub wykonanym ze szkła kwarcowego, bądź uzyskana z układu oczyszczania, można też użyć wody o czystości HPLC. W przypadku wody destylowanej wymagane jest filtrowanie przez filtr 0,22 μm, należy także przeprowadzić ślepe próby w celu sprawdzenia, czy w stężonych ekstraktach nie ma zanieczyszczeń, które mogą wpływać na substancję badaną. W przypadku gdy stosowany jest filtr z włókna szklanego, należy go oczyścić poprzez wypalanie przez co najmniej trzy godziny w temperaturze 400 °C.
20. Oba rozpuszczalniki przed wykonaniem doświadczenia powinny zostać wzajemnie nasycone w drodze ustalania stanu równowagi w wystarczająco dużym naczyniu. Stan równowagi osiąga się poprzez powolne mieszanie układu dwufazowego przez dwa dni.
21. Wybrać odpowiednie stężenie substancji badanej i rozpuścić substancję w 1-oktanolu (nasyconym wodą). Należy wyznaczyć współczynnik podziału 1-oktanol/woda w rozcieńczonych roztworach w 1-oktanolu oraz w wodzie. Stężenie substancji badanej nie powinno zatem przekraczać 70 % jej rozpuszczalności, przy stężeniu w obu fazach wynoszącym maksymalnie 0,1 M (1). Roztwory w 1-oktanolu używane w doświadczeniu muszą być wolne od zawiesiny nierozpuszczonych cząstek substancji badanej.
22. Odpowiednią ilość substancji badanej rozpuścić w 1-oktanolu (nasyconym wodą). Jeżeli szacowana wartość log POW przekracza 5, należy dopilnować, aby roztwory w 1-oktanolu używane w doświadczeniu były wolne od zawiesiny nierozpuszczonych cząstek substancji badanej. W tym celu stosuje się następującą procedurę dla chemikaliów o szacowanej wartości log POW > 5:
- substancję badaną rozpuścić w 1-oktanolu (nasyconym wodą),
- pozostawić roztwór na czas wystarczający, aby zawieszone nierozpuszczone cząstki substancji opadły na dno. Podczas osiadania monitorować stężenie substancji badanej,
- po ustabilizowaniu się wartości mierzonych stężeń w roztworze 1-oktanolu rozcieńczyć roztwór podstawowy dodając odpowiednią objętość 1-oktanolu,
- wykonać pomiar stężenia roztworu podstawowego. Jeżeli zmierzone stężenie odpowiada rozcieńczeniu, można użyć rozcieńczonego roztworu w doświadczeniu metodą powolnego mieszania.
Ekstrakcja i analiza próbek
23. Do oznaczenia substancji badanej należy użyć zwalidowanej metody analitycznej. Wykonujący badanie muszą wykazać, że stężenia w 1-oktanolu nasyconym wodą oraz w fazie wodnej nasyconej 1-oktanolem podczas doświadczenia przekraczają granicę oznaczalności w stosowanych metodach analitycznych. W przypadkach, w których potrzebne są metody ekstrakcji, przed doświadczeniem trzeba ustalić odzysk analityczny substancji badanej z fazy wodnej i 1-oktanolu. Sygnały analityczne należy skorygować o ślepą próbę i dopilnować, aby nie było możliwe przeniesienie analitu z jednej próbki do innej.
24. Przed analizą może być potrzebna ekstrakcja fazy wodnej za pomocą rozpuszczalnika organicznego oraz wstępne zatężanie ekstraktu w związku z dość niskimi stężeniami hydrofobowych substancji badanych w fazie wodnej. Z tego samego powodu konieczne jest zmniejszenie stężeń dla ewentualnych ślepych prób. W tym celu trzeba stosować rozpuszczalniki o wysokiej czystości, najlepiej rozpuszczalniki do analizy pozostałości. W uniknięciu zanieczyszczeń krzyżowych może ponadto pomóc używanie starannie wyczyszczonego sprzętu szklanego (np. mytego w rozpuszczalniku lub wypalanego w podwyższonej temperaturze).
25. Oszacowanie log POW można uzyskać z programu służącego do szacowania lub na podstawie specjalistycznej wiedzy. Jeżeli oszacowana wartość przekracza 6, należy bliżej przyjrzeć się korektom o ślepą próbę oraz przenoszeniu analitu. W przypadku gdy oszacowana wartość log POW jest większa od 6, obowiązkowe jest również zastosowanie wzorca zastępczego do określenia korekty o odzysk, tak aby można było uzyskać wysoki współczynnik zatężenia wstępnego. W handlu dostępnych jest szereg programów komputerowych służących do szacowania log POW(1) np. Clog P (16), KOWWIN (17), ProLogP (18) czy ACD log P (19). Opis metod szacowania można znaleźć w pozycjach literaturowych (20-22).
26. Granice oznaczalności (LOQ) dla oznaczania substancji badanej w 1-oktanolu i w wodzie ustalić zatwierdzonymi metodami. Zasadniczo za granicę oznaczalności danej metody można przyjąć takie stężenie w wodzie lub 1-oktanolu, dla którego stosunek sygnału do szumu wynosi 10. Należy wybrać odpowiednią metodę ekstrakcji i zatężania wstępnego, a także określić odzysk analityczny. Aby otrzymać sygnał o odpowiedniej mocy, przy oznaczaniu analitycznym wybiera się odpowiedni współczynnik zatężania wstępnego.
27. Na podstawie parametrów metody analitycznej i oczekiwanych stężeń wyznaczyć przybliżoną wielkość próbki potrzebnej do dokładnego oznaczenia stężenia związku. Należy unikać używania próbek fazy wodnej zbyt małych, aby uzyskać wystarczający sygnał analityczny. Nie należy również stosować nadmiernie dużych próbek fazy wodnej, ponieważ mogłoby pozostać zbyt mało wody, aby przeprowadzić wymaganą minimalną liczbę analiz (n = 5). W dodatku 1 minimalna objętość próbki podana jest jako funkcja objętości naczynia, granicy wykrywalności substancji badanej i jej rozpuszczalności.
28. Ilościowego oznaczenia substancji badanych dokonuje się poprzez porównanie z krzywymi kalibracyjnymi dla odpowiedniego związku chemicznego. Wartości stężeń w analizowanych próbkach muszą mieścić się pomiędzy wartościami stężeń wzorców.
29. W przypadku substancji badanych o szacowanej wartości log POW przekraczającej 6 przed ekstrakcją należy dodać do próbki fazy wodnej wzorzec zastępczy w celu rejestracji strat zachodzących podczas ekstrakcji i wstępnego zatężania próbek fazy wodnej. Dla dokładnego obliczenia korekty o odzysk wzorce zastępcze muszą mieć właściwości bardzo zbliżone do substancji badanej lub z nią identyczne. Do tego celu najlepiej jest użyć analogów danej substancji (trwale) znakowanych izotopowo (np. deuterowanych w maksymalnym stopniu lub znakowanych 13C). Jeżeli nie jest możliwe zastosowanie znakowanych izotopów trwałych, tj. 13C lub 2H, należy za pomocą wiarygodnych danych literaturowych wykazać, że właściwości fizykochemiczne substancji zastępczej są bardzo bliskie właściwościom substancji badanej. Przy ekstrakcji ciecz-ciecz z fazy wodnej mogą powstawać emulsje. Można to ograniczyć poprzez dodanie soli i pozostawienie emulsji na noc, aby osiadła. Metody ekstrakcji i wstępnego zatężania próbek trzeba podać w sprawozdaniu.
30. Próbki pobrane z fazy 1-oktanolu można w razie potrzeby rozcieńczyć odpowiednim rozpuszczalnikiem przed analizą. Ponadto zaleca się użycie wzorca zastępczego do obliczenia korekty o odzysk w przypadku substancji, dla których wyniki doświadczeń z odzyskiem wykazały dużą zmienność (względne odchylenie standardowe > 10 %).
31. Szczegóły metody analitycznej trzeba zamieścić w sprawozdaniu. Obejmuje to metodę ekstrakcji, współczynniki wstępnego zatężania i rozcieńczania, parametry przyrządów, procedurę kalibracji, zakres kalibracji, odzysk analityczny substancji badanej z wody, dodawanie wzorców zastępczych w celu obliczenia korekty o odzysk, wartości ślepych prób, granice wykrywalności i granice oznaczalności.
Wykonanie badania
Optymalny stosunek objętości 1-oktanol/woda
32. Przy dobieraniu odpowiednich objętości wody i 1-oktanolu należy uwzględnić LOQ w 1-oktanolu i wodzie, współczynniki zatężania wstępnego stosowane do próbek wody, objętości próbek pobranych z fazy 1-oktanolu i wody oraz oczekiwane stężenia. Dla ułatwienia doświadczenia należy wybrać taką objętość 1-oktanolu w układzie powolnego mieszania, aby warstwa 1-oktanolu miała grubość wystarczającą (> 0,5 cm) do pobierania próbek z fazy 1-oktanolu bez jej naruszania.
33. Typowe objętości faz stosowane przy oznaczaniu związków o log POW równych 4,5 i więcej to 20-50 ml 1-oktanolu i 950-980 ml wody w naczyniu jednolitrowym.
Warunki badania
34. W trakcie badania za pomocą termostatu ustalić temperaturę w naczyniu reakcyjnym tak, aby ograniczyć wahania temperatury do wartości poniżej 1 °C. Oznaczenie należy przeprowadzić w temperaturze 25 °C.
35. Układ doświadczalny należy chronić przed światłem słonecznym poprzez przeprowadzanie doświadczenia w ciemnym pomieszczeniu albo przykrycie naczynia reakcyjnego folią aluminiową.
36. Doświadczenie należy przeprowadzać w środowisku wolnym od pyłu (w jak największym stopniu).
37. kład 1-oktanol-woda mieszać aż do osiągnięcia stanu równowagi. W doświadczeniu pilotażowym ocenia się długość okresu ustalania stanu równowagi poprzez przeprowadzenie doświadczenia metodą powolnego mieszania i okresowe pobieranie próbek wody oraz 1-oktanolu. Próbki należy pobierać nie częściej niż co pięć godzin.
38. Każda procedura wyznaczania POW musi obejmować co najmniej trzy niezależne doświadczenia metodą powolnego mieszania.
Wyznaczanie czasu ustalania stanu równowagi
39. Przyjmuje się, że stan równowagi jest ustalony wtedy, gdy krzywa regresji stosunku stężeń w 1-oktanolu/wodzie względem czasu przez cztery punkty czasowe ma nachylenie nieróżniące się znacznie od zera przy granicznym poziomie istotności równym 0,05. Minimalny czas ustalania równowagi przed rozpoczęciem pobierania próbek to jeden dzień. Z reguły pobieranie próbek substancji o szacowanej wartości log POW mniejszej niż 5 można przeprowadzić na drugi i trzeci dzień. W przypadku związków bardziej hydrofobowych może zajść konieczność wydłużenia czasu ustalania równowagi. Dla związku o log POW = 8,23 (dekachlorobifenyl) do ustalenia stanu równowagi wystarczyły 144 godziny. Stan równowagi ocenia się poprzez powtarzanie pobierania próbek z pojedynczego naczynia.
Rozpoczynanie doświadczenia
40. Na początku doświadczenia napełnić naczynie reakcyjne wodą nasyconą 1-oktanolem. Należy pozostawić układ na czas wystarczający do osiągnięcia temperatury ustalonej za pomocą termostatu.
41. Do naczynia reakcyjnego ostrożnie dodać pożądaną ilość substancji badanej (rozpuszczoną w wymaganej ilości 1-oktanolu nasyconego wodą). Jest to kluczowy etap doświadczenia, ponieważ konieczne jest uniknięcie gwałtownego zmieszania obu faz. W tym celu fazę 1-oktanolową można powoli podawać pipetą na ściankę naczynia, blisko powierzchni wody. Roztwór spłynie wzdłuż szklanej ścianki i utworzy film na powierzchni fazy wodnej. Należy zawsze unikać wlewania 1-oktanolu bezpośrednio do naczynia - krople 1-oktanolu nie powinny wpadać bezpośrednio do wody.
42. Po rozpoczęciu mieszania jego prędkość należy powoli zwiększać. Jeżeli nie da się odpowiednio wyregulować silników mieszadła, należy rozważyć zastosowanie transformatora. Prędkość mieszania należy wyregulować tak, aby powstał wir na styku wody i 1-oktanolu, o głębokości od 0,5 do maksymalnie 2,5 cm. Prędkość mieszania należy zmniejszyć, jeśli grubość wiru przekroczy 2,5 cm; w przeciwnym razie z kropelek 1-oktanolu w fazie wodnej mogą powstać mikrokropelki, co może spowodować przeszacowanie stężenia substancji badanej w wodzie. Maksymalną prędkość mieszania powodującą powstanie 2,5 cm wiru zaleca się na podstawie wyników międzylaboratoryjnego badania walidacyjnego (5). Jest to kompromis pomiędzy szybkim ustalaniem równowagi a zapobieganiem tworzeniu mikrokropelek 1-oktanolu.
Pobieranie i przygotowywanie próbek
43. Przed pobieraniem próbek mieszadło należy wyłączyć i pozostawić układ, aż płyny znieruchomieją. Po ukończeniu pobierania próbek uruchomić mieszadło ponownie na wolnych obrotach, jak opisano powyżej, i stopniowo zwiększa się prędkość mieszania.
44. Próbkę fazy wodnej pobiera się przez zawór znajdujący się w dolnej części naczynia reakcyjnego. Należy zawsze odrzucać objętość martwą wody znajdującą się w kranach (dla naczynia przedstawionego w dodatku 2 jest to około 5 ml). Woda w kranach nie ulega mieszaniu, a zatem nie znajduje się w równowadze z całym układem. Należy odnotować objętość próbek wody i upewnić się, że przy ustalaniu bilansu masy wzięto pod uwagę ilość substancji badanej obecnej w odrzuconej wodzie. Należy minimalizować straty związane z parowaniem poprzez umożliwienie spokojnego przepływu wody do rozdzielacza, tak aby warstwa styku wody/1-oktanolu pozostała nienaruszona.
45. Próbki fazy 1-oktanolu uzyskuje się poprzez pobranie małej podwielokrotnej części (ok. 100 μl) z warstwy 1-oktanolu za pomocą strzykawki o objętości 100 mikrolitrów wykonanej wyłącznie ze szkła i metalu. Należy uważać, aby nie naruszyć warstwy styku rozpuszczalników. Objętość pobranej cieczy jest zapisywana. Wystarczy mała podwielokrotność, ponieważ próbka fazy 1-oktanolu będzie rozcieńczana.
46. Należy unikać zbędnych etapów polegających na przenoszeniu próbki. W tym celu objętość próbki należy wyznaczyć grawimetrycznie. W przypadku próbek fazy wodnej można to uzyskać poprzez pobieranie próbki roztworu do rozdzielacza, który zawiera już potrzebną objętość rozpuszczalnika.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
47. Zgodnie z niniejszą metodą badawczą POW wyznacza się, wykonując trzy doświadczenia metodą powolnego mieszania (w trzech jednostkach doświadczalnych) dla badanego związku, w identycznych warunkach. Analiza metodą regresji zastosowana do wykazania, że osiągnięty został stan równowagi, powinna być oparta na wynikach co najmniej czterech oznaczeń CO/CW w następujących po sobie punktach czasowych. Umożliwia to obliczenie wariancji jako miary niepewności wartości średniej otrzymanej przez każdą jednostkę doświadczalną.
48. POW można określić przez wariancję danych otrzymanych dla każdej jednostki doświadczalnej. Informacje te wykorzystuje się do obliczenia POW jako średniej ważonej z wyników poszczególnych jednostek doświadczalnych. Wagą jest odwrotność wariancji wyników dla jednostek doświadczalnych. W efekcie dane, dla których zmienność (wyrażana jako wariancja) jest duża, a zatem mające mniejszą wiarygodność, wpływają na wynik w mniejszym stopniu niż dane, dla których wariancja jest mała.
49. Analogicznie oblicza się ważone odchylenie standardowe. Jest ono miarą powtarzalności pomiarów POW. Niska wartość ważonego odchylenia standardowego wskazuje na to, że wyznaczenie POW w ramach jednego laboratorium dawało bardzo powtarzalne wyniki. Formalne opracowanie statystyczne danych przedstawiono w skrócie poniżej.
Opracowanie wyników
Wykazanie, że stan równowagi został osiągnięty
50. Dla każdego pobierania próbek oblicza się logarytm stosunku stężeń substancji badanej w 1-oktanolu i w wodzie (log (CO/Cw)). Osiągnięcie równowagi chemicznej wykazuje się za pomocą wykresu tego stosunku względem czasu. Plateau pojawiające się na tym wykresie dla co najmniej czterech kolejnych punktów czasowych wskazuje na osiągnięcie równowagi oraz na rzeczywiste rozpuszczenie związku w 1-oktanolu. W razie jego braku badanie trzeba kontynuować aż do momentu, gdy nachylenie dla czterech kolejnych punktów czasowych nie będzie znacząco różne od zera przy granicznym poziomie istotności równym 0,05, co wskazuje na niezależność log Co/Cw od czasu.
Obliczanie log POW
51. Wartość log POW dla jednostki doświadczalnej oblicza się jako średnią ważoną log Co/Cw dla tej części krzywej log Co/Cw względem czasu, dla której wykazano osiągnięcie stanu równowagi. Średnią ważoną oblicza się poprzez stosowanie do danych wag będących odwrotnością wariancji, tak aby wpływ na wynik końcowy był odwrotnie proporcjonalny do niepewności danych.
Wartość średnia log POW
52. Wartość średnią log POW dla różnych jednostek doświadczalnych oblicza się jako średnią wyników dla poszczególnych jednostek doświadczalnych ważoną ich odpowiednimi wariancjami.
Obliczenie wykonuje się w następujący sposób:
log POW,Av = (Swi × log POW,i) × (Swi)-1
gdzie:
log POW,i = wartość log POW dla jednostki doświadczalnej,
log POW,Av = średnia ważona wartości dla poszczególnych oznaczeń log POW,
wi = waga statystyczna przypisana wartości log POW dla jednostki doświadczalnej i.
Odwrotność wariancji log POW,i występuje jako wi (wi = var (log POW,i)-1).
53. Błąd średniej log POW szacowany jest jako powtarzalność log Co/Cw wyznaczanych w fazie równowagi w poszczególnych jednostkach doświadczalnych. Wyrażany jest jako ważone odchylenie standardowe log POW,Av (σlog Pow,Av), które z kolei jest miarą błędu związanego z log POW,Av. Ważone odchylenie standardowe można obliczyć z wariancji ważonej (varlog Pow,Av) w następujący sposób:
varlog Pow,Av = (Swi x (log POW,i - log POW,Av)2) x (Swi (n - 1))-1
σlog Pow,Av = (varlog Pow,Av)0,5
Symbol n oznacza liczbę jednostek doświadczalnych.
Sprawozdanie z badania
54. Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
Substancja badana
- nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna, numer CAS, wzór strukturalny (z zaznaczeniem miejsca znakowania, jeżeli używa się substancji znakowanej izotopowo) oraz istotne właściwości fizykochemiczne (zob. pkt 17),
- stopień czystości substancji badanej (zanieczyszczenia),
- czystość radiochemiczna dla znakowanych substancji chemicznych i aktywność molowa (w stosownych przypadkach),
- wstępne oszacowanie log Pow oraz metoda zastosowana do wyprowadzenia tej wartości.
Warunki badania
- daty wykonywania badań,
- temperatura podczas doświadczenia,
- objętości 1-oktanolu i wody na początku badania,
- objętości pobranych próbek 1-oktanolu i wody,
- objętości 1-oktanolu i wody pozostałe w naczyniach używanych do badania,
- opis naczyń używanych do badania i zastosowanych warunków mieszania (geometria mieszadła i naczynia używanego do badania, wysokość wiru w mm oraz, jeżeli jest znana, prędkość mieszania),
- metody analityczne wykorzystane do oznaczenia substancji badanej oraz granice oznaczalności danych metod,
- czasy pobierania próbek,
- pH fazy wodnej i zastosowane substancje buforowe w przypadku regulowania pH w celu badania cząsteczek podatnych na dysocjację,
- liczba powtórzeń.
Wyniki
- powtarzalność i czułość zastosowanych metod analitycznych,
- oznaczone stężenia substancji badanej w 1-oktanolu i w wodzie w funkcji czasu,
- wykazanie bilansu masy,
- temperatura oraz odchylenie standardowe zakresu temperatur podczas doświadczenia,
- regresja stosunku stężeń względem czasu,
- średnia wartość log Pow,Av i jej błąd standardowy,
- omówienie i interpretacja wyników,
- przykłady surowych danych liczbowych z reprezentatywnej analizy (wszystkie surowe dane muszą być przechowywane zgodnie ze standardami DPL), w tym odzysk substancji zastępczych oraz liczba poziomów zastosowanych w kalibracji (wraz z kryteriami dla współczynnika korelacji krzywej kalibracyjnej) oraz wyniki zapewniania jakości/kontroli jakości (QA/QC),
- jeśli jest dostępne: sprawozdanie z walidacji procedury oznaczania (wskazane wśród odnośników literaturowych).
BIBLIOGRAFIA:
(1) De Bruijn JHM, Busser F, Seinen W, Hermens J. (1989). Determination of octanol/water partition coefficients with the "slow-stirring" method. Environ. Toxicol. Chem. 8: 499-512.
(2) Rozdział A.8 niniejszego załącznika. Współczynnik podziału.
(3) Rozdział A.8 niniejszego załącznika. Współczynnik podziału.
(4) OECD (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122 Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paryż.
(5) Tolls J (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
(6) Boethling RS, Mackay D (eds.) (2000). Handbook of property estimation methods for chemicals. Lewis Publishers Boca Raton, FL, USA.
(7) Schwarzenbach RP, Gschwend PM, Imboden DM (1993). Environmental Organic Chemistry. Wiley, Nowy Jork, NY.
(8) Arnold CG, Widenhaupt A, David MM, Müller SR, Haderlein SB, Schwarzenbach RP (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water partitioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition. Environ. Sci. Technol. 31: 2596-2602.
(9) OECD (1981) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112 Dissociation Constants in Water. Paris.
(10) Rozdział A.6 niniejszego załącznika. Rozpuszczalność w wodzie.
(11) Rozdział C.7 niniejszego załącznika. Rozpad - rozpad abiotyczny: hydroliza jako funkcja pH
(12) Rozdział C.4 - część II-VII (metody A-F) niniejszego załącznika. Oznaczenie szybkiej biodegradowalności.
(13) Rozdział A.4 niniejszego załącznika. Prężność pary.
(14) Pinsuwan S, Li A and Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water solubility ratios and partition coefficients, J. Chem. Eng. Data. 40: 623-626.
(15) Lyman WJ (1990). Solubility in water. W: Handbook of Chemical Property Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds, Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, Eds. American Chemical Society, Washington, DC, 2-1 do 2-52.
(16) Leo A, Weininger D (1989). Medchem Software Manual. Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA.
(17) Meylan W (1993). SRC-LOGKOW for Windows. SRC, Syracuse, N.Y.
(18) Compudrug L (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd, Budapeszt.
(19) ACD. ACD logP; Advanced Chemistry Development: Toronto, Ontario M5H 3V9, Kanada 2001.
(20) Lyman WJ (1990). Octanol/water partition coefficient. W: Lyman WJ, Reehl WF, Rosenblatt DH, eds, Handbook of chemical property estimation, American Chemical Society, Washington, D.C.
(21) Rekker RF, de Kort HM (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther. 14: 479-488.
(22) Jübermann O (1958). Houben-Weyl (red.), Methoden der Organischen Chemie: 386-390.
______
(1) W odniesieniu do niektórych pomiarów dotyczących surowicy i osocza, w szczególności dla glukozy, zaleca się wstrzymanie podawania pokarmu przez noc. Zalecenie to wynika głównie z faktu, że zwiększona zmienność, którą nieuchronnie powoduje brak wstrzymania podawania pokarmu, często maskuje bardziej subtelne skutki, co utrudnia interpretację wyników. Z drugiej strony jednak wstrzymanie podawania pokarmu przez noc może wpływać na ogólny metabolizm zwierząt i w szczególności w badaniach żywieniowych może zakłócać dzienne narażenie na działanie badanej substancji chemicznej. Jeżeli przyjęte jest wstrzymanie podawania pożywienia przez całą noc, biochemiczne oznaczenia kliniczne należy wykonać po przeprowadzeniu obserwacji czynnościowych w czwartym tygodniu badania.
Dodatek 1
Arkusz kalkulacyjny do obliczania minimalnych objętości wody wymaganych dla wykrywania substancji badanych o różnych wartościach LOG POW w fazie wodnej
Założenia:
- Maksymalna objętość poszczególnych podwielokrotnych części = 10 % objętości całkowitej; 5 podwielokrotnych części = 50 % objętości całkowitej.
- Stężenie substancji badanych = 0,7 × rozpuszczalność w obu fazach. W przypadku niższych stężeń wymagane są większe objętości.
- Objętość do wyznaczania LOD = 100 ml.
- Relacje log Pow vs. log Sw oraz log Pow vs. SR (Soct/Sw) w uzasadnionym zakresie odzwierciedlają związki dla substancji badanych.
Oszacowanie Sw
| log Pow | Równanie | log Sw | Sw (mg/l) |
| 4 | (-)0,922 × log Pow + 4,184 | 0,496 | 3,133E+00 |
| 4,5 | (-)0,922 × log Pow + 4,184 | 0,035 | 1,084E+00 |
| 5 | (-)0,922 × log Pow + 4,184 | -0,426 | 3,750E-01 |
| 5,5 | (-)0,922 × log Pow + 4,184 | -0,887 | 1,297E-01 |
| 6 | (-)0,922 × log Pow + 4,184 | -1,348 | 4,487E-02 |
| 6,5 | (-)0,922 × log Pow + 4,184 | -1,809 | 1,552E-02 |
| 7 | (-)0,922 × log Pow + 4,184 | -2,270 | 5,370E-03 |
| 7,5 | (-)0,922 × log Pow + 4,184 | -2,731 | 1,858E-03 |
| 8 | (-)0,922 × log Pow + 4,184 | -3,192 | 6,427E-04 |
Oszacowanie Soct
| log Pow | Równanie | Soct (mg/l) |
| 4 | log Pow = 0,88log SR + 0,41 | 3,763E+04 |
| 4,5 | log Pow = 0,88log SR + 0,42 | 4,816E+04 |
| 5 | log Pow = 0,88log SR + 0,43 | 6,165E+04 |
| 5,5 | log Pow = 0,88log SR + 0,44 | 7,890E+04 |
| 6 | log Pow = 0,88log SR + 0,45 | 1,010E+05 |
| 6,5 | log Pow = 0,88log SR + 0,46 | 1,293E+05 |
| 7 | log Pow = 0,88log SR + 0,47 | 1,654E+05 |
| 7,5 | log Pow = 0,88log SR + 0,48 | 2,117E+05 |
| 8 | log Pow = 0,88log SR + 0,49 | 2,710E+05 |
| Masa całkowita substancji badanej (mg) | Masaoktanolu /Masawody | MasaH2O (mg) | StężH2O (mg/l) | Masaoktanolu (mg) | Stężoktanolu (mg/l) |
| 1 319 | 526 | 2,5017 | 2,6333 | 1 317 | 26 333 |
| 1 686 | 1 664 | 1,0127 | 1,0660 | 1 685 | 33 709 |
| 2 158 | 5 263 | 0,4099 | 0,4315 | 2 157 | 43 149 |
| 2 762 | 16 644 | 0,1659 | 0,1747 | 2 762 | 55 230 |
| 3 535 | 52 632 | 0,0672 | 0,0707 | 3 535 | 70 691 |
| 4 524 | 1664 36 | 0,0272 | 0,0286 | 4 524 | 90 480 |
| 5 790 | 5263 16 | 0,0110 | 0,0116 | 5 790 | 115 807 |
| 7 411 | 1 664 357 | 0,0045 | 0,0047 | 7 411 | 148 223 |
| 9 486 | 5 263 158 | 0,0018 | 0,0019 | 9 486 | 189 713 |
Obliczanie objętości
Minimalna objętość wymagana dla fazy H2O przy każdym stężeniu LOD
| log Kow | LOD (mikrogram/l)→ | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10 |
| 4 | 0,04 | 0,38 | 3,80 | 38 | 380 | |
| 4,5 | 0,09 | 0,94 | 9,38 | 94 | 938 | |
| 5 | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 232 | 2 318 | |
| 5,5 | 0,57 | 5,73 | 57,26 | 573 | 5 726 | |
| 6 | 1,41 | 14,15 | 141 | 1 415 | 14 146 | |
| 6,5 | 3,50 | 34,95 | 350 | 3 495 | 34 950 | |
| 7 | 8,64 | 86,35 | 864 | 8 635 | 86 351 | |
| 7,5 | 21,33 | 213 | 2 133 | 21 335 | 213 346 | |
| 8 | 52,71 | 527 | 5 271 | 52 711 | 527 111 | |
| Objętość zastosowana dla LOD (I) | 0,1 |
Legenda do obliczeń
Stanowi < 10 % całkowitej objętości fazy wodnej, naczynie do ustalania równowagi o objętości 1 litra.
Stanowi < 10 % całkowitej objętości fazy wodnej, naczynie do ustalania równowagi o objętości 2 litrów.
Stanowi < 10 % całkowitej objętości fazy wodnej, naczynie do ustalania równowagi o objętości 5 litrów.
Stanowi < 10 % całkowitej objętości fazy wodnej, naczynie do ustalania równowagi o objętości 10 litrów.
Przekracza 10 % nawet dla 10-litrowego naczynia do ustalania równowagi.
Przegląd wymaganych objętości jako funkcji rozpuszczalności w wodzie i log POW
Minimalna objętość wymagana dla fazy H2O przy każdym stężeniu LOD (ml)
| log Pow | Sw (mg/l) | LOD (mikrogram/l)→ | 0,001 | 0,01 | 0,10 | 1,00 | 10 |
| 4 | 10 | 0,01 | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99 | |
| 5 | 0,02 | 0,24 | 2,38 | 23,80 | 237,97 | ||
| 3 | 0,04 | 0,40 | 3,97 | 39,66 | 396,62 | ||
| 1 | 0,12 | 1,19 | 11,90 | 118,99 | 1 189,86 | ||
| 4,5 | 5 | 0,02 | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37 | |
| 2 | 0,05 | 0,51 | 5,08 | 50,84 | 508,42 | ||
| 1 | 0,10 | 1,02 | 10,17 | 101,68 | 1 016,83 | ||
| 0,5 | 0,20 | 2,03 | 20,34 | 203,37 | 2 033,67 | ||
| 5 | 1 | 0,09 | 0,87 | 8,69 | 86,90 | 869,01 | |
| 0,5 | 0,17 | 1,74 | 17,38 | 173,80 | 1 738,02 | ||
| 0,375 | 0,23 | 2,32 | 23,18 | 231,75 | 2 317,53 | ||
| 0,2 | 0,43 | 4,35 | 43,45 | 434,51 | 4 345,05 | ||
| 5,5 | 0,4 | 0,19 | 1,86 | 18,57 | 185,68 | 1 856,79 | |
| 0,2 | 0,37 | 3,71 | 37,14 | 371,36 | 3 713,59 | ||
| 0,1 | 0,74 | 7,43 | 74,27 | 742,72 | 7 427,17 | ||
| 0,05 | 1,49 | 14,85 | 148,54 | 1 485,43 | 14 854,35 | ||
| 6 | 0,1 | 0,63 | 6,35 | 63,48 | 634,80 | 6 347,95 | |
| 0,05 | 1,27 | 12,70 | 126,96 | 1 269,59 | 12 695,91 | ||
| 0,025 | 2,54 | 25,39 | 253,92 | 2 539,18 | 25 391,82 | ||
| 0,0125 | 5,08 | 50,78 | 507,84 | 5 078,36 | 50 783,64 | ||
| 6,5 | 0,025 | 2,17 | 21,70 | 217,02 | 2 170,25 | 21 702,46 | |
| 0,0125 | 4,34 | 43,40 | 434,05 | 4 340,49 | 43 404,93 | ||
| 0,006 | 9,04 | 90,43 | 904,27 | 9 042,69 | 90 426,93 | ||
| 0,003 | 18,09 | 180,85 | 1 808,54 | 18 085,39 | 180 853,86 | ||
| 7 | 0,006 | 7,73 | 77,29 | 772,89 | 7 728,85 | 77 288,50 | |
| 0,003 | 15,46 | 154,58 | 1 545,77 | 15 457,70 | 154 577,01 | ||
| 0,0015 | 23,19 | 231,87 | 2 318,66 | 23 186,55 | 231 865,51 | ||
| 0,001 | 46,37 | 463,73 | 4 637,31 | 46 373,10 | 463 731,03 | ||
| 7,5 | 0,002 | 19,82 | 198,18 | 1 981,77 | 19 817,73 | 198 177,33 | |
| 0,001 | 39,64 | 396,35 | 3 963,55 | 39 635,47 | 396 354,66 | ||
| 0,0005 | 79,27 | 792,71 | 7 927,09 | 79 270,93 | 792 709,32 | ||
| 0,00025 | 158,54 | 1 585,42 | 15 854,19 | 158 541,86 | 1 585 418,63 | ||
| 8 | 0,001 | 33,88 | 338,77 | 3 387,68 | 33 876,77 | 338 767,72 | |
| 0,0005 | 67,75 | 677,54 | 6 775,35 | 67 753,54 | 677 535,44 | ||
| 0,00025 | 135,51 | 1 355,07 | 13 550,71 | 135 507,09 | 1 355 070,89 | ||
| 0,000125 | 271,01 | 2 710,14 | 27 101,42 | 271 014,18 | 2 710 141,77 |
| Objętość zastosowana dla LOD (I) | 0,1 |
Dodatek 2
Przykład naczynia z płaszczem szklanym do wyznaczania POW metodą powolnego mieszania
"A.24. WSPÓŁCZYNNIK PODZIAŁU (N-OKTANOL/WODA), METODA WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC)
WPROWADZENIE
Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD nr 117 (2004).
1. Współczynnik podziału (P) definiuje się jako stosunek stężeń (C) w stanie równowagi substancji rozpuszczonej w układzie dwufazowym, składającym się z dwóch zasadniczo niemieszających się ze sobą rozpuszczalników. W przypadku n-oktanolu i wody:
Współczynnik podziału będący ilorazem dwóch stężeń jest bezwymiarowy i na ogół podaje się go w postaci jego logarytmu o podstawie 10.
2. Pow jest kluczowym parametrem w badaniach wpływu substancji chemicznych na środowisko. Wykazano, że istnieje bardzo istotna zależność między Pow niezjonizowanej postaci substancji a bioakumulacją tych substancji w rybach. Wykazano również, że Pow jest przydatnym parametrem do celów przewidywania adsorpcji na glebie i osadach oraz ustalania ilościowych zależności struktura-aktywność dla szerokiego zakresu skutków biologicznych.
3. Pierwotna propozycja dotycząca tej metody badawczej opierała się na artykule autorstwa C.V. Eadsforth i P. Moser (1). Agencja Umweltbundesamt Republiki Federalnej Niemiec koordynowała w 1986 r. opracowywanie metody badawczej oraz międzylaboratoryjne badanie porównawcze (2).
ZAŁOŻENIA WSTĘPNE
4. Wartości logarytmu Poww przedziale - 2-4 (niekiedy do 5 i więcej) 4 można określić doświadczalnie za pomocą metody wstrząsania kolby (rozdział A.8 niniejszego załącznika, dotycząca badań wytyczna OECD nr 107). Metoda HPLC obejmuje logarytm Pow w przedziale od 0 do 6 (1)(2)(3)(4)(5). Metoda ta może wymagać oszacowania Pow, w celu przypisania odpowiednich substancji odniesienia i poparcia wszelkich wniosków wyciągniętych na podstawie danych wygenerowanych w ramach badania. Metody obliczania omówiono krótko w dodatku do niniejszej metody badawczej. Tryb działania HPLC ma charakter izokratyczny.
5. Wartości Pow zależą od warunków otoczenia, takich jak temperatura, pH, moc jonowa itp., i należy je zdefiniować w eksperymencie, aby umożliwić poprawną interpretację danych Pow. W przypadku substancji podatnych na dysocjację dostępna może stać się inna metoda (np. projekt wytycznej OECD dotyczącej metody pH-metrycznej dla substancji jonowych (6)) i można ją będzie zastosować jako metodę alternatywną. Mimo że wspomniany projekt wytycznej OECD może być właściwy do ustalenia Pow odniesieniu do tych substancji podatnych na dysocjację, w niektórych przypadkach bardziej odpowiednie jest zastosowanie metody HPLC przy pH występującym w środowisku naturalnym (zob. pkt 9).
ZASADA METODY
6. Metoda HPLC w układzie faz odwróconych jest wykonywana na kolumnach analitycznych wypełnionych dostępną na rynku fazą stałą zawierającą długołańcuchowe węglowodory (np. C8, C18) chemicznie związane na krzemionce.
7. Substancja chemiczna wstrzyknięta do takiej kolumny rozdziela się na rozpuszczalnikową fazę ruchomą i węglowodorową fazę stacjonarną, w miarę jak jest transportowana w kolumnie przez fazę ruchomą. Substancje są zatrzymywane proporcjonalnie do ich współczynnika podziału węglowodór-woda, przy czym pierwsze są wymywane substancje hydrofilowe, a ostatnie - substancje lipofilowe. Czas retencji opisuje się jako współczynnik retencji k podany za pomocą wyrażenia:
gdzie tR oznacza czas retencji substancji badanej, a t0 oznacza czas martwy, tj. średni czas przejścia cząsteczki rozpuszczalnika przez kolumnę. Nie są wymagane analizy ilościowe, konieczne jest tylko oznaczenie czasu retencji.
8. Współczynnik podziału oktanol/woda substancji badanej można obliczyć poprzez doświadczalne określenie jego współczynnika retencji k, a następnie wprowadzenie k do następującego równania:
gdzie
a, b = współczynniki regresji liniowej.
Powyższe równanie można również uzyskać, przeprowadzając regresję liniową logarytmu współczynników podziału oktanol/woda substancji odniesienia w odniesieniu do logarytmu współczynników retencji substancji odniesienia.
9. Metoda HPLC w układzie faz odwróconych fazami umożliwia oszacowanie współczynników podziału w logarytmie Pow w przedziale od 0 do 6, ale w wyjątkowych przypadkach można ją rozszerzyć tak, aby objęła logarytm Poww przedziale od 6 do 10. Może to wymagać modyfikacji fazy ruchomej (3). Metoda ta nie ma zastosowania do mocnych kwasów i zasad, związków kompleksowych metali, substancji, które reagują z eluentem ani do środków powierzchniowo czynnych. Pomiary można wykonywać na substancjach podatnych na dysocjację w ich niezjonizowanej postaci (wolny kwas lub wolna zasada) jedynie poprzez zastosowanie odpowiedniego roztworu buforowego o pH poniżej pKa dla wolnego kwasu lub powyżej pKa dla wolnej zasady. Alternatywnie, do badania substancji podatnych na dysocjację dostępna może być metoda pH-metryczna (6) i można ją zastosować jako metodę alternatywną (6). Jeżeli wartość logarytmu Pow określa się w celu zastosowania w klasyfikacji zagrożeń dla środowiska lub w ocenie ryzyka środowiskowego, badanie należy przeprowadzić w przedziale pH odpowiednim dla środowiska naturalnego, tj. w przedziale pH 5,0-9.
10. W niektórych przypadkach zanieczyszczenia mogą utrudnić interpretację wyników z uwagi na niepewność pomiaru przy wyznaczaniu piku. Dla mieszanin dających nierozdzielone pasmo należy podać górną i dolną granicę logarytmu Pow oraz powierzchnię procentową każdego piku logarytmu Pow. Dla mieszanin będących grupami homologów należy również podać średnią ważoną logarytmu Pow (7), obliczoną w oparciu o pojedyncze wartości Pow i odpowiadające im wartości powierzchni procentowej (8). W obliczeniach należy uwzględnić wszystkie piki mające powierzchnię 5 % lub większą w ramach całkowitej powierzchni piku (9):
średnia ważona logPow=
Logarytm Pow średniej ważonej jest ważny jedynie dla substancji lub mieszanin (np. olej talowy) składających się z homologów (np. serii alkanów). Można wykonać pomiary mieszanin dające konkretne wyniki, pod warunkiem że czułość zastosowanego detektora analitycznego jest taka sama w odniesieniu do wszystkich substancji w mieszaninie i że mogą one zostać odpowiednio rozdzielone.
INFORMACJE NA TEMAT SUBSTANCJI BADANEJ
11. Przed zastosowaniem metody powinny być znane stała dysocjacji, wzór strukturalny oraz rozpuszczalność w fazie ruchomej. Dodatkowo przydatne byłyby informacje na temat hydrolizy.
KRYTERIA JAKOŚCI
12. W celu zwiększenia zaufania do pomiarów trzeba wykonywać po dwa oznaczenia.
- Powtarzalność: wartość logarytmu Pow uzyskana z wielokrotnych pomiarów wykonanych w identycznych warunkach i z zastosowaniem tego samego zestawu substancji odniesienia powinna mieścić się w zakresie ± 0,1 jednostki logarytmicznej.
- Odtwarzalność: jeżeli pomiary powtarza się z zastosowaniem innego zestawu substancji odniesienia, wyniki mogą się różnić. Zwykle współczynnik korelacji R dla zależności między logarytmem k a logarytmem Pow dla zestawu substancji badanych wynosi około 0,9, co odpowiada współczynnikowi podziału oktanol/woda logarytmu Pow wynoszącemu + 0,5 jednostki logarytmicznej.
13. Z międzylaboratoryjnego badania porównawczego wynika, że można uzyskać wartości logarytmu Pow metodą HPLC w zakresie + 0,5 jednostki wartości w ramach metody wstrząsania kolby (2). Inne porównania można znaleźć w literaturze przedmiotu (4)(5)(10)(11)(12). Wykres korelacji oparty na strukturalnie powiązanych substancjach odniesienia daje najdokładniejsze wyniki (13).
SUBSTANCJE ODNIESIENIA
14. W celu skorelowania zmierzonego współczynnika retencji k danej substancji z jego Pow trzeba ustalić wykres kalibracyjny z zastosowaniem co najmniej sześciu punktów (zob. pkt 24). Użytkownik może wybrać odpowiednie substancje odniesienia. Wartości logarytmu Pow substancji odniesienia zwykle powinny obejmować logarytm Pow substancji badanej, tj. Pow co najmniej jednej substancji odniesienia powinien być wyższy niż substancji badanej, a Pow innej substancji powinien być niższy niż substancji badanej. Ekstrapolację należy stosować wyłącznie w wyjątkowych przypadkach. Pożądane jest, aby przedmiotowe substancje odniesienia były strukturalnie powiązane z substancją badaną. Wartości logarytmu Pow substancji odniesienia zastosowanych do kalibracji powinny opierać się na wiarygodnych danych doświadczalnych. Dla substancji o wysokim logarytmie Pow (zwykle powyżej 4) można wykorzystać obliczone wartości, chyba że dostępne są wiarygodne dane doświadczalne. Jeżeli korzysta się z wartości ekstrapolowanych, należy podać wartość graniczną.
15. Rozszerzone wykazy wartości logarytmu Pow dla wielu grup substancji chemicznych są dostępne w pozycjach bibliograficznych (14) i (15). Jeżeli dane współczynników podziału strukturalnie powiązanych substancji nie są dostępne, można zastosować bardziej ogólną kalibrację ustaloną w oparciu o inne substancje odniesienia. Zalecane substancje odniesienia oraz ich wartości Pow wymieniono w tabeli 1. Dla substancji podatnych na dysocjację podane wartości mają zastosowanie do niezjonizowanej postaci. Wartości skontrolowano pod kątem wiarygodności i jakości podczas międzylaboratoryjnego badania porównawczego.
Tabela 1
Zalecane substancje odniesienia
| Numer CAS | Substancja odniesienia | logarytm Pow | stała dysocjacji (pKa) | |
| 1 | 78-93-3 | 2-butanon Keton metylowo-etylowy | 0,3 | |
| 2 | 1122-54-9 | 4-acetylopirydyna | 0,5 | |
| 3 | 62-53-3 | Anilina | 0,9 | |
| 4 | 103-84-4 | Acetanilid | 1,0 | |
| 5 | 100-51-6 | Alkohol benzylowy | 1,1 | |
| 6 | 150-76-5 | 4-metoksyfenol | 1,3 | pKa = 10,26 |
| 7 | 122-59-8 | Kwas fenoksyoctowy | 1,4 | pKa = 3,12 |
| 8 | 108-95-2 | Fenol | 1,5 | pKa = 9,92 |
| 9 | 51-28-5 | 2,4-dinitrofenol | 1,5 | pKa = 3,96 |
| 10 | 100-47-0 | Benzonitryl | 1,6 | |
| 11 | 140-29-4 | Fenyloacetonitryl | 1,6 | |
| 12 | 589-18-4 | Alkohol 4-metylobenzylowy | 1,6 | |
| 13 | 98-86-2 | Acetofenon | 1,7 | |
| 14 | 88-75-5 | 2-nitrofenol | 1,8 | pKa = 7,17 |
| 15 | 121-92-6 | Kwas 3-nitrobenzoesowy | 1,8 | pKa = 3,47 |
| 16 | 106-47-8 | 4-chloroanilina | 1,8 | pKa = 4,15 |
| 17 | 98-95-3 | Nitrobenzen | 1,9 | |
| 18 | 104-54-1 | Alkohol cynamylowy (Alkohol cynamonowy) | 1,9 | |
| 19 | 65-85-0 | Kwas benzoesowy | 1,9 | pKa = 4,19 |
| 20 | 106-44-5 | P-krezol | 1,9 | pKa = 10,17 |
| 21 | 140-10-3 (trans) | Kwas cynamonowy | 2,1 | pKa = 3,89 (cis) 4,44 (trans) |
| 22 | 100-66-3 | Anizol | 2,1 | |
| 23 | 93-58-3 | Benzoesan metylu | 2,1 | |
| 24 | 71-43-2 | Benzen | 2,1 | |
| 25 | 99-04-7 | Kwas 3-metylobenzoesowy | 2,4 | pKa = 4,27 |
| 26 | 106-48-9 | 4-chlorofenol | 2,4 | pKa = 9,1 |
| 27 | 79-01-6 | Trójchloroetylen | 2,4 | |
| 28 | 1912-24-9 | Atrazyna | 2,6 | |
| 29 | 93-89-0 | Benzoesan etylu | 2,6 | |
| 30 | 1194-65-6 | 2,6-dichlorobenzonitryl | 2,6 | |
| 31 | 535-80-8 | Kwas 3-chlorobenzoesowy | 2,7 | pKa = 3,82 |
| 32 | 108-88-3 | Toluen | 2,7 | |
| 33 | 90-15-3 | 1-naftol | 2,7 | pKa = 9,34 |
| 34 | 608-27-5 | 2,3-dichloroanilina | 2,8 | |
| 35 | 108-90-7 | Chlorobenzen | 2,8 | |
| 36 | 1746-13-0 | Eter allilowo-fenylowy | 2,9 | |
| 37 | 108-86-1 | Bromobenzen | 3,0 | |
| 38 | 100-41-4 | Etylobenzen | 3,2 | |
| 39 | 119-61-9 | Benzofenon | 3,2 | |
| 40 | 92-69-3 | 4-fenylofenol | 3,2 | pKa = 9,54 |
| 41 | 89-83-8 | Tymol | 3,3 | |
| 42 | 106-46-7 | 1,4-dichlorobenzen | 3,4 | |
| 43 | 122-39-4 | Difenyloamina | 3,4 | pKa = 0,79 |
| 44 | 91-20-3 | Naftalen | 3,6 | |
| 45 | 93-99-2 | Benzoesan fenylu | 3,6 | |
| 46 | 98-82-8 | Izopropylobenzen | 3,7 | |
| 47 | 88-06-2 | 2,4,6-trichlorofenol | 3,7 | pKa = 6 |
| 48 | 92-52-4 | Bifenyl | 4,0 | |
| 49 | 120-51-4 | Benzoesan benzylu | 4,0 | |
| 50 | 88-85-7 | 2,4-Dinitro-6-sec-butylofenol | 4,1 | |
| 51 | 120-82-1 | 1,2,4-trichlorobenzen | 4,2 | |
| 52 | 143-07-7 | Kwas dodekanowy | 4,2 | pKa = 5,3 |
| 53 | 101-84-8 | Eter difenylowy | 4,2 | |
| 54 | 85-01-8 | Fenantren | 4,5 | |
| 55 | 104-51-8 | n-butylobenzen | 4,6 | |
| 56 | 103-29-7 | Dibenzyl | 4,8 | |
| 57 | 3558-69-8 | 2,6-difenylopirydyna | 4,9 | |
| 58 | 206-44-0 | Fluoranten | 5,1 | |
| 59 | 603-34-9 | Trifenyloamina | 5,7 | |
| 60 | 50-29-3 | DDT | 6,5 |
OPIS METODY
Wstępne oszacowanie współczynnika podziału
16. W razie konieczności współczynnik podziału substancji badanej można oszacować, najlepiej stosując metodę obliczania (zob. dodatek) lub, w stosownych przypadkach, wykorzystując stosunek rozpuszczalności substancji badanej w czystych rozpuszczalnikach.
Aparatura
17. Wymagany jest chromatograf cieczowy wyposażony w niskociśnieniową pompę i odpowiedni system detekcji. Do wielu różnorodnych grup substancji chemicznych ma zastosowanie detektor UV wykorzystujący długość fali wynoszącą 210 nm lub detektor współczynnika załamania światła. Obecność grup polarnych w fazie stacjonarnej może poważnie zakłócić działanie kolumny HPLC. W związku z tym fazy stacjonarne powinny posiadać minimalną zawartość grup polarnych (16). Można stosować dostępne na rynku mikrocząsteczkowe wypełnienie dla fazy odwróconej lub gotowe wypełnione kolumny. Kolumna osłonowa może być umieszczona między systemem dozowania a kolumną analityczną.
Faza ruchoma
18. Do przygotowania eluentu, który zostaje odgazowany przed użyciem, stosuje się metanol do HPLC oraz wodę destylowaną lub dejonizowaną. Wykorzystuje się elucję izokratyczną. Należy stosować stosunki metanol/woda o minimalnej zawartości wody 25 %. Mieszanina metanol-woda o typowym stosunku 3:1 (obj.) jest zadowalająca do wymywania związków o logarytmie P 6 w ciągu jednej godziny, przy szybkości przepływu 1 ml/min. Dla substancji o logarytmie P powyżej 6 może być konieczne skrócenie czasu elucji (oraz czasów elucji substancji odniesienia) poprzez zmniejszenie polarności fazy ruchomej lub długości kolumny.
19. Substancja badana i substancje odniesienia muszą być rozpuszczalne w fazie ruchomej w stężeniu umożliwiającym ich wykrycie. Tylko w wyjątkowych przypadkach można zastosować dodatki do mieszaniny metanol-woda, ponieważ dodatki zmieniają właściwości kolumny. W takich przypadkach trzeba potwierdzić, że nie ma to wpływu na czas retencji substancji badanych ani substancji odniesienia. Jeżeli układ metanol-woda nie jest odpowiedni, można użyć innych mieszanin rozpuszczalników organicznych z wodą, na przykład etanol-woda, acetonitryl-woda lub alkohol izopropylowy (propan-2-ol)-woda.
20. Wartość pH eluentu ma znaczenie krytyczne dla substancji podatnych na dysocjację. Powinna ona znajdować się w zakresie roboczym pH kolumny, który zwykle wynosi 2-8. Zalecane jest buforowanie. Należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do strącania się soli i zniszczenia kolumny, co zachodzi w przypadku niektórych mieszanin fazy organicznej i roztworu buforowego. Pomiary HPLC w przypadku faz stacjonarnych opartych na krzemionce powyżej pH 8 nie są zwykle zalecane, gdyż użycie zasadowej fazy ruchomej może powodować gwałtowne pogorszenie się wydajności kolumny.
Substancje rozpuszczone
21. Substancje badane i substancje odniesienia muszą być wystarczająco czyste, aby można było przypisać piki w chromatogramach do odpowiednich substancji. Substancje używane do celów badania lub kalibracji są rozpuszczone, o ile to możliwe, w fazie ruchomej. Jeżeli do rozpuszczania substancji badanej i substancji odniesienia stosuje się rozpuszczalnik inny niż faza ruchoma, fazę ruchomą należy zastosować do ostatecznego rozpuszczenia przed wstrzyknięciem.
Warunki badania
22. Temperatura w trakcie wykonywania pomiarów nie może zmieniać się o więcej niż ± 1 °C.
Oznaczenie czasu martwego t0
23. Czas martwy t0 można obliczyć, wykorzystując niezwiązane substancje organiczne (np. tiomocznik lub formamid). Bardziej precyzyjny czas martwy można uzyskać na podstawie zmierzonych czasów retencji lub zestawu około siedmiu członów szeregu homologicznego (np. n-alkilometyloketonów) (17). Czasy retencji tR (nC + 1) są wykreślane w funkcji tR (nC), gdzie nC oznacza liczbę atomów węgla. Uzyskuje się linię prostą, tR (nC + 1) = A tR (nC) + (1 - A)t0, gdzie A odpowiadające k(nC + 1)/k(nC) jest stałe. Czas martwy t0 uzyskuje się na podstawie punktu przecięcia (1 - A)t0 oraz nachylenia A.
Równanie regresji
24. Następnym krokiem jest wykreślenie korelacji logarytmu k w odniesieniu do logarytmu P dla właściwych substancji odniesienia o wartościach logarytmu P zbliżonych do wartości spodziewanych dla substancji badanej. W praktyce wstrzykuje się jednocześnie 6-10 substancji odniesienia. Oznacza się czasy retencji, najlepiej przez integrator rejestrujący podłączony do systemu detekcji. Odpowiadające logarytmy współczynników retencji, logarytm k, są wykreślane w funkcji logarytmu P. Równanie regresji jest wykonywane w regularnych odstępach czasu, co najmniej raz dziennie, tak aby możliwe zmiany wydajności kolumny mogły być uwzględniane.
OZNACZANIE POW SUBSTANCJI BADANEJ
25. Substancja badana jest wstrzykiwana w najmniejszych wykrywalnych ilościach. Czas retencji oznacza się podwójnie. Współczynnik podziału substancji badanej uzyskuje się poprzez interpolację obliczonego współczynnika retencji na wykresie kalibracyjnym. Dla bardzo niskich oraz dla bardzo wysokich współczynników podziału konieczna jest ekstrapolacja. Szczególnie w tych przypadkach trzeba zwrócić uwagę na granice ufności linii regresji. Jeżeli czas retencji próby wykracza poza zakres czasów retencji uzyskanych z norm, należy podać wartość graniczną.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Sprawozdanie z badania
26. Sprawozdanie musi zawierać następujące dane:
- wstępne oszacowanie współczynnika podziału, jeżeli jest oznaczony, szacowane wartości i zastosowaną metodę; a jeżeli zastosowano metodę obliczania - jej pełny opis, w tym określenie bazy danych i szczegółowe informacje na temat wyboru fragmentów;
- substancje badane i substancje odniesienia: czystość, wzór strukturalny i numer CAS;
- opis wyposażenia i warunki pracy: kolumna analityczna, kolumna osłonowa;
- fazę ruchomą, sposoby wykrywania, zakres temperatur, pH;
- profile elucji (chromatogramy);
- czas martwy i sposób jego pomiaru;
- dane retencji oraz literaturowe wartości logarytmu Pow dla substancji odniesienia użytych w kalibracji;
- szczegółowe informacje na temat dopasowania linii regresji (logarytm k w odniesieniu do logarytmu Pow) oraz współczynnik korelacji linii, w tym przedziały ufności;
- dane średniej retencji i interpolowaną wartość logarytmu Pow substancji badanej;
- w przypadku mieszanin: chromatogram profilu elucji z zaznaczonymi wartościami granicznymi;
- wartości logarytmu Pow dotyczące zakresu procentowego piku logarytmu
- obliczenie z zastosowaniem linii regresji;
- w stosownych przypadkach obliczoną średnią ważoną wartości logarytmu Pow.
BIBLIOGRAFIA
(1) C.V. Eadsforth i P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.
(2) W. Klein, Kördel, M. Weiss i H.J. Poremski. (1988). Updating of the OECD Test Guideline 107 Partition Coefficient n-Octanol-Water, OECD Laboratory Intercomparison Test on the HPLC Method. Chemosphere. 17, 361.
(3) C.V. Eadsforth. (1986). Application of Reverse H.P.L.C. for the Determination of Partition Coefficient. Pesticide Science. 17, 311.
(4) H. Ellgehausen, C. D'Hondt i R. Fuerer (1981). Reversed-phase chromatography as a general method for determining octan-1-ol/water partition coefficients. Pesticide. Science. 12, 219.
(5) B. McDuffie (1981). Estimation of Octanol Water Partition Coefficients for Organic Pollutants Using Reverse Phase High Pressure Liquid Chromatography. Chemosphere. 10, 73.
(6) OECD (2000). Guideline for Testing of Chemicals - Partition Coefficient (n-octanol/water):pH-metric Method for Ionisable Substances. Projekt wytycznej, listopad 2000 r.
(7) OSPAR (1995). Harmonised Offshore Chemicals Notification Format (HOCFN) 1995, Oslo and Paris Conventions for the Prevention of Marine Pollution Programmes and Measures Committee (PRAM), załącznik 10, Oviedo, 20-24 lutego 1995 r.
(8) M. Thatcher, M. Robinson, L. R. Henriquez i C. C. Karman. (1999). An User Guide for the Evaluation of Chemicals Used and Discharged Offshore, A CIN Revised CHARM III Report 1999. Wersja 1.0, 3. Sierpień.
(9) E. A. Vik, S. Bakke i K. Bansal. (1998). Partitioning of Chemicals. Important Factors in Exposure Assessment of Offshore Discharges. Environmental Modelling & Software, tom 13, s. 529-537.
(10) L.O. Renberg, S.G. Sundstroem i K. Sundh-Nygård. (1980). Partition coefficients of organic chemicals derived from reversed-phase thin-layer chromatography. Evaluation of methods and application on phosphate esters, polychlorinated paraffins and some PCB-substitutes. Chemosphere. 9, 683.
(11) W.E. Hammers, G. J.Meurs i C. L. De-Ligny. (1982). Correlations between liquid chromatographic capacity ratio data on Lichrosorb RP-18 and partition coefficients in the octanol-water system. J. Chromatography 247, 1.
(12) J.E. J. E. Haky i A. M. Young. (1984). Evaluation of a simple HPLC correlation method for the estimation of the octanol-water partition coefficients of organic compounds. J. Liq. Chromatography. 7, 675.
(13) S. Fujisawa i E. Masuhara. (1981). Determination of Partition Coefficients of Acrylates Methacrylates and Vinyl Monomers Using High Performance Liquid Chromatography. Journal of Biomedical Materials Research. 15, 787.
(14) C. Hansch i A. J. Leo. (1979). Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology. John Willey, Nowy Jork.
(15) C. Hansch, przewodniczący; A.J. Leo, dyr. (1982). Log P and Parameter Database: A tool for the quantitative prediction of bioactivity - udostępnione w ramach Pomona College Medical Chemistry Project, Pomona College, Claremont, Kalifornia 91711.
(16) R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. - Chim. Ther. 14, 479.
(17) G.E. Berendsen, P.J. Schoenmakers, L. de Galan, G. Vigh, Z. Varga-Puchony, i J. Inczédy. (1980). On determination of hold-up time in reversed-phase liquid chromatography. J. Liq. Chromato. 3, 1669.
Dodatek
Metody obliczania POW
WPROWADZENIE
1. W niniejszym dodatku przedstawiono krótkie wprowadzenie do obliczania Pow. Dalsze informacje czytelnik może znaleźć w podręcznikach (1)(2).
2. Obliczone wartości Pow wykorzystuje się do:
- określania, którą metodę eksperymentalną należy zastosować: metodę wstrząsania kolby dla logarytmu Pow wynoszącego - 2-4 oraz metodę HPLC dla logarytmu Pow wynoszącego 0-6;
- wybierania warunków, które mają być zastosowane w HPLC (substancje odniesienia, stosunek metanol/ woda);
- sprawdzania wiarygodności wartości uzyskanych dzięki metodom eksperymentalnym;
- przedstawiania szacunków, w przypadku gdy nie można zastosować metod eksperymentalnych.
Zasada metod obliczania
3. Proponowane tutaj metody obliczania są oparte na teoretycznej fragmentacji cząsteczki na odpowiednie podstruktury, dla których znane są wiarygodne przyrosty logarytmu Pow. Logarytm Pow uzyskuje się poprzez zsumowanie wartości fragmentów i współczynników korygujących dla oddziaływań wewnątrzcząsteczkowych. Dostępne są wykazy stałych fragmentu cząsteczki i współczynników korygujących (1)(2)(3)(4)(5)(6). Niektóre są regularnie aktualizowane (3).
Wiarygodność obliczonych wartości
4. Zasadniczo wiarygodność metod obliczania obniża się wraz ze wzrostem złożoności badanej substancji. W przypadku prostych cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej i jednej lub dwóch grupach funkcyjnych można oczekiwać odchylenia 0,1-0,3 jednostek logarytmu Pow między wynikami różnych metod fragmentacji a wartościami pomiarowymi. Margines błędu będzie zależał od wiarygodności zastosowanych stałych fragmentu cząsteczki, zdolności rozpoznania oddziaływań wewnątrzcząsteczkowych (np. wiązań wodorowych) oraz poprawnego zastosowania współczynników korygujących. W przypadku substancji jonizujących należy uwzględnić ładunek i stopień jonizacji (10).
π-metoda Fujity-Hanscha
5. Stała podstawienia hydrofobowego, π, pierwotnie wprowadzona przez Fujitę i in. (7), jest zdefiniowana jako:
πX = log Pow (PhX) - log Pow (PhH)
gdzie PhX oznacza pochodną aromatyczną, a PhH substancję macierzystą.
np. πCl = log Pow (C6H5Cl) - log Pow (C6H6)
= 2,84 - 2,13
= 0,71
π-metoda jest przedmiotem szczególnego zainteresowania w przypadku substancji aromatycznych. Dostępne są π-wartości dla dużej liczby podstawników (4)(5).
Metoda Rekkera
6. Stosując metodę Rekkera (8), wartość logarytmu Pow oblicza się jako:
(składniki oddziaływań)
gdzie ai oznacza liczbę przypadków, gdy dany fragment występuje w cząsteczce, a fi oznacza przyrost logarytmu Pow fragmentu. Składniki oddziaływań można wyrazić jako całkowitą wielokrotność pojedynczej stałej Cm (tak zwaną "stałą magiczną"). Stałe fragmentu cząsteczki fi oraz Cm zostały ustalone na podstawie wykazu 1 054 doświadczalnych wartości Pow dla 825 substancji poprzez zastosowanie wielokrotnej analizy regresji (6)(8). Oznaczenie składników oddziaływań przeprowadza się zgodnie z wyznaczonymi zasadami (6)(8) (9).
Metoda Hansch-Leo
7. Stosując metodę Hanscha i Leo (4), wartość logarytmu Pow oblicza się jako:
gdzie Fi oznacza stałą fragmentu cząsteczki, Fj oznacza współczynnik korygujący, ai i bj oznaczają odpowiadającą częstotliwość występowania. Wykazy atomowych i grupowych wartości fragmentów oraz współczynniki korygujące Fj uzyskano metodą prób i błędów z doświadczalnych wartości Pow. Współczynniki korygujące podzielono na kilka różnych klas (1)(4). Opracowano pakiety oprogramowania, aby uwzględnić wszystkie zasady i współczynniki korygujące (3).
METODA POŁĄCZONA
8. Obliczanie logarytmu Pow złożonych cząsteczek można znacząco poprawić, jeżeli cząsteczkę dzieli się na większe podstruktury, dla których dostępne są wiarygodne wartości logarytmu Pow na podstawie tabeli (3)(4) albo na podstawie istniejących pomiarów. Takie fragmenty (np. heterocykle, antrachinon, azobenzen) mogą być potem połączone z wartościami π-Hanscha lub ze stałymi fragmentu cząsteczki Rekkera lub Leo.
Uwagi
(i) Metody obliczania mają zastosowanie tylko do substancji zjonizowanych częściowo lub w całości, w przypadku gdy uwzględniono niezbędne współczynniki korygujące.
(ii) Jeżeli można założyć, że istnieją wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe, trzeba dodać odpowiadające współczynniki korygujące (od około + 0,6 do + 1,0 jednostki logarytmu Pow) (1). Wskazania dotyczące występowania takich wiązań można uzyskać z modeli przestrzennych lub danych spektroskopowych.
(iii) Jeżeli możliwe jest występowanie kilku postaci tautomerycznych, podstawą do obliczeń powinna być najbardziej prawdopodobna postać.
(iv) Należy starannie prowadzić weryfikacje wykazów stałych fragmentu cząsteczki.
BIBLIOGRAFIA Z ZAKRESU METOD OBLICZANIA
(1) W.J. Lyman, W.F. Reehl i D. H. Rosenblatt (red.). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill, Nowy Jork (1982).
(2) W.J. Dunn, J.H. Block i R. S. Pearlman (red.). Partition Coefficient, Determination and Estimation, Pergamon Press, Elmsford (Nowy Jork) i Oxford (1986).
(3) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, Kalifornia 91711, USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).
(4) C. Hansch i A.J. Leo. Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, Nowy Jork (1979).
(5) Leo, C. Hansch i D. Elkins. (1971) Partition coefficients and their uses. Chemical. Reviews. 71, 525.
(6) R. F. Rekker, H. M. de Kort. (1979). The hydrophobic fragmental constant: An extension to a 1 000 data point set. Eur. J. Med. Chem. - Chim. Ther. 14, 479.
(7) Toshio Fujita, Junkichi Iwasa i Corwin Hansch (1964). A New Substituent Constant, π, Derived from Partition Coefficients. J. Amer. Chem. Soc. 86, 5175.
(8) R.F. Rekker. The Hydrophobic Fragmental Constant, Pharmacochemistry Library, tom 1, Elsevier, Nowy Jork (1977).
(9) C.V. Eadsforth i P. Moser. (1983). Assessment of Reverse Phase Chromatographic Methods for Determining Partition Coefficients. Chemosphere. 12, 1459.
(10) R.A. Scherrer. ACS - Symposium Series 255, s. 225, Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne, Waszyngton, D.C. (1984).
CZĘŚĆ B: METODY OZNACZANIA TOKSYCZNOŚCI I INNYCH SKUTKÓW ZDROWOTNYCH
WPROWADZENIE OGÓLNE
A. CHARAKTERYSTYKA SUBSTANCJI TESTOWANEJ
Skład substancji testowanej, w tym główne zanieczyszczenia oraz jej istotne właściwości fizyko-chemiczne włącznie z trwałością, powinny być znane przed rozpoczęciem każdego badania toksyczności.
Właściwości fizyko-chemiczne substancji testowanej dostarczają ważnych informacji przy wyborze drogi aplikowania, projektowaniu każdego poszczególnego badania oraz posługiwaniu się i przechowywaniu substancji testowanej.
Rozpoczęcie badania powinno poprzedzać zastosowanie metody analitycznej w celu jakościowego i ilościowego oznaczenia substancji testowanej (wraz z głównymi zanieczyszczeniami, jeżeli możliwe) w ośrodku dawkującym i materiale biologicznym.
Wszystkie informacje dotyczące identyfikacji, właściwości fizyko-chemicznych, czystości i zachowania substancji testowanej powinny być zawarte w sprawozdaniu z testu.
B. UTRZYMANIE ZWIERZĄT
Rygorystyczna kontrola warunków otoczenia i właściwe techniki utrzymania zwierząt są niezbędne przy testowaniu toksyczności.
(i) Warunki, w których przebywają zwierzęta
Warunki otoczenia w pomieszczeniach dla zwierząt doświadczalnych i zagrodach powinny być odpowiednie dla badanego gatunku. Odpowiednimi warunkami dla szczurów, myszy i świnek morskich są: temperatura pokojowa wynosząca 22 oC ± 3 oC i wilgotność względna 30-70 %; dla królików temperatura powinna wynosić 20 oC ± 3 oC przy wilgotności względnej 30-70 %.
Niektóre techniki eksperymentalne są szczególnie wrażliwe na wpływ temperatury i w takich przypadkach szczegóły odpowiednich warunków są zawarte w opisie metody badania. We wszystkich badaniach działania toksycznego temperatura i wilgotność powinny być monitorowane, rejestrowane i zawarte w końcowym sprawozdaniu z badania.
Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Szczegóły form oświetlenia powinny być rejestrowane i zawarte w końcowym sprawozdaniu z badania.
Przy braku innych wskazań w danej metodzie zwierzęta mogą być umieszczane pojedynczo, lub umieszczane w klatkach w małych grupach o tej samej płci; w przypadku umieszczania grupowego, nie więcej niż pięć zwierząt powinno być umieszczanych w jednej klatce.
W sprawozdaniach z eksperymentów na zwierzętach, ważne jest wskazanie stosowanego typu umieszczania zwierząt w klatkach i liczby zwierząt umieszczanych w każdej klatce zarówno podczas ekspozycji na związek chemiczny, jak i w późniejszym okresie obserwacji.
(ii) Warunki żywienia
Diety powinny w pełni spełniać zapotrzebowanie pokarmowe gatunku poddanego testowi. W przypadkach gdy substancje testowane są podawane zwierzętom w ich pożywieniu, wartość pokarmowa może być zredukowana przez interakcję tej substancji ze składnikiem pokarmowym. Możliwość takiej reakcji powinna być rozważona przy interpretacji wyników testów. Konwencjonalne diety laboratoryjne mogą być stosowane przy nieograniczonym dostarczaniu wody pitnej. Na wybór diety może mieć wpływ potrzeba zapewnienia odpowiedniej domieszki substancji testowanej przy podawaniu powyższą metodą.
Pokarmowe substancje zanieczyszczające, o których wiadomo, że wpływają na toksyczność, nie powinny być obecne w stężeniach przeszkadzających.
C. TESTOWANIE ALTERNATYWNE
Unia Europejska jest zaangażowana w promowanie rozwijania i zatwierdzania technik alternatywnych, które mogą dostarczyć ten sam poziom informacji jak obecne testy na zwierzętach, ale które stosują mniej zwierząt, powodują mniejsze cierpienie lub całkowicie unikają wykorzystania zwierząt.
Takie metody, w przypadku gdy staną się dostępne, muszą być rozważane, gdziekolwiek jest to możliwe, przy charakteryzowaniu zagrożenia i późniejszym klasyfikowaniu i etykietowaniu wewnętrznych zagrożeń.
D. OCENA I INTERPRETACJA
Podczas oceny i interpretacji testów, muszą być rozważone ograniczenia zakresu, w którym wyniki badań na zwierzętach i in vitro mogą być odniesione bezpośrednio do człowieka i dlatego tam, gdzie dostępne są dowody niekorzystnych skutków dla ludzi, mogą one być użyte do potwierdzenia wyników testowania.
D. BIBLIOGRAFIA
Większość tych metod jest opracowana w ramach programu OECD - wskazówki dotyczące testowania, i powinny być one realizowane zgodnie z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej, aby zapewnić możliwie najszerszą "wzajemną akceptację danych".
Dodatkowe informacje mogą być odnalezione w bibliografii wskazówek OECD i odpowiedniej literaturze publikowanej w innych źródłach.
B1 bis. TOKSYCZNOŚĆ OSTRA POKARMOWA - PROCEDURA Z WYKORZYSTANIEM STAŁEJ DAWKI
1. METODA
Niniejsza metoda jest kopią OECD TG 420 (2001)
1.1. WPROWADZENIE
Tradycyjne metody oceny ostrej toksyczności wykorzystują śmierć zwierząt jako punkt końcowy. W 1984 r. Brytyjskie Towarzystwo Toksykologiczne zaproponowało nowe podejście do określania ostrej toksyczności, oparte na podawaniu serii dawek o stałym stężeniu (1). To podejście umożliwia uniknięcie śmierci zwierząt jako punktu końcowego, wykorzystując jako alternatywę obserwacje wyraźnych objawów zatrucia na danym etapie podawania serii dawek o stałym stężeniu. W następstwie badań weryfikacyjnych in vivo, przeprowadzonych przez Zjednoczone Królestwo (2) oraz na szczeblu międzynarodowym (3), procedura ta została przyjęta jako metoda badawcza w 1992 r. Jednocześnie, wykorzystując w szeregu badań modele matematyczne, poddano ocenie właściwości statystyczne Procedury stałych dawek (4)(5)(6). Zarówno badania in vivo, jak i badania z wykorzystaniem modeli wykazały, że procedura ta jest powtarzalna, wymaga mniejszej liczby zwierząt i powoduje mniej cierpień niż metody tradycyjne oraz że możliwa jest dzięki niej ocena substancji w podobny sposób, jak to ma miejsce z wykorzystaniem innych metod.
Wytyczne dotyczące wyboru najbardziej odpowiedniej metody badawczej dla indywidualnych przypadków zostały zamieszczone w Wytycznych dotyczących badania ostrej toksyczności drogą pokarmową (7). Wytyczne te zawierają także dodatkowe informacje na temat przeprowadzania i interpretacji metody badawczej B.1 bis.
Zasadniczo w badaniu głównym z wykorzystaniem niniejszej metody stosuje się jedynie umiarkowane toksycznie dawki oraz unika się dawek mogących spowodować śmierć. Nie jest również konieczne podawanie dawek mogących powodować silny ból lub stres wynikający z działania żrącego lub podrażniającego. Zwierzęta w stanie agonalnym lub w oczywisty sposób cierpiące albo chore i przeżywające strach powinny zostać uśmiercone w humanitarny sposób i uwzględniane w interpretacji wyników badań jako zwierzęta padłe w trakcie badania. Kryteria podejmowania decyzji co do uśmiercenia zwierząt w stanie agonalnym lub cierpiących ból oraz wytyczne dotyczące rozpoznania przewidywanego lub zbliżającego się zgonu są zawarte w oddzielnych Wytycznych (8).
Metoda umożliwia przedstawienie informacji na temat niebezpiecznych właściwości danej substancji i pozwala na ocenę i klasyfikację zgodną z Globalnym Zharmonizowanym Systemem (GHS) klasyfikującym związki chemiczne pod względem ich ostrej toksyczności (9).
Laboratorium badawcze powinno uwzględnić wszystkie dostępne informacje na temat badanej substancji przed rozpoczęciem badań. Informacje te powinny obejmować nazwę i budowę chemiczną substancji; właściwości fizyko-chemiczne; wyniki innych badań toksyczności in vitro lub in vivo; dane dotyczące toksyczności substancji zbliżonych pod względem budowy; przewidywane zastosowanie (zastosowania) tej substancji. Informacje te są niezbędne celem spełnienia wszelkich wymogów dotyczących ochrony zdrowia ludzkiego, i pomocne w wyborze odpowiedniej dawki wyjściowej.
1.2. DEFINICJE
Toksyczność ostra pokarmowa: oznacza niepożądane skutki pojawiające się w następstwie podania doustnego pojedynczej dawki substancji lub wielu dawek w okresie 24 godzin.
Opóźniona śmierć: oznacza, że zwierzę nie umiera, ani nie wydaje się być w agonii przez 48 godzin, lecz pada później w 14-dniowym okresie obserwacyjnym.
Dawka: oznacza ilość podawanej substancji badanej. Dawka jest wyrażana jako masa próbki na jednostkę masy zwierzęcia (np. mg/kg).
Wyraźne działanie toksyczne: jest ogólnym terminem opisującym wyraźne objawy zatrucia występujące w następstwie podania substancji badanej (zob. (3) celem uzyskania przykładów), pozwalające oczekiwać, że u większości zwierząt następna najwyższa stała dawka spowoduje bądź silny ból, przewlekłe oznaki strachu, stan agonalny (kryteria są przedstawione w Wytycznych dotyczących humanitarnego punktu końcowego (8)), bądź zgon u większości badanych zwierząt.
GHS: Globalny zharmonizowany system klasyfikacji substancji i mieszanin chemicznych. Połączone działania OECD (w dziedzinie zdrowia ludzkiego i ochrony środowiska), Komitetu Ekspertów ONZ w sprawie transportu towarów niebezpiecznych (w zakresie właściwości fizyko-chemicznych) i Międzynarodowej Organizacji Pracy (ILO) (w zakresie wymiany informacji na temat niebezpieczeństw), koordynowane w ramach Międzyorganizacyjnego programu na rzecz właściwego zarządzania związkami chemicznymi (IOMC).
Zagrażająca śmierć: występuje w przypadku gdy przewiduje się wystąpienie stanu agonalnego lub śmierci przed następnym zaplanowanym czasem obserwacji. Objawy wskazujące na ten stan mogą obejmować u gryzonia konwulsje, ułożenie na boku, pozycja leżąca oraz drgawki (zob. Wytyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (9) celem uzyskania szczegółowych informacji).
LD50 (średnia dawka śmiertelna): jest statystycznie wyprowadzoną pojedynczą dawką substancji, która powoduje zgon 50 % zwierząt przy podaniu drogą pokarmową. Wartość LD50 jest wyrażona w wadze substancji badanej na jednostkę masy badanego zwierzęcia (mg/kg).
Dawka graniczna: oznacza górną dawkę graniczną w badaniach (2.000 lub 5.000 mg/kg).
Stan agonalny: stan śmierci lub niezdolności do przeżycia nawet w przypadku zastosowania leczenia (zob. Wytyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (8) w celu uzyskania danych szczegółowych).
Przewidywalna śmierć: obecność objawów klinicznych wskazujących na nadchodzący zgon przed planowanym zakończeniem eksperymentu, na przykład: niezdolność do dotarcia do wody lub pożywienia (zob. Wytyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (8) w celu uzyskania danych szczegółowych).
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Grupom zwierząt tej samej płci podaje się, zgodnie z procedurą stopniową, stałe dawki na poziomie 5, 50, 300 i 2.000 mg/kg (w wyjątkowych wypadkach można rozważyć podanie dodatkowej stałej dawki wynoszącej 5.000 mg/kg, zob. sekcja 1.6.2). Poziom pierwszej stałej dawki jest określany na podstawie badania poglądowego na poziomie, który spowoduje wystąpienie określonych objawów zatrucia, lecz nie spowoduje ciężkich zatruć lub śmierci. Objawy kliniczne oraz objawy kojarzone z bólem, cierpieniem i zbliżającą się śmiercią zostały opisane w oddzielnych Wytycznych OECD (8). Następnej grupie zwierząt może zostać podana wyższa bądź niższa stała dawka, w zależności od obecności lub braku objawów zatrucia lub śmiertelności. Taka procedura jest powtarzana aż do osiągnięcia dawki powodującej wyraźne zatrucie lub powodującej nie więcej niż jeden przypadek śmiertelny, lub w przypadku braku skutków w następstwie podania najwyższej dawki, bądź w przypadku zgonu przy najniższej dawce.
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.4.1. Wybór gatunków zwierząt
Preferowanym gatunkiem gryzonia jest szczur, choć dopuszcza się wykorzystywanie innych gatunków gryzoni. Na ogół w doświadczeniach wykorzystuję się samice (7). Wynika to z faktu, znajdującego swoje potwierdzenie w literaturze dotyczącej konwencjonalnych badań LD50, że różnice między płciami są znikome, lecz tam gdzie występują, samice są z reguły nieznacznie bardziej wrażliwe (10). Jednakże jeżeli wiedza na temat właściwości toksykologicznych i toksykokinetycznych związków o pokrewnej budowie wskazuje, że samce mogą być bardziej wrażliwe, w takim przypadku należy wybrać do badania tę płeć. Jeżeli badanie jest przeprowadzane na samcach, należy podać uzasadnienie.
Zaleca się wykorzystanie zdrowych, młodych, dorosłych zwierząt pochodzących ze szczepów na ogół wykorzystywanych w laboratorium. Samice powinny być bezdzietne i nieciężarne. Każde zwierzę na początku cyklu laboratoryjnego powinno być w wieku między 8 a 12 tygodniem, a jego masa nie powinna przekraczać lub być mniejsza o ± 20 % średniej masy wszystkich wykorzystywanych uprzednio zwierząt.
1.4.2. Warunki przebywania i warunki żywieniowe
Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 22o C (±3 oC). Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50-60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej. Zwierzęta mogą być grupowane w klatkach w sposób nieograniczający łatwej obserwacji pojedynczych sztuk.
1.4.3. Przygotowanie zwierząt
Zwierzęta są wybierane losowo, oznaczane w sposób umożliwiający identyfikację poszczególnych osobników, i przetrzymywane w swoich klatkach przynajmniej przez 5 dni przed podaniem pierwszej dawki, co umożliwia aklimatyzację do warunków laboratoryjnych.
1.4.4. Przygotowanie dawek
Na ogół badana substancja powinna być podawana w dawkach o stałej objętości przy zmianie stężenia dawkowanego preparatu. Jednakże w przypadku badania końcowego produktu będącego cieczą lub mieszaniny, dla celów oceny niebezpiecznego działania tej substancji, bardziej stosowne może okazać się wykorzystanie substancji nierozcieńczonej. tj. substancji o stałym stężeniu. Wymóg ten może być ponadto określony w niektórych przepisach wykonawczych. W żadnym razie niedopuszczalne jest przekroczenie maksymalnej objętości przewidzianej do podania. Maksymalna objętość cieczy podanej jednorazowo zależy od
wielkości badanego zwierzęcia. Dla gryzoni objętość ta nie powinna przekraczać 1 ml/100 g masy ciała: jednakże w przypadku roztworów wodnych dopuszczalne jest przyjęcie dawki 2 ml/100 g masy ciała. Jeżeli chodzi o przygotowywanie dozowanego preparatu, należy użyć, o ile to możliwe, roztworów/zawiesin/emulsji wodnych, następnie rozważyć przygotowanie roztworów/zawiesin/emulsji w oleju (np. oleju kukurydzianym), a dopiero w następnej kolejności roztworów innych nośników. W przypadkach stosowania nośnika różnego od wody muszą być znane jego właściwości toksykologiczne. Dawki muszą być przygotowywane na krótko przed podaniem, chyba że stabilność przygotowanego preparatu w okresie w jakim ma on być stosowany jest znana i możliwa do przyjęcia.
1.5. PROCEDURA
1.5.1. Podawanie dawki
Substancja badana jest podawana w formie pojedynczej dawki przez zgłębnik przy użyciu sondy przełykowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. W nietypowych przypadkach, gdy niemożliwe jest podanie pojedynczej dawki, jednorazowa dawka może zostać rozbita na mniejsze porcje i podawana w odstępach czasowych w okresie nieprzekraczającym 24 godzin.
Zwierzęta powinny być wyposzczone przed podaniem dawki (np. szczurom należy wstrzymać podawanie jedzenia przez noc, lecz nie wstrzymywać wody, myszom należy wstrzymać jedzenie przez 3-4 godziny, lecz nie wstrzymywać wody). Następnie, po wyposzczeniu, zwierzęta należy zważyć oraz podać im substancję badaną. W przypadku szczurów, po podaniu substancji badanej można wstrzymać podawanie jedzenia przez 3-4 godziny, a w przypadku myszy przez 1-2 godziny. Jeżeli dawka jest podawana porcjami przez określony czas, może być konieczne podanie pokarmu i wody w zależności od długości okresu podawania dawki.
1.5.2. Badania poglądowe
Celem badań poglądowych jest wybranie odpowiedniej dawki początkowej dla badań zasadniczych. Substancja badana jest podawana poszczególnym zwierzętom w sposób sekwencyjny, zgodnie ze schematem postępowania zawartym w załączniku 1. Badania poglądowe są przerywane, gdy możliwe jest podjęcie decyzji co do ilości dawki wyjściowej (lub następuje śmierć w wyniku podania najmniejszej stałej dawki).
Dawka początkowa wyznaczona do badania poglądowego danej substancji jest wybierana w oparciu o dane eksperymentalne z badań in vivo i in vitro tej samej substancji lub substancji pokrewnych pod względem budowy, spośród stałych dawek określonych na poziomie 5, 50, 300, i 2.000 mg/kg, jako dawka, która powinna wywołać wyraźną toksyczność. W przypadku braku danych na temat takich substancji należy ustalić dawkę wyjściową na poziomie 300 mg/kg.
Dopuszczalna jest nie krótsza niż 24-godzinna przerwa w podawaniu dawki jednemu zwierzęciu. Wszystkie zwierzęta należy objąć obserwacją przez przynajmniej 14 dni.
W wyjątkowych okolicznościach i wyłącznie jeżeli wymagają tego określone potrzeby regulacyjne, można rozważyć podanie dawki dodatkowej stałej na górnym poziomie 5.000 mg/kg (zob. załącznik 3). Z uwagi na dobrostan zwierząt badania na zwierzętach w zakresie kategorii 5 GSH (2.000 i 5.000 mg/kg) są odradzane i powinny być rozważane wyłącznie w przypadku znacznego prawdopodobieństwa, że wyniki takich badań przyniosą bezpośrednie korzyści dla ochrony zdrowia ludzkiego, zwierząt lub środowiska naturalnego.
W przypadku gdy zwierzę, któremu w badaniach poglądowych została podana najniższa stała dawka (5 mg/ kg), ginie, normalną procedurą jest przerwanie badań i przypisanie substancji do kategorii 1 GSH (jak to przedstawiono w załączniku 1). Jednakże w przypadku gdy wymagane jest potwierdzenie klasyfikacji wstępnej, możliwe jest przeprowadzenie procedury dodatkowej, zgodnie z poniższym opisem. Drugie zwierzę otrzymuje dawkę 5 mg/kg. Jeżeli również ono pada, przypisanie do kategorii 1 GHS zostaje potwierdzone, a badanie zostaje natychmiastowo przerwane. Jeżeli drugie zwierzę przeżyje, dawkę 5 mg/kg podaje się maksymalnie trzem kolejnym zwierzętom. Z uwagi na wysokie ryzyko śmiertelności dawki powinny być podawane sekwencyjnie, co zapewni optymalną ochronę zwierząt. Przerwy w podawaniu dawek każdemu zwierzęciu powinny pozwalać na uzyskanie pewności, że poprzednie zwierzę przeżyje. W momencie wystąpienia drugiego przypadku śmiertelnego sekwencyjne podawanie dawek zostaje natychmiast przerwane, a podawanie dawek kolejnym zwierzętom wstrzymane. Ponieważ wystąpienie drugiego przypadku śmiertelnego (niezależnie od liczby zwierząt poddanych badaniu do momentu ich przerwania) mieści się w wyniku A (2 lub więcej przypadków śmiertelnych), stosowana jest zasada klasyfikacji określona w załączniku 2, zgodnie z którą stężenie stałej dawki wynosi 5 mg/kg. Dodatkowo, do momentu przyjęcia nowego GHS, obowiązujące są wytyczne zawarte w załączniku 4, dotyczące klasyfikacji substancji w ramach systemu WE.
1.5.3. Badania zasadnicze
1.5.3.1. Liczba zwierząt i poziomy dawek
Działania, jakie mają być podjęte w następstwie przeprowadzenia badań przy pomocy dawek wyjściowych, są przedstawione na schemacie postępowania zawartym w załączniku 2. Wymagany jest jeden z trzech schematów postępowania; bądź przerwanie testów i przypisanie do jednej z klas klasyfikacji niebezpieczeństwa, zbadanie zwierzęcia przy pomocy wyższej stałej dawki, bądź jego zbadanie przy pomocy niższej stałej dawki. Jednakże w celu ochrony zwierząt poziom, który spowodował śmierć zwierzęcia w trakcie badań poglądowych, nie będzie powtórnie wykorzystany w badaniach zasadniczych (zob. załącznik 2). Doświadczenie wykazuje, że najbardziej prawdopodobny wynik na poziomie wyjściowym stałej dawki umożliwi klasyfikację substancji, skutkiem czego nie będą konieczne dalsze badania.
Normalnie wykorzystuje się ogólną liczbę pięciu zwierząt jednej płci dla każdego badanego poziomu dawki. Liczba ta obejmuje jedno zwierzę zbadane w trakcie badań poglądowych przy pomocy wybranej dawki oraz cztery inne zwierzęta (z wyjątkiem sytuacji, w których poziom dawki wykorzystanej w badaniach zasadniczych nie był wcześniej zastosowany w badaniach poglądowych).
Odstępy między podawaniem dawek na każdym poziomie określa się na podstawie czasu wystąpienia, długości trwania i dokuczliwości objawów zatrucia. Podanie zwierzęciu następnej dawki powinno zostać opóźnione do momentu uzyskania pewności co do możliwości przeżycia zwierząt, którym podano ostatnią dawkę. Zalecana jest przerwa rzędu 3 lub 4 dni między podaniem kolejnych dawek, o ile wystąpi taka potrzeba, w celu umożliwienia obserwacji opóźnionego zatrucia. Odstęp ten może zostać przedłużony np. w przypadku niejednoznacznej reakcji.
W przypadku stosowania górnej dawki granicznej na poziomie 5.000 mg/kg należy stosować procedurę przedstawioną w załączniku 3 (zob. także sekcja 1.6.2).
1.5.3.2. Badanie graniczne
Badanie graniczne jest stosowane w sytuacji gdy badający posiada informacje sugerujące, że badany materiał może być nietoksyczny np. posiada toksyczność na poziomie przekraczającym nieznacznie dawki graniczne określone przepisami wykonawczymi. Informacje na temat toksyczności można uzyskać na podstawie wiedzy na temat podobnych zbadanych związków lub podobnych badanych mieszanin lub produktów, z uwzględnieniem tożsamości i zawartości procentowej składników, o których wiadomo, że mają znaczenie z punktu widzenia toksyczności. W sytuacji niewystarczającej ilości lub braku informacji na temat toksyczności materiału badanego lub w przypadku gdy oczekuje się, że badany materiał może być toksyczny, należy przeprowadzić badanie zasadnicze.
W przypadku zastosowania normalnej procedury badanie graniczne dla potrzeb niniejszych wytycznych polega na podaniu dawki wyjściowej badania poglądowego, a następnie podaniu substancji czterem pozostałym zwierzętom.
1.6. OBSERWACJE
Zwierzęta są poddawane obserwacji osobniczej przynajmniej raz w ciągu pierwszych 30 minut po podaniu dawki, okresowo przez pierwsze 24 godziny, ze szczególnym uwzględnieniem pierwszych 4 godzin, a następnie codziennie, ogólnie przez 14 dni, z wyjątkiem sytuacji, w których muszą one zostać wyeliminowane z badań i uśmiercone w sposób humanitarny z uwagi na ich dobrostan, lub gdy padły. Jednakże czas trwania obserwacji nie powinien być ustalany według ścisłych reguł. Powinien zależeć od działania toksycznego, czasu wystąpienia skutków i długości okresu powrotu do stanu normalnego, i może skutkiem tego być wydłużony, w przypadku gdy zostanie to uznane za stosowne. Czas, w jakim pojawiają się i zanikają objawy zatrucia, jest istotny, szczególnie w przypadku występowania opóźnionych objawów zatrucia (11). Wszystkie spostrzeżenia są systematycznie zapisywane w ewidencji prowadzonej osobno dla każdego osobnika.
Dodatkowe obserwacje są wymagane, jeżeli zwierzęta wciąż wykazują objawy zatrucia. Obserwacje powinny dotyczyć zmian na skórze i futrze, oczach i błonach śluzowych, a także w układach oddechowym, krążenia, autonomicznym i centralnym układzie nerwowym oraz zmian w funkcjonowaniu somatomotorycznym i schematach zachowań. Szczególną uwagę należy poświęcić obserwacjom drżenia, konwulsji, ślinienia się, biegunki, letargu, snu i śpiączki. Należy przestrzegać zasad i kryteriów streszczonych w Wytycznych dotyczących humanitarnego punktu końcowego (8). Zwierzęta, u których stwierdzono stan agonalny, oraz zwierzęta wykazujące objawy silnego bólu, powinny zostać uśmiercone w sposób humanitarny. W przypadku uśmiercenia zwierząt z przyczyn humanitarnych lub ich zgonu, czas zgonu powinien zostać zapisany najdokładniej jak to możliwe.
1.6.1. Masa ciała
Masa każdego zwierzęcia powinna zostać określona na krótko przed podaniem substancji badanej i przynajmniej w odstępie tygodnia od jej podania. Zmiany masy powinny zostać obliczone i zapisane. Po zakończeniu badań zwierzęta, które przeżyły, są ważone i uśmiercane w sposób humanitarny.
1.6.2. Patologia
Wszystkie badane zwierzęta (włączając zwierzęta, które padły podczas badań lub zostały wyeliminowane z badań ze względu na ich dobrostan) powinny zostać poddane całkowitej sekcji zwłok. Wszystkie całkowite zmiany patologiczne powinny zostać zapisane oddzielnie dla każdego zwierzęcia. Badanie mikroskopowe organów wykazujących wyraźne zmiany patologiczne u zwierząt, które przeżyły 24 lub więcej godzin po podaniu pierwszej dawki, mogą również zostać rozważone, ponieważ mogą one dostarczyć użytecznych informacji.
2. DANE
Należy podać dane dla każdego zwierzęcia. Dodatkowo, wszystkie dane powinny zostać streszczone w tabeli, pokazującej dla każdej badanej grupy liczbę wykorzystanych sztuk, liczbę zwierząt wykazujących objawy zatrucia, liczbę zwierząt padłych w trakcie badań lub uśmierconych z przyczyn humanitarnych, czas zgonu poszczególnych zwierząt, opis oraz przebieg w czasie skutków zatrucia oraz powrotu do stanu normalnego, a także wyniki sekcji zwłok.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań musi zawierać następujące informacje, jeśli są one stosowne:
Substancja badana:
- charakter fizyczny, czystość, i jeśli to stosowne, właściwości fizyko-chemiczne (włączając rodzaj izomerii),
- identyfikację w tym numer CAS. Nośnik (jeśli był użyty):
- uzasadnienie wyboru nośnika, jeśli jest inny niż woda. Zwierzęta badane:
- użyty gatunek/szczep,
- stan mikrobiologiczny zwierzęcia, jeśli jest znany,
- liczbę, wiek i płeć zwierząt (włączając, o ile to stosowne, uzasadnienie wykorzystania samców zamiast samic),
- źródło, warunki środowiska, pożywienie itp. Warunki badań:
- szczegóły dotyczące postaci substancji badanej, włączając stan skupienia podawanego środka,
- szczegóły dotyczące podawania substancji badanej, włączając objętość dawki oraz czas podawania dawki,
- szczegóły dotyczące jakości pożywienia i wody (włączając w to rodzaj/źródło diety, źródło wody),
- uzasadnienie wyboru dawki wyjściowej. Wyniki:
- tabelę przedstawiającą dane nt. reakcji oraz poziomów dawek dla każdego zwierzęcia (np. zwierząt wykazujących objawy zatrucia, włączając śmiertelność, a także charakter, intensywność oraz trwałość objawów),
- tabelę zawierającą informację na temat masy ciała oraz zmiany masy ciała,
- masę indywidualną zwierząt w dniu podania dawki, następnie w odstępach tygodniowych, a także w momencie śmierci lub uśmiercenia,
- data i czas śmierci, o ile nastąpiła przed przewidywanym uśmierceniem,
- przebieg w czasie objawów zatrucia i informacje, czy były one odwracalne w przypadku każdego zwierzęcia,
- wyniki sekcji zwłok oraz badań histopatologicznych dla każdego zwierzęcia, jeżeli są dostępne. Omówienie i interpretacja wyników.
Wnioski.
4. BIBLIOGRAFIA
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparation on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3, 85-92.
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparation for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291.
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.
(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem. Toxicol., 30, 313-324.
(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl.Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed doseprocedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196.
(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.
(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.
(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3 rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.
ZAŁĄCZNIK 1
SCHEMAT DZIAŁAŃ DLA BADAŃ POGLĄDOWYCH
ZAŁĄCZNIK 2
SCHEMAT DZIAŁAŃ DLA BADAŃ ZASADNICZYCH
ZAŁĄCZNIK 3
KRYTERIA KLASYFIKACJI SUBSTANCJI BADANYCH O OCZEKIWANYCH WARTOŚCIACH LD50 PRZEKRACZAJĄCYCH 2.000 MG/KG, Z POMINIĘCIEM BADAŃ
Kryteria kategorii niebezpieczeństwa 5 mają w zamierzeniu umożliwiać identyfikację substancji badanych, które charakteryzują się niskim niebezpieczeństwem ostrej toksyczności, lecz które w określonych okolicznościach mogą okazać się niebezpieczne dla populacji podatnych na zatrucie. Przewiduje się, że takie substancje charakteryzują się pokarmowym lub skórnym LD50 mieszczącym się w zakresie 2.000-5.000 mg/kg lub odpowiadają analogicznym dawkom w przypadku innych szlaków kontaktu z substancją. Substancja może zostać zaklasyfikowana do kategorii niebezpieczeństwa przy następujących cechach: 2.000 mg/kg < LD50 < 5.000 mg/kg (kategoria 5 według GHS) w następujących przypadkach:
a) jeżeli została przypisana do tej kategorii w wyniku zastosowania jednego ze schematów przedstawionych w załączniku 2, w oparciu o poziom śmiertelności;
b) jeżeli dostępne są wiarygodne dowody wskazujące, że LD50 powinno znaleźć się w obrębie kategorii 5; bądź jeżeli inne badania na zwierzętach lub ostre skutki u ludzi sugerują niebezpieczeństwo dla zdrowia ludzkiego spowodowane ostrym działaniem;
c) jeżeli okazuje się, w wyniku przeprowadzenia ekstrapolacji, szacunków lub pomiaru danych, że przypisanie do wyższej klasy zagrożenia nie jest uzasadnione oraz:
- dostępne są wiarygodne informacje wskazujące na silne skutki toksyczne u ludzi, lub
- zaobserwowano przypadki zgonu w toku pomiarów do wartości kategorii 4 w przypadku podania substancji droga pokarmową, lub
- jeżeli ocena eksperta potwierdzi wyraźne kliniczne objawy toksyczności, w trakcie pomiarów do wartości kategorii 4, z wyjątkiem przypadków biegunki, piloerekcji lub wyglądu odbiegającego w sposób negatywny od normy, lub
- jeżeli ocena eksperta potwierdzi wiarygodność informacji wskazujących na potencjalne, znaczne, ostre działanie, uzyskanych w wyniku innych badań na zwierzętach.
BADANIA PRZY DAWKACH PRZEKRACZAJĄCYCH 2.000 MG/KG
W wyjątkowych okolicznościach i wyłącznie jeżeli wymagają tego określone potrzeby regulacyjne, można rozważyć podanie dawki dodatkowej stałej na górnym poziomie 5.000 mg/kg. Z uwagi na dobrostan zwierząt badania przy 5.000 mg/kg są odradzane i powinny być brane pod uwagę wyłącznie w przypadku znacznego prawdopodobieństwa, że wyniki takich badań przyniosą bezpośrednie korzyści dla ochrony zdrowia ludzkiego, zwierząt lub środowiska naturalnego (9).
Badanie poglądowe
Zakres przepisów niniejszej decyzji dotyczących procedury sekwencyjnej określonej w załączniku 1 zostaje rozszerzony o poziom dawki wynoszący 5.000 mg/kg. W związku z tym, jeżeli w przypadku zastosowania w badaniu poglądowym dawki początkowej wynoszącej 5.000 mg/kg wystąpi wynik A (zgon), należy zbadać następne zwierzę z wykorzystaniem dawki 2.000 mg/kg; pojawienie się wyników B i C (wyraźne zatrucie lub brak zatrucia) pozwoli na wybranie dawki 5.000 mg/kg jako dawki wyjściowej ma być: jako dawki wyjściowej badania głównego. Podobnie, jeżeli zostanie użyta inna dawka niż 5.000 mg/kg, badanie będzie zmierzało do zastosowania dawki 5.000 mg/kg w przypadku wystąpienia wyników B lub C przy 2.000 mg/kg; pojawienie się następnie wyniku A przy dawce 5.000 mg/kg wyznaczy dawkę wyjściową w badaniu zasadniczym przy 2.000 mg/kg, natomiast pojawienie się wyników B lub C wyznaczy dawkę wyjściową w badaniu głównym na 5.000 mg/kg.
Badanie główne
Zakres przepisów niniejszej decyzji dotyczących procedury sekwencyjnej określonej w załączniku 2 zostaje rozszerzony o poziom dawki wynoszący 5.000 mg/kg. W związku z tym, w przypadku gdy dawka wyjściowa badania zasadniczego wynosi 5.000 mg/kg, wynik A (≥ 2 przypadki śmiertelne) będzie wymagał zbadania drugiej grupy przy 2.000 mg/kg; wynik B (wyraźna toksyczność i/lub ≤ 1) lub wynik C (brak toksyczności) spowoduje niesklasyfikowanie substancji w ramach GHS. Podobnie, w przypadku zastosowania innej dawki początkowej niż 5.000 mg/kg, badanie będzie zmierzało do 5.000 mg/kg przy wyniku C przy 2.000 mg/kg; pojawienie się następnie wyniku A przy 5.000 mg/kg spowoduje przypisanie substancji do kategorii 5 GHS, natomiast pojawienie się wyników B lub C spowoduje niesklasyfikowanie substancji.
ZAŁĄCZNIK 4
METODA BADAWCZA B.1 bis
Wytyczne dotyczące klasyfikacji zgodnie z systemem WE obowiązującej w okresie przejściowym do momentu pełnego wdrożenia Globalnego Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji (GHS) (wytyczne pochodzą z pozycji bibliograficznej (8))
B1 ter. TOKSYCZNOŚĆ OSTRA POKARMOWA - METODA KLAS OSTREJ TOKSYCZNOŚCI
1. METODA
Niniejsza metoda badawcza jest kopią OECD TG 423 (2001).
1.1. WPROWADZENIE
Metoda klas ostrej toksyczności (1) przyjęta w tym badaniu jest procedurą stopniową, w której dla każdego stopnia wykorzystywane są trzy osobniki zwierząt jednej płci. Zależnie od śmiertelności oraz/lub stanu agonalnego zwierząt do stwierdzenia ostrej toksyczności badanej substancji konieczne mogą być średnio 2-4 etapy. Niniejsza procedura jest powtarzalna, w jej toku wykorzystuje się niewiele zwierząt i daje ona możliwość klasyfikacji substancji w sposób podobny do innych metod badania ostrej toksyczności. Metoda klas ostrej toksyczności opiera się na ocenach biometrycznych (2)(3)(4)(5) przeprowadzonych z wykorzystaniem stałych dawek, oddzielonych w odpowiedni sposób umożliwiający ocenę substancji dla celów klasyfikacji i oceny niebezpieczeństwa. Metoda ta została przyjęta w 1996 r. i była poddawana intensywnej weryfikacji in vivo w oparciu o dane o LD50 uzyskane z literatury, zarówno na szczeblu narodowym (6), jak i międzynarodowym (7).
Wytyczne dotyczące wyboru najbardziej odpowiedniej metody badawczej dla danego przypadku zostały zamieszczone w Wytycznych dotyczących badania toksyczności ostrej pokarmowej (8). Wytyczne te zawierają ponadto dodatkowe informacje na temat przeprowadzania i interpretacji Metody badawczej B.1ter.
Nie jest również konieczne podawanie dawek mogących powodować silny ból lub strach wynikający z działania żrącego lub podrażniającego. Zwierzęta w stanie agonalnym lub w oczywisty sposób cierpiące albo chore i doświadczające strachu powinny zostać uśmiercone w humanitarny sposób i uwzględniane w interpretacji wyników badań jako zwierzęta padłe w trakcie badania. Kryteria podejmowania decyzji co do uśmiercenia zwierząt w stanie agonalnym lub cierpiących ból oraz wytyczne dotyczące rozpoznawania przewidywalnego lub zbliżającego się zgonu, są zawarte w oddzielnych Wytycznych (9).
Metoda opiera się na wcześniej określonych dawkach, a wyniki uzyskane w wyniku jej zastosowania pozwalają na ocenę i klasyfikację zgodną z Globalnym Zharmonizowanym Systemem klasyfikacji związków chemicznych pod względem ich ostrej toksyczności (10).
W zasadzie niniejsza metoda nie pozwala na dokładne obliczenie LD50, lecz pozwala na określenie zakresu ekspozycji, tam gdzie oczekiwana jest śmiertelność, ponieważ śmierć określonego odsetka zwierząt nadal stanowi jeden z głównych punktów końcowych badania. Metoda umożliwia określenie wartości LD50 wyłącznie w przypadku, gdy przynajmniej dwie dawki spowodowały śmiertelność wyższą niż 0 %, lecz mniejszą niż 100 %. Wykorzystanie selekcji wcześniej określonych dawek, niezależnie od substancji badanej, której klasyfikacja jest wyraźnie powiązana z liczbą zwierząt obserwowanych na poszczególnych etapach, poprawia możliwości laboratoriom w zakresie konsekwencji i powtarzalności sprawozdań laboratoryjnych.
Laboratorium badawcze powinno uwzględniać wszystkie dostępne informacje na temat badanej substancji przed rozpoczęciem badań. Informacje te powinny obejmować tożsamość i budowę chemiczną substancji; właściwości fizyko-chemiczne; wyniki innych badań toksyczności in vitro lub in vivo substancji; dane dotyczące toksyczności substancji pokrewnych pod względem budowy; przewidywane zastosowanie (zastosowania) tej substancji. Informacje te są niezbędne celem spełnienia wszelkich wymogów dotyczących ochrony zdrowia ludzkiego i umożliwienia wyboru najbardziej odpowiedniej dawki wyjściowej.
1.2. DEFINICJE
Toksyczność ostra pokarmowa: oznacza niepożądane skutki pojawiające się w następstwie podania doustnego pojedynczej dawki substancji lub wielu dawek w okresie 24 godzin.
Opóźniona śmierć: oznacza, że zwierzę nie umiera, ani nie wydaje się być w agonii przez 48 godzin, lecz pada później w 14-dniowym okresie obserwacyjnym.
Dawka: oznacza ilość podanej substancji badanej. Dawka jest wyrażana w wadze próbki na jednostkę masy zwierzęcia (np. mg/kg).
GHS: Globalny Zharmonizowany System Klasyfikacji Substancji i Mieszanin Chemicznych. Połączone działania OECD (w dziedzinie zdrowia ludzkiego i ochrony środowiska), Komitetu Ekspertów ONZ w sprawie transportu towarów niebezpiecznych (w zakresie właściwości fizyko-chemicznych) i Międzynarodowej Organizacji Pracy (ILO) (w zakresie wymiany informacji na temat niebezpieczeństw), koordynowane w ramach Międzyorganizacyjnego programu na rzecz właściwego zarządzania związkami chemicznymi (IOMC).
Zagrażająca śmierć: występuje w przypadku, gdy przewiduje się wystąpienie stanu agonalnego lub śmierć przed następnym zaplanowanym punktem czasowym obserwacji. Objawy wskazujące na ten stan mogą obejmować u gryzonia konwulsje, ułożenie na boku, pozycję leżącą oraz drgawki (zob. Wytyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (9) celem uzyskania szczegółowych informacji).
LD50 (średnia dawka śmiertelna): jest statystycznie wyprowadzoną pojedynczą dawką substancji, która powoduje zgon 50 procent zwierząt, przy podaniu drogą pokarmową. Wartość LD50 jest wyrażona w wadze substancji badanej na jednostkę masy badanego zwierzęcia (mg/kg).
Dawka graniczna: oznacza górną dawkę graniczną w badaniach (2.000 lub 5.000 mg/kg).
Stan agonalny: stan śmierci lub niezdolności do przeżycia nawet w przypadku zastosowania leczenia (zob. Wytyczne metodyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (9) w celu uzyskania danych szczegółowych).
Przewidywana śmierć: obecność objawów klinicznych wskazujących na nadchodzący zgon w przewidzianym czasie w przyszłości przed planowanym zakończeniem eksperymentu, na przykład: niezdolność do dotarcia do wody lub pożywienia (zob. Wytyczne metodyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (9) w celu uzyskania danych szczegółowych).
1.3. ZASADA METODY BADANIA
Zasadą badania jest to, że w oparciu o procedurę etapową z użyciem minimalnej liczby zwierząt na każdym etapie uzyskiwane są wystarczające informacje na temat ostrej toksyczności substancji badanej w celu jej zaklasyfikowania. Substancja jest podawana doustnie grupie zwierząt laboratoryjnych w jednej z określonych dawek. Substancja jest badana przy użyciu procedury etapowej, na każdym etapie wykorzystywane są trzy zwierzęta jednej płci (na ogół samice). Brak lub obecność śmiertelności związanej z podaniem odczynnika zwierzętom determinuje następny etap, tj.:
- dalsze badania są zbyteczne,
- dawka zostaje podana trzem następnym zwierzętom,
- dawka na następnym niższym bądź wyższym poziomie zostaje podana trzem następnym zwierzętom.
Szczegóły procedury są opisane w załączniku 1. Metoda pozwala na ocenę w odniesieniu do przypisania substancji badanej do jednej z szeregu klas toksyczności określonych poprzez ustalone wartości odcinania D50.
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.4.1. Wybór gatunków zwierząt
Preferowanym gatunkiem gryzonia jest szczur, choć dopuszcza się wykorzystywanie innych gatunków gryzoni. Na ogół w doświadczeniach wykorzystuję się samice (9). Wynika to z faktu, znajdującego swoje potwierdzenie w literaturze na temat konwencjonalnych badań LD50, że różnice między płciami są znikome, lecz tam gdzie występują, samice są z reguły nieznacznie bardziej wrażliwe (11). Jednakże jeżeli wiedza na temat właściwości toksykologicznych i toksokinetycznych związków o podobnej budowie wskazuje na to, że samce mogą być bardziej wrażliwe, w takim przypadku należy wybrać do badania tę płeć. Jeżeli badanie jest przeprowadzane na samcach, należy podać uzasadnienie.
Zaleca się wykorzystanie zdrowych, młodych, dorosłych zwierząt pochodzących ze szczepów na ogół wykorzystywanych w laboratorium. Samice powinny być bezdzietne i nieciężarne. Każde zwierzę na początku cyklu laboratoryjnego powinno być w wieku między 8 a 12 tygodniem, a jego masa nie powinna przekraczać lub być mniejsza o ± 20 % średniej masy wszystkich wykorzystywanych uprzednio zwierząt.
1.4.2. Warunki przebywania i warunki żywieniowe
Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 20 oC (± 3 oC). Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50-60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej. Zwierzęta mogą być grupowane w klatkach w sposób nieograniczający łatwej obserwacji pojedynczych sztuk.
1.4.3. Przygotowanie zwierząt
Zwierzęta są wybierane losowo, oznaczane w sposób umożliwiający identyfikację pojedynczych osobników i przetrzymywane w swoich klatkach przynajmniej przez 5 dni przed podaniem pierwszej dawki, co umożliwia aklimatyzację do warunków laboratoryjnych.
1.4.4. Przygotowanie dawek
Na ogół badana substancja powinna być podawana w dawkach o stałej objętości przy zmianie stężenia dawkowanego preparatu. Jednakże w przypadku badania końcowego produktu będącego cieczą lub mieszaniną dla celów oceny ryzyka tej substancji bardziej stosowne może okazać się wykorzystanie w badaniach substancji nierozcieńczonej. tj. substancji o stałym stężeniu. Wymóg ten może być ponadto określony w niektórych przepisach wykonawczych. W żadnym razie niedopuszczalne jest przekroczenie maksymalnej objętości przewidzianej do podania. Maksymalna objętość cieczy podanej jednorazowo zależy od wielkości badanego zwierzęcia. Dla gryzoni objętość ta nie powinna przekraczać 1 ml/100g masy ciała: jednakże w przypadku roztworów wodnych dopuszczalne jest przyjęcie dawki 2 ml/100 g masy ciała. Jeżeli chodzi o przygotowywanie dozowanego preparatu należy użyć, o ile to możliwe, roztworów/zawiesin/emulsji wodnych, następnie rozważyć przygotowanie roztworów/zawiesin/emulsji w oleju (np. oleju kukurydzianym), a dopiero w następnej kolejności roztworów innych nośników. W przypadkach stosowania nośnika różnego od wody muszą być znane jego właściwości toksykologiczne. Dawki muszą być przygotowywane na krótko przed podaniem, chyba że stabilność przygotowanego preparatu w okresie w jakim ma on być stosowany jest znana i możliwa do przyjęcia.
1.5. PROCEDURA
1.5.1. Podawanie dawki
Substancja badana jest podawana w formie pojedynczej dawki przez zgłębnik przy użyciu sondy przełykowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. W nietypowych przypadkach, gdy niemożliwe jest podanie pojedynczej dawki, jednorazowa dawka może zostać rozbita na mniejsze porcje i podawana w odstępach czasowych w okresie nieprzekraczającym 24 godzin.
Zwierzęta powinny być wyposzczone przed podaniem dawki (np. szczurom należy wstrzymać podawanie jedzenia przez noc, lecz nie wstrzymywać podawania wody, myszom należy wstrzymać podawanie jedzenia przez 3-4 godziny, lecz nie wstrzymywać wody). Następnie, po wyposzczeniu, zwierzęta należy zważyć oraz podać im substancję badaną. W przypadku szczurów, po podaniu substancji badanej można wstrzymać podawanie jedzenia przez 3-4 godziny, a w przypadku myszy przez 1-2 godziny. Jeżeli dawka jest podawana porcjami przez określony czas, może być konieczne podanie pokarmu i wody w zależności od długości okresu podawania dawki.
1.5.2. Liczba zwierząt i poziomy dawki
Na każdym etapie wykorzystywane są trzy zwierzęta. Poziom dawki, która ma być wykorzystana jako dawka wyjściowa, jest wybierana z jednego z czterech stałych poziomów 5, 50, 300 i 2.000 mg/kg masy ciała. Poziom wyjściowy dawki powinien być taki, żeby powodował śmiertelność u niektórych zwierząt, którym ją zaaplikowano. Schemat postępowania zamieszczony w załączniku 1 opisuje procedurę, którą należy podjąć dla każdej dawki wyjściowej. Dodatkowo, do momentu przyjęcia nowego GHS, obowiązujące są wytyczne zawarte w załączniku 4, dotyczące klasyfikacji substancji w ramach systemu WE.
Jeżeli dostępne informacje sugerują brak prawdopodobieństwa śmiertelności przy najwyższym poziomie dawki (2.000 mg/kg masy ciała), powinno zostać przeprowadzone badanie graniczne. W przypadku braku informacji na temat danej substancji, która ma być badana, z uwagi na dobrostan zwierząt zalecane jest zastosowanie dawki wyjściowej 300 mg/kg masy ciała.
Odstępy między podawaniem dawek na każdym poziomie określa się na podstawie czasu wystąpienia, długości trwania i dokuczliwości objawów zatrucia. Podanie zwierzęciu następnej dawki powinno zostać opóźnione do momentu uzyskania pewności co do możliwości przeżycia zwierząt, którym podano ostatnią dawkę.
W wyjątkowych okolicznościach i wyłącznie jeżeli wymagają tego określone potrzeby regulacyjne, można rozważyć podanie dawki dodatkowej ustalonej na górnym poziomie 5.000 mg/kg (zob. załącznik 3). Z uwagi na dobrostan zwierząt badania na zwierzętach w zakresie kategorii 5 GSH (2.000 i 5.000 mg/kg) są odradzane i powinny być rozważane wyłącznie w przypadku znacznego prawdopodobieństwa, że wyniki takich badań przyniosą bezpośrednie korzyści dla ochrony zdrowia ludzkiego, zwierząt lub środowiska naturalnego.
1.5.3. Badanie graniczne
Badanie graniczne jest stosowane w sytuacji gdy badający posiada informacje sugerujące, że badany materiał może być nietoksyczny np. posiada toksyczność na poziomie przekraczającym nieznacznie dawki graniczne określone przepisami wykonawczymi. Informacje na temat toksyczności mogą zostać uzyskane na podstawie wiedzy na temat podobnych zbadanych związków lub podobnych zbadanych mieszanin lub produktów, z uwzględnieniem tożsamości i zawartości procentowej składników, o których wiadomo, że mają znaczenia z punktu widzenia toksyczności. W sytuacji niewystarczającej ilości lub braku informacji na temat toksyczności materiału testowego lub w przypadku gdy, zgodnie z oczekiwaniami, badany materiał może być toksyczny, należy przeprowadzić badanie zasadnicze.
Badanie graniczne dla jednej dawki na poziomie 2.000 mg/kg masy ciała może zostać przeprowadzone na sześciu zwierzętach (trzy na każdym etapie). W wyjątkowych okolicznościach dopuszczalne jest przeprowadzenie badania granicznego przy jednej dawce na poziomie 5.000 mg/kg na trzech zwierzętach (zob. załącznik 2). W przypadku wystąpienia śmiertelności związanej z substancją badaną konieczne może okazać się przeprowadzenie badania na następnym niższym poziomie.
1.6. OBSERWACJE
Zwierzęta są poddawane obserwacji osobniczej przynajmniej raz w ciągu pierwszych 30 min. po podaniu dawki, okresowo przez pierwsze 24 godziny, ze szczególnym uwzględnieniem pierwszych 4 godzin, a następnie codziennie ogólnie przez 14 dni, z wyjątkiem sytuacji w których muszą one zostać wyeliminowane z badań i humanitarnie zabite ze względu na ich dobro, lub zostały znalezione martwe. Jednakże czas trwania obserwacji nie powinien być ustalany według ścisłych reguł. Powinien on być zależny od działania toksycznego, czasu wystąpienia skutków i długości okresu powrotu do stanu normalnego, i może skutkiem tego być przedłużany, w przypadku gdy zostanie to uznane za stosowne. Czas w jakim pojawiają się i zanikają objawy zatrucia jest istotny, szczególnie w przypadku występowania opóźnionych objawów zatrucia (11). Wszystkie obserwacje są systematycznie zapisywane w ewidencji prowadzonej osobno dla każdego zwierzęcia.
Dodatkowe obserwacje będą wymagane, jeżeli zwierzęta wciąż wykazują objawy zatrucia. Obserwacje powinny dotyczyć zmian na skórze i futrze, oczach i śluzówce a także w układach oddechowym, krążenia, autonomicznym i centralnym układzie nerwowym oraz zmian w funkcjonowaniu somatomotorycznym i schematach zachowania. Szczególną uwagę należy poświęcić obserwacjom drżenia, drgawek, ślinienia się, biegunki, letargu, snu i śpiączki. Należy przestrzegać zasad i kryteriów streszczonych w Wytycznych dotyczących humanitarnego punktu końcowego. Zwierzęta u których stwierdzono stan agonalny oraz zwierzęta wykazujące objawy silnego bólu powinny zostać uśmiercone w sposób humanitarny. W przypadku uśmiercenia zwierząt z przyczyn humanitarnych lub stwierdzenia u nich zgonu, czas zgonu powinien zostać zapisany najdokładniej, jak to jest możliwe.
1.6.1. Masa ciała
Masa każdego zwierzęcia powinna zostać określona na krótko przed podaniem substancji badanej i przynajmniej w odstępie tygodnia od jej podania. Zmiany masy powinny zostać obliczone i zapisane. Po zakończeniu badań zwierzęta, które przeżyły, są ważone i humanitarnie uśmiercane.
1.6.2. Patologia
Wszystkie badane zwierzęta (włączając zwierzęta, które padły podczas badań lub zostały wyeliminowane z badań ze względu na ich dobro) powinny zostać poddane całkowitej sekcji zwłok. Wszystkie całkowite zmiany patologiczne powinny zostać zapisane oddzielnie dla każdego zwierzęcia. Badanie mikroskopowe organów wykazujących ewidentne zmiany patologiczne u zwierząt, które przeżyły 24 lub więcej godzin po podaniu pierwszej dawki, mogą również zostać wzięte pod uwagę, ponieważ mogą one dostarczyć użytecznych informacji.
2. DANE
Należy podać dane dla każdego zwierzęcia. Dodatkowo, wszystkie dane powinny zostać streszczone w tabeli pokazującej dla każdej badanej grupy liczbę wykorzystanych sztuk, liczbę zwierząt wykazujących objawy zatrucia, liczbę zwierząt, u których stwierdzono zgon w trakcie badań lub uśmierconych z przyczyn humanitarnych, czas zgonu poszczególnych zwierząt, opis oraz przebieg w czasie objawów zatrucia oraz powrotu do stanu normalnego, a także wyniki sekcji.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. Sprawozdanie z badań
Sprawozdanie z badań musi zawierać następujące informacje, o ile są one stosowne:
Substancja badana:
- charakter fizyczny, czystość, i jeśli to stosowne, właściwości fizyko-chemiczne (włączając rodzaj izomerii),
- identyfikacja, w tym numer CAS. Nośnik (jeśli był użyty):
- uzasadnienie wyboru nośnika, jeśli jest inny niż woda.
Zwierzęta badane:
- użyty gatunek/szczep,
- stan mikrobiologiczny zwierzęcia, jeśli jest znany,
- liczbę, wiek i płeć zwierząt (włączając, o ile to stosowne, uzasadnienie wykorzystania samców zamiast samic),
- źródło, warunki środowiska, pożywienie itp. Warunki badań:
- szczegóły dotyczące postaci substancji badanej, włączając stan skupienia podawanego środka,
- szczegóły dotyczące podawania substancji badanej, włączając objętość dawki oraz czas podawania dawki,
- szczegóły dotyczące jakości pożywienia i wody (włączając w to rodzaj/źródło diety, źródło wody),
- uzasadnienie wyboru dawki wyjściowej. Wyniki:
- tabelę przedstawiającą dane nt. reakcji oraz poziomów dawek dla każdego zwierzęcia (np. zwierząt wykazujących objawy zatrucia, włączając śmiertelność, charakter, intensywność oraz trwałość objawów),
- tabelę zawierającą informacje na temat masy ciała oraz zmian masy ciała,
- masę indywidualną zwierząt w dniu podania dawki, następnie w tygodniowych odstępach, a także w momencie śmierci lub uśmiercenia,
- data i czas śmierci, o ile nastąpiła przed przewidywanym uśmierceniem,
- przebieg w czasie objawów zatrucia i czy były one odwracalne w przypadku każdego zwierzęcia,
- wyniki sekcji oraz badań histopatologicznych w odniesieniu do każdego zwierzęcia, jeżeli są dostępne. Omówienie i interpretacja wyników.
Wnioski.
4. BIBLIOGRAFIA
(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86.
(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute- Toxic-Class Metoda (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610.
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.
(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Metodas: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX16, 129-134.
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method. An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.
(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Grade N. 24. Paris.
(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Grade and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.
(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/stronas/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF. html]
(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA.
ZAŁĄCZNIK 1
PROCEDURA REALIZOWANA W PRZYPADKU DAWEK WYJŚCIOWYCH
UWAGI OGÓLNE
Dla każdej dawki wyjściowej, odpowiednie schematy badań zawarte w niniejszym załączniku przedstawiają procedurę, jaką należy zastosować.
- ZAŁĄCZNIK 1a: Dawka początkowa wynosi 5 mg/kg.
- ZAŁĄCZNIK 1b: Dawka początkowa wynosi 50 mg/kg.
- ZAŁĄCZNIK 1c: Dawka początkowa wynosi 300 mg/kg.
- ZAŁĄCZNIK 1d: Dawka początkowa wynosi 2.000 mg/kg.
W zależności od liczby zwierząt uśmierconych w sposób humanitarny lub martwych zwierząt procedura badań przebiega zgodnie z kierunkiem wyznaczanym przez strzałki.
ZAŁĄCZNIK 1A
PROCEDURA BADANIA PRZY DAWCE WYJŚCIOWEJ 5 MG/KG MASY CIAŁA
ZAŁĄCZNIK 1B
PROCEDURA BADANIA PRZY DAWCE WYJŚCIOWEJ 50 MG/KG MASY CIAŁA
ZAŁĄCZNIK 1C
PROCEDURA BADANIA PRZY DAWCE WYJŚCIOWEJ 300 MG/KG MASY CIAŁA
ZAŁĄCZNIK 1D
PROCEDURA BADANIA PRZY DAWCE WYJŚCIOWEJ 2.000 MG/KG MASY CIAŁA
ZAŁĄCZNIK 2
KRYTERIA KLASYFIKACJI SUBSTANCJI BADANYCH O OCZEKIWANYCH WARTOŚCIACH LD50 PRZEKRACZAJĄCYCH 2.000 mg/kg, Z POMINIĘCIEM BADAŃ
Kryteria kategorii niebezpieczeństwa 5 mają w zamierzeniu umożliwiać identyfikację substancji badanych, które charakteryzują się niskim niebezpieczeństwem ostrej toksyczności, lecz które, w określonych okolicznościach mogą okazać się niebezpieczne dla populacji podatnych na zatrucie. Przewiduje się, że takie substancje charakteryzują się pokarmowym lub skórnym LD50 mieszczącym się w zakresie 2.000-5.000 mg/kg lub odpowiadają analogicznym dawkom w przypadku innych szlaków kontaktu z substancją. Substancja może zostać zaklasyfikowana do kategorii niebezpieczeństwa przy następujących cechach: 2.000 mg/kg < LD50 < 5.000 mg/kg (kategoria 5 według GHS) w następujących przypadkach:
a) jeżeli została przypisana do tej kategorii w wyniku zastosowania jednego ze schematów przedstawionych w załącznikach 1a-1d, w oparciu o poziom śmiertelności;
b) jeżeli dostępne są wiarygodne dowody wskazujące, że LD50 powinno znaleźć się w obrębie kategorii 5; bądź jeżeli inne badania na zwierzętach lub ostre skutki u ludzi sugerują niebezpieczeństwo dla zdrowia ludzkiego spowodowane ostrym działaniem;
c) jeżeli okazuje się, w wyniku przeprowadzenia ekstrapolacji, szacunków lub pomiaru danych, że przypisanie do wyższej klasy niebezpieczeństwa nie jest uzasadnione oraz:
- dostępne są wiarygodne informacje wskazujące na silne skutki toksyczne u ludzi, lub
- zaobserwowano przypadki zgonu w toku pomiarów do wartości kategorii 4 w przypadku podania substancji droga pokarmową, lub
- jeżeli ocena eksperta potwierdzi wyraźne kliniczne objawy toksyczności, w trakcie pomiarów do wartości kategorii 4, z wyjątkiem przypadków biegunki, piloerekcji lub wyglądu odbiegającego w sposób negatywny od normy, lub
- jeżeli ocena eksperta potwierdzi wiarygodność informacji wskazujących na potencjalne, znaczne, ostre działanie uzyskanych w wyniku innych badań na zwierzętach zwierząt.
BADANIA PRZY DAWKACH PRZEKRACZAJĄCYCH 2.000 MG/KG
Uznając potrzebę dbałości o dobrostan zwierząt, badanie zwierząt w ramach kategorii 5 (5.000 mg/kg) jest odradzane i powinno być rozważane, wyłącznie jeżeli występuje wysokie prawdopodobieństwo, że wynik takich badań będzie miał bezpośredni wpływ na bezpieczeństwo i zdrowie ludzi i zwierząt (10). Nie należy prowadzić badań przy zastosowaniu wyższych poziomów dawek.
W przypadku konieczności przeprowadzenia badania przy zastosowaniu dawki 5.000 mg/kg wymagane jest przeprowadzenie jednego etapu (tj. przy wykorzystaniu trzech zwierząt). Jeżeli pierwsze zwierzę padnie, następnemu podaje się 2.000 mg/kg, zgodnie ze schematem działań zamieszczonym w załączniku 1. Jeżeli pierwsze zwierzę przeżyje, dawka podawana jest dwóm następnym. Jeżeli pada wyłącznie jedno zwierzę, przyjmuje się, że wartość LD50 przekracza 5.000 mg/kg. Jeżeli padają oba zwierzęta, podawanie kontynuuje się na poziomie 2.000 mg/kg.
ZAŁĄCZNIK 3
METODA BADAWCZA B.1 ter Wytyczne dotyczące klasyfikacji zgodnie z systemem WE obowiązującej w okresie przejściowym do momentu pełnego wdrożenia Globalnego Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji (GHS) (wytyczne pochodzą z pozycji bibliograficznej (8))
B.2. TOKSYCZNOŚĆ OSTRA (INHALACYJNA)
1. METODA
1.1. WPROWADZENIE
Jest użyteczne posiadanie wstępnych informacji na temat rozkładu wielkości ziarna, prężności pary, temperatury topnienia, temperatury wrzenia, temperatury zapłonu w wybuchowości (o ile dotyczy) substancji.
Zob. także Wprowadzenie ogólne część B lit. A).
1.2. DEFINICJE
Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. B).
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Brak.
1.4. ZASADA METODY BADANIA
Kilka grup zwierząt doświadczalnych poddaje się ekspozycji przez określony okres czasu na substancję badaną w stopniowanych stężeniach, po jednym stężeniu na grupę. Następnie przeprowadza się obserwację skutków podania substancji i zgonów. Zwierzęta, które padną w trakcie badania, i te, które przeżyją po jego zakończeniu, poddaje się sekcji zwłok.
Zwierzęta wykazujące ciężkie i trwałe oznaki stanu zagrożenia i bólu mogą wymagać humanitarnego uśmiercenia. Dozowanie badanych substancji w sposób znany z powodowania znaczącego bólu i stanu zagrożenia z powodu właściwości żrących lub poważnie drażniących nie może być przeprowadzane.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCI
Brak.
1.6. OPIS METODY BADANIA
1.6.1. Przygotowania
Zwierzęta muszą być trzymane w doświadczalnych warunkach pobytu i karmienia przez co najmniej pięć dni przed przeprowadzeniem badania. Przed przeprowadzeniem badania zdrowe, młode, dorosłe zwierzęta są wybierane losowo i przydzielane do wymaganej liczby grup otrzymujących substancję. Nie muszą być poddawane symulowanej ekspozycji, chyba że jest to wskazane z powodu wykorzystania określonego przyrządu zapewniającego ekspozycję.
Badane substancje w postaci ciała stałego wymagają mikronizacji w celu uzyskania właściwego wymiaru cząstki.
W miarę potrzeby do badanej substancji można dodać odpowiednie podłoże, aby można było zapewnić właściwe stężenie tej substancji w powietrzu - w takim przypadku należy zastosować grupę kontrolną, która będzie otrzymywać samo podłoże. W razie wykorzystania podłoża lub innych substancji pomocniczych w celu ułatwienia dawkowania, musi być wiadomo, że nie wykazują one działania toksycznego. O ile będzie to właściwe, można wykorzystać dane historyczne.
1.6.2. Warunki badania
1.6.2.1. Zwierzęta doświadczalne
O ile nie ma przeciwwskazań, preferowanym gatunkiem jest szczur. Należy wykorzystywać powszechnie stosowane szczepy laboratoryjne. Dla każdej płci, na początku badania, zakres zmian wagi używanych zwierząt nie może przekraczać ± 20 % właściwej wartości średniej.
1.6.2.2. Liczba i płeć
Wykorzystuje się po co najmniej 10 gryzoni (pięć samic i pięciu samców) w przypadku każdego poziomu dawkowania. Samice powinny być nieródkami i nie mogą być w ciąży.
Uwaga: W badaniach ostrej toksyczności u zwierząt wyższego rzędu niż gryzonie, należy rozważyć użycie mniejszej ilości. Dawki muszą być starannie wybrane oraz należy dołożyć wszelkich starań by nie przekraczać dawek średniej toksyczności. Należy unikać podawania w takich badaniach dawek śmiertelnych substancji badanej.
1.6.2.3. Stężenia ekspozycyjne
Powinno się zapewnić odpowiednią liczbę wartości tych stężeń - co najmniej trzy - przy czym należy zachować odpowiednie odstępy między nimi, tak aby uzyskać grupy badane różniące się istotnie efektami toksycznymi i stopniem śmiertelności. Dane powinny wystarczyć do nakreślenia krzywej zależności między stężeniem a śmiertelnością oraz w miarę możliwości powinny zapewnić możliwe do przyjęcia obliczenie LC50.
1.6.2.4. Badanie graniczne
W przypadku gdy ekspozycja pięciu samców i pięciu samic badanych zwierząt na 20 mg na litr gazu lub 5 mg na litr aerozolu lub cząstek substancji przez cztery godziny (lub, jeżeli jest to niemożliwe ze względu na fizyczne lub chemiczne, w tym wybuchowe, właściwości substancji badanej, na maksymalne możliwe do uzyskania stężenie) nie spowoduje związanych z danym związkiem zgonów w ciągu 14 dni, dalsze badania można uznać za zbędne.
1.6.2.5. Czas ekspozycji
Okres czasu ekspozycji powinien być cztery godziny.
1.6.2.6. Wyposażenie
Zwierzęta należy poddać badaniu przy użyciu przyrządów do inhalacji zapewniających przepływ dynamiczny powietrza co najmniej 12 wymian na godzinę, aby zapewnić odpowiednią zawartość tlenu i równomierną dystrybucję powietrza ekspozycji. W przypadku wykorzystania komory należy ją tak zaprojektować, aby zmniejszyć do minimum stłoczenie zwierząt badanych i zwiększyć do maksimum ich ekspozycję drogą inhalacyjną na substancję badaną. Z reguły, aby zapewnić stabilność powietrza w komorze, całkowita "objętość" zwierząt badanych nie powinna przekraczać 5 % objętości komory do badań. Można zastosować ekspozycję doustno-nosową, ekspozycję jedynie głowy lub ekspozycję całego ciała w pojedynczych komorach, przy czym te pierwsze dwa sposoby pomogą w zminimalizowaniu przechodzenia substancji badanej do organizmu innymi drogami.
1.6.2.7. Okres obserwacji
Okres obserwacji powinien wynosić co najmniej 14 dni. Jednakże nie powinien on być sztywno ustalony. Powinien zależeć od reakcji toksycznych, szybkości ich pojawiania się oraz okresu powrotu do zdrowia po ich wystąpieniu; w związku z tym można go wydłużyć, jeżeli uzna się to za konieczne. Ważny jest czas, po jakim pojawiają się i znikają objawy toksyczności oraz czas zgonu, w szczególności gdy istnieje tendencja do opóźnionych zgonów.
1.6.3. Procedura
Tuż przed ekspozycją zwierzęta waży się, a następnie poddaje ekspozycji na stężenie badane w wyznaczonej aparaturze przez minimalny okres czterech godzin, po zapewnieniu równowagi stężenia substancji w komorze. Czas do uzyskania równowagi powinien być krótki. Temperatura przeprowadzania badania powinna być utrzymywana na poziomie 22 °C ± 3 °C. Idealnie wilgotność względną należy utrzymywać w przedziale między 30 i 70%, jednak w niektórych przypadkach (np. badania niektórych aerozoli) może to nie być możliwe ze względów praktycznych. Utrzymanie lekkiego podciśnienia wewnątrz komory (ok. 5 mm słupa wody) zapobiega wyciekowi substancji badanej do otaczającego obszaru. W trakcie ekspozycji należy zaprzestać podawania zwierzętom karmy i wody. Należy użyć układów generacji i monitorowania powietrza stosowanego do badań. Układ powinien zapewnić jak najszybsze uzyskanie stabilnych warunków ekspozycji. Komora musi być zaprojektowana i działać w taki sposób, by utrzymywać jednorodny rozkład badanego powietrza w jej obrębie.
Należy prowadzić pomiary lub monitorować:
(a) szybkość przepływu powietrza (w sposób ciągły),
(b) rzeczywiste stężenie substancji badanej mierzone w obszarze wdychania co najmniej trzy razy w czasie trwania ekspozycji (niektóre atmosfery, na przykład aerozole o wysokich stężeniach mogą wymagać częstszej kontroli). W czasie trwania okresu ekspozycji, stężenie nie powinno zmieniać się więcej niż ± 15 % od wartości średniej. W przypadku niektórych aerozoli ten poziom kontroli możne być niemożliwy do uzyskania, przy czym dopuszczalny jest wtedy szerszy zakres. Dla aerozoli należy przeprowadzić analizę wielkości cząsteczki (co najmniej raz na badaną grupę),
(c) temperaturę i wilgotność, o ile możliwe, w sposób ciągły.
W trakcie ekspozycji i po jej zakończeniu należy prowadzić systematyczne obserwacje, zapisując ich wyniki; należy prowadzić oddzielne zapisy dla każdego zwierzęcia. Obserwacja powinna być częsta w ciągu pierwszego dnia. Staranne badanie kliniczne należy przeprowadzać co najmniej raz każdego dnia roboczego, inne obserwacje należy przeprowadzać codziennie, podejmując odpowiednie działania mające na celu zmniejszenie do minimum straty zwierząt podczas badania, np. sekcję zwłok lub zamrażanie tych zwierząt, które zostaną znalezione martwe, oraz izolację lub usypianie zwierząt słabych lub śmiertelnie chorych.
Obserwacje powinny obejmować zmiany skóry i sierści, oczu i błon śluzowych oraz zmiany układu oddechowego, krążenia, autonomicznego i ośrodkowego układu nerwowego, jak też wzorców aktywności somatomotorycznej i wzorca zachowania. Szczególną uwagę należy zwrócić na obserwacje drżeń, drgawek, zwiększonego wydzielania śliny, biegunki, stanów zwiększonej senności, snu i śpiączki. Należy jak najprecyzyjniej odnotować termin zgonu. Masy ciała poszczególnych zwierząt należy ustalać co tydzień po ekspozycji oraz w momencie zgonu.
Zwierzęta, które zdechną w trakcie badania, i te, które przeżyją po jego zakończeniu, poddaje się sekcji zwłok, ze szczególnym zwróceniem uwagi na wszelkie zmiany w obrębie górnych i dolnych dróg oddechowych. Należy odnotować wszelkie makroskopowe zmiany patologiczne. O ile jest to wskazane, należy pobrać wycinki tkanek do badania histopatologicznego.
2. DANE
Dane należy przedstawić w skrócie w formie tabelarycznej, z podaniem - dla każdej badanej grupy - liczby zwierząt na początku badania, terminów zgonu poszczególnych zwierząt, liczby zwierząt wykazujących inne objawy toksyczności, opisu efektów toksycznych i wyniku sekcji zwłok. Należy obliczać zmiany masy ciała i zapisywać je, gdy przeżycie przekroczy jedną dobę. Zwierzęta, które zostały humanitarnie uśmiercone z powodów związanych ze stanami zagrożenia i bólem, są zapisywane jako zgony związane z substancją. Należy ustalić LC50 przy użyciu uznanej metody. Ocena danych powinna objąć istnienie ewentualnej współzależności między ekspozycją zwierząt na substancję badaną i częstością i ciężkością wszelkich zaburzeń, włącznie z zaburzeniami zachowania i klinicznymi, zmianami makroskopowymi, zmianami masy ciała, umieralnością i wszelkimi innymi efektami toksycznymi.
3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:
- gatunek, szczep, źródło, warunki środowiska, dieta itp.,
- warunki badania: opis przyrządu do ekspozycji, włączając konstrukcję, typ, wymiary, źródło powietrza, układ wytwarzania aerozoli, metody klimatyzacji powietrza i metoda przetrzymywania zwierząt w komorze badawczej, gdy jest używana. Należy opisać wyposażenie do pomiaru temperatury, wilgotności, stężenia aerozolu i rozkładu wielkości ziaren.
Dane ekspozycji
Powinny być przedstawione w formie tabeli, z podaniem wartości średniej i miary zmienności (np. odchylenia standardowego) i powinny, jeśli możliwe, zawierać:
a) szybkości przepływu powietrza przez urządzenia do inhalacji;
b) temperaturę i wilgotność powietrza;
c) nominalne stężenia (całkowita ilość badanej substancji dostarczona do wyposażenia inhalacyjnego, podzielona przez objętość powietrza);
d) rodzaj podłoża, o ile jest wykorzystane;
e) rzeczywiste stężenia w badawczej strefie wdychania;
f) średnicę aerodynamiczną średniej masy (MMAD) i geometryczne standardowe odchylenie (GSD);
g) czas równoważenia;
h) okres ekspozycji;
- zestawienie tabelaryczne danych reakcji toksycznej z uwagi na płeć i poziom ekspozycji (to jest liczba zwierząt padłych lub uśmierconych w czasie trwania badania; liczba zwierząt wykazujących oznaki działania toksycznego; liczba zwierząt poddanych ekspozycji),
- czas śmierci w czasie trwania lub po ekspozycji, przyczyny i kryteria przyjęte przy humanitarnym zabijaniu zwierząt,
- wszystkie obserwacje,
- LC50 dla każdej płci, ustalona pod koniec okresu obserwacji (z podaniem metody obliczeń),
- 95 % poziom ufności dla LiC50 (gdzie może być to dostarczone),
- krzywa zależności umieralności od dawki i jej nachylenie (o ile metoda oznaczania pozwala na ustalenie tych danych),
- wyniki sekcji zwłok,
- wszystkie dane histopatologiczne,
- omówienie wyników (należy zwrócić szczególną uwagę, że humanitarne zabicie zwierząt w czasie trwania badania wpływa na obliczoną wartość LC50),
- interpretacja wyników.
3.2. OCENA I INTERPRETACJA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. D).
4. LITERATURA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. E).
B.3. TOKSYCZNOŚĆ OSTRA (DERMALNA)
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.4. OSTRA TOKSYCZNOŚĆ: PODRAŻNIENIA/KOROZJA SKÓRY
1. METODA
Niniejsza metoda jest kopią OECD TG 404 (2002).
1.1. WPROWADZENIE
W przygotowywaniu niniejszej zaktualizowanej metody specjalną uwagę poświęcono możliwym ulepszeniom w zakresie zagadnień dotyczących dobrostanu zwierząt, a także ocenie wszystkich dostępnych informacji na temat substancji badanej, w celu uniknięcia niepotrzebnych badań na zwierzętach laboratoryjnych. Niniejsza metoda zawiera zalecenie, zgodnie z którym przed przystąpieniem do opisywanego badania in vivo na korozję/podrażnienia skórne wywołane przez daną substancję, zostanie przeprowadzona analiza wagi dowodów uzyskanych na podstawie istniejących danych. Jeżeli dostępne dane są niewystarczające, mogą zostać opracowane przy pomocy badań sekwencyjnych (1). Strategia badań zawiera wykaz zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vitro i stanowi załącznik do niniejszej metody. Dodatkowo, tam gdzie to stosowne, zamiast jednoczesnej aplikacji zwierzęciu trzech łat testowych, zalecane jest stosowanie aplikacji sekwencyjnej, zamiast symultanicznej, we wstępnych badaniach in vivo.
Z uwagi na dobrze pojęty interes nauki i dobrostan zwierząt badania in vivo nie powinny być podejmowane, jeżeli wszystkie dostępne dane odnoszące się do potencjalnego działania korozyjnego/podrażniającego skórę w wyniku działania substancji nie zostały uzyskane z analizy wagi dowodów. Takie dane będą zawierały dowody z wykonanych badań na ludziach oraz/lub zwierzętach laboratoryjnych, dowody korozji/podrażnień wywołanych przez jedną lub wiele substancji pokrewnych pod względem budowy lub mieszanin takich substancji, dane wskazujące na silną kwasowość lub alkaliczność substancji (2)(3) oraz wyniki zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo lub ex vivo (4)(5)(5a). Takie analizy powinny ograniczyć potrzebę badań in vivo pod kątem korozji/podrażnień skórnych wywołane przez substancje, w odniesieniu do których już istnieje wystarczający materiał dowodowy w odniesieniu do dwóch odnośnych punktów docelowych, zgromadzony w wyniku prowadzenia innych badań.
Preferowaną strategię badań sekwencyjnych, obejmującą przeprowadzenie zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo i ex vivo działania korozyjnego/podrażniającego, zawiera załącznik do niniejszej metody. Strategia ta została opracowana i jednomyślnie zalecona przez uczestników warsztatów OECD (6), a następnie zatwierdzona jako zalecana strategia badań w ramach Globalnego Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji Związków Chemicznych (GHS) (7). Zaleca się realizację tej strategii badań przed podjęciem badań in vivo. Dla nowych substancji strategia ta jest zalecanym stopniowym podejściem badawczym służącym opracowywaniu danych wartościowych z naukowego punktu widzenia dotyczących korozyjnego/podrażniającego działania substancji na skórę. W odniesieniu do istniejących substancji, na temat których brak wystarczających danych co do ich działania korozyjnego/podrażniającego, strategia ta powinna zostać wykorzystana w celu uzupełnienia brakujących danych. Użycie innych strategii badawczych bądź procedur lub decyzja o nieprzyjęciu stopniowego podejścia badawczego wymaga uzasadnienia.
Jeżeli określenie korozyjności lub podrażnienia nie może zostać przeprowadzone przy użyciu analizy wagi dowodów, która jest zbieżna ze strategią badań sekwencyjnych, należy rozważyć badanie in vivo (zob. załącznik).
1.2. DEFINICJE
Podrażnienie skórne: jest wynikiem odwracalnych uszkodzeń skóry wynikających z zastosowania substancji badanej przez okres czterech godzin.
Korozja skórna: jest wynikiem nieodwracalnego uszkodzenia skóry; mianowicie widocznej martwicy przebiegającej przez naskórek w głąb skóry, spowodowanej zaaplikowaniem substancji badanej na okres nieprzekraczający czterech godzin. Rodzaje korozji obejmują wrzody, krwawienie, strupy oraz - po zakończeniu 14-dniowej obserwacji - odbarwienia wynikłe ze zbielenia skóry, obszary jednolitej alopecji, a także blizny. Celem oceny niejasnych zmian można przeprowadzić badanie histopatologiczne.
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Substancja, która ma być zbadana, jest nakładana na skórę zwierzęcia doświadczalnego w pojedynczej dawce, część skóry niepoddana zabiegowi służy jako część kontrolna. Stopień korozji/podrażnienia jest oceniany przy pomocy punktacji w określonych odstępach i zapisywany, a następnie dodatkowo opisywany w celu całkowitego oszacowania skutków działania. Czas trwania badania powinien być wystarczający do oceny odwracalności lub nieodwracalności zaobserwowanych skutków.
Zwierzęta wykazujące ciągłe objawy silnego strachu i/lub bólu na jakimkolwiek etapie badań powinny zostać uśmiercone w sposób humanitarny, a substancja oceniona stosownie do zaobserwowanych skutków. Kryteria podejmowania decyzji co do uśmiercenia zwierząt w stanie agonalnym lub cierpiących ból zostały określone w załączniku (8).
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.4.1. Przygotowanie do badań in vivo
1.4.1.1. Wybór gatunku zwierząt
Biały królik jest preferowanym gatunkiem zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystywane są zdrowe młode dorosłe króliki. W przypadku wykorzystania innych gatunków należy podać uzasadnienie.
1.4.1.2. Przygotowanie zwierząt
Na około 24 godziny przed badaniem należy usunąć futro z tułowia zwierzęcia poprzez gładkie wygolenie obszaru skóry na grzbiecie. Należy unikać otarć naskórka. Należy wykorzystywać wyłącznie zwierzęta ze zdrową nienaruszoną skórą.
Niektóre szczepy królików posiadają kępy futra, których gęstość jest większa w określonych porach roku. Takie obszary gęstego futra nie powinny być używane jako miejsca badań.
1.4.1.3. Warunki przebywania i warunki żywieniowe
Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 20 °C (± 3°) dla królików. Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50-60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej.
1.4.2. Procedura badań
1.4.2.1. Podanie substancji badanej
Substancja badana powinna zostać zaaplikowana na małym obszarze skóry (około 6 cm2) i przykryta łatą gazy przytrzymywaną na miejscu przy pomocy niepodrażniającego plastra. W przypadku gdy zaaplikowanie substancji bezpośrednio nie jest niemożliwe (np. w przypadku cieczy lub niektórych past), substancja badana powinna zostać najpierw nałożona na gazę, a następnie na skórę. Gaza powinna luźno przylegać do skóry i powinna być przyczepiona do skóry na czas trwania ekspozycji przy pomocy odpowiedniego opatrunku półokluzyjnego. Jeżeli substancja badana została podana na łacie, powinna ona być przyczepiona do skóry w sposób zapewniający dobry kontakt i równomierne rozprowadzenie substancji na skórze. Należy zapobiec dostępowi zwierzęcia do gazy oraz spożyciu lub inhalacji substancji badanej przez zwierzę.
Ciekłe substancje badane są na ogół stosowane w stanie nierozcieńczonym. W przypadku badania substancji stałych (których postać można zmienić na postać proszkową, o ile zachodzi tak konieczność) substancja badana powinna zostać rozcieńczona przy użyciu minimalnej ilości wody (lub, o ile to konieczne, innego odpowiedniego nośnika), wystarczającej do zapewnienia dobrego kontaktu ze skórą. Jeżeli stosowany jest inny nośnik niż woda, potencjalny wpływ na podrażnienia skóry przez tą substancję powinien być minimalny lub żaden.
O ile to możliwe, na zakończenie okresu ekspozycji, który na ogół trwa cztery godziny, pozostałości substancji badanej powinny zostać usunięte przy użyciu wody lub innego odpowiedniego rozcieńczalnika, w sposób pozwalający na uniknięcie zmian w zaistniałej reakcji oraz nienaruszenie naskórka.
1.4.2.2. Poziom dawki
Aplikowana jest dawka 0,5 ml cieczy lub 0,5 g ciała stałego lub pasty na badany obszar skóry.
1.4.2.3. Badanie wstępne (Badanie in vivo podrażnienia/korozji skóry przy użyciu jednego zwierzęcia)
Stanowczo zaleca się, aby badania in vivo były przeprowadzane wstępnie przy użyciu jednego zwierzęcia, zwłaszcza w przypadku podejrzeń, że substancja jest potencjalnie korozyjna. Jest to zgodne z sekwencyjną strategią badawczą (zob. załącznik 1).
Jeżeli oceniono, że substancja może mieć właściwości korozyjne na podstawie analizy wagi dowodów, nie są wymagane dalsze badania na zwierzętach. W przypadku większości substancji, w odniesieniu do których istnieje podejrzenie korozyjności, nie wymagane są zazwyczaj dodatkowe badania in vivo. Jednakże w przypadkach gdzie istnieje potrzeba dostarczenia dodatkowych danych z uwagi na niewystarczające dowody, mogą zostać przeprowadzone ograniczone badania na zwierzętach z zastosowaniem następującej procedury: na skórę zwierzęcia nakłada się maksymalnie do trzech łat testowych. Pierwsza łata jest usuwana po
trzech minutach. Jeżeli nie zaobserwowano żadnych poważnych reakcji skórnych, nakładana jest druga łata i usuwana po godzinie. Jeżeli obserwacje na tym etapie wskazują na to, że ekspozycja może być humanitarnie przeprowadzana, należy wydłużyć jej czas do czterech godzin, trzecia łata jest nakładana i zdejmowana po czterech godzinach, a reakcja punktowana.
Jeżeli działanie korozyjne jest stwierdzone po jednej z trzech sekwencyjnych ekspozycji, badanie jest natychmiast przerywane. W przypadku niestwierdzenia działania korozyjnego po usunięciu ostatniej łaty, zwierzę jest poddawane obserwacji w okresie 14 dni, o ile wcześniej nie rozwinie się korozja.
W przypadku gdy nie przewiduje się, że substancja badana może powodować korozję, lecz może wywoływać podrażnienia, powinna ona zostać zaaplikowana jednemu zwierzęciu na czas czterech godzin.
1.4.2.4. Badanie potwierdzające (Badanie in vivo podrażnienia skórnego przy wykorzystaniu dodatkowych zwierząt)
W przypadku niestwierdzenia działań korozyjnych w badaniach wstępnych działanie podrażniające lub jego brak należy potwierdzić przy wykorzystaniu maksymalnie dwóch dodatkowych zwierząt. Każde powinno zostać zbadane przy pomocy jednej łaty w czterogodzinnym okresie ekspozycji. W przypadku stwierdzenia działania podrażniającego w badaniu wstępnym, badanie potwierdzające może zostać przeprowadzone w sposób sekwencyjny lub poprzez ekspozycję dwóch dodatkowych zwierząt jednocześnie. W wyjątkowym przypadku nieprzeprowadzania badania wstępnego, można zbadać dwa lub trzy zwierzęta, z których każde zostanie poddane działaniu jednej łaty, usuniętej następnie po czterech godzinach. Jeżeli w przypadku wykorzystywania dwóch zwierząt, obydwa wykazują te same reakcje, nie wymaga się przeprowadzania dalszych badań. W innym wypadku zbadane zostaje również trzecie zwierzę. Niejednoznaczna reakcja może wymagać oceny z wykorzystaniem dodatkowych zwierząt.
1.4.2.5. Okres obserwacji
Długość trwania obserwacji powinien być wystarczający do pełnej oceny odwracalności zaobserwowanych efektów. Jednakże eksperyment powinien zostać przerwany, skoro tylko zwierzę zacznie wykazywać trwałe objawy silnego bólu lub strachu. W celu określenia odwracalności skutków zwierzę powinno być obserwowane maksymalnie przez okres 14 dni od usunięcia łat. W przypadku zaobserwowania odwracalności przed upływem 14 dni, eksperyment powinien zostać przerwany.
1.4.2.6. Obserwacja kliniczna i ocena punktowa reakcji skóry
Zwierzęta powinny zostać zbadane pod kątem wystąpienia objawów rumienia i obrzęku oraz reakcji odnotowanych po 60 minutach, a następnie po 24, 48 oraz 72 godzinach od usunięcia łaty. W badaniu wstępnym przeprowadzanym na jednym zwierzęciu miejsce zaaplikowania substancji badanej jest badane również natychmiast po usunięciu łaty. Reakcje skórne są oceniane przy pomocy wartości punktowych i zapisywane zgodnie z punktacją podaną w tabeli poniżej. W przypadku uszkodzenia naskórka, którego nie można zidentyfikować jako podrażnienia ani korozji po 72 godzinach, w celu określenia odwracalności efektów konieczne może okazać się prowadzenie obserwacji do 14 dnia. Oprócz spostrzeżeń na temat podrażnień należy w pełni opisać i zarejestrować wszelkie miejscowe skutki toksyczne, takie jak odtłuszczenie skóry oraz wszelkie ogólnoustrojowe niekorzystne skutki (np. skutki klinicznych objawów zatrucia i utrata masy ciała). Celem wyjaśnienia niejednoznacznych reakcji można posłużyć się badaniem histopatologicznym.
Ocena punktowa reakcji skóry jest z konieczności subiektywna. Celem propagowania harmonizacji oceny punktowej reakcji skóry oraz zapewnienia pomocy laboratoriom badawczym oraz osobom zaangażowanym w prowadzenie oraz interpretację obserwacji, personel prowadzący obserwacje powinien być odpowiednio przeszkolony w zakresie stosowanego systemu oceny (zob. tabela poniżej). Pomocne mogą okazać się ilustrowane instrukcje dotyczące klasyfikacji podrażnień i innych zmian skóry (9).
2. DANE
2.1. PREZENTACJA WYNIKÓW
Streszczenie wyników badań powinno zostać przedstawione w formie tabeli w sprawozdaniu końcowym z badań, która powinna zawierać wszystkie pozycje wymienione w sekcji 3.1.
2.2. OCENA WYNIKÓW
Wartości punktowe podrażnienia skóry winny być ocenianie stosownie do natury oraz natężenia zmian, oraz w świetle ich odwracalności lub jej braku. Poszczególne wyniki nie stanowią normy bezwzględnej właściwości podrażniających danego materiału, ponieważ ocenie poddawane są również pozostałe skutki ekspozycji na badany materiał. Alternatywnie, poszczególne wyniki powinny być traktowane jako wartości odniesienia, które muszą być oceniane w świetle wszystkich pozostałych spostrzeżeń z badań.
W ocenie reakcji podrażnienia pod uwagę powinna być brana odwracalność zmian skóry. Jeżeli reakcje takie jak alopecja (na ograniczonej powierzchni), hiperkeratoza, hiperplazja i łuszczenie są nadal obecne wraz z upływem 14-dniowego okresu obserwacji, substancja badana powinna zostać uznana za drażniącą.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań musi zawierać następujące informacje:
Uzasadnienie badań in vivo: analizę wagi dowodów, włączając wyniki realizacji strategii badań sekwencyjnych:
- opis odpowiednich danych z uprzednio przeprowadzonych badań,
- dane uzyskane w wyniku realizacji każdego etapu strategii badawczej,
- opis przeprowadzonych badań in vitro, włączając szczegółowe dane na temat procedur, wyników otrzymanych z zastosowaniem substancji testowych/odniesienia,
- analiza wagi dowodów istniejących danych dla celów przeprowadzenia badań in vivo. Substancja badana:
- identyfikacja (np. numer CAS, źródło, czystość, znane zanieczyszczenia, numer osobnika),
- stan skupienia i właściwości fizyko-chemiczne (np. pH, lotność, rozpuszczalność, stabilność),
- w przypadku mieszaniny skład i zawartość procentową składników. Nośnik:
- identyfikacja, stężenie (jeżeli dotyczy), użyta objętość,
- uzasadnienie wyboru nośnika. Badane zwierzęta:
- wykorzystany gatunek/szczep, uzasadnienie wykorzystania zwierząt innych niż białe króliki,
- liczba zwierząt każdej płci,
- indywidualna masa ciała na początku i na końcu badań,
- wiek na początku badań,
- źródło pochodzenia zwierząt, warunki przetrzymywania, dieta itp. Warunki badań:
- technika przygotowywania miejsc przyłożenia łat,
- szczegółowy opis materiału, z którego wykonane są łaty, i sposób ich przykładania,
- szczegóły dotyczące przygotowania, zaaplikowania i usunięcia substancji badanej. Wyniki:
- tabele wyników podrażnienia/korozji dla każdego zwierzęcia w każdym punkcie czasowym pomiaru,
- opis wszelkich zaobserwowanych zmian,
- słowny opis rodzaju i stopnia zaobserwowanego podrażnienia lub korozji oraz wszystkie dane histopatologiczne,
- opis innych niekorzystnych zmian miejscowych i ogólnoustrojowych (np. odtłuszczenie skóry) towarzyszących podrażnieniu lub korozji skóry.
Omówienie wyników
4. BIBLIOGRAFIA
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C, Fentem, J.H., Gerner, I.,Giuliani, A., Gray T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P.(1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23,410-429.
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. InVitro, 2, 19-26.
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709-720.
(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, "Skin Irritation", European Chemical Industry Ecology and Toxicology Centre, Brussels.
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.
(5a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.
(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/ HCL6.htm).
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Grade and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Grading No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm).
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.
[Dostępne na wniosek w sekretariacie OECD].
Tabela I
PUNKTOWA OCENA REAKCJI SKÓRY
Tworzenie rumienia i obrzęku
Brak rumienia ....0
Bardzo lekki rumień (prawie niewidoczny) ....1
Wyraźny rumień ....2
Rumień umiarkowany do mocnego ....3
Mocny rumień (czerwień przypominająca barwę mięsa czerwonego) do form obrzęku wykluczających klasyfikację zmiany jako rumienia ....4
Maksymalna możliwa wartość punktowa: ....4
Tworzenie się obrzęku
Brak obrzęku ....0
Bardzo słaby obrzęk (prawie niewidoczny) ....1
Lekki obrzęk (dobrze wyodrębniony) ....2
Umiarkowany obrzęk (wzniesienie na około 1 mm) ....3
Mocny obrzęk (wniesienie ponad 1 mm, sięgający poza obszar eksponowania) ....4
Maksymalna możliwa wartość punktowa: 4
Celem wyjaśnienia reakcji niejednoznacznych można przeprowadzić badanie histopatologiczne.
ZAŁĄCZNIK
Strategia badań sekwencyjnych podrażnienia i korozji skóry
ROZWAŻANIA OGÓLNE
Zarówno w dobrze pojętym interesie nauki, jak i dobrostanu zwierząt, istotne jest uniknięcie niepotrzebnego wykorzystywania zwierząt oraz minimalizacja badań, które mogą powodować silne reakcje u zwierząt. Wszystkie informacje na temat danej substancji ważne z punktu widzenia jej potencjalnego działania podrażniającego/korozyjnego na skórę powinny zostać poddane ocenie przed podjęciem badań in vivo. Wystarczające dowody, pozwalające na sklasyfikowanie substancji badanej jako potencjalnie korozyjnej lub żrącej, mogą być dostępne na dzień dzisiejszy, skutkiem czego zbyteczne będzie przeprowadzanie badań na zwierzętach laboratoryjnych. Dlatego wykorzystanie analizy wagi dowodów pochodzących z istniejących danych oraz strategii badań sekwencyjnych zminimalizuje potrzebę badań in vivo, zwłaszcza jeżeli substancja może powodować silne reakcje.
Zalecane jest wykorzystanie analizy wagi dowodów celem oceny istniejących informacji dotyczących podrażnienia i korozji skóry przez substancje, a także celem stwierdzenia, czy należy przeprowadzić dodatkowe badania, inne niż badania skóry in vivo, celem scharakteryzowania takiego potencjalnego działania substancji. Jeżeli niezbędne są dalsze badania, zaleca się realizowanie strategii badań sekwencyjnych celem uzyskania odpowiednich danych doświadczalnych. W odniesieniu do substancji, które nie posiadają historii badań, strategia badań sekwencyjnych powinna zostać zastosowana w celu uzyskania kompletu danych potrzebnych do oceny potencjalnego działania korozyjnego/podrażniającego danej substancji na skórę. Strategia badań opisana w niniejszym załączniku została opracowana w trakcie warsztatów OECD (1), a następnie potwierdzona i rozszerzona w ramach Zharmonizowanego Zintegrowanego Systemu klasyfikacji substancji chemicznych zagrażających zdrowiu ludzkiemu i środowisku, zatwierdzonym w wyniku prac w ramach 28. Wspólnego spotkania Komitetu ds. Związków Chemicznych i Grupy Roboczej ds. Związków Chemicznych w listopadzie 1998 roku (2).
Pomimo że strategia badań sekwencyjnych nie jest integralną częścią metody badawczej B.4, utożsamia ona zalecane podejście do określania cech korozji/podrażnienia skóry. Wspomniane podejście reprezentuje zarówno najlepszą praktykę, jak i wzorzec etyczny dla badań in vivo podrażnień/korozji skóry. Omawiana metoda badawcza stanowi wytyczne dotyczące prowadzenia badań in vivo i streszcza czynniki, jakim należy poświęcić uwagę przed rozpoczęciem takich badań. Strategia określa podejście do oceny istniejących danych na temat właściwości podrażniających/korozyjnych substancji badanej na skórę oraz podejście warstwowe do generowania odpowiednich danych dotyczących substancji wymagających dodatkowych badań lub takich, w odniesieniu do których nie przeprowadzono jak dotąd badań. W ramach strategii zalecane jest ponadto przeprowadzenie zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo lub ex vivo korozji/podrażnienia skóry w określonych okolicznościach.
OPIS STRATEGII OCENY I BADAŃ
Przed podjęciem badań w ramach strategii badań sekwencyjnych (rysunek) należy poddać ocenie wszystkie dostępne informacje w celu określenia potrzeby prowadzenia badań in vivo na skórze. Chociaż istotne informacje mogą zostać uzyskane na podstawie oceny pojedynczych parametrów (np. wartości skrajnych pH), należy wziąć pod uwagę ogół istniejących informacji. Należy poddać ocenie wszystkie dane dotyczące skutków działania danej substancji lub substancji analogicznych, w podejmowaniu decyzji dotyczącej wagi dowodów, oraz należy przedstawić racjonalne uzasadnienie powziętej decyzji. Główny nacisk należy położyć na istniejące dane na temat działania substancji na ludzi oraz zwierzęta, a w następnej kolejności na wyniki badań in vivo lub ex vivo. O ile to możliwe, należy uniknąć badań in vivo substancji powodujących korozję. Czynniki uwzględniane w omawianej strategii badań obejmują:
Ocenę istniejących danych na temat działania substancji na ludzi i zwierzęta (etap 1). W pierwszej kolejności należy wziąć pod uwagę istniejące dane dotyczące działania na ludzi, np. badania kliniczne lub dane na temat stanowisk pracy, a także studia konkretnych przypadków oraz/lub dane pochodzące z badań przeprowadzonych na zwierzętach, np. pojedyncze lub wielokrotne badania ekspozycji na substancje toksyczne, ponieważ dostarczają informacji bezpośrednio związanych z oddziaływaniem na skórę. Substancje o znanym działaniu podrażniającym lub korozyjnym, a także substancje wyraźnie niewywierające skutków korozyjnych lub podrażniających nie muszą być badane in vivo.
Analiza zależności aktywności i struktury (SAR) (etap 2). Należy uwzględnić wyniki badań substancji pokrewnych pod względem budowy, o ile są one dostępne. W przypadku dostępności wystarczających danych na temat oddziałania na ludzi i/lub zwierzęta substancji pokrewnych pod względem budowy lub mieszanin takich substancji, wskazujących na ich potencjalne działanie korozyjne/podrażniające na skórę, można domniemywać, że substancja badana poddawana ocenie spowoduje taką samą reakcję. W takich przypadkach substancja ta nie musi być poddawana badaniu. Negatywne wyniki z badań na temat substancji pokrewnych pod względem budowy lub mieszanin takich substancji nie są wystarczającym dowodem na brak działań podrażniających lub korozyjnych danej substancji w świetle strategii badań sekwencyjnych. Zweryfikowane i zaakceptowane podejście SAR powinno zostać wykorzystane w celu zidentyfikowania potencjalnego oddziałania korozyjnego i podrażniającego na skórę.
Właściwości fizyko-chemiczne i reaktywność chemiczna (etap 3). Substancje charakteryzujące się skrajnym pH > 2,0 i < 11,5 mogą mieć silne działanie miejscowe. Jeżeli takie skrajne pH jest podstawą do identyfikacji substancji jako korozyjnej dla skóry, możliwe jest wykorzystanie jej rezerwy kwasowej/alkalicznej (tj. zdolności buforowej) (3)(4). Jeżeli zdolność buforowa wskazuje na to, że substancja może nie być korozyjna dla skóry, należy przeprowadzić dalsze badania w celu potwierdzenia tej cechy, najlepiej przy użyciu zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo lub ex vivo (zob. etapy 5 i 6).
Toksyczność skórna (etap 4). Jeżeli dana substancja chemiczna okazała się być bardzo toksyczna na skórę, badanie in vivo podrażnień/korozji skórnej może okazać się niemożliwe do przeprowadzenia, ponieważ ilość substancji badanej normalnie podawanej mogłaby przekroczyć bardzo toksyczną dawkę, co w konsekwencji powodowałoby śmierć lub silne cierpienie zwierząt. Dodatkowo, jeżeli badania toksyczności skórnej na białych królikach już zostały przeprowadzone do poziomu dawki granicznej 2.000 mg/kg masy ciała lub wyższego, i nie zaobserwowano skutków korozyjnych lub podrażniających, dodatkowe badania podrażnienia/korozji skóry mogą okazać się niepotrzebne. Należy uwzględnić wiele czynników w trakcie oceny ostrej toksyczności skórnej w przeprowadzonych uprzednio badaniach. Na przykład przedstawione informacje na temat zmian skóry mogą być niekompletne. Badania i obserwacje mogły być przeprowadzone na innych niż króliki gatunkach, które mogą wykazywać znaczące różnice w zakresie wrażliwości reakcji. Także postać substancji badanej zaaplikowanej zwierzętom mogła być nieodpowiednia do oceny działania korozyjnego/podrażniającego na skórę (np. poziom rozcieńczenia substancji do badań toksyczności skórnej (5)). Jednakże w przypadku właściwie zaprojektowanych i przeprowadzonych badań toksyczności u królików wyniki negatywne mogą stanowić wystarczające dowody na to, że dana substancja nie jest korozyjna lub podrażniająca.
Wyniki badań in vitro lub ex vivo (etap 5 i 6). Substancje, które wykazują właściwości korozyjne lub silnie podrażniające w zweryfikowanych i zaakceptowanych badaniach in vitro lub ex vivo (6)(7), przewidziane do oceny tych specyficznych skutków, nie muszą być badane na zwierzętach. Można przyjąć, że substancje te dadzą podobne wyniki in vivo.
Badania in vivo na królikach (etap 7 i 8). W przypadku podjęcia, na podstawie analizy wagi dowodów, decyzji dotyczącej przeprowadzenia badań in vivo, badanie takie powinno rozpocząć się badaniem wstępnym na jednym zwierzęciu. Jeżeli wyniki tego badania wskazują, że substancja ma działanie korozyjne na skórę, dalsze badania powinny zostać wstrzymane. W przypadku niestwierdzenia działania korozyjnego w badaniu wstępnym reakcja podrażniająca lub negatywna powinna zostać potwierdzona przy użyciu maksymalnie dwóch dodatkowych zwierząt poddanych ekspozycji przez czas czterech godzin. W przypadku wystąpienia podrażnienia we wstępnym badaniu należy przeprowadzić sekwencyjne badanie potwierdzające lub jednoczesną ekspozycję obydwu zwierząt.
BIBLIOGRAFIA
(1) OECD (1996). Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test method. Held on Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).
(2) OECD (1998). Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., Esdail D.J., Liebsch M. (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, 709-720.
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H. (1988). Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxic In Vitro, 2 (1) pp 19-26.
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I. (1996) Animal, Human, and In Vitro Test Method for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology Fifth Edition ISBN 1- 56032-356-6, Chapter 31,411-436.
(6) Testing Method B.40.
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, PA., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, pp. 483-524.
RYSUNEK STRATEGIA BADAŃ I OCENY PODRAŻNIEŃ/KOROZJI SKÓRY
B.5. TOKSYCZNOŚĆ OSTRA: PODRAŻNIENIE/KOROZJA OCZU
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.6. SENSYBILIZACJA SKÓRY
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.7. TOKSYCZNOŚĆ POWTARZANEJ (28 DNI) DAWKI (DOUSTNA)
1. METODA
1.1. WPROWADZENIE
Zob. Wprowadzenie ogólne w części B.
1.2. DEFINICJE
Zob. Wprowadzenie ogólne w części B.
1.3. ZASADA METODY BADANIA
Substancja testowana jest podawana kilku grupom zwierząt doświadczalnych doustnie, codziennie, w stopniowanych dawkach, jeden poziom dawki na grupę przez okres 28 dni. Podczas okresu dawkowania każdego dnia zwierzęta są dokładnie obserwowane w celu wykrycia oznak toksyczności. Zwierzęta, które zdychają lub są zabijane podczas testu, poddaje się sekcji zwłok, a na zakończenie testu zwierzęta, które przeżyły, są zabijane i poddawane sekcji zwłok.
Niniejsza metoda kładzie większy nacisk na objawy neurologiczne jako określony punkt końcowy, i podkreślana jest konieczność uważnych obserwacji klinicznych zwierząt, w celu otrzymania możliwie najwięcej informacji. Metoda ta powinna identyfikować związki chemiczne o potencjale neurotoksycznym, co może dawać podstawy do dalszego dogłębnego badania tego aspektu. Dodatkowo, metoda może wykazywać skutki immunologiczne i toksyczność organów rozrodczych.
1.4. OPIS METODY BADANIA
1.4.1. Przygotowania
Zdrowe, młode, dorosłe zwierzęta są losowo przydzielane do grupy kontrolnej i badanej. Klatki powinny być ustawione w taki sposób, żeby zminimalizować możliwy wpływ położenia klatki. Zwierzęta są identyfikowane jednoznacznie i przetrzymywane w klatkach przez co najmniej pięć dni przed rozpoczęciem badania, żeby umożliwić aklimatyzację do warunków laboratoryjnych.
Substancja testowana jest podawana bezpośrednio do żołądka, w pożywieniu lub w wodzie pitnej. Metoda aplikowania zależy od celu badania i właściwości fizycznych/chemicznych substancji.
W przypadku gdy to konieczne, substancja testowana jest rozpuszczona lub ma postać zawiesiny w odpowiednim nośniku. Zaleca się, aby jeżeli możliwe, najpierw było rozważone użycie wodnego roztworu/zawiesiny, następnie roztworu/emulsji w oleju (np. olej kukurydziany) i potem możliwy roztwór w innym nośnikach. W przypadku nośników innych niż woda musi być znana charakterystyka toksyczna nośnika. Powinna być określona trwałość testowanej substancji w nośniku.
1.4.2. Warunki badania
1.4.2.1. Zwierzęta badane
Preferowanym gatunkiem gryzonia jest szczur, chociaż inne gatunki gryzoni mogą być wykorzystane. Powinny być wykorzystywane powszechnie używane laboratoryjne rasy młodych, zdrowych, dorosłych zwierząt. Samice powinny być nieciężarne i takie, które nie rodziły. Dawkowanie powinno się rozpocząć jak najszybciej po odsadzeniu od matki, a w każdym przypadku przed ukończeniem dziewięciu tygodni.
Na początku badania wahania wagi zwierząt powinny być minimalne i nie przekraczać ± 20 % średniej wagi dla każdej płci.
W przypadku gdy badanie wielokrotnej dawki doustnej jest przeprowadzane jako badanie wstępne do badania długoterminowego, preferowane do obu badań są zwierzęta tej samej rasy i z tego samego źródła.
1.4.2.2. Liczba i płeć
Co najmniej 10 zwierząt (pięć samic i pięć samców) powinno być użytych dla każdego poziomu dawki. Jeżeli planowane jest uśmiercanie w międzyczasie, liczba powinna być powiększona o liczbę zwierząt, które według planu mają być zabite przed ukończeniem badania.
Dodatkowo grupa satelicka 10 zwierząt (pięć zwierząt każdej płci) może być poddana działaniu wysokiego poziomu dawki przez 28 dni i obserwowana, przez 14 dni po dawkowaniu, pod kątem odwracalności, trwałości, i opóźnionego wystąpienia objawów zatrucia. Jest także stosowana grupa satelicka 10 zwierząt kontrolnych (pięć zwierząt każdej płci).
1.4.2.3. Poziomy dawki
Zasadniczo powinny być wykorzystane co najmniej trzy grupy badane i grupa kontrolna. Z wyjątkiem zastosowania substancji testowanej, ze zwierzętami grupy kontrolnej powinno się obchodzić w sposób identyczny, jak z podmiotami grupy badanej. Jeżeli przy podawaniu substancji testowanej jest stosowany nośnik, grupa kontrolna powinna otrzymać największą użytą objętość nośnika.
Jeżeli z oceny innych danych należałoby oczekiwać braku objawów przy dawce 1.000 mg/kg masy ciała/dzień, może być przeprowadzony test graniczny. Jeżeli nie są dostępne odpowiednie dane, może być wykonane badanie wyników zakresowych, pomagające określić dawki, które mają być użyte.
Poziomy dawki powinny być wybierane, biorąc pod uwagę jakiekolwiek istniejące dane o toksyczności i dane toksykokinetczne osiągalne dla substancji testowanej lub materiałów pokrewnych. Powinien zostać wybrany najwyższy poziom dawki, w celu wywołania objawów zatrucia, ale nie śmierci lub poważnego cierpienia. Od tego czasu malejąca sekwencja poziomów dawki powinna być dobierana w taki sposób, aby wykazać wszystkie reakcje powiązane z dawkowaniem i brak obserwowanych objawów niekorzystnych przy najmniejszym poziomie dawki (NOAEL). Dwie lub cztery ograniczone przerwy są często optymalne dla ustalenia malejących poziomów dawki i dodanie czwartej grupy badanej jest często bardziej pożądane niż stosowanie bardzo dużych przerw (np. współczynnik większy od 10) między dawkowaniem.
W przypadku substancji podawanych w pożywieniu lub wodzie pitnej ważne jest zapewnienie, aby wymagane ilości substancji testowanej nie kolidowały z prawidłową równowagą odżywiania lub wody. W przypadku gdy substancja testowana jest podawana w pożywieniu, może być stosowane stałe stężenie żywieniowe (ppm) albo stały poziom dawki odniesionej do masy ciała zwierząt; użyta opcja musi być wyszczególniona. W przypadku substancji podawanej bezpośrednio do żołądka dawka powinna być podawana każdego dnia o podobnym czasie i w razie konieczności modyfikowana, żeby utrzymać stały poziom dawki w odniesieniu do masy ciała zwierzęcia.
W przypadku gdy badanie wielokrotnej dawki jest przeprowadzane jako badanie wstępne do badania długoterminowego, w obu badaniach powinna być stosowana podobna dieta.
1.4.2.4. Test graniczny
Jeżeli test przy jednym poziomie dawki równym co najmniej 1.000 mg/kg masy ciała/dzień lub, w przypadku podawania w pożywieniu lub wodzie pitnej, równoważny procent w pożywieniu lub wodzie pitnej (na podstawie ustalonej masy ciała), stosując procedury opisane dla tego badania, nie wywołuje widocznych objawów zatrucia i jeżeli nie należałoby spodziewać się toksyczności na podstawie danych, dotyczących substancji strukturalnie pokrewnych, wtedy pełne badanie przy użyciu trzech poziomów dawki może nie być konieczne. Niniejszy test graniczny ma zastosowanie, z wyłączeniem tych przypadków, w których ekspozycja ludzi wskazuje na konieczność użycia wyższego poziomu dawki.
1.4.2.5. Okres obserwacji
Okres obserwacji powinien wynosić 28 dni. Zwierzęta w grupie satelickiej wyznaczone do obserwacji uzupełniających powinny być przetrzymane przez co najmniej 14 dalszych dni bez terapii, w celu wykrycia opóźnionych objawów zatrucia, ich trwałości lub powrotu do zdrowia.
1.4.3. Procedura
Substancja testowana jest dawkowana zwierzętom codziennie przez siedem dni każdego tygodnia w okresie 28 dni; zastosowanie pięciodniowego tygodniowego reżimu dawkowania musi być uzasadnione. W przypadku gdy substancja testowana jest podawana bezpośrednio do żołądka, powinno to być zrobione w jednej dawce przy użyciu rurki lub odpowiedniej kaniuli dotchawicznej. Maksymalna objętość cieczy, która może być podana jednorazowo, zależy od rozmiarów badanego zwierzęcia. Objętość nie powinna przekraczać 1 ml/100 g masy ciała, oprócz roztworów wodnych, w przypadku których można użyć 2 ml/100 g masy ciała. Poza substancjami drażniącymi i korozyjnymi, które normalnie ujawniają zaostrzone objawy przy wyższych stężeniach, zmienność objętości w badaniu powinna być zminimalizowana przez dostosowanie stężenia, aby zapewnić stałą objętość przy wszystkich poziomach dawki.
1.4.3.1. Ogólne obserwacje
Ogólne obserwacje kliniczne powinny być przeprowadzane co najmniej raz dziennie, najlepiej każdego dnia w tym samym czasie, biorąc pod uwagę szczytowy okres przewidywanych objawów po dawkowaniu. Stan zdrowia zwierząt powinien być odnotowywany. Co najmniej dwa razy dziennie wszystkie zwierzęta są obserwowane pod kątem zachorowalności i śmiertelności. Zwierzęta konające oraz zwierzęta przejawiające ostre cierpienie i ból powinny być usuwane, gdy zostanie to zauważone, humanitarnie zabite i poddane sekcji zwłok.
Jeden raz przed pierwszą ekspozycją (aby uwzględnić porównanie w obrębie podmiotów), i od tego czasu co najmniej raz w tygodniu, powinny być przeprowadzane szczegółowe obserwacje kliniczne wszystkich zwierząt. Obserwacje te powinny być przeprowadzane na zewnątrz klatki macierzystej na znormalizowanej powierzchni i najlepiej za każdym razem w tym samym czasie. Powinny one być starannie odnotowywane, najlepiej przy użyciu systemów zapisywania, wyraźnie zdefiniowanych przez laboratorium testujące. Powinny być podjęte wysiłki, aby zagwarantować, że zmiany warunków badania są minimalne i że obserwacje są przeprowadzane najlepiej przez obserwatorów nieświadomych terapii. Zanotowane oznaki powinny obejmować, ale nie powinny być do nich ograniczone, zmiany w skórze, futrze, oczach, błonach śluzowych, wystąpienie wydzielin i wydalin aktywności wegetatywnej (np. łzawienie, podniesienie sierści, rozmiar źrenicy, niezwykła forma oddychania). Powinny być także odnotowywane zmiany w sposobie chodzenia, postawie, i reakcji na dotyk, jak również obecność ruchów drgawkowych lub kurczowych, stereotypów (np. nadmierne czyszczenie się, powtarzające się krążenie w kółko) oraz dziwne zachowanie (np. samookaleczanie, chodzenie do tyłu).
W czwartym tygodniu ekspozycji powinna być przeprowadzona ocena reaktywności sensorycznej na różnego typu bodźce (np. bodźce słuchowe, wzrokowe i proprioreceptoryczne), ocena siły uchwytu i aktywności motorycznej. Dalsze szczegóły procedur, które mogłyby być zastosowane, są podane w literaturze (zob. Wprowadzenie ogólne w część B).
Obserwacje funkcjonalne przeprowadzane w czwartym tygodniu ekspozycji mogą być pominięte, gdy badanie prowadzone jest jako badanie wstępne do późniejszego badania (90-dniowego) podchronicznego. W takim przypadku obserwacje funkcjonalne powinny być zawarte w tym uzupełniającym badaniu. Z drugiej strony, dostępność danych dotyczących obserwacji funkcjonalnych z badania wielokrotnej dawki może poprawić możliwość wyboru poziomów dawki do celów późniejszego badania podchronicznego.
Wyjątkowo obserwacje funkcjonalne mogą być pominięte w przypadku grup, które w przeciwnym przypadku ujawniają oznaki zatrucia w stopniu, który mógłby znacząco kolidować z wykonaniem testu funkcjonalnego.
1.4.3.2. Masa ciała i spożycie żywności/wody
Wszystkie zwierzęta powinny być ważone co najmniej raz w tygodniu. Pomiary spożycia żywności i wody powinny być wykonywane co najmniej raz na tydzień. Jeżeli substancja testowana podawana jest z wodą pitną, spożycie wody powinno być również mierzone co najmniej raz na tydzień.
1.4.3.3. Hematologia
Na końcu okresu badania powinny być przeprowadzone następujące analizy hematologiczne: hematokryt, stężenie hemoglobiny, liczba erytrocytów, całkowita i różnicowa liczba leukocytów, liczba płytek krwi i pomiar krzepliwości krwi czas/potencjał.
Próbki krwi powinny być pobierane z wyznaczonego miejsca tuż przed lub jako część procedury zabijania zwierząt i przechowywane w odpowiednich warunkach.
1.4.3.4. Biochemia kliniczna
Oznaczenia biochemii klinicznej w celu zbadania znaczących skutków toksycznych w tkankach, a ściśle - skutków w nerkach i wątrobie, powinny być wykonane na otrzymanych próbkach krwi wszystkich zwierząt tuż przed lub jako część procedury zabijania zwierząt (z wyjątkiem tych, które znaleziono konające i/lub zabite w międzyczasie). Zalecane jest wstrzymanie podawania pożywienia dla zwierząt przez noc poprzedzającą pobranie krwi(1). Badania osocza i surowicy muszą obejmować sód, potas, glukozę, całkowity cholesterol, mocznik, kreatyninę, całkowite białko i albuminę, co najmniej dwa enzymy wskazujące na skutki komórkowe w wątrobie (takie jak aminotransferaza alaninowa, aminotransferaza asparaginowa, alkaliczna fosfataza, transpeptydaza gamma-glutamylowa i dehydrogenaza sorbitowa). Pomiary dodatkowych enzymów (wątrobowego lub innego pochodzenia) i kwasów żółciowych mogą dostarczyć przydatnych informacji w danych okolicznościach.
Fakultatywnie, stosując czasowe objętościowe zbieranie moczu podczas ostatniego tygodnia badań, mogłyby być wykonane następujące oznaczenia analizy moczu: wygląd, objętość, osmolarność i ciężar właściwy, pH, białko, glukoza i krew/komórki krwi.
Dodatkowo powinno być rozważone badanie markerów surowicy dotyczących ogólnego uszkodzenia tkanki. Inne oznaczenia, które powinny być przeprowadzone, jeżeli znane właściwości substancji testowanej mogą lub podejrzewa się, że mogą wpływać na pokrewne profile metaboliczne, obejmują wapń, fosforan, triglicerydy po poście, hormony specyficzne, metahemoglobinę i cholinoesterazę. Powyższe musi zostać rozpoznane w odniesieniu do substancji w niektórych klasach lub na zasadzie analizy przypadku.
Ogólnie, istnieje konieczność elastycznego podejścia, zależnie od gatunku i obserwowanych i/lub spodziewanych skutków danej substancji.
Jeżeli dane poziomu tolerancji z przeszłości są niedostateczne, powinno się rozważyć oznaczenie zmiennych hematologicznych i biochemii klinicznej zanim rozpocznie się dawkowanie.
1.4.3.5. Sekcja zwłok
Wszystkie zwierzęta uczestniczące w badaniu muszą być poddane pełnej, szczegółowej sekcji zwłok, która obejmuje staranne badanie zewnętrznych powierzchni ciała, wszystkich otworów i jam czaszkowych, piersiowych i brzusznych oraz ich zawartości. Wątroba, nerki, nadnercza, jądra, gruczoły opuszkowo-cewkowe, grasica, śledziona, mózg i serce wszystkich zwierząt powinny być właściwie oczyszczone z jakiejkolwiek przylegającej tkanki i zważone mokre, jak najszybciej po przeprowadzeniu sekcji, aby uniknąć wysuszenia.
Następujące tkanki powinny być zakonserwowane w utrwalającym ośrodku najbardziej odpowiednim zarówno dla typu tkanki, jak i zamierzonego późniejszego badania histopatologicznego: wszystkie duże zmiany patologiczne, mózg (reprezentatywne rejony w tym mózg, móżdżek i pons), rdzeń kręgowy, żołądek, jelito cienkie i grube (w tym kępki Peyera), wątroba, nerki, nadnercza, śledziona, serce, grasica, tarczyca, tchawica i płuca (zakonserwowane przez napełnienie środkiem utrwalającym i następnie zanurzenie), gruczoły płciowe, pomocnicze narządy płciowe (np. macica, prostata), pęcherz moczowy, węzły chłonne (najlepiej jeden węzeł chłonny obejmujący drogę podawania i inny węzeł odległy od drogi podawania, aby uwzględnić skutki ogólnoustrojowe), nerw obwodowy (kulszowy lub piszczelowy), najlepiej w bliskiej odległości od mięśnia, i część szpiku kostnego (lub, ewentualnie, świeżo pobrana mała objętość szpiku kostnego). Wyniki badań klinicznych i innych mogą wskazywać na konieczność zbadania dodatkowych tkanek. Powinny również zostać zakonserwowane inne narządy, na które może być skierowane działanie substancji testowanej, opierając się na jej znanych właściwościach.
1.4.3.6. Badanie histopatologiczne
Pełne badanie histopatologiczne powinno być przeprowadzone na zakonserwowanych narządach i tkankach wszystkich zwierząt z grupy kontrolnej i grupy wysokiej dawki. Badania te powinny być rozszerzone na zwierzęta z grup wszystkich innych dawek, jeżeli w grupie wysokiej dawki obserwowane są zmiany związane z działaniami badawczymi.
Wszystkie duże zmiany patologiczne muszą być zbadane.
W przypadku gdy stosowana jest grupa satelicka, badania histopatologiczne powinny być przeprowadzone na tkankach i narządach rozpoznanych jako wykazujące skutki w grupach badanych.
2. DANE
Powinny zostać dostarczone dane indywidualne zwierząt. Dodatkowo wszystkie dane powinny być podsumowane w formie tabeli, przedstawiając dla każdej grupy badanej liczbę zwierząt na początku testu, liczbę zwierząt, które znaleziono martwe podczas testu lub zabito z powodów humanitarnych i czas każdej śmierci lub humanitarnego zabicia, liczbę zwierząt wykazujących oznaki toksyczności, opis obserwowanych oznak zatrucia, w tym czas rozpoczęcia, okres trwania, ostrość wszystkich objawów zatrucia, liczbę zwierząt wykazujących zmiany patologiczne, typ tych zmian i procent zwierząt przejawiających każdy typ zmian patologicznych.
W przypadkach gdy jest to możliwe, wyniki liczbowe powinny być ocenione za pomocą odpowiedniej i ogólnie akceptowanej metody statystycznej. Metody statystyczne powinny być wybrane podczas planowania badania.
3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
SPRAWOZDANIE Z TESTU Sprawozdanie z testu obejmuje, jeżeli możliwe, następujące informacje:
Zwierzęta badane:
- wykorzystany gatunek/rasa,
- liczba, wiek i płeć zwierząt,
- źródło, warunki przebywania zwierząt, dieta itp.,
- indywidualna waga zwierząt na początku testu, od tego czasu w tygodniowych odstępach i na końcu testu.
Warunki testu:
- uzasadnienie wyboru nośnika, jeżeli jest inny niż woda,
- racjonalna podstawa wyboru poziomu dawki,
- szczegóły dotyczące przygotowania formy użytkowej substancji testowanej/żywności, osiąganego stężenia, trwałości i homogeniczności preparatu,
- szczegóły podawania substancji testowanej,
- jeżeli ma zastosowanie, przeliczenie stężenia substancji testowanej w żywności/wodzie pitnej (ppm) na rzeczywistą dawkę (mg/kg masy ciała/dzień),
- szczegóły jakości pożywienia i wody. Wyniki:
- masa ciała/zmiany masy ciała,
- spożycie żywności i spożycie wody, w odpowiednich przypadkach,
- dane, dotyczące reakcji toksycznej według płci i poziomu dawki, w tym oznaki oksyczności,
- natura, ostrość i czas trwania obserwacji klinicznych (czy odwracalne, czy nie),
- ocena aktywności sensorycznej, siły uchwytu i aktywności motorycznej,
- testy hematologiczne z odpowiednimi wartościami poziomu tolerancji,
- kliniczne testy biochemiczne z odpowiednimi wartościami poziomu tolerancji,
- masa ciała w chwili zabicia i dane o masie narządów,
- wyniki sekcji zwłok,
- szczegółowy opis wszystkich wyników histopatologicznych,
- dane absorpcji, jeżeli dostępne,
- statystyczna obróbka wyników, gdzie właściwe. Rozpatrzenie wyników. Wnioski.
4. BIBLIOGRAFIA
Niniejsza metoda jest analogiczna do OECD TG 407.
______
(1) W przypadku kilku pomiarów w osoczu i surowicy, zwłaszcza glukozy, pożądane byłoby wstrzymanie podawania pożywienia przez całą noc. Głównym powodem takich preferencji jest fakt, że zwiększona zmienność, która nieuchronnie wynikałaby z podawania pożywienia, przyczyniałaby się do maskowania bardziej subtelnych skutków i utrudniałaby interpretację. Z drugiej strony, jednakże wstrzymanie podawania pożywienia przez całą noc może szkodzić ogólnemu metabolizmowi zwierząt i, szczególnie w badaniach żywieniowych, może naruszać dzienną ekspozycję na substancję testowaną. Jeżeli przyjęte jest wstrzymanie podawania pożywienia przez całą noc, biochemiczne oznaczenia kliniczne powinny być wykonane po przeprowadzeniu obserwacji funkcjonalnych w czwartym tygodniu badania.
B.8. TOKSYCZNOŚĆ POWTARZANEJ (28 DNI) DAWKI (INHALACYJNA)
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.9. TOKSYCZNOŚĆ POWTARZANEJ (28 DNI) DAWKI (DERMALNA)
1. METODA
1.1. WPROWADZENIE
Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. A).
1.2. DEFINICJE
Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. B).
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Brak.
1.4. ZASADA METODY BADANIA
Substancję badaną podaje się na skórę w stopniowanych dawkach kilku grupom zwierząt doświadczalnych, po jednej dawce na grupę, przez okres 28 dni. W okresie podawania prowadzi się codzienną obserwację zwierząt w celu wykrycia objawów toksyczności. Zwierzęta, które zdechną w trakcie badania, i te, które przeżyją po jego zakończeniu, poddaje się sekcji zwłok.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCI
Brak.
1.6. OPIS METODY BADANIA
1.6.1. Przygotowania
Zwierzęta muszą być trzymane w doświadczalnych warunkach pobytu i karmienia przez co najmniej pięć dni przed przeprowadzeniem badania. Przed przeprowadzeniem badania zdrowe, młode, dorosłe zwierzęta są wybierane losowo i przydzielane do poszczególnych grup poddanych działaniu substancji i kontrolnych. Na krótko przed rozpoczęciem eksperymentu należy usunąć sierść z grzbietowej powierzchni tułowia zwierząt przez przycięcie lub ogolenie. Można zastosować ogolenie, jednak należy je przeprowadzić na około 24 godziny przed rozpoczęciem badania. Na ogół konieczne jest powtarzanie przycinania lub golenia sierści w odstępach około jednego tygodnia. Podczas przycinania lub golenia sierści należy uważać, aby nie uszkodzić skóry. Nie mniej niż 10 % powierzchni ciała powinno być wolne w celu zastosowania substancji badanej. Przy podejmowaniu decyzji o wielkości powierzchni ciała, jaką należy oczyścić, oraz o rozmiarach pokrycia tej powierzchni substancją należy uwzględnić masę ciała zwierzęcia. Przy badaniu ciała stałego, które można sproszkować gdy to stosowne, substancja badana powinna być wystarczająco nawilżona wodą lub, w miarę potrzeby, stosownym podłożem dla zapewnienia dobrego kontaktu ze skórą. Płynne substancje badane stosuje się na ogół w stanie nierozcieńczonym. Substancję stosuje się codziennie przez pięć do siedmiu dni w tygodniu.
1.6.2. Warunki badania
1.6.2.1. Zwierzęta doświadczalne
Można wykorzystać dorosłe szczury, króliki lub świnki morskie. Można stosować inne gatunki, lecz ich użycie wymaga uzasadnienia.
Na początku badania zmienność masy ciała zastosowanych zwierząt nie powinna przekraczać ± 20 % odpowiedniej wartości średniej.
1.6.2.2. Liczba i płeć
Wykorzystuje się co najmniej 10 zwierząt (pięć samic i pięciu samców) ze zdrową, nienaruszoną skórą w przypadku każdego poziomu dawkowania. Samice powinny być nieródkami i nie mogą być w ciąży. Jeżeli planuje się uśmiercanie zwierząt w międzyczasie, ogólna ich liczba powinna być zwiększona o liczbę zwierząt zaplanowanych do uśmiercenia przed zakończeniem badania. Dodatkowo, grupa satelicka 10 zwierząt (pięć zwierząt każdej płci) może być poddana działaniu wysokiego poziomu dawki przez 28 dni i obserwowana, przez 14 dni po dawkowaniu, pod kątem odwracalności, trwałości i opóźnionego wystąpienia objawów zatrucia. Jest także stosowana grupa satelicka 10 zwierząt kontrolnych (pięć zwierząt każdej płci).
1.6.2.3. Wielkości dawek
Należy zastosować co najmniej trzy wielkości dawek z grupą kontrolną lub grupą kontrolną otrzymującą podłoże, o ile to ostatnie jest stosowane. Czas ekspozycji powinien wynosić co najmniej sześć godzin na dobę. Substancję badaną należy podawać o podobnej porze każdego dnia, przy czym wielkości dawek należy tak dostosowywać w odpowiednich odstępach czasu (co tydzień lub co dwa tygodnie), aby utrzymać stałą wielkość dawki w przeliczeniu na masę ciała zwierzęcia. Z wyjątkiem zastosowania substancji badanej, ze zwierzętami grupy kontrolnej powinno się obchodzić w sposób identyczny jak z podmiotami grupy badanej. W przypadku stosowania podłoża w celu ułatwienia dawkowania, u zwierząt kontrolnych otrzymujących podłoże należy stosować samo to podłoże w taki sam sposób, jak w grupach otrzymujących substancję badaną, w takiej samej dawce, jak stosowana w grupie otrzymującej najwyższą dawkę. Najwyższa dawka powinna być tak dobrana, aby wywierała działanie toksyczne, jednak nie prowadziła do zgonów lub prowadziła do jedynie niewielu zgonów. Najniższa dawka nie powinna dawać żadnych objawów toksyczności. W przypadku gdy istnieje możliwa do wykorzystania, oszacowana wielkość ekspozycji u ludzi, najniższy poziom dawkowania powinien ją przewyższać. W idealnej sytuacji pośredni poziom dawkowania powinien prowadzić do uzyskania minimalnych dostrzegalnych efektów toksycznych. W przypadku gdy zostanie wykorzystana więcej niż jedna dawka pośrednia, wielkości dawek powinny być tak rozstawione, aby uzyskać stopniowanie działań toksycznych. W grupach otrzymujących niskie i pośrednie dawki oraz w grupach kontrolnych częstość występowania zgonów powinna być niska, aby umożliwić znaczącą ocenę wyników.
W przypadku gdy zastosowanie substancji badanej wiąże się z ciężkim działaniem drażniącym na skórę, stężenia należy zmniejszyć, przy czym może to spowodować zmniejszenie pojawiania się lub brak innych skutków toksycznych przy najwyższym poziomie dawkowania. Ponadto w przypadku znacznego uszkodzenia skóry może być konieczne przerwanie badania i podjęcie nowego eksperymentu z zastosowaniem niższych stężeń.
1.6.2.4. Czas ekspozycji
W przypadku gdy w badaniu wstępnym z zastosowaniem dawki 1.000 mg/kg lub wyższej, odpowiadającej potencjalnej ekspozycji u ludzi, o ile taki poziom jest znany, nie zostaną stwierdzone żadne efekty toksyczne, można uznać, że dalsze badania nie są potrzebne.
1.6.2.5. Okres obserwacji
Zwierzęta doświadczalne należy obserwować codziennie pod kątem występowania objawów toksyczności. Należy zapisać czas zgonu zwierzęcia i czas pojawienia się i ustąpienia objawów toksyczności.
1.6.3. Procedura
Zwierzęta powinny być trzymane w oddzielnych klatkach. W idealnej sytuacji podaje się im substancję badaną przez siedem dni w tygodniu przez okres 28 dni. Zwierzęta w grupach satelickich, w których planuje się późniejszą obserwację, powinny zostać przetrzymane przez następnych 14 dni bez podawania im substancji w celu stwierdzenia ustępowania lub utrzymywania się działań toksycznych. Czas ekspozycji powinien wynosić co najmniej sześć godzin na dobę.
Substancja badana powinna zostać nałożona w sposób równomierny na obszar równy około 10 % całkowitej powierzchni ciała. W przypadku substancji wysoce toksycznych można je nanieść na mniejszą powierzchnię, jednak należy dążyć do tego, aby pokryć jak największy obszar jak najcieńszą i jak najbardziej równomierną warstwą badanego związku.
W trakcie ekspozycji substancja badana jest utrzymywana w kontakcie ze skórą dzięki zastosowaniu porowatego opatrunku z gazy i niedrażniącej taśmy. Miejsce badania należy dodatkowo przykryć w taki sposób, aby utrzymać opatrunek z gazy i substancję badaną i zapewnić, aby zwierzęta nie mogły zjeść tej ostatniej. W celu zapobieżenia spożyciu substancji badanej można uwiązać zwierzę, jednak pełna immobilizacja nie jest zalecaną metodą. Jako alternatywę można zastosować "kołnierzowy przyrząd zabezpieczający".
Pod koniec okresu ekspozycji należy usunąć resztki badanej substancji, w miarę możliwości stosując wodę lub jakieś inne, właściwe metody oczyszczania skóry.
Wszystkie zwierzęta należy obserwować codziennie i odnotowywać występujące u nich objawy toksyczności, włącznie z czasem ich pojawienia się, stopniem ich ciężkości i czasem trwania. Obserwacje przy klatce zwierzęcia powinny obejmować zmiany skóry i sierści, oczu i błon śluzowych oraz zmiany układu oddechowego, krążenia, autonomicznego i ośrodkowego układu nerwowego, jak też wzorców aktywności somatomotorycznej i wzorca zachowania. Co tydzień należy ważyć zwierzęta. Zaleca się także przeprowadzanie cotygodniowych pomiarów wielkości spożycia karmy. Regularna obserwacja zwierząt jest niezbędna do tego, aby w możliwym zakresie nie stracić zwierząt badanych z takich przyczyn, jak kanibalizm, autoliza tkanek lub przemieszczenie. Pod koniec okresu badania wszystkie osobniki, które przeżyły w grupach innych niż satelicka, poddaje się sekcji zwłok. Zwierzęta konające oraz zwierzęta przejawiające ostre cierpienie i ból powinny być usuwane, gdy zostanie to zauważone, humanitarnie zabite i poddane sekcji zwłok.
Następujące badania należy wykonać pod koniec okresu badania u wszystkich zwierząt, włącznie z osobnikami w grupie kontrolnej:
1) badania hematologiczne, w tym co najmniej hematokryt, stężenie hemoglobiny, liczba erytrocytów, liczba leukocytów z rozmazem i oznaczenie parametrów krzepnięcia;
2) laboratoryjne badania biochemiczne krwi zawierające co najmniej jeden parametr funkcji wątroby i nerek: aktywność aminotransferazy alaninowej (uprzednio nazywanej transferazą glutaminianowo-piro-gronową) w surowicy, aktywność aminotransferazy asparaginianowej (uprzednio nazywanej transferazą glutaminianowo-szczawiooctową) w surowicy, stężenie azotu mocznikowego, albumin, kreatyniny we krwi, całkowite stężenie bilirubiny i całkowite stężenie białka w surowicy.
Do innych oznaczeń, które mogą okazać się niezbędne do odpowiedniej oceny toksykologicznej, należą oznaczenia stężenia wapnia, fosforu, chlorków, sodu, potasu, glukozy na czczo, lipidogram, stężenia hormonów i oznaczenia równowagi kwasowo-zasadowej, stężenia methemoglobiny oraz aktywności cholinesterazy.
W razie potrzeby można zastosować dodatkowe oznaczenia biochemiczne, aby rozszerzyć badania zaobserwowanych działań toksycznych.
1.6.4. Pełne badanie patomorfologiczne
Wszystkie zwierzęta objęte badaniem powinny zostać poddane pełnemu makroskopowemu badaniu patomorfologicznemu. Należy zważyć wątrobę, nerki, nadnercza i jądra w stanie wilgotnym, najszybciej, jak to będzie możliwe po rozcięciu zwłok, aby uniknąć wysuszenia. Narządy i tkanki, tj. prawidłową i poddawaną ekspozycji na substancję skórę, wątrobę, nerki i narządy docelowe (czyli narządy wykazujące makroskopowe zmiany patologiczne lub o nieprawidłowych wymiarach) należy zakonserwować w odpowiednim środku w celu przeprowadzenia ewentualnych, przyszłych badań histopatologicznych.
1.6.5. Badania histopatologiczne
W grupie otrzymującej najwyższą dawkę i w grupie kontrolnej należy wykonać badanie histologiczne zakonserwowanych narządów i tkanek. We wszystkich grupach otrzymujących niższe dawki należy przeprowadzić badanie tych narządów i tkanek, w których stwierdzono zmiany przypisywane badanej substancji przy zastosowaniu najwyższych dawek. Należy również przeprowadzić badanie histologiczne zwierząt w grupie satelickiej, ze szczególnym naciskiem na te narządy i tkanki, w których stwierdzono skutki podania substancji w innych badanych grupach.
2. DANE
Dane należy przedstawić w skrócie w formie tabelarycznej, z podaniem - dla każdej badanej grupy - liczby zwierząt na początku badania oraz liczby zwierząt z każdym rodzajem zmiany patologicznej.
Wszystkie zaobserwowane zmiany należy ocenić przy pomocy właściwej metody statystycznej. Można zastosować dowolną, uznaną metodę statystyczną.
3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badań zawiera w miarę możliwości następujące informacje:
- dane zwierząt (gatunek, szczep, źródło, warunki środowiska, dieta itp.),
- warunki badania (włączając typ opatrunku: okluzyjny lub nieokluzyjny),
- wielkości dawek (włączając podłoże, o ile jest wykorzystane) i stężenia,
- poziom niewywierający działania, o ile to możliwe,
- dane reakcji toksycznej w rozbiciu na płci i dawki,
- czas zgonu w trakcie badania lub fakt, że zwierzęta przeżyły do jego zakończenia,
- działania toksyczne lub inne,
- czas zaobserwowania każdego nieprawidłowego objawu i późniejszy przebieg zmian,
- dane na temat karmy i masy ciała,
- zastosowane badania hematologiczne i ich wyniki,
- zastosowane laboratoryjne badania biochemiczne i ich wyniki,
- wyniki sekcji zwłok,
- szczegółowy opis wszystkich wyników histopatologicznych,
- gdzie to możliwe, statystyczna obróbka wyników,
- omówienie wyników,
- interpretacja wyników.
3.2. OCENA I INTERPRETACJA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. D).
4. LITERATURA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B lit. E).
B10. MUTAGENNOŚĆ - BADANIE ABERRACJI CHROMOSOMOWEJ SSAKÓW IN VITRO
1. METODA
Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 473, metody badania aberracji chromosomowej ssaków invitro (1997).
1.1. WPROWADZENIE
Celem badania chromosomowej aberracji u ssaków jest zidentyfikowanie czynników, które powodują strukturalne chromosomowe aberracje w hodowanych komórkach ssaków (1)(2)(3). Strukturalne aberracje mogą występować w dwóch typach, chromosomowym lub chromatydowym. W przypadku mutagenów chemicznych większość wywołanych aberracji jest typu chromatydowego, ale mogą się pojawiać aberracje typu chromosomowego. Wzrost poliploidalności może wskazywać, że substancja chemiczna ma potencjał do wywoływania aberracji liczbowej. Jednakże metoda ta nie jest wykorzystywana do pomiarów aberracji liczbowych i nie jest rutynowo wykorzystywana do tego celu. Mutacje chromosomowe oraz powiązane z nimi zdarzenia są przyczyną wielu chorób genetycznych u ludzi oraz istnieje dowód na to, że mutacje chromosomowe oraz związane z nimi zdarzenia powodujące zmiany w onkogenach oraz genach hamowania nowotworów komórek somatycznych są odpowiedzialne za wywoływanie raka u ludzi oraz zwierząt doświadczalnych.
Aberracja chromosomowa in vitro może wykorzystywać ustanowione linie komórkowe, łańcuchy komórkowe lub pierwotne hodowle komórek. Wykorzystane komórki są wybierane na podstawie możliwości wzrostu hodowli, stabilności kariotypu, liczby chromosomów, zróżnicowania chromosomów oraz spontanicznych częstotliwości aberracji.
Badania przeprowadzane in vitro wymagają wykorzystania źródła egzogennego aktywacji metabolicznej. Ten system aktywacji metabolicznej nie może imitować w całości warunków in vivo w odniesieniu do ssaków. Powinna zostać zachowana ostrożność w celu uniknięcia warunków, które mogłyby prowadzić do pozytywnych wyników, które nie odzwierciedlają wewnętrznej mutagenności oraz mogą wynikać ze zmian w pH, stężeniu osmolalnym lub wysokich poziomów cytotoksyczności (4)(5).
Badanie to jest wykorzystywane w celu sprawdzenia możliwych czynników mutagennych oraz rakotwórczych dla ssaków. Wiele związków, które mają charakter dodatni w tym badaniu, są czynnikami rakotwórczymi dla ssaków, jednakże nie istnieje idealne powiązanie między tym badaniem a rakotwórczością. Powiązanie zależne jest od klasy chemicznej oraz jest coraz więcej dowodów na to, że istnieją czynniki rakotwórcze, które nie są wykrywane w drodze tego badania, ponieważ wydaje się, iż działają one poprzez mechanizmy inne niż bezpośrednie niszczenie DNA.
Zob. również Ogólne wprowadzenie do części B.
1.2. DEFINICJE
Aberracja typu chromatydowego: strukturalne uszkodzenie chromosomu, wyrażone jako pękanie pojedynczych chromatydów lub pękanie oraz ponowne łączenie między chromatydami.
Aberracja typu chromosomowego: strukturalne uszkodzenie chromosomu, wyrażone jako pękanie pojedynczych chromatydów lub pękanie oraz ponowne łączenie obu chromatydów w identycznej lokalizacji.
Endoreduplikacja: proces, w którym po okresie replikacji DNA jądro nie ulega mitozie, ale rozpoczyna nowy okres S. Wynikiem są chromosomy o 4, 8, 16, ... chromatydach.
Szczelina: achromatyczne uszkodzenie mniejsze niż szerokość chromatydu, powodujące minimalne wypaczenie chromatydu.
Indeks mitotyczny: stosunek komórek w metafazie podzielony przez całkowitą liczba komórek zaobserwowany w populacji komórek; wskazanie stopnia proliferacji tej populacji.
Aberracja liczbowa: zmiana w ilości chromosomów w odniesieniu do normalnej ilości charakterystycznej dla wykorzystywanych komórek.
Poliploidalność wielokrotność ilości chromosomów haploidalnych (n) inna niż liczba diploidalna (np. 3n, 4n itd.).
Aberracja strukturalna: zmiana w strukturze chromosomu, wykrywalna przez badanie mikroskopowe etapu metafazy podziału komórek, zaobserwowana jako usunięcia oraz fragmenty, zmiany (zachodzące - wewnątrz oraz między chromosomami).
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Hodowle komórek są poddane działaniu substancji badanej zarówno z aktywacją, jak i bez aktywacji metabolicznej. Substancje są poddawane działaniu metafazy zatrzymującej (np. Colcemid® lub kolchicyna) substancje we wcześniej określonych odstępach czasu po poddaniu hodowli komórek działaniu substancji badanej, komórki pobrane, zabarwione oraz komórki metafazy są analizowane mikroskopowo na obecność aberracji chromosomowych.
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.4.1. Preparaty
1.4.1.1. Komórki
Wykorzystywane mogą być rozmaite linie komórkowe, łańcuchy lub pierwotne hodowle komórek łącznie z komórkami ludzkimi (np. fibroblasty chomika chińskiego, limfocyty krwi obwodowej ludzi lub ssaków).
1.4.1.2. Warunki dotyczące podłoża hodowli i hodowli
W utrzymywaniu hodowli powinny być stosowane odpowiednie warunki podłoża hodowli oraz inkubacji (naczynia do hodowli, stężenie CO2, temperatura oraz wilgotność). Ustanowione linie komórkowe oraz szczepy powinny być rutynowo sprawdzane pod kątem stabilności zmiennej ilości chromosomów oraz nieobecności zanieczyszczenia mykoplazmą oraz nie powinny być wykorzystywane, jeżeli są zanieczyszczone. Normalny czas cyklów komórkowych oraz wykorzystywane warunki dotyczące hodowli powinny być znane.
1.4.1.3. Preparaty hodowli
Ustanowione linie komórkowe oraz łańcuchy: komórki są rozmnażane z hodowli podstawowej, siane na podłożu hodowli w takiej gęstości, że hodowle nie osiągną zrastania się przed czasem pobierania, oraz są inkubowane w temperaturze 37 oC.
Limfocyty: krew pełna jest poddawana działaniu antykoagulantu (np. heparyny) lub oddzielone limfocyty uzyskane ze zdrowych przedmiotów są dodawane do podłoża hodowli zawierającego mitogen (np. phytohaemagglutinin) oraz inkubowane w temperaturze 37 oC.
1.4.1.4. Aktywacja metaboliczna
Komórki powinny zostać poddane działaniu substancji badanej zarówno w obecności, jak i w nieobecności odpowiedniego systemu aktywacji metabolicznej. Najpowszechniej wykorzystywanym systemem jest frakcja przesączu znad mitochondriów uzupełniona o kofaktor, przygotowana z wątroby gryzoni poddanej działaniu substancji, czynnikami pobudzającymi enzymy, takimi jak Aroklor 1254 (6)(7)(8)(9) lub mieszanina fanobarbitonu oraz β-naftoflawonu (10)(11)(12).
Frakcja przesączu znad mitochondriów jest zazwyczaj wykorzystywana w stężeniach w zakresie 1-10 % objętościowo w końcowym nośniku badania. Warunki systemu aktywacji metabolicznej mogą być uzależnione od klasy badanej substancji chemicznej. W niektórych przypadkach właściwe może być wykorzystanie więcej niż jednego stężenia frakcji przesączu znad mitochondriów.
Pewna liczba ulepszeń, w tym konstrukcja genetycznie modyfikowanych linii komórkowych wyrażających szczególne enzymy aktywujące, mogą zapewnić możliwość aktywacji endogenicznej. Wybór wykorzystanych linii komórkowych powinien być uzasadniony naukowo (np. przez znaczenie izoenzymu cytochromowego P450 dla metabolizmu substancji).
1.4.1.5. Substancja badana/przygotowanie
Stała substancja badana powinna zostać rozpuszczona lub zawieszona w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach oraz rozcieńczona, jeżeli jest to odpowiednie, przed poddaniem jej działaniu komórek. Płynne substancje badane mogą być dodawane bezpośrednio do systemu badawczego i/lub rozcieńczane przed poddaniem ich działaniu komórek. Powinny zostać wykorzystane świeżo przygotowywane substancje, chyba że dane dotyczące stabilności wskazują, iż dopuszczalne jest składowanie substancji.
1.4.2. Warunki badania
1.4.2.1. Rozpuszczalnik/nośnik
Rozpuszczalnik/nośnik nie powinien mieć możliwości reagowania chemicznego z substancją badaną oraz powinien być zgodny z przeżywaniem komórek oraz aktywnością S9. Jeśli inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/nośniki są wykorzystywane, ich włączenie do badania powinno być wsparte danymi wskazującymi ich zgodność. Zaleca się, o ile to możliwe, aby w pierwszej kolejności rozważone zostało wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/nośników. Badając substancje nietrwałe w wodzie, wykorzystane rozpuszczalniki organiczne powinny być wolne od wody. Woda może zostać usunięta przez zastosowanie sita molekularnego.
1.4.2.2. Stężenia poddania działaniu substancji
Wśród kryteriów, które mają zostać uwzględnione przy określaniu najwyższego stężenia, znajduje się cytotoksyczność, rozpuszczalność w systemie oraz zmiany pH lub osmolalność.
Cytotoksyczność powinna zostać określona z aktywacją lub bez aktywacji metabolicznej w ramach głównego doświadczenia, przy wykorzystaniu odpowiedniego wskazania dotyczącego integralności komórki oraz wzrostu, takiego, jak stopień zrastania się, liczba komórek zdolnych do życia lub indeksy mitotyczne. Może to być użyteczne do oznaczenia cytotoksyczności oraz rozpuszczalności w doświadczeniu wstępnym.
Powinny zostać wykorzystane co najmniej trzy nadające się do analizy stężenia. W przypadku gdy pojawia się cytotoksyczność, stężenia te powinny obejmować zakres od najwyższej do małej toksyczności lub jej braku; będzie to zazwyczaj oznaczać, że stężenia powinny zostać rozdzielone przez nie więcej niż jeden czynnik między 2 a √ 10. W czasie pobierania wyhodowanych komórek najwyższe stężenia powinny wskazywać znaczące zmniejszenie w stopniu zrastania się, liczbie komórek lub indeksie mitotycznym (wszystkie wyższe niż 50 %). Indeks mitotyczny jest jedynie bezpośrednią miarą skutków cytotoksycznych/cytostatycznych oraz jest zależny od czasu po poddaniu działaniu substancji. Jednakże indeks mitotyczny jest dopuszczalny w odniesieniu do hodowli zawiesinowych, w których inne pomiary toksyczności mogą być niewygodne i niepraktyczne. Informacje w sprawie kinetyki komórek, takie jak średnie czasy tworzenia się (AGT), mogą być wykorzystywane jako informacje dodatkowe. Jednakże AGT jest ogólną średnią, która nie zawsze ujawnia istnienie opóźnionych podpopulacji, a nawet delikatne wzrosty średnich czasów tworzenia się mogą być związane z bardzo zasadniczym opóźnieniem w czasie optymalnych wydajności aberracji.
W odniesieniu do substancji względnie niecytotoksycznych maksymalne stężenie badawcze powinno wykosić 5 μl/ml, 5 mg/ml lub 0,01 M, w zależności od tego, które z nich jest najniższe.
W odniesieniu do substancji względnie nierozpuszczalnych, które nie są toksyczne w stężeniach niższych niż stężenia nierozpuszczalne, najwyższa wykorzystana dawka powinna być stężeniem powyżej limitu rozpuszczalności w końcowym podłożu hodowli na koniec okresu poddawania działaniu substancji. W niektórych przypadkach (np. kiedy toksyczność pojawia się wyłącznie przy wyższym niż najniższe stężeniu nierozpuszczalnym) słuszne jest przeprowadzenie badania na jednym większym stężeniu z widocznym strącaniem się. Użyteczna może być ocena rozpuszczalności na początku oraz na końcu poddawania działaniu substancji, ze względu na to, że rozpuszczalność może zmieniać się w trakcie trwania poddania działaniu substancji w systemie badawczym spowodowana obecnością komórek, surowicy S9 itp. Nierozpuszczalność może zostać wykryta okiem nieuzbrojonym. Stężanie nie powinno zakłócać oceny.
1.4.2.3. Kontrole pozytywne i negatywne
Równoległe kontrole pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik lub nośnik), zarówno z aktywacją metaboliczną, jak i bez niej, powinny zostać objęte każdym doświadczeniem. Kiedy wykorzystywana jest aktywacja metaboliczna, pozytywna kontrolna substancja chemiczna jest substancją, która wymaga aktywacji w celu wywołania reakcji mutagennej.
Pozytywne kontrole powinny wykorzystywać znany elastogen przy poziomie poddania działaniu substancji, od którego oczekuje się wytworzenia odtwarzalnego oraz wykrywalnego wzrostu poza tło, które wskazuje czułość systemu.
Stężenia pozytywnych kontroli powinny zostać wybrane tak, aby były jasne, ale by badającemu nie ujawniały bezpośrednio tożsamości zakodowanych szkiełek laboratoryjnych. Przykłady pozytywnych substancji kontrolnych obejmują:
| Warunki aktywacji metabolicznej | Substancja | Nr CAS | Nr Einecs |
| Nieobecność egzogenicznej aktywacji metabolicznej | Metanosulfonat metylu | 66-27-3 | 200-625-0 |
| Metanosulfonat etylu | 62-50-0 | 200-536-7 | |
| Nitrozomocznik etylu | 759-73-9 | 212-072-2 | |
| Mitomycyna C | 50-07-7 | 200-008-6 | |
| N-tlenek-4-nitrokwinolinu | 56-57-5 | 200-281-1 | |
| Obecność egzogenicznej aktywacji metabolicznej | Benzo[a]piren | 50-32-8 | 200-028-5 |
| Cyklofosfamid Cyklofosfamid monohydrat | 50-18-0 6055-19-2 | 200-015-4 |
Mogą być wykorzystane inne właściwe substancje kontroli pozytywnych. Wykorzystanie substancji chemicznej z klasy powiązanej z kontrolą pozytywną powinno zostać rozważone, jeżeli jest dostępne.
Kontrole negatywne, składające się z rozpuszczalników lub samego nośnika w podłożu poddania działaniu substancji, oraz poddanie działaniu substancji w ten sam sposób co hodowle poddane działaniu substancji, powinny zostać włączone w ramy każdego okresu pobierania hodowli. Dodatkowo wykorzystywane powinny być kontrole, w ramach których nie poddaje się działaniu substancji, chyba że istnieją dane historyczne dotyczące kontroli wskazujące na to, że inne skutki szkodliwe lub mutagenne są wywołane wybranym rozpuszczalnikiem.
1.4.3. Procedura
1.4.3.1. Poddanie działaniu substancji badanej
Komórki rozmnażające się wegetatywnie są poddawane działaniu, wykorzystując substancję badaną w obecności oraz nieobecności systemu aktywacji metabolicznej. Przetwarzanie limfocytów powinno następować w około 48 godzin po stymulacji mitogenicznej.
1.4.3.2. Hodowle reprodukcyjne powinny normalnie być wykorzystywane przy każdym stężeniu oraz są one silnie zalecane w odniesieniu do negatywnych/rozpuszczalnikowych hodowli kontrolnych. W przypadku gdy na podstawie danych historycznych mogą zostać przedstawione minimalne zmiany między hodowlami reprodukcyjnymi (13)(14), dopuszczalne może być, aby pojedyncze hodowle miały być wykorzystywane przy każdym badaniu.
Substancje gazowe lub lotne powinny być badane odpowiednia metodą, taką jak badanie w szczelnie zamkniętych naczyniach do hodowli (15)(16).
1.4.3.3. Czas pobierania hodowli
W pierwszym doświadczeniu komórka powinna być poddana działaniu substancji badanej, zarówno z aktywacja metaboliczną, jak i bez niej, przez 3-6 godzin oraz próbki powinny zostać pobrane w czasie równoważnym długości około 1,5 cyklu komórkowego po rozpoczęciu poddawania działaniu substancji (12). Jeżeli ten protokół daje negatywne wyniki, zarówno z aktywacją, jak i bez niej, powinno zostać przeprowadzone dodatkowe doświadczenie, z ciągłym poddawaniem działaniu substancji badanej do momentu pobrania próbek w czasie równoważnym długości 1,5 cyklu komórkowego. Niektóre substancje chemiczne mogą być wykryte z mniejszym trudem przez czasy poddawania działaniu substancji badanej/ pobierania próbek dłuższe niż długości 1,5 cyklu. Wyniki negatywne z metaboliczną aktywacją muszą zostać ustalone na zasadzie jednostkowych przypadków. W tych przypadkach, gdy potwierdzenie negatywnych wyników nie jest uznawane za niezbędne, powinno zostać zapewnione uzasadnienie.
1.4.3.4. Preparaty chromosomów
Hodowle komórek są poddawane działaniu Colcemidu® lub kolchicyny zazwyczaj przez 1-3 godzin przed pobraniem hodowli. Każda hodowla komórek jest pobierana oraz poddawana działaniu substancji oddzielnie w celu przygotowania chromosomów. Przygotowanie chromosomów obejmuje hipotoniczne przetwarzanie komórek, wiązanie oraz barwienie.
1.4.3.5. Analiza
Wszystkie szkiełka mikroskopowe, włącznie z tymi dotyczącymi pozytywnych oraz negatywnych kontroli, powinny zostać odpowiednio zakodowane przed analizą mikroskopową. Ze względu na to, że procedury wiązania, utrwalania barwnika często skutkują przerwaniem stosunku komórek metafazy do straty chromosomów, oceniane komórki powinny z tego względu zawierać liczbę centromerów równą zmiennej liczbie ± 2 dla wszystkich rodzajów komórek. Powinno zostać ocenione przynajmniej 200 dobrze rozciągniętych metafaz na stężenie oraz kontrole, równo podzielonych między wtórniki, jeżeli ma to zastosowanie. Liczba ta może zostać zredukowana, jeśli zaobserwowana jest wysoka liczba aberracji.
Chociaż celem badania jest wykrycie strukturalnych aberracji chromosomowych, ważne jest odnotowanie poliploidalności oraz endoreduplikacji, jeśli zaobserwowane są te zdarzenia.
2. DANE
2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW
Jednostką doświadczalną jest komórka, a z tego względu udział procentowy komórek ze strukturalną aberracją chromosomową powinien zostać poddany ocenie. Różne typy strukturalnej aberracji chromosomowej powinny zostać wymienione wraz z ich ilościami oraz częstotliwościami w odniesieniu do hodowli doświadczalnych oraz kontrolnych. Szczeliny są oddzielnie odnotowywane oraz zgłaszane, ale ogólnie nie są włączane do częstotliwości aberracji ogółem.
Równoległe pomiary cytotoksyczności w odniesieniu do wszystkich przetwarzanych oraz negatywnych hodowli kontrolnych w ramach głównych doświadczeń aberracji powinny również zostać odnotowane.
Powinny zostać dostarczone dane dotyczące poszczególnych hodowli. Dodatkowo wszelkie dane powinny zostać podsumowane w formie tabelarycznej.
Nie istnieje wymóg jasnej reakcji pozytywnej w odniesieniu do weryfikacji. Niejednoznaczne wyniki powinny zostać wyjaśnione w drodze dalszych badań, w szczególności z wykorzystaniem modyfikacji warunków doświadczalnych. Potrzeba potwierdzenia wyników negatywnych została omówiona w ppkt 1.4.3.3. Modyfikacje parametrów badawczych w celu poszerzenia zakresu ocenionych warunków powinna zostać rozważona w dalszych doświadczeniach. Parametry badawcze, które mogą być zmodyfikowane, obejmują zakres stężenia oraz warunki aktywacji metabolicznej.
2.2. OCENA ORAZ INTERPRETACJA WYNIKÓW
Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak związany ze stężeniem wzrost odtwarzalności w pewnej ilości komórek z aberracjami chromosomowymi. Biologiczne znaczenie wyników powinno zostać wzięte pod uwagę w pierwszej kolejności. Metody statystyczne mogą zostać wykorzystane jako metody pomocnicze w przeprowadzaniu oceny wyników (3)(13). Znaczenie statystyczne nie powinno być jedynym czynnikiem określającym w odniesieniu do reakcji pozytywnej.
Wzrost ilości komórek poliploidalnych może wskazywać, że substancja badana ma potencjał do wstrzymywania procesów mitotycznych oraz pobudzania liczbowych aberracji chromosomowych. Wzrost liczby komórek z endoreduplikowanymi chromosomami może wskazywać, że substancje badane mają potencjał wstrzymywania postępowania cyklu komórkowego (17)(18).
Substancja badana, w odniesieniu do której wyniki nie spełniają powyższych kryteriów, uważana jest za niemutagenną w tym systemie.
Chociaż większość doświadczeń będzie dawało w jasny sposób pozytywne lub negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw danych będzie uniemożliwiał dokonanie ostatecznej oceny dotyczącej aktywności substancji badanej. Wyniki mogą pozostać niejednoznaczne lub sporne, niezależnie od tego, ile razy doświadczenia były powtarzane.
Wyniki pozytywne z badania chromosomowej aberracji in vitro wskazują, że substancja badana wywołuje aberracje. Wyniki negatywne wskazują, że w warunkach badawczych substancja badana nie wywołuje aberracji chromosomowej hodowanych komórek somatycznych ssaków.
3. SPRAWOZDAWCZOŚĆ
SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
Rozpuszczalnik/nośnik:
- uzasadnienie wyboru nośnika,
- rozpuszczalność oraz stabilność substancji w rozpuszczalniku/nośniku, jeżeli jest znana. Komórki:
- rodzaj i źródło komórek,
- cechy kariotyczne oraz odpowiedniość wykorzystanych komórek,
- nieobecność mykoplazmy jeżeli ma zastosowanie,
- informacja w sprawie długości cyklu komórkowego,
- płeć dawcy krwi, krew całkowita lub oddzielone limfocyty, wykorzystany mitogen,
- liczba przejść, jeżeli ma zastosowanie,
- metoda utrzymania hodowli komórek, jeżeli ma zastosowanie,
- zmienna liczba chromosomów. Warunki badania:
- tożsamość metafazy zatrzymującej substancję, jej stężenie oraz czas trwania poddania działania substancji,
- racjonalne uzasadnienie wyboru stężeń oraz liczby hodowli, w tym np. dane dotyczące cytotoksyczności oraz ograniczeń rozpuszczalności, jeżeli są dostępne,
- skład podłoża, stężenie CO2, jeżeli ma zastosowanie,
- stężenie substancji badanej,
- objętość nośnika oraz dodanej substancji badanej,
- temperatura inkubacji,
- czas inkubacji,
- czas trwania poddania działaniu substancji,
- gęstość komórki w czasie osadzania, jeżeli właściwe,
- typ oraz skład systemu aktywacji metabolicznej włącznie z kryteriami dopuszczalności,
- kontrole pozytywne i negatywne,
- metody przygotowania szkiełek mikroskopowych,
- kryteria w odniesieniu do oceniającej aberracji,
- liczba przeanalizowanych metafaz,
- metody pomiarów toksyczności,
- kryteria uznawania badań za pozytywne, negatywne lub niejednoznaczne, Wyniki:
- oznaki toksyczności, np. stopień zrastania się strumieni, dane dotyczące cyklu komórkowego, obliczenia liczby komórek, indeks mitotyczny,
- oznaki strącania,
- dane dotyczące pH oraz osmolalności podłoża poddania działaniu substancji, jeżeli są określone,
- definicje aberracji, w tym szczelin,
- liczba komórek z aberracjami chromosomowymi oraz typ aberracji chromosomowej podane osobno w odniesieniu do każdej poddanej działaniu substancji badanej oraz kontrolnej hodowli,
- zmiany poliploidalności, jeżeli są znane,
- relacja miedzy dawką a reakcją, w miarę możliwości,
- analizy statystyczne, jeżeli istnieją,
- dane dotyczące równoległych negatywnych (rozpuszczalnik/nośnik) oraz pozytywnych kontroli,
- historyczne dane dotyczące negatywnych (rozpuszczalnik/nośnik) oraz pozytywnych kontroli, ze średnimi oraz standardowymi odchyleniami.
Omówienie wyników.
Wnioski.
4. ODNIESIENIA
(1) Evans, H. J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, w: Chemical mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum Press, New York and London, pp. 1-29.
(2) Ishidate, M. Jr. and Sofumi, T. (19 8 5), The In vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, in: Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby J. et al., (eds) Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York-Oxford, pp. 427-432.
(3) Galloway S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C, Colman, S., Brown, B., Cannon, C, Bloom, A. D., Naka-mura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G. H., Resnick, M. A., Anderson, G. and Zeiger E. (1978), Chromosome aberration and sister chromatic exchanges in Chinese hamster ovary cellS: Evaluation of 108 chemicals, Environs, Molec. Mutagen 10 (suppl.10), pp. 1-175.
(4) Scott, D., Galloway, S. M., Marshall, R. R, Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B. C. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, pp. 147-204.
(5) Morita, T, Nagaki, T, Fukuda, I. and Okumura, K., (1992), Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Res., 268, pp. 297-305.
(6) Ames, B. N., McCann, J. and Yamasaki, E. (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Res., 31, pp. 347-364.
(7) Maron, D. M. and Ames, B. N. (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Res., 113, pp. 173-215.
(1) (8) Natarajan, A. T, Tates, A. D., van Buul, P. P. W., Meijers, M. and de Vogel, N. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagen/Carcinogens after Activation in a Mircrosomal System In vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dime-thylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Res., 37, pp. 83-90.
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr. (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In vitro, Mutation Res., 66, pp. 277-290.
(10) Elliot, B. M., Combes, R. D., Elcombe, C. R, Gatehouse, D. G., Gibson, G. G., Mackay, J. M. and Wolf, R C. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternative to Aroclor 1254-induced S9 in In vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 175-177.
(11) Matsushima, T, Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T (1976), A. Safe Substitute for Polychlori-nated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in: de Serres, F. J. Fouts, J. R. Bend, J. R. and Philpot, R M. (eds), In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
(12) Galloway, S. M., Aardema, M. J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J. L., Kirkland, D. J. Morita, T., Mosesso, P, Sofumi, T (1994), Report from Working Group on in In vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Res., 312, pp. 241-261.
(13) Richardson, C, Williams, D. A., Allen, J. A., Amphlett, G., Chanter, D. O. and Phillips, B. (1989), Analysis of Data from In vitro Cytogenetic Assays, w: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J., (cd) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.
(14) Soper, K. A. and Galloway, S. M. (1994), Replicate Flasks are not Necessary for In vitro Chromosome Aberration Assays in CHO Cells, Mutation Res., 312, pp. 139-149.
(15) Krahn, D. F., Barsky F. C. and McCooey K. T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay Evaluation of Gases and Volatile Liquids, in: Tice, R. R, Costa, D. L., Schaich, K. M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents, New York, Plenum, pp. 91-103.
(16) Zamora, P. O., Benson, J. M., Li, A. P. and Brooks, A. L. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental Mutagenesis, 5, pp. 795-801.
(17) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413.
(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.
B11. MUTAGENNOŚĆ - BADANIE ABERRACJI CHROMOSOMOWEJ SZPIKU KOSTNEGO IN VIVO
1. METODA
Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 475, metody badania aberracji chromosomowej szpiku kostnego (1997).
1.1. WPROWADZENIE
Badanie aberracji chromosomowej ssaków in vivo jest wykorzystywane w celu wykrycia strukturalnych aberracji chromosomowych komórek szpiku kostnego zwierząt, zwykle gryzoni, wywołanych przez substancje badane (1)(2)(3)(4). Strukturalne aberracje mogą występować w dwóch typach, chromosomowym lub chromatydowym. Wzrost poliploidalności może wskazywać, że substancja chemiczna ma potencjał do wywoływania aberracji liczbowej. W przypadku mutagenów chemicznych większość wywołanych aberracji jest typu chromatydowego, ale mogą pojawiać się również aberracje typu chromosomowego. Mutacje chromosomowe oraz powiązane z nimi zdarzenia są przyczyną wielu ludzkich chorób genetycznych oraz istnieje dowód na to, że mutacje chromosomowe oraz związane z nimi zdarzenia powodujące zmiany w onkogenach oraz genach hamowania nowotworów komórek somatycznych są odpowiedzialne za wywoływanie raka u ludzi oraz zwierząt doświadczalnych.
Rutynowo w badaniach tych wykorzystuje się gryzonie. Docelową komórką w tym badaniu jest szpik kostny, ze względu na to, że jest on wysoce unaczynioną tkanką oraz zawiera populacje komórek o szybkich cyklach, które mogą być bez trudu wyizolowane oraz poddane działaniu substancji. Inne gatunki oraz tkanki docelowe nie są przedmiotem wykorzystania tej metody.
To badanie chromosomowej aberracji ma szczególne znaczenie w odniesieniu do oceny zagrożenia mutagennego, w związku z czym pozwala ono na wykorzystanie stężenia czynników metabolizmu in vivo, farmakokinetyków oraz procesów naprawy DNA, chociaż mogą one różnić się od siebie w zależności od gatunku oraz tkanek. Badanie in vivo jest również użyteczne w odniesieniu do dalszych badań wyników mutagennych wykrytych w badaniu in vitro.
Jeżeli istnieje dowód na to, że substancja badana lub metabolit reakcyjny nie dotrze do tkanki docelowej, niewłaściwe jest wykorzystanie tej metody.
Zob. również Ogólne wprowadzenie do części B.
1.2. DEFINICJE
Aberracja typu chromatydowego: strukturalne uszkodzenie chromosomu, wyrażone jako pękanie pojedynczych chromatydów lub pękanie oraz ponowne łączenie między chromatydami.
Aberracja typu chromosomowego: strukturalne uszkodzenie chromosomu, wyrażone jako pękanie pojedynczych chromatydów lub pękanie oraz ponowne łączenie obu chromatydów w identycznej lokalizacji.
Endoreduplikacja: proces, w którym po okresie replikacji DNA jądro nie ulega mitozie, ale rozpoczyna nowy okres S. Wynikiem są chromosomy o 4, 8, 16, ... chromatydach.
Szczelina: achromatyczne uszkodzenie mniejsze niż szerokość chromatydu, powodująca minimalne wypaczeniu chromatydu(-ów).
Aberracja liczbowa: zmiana w ilości chromosomów w odniesieniu do normalnej ilości charakterystycznej dla wykorzystywanych komórek.
Poliploidalność wielokrotność ilości chromosomów haploidalnych (n) inna niż liczba diploidalna (np. 3n, 4n itd.).
Aberracja strukturalna: zmiana w strukturze chromosomu, wykrywalna przez badanie mikroskopowe etapu metafazy podziału komórek, zaobserwowana jako usunięcia oraz fragmenty, zmiany (zachodzące - wewnątrz oraz między chromosomami).
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Zwierzęta są poddane działaniu substancji badanej odpowiednią drogą oraz są uśmiercane w odpowiednim czasie po badaniu. Przed uśmierceniem zwierzęta są poddane działaniu metafazy zatrzymującej substancje (np. Colcemid® lub kolchicyna). Następnie dokonuje się przygotowania chromosomu ze szpiku kostnego oraz zabarwienia, a komórki metafazy są analizowane w odniesieniu do aberracji chromosomowej.
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.4.1. Preparaty
1.4.1.1. Wybór gatunku zwierząt
Szczury, myszy i chomiki chińskie są powszechnie wykorzystywane, chociaż może zostać wykorzystany każdy odpowiedni gatunek ssaków. Powszechnie wykorzystywane laboratoryjne szczepy młodych, zdrowych, dorosłych zwierząt powinny zostać wykorzystane w badaniu. W czasie przeprowadzania badania różnice w masie zwierząt powinny być minimalne oraz nie powinny przekraczać ± 20 % średniej masy każdej płci.
1.4.1.2. Warunki pobytu i karmienia
Ogólne warunki określone w ogólnym wprowadzeniu do części B mają zastosowanie, chociaż celem w odniesieniu do wilgotności powinien być poziom wilgotności 50-60 %.
1.4.1.3. Preparaty zwierzęce
Zdrowe młode dorosłe osobniki zwierząt są losowo przypisane do grup kontrolnych oraz grup poddanych działaniu substancji. Klatki powinny zostać przygotowane w sposób minimalizujący możliwe skutki negatywne wynikające z umieszczenia w klatce. Zwierzęta są identyfikowane oraz aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przynajmniej przez okres pięciu dni.
1.4.1.4. Przygotowanie dawek
Substancje badane stałe powinny zostać rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach oraz rozcieńczone, jeżeli stosowne, przed dozowaniem zwierzętom. Substancje badane płynne mogą być dawkowane bezpośrednio lub mogą zostać rozpuszczone przed dawkowaniem. Powinny zostać wykorzystane świeżo przygotowane substancje, chyba że dane dotyczące stabilności wskazują, iż dopuszczalne jest składowanie substancji.
1.4.2. Warunki badania
1.4.2.1. Rozpuszczalnik/nośnik
Rozpuszczalnik/nośnik nie powinien wywoływać skutków toksycznych przy wykorzystywanych dawkach oraz nie powinien mieć możliwości reagowania chemicznego z substancją badaną. Jeśli inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/nośniki są wykorzystywane, ich włączenie do doświadczenia powinno być wsparte danymi wskazującymi ich zgodność. Zaleca się, o ile to możliwe, aby w pierwszej kolejności rozważone zostało wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/nośników.
1.4.2.2. Kontrole
Równoległe kontrole pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik/nośnik) powinny zostać przeprowadzone w odniesieniu do każdej płci w ramach każdego badania. Z wyjątkiem poddawania działaniu substancji badanej zwierzęta w grupie kontrolnej powinny być przedmiotem identycznych działań w porównaniu ze zwierzętami w grupie poddanej działaniu substancji.
Kontrole pozytywne powinny wywoływać strukturalne aberracje in vivo przy poziomie poddania działaniu substancji, w odniesieniu do którego oczekuje się wykrywalnego wzrostu powyżej tło. Dawki kontroli pozytywnych powinny zostać dobrane tak, aby wyniki były jasne, ale by badającemu nie ujawniały bezpośrednio tożsamości sporządzonych szkiełek mikroskopowych. Dopuszczalne jest, aby pozytywne kontrole podawane były inną drogą niż substancje badane oraz aby ich próbki pobierane były tylko jeden raz. Wykorzystanie substancji chemicznych kontroli pozytywnych powiązanych z klasą chemiczną może być brane pod uwagę, jeżeli są one dostępne. Przykłady substancji pozytywnych kontroli obejmują:
| Substancja | Nr CAS | Nr Einecs |
| Metanosulfonat etylu | 62-50-0 | 200-536-7 |
| Nitrozomocznik etylu | 759-73-9 | 212-072-2 |
| Mitomycyna C | 50-07-7 | 200-008-6 |
| Cyklofosfamid Cyklofosfamid monohydrat | 50-18-0 6055-19-2 | 200-015-4 |
| Trietylenomelamina | 51-18-3 | 200-083-5 |
Negatywne kontrole z poddaniem działaniu samego rozpuszczalnika lub nośnika, a w innych przypadkach poddanie działaniu w ten sam sposób jak grupy poddane działaniu substancji, powinny zostać objęte każdorazowym pobieraniem próbek, chyba że zmienność oraz częstotliwości komórek z aberracjami chromosomowymi są dostępne w historycznych danych dotyczących kontroli. Jeżeli stosowane jest jednokrotne pobieranie próbek w odniesieniu do negatywnych kontroli, najbardziej odpowiednim czasem jest pierwsze pobranie próbek. Dodatkowo kontrole bez poddania działaniu substancji powinny być również wykorzystywane, chyba że istnieją historyczne lub opublikowane dane dotyczące kontroli wykazujące, że wybrany rozpuszczalnik/nośnik nie wywołuje żadnych skutków szkodliwych lub mutagennych.
1.5. PROCEDURA
1.5.1. Liczba oraz płeć zwierząt
Każda z poddanych działaniu substancji oraz kontrolnych grup obejmuje przynajmniej pięć nadających się do poddania analizie zwierząt każdej płci. Jeżeli w czasie badania istnieją dostępne dane z badań naukowych dotyczących tego samego gatunku oraz z wykorzystaniem tej samej drogi poddania działania substancji, które wykazują, że nie istnieją zasadnicze różnice w toksyczności między płciami, wówczas badanie na jednej płci będzie wystarczające. W przypadku gdy poddanie człowieka działaniu substancji chemicznej może być zależne od płci, jak na przykład w odniesieniu do niektórych czynników środków farmaceutycznych, badanie powinno zostać przeprowadzone na zwierzętach odpowiedniej płci.
1.5.2. Harmonogram poddawania działaniu substancji
Substancje badane są podawane przede wszystkim jako pojedynczy zabieg. Substancje badane mogą być również podawane jako dawka rozbita na części, np. dwa zabiegi, tego samego dnia w odstępie nie dłuższym niż kilku godzin, w celu ułatwienia podawania jako duża objętość substancji. Inne reżimy dawki powinny zostać naukowo uzasadnione.
Próbki powinny być pobierane dwukrotnie w ciągu jednego dnia po poddaniu działaniu substancji. W odniesieniu do gryzoni pierwszy odstęp czasu między pobieraniem trwa 1,5 długości normalnego cyklu komórkowego (ten ostatni trwa przeciętnie 12-18 godzin) po poddaniu działaniu substancji. Ze względu na to, że czas wymagany na pobór oraz przemianę materii substancji badanej, jak również jej skutki na kinetykę cyklu komórkowego może wpływać na optymalny czas wykrywania aberracji chromosomowej, zalecane jest późniejsze pobieranie próbek w 24 godziny po pobraniu pierwszej próbki. Jeżeli wykorzystywane są reżimy dawki większe niż jeden dzień, zastosowany powinien zostać jeden okres pobierania próbek w czasie 1,5 długości trwania normalnego cyklu komórkowego po przeprowadzeniu końcowego poddania działaniu substancji.
Przed uśmierceniem zwierzętom wstrzykuje się wewnątrzotrzewnowo odpowiednią dawkę czynnika zatrzymującego metafazę (np. Colcemid® lub kolchicyna). W następnej kolejności pobiera się próbki od zwierząt w odpowiednich odstępach czasu. W odniesieniu do myszy odstęp czasu między pobieraniem próbek wynosi 3-5 godzin; w odniesieniu do chomików ten odstęp czasu wynosi 4-5 godzin. Komórki są pobierane ze szpiku kostnego oraz analizowane pod kątem występowania aberracji chromosomowych.
1.5.3. Poziomy dawek
Jeżeli zakres badań jest przeprowadzanych ze względu na to, że nie istnieją dostępne odpowiednie dane, powinny być one prowadzone w tym samym laboratorium, wykorzystując ten sam reżim gatunku, szczepu, płci oraz poddawania działaniu substancji, który ma zostać zastosowany do głównego badania (5). Jeżeli istnieje toksyczność, trzy poziomy dawek są stosowane w odniesieniu do pierwszego okresu pobierania próbek. Trzy poziomy dawek powinny objąć zakres od maksimum do niskiej toksyczności lub do jej braku. W trakcie późniejszego okresu pobierania próbek muszą zostać wykorzystane jedynie najwyższe dawki. Najwyższa dawka jest określona jako dawka wywołująca oznaki toksyczności, a wyższe poziomy dawek oparte na tym samym reżimie dawkowania mogłyby być śmiertelne. Substancje o szczególnej aktywności biologicznej przy niskich nietoksycznych dawkach (takie jak hormony i mitogeny) mogą stanowić wyjątek w odniesieniu do kryteriów ustalania dawki i powinny być oceniane na zasadzie jednostkowych przypadków. Najwyższa dawka może być również określona jako dawka, która wywołuje pewne wskazania toksyczności w szpiku kostnym (np. wyższa niż 50 % redukcja indeksu mitotycznego).
1.5.4. Badanie ograniczone
Jeżeli badanie w oparciu o jeden poziom dawek o przynajmniej 2.000 mg/kg masy ciała, wykorzystujące pojedyncze poddanie działaniu substancji, lub jak dwa zabiegi poddania działaniu substancji tego samego dnia, nie daje dostrzegalnych wyników toksycznych, oraz jeżeli nie podejrzewa się genotoksyczności w oparciu o dane dotyczące substancji powiązanych strukturalnie, wówczas przeprowadzenie pełnego badania może nie być konieczne. W odniesieniu do badań o dłuższym czasie trwania ograniczenie dawki wynosi 2.000 mg/kg/ masa ciała/dzień w odniesieniu do poddawania działaniu substancji trwającego do 14 dni oraz 1.000 mg/kg/ masa ciała/dzień w odniesieniu do poddawania działaniu substancji trwającego dłużej niż 14 dni. Spodziewa się, iż poddanie człowieka działaniu substancji może wykazać potrzebę wykorzystania większej dawki w badaniu ograniczonym.
1.5.5. Dawkowanie
Substancja badana jest zazwyczaj podawana przez zgłębnik żołądkowy lub odpowiednią rurkę intubacyjną, lub przez wstrzyknięcie wewnątrzotrzewnowe. Inne drogi poddania działaniu substancji mogą być dopuszczalne w przypadku, gdy ich wykorzystanie jest uzasadnione. Maksymalna objętość płynu, jaka może być podana przez zgłębnik lub wstrzyknięta jednorazowo, zależy od wielkości badanego zwierzęcia. Objętość nie powinna przekraczać 2 ml/100 g masy ciała. Wykorzystanie objętości wyższych niż te musi być uzasadnione.
Z wyjątkiem podrażniających lub żrących substancji, które zazwyczaj ujawniają zwiększone skutki o dużym stężeniu, zmienności w objętości substancji badanej powinny zostać zminimalizowane przez dostosowanie stężenia w celu zapewnienia stałej objętości przy wszystkich poziomach dawek.
1.5.6. Preparaty chromosomów
Zaraz po uśmierceniu zwierzęcia, uzyskuje się szpik kostny, poddany działaniu roztworu hipotonicznego oraz ustabilizowany. Komórki są następnie rozmieszczane na szkiełku mikroskopu i barwione.
1.5.7. Analiza
Indeks mitotyczny powinien zostać oznaczony jako miara cytotoksyczności w przynajmniej 1.000 komórek na zwierzę w odniesieniu do wszystkich poddanych działaniu substancji zwierząt (łącznie z pozytywnymi kontrolami) lub kontrolowanych zwierząt, które nie zostały poddane działaniu substancji.
Przynajmniej 100 komórek powinno zostać poddane analizie w odniesieniu do każdego zwierzęcia. Liczba ta może zostać zmniejszona, jeśli zaobserwowano dużą liczbę aberracji. Wszystkie szkiełka mikroskopowe, w tym dotyczące negatywnych i pozytywnych kontroli, powinny być niezależnie zakodowane przed analizą mikroskopową. Ponieważ procedury przygotowania szkiełka mikroskopowego często skutkują przerwaniem proporcji między metafazą ze stratą chromosomów, oceniane komórki powinny z tego względu zawierać pewną liczbę centromerów równą 2n ± 2.
2. DANE
2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW
Dane dotyczące poszczególnych zwierząt powinny zostać przedstawione w formie tabelarycznej. Jednostką doświadczalną jest zwierzę. W odniesieniu do każdego zwierzęcia ocenione powinny zostać: liczba ocenionych komórek, liczba aberracji przypadających na komórkę oraz udział procentowy komórek ze strukturalnymi aberracjami chromosomowymi. Różne typy strukturalnej aberracji chromosomowej powinny być wymienione wraz z ich ilościami oraz częstotliwościami w odniesieniu do grupy poddanej działaniu substancji oraz kontrolnej. Szczeliny są oddzielnie odnotowywane oraz zgłaszane, ale ogólnie nie są włączane do częstotliwości aberracji ogółem. Jeżeli nie ma dowodu na różnicę między płciami, dane dotyczące obu płci mogą zostać połączone dla przeprowadzenia analizy statystycznej.
2.2. OCENA ORAZ INTERPRETACJA WYNIKÓW
Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak związany z dawką wzrost odpowiedniej ilości komórek z aberracjami chromosomowymi lub wyraźny wzrost w ilości komórek z aberracjami w grupie pojedynczej dawki przy jednym okresie pobierania próbek. Biologiczne znaczenie wyników powinno zostać wzięte pod uwagę w pierwszej kolejności. Metody statystyczne mogą zostać wykorzystane jako metody pomocnicze w przeprowadzaniu oceny wyników (6). Znaczenie statystyczne nie powinno być jedynym czynnikiem określającym w odniesieniu do reakcji pozytywnej. Wyniki niejednoznaczne powinny zostać wyjaśnione przez dalsze badanie, w szczególności z wykorzystaniem modyfikacji warunków doświadczalnych.
Wzrost liczby komórek poliploidalnych może wskazywać, że substancja badana ma potencjał wywoływania liczbowych aberracji chromosomowych. Wzrost endoreduplikacji chromosomami może wskazywać, że substancje badane mają potencjał wstrzymywania postępowania cyklu komórkowego (7)(8).
Substancja badana, w odniesieniu do której wyniki nie spełniają powyższych kryteriów, uważana jest za niemutagenną w tym badaniu.
Chociaż większość doświadczeń będzie dawała w jasny sposób pozytywne lub negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw danych wyklucza dokonanie ostatecznej oceny dotyczącej aktywności badanej substancji. Wyniki mogą pozostać niejednoznaczne lub sporne niezależnie od liczby powtórzonych doświadczeń.
Wyniki pozytywne z badania aberracji chromosomowej wskazują, że substancja badana wywołuje chromosomową aberrację w szpiku kostnym badanych gatunków. Wyniki negatywne wskazują, że w warunkach badawczych substancja badana nie pobudza aberracji chromosomowej w szpiku kostnym badanych zwierząt.
Prawdopodobieństwo, że substancja badana lub jej metabolity docierają do ogólnego obiegu lub w szczególności do tkanki docelowej (np. toksyczność systemowa), powinno zostać wzięte pod uwagę.
3. SPRAWOZDAWCZOŚĆ
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
Rozpuszczalnik/nośnik:
- uzasadnienie wyboru nośnika,
- rozpuszczalność oraz stabilność substancji w rozpuszczalniku/nośniku, jeżeli jest znana. Badane zwierzęta:
- gatunek/szczep wykorzystany,
- liczba, wiek oraz płeć zwierząt,
- źródło, warunki przetrzymywania, odżywianie itp.,
- indywidualna masa zwierzęcia na początku badania, łącznie z zakresem masy ciała, średnimi oraz standardowymi odchyleniami dla każdej grupy.
Warunki badania:
- pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik/nośnik) kontrole,
- dane z zakresu studium dotyczącego określania zakresu badania, jeżeli zostały przeprowadzone,
- racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do zamkniętego wyboru dawek,
- szczegóły dotyczące przygotowania substancji badanej,
- szczegóły dotyczące podawania substancji badanej,
- racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do drogi podawania,
- metody sprawdzania, czy substancja badana dotarła do ogólnego obiegu lub tkanki docelowej, jeżeli ma zastosowanie,
- zmiana stężenia substancji badanej w odżywianiu/wodzie pitnej (ppm) na rzeczywistą dawkę (mg/kg masy ciała/dzień), jeżeli ma zastosowanie,
- szczegóły dotyczące jakości pokarmu oraz wody,
- szczegółowy opis harmonogramów poddawania działaniu substancji oraz pobierania próbek,
- metody pomiarów toksyczności,
- tożsamość metafazy zatrzymującej substancje, jej stężenie oraz czas trwania poddania działaniu substancji,
- metody przygotowania szkiełek mikroskopowych,
- kryteria w odniesieniu do aberracji oceniającej,
- liczba komórek objętych analizą przypadająca na zwierzę,
- kryteria uznawania badań za pozytywne, negatywne lub niejednoznaczne. Wyniki:
- oznaki toksyczności,
- indeks mitotyczny
- typ oraz liczba aberracji, podane oddzielnie dla każdego zwierzęcia,
- liczba aberracji ogółem na grupę ze średnimi i standardowymi odchyleniami,
- liczba komórek z aberracjami na grupę ze średnimi i standardowymi odchyleniami,
- zmiany poliploidalności, jeżeli są znane,
- relacja miedzy dawką a reakcją, w miarę możliwości,
- analizy statystyczne, jeżeli istnieją,
- dane dotyczące równoległych kontroli negatywnych,
- historyczne dane dotyczące negatywnych kontroli, z zakresami, średnimi oraz standardowymi odchyleniami,
- dane dotyczące równoległych pozytywnych kontroli. Omówienie wyników.
Wnioski.
4. ODNIESIENIA
(1) Adler, I. D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, w: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, S. Venitt and J. M. Parry (eds), IRL Press, Oxford, Washington D. C, pp. 275-306.
(2) Preston, R. J., Dean, B. J., Galloway, S., Holden, H., McFee, A. F. and Shelby, M. (1987), Mammalian In vivo Cytogenetic AssayS: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow Cells, Mutation Res., 189, pp. 157-165.
(1) (3) Richold, M., Chandley A., Ashby, J., Gatehouse, D. G., Bootman, J. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, w: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
(4) Tice, R. R., Hayashi, M., MacGregaro, J. T., Anderson, D., Blakey, D. H., Holden, H. E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F. B., Pacchierotti, F., Preston, R. J., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B. (1994), Report from the Working Group on the in vivo Mammalian Bone Marrow Chromosomal Aberration Test, Mutation Res., 312, pp. 305-312.
(5) Fielder, R.J., Allen, J. A., Boobis, A. R, Botham, P. A., Doe,J., Esdaile, D.J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in In vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
(6) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K. (19 8 9), Statistical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays, w: UKEMS Sub-Committee on Guidelinesfor Mutagenicity Testing, Report Part III. Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, D. J. Kirkland (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.
(7) Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation-induced G2 arrest, Mutation Res., 119, pp. 403-413.
(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J. E. (1983), Aphidicolin-induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Res., 43, pp. 1362-1364.
B12. MUTAGENNOŚĆ - BADANIE MIKROJĄDROWE ERYTRYOCYTOW IN VIVO U SSAKÓW
1. METODA
Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 474, metody badania mikrojądrowego erytrocytów in vivo u ssaków (1997).
1.1. WPROWADZENIE
Badanie mikrojądrowe erytrocytów u ssaków in vivo jest wykorzystywane w celu wykrycia uszkodzeń wywołanych przez chromosomy lub aparat mitotyczny erytroblastów przez analizę erytrocytu pobranego jako próbka szpiku kostnego lub komórek krwi obwodowej zwierząt, zazwyczaj gryzoni.
Celem badania mikrojądrowego jest identyfikacja substancji powodujących cytogenetyczne uszkodzenia, które skutkują formowaniem się mikrojądra zawierającego okrywające fragmenty chromosomów lub całe chromosomy.
Kiedy w erytroblaście szpiku kostnego rozwija się w erytrocyt polichromatyczny główne jądro jest wyrzucane; każde mikrojądro, które zostało uformowane, może pozostać poza cytoplazmą poddaną w inny sposób tworzeniu się zarodników. Wizualizacja mikrojądra jest ułatwiona w tych komórkach, ponieważ brak im głównego jądra. Wzrost częstotliwości mikrojądrowych polichromicznych erytrocytów w zwierzętach poddanych działaniu substancji jest wskazaniem wywołanego uszkodzenia chromosomu.
Szpik kostny gryzoni jest rutynowo wykorzystywany w tych badaniach ze względu na to, że erytrocyty polichromiczne produkowane są w tej tkance. Pomiar mikrojądrowych niedojrzałych (polichromicznych) erytrocytów w krwi obwodowej jest na równi dopuszczalny w odniesieniu do jakiegokolwiek gatunku, co do którego wykazana została niezdolność śledziony do usunięcia mikrojądrowego erytrocytu lub który wskazał odpowiednią czułość w celu wykrywania czynników, które powodują strukturalne lub liczbowe aberracje chromosomowe. Mikrojądro może być wyróżnione w oparciu o różne kryteria. Obejmują one identyfikacje obecności lub nieobecności kinetochoru lub centromeru DNA w mikrojądrze. Częstotliwość mikrojądrowych niedojrzałych (polichromicznych) erytrocytów jest głównym punktem końcowym. Liczba dojrzałych erytrocytów w krwi obwodowej, które zawierają mikrojądro, pośród danej ilości dojrzałych erytrocytów może być również wykorzystana jako punkt końcowy oznaczania, jeśli zwierzęta są poddawane działaniu substancji przez cztery tygodnie lub dłużej.
To badanie mikrojądrowe erytrocytów u ssaków in vivo ma szczególne znaczenie dla oceniania zagrożenia, w związku z czym pozwala ono na stężenie czynników metabolizmu farmakokinetyków oraz procesów naprawy DNA chociaż mogą one różnić się wzajemnie w zależności od gatunku oraz tkanek, oraz genetycznych punktów końcowych. Badanie in vivo jest również użyteczne w odniesieniu do dalszych badań skutków mutagennych wykrytych w systemie in vitro.
Jeżeli istnieje dowód na to, że substancja badana lub metabolit reakcyjny nie dotrze do tkanki docelowej, niewłaściwe jest wykorzystanie tego badania.
Zob. również Ogólne wprowadzenie do części B.
1.2. DEFINICJE
Centromer (Kinetochor): region(-y) chromosomu, w którym(-ch) mikrotubule wrzeciona podziałowego są asocjowane w trakcie podziału komórki, dopuszczając uporządkowane przemieszczanie się chromosomów potomnych do biegunów komórek potomnych.
Mikrojądra: małe jądra, oddzielone oraz występujące dodatkowo w stosunku do jądra głównego komórek, wytwarzane w trakcie telofazy mitozy (mejozy) przez okrywające fragmenty chromosomów lub całe chromosomy.
Erytrocyt normochromiczny: dojrzały erytrocyt, któremu brakuje rybosomów oraz może być odróżniony od niedojrzałego, polichromatycznych erytrocytów przez szczepy wybiórczo w odniesieniu dla rybosomów.
Erytrocyt polichromiczny: niedojrzały erytrocyt, w pośrednim stadium rozwoju, który nadal zawiera rybosomy i z tego względu może zostać odróżniony od dojrzałych, normochromicznych erytrocytów, dzięki plamom selektywnym dla rybosomów.
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Zwierzęta są poddane działaniu substancji badanej odpowiednią drogą. Jeżeli wykorzystywany jest szpik kostny, zwierzęta są uśmiercane w odpowiednim czasie po poddaniu działaniu substancji, pobiera się szpik kostny, sporządzane są preparaty oraz dokonuje się barwienia (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7). Kiedy wykorzystywana jest krew obwodowa, krew pobierana jest w odpowiednim czasie po poddaniu działaniu substancji oraz sporządzane są i barwione preparaty wymazowe (4)(8)(9)(10). W odniesieniu do badań z krwią obwodową powinno upłynąć możliwie jak najmniej czasu między ostatnim poddaniem działaniu substancji a pobraniem komórek. Preparaty są analizowane pod kątem obecności mikrojądra.
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.4.1. Preparaty
1.4.1.1. Wybór gatunku zwierząt
Szczury lub myszy są zalecane, jeśli wykorzystywany jest szpik kostny, chociaż może zostać wykorzystany każdy odpowiedni gatunek ssaków. Jeśli wykorzystywana jest krew obwodowa, zalecane są myszy. Jednakże może zostać wykorzystany każdy odpowiedni gatunek ssaków pod warunkiem, że jest gatunkiem, w którym śledziona nie usuwa mikrojądrowych erytrocytów lub gatunkiem, który wykazał czułość odpowiednią do wykrycia czynników powodujących strukturalne lub liczbowe aberracje chromosomowe. Powszechnie wykorzystywane laboratoryjne szczepy młodych zdrowych dorosłych zwierząt powinny zostać wykorzystane w badaniu. W czasie przeprowadzania badania różnice w masie zwierząt powinny być minimalne i nie powinny przekraczać ± 20 % średniej masy każdej płci.
1.4.1.2. Warunki przetrzymywania i karmienia
Ogólne warunki określone w ogólnym wprowadzeniu do części B są stosowane, chociaż celem w odniesieniu do wilgotności powinien być poziom 50-60 %.
1.4.1.3. Przygotowanie zwierząt
Zdrowe młode dorosłe osobniki zwierząt są losowo przypisane do grup kontrolnych oraz grup poddanych działaniu substancji. Zwierzęta są identyfikowane w niepowtarzalny sposób. Zwierzęta są aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przynajmniej przez pięć dni. Klatki powinny zostać przygotowane w sposób minimalizujący możliwe negatywne skutki wynikające z umieszczenia w klatce.
1.4.1.4. Przygotowanie dawek
Substancje badane stałe powinny zostać rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach oraz rozcieńczone, jeżeli to stosowne, przed dawkowaniem zwierzętom. Substancje badane płynne mogą być dawkowane bezpośrednio lub mogą zostać rozpuszczone przed dawkowaniem. Powinny zostać wykorzystane świeżo przygotowywane substancje, chyba że dane dotyczące stabilności wskazują, iż dopuszczalne jest składowanie substancji.
1.4.2. Warunki badania
1.4.2.1. Rozpuszczalnik/nośnik
Rozpuszczalnik/nośnik nie powinien wywoływać skutków toksycznych przy wykorzystywanych poziomach dawek oraz nie powinien mieć możliwości reagowania chemicznego z substancją badaną. Jeśli inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/nośniki są wykorzystywane, ich włączenie do doświadczenia powinno być wsparte danymi wskazującymi ich zgodność. Zaleca się, o ile to możliwe, aby w pierwszej kolejności rozważone zostało wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/nośników.
1.4.2.2. Kontrole
Równoległe kontrole pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik/nośnik) powinny zostać przeprowadzone w odniesieniu do każdej płci w ramach każdego badania. Z wyjątkiem poddawania działaniu substancji badanej zwierzęta w grupie kontrolnej powinny być przedmiotem identycznych działań w porównaniu ze zwierzętami w grupie poddanej działaniu substancji.
Kontrole pozytywne powinny wytwarzać mikrojądro przy poziomie poddania działaniu substancji, w odniesieniu do którego oczekuje się wykrywalnego wzrostu względem tła. Dawki kontroli pozytywnych powinny zostać wybrane tak, aby wyniki były jasne, ale nie ujawniały bezpośrednio tożsamości zakodowanych szkiełek mikroskopowych badającemu. Dopuszczalne jest, aby pozytywne kontrole podawane były inną drogą niż substancje badane oraz aby ich próbki pobierane były tylko jeden raz. Dodatkowo wykorzystanie substancji chemicznych pozytywnych powiązanych z klasą chemiczną kontroli może być brane pod uwagę, jeżeli są one dostępne. Przykłady pozytywnych substancji kontrolnych obejmują:
| Substancja | Nr CAS | Nr Einecs |
| Etyl metanosulfonowy | 62-50-0 | 200-536-7 |
| N-etylo-N-nitrozomocznik | 759-73-9 | 212-072-2 |
| Mitomycyna C | 50-07-7 | 200-008-6 |
| Cyklofosfamid Cyclofosfamid monohydrat | 50-18-0 6055-19-2 | 200-015-4 |
| Trietyleneomelamina | 51-18-3 | 200-083-5 |
Negatywne kontrole z poddaniem działaniu samego rozpuszczalnika lub nośnika, a w innych przypadkach poddane działaniu w ten sam sposób jak grupy poddane działaniu substancji, powinny zostać objęte każdorazowym pobieraniem próbek, chyba że dopuszczalna zmienność oraz częstotliwości komórek z aberracjami chromosomowymi są dostępne z historycznych danych dotyczących kontroli. Jeżeli stosowane jest jednokrotne pobieranie próbek w odniesieniu do negatywnych kontroli, najbardziej odpowiednim czasem jest pierwszy okres pobrania próbek. Dodatkowo kontrole bez poddania działaniu substancji powinny być również wykorzystywane, chyba że istnieją historyczne lub opublikowane dane dotyczące kontroli wykazujące, że wybrany rozpuszczalnik/nośnik nie wywołuje żadnych skutków szkodliwych lub mutagennych.
Jeżeli wykorzystywana jest krew obwodowa, dopuszczalna może być również próbka sprzed poddania działaniu substancji jako równoległa kontroli negatywnej, ale tylko w krótkich badaniach krwi obwodowej (np. 1-3 zabiegów poddania działaniu substancji), jeśli wynikające z badania dane mieszczą się w spodziewanym zakresie w odniesieniu do kontroli historycznych.
1.5. PROCEDURA
1.5.1. Liczba oraz płeć zwierząt
Każda z poddanych działaniu substancji oraz kontrolnych grup obejmuje przynajmniej pięć nadających się do poddania analizie zwierząt z każdej płci (11). Jeżeli w czasie badania istnieją dostępne dane z badań naukowych dotyczących tego samego gatunku oraz z wykorzystaniem tej samej drogi poddania działania substancji, które wykazują, że nie istnieją zasadnicze różnice w toksyczności między płciami, wówczas badanie na jednej płci będzie wystarczające. Gdy poddanie człowieka działaniu substancji chemicznej może być zależne od płci, jak na przykład w odniesieniu do niektórych środków farmaceutycznych, badanie powinno zostać przeprowadzone na zwierzętach odpowiedniej płci.
1.5.2. Harmonogram poddawania działaniu substancji
Nie można zalecić żadnego harmonogramu poddawania działaniu substancji (np. jeden, dwa albo więcej zabiegów poddawania działaniu substancji w 24-godzinnych odstępach czasu). Próbki z rozszerzonych reżimów dawkowania są dopuszczalne, o ile wykazane zostały pozytywne wyniki w odniesieniu do tego badania, w odniesieniu do badania negatywnego, o ile wykazana została toksyczność lub została wykorzystana dawka ograniczona oraz kontynuowano dawkowanie do momentu okresu pobierania próbek. Substancja badana może być również podawana jako dawka podzielona, np. dwa zabiegi poddania działaniu substancji tego samego dnia, w odstępie nie więcej niż kilku godzin, w celu ułatwienia podawania dużej objętości substancji.
Badanie można przeprowadzić na dwa sposoby:
a) zwierzęta są poddawane działaniu substancji badanej jeden raz. Próbki szpiku kostnego są pobierane przynajmniej dwukrotnie, rozpoczynając nie wcześniej niż w 24 godziny po poddaniu działaniu substancji badanej, ale nie przedłużając poza okres 48 godzin po poddaniu działaniu substancji badanej z odpowiednimi odstępami czasu między pobieraniem próbek. Stosowanie próbek wcześniej niż 24 godziny po leczeniu powinno być uzasadnione. Próbki krwi obwodowej są pobierane przynajmniej dwukrotnie, rozpoczynając nie wcześniej niż w 36 godzin po poddaniu działaniu substancji badanej z odpowiednimi odstępami czasu po pobraniu pierwszej próbki, ale nieprzedłużającymi się powyżej 72 godzin. Jeżeli rozpoznano pozytywną reakcję przy jednym okresie pobierania próbek, nie jest wymagane dodatkowe pobieranie próbek;
b) jeżeli wykorzystywane są dwa lub więcej zabiegów poddawania działaniu substancji badanej dziennie (np. dwa lub więcej zabiegów poddawania działaniu substancji przy 24-godzinnych odstępach czasu), próbki powinny zostać zebrane w okresie między 18 a 24 godziną po końcowym poddaniu działaniu substancji w odniesieniu do szpiku kostnego oraz między 36 a 48 godziną po poddaniu działaniu substancji w odniesieniu do krwi obwodowej (12).
Można stosować dodatkowo inne okresy pobierania próbek, jeżeli są one odpowiednie.
1.5.3. Poziomy dawek
Jeżeli studium określające zakres badania jest przeprowadzane ze względu na to, że nie istnieją dostępne odpowiednie dane, powinno być ono prowadzane w tym samym laboratorium, wykorzystując ten sam reżim gatunku, szczepu, płci oraz poddawania działaniu substancji, który ma zostać zastosowany do głównego badania (13). Jeżeli istnieje toksyczność, trzy poziomy dawek są wykorzystywane w odniesieniu do pierwszego okresu pobierania próbek. Te poziomy dawek powinny objąć zakres od najwyższej do niskiej toksyczności lub do jej braku. W trakcie późniejszego okresu pobierania próbek muszą zostać wykorzystane jedynie najwyższe dawki. Najwyższa dawka jest określona jako dawka wywołująca oznaki toksyczności, a wyższe poziomy dawek oparte na tych samych reżimach dotyczących dawkowania mogłyby być zabójcze. Substancje o szczególnej aktywności biologicznej przy niskich nietoksycznych dawkach (takie jak hormony i mitogeny) mogą stanowić wyjątek w odniesieniu do kryteriów ustalania dawki i powinny być oceniane na zasadzie jednostkowych przypadków. Najwyższa dawka może być również określona jako dawka, która wywołuje pewne wskazania toksyczności w szpiku kostnym (np. redukcja udziału niedojrzałych erytrocytów pośród erytrocytów ogółem w szpiku kostnym lub krwi obwodowej).
1.5.4. Badanie ograniczone
Jeżeli badanie w oparciu o jeden poziom dawek w odniesieniu do zwierząt o przynajmniej 2.000 mg/kg masy ciała, wykorzystujące pojedyncze poddanie działaniu substancji lub dwa zabiegi poddania działaniu substancji tego samego dnia, nie daje dostrzegalnych skutków toksycznych, oraz jeżeli nie podejrzewa się genotoksyczności w oparciu o dane dotyczące substancji powiązanych strukturalnie, wówczas przeprowadzenie pełnego badania może nie być konieczne. W odniesieniu do badań o dłuższym czasie trwania, ograniczenie dawki wynosi 2.000 mg/kg/masa ciała/dzień w odniesieniu do poddania działaniu substancji trwającego do 14 dni oraz 1.000 mg/kg/masa ciała/dzień w odniesieniu do poddania działaniu substancji trwającego dłużej niż 14 dni. Spodziewane poddanie człowieka działaniu substancji może wykazać potrzebę wykorzystania większej dawki w badaniu ograniczonym.
1.5.5. Dawkowanie
Substancja badana jest zazwyczaj podawana przez zgłębnik żołądkowy lub odpowiednią rurkę intubacyjną lub wstrzyknięcie wewnątrzotrzewnowe. Inne drogi poddania działaniu substancji mogą być dopuszczalne, w przypadku gdy ich wykorzystanie może być uzasadnione. Maksymalna objętość płynu, jaka może być podana przez zgłębnik lub wstrzyknięta jednorazowo, zależy od wielkości badanego zwierzęcia. Objętość nie powinna przekraczać 2 ml/100 g masy ciała. Wykorzystanie objętości wyższych musi być uzasadnione. Z wyjątkiem podrażniających lub żrących substancji, które zazwyczaj ujawniają zwiększone skutki o wyższym stężeniu, zmienności w objętości substancji badanej powinny zostać zminimalizowane przez dostosowanie stężenia w celu zapewnienia stałej objętości przy wszystkich poziomach dawek.
1.5.6. Przygotowanie szpiku kostnego/krwi
Komórki szpiku kostnego są zazwyczaj uzyskiwane z kości udowych lub piszczeli bezpośrednio po uśmierceniu. Powszechnie komórki są usuwane z kości udowych lub piszczeli, preparowane oraz barwione, wykorzystując ustalone metody. Krew obwodowa jest uzyskiwana z tętnicy szyjnej lub innego odpowiedniego naczynia krwionośnego. Komórki krwi są natychmiast barwione (8)(9)(10) lub sporządzane są preparaty wymazowe, a następnie są barwione. Wykorzystanie szczególnego barwnika DNA (np. oranż akrydynowy (14) lub Hoechst 33258 plus pyronina-Y (15)) może wyeliminować niektóre spośród artefaktów związanych z barwnikiem nienadającym się do szczególnego szczepu DNA. Ta korzyść nie wyklucza zastosowania zwykłych barwników (np. Giemsa). Dodatkowe systemy (np. kolumny celulozowe w celu usunięcia komórek jądrowych (16)) mogą być również wykorzystane pod warunkiem, że wykazano, iż systemy te odpowiednio działają w odniesieniu do przygotowywania mikrojądra w laboratorium.
1.5.7. Analiza
Udział niedojrzałych erytrocytów pośród ogółu (dojrzałych i niedojrzałych) erytrocytów jest oznaczana podliczając ogół przynajmniej 200 erytrocytów w odniesieniu do szpiku kostnego oraz 1.000 erytrocytów w odniesieniu do krwi obwodowej (17). Wszystkie szkiełka mikroskopowe, łącznie z tymi dotyczącymi pozytywnych i negatywnych kontroli, powinny być niezależnie kodowane przed przeprowadzeniem analizy mikroskopowej. Przynajmniej 2.000 niedojrzałych erytrocytów przypadających na zwierzę jest oceniane w odniesieniu do zapadalności niedojrzałych erytrocytów. Analizując szkiełka mikroskopowe, udział niedojrzałych erytrocytów nie powinien być mniejszy niż 20 % wartości kontrolnej. Jeżeli zwierzęta są poddawane działaniu substancji nieprzerwanie przez cztery tygodnie lub dłużej, przynajmniej 2.000 dojrzałych erytrocytów na zwierzę może zostać ocenione w odniesieniu do częstości występowania mikrojądra. Systemy automatycznej analizy (analiza obrazowa oraz przepływowa analiza cytometryczna zawiesin komórkowych) są dopuszczalne alternatywnie w odniesieniu do to oceny manualnej, jeżeli są odpowiednio uzasadnione oraz jeżeli stwierdzono ich ważność.
2. DANE
2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW
Dane dotyczące poszczególnych zwierząt powinny zostać przedstawione w formie tabelarycznej. Liczba ocenionych niedojrzałych erytrocytów, liczba mikrojądrowych niedojrzałych erytrocytów oraz liczba niedojrzałych erytrocytów pośród erytrocytów ogółem powinna zostać wymieniona oddzielnie w odniesieniu do każdego zwierzęcia poddanego analizie. Jeżeli zwierzęta są poddawane działaniu substancji nieprzerwanie przez cztery tygodnie lub dłużej, dane dotyczące dojrzałych erytrocytów powinny zostać podane, jeżeli zostały one zebrane. Udział niedojrzałych erytrocytów pośród erytrocytów ogółem oraz, jeżeli uznaje się to za mające zastosowanie, udział procentowy mikrojądrowych erytrocytów podawany jest dla każdego zwierzęcia. Jeżeli nie ma dowodu na różnicę między płciami, dane dotyczące obu płci mogą zostać połączone celem przeprowadzenia analizy statystycznej.
2.2. OCENA ORAZ INTERPRETACJA WYNIKÓW
Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak związany z dawką wzrost w odpowiedniej ilości komórek z aberracjami chromosomowymi lub wyraźny wzrost w ilości komórek z aberracjami w grupie pojedynczej dawki przy jednym okresie pobierania próbek. Biologiczne znaczenie wyników powinno zostać wzięte pod uwagę w pierwszej kolejności. Metody statystyczne mogą zostać wykorzystane jako metody pomocnicze w przeprowadzaniu oceny wyników (18)(19). Znaczenie statystyczne nie powinno być jedynym czynnikiem określającym w odniesieniu do reakcji pozytywnej. Wyniki niejednoznaczne powinny zostać wyjaśnione przez dalsze badanie, w szczególności z wykorzystaniem modyfikacji warunków doświadczalnych.
Substancja badana, w odniesieniu do której wyniki nie spełniają powyższych kryteriów, uważana jest za niemutagenną w tym badaniu.
Chociaż większość doświadczeń będzie dawało w jasny sposób pozytywne lub negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw danych będzie wykluczał dokonanie ostatecznej oceny dotyczącej aktywności substancji badanej. Wyniki mogą pozostać niejednoznaczne lub sporne niezależnie od ilości powtórzeń doświadczenia.
Wyniki pozytywne z badania mikrojądrowego wskazują, że substancja badana wywołuje powstanie mikrojądra, które jest wynikiem uszkodzenia chromosomowego albo uszkodzenia w erytroblaście badanego gatunku. Wyniki negatywne wskazują, że w warunkach badawczych substancja badana nie produkuje mikrojądra w niedojrzałym erytrocycie badanego gatunku.
Prawdopodobieństwo, że substancja badana lub jej metabolity docierają do ogólnego obiegu lub w szczególności tkanki docelowej (np. toksyczność systemowa), powinno zostać rozpatrzone.
3. SPRAWOZDAWCZOŚĆ
SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
Rozpuszczalnik/nośnik:
- uzasadnienie wyboru nośnika,
- rozpuszczalność oraz stabilność substancji w rozpuszczalniku/nośniku, jeżeli jest znana. Badane zwierzęta:
- gatunek/szczep wykorzystany,
- liczba, wiek oraz płeć zwierząt,
- źródło, warunki przetrzymywania, odżywianie itp.,
- indywidualna masa ciała zwierzęcia na początku badania, łącznie z zakresem masy ciała, średnimi oraz standardowymi odchyleniami dla każdej grupy.
Warunki badania:
- dane dotyczące pozytywnych i negatywnych (rozpuszczalnik/nośnik) kontroli,
- dane z zakresu studium określania zakresu badania, jeżeli zostało przeprowadzone,
- racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do wyboru poziomu dawek,
- szczegóły dotyczące preparatów substancji,
- szczegóły dotyczące podawania substancji badanej,
- racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do drogi podawania,
- metody sprawdzania, czy substancja testowa dotarła do ogólnego obiegu lub tkanki docelowej, jeżeli mają zastosowanie,
- zmiana stężenia substancji badanej w odżywianiu/wodzie pitnej (ppm) na rzeczywistą dawkę (mg/kg masy ciała/dzień), jeżeli ma zastosowanie,
- szczegóły dotyczące jakości pokarmu oraz wody,
- szczegółowy opis harmonogramów leczenia oraz pobierania próbek,
- metody przygotowania slajdów,
- metody pomiarów toksyczności,
- kryteria w odniesieniu do oceniającej aberracji mikrojądrowych niedojrzałych erytrocytów,
- liczba przeanalizowanych komórek przypadająca na zwierzę,
- kryteria uznawania badań za pozytywne, negatywne lub niejednoznaczne. Wyniki:
- oznaki toksyczności,
- udział niedojrzałych erytrocytów pośród erytrocytów ogółem,
- liczba mikrojądrowych niedojrzałych erytrocytów podana oddzielnie w odniesieniu do każdego zwierzęcia,
- średnia ± mikrojądrowych niedojrzałych erytrocytów przypadająca na grupę,
- relacja miedzy dawką a reakcją, w miarę możliwości,
- analizy statystyczne, jeżeli istnieją,
- dane dotyczące równoległych oraz historycznych kontroli negatywnych,
- dane dotyczące równoległych pozytywnych kontroli.
Omówienie wyników. Wnioski.
4. ODNIESIENIA
(1) Heddle, J. A. (1973), A Rapid In vivo Test for Chromosomal Damage, Mutation Res., 18, pp. 187-190.
(2) Schmid, W. (1975), The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, pp. 9-15.
(3) Heddle, J. A., Salamone, M. F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavournin, K, MacGregor, J. G. and Newell, G. W. (198 3), The Induction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity, Mutation Res. 123, pp. 61-118.
(4) Mavournin, K H., Blakey, D. H., Cimino, M. C, Salamone, M. F. and Heddle, J. A. (1990), The In vivo Micronucleus Assay in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A report of the U. S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Res., 239, pp. 29-80.
(5) MacGregor, J. T, Schlegel, R., Choy W. N. and Wehr, C. M. (1983), Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid Screen for Chromosomal Damage During Routine Toxicity Testing in Mice, w: Developments in Science and Practice ofToxicology, ed. A. W. Hayes, R. C. Schnell and T S. Miya. Elsevier, Amsterdam, pp. 555-558.
(6) MacGregor, J. T, Heddle, J. A. Hite, M., Margolin, G. H, Ramel, C, Salamone, M. F., Tice, R. R, and Wild, D. (19 8 7), Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mammalian Bone Marrow Erythrocytes, Mutation Res., 189, pp. 103-112.
(7) MacGregor, J. T, Wehr, C M., Henika, P. R. and Shelby M. E. (1990), The in vivo Erythrocyte Micronucleus Test: Measurement at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies, Fund. Appl. Toxicol. 14, pp. 513-522.
(8) Hayashi, M., Morita, T, Kodama, Y., Sofumi, T and Ishidate, M. Jr. (1990), The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides, Mutation Res., 245, pp. 245-249.
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992). Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Erythrocytes by Acridime Orange Supravital Staining: The Summary Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS, MMS, Mutation Res., 278, pp. 83-98.
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT/JEMMS, MMS: The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan)(1995), Protocol recommended for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 53-159.
(11) Hayashi, M., Tice, R. R, MacGregor, J. T, Anderson, D., Blackey, D. H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchicrotti, F., Romagna, F., Shimada, H. Sutou, S. and Vannier, B. (19 94), in vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay, Mutation Res., 312, pp. 293-304.
(12) Higashikuni, N. and Sutou, S. (1995), An optimal, generalised sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse peripheral micronucleus test, Mutagenesis, 10, pp. 313-319.
(13) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R, Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Rochold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/ UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose Setting in In vivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
(14) Hayashi, M., Sofumi, T and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, pp. 241-247.
(15) MacGregor, J. T., Wehr, C. M. and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyromin Y, Mutation Res., 120, pp. 269-275.
(16) Romagna, F. and Staniforth, C. D. (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 213, pp. 91-104.
(17) Gollapudi, B. and McFadden, L. G. (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Res., 347, pp. 97- 99.
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetics Assay, w: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity tests, UKEMS Recommended Procedures, UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
(19) Lovell, D. P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G. E., Clare, G., Ferguson R., Richold, M., Papworth, D. G. and Savage, J. R. K (1989), Staticical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays, w: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report, Part III, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
B13/14. MUTAGENNOŚĆ - BADANIE MUTACJI POWROTNYCH W KOMORKACH BAKTERYJNYCH
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B15. BADANIE MUTAGENNOŚCI I BADANIE PRZESIEWOWE NA RAKOTWÓRCZOŚĆ MUTACJA GENU - SACCHAROMYCES CEREVISIAE
1. METODA
1.1. WSTĘP
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
1.2. DEFINICJE
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Brak.
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Odmiana haploidalnych i diploidalnych szczepów bakterii drożdży Saccharomyces cerevisiae może zostać użyta w celu dokonania pomiaru produkcji mutacji genu wywołanych czynnikami chemicznymi z udziałem oraz bez aktywacji metabolitycznej.
Używane były wczesne systemy mutacji w szczepach haploidalnych, takie jak pomiar mutacji od czerwonych mutantów wymagających do wzrostu adeniny (ade-1, ade-2) do białych mutantów z podwójną mutacją adeninową oraz selektywne systemy takie jak indukcja oporności na kanawainę i cykloheksimid.
Najszerzej uznawany system mutacji wstecznych (rewersji) wymaga użycia haploidalnego szczepu XV 185-14C, posiadający nonsensowną mutację ochre ade 2-1, arg 4-17, lys 1-1 i trp 5-48, który może rewertować głównie przez mutacje zastępcze indukujące mutacje specyficzne co do miejsca lub mutacje supresora ochre. XV 185-14C posiada także marker his 1-7, niezmysłową mutację, która może rewertować głównie przez mutacje zewnątrz genowe, i marker hom 3-10 rewertowany przez mutageny powodujące zmianę fazy odczytu.
Wśród diploidalnych szczepów S. cerevisiae jedynym szeroko używanym szczepem jest D7, który jest homozygotyczny względem ilv 1-92.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Brak.
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ
Przygotowania
Roztwory testowanych substancji chemicznych i próbki kontrolne powinny być przygotowywane tuż przed testem, przy użyciu odpowiednich nośników. W przypadku związków organicznych, które nie są rozpuszczalne w wodzie, należy używać nie więcej niż 2-procentowych (objętościowo) roztworów rozpuszczalników organicznych, takich jak etanol, aceton, czy dimetylosulfotlenek (DMSO). Końcowe stężenie nośnika nie powinno znacząco wpływać na żywotność komórek i charakterystykę wzrostu.
Aktywacja metaboliczna
Komórki należy poddać oddziaływaniu testowych substancji chemicznych zarówno w przypadku obecności, jak i braku obecności właściwego egzogenicznego systemu aktywacji metabolicznej.
Najpowszechniej używanym systemem jest współczynnik uzupełniony postmitochondrialną frakcją z wątrób gryzoni wcześniej przebadanych enzymem wywołującym czynniki. Wykorzystanie innych gatunków, tkanek, postmitochondrialnych frakcji lub procedur również może być właściwe dla aktywacji matabolicznej.
Warunki badania
Szczepy testowe
Haploidalny szczep XV185-14C i diploidalny szczep D7 są najczęściej używanymi szczepami w badaniach mutacji genu. Inne szczepy również mogą być właściwe.
Pożywka do hodowli szczepu
Wykorzystuje się właściwe pożywki do hodowli szczepu celem ustalenia liczby komórek, które zachowały żywotność i komórek zmutowanych.
Stosowanie kontroli pozytywnej i negatywnej
Próbki kontrolne pozytywne, niepoddane działaniu substancji i z dodatkiem rozpuszczalnika, muszą być przygotowane jednocześnie. Odpowiednie substancje do kontroli pozytywnej powinny być użyte na zakończenie każdej mutacji.
Stężenie do celów ekspozycji
Należy użyć co najmniej pięć odpowiednio rozmieszczonych stężeń substancji testowej. W odniesieniu do substancji toksycznych, najwyższa wielkość testowego stężenia nie powinna obniżać liczby komórek, które zachowały żywotność poniżej poziomu 5-10%. Odpowiednio, należy zbadać substancje rozpuszczalne w wodzie do granicy ich rozpuszczalności, wykorzystując właściwe procedury. W odniesieniu do nietoksycznych substancji łatwo rozpuszczalnych w wodzie, najwyższe stężenie należy ustalić dla każdego przypadku oddzielnie.
Warunki inkubacji
Płytki inkubują się cztery do siedmiu dni w temperaturze 28-30 °C bez dostępu światła.
Częstotliwość mutacji samorzutnej.
Należy użyć subkultury z normalnym zakresem częstotliwości mutacji samorzutnej.
Liczba replikacji
Należy użyć co najmniej trzech szalek replikacji na dane stężenie dla oznaczenia prototrofów produkowanych przez mutację genu i żywotności komórki. W przypadku badań z wykorzystaniem znaczników takich jak horn 3-10 o niskim wskaźniku mutacji liczba szalek musi zostać powiększona w celu dostarczenia istotnych danych statystycznych.
Procedura
Badanie szczepów S. cerevisiae zazwyczaj przeprowadzane jest według procedury badania w środowisku płynnym włączając albo komórki stacjonarne albo wzrostowe. Badania wstępne należy przeprowadzić na komórkach wzrostowych: 1-5 × 107 komórek/ml jest poddanych ekspozycji na testową substancję chemiczną przez 18 godzin przy temperaturze 28-37 oC ze wstrząsaniem; podczas czynności badawczych, w odpowiednich przypadkach, dodawana jest odpowiednia ilość substancji systemu aktywacji metabolicznej. Na zakończenie badań komórki poddawane są odwirowaniu, oczyszczaniu i umieszczeniu na właściwej pożywce do hodowli szczepu. Po okresie inkubacji płytki poddawane są analizie w celu ustalenia ilości komórek, które zachowały żywotność i komórek wywołujących mutację genu. Jeżeli pierwsze badanie daje negatywny wynik, następne doświadczenie powinno być przeprowadzane z użyciem komórek znajdujących się w fazie stacjonarnej. Jeżeli pierwsze badanie daje wynik pozytywny, to potwierdzane jest następnym, niezależnym badaniem.
2. DANE
Dane należy przedstawić w formie tabeli, wskazując liczbę zliczonych kolonii, liczbę mutantów, liczbę komórek żywych i mutantów. Wszystkie wyniki należy potwierdzić w odpowiednim niezależnym badaniu. Dane należy ocenić za pomocą właściwych metod statystycznych.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:
- użyty szczep,
- warunki testu: komórki w fazie stacjonarnej bądź w fazie wzrostu, skład pożywki, temperatura i czas inkubacji, system aktywacji metabolicznej,
- warunki badania: wielkość stężenia substancji podczas ekspozycji na jej działanie, procedura i czas trwania badania, temperatura zastosowana do badania, pozytywne i negatywne kontrole,
- liczba zliczonych kolonii, liczba mutantów, liczba komórek żywych i mutantów, stosunek dawki do reakcji w odpowiednich przypadkach, dane oceny statystycznej,
- analiza wyników,
- interpretacja wyników.
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
4. ODNIESIENIA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
B16. BADANIE REKOMBINACJI GENETYCZNEJ - SACCHAROMYCES CEREVISIAE
1. METODA
1.1. WSTĘP
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
1.2. DEFINICJE
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Mitotyczna rekombinacja u Saccharomyces cerevisiae może być wykryta między genami (lub ogólnie między genem a jego centromerem) i wewnątrz genów. Ten pierwszy przypadek posiada nazwę "mitotyczne crossing-over " i generuje symetryczny produkt, podczas gdy drugi przypadek najczęściej generuje niesymetryczne produkty i posiada nazwę "konwersja genów". Zajście crossing-over jest widoczne dzięki wytwarzaniu się kolonii homozygot recesywnych, lub sektorów wytworzonych w szczepach heterozygotycznych, podczas gdy konwersja genów uwidacznia się przez wytworzenie prototroficznych rewertantów w auksotroficznych, heteroallelicznych szczepach posiadających dwa różne nieprawidłowe allele tego samego genu. Do detekcji mitotycznej konwersji genów najczęściej używa się szczepów D4 (heteroalleliczny pod względem ade 2 i trp 5), D7 (heteroalleliczny pod względem trp 5), BZ34 (heteroalleliczny pod względem arg 4) i JD1 (heteroalleliczny pod względem his 4 i trp 5). Mitotyczne crossing-over, którego skutkiem jest powstanie czerwonych i różowych sektorów komórek homozygotycznych, może być wykrywane przy użyciu szczepów D5 lub D7 (które również wskazują na mitotyczną konwersję genów i wsteczną mutację przy ilv 1-92). Obydwa szczepy są heteroalleliczne pod względem odpowiadających sobie alleli ade 2.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Brak.
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ
Przygotowania
Roztwory testowych substancji chemicznych i próbki kontrolne powinny być przygotowywane tuż przed badaniem, przy użyciu odpowiednich nośników. W przypadku związków organicznych, które nie są rozpuszczalne w wodzie, należy używać nie więcej niż 2 % (objętościowo) roztworów rozpuszczalników organicznych, takich jak etanol, aceton, czy dimetylosulfotlenek (DMSO). Końcowe stężenie nośnika nie powinno w sposób znaczący wpływać na żywotność komórek i charakterystykę wzrostu.
Aktywacja metaboliczna
Komórki należy poddać oddziaływaniu testowych substancji chemicznych zarówno w przypadku obecności, jak i braku obecności właściwego egzogenicznego systemu aktywacji metabolicznej. Najpowszechniej używanym systemem jest współczynnik uzupełniony postmitochondrialną frakcją z wątrób gryzoni wcześniej przebadanych enzymem wywołującym czynniki. Wykorzystanie innych gatunków, tkanek, postmitochondrialnych frakcji lub procedur również może być właściwe dla aktywacji metabolicznej.
Warunki badania
Badane szczepy
Najczęściej wykorzystywanymi szczepami są szczepy diploidalne D4, D5, D7 i JD1. Inne szczepy również mogą być właściwe.
Pożywka do hodowli szczepu
Wykorzystuje się właściwe pożywki do hodowli szczepu celem ustalenia liczby komórek pozostałych przy życiu i częstotliwości genetycznych rekombinacji.
Użycie kontroli pozytywnej i negatywnej
Próbki kontrolne pozytywne, niepoddane działaniu substancji i z dodatkiem rozpuszczalnika, muszą być przygotowane jednocześnie. Odpowiednie substancje do kontroli pozytywnej powinny być użyte na zakończenie każdej mutacji.
Stężenie ekspozycji
Należy użyć co najmniej pięć odpowiednio rozmieszczonych stężeń substancji testowej. Należy uwzględnić między innymi takie czynniki, jak cytotoksyczność i rozpuszczalność. Najniższe stężenie nie może wpływać na żywotność komórki. W odniesieniu do substancji toksycznych najwyższa wielkość badanego stężenia nie powinna obniżać liczby komórek, które zachowały żywotność poniżej poziomu 5-10 %. Odpowiednio, należy zbadać substancje rozpuszczalne w wodzie do granicy ich rozpuszczalności, wykorzystując właściwe procedury. W odniesieniu do nietoksycznych substancji łatwo rozpuszczalnych w wodzie najwyższe stężenie należy ustalić dla każdego przypadku oddzielnie.
Komórki mogą zostać poddane oddziaływaniu substancji testowej albo w fazie stacjonarnej, albo podczas wzrastania przez okres do 18 godzin. Jednakże, w przypadku długotrwałych badań, kultury należy poddać badaniu mikroskopowemu w celu wykrycia formacji zarodnika, którego obecność unieważnia badanie.
Warunki inkubacji
Płytki są inkubowane w ciemności od czterech do siedmiu dni w temperaturze 28-30 °C. Płytki użyte do oznaczenia czerwonych i różowych sektorów homozygot wytworzonych przez mitotyczny crossing-over powinny być przechowywane w lodówce (w temperaturze około 4 oC) przez dalsze 1-2 dni przed oznaczeniem wyników, aby umożliwić rozwój odpowiednich zabarwionych kolonii.
Częstotliwość samorzutnej rekombinacji genetycznej
Należy użyć subkultur z normalnym zakresem częstotliwości samorzutnej rekombinacji genetycznej.
Liczba replikacji
Powinny być użyte co najmniej trzy szalki na określone stężenie, w celu oznaczenia prototrofów wytworzonych za pomocą mitotycznej konwersji genów i w celu oznaczenia żywotności komórek. W przypadku oznaczania recesywnych homozygot wytworzonych przez mitotyczny crossing-over liczba płytek powinna być zwiększona, aby dostarczyć odpowiednią liczbę kolonii.
Procedura
Badanie szczepów S. cerevisiae zazwyczaj przeprowadzane jest według procedury badania w środowisku płynnym, włączając komórki stacjonarne albo wzrostowe. Początkowe badania należy przeprowadzić na komórkach wzrostowych: 1-5 × 107 komórek/ml jest poddanych ekspozycji na testową substancję chemiczną przez 18 godzin przy temperaturze 28-37 °C ze wstrząsaniem; w okresie trwania badań, w odpowiednich przypadkach, dodawana jest odpowiednia ilość systemu aktywacji metabolicznej.
Na zakończenie badań komórki poddawane są odwirowaniu, oczyszczaniu i umieszczane na właściwej pożywce do hodowli szczepu. Po okresie inkubacji płytki poddawane są analizie w celu ustalenia liczby komórek, które zachowały żywotność i komórek wywołujących mutację genu.
Jeżeli pierwsze badanie daje wynik negatywny, następne doświadczenie powinno być przeprowadzane z użyciem komórek znajdujących się w fazie stacjonarnej. Jeżeli pierwsze badanie daje wynik pozytywny, to potwierdzane jest następnym, niezależnym badaniem.
2. DANE
Dane powinny być przedstawione w formie tabeli, która wskazuje liczbę zliczonych kolonii, ilość rekombinantów, liczbę komórek żywych i częstotliwość wystąpienia rekombinacji. Wyniki powinny być potwierdzone niezależnym badaniem. Dane powinny być ocenione przy użyciu odpowiednich metod statystycznych.
Dane należy ocenić za pomocą właściwych metod statystycznych.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:
- użyty szczep,
- warunki badań: komórki fazy stacjonarnej lub wzrostowej, skład pożywki, temperatura i okres trwania inkubacji, system aktywacji metabolicznej,
- warunki badania: wielkość stężenia substancji, procedura i czas trwania badania, temperatura zastosowana do badania, pozytywne i negatywne grupy kontrolne,
- liczba zliczonych kolonii, liczba rekombinantów, liczba komórek żywych i częstotliwość wystąpienia rekombinacji, w odpowiednich przypadkach stosunek dawki do reakcji, dane analizy statystycznej,
- analiza wyników,
- interpretacja wyników.
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
4. ODNIESIENIA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
B17. MUTAGENNOŚĆ - BADANIE MUTACJI GENETYCZNEJ IN VITRO U SSAKÓW
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B18. USZKODZENIE I NAPRAWA DNA - NIEREGULARNA SYNTEZA DNA - KOMÓRKI SSAKÓW IN VITRO
1. METODA
1.1. WSTĘP
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
1.2. DEFINICJE
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Test niezaplanowanej syntezy DNA (UDS) mierzy syntezę DNA po wycięciu i usunięciu odcinka DNA zawierającego obszar uszkodzony przez czynniki chemiczne lub fizyczne. Ten test jest oparty na inkorporacji tymidyny znakowanej trytem (3H-TdR) do DNA komórek ssaków, które nie znajdują się w fazie S cyklu komórkowego. Przyjęcie 3H-TdR może być oznaczone metodą autoradiografii lub zliczania w ciekłym scyntylatorze (LSC) DNA badanych komórek. Komórki ssaków w kulturach, o ile nie są to pierwotne hepatocyty szczura, są poddawane działaniu czynników testowych z obecnością lub bez obecności egzogennych systemów aktywacji metabolicznej. UDS może być także wykonywany w systemach in vivo.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Brak.
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ
Przygotowania
Substancje testowe i próbki kontrolne bądź próbki odniesienia powinny być przygotowywane w pożywce wzrostowej, bądź rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich nośnikach, a następnie rozcieńczone w pożywce wzrostowej i użyte do oznaczenia. Końcowe stężenie nośnika nie powinno wpływać na żywotność komórki.
Kultury hepatocytów szczura, ludzkich limfocytów lub ustalonych linii komórkowych (np. ludzkich diploidalnych fibroblastów) mogą być użyte do oznaczeń.
Komórki należy poddać działaniu substancji testowej zarówno w obecności, jak i przy braku obecności właściwego systemu aktywacji metabolicznej.
Warunki badania
Liczba kultur
Konieczne jest wykorzystanie w każdym punkcie badania co najmniej dwóch kultur komórkowych do autoradiografii i sześciu kultur (lub mniej w przypadku naukowego uzasadnienia) dla określenia UDS za pomocą LSC.
Użycie negatywnych i pozytywnych grup kontrolnych
Do każdego badania należy włączyć równoległe pozytywne i negatywne grupy kontrolne (niezbadane i/lub którym podawano nośnik) przy obecności, jak i przy braku aktywacji metabolicznej.
Przykładami związków, które mogą być dodawane do próbek kontrolnych pozytywnych, mogą być 7, 12-dimetylobenzatracen (7,12-DMBA) lub 2-acetylaminofluoren (2-AAF). W przypadku ustalonych linii komórkowych 4-nitrochinolino-N-tlenek (4-NQO) jest przykładem związku mogącego stanowić pozytywną kontrolę zarówno dla autoradiografii, jak i oznaczeń LSC wykonywanych bez aktywacji metabolicznej komórek; N-dimetylonitrozamina jest przykładem związku dodawanego do próbek kontrolnych, kiedy używane są systemy aktywacji metabolizmu.
Stężenie w celu ekspozycji
Należy użyć wielu stężeń substancji testowej ponad zakres odpowiedni w celu określenia reakcji. Najwyższe stężenia powinny wywołać pewne objawy cytotoksyczności. Odpowiednio, substancje nierozpuszczalne w wodzie należy badać do granicy ich rozpuszczalności. Dla substancji nietoksycznych łatwo rozpuszczalnych w wodzie wyższe stężenie substancji testowej należy rozpatrywać dla każdego przypadku oddzielnie.
Komórki
W celu utrzymania kultury należy zastosować właściwą pożywkę, stężenie CO2, temperaturę oraz wilgotność. Ustalone linie komórkowe należy okresowo sprawdzać w celu wykrycia skażenia mikoplazmą.
Aktywacja metaboliczna
System aktywacji metabolicznej nie jest używany w przypadku pierwotnych kultur hepatocytów. Ustalone linie komórkowe i limfocyty poddane ekspozycji na substancję testową zarówno przy obecności, jak i przy braku odpowiedniego systemu aktywacji metabolizmu.
Procedura
Przygotowanie kultury
Ustalone linie komórkowe są tworzone z kultur zapasowych (np. przez trypsynizację bądź wytrząsanie), pasażowanych w odpowiedniej gęstości do naczyń i inkubowanych w temperaturze 37 oC.
Krótkoterminowe kultury hepatocytów szczura zakładane są przez umożliwienie hepatocytom świeżo rozdzielonym na właściwej pożywce, zagnieżdżenie się na powierzchni wzrostowej.
Kultury ludzkich limfocytów zakładane są za pomocą właściwych technik.
Poddanie kultur ekspozycji na substancję testową
Pierwotne hypocyty szczura
Świeżo izolowane hepatocyty szczura są przez odpowiedni czas poddawane działaniu substancji testowej w pożywce zawierającej 3H-TdR. Pod koniec tego okresu pożywka powinna zostać odsączona, a komórki przepłukane, przygotowane i wysuszone. Szkiełka powinny być zanurzone w emulsji autoradiograficznej (ewentualnie można użyć filmu), naświetlone, wywołane, wybarwione i zliczone.
Ustalone linie komórkowe i limfocytowe
Techniki autoradiograficzne: Kultury komórkowe są poddane ekspozycji na substancję testową przez odpowiedni okres czasu po zastosowaniu 3H-TdR. Czas trwania ekspozycji na działanie substancji zależy od charakteru substancji, aktywności systemów metabolizujących oraz rodzaju komórek. W celu wykrycia szczytu UDS należy dodać 3H-TdR równocześnie z substancją testową albo w przeciągu kilku minut po ekspozycji na substancje testową. Wybór między tymi dwiema procedurami będzie uwarunkowany ewentualnymi interakcjami między substancją testową a 3H-TdR. Aby odróżnić między UDS i semikonserwatywną replikacją DNA, to ostatnie powinno być zahamowane, na przykład przez użycie pożywki bez zawartości argininy, niewielkiej zawartości surowicy lub przez dodatek hydroksymocznika w pożywce.
Badanie UDS przy pomocy LSC: Przed zastosowaniem substancji testowej powinno zostać zablokowane wejście komórek w fazę S w taki sposób, jak opisano powyżej; komórki powinny być poddawane działaniu substancji testowych tak, jak opisano dla autoradiografii. Po zakończeniu okres inkubacji DNA należy wydobyć z komórek oraz należy ustalić ogólną zawartość DNA oraz stopień zawartości 3H-TdR.
Należy zauważyć, że - w przypadku użycia ludzkich limfocytów w powyższych technikach - wymagane jest wyeliminowanie półkonserwatywnej replikacji DNA w niestymulowanych kulturach.
Analiza
Oznaczenia autoradiograficzne
Przy oznaczaniu UDS w komórkach danej kultury jądra znajdujące się w fazie S nie są zliczane. Należy zliczyć, co najmniej 50 komórek na skupienie. Szkiełka powinny być opisywane przed zliczaniem. Kilka wyraźnie oddzielonych losowych pól powinno być policzonych na każdym szkiełku. Ilość 3H-TdR wbudowanego w cytoplazmę powinna być oznaczona przez liczenie trzech terenów o kształcie jądra w cytoplazmie każdej ze zliczanych komórek.
Oznaczenie LSC
Oznaczając LSC UDS, należy zastosować odpowiednią liczbę kultur do każdej wielkości stężenia.
Wszystkie wyniki należy potwierdzić niezależnie przeprowadzonym badaniem.
2. DANE
Dane należy przedstawić w formie tabeli.
2.1. USTALENIA AUTORADIOGRAFICZNE
Należy oddzielnie odnotować stopień zawartości 3H-TdR w cytoplazmie oraz liczbę ziaren wykrytą w jądrze komórki.
Średnia, mediana i tryb mogą być użyte, aby opisać dystrybucję i stopień wbudowania 3H-TdR do cytoplazmy i liczbę ziaren na jądro.
2.2. OZNACZENIE LSC
Dla oznaczenia LSC należy zgłaszać zawartość 3H-TdR jako dpm/ug DNA. Można zastosować średnią dpm/ug DNA z odchyleniem standardowym w celu opisania dystrybucji zawartości.
Dane należy ocenić za pomocą właściwych metod statystycznych.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:
- zastosowane komórki, gęstość oraz liczba pasaży trakcie badania, liczba kultur komórek,
- metody użyte w celu utrzymania kultury komórek, włączając pożywkę, temperaturę i stężenie CO2,
- substancja badana, nośnik, stężenia i racjonalna podstawa wyboru wielkości zastosowanych stężeń w próbie,
- szczegóły systemów aktywacji metabolicznej,
- zasady badania,
- pozytywne i negatywne grupy kontrolne,
- zastosowane techniki autoradiograficzne,
- procedury użyte w celu zablokowania wejścia komórek do fazy S,
- procedury zastosowane w celu wydobycia DNA oraz ustalenia ogólnej zawartości DNA w oznaczaniu LSC,
- stosunek dawki do reakcji, jeżeli to możliwe,
- analiza statystyczna,
- analiza wyników,
- interpretacja wyników.
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
4. ODNIESIENIA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
B19. TEST WYMIANY CHROMATYD SIOSTRZANYCH IN VITRO
1. METODA
1.1. WSTĘP
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
1.2. DEFINICJE
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Test wymiany chromatyd siostrzanych (SCE) jest krótkoterminowym badaniem mającym na celu wykrywanie wzajemnych wymian DNA między dwoma chromatydami siostrzanymi powielającego się chromosomu. SCE stanowi wymianę produktów replikacji DNA w pozornie homologicznych miejscach. Proces wymiany przypuszczalnie obejmuje rozerwanie i ponowne połączenie DNA, chociaż niewiele poznano na temat jego molekularnej podstawy. Wykrywanie SCE wymaga niektórych sposobów odmiennego etykietowania chromatyd siostrzanych, co można osiągnąć przez włączenie bromodeoksyurydyna (BrdU) do chromosomowego DNA dla dwóch cykli komórkowych.
Komórki ssaków in vitro poddane są ekspozycji na substancje testowe z użyciem lub bez użycia egzogennego systemu aktywacji metabolicznej, jeżeli jest to odpowiednia metoda i hodowane przez okres dwóch cykli replikacyjnych w pożywce zawierającej BrdU. Po dodaniu inhibitora hamującego tworzenie się wrzeciona kariokinetycznego (np. kolchicyny), umożliwiającego nagromadzenie się komórek w stadium mitozy podobnym do metafazy (metafaza c), komórki są zbierane i przygotowywane są preparaty chromosomów.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Brak.
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ Przygotowania:
- w teście mogą zostać wykorzystane pierwotne kultury, (ludzkie limfocyty) lub ustalone linie komórkowe (np. komórki jajnika chomika chińskiego). Linie komórkowe należy sprawdzić na skażenie mikoplazmą,
- należy zastosować właściwą pożywkę hodowlaną i warunki inkubacji (np. temperatura, zbiorniki hodowlane, stężenie CO2 i wilgotność),
- substancje testowe można przygotować na pożywce hodowlanej lub rozpuścić lub zawiesić w odpowiednich nośnikach przed poddaniem badaniu właściwych komórek. Stężenie końcowe nośnika w systemie hodowli nie powinno znacznie wpłynąć na żywotność komórki ani na tempo wzrostu oraz należy monitorować wpływ na częstotliwość SCE przez kontrolę somatyczną,
- komórki należy poddać działaniu substancji testowej zarówno w obecności, jak i braku obecności egzogenicznego systemu aktywacji metabolicznej ssaków. Alternatywnie, w przypadku użycia rodzaju komórek z wrodzonym systemem aktywności metabolicznej, tempo oraz charakter aktywności powinny być właściwe w odniesieniu z do badanej klasy chemicznej.
Warunki badania
Liczba kultur
Należy użyć co najmniej podwójne kultury dla każdego punktu badania.
Użycie negatywnych i pozytywnych grup kontrolnych
Pozytywne grupy kontrolne, używając zarówno bezpośrednio działającego związku, jak i związku wymagającego metabolicznej aktywacji, należy włączyć do każdego badania; należy uwzględnić również grupę kontrolną, której podawany jest nośnik.
Poniższe substancje są przykładami substancji, które mogą być użyte jako pozytywne grupy kontrolne:
- bezpośrednio działające związki:
- etylometanosulfonian,
- pośrednio działające związki:
- cyklofosfamid.
W odpowiednich przypadkach można włączyć dodatkową pozytywną grupę kontrolną tej samej klasy chemicznej co substancja chemiczna używana w badaniu.
Stężenia do celów ekspozycji
Należy użyć co najmniej trzy odpowiednio rozmieszczone substancje testowe. Najwyższe stężenie powinno wywołać znaczne objawy toksyczności, ale umożliwiać musi odpowiednią replikację komórki. Odpowiednio, substancje nierozpuszczalne w wodzie należy badać do granicy ich rozpuszczalności, wykorzystując właściwe procedury. Dla substancji nietoksycznych łatwo rozpuszczalnych w wodzie wyższe stężenie substancji testowej należy rozpatrywać dla każdego przypadku oddzielnie.
Procedura
Przygotowanie hodowli
Ustalone linie komórkowe są tworzone z kultur zapasowych (np. przez trypsynizację lub wytrząsanie), pasażowanych w odpowiedniej gęstości do naczyń i inkubowanych w temperaturze 37 oC. Dla kultur monowarstwowych ilość komórek na naczynie powinna być regulowana w ten sposób, że kultury stanowią niewiele więcej niż 50 % płynu w czasie zbierania komórek. Ewentualnie komórki mogą być użyte w kulturze zawieszonej. Kultury ludzkich limfocytów są zakładane z heparynizowanej krwi z użyciem odpowiednich technik i inkubowane w temperaturze 37 oC.
Poddanie działaniu substancji testowej
Komórki w fazie gwałtownego wzrostu poddawane są ekspozycji na substancję testową przez odpowiedni okres czasu; w większości wypadków wystarczy jedna lub dwie godziny w celu uzyskania pożądanych skutków, ale w niektórych przypadkach czas badania może być przedłużony do dwóch kompletnych cyklów komórkowych. Komórki nieposiadające odpowiedniego wrodzonego systemu aktywności metabolicznej należy poddać działaniu testowej substancji chemicznej w obecności lub braku obecności odpowiedniego systemu aktywności metabolicznej. Po zakończeniu okresu ekspozycji komórki są oczyszczane z substancji testowej i hodowane przez okres dwóch cykli replikacyjnych w obecności BrdU. Alternatywnie, komórki można poddać procedurze równoczesnej ekspozycji na substancję testową oraz BrdU przez całkowity okres hodowli dwóch cyklów komórkowych.
Kultury ludzkich limfocytów poddane są badaniu w chwili, gdy znajdują się w stadium półsynchronicznym.
Komórki analizowane są podczas ich drugiego podziału, po poddaniu działaniu substancji, co zapewnia, iż najbardziej wrażliwe fazy podziału komórki zostały poddane działaniu testowej substancji chemicznej. Wszystkie kultury, do których dodano BrdU, należy utrzymywać w środowisku braku światła lub świetle przyćmionym pochodzącym z żarówek, do chwili zbioru komórek w celu zminimalizowania fotolizy DNA zawierającego BrdU.
Zbieranie komórek
Kultury komórkowe poddawane są działaniu inhibitora (np. kolchiny) na godzinę do czterech godzin przed zbiorem. Każda kultura jest zbierana i przetwarzana oddzielnie w celu przygotowania chromosomów.
Przygotowanie chromosomu i barwienie
Przygotowanie chromosomu dokonywane jest za pomocą standardowych technik cytogenetycznych. Barwienie preparatów w celu wykazania SCE można przeprowadzić za pomocą kilku technik (np. metoda fluorescencyjna plus Giemsa).
Analiza
Liczba komórek przeznaczonych do analizy powinna być oparta o częstotliwość samorzutnej kontroli SCE. Zazwyczaj co najmniej 25 rozprzestrzeniających się metafaz na kulturę jest analizowanych pod względem SCE. Preparty są oznaczane przed rozpoczęciem analiz. W odniesieniu do ludzkich limfocytów jedynie metafazy zawierające 46 centromerów są poddawane analizie. W ustalonych liniach komórkowych jedynie metafazy zawierające ± 2 centromery liczby modalnej są poddawane analizie. Powinno zostać stwierdzone, czy centromeryczny przełącznik znacznika jest oznaczony jako SCE. Wszystkie wyniki należy potwierdzić niezależnie przeprowadzonym badaniem.
2. DANE
Dane należy przedstawić w formie tabeli. Liczba SCE dla każdej metafazy oraz liczba SCE na dany chromosom dla każdej metafazy powinna zostać oddzielnie wyszczególniona dla wszystkich kultur badanych i kontrolnych.
Dane należy oszacować za pomocą odpowiednich metod statystycznych.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:
- użyte komórki, metody utrzymywania kultur komórek,
- warunki badań: skład pożywki, stężenie CO2, stężenie substancji testowej, użyty nośnik, temperatura inkubacji, czas poddania działaniu substancji, użyty inhibitor, jego stężenie oraz czas trwania badania z jego użyciem, rodzaj użytego systemu metabolicznej aktywacji ssaków, pozytywne i negatywne grupy kontrolne,
- liczba kultur komórkowych w danym punkcie badania,
- szczegóły dotyczące techniki zastosowanej w celu przygotowania preparatu,
- liczba metafaz poddanych analizie (dane przedstawione oddzielnie dla każdej kultury),
- średnia liczba SCE w danej komórce i w danym chromosomie (dane przedstawione oddzielnie dla każdej kultury),
- kryteria obliczania SCE,
- racjonalna podstawa wyboru dawki,
- stosunek dawki do reakcji, w odpowiednich przypadkach,
- statystyczna analiza,
- analiza wyników,
- interpretacja wyników.
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
4. ODNIESIENIA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
B.20. BADANIA SPRZĘŻONYCH Z PŁCIĄ RECESYWNYCH CECH LETALNYCH UDROSOPHILA MELANOGASTER
1. METODA
1.1. WSTĘP
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
1.2. DEFINICJE
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Badanie sprzężonych z płcią recesywnych cech letalnych (SLRL) u Drosopbila melanogaster wykrywa istnienie mutacji, zarówno punktowych, jak i niewielkich delecji, w linii zarodkowej owada. Niniejsze badanie jest poprzedzone testem mutacji zdolnym zbadać około 800 miejsc na chromosomie X; stanowi to około 80 % wszystkich miejsc chromosomu X. Chromosom X stanowi około jednej piątej całego genomu haploidalnego.
Mutacje w chromosomie X u Drosophila melanogaster fenotypowo ujawniają się u samców przenoszących gen nurtujący. Kiedy mutacja jest letalna u homozygot, jej obecność można wnioskować na podstawie nieobecności jednej klasy męskiego potomstwa, podczas gdy heterozygotyczne samice normalnie wydają dwa rodzaje męskiego potomstwa. Badanie SLRL wykorzystuje te aspekty za pomocą specjalnie oznaczonych i ułożonych chromosomów.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Brak.
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ Przygotowania
Zasoby
Samce pochodzące z dobrze zdefiniowanych zasobów dzikiego typu i samice z zasobu Muller-5 mogą być używane. Inne odpowiednio oznaczone samice z wielokrotną inwersją chromosomu X także mogą być używane.
Substancja testowa
Substancje testowe powinny być rozpuszczone w wodzie. Substancje nierozpuszczalne w wodzie mogą być rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich nośnikach (np. mieszaninie etanolu i Tween-60 lub 80) i rozcieńczone w wodzie lub roztworze soli przed podaniem. Dimetylosulfoksyd nie powinien być używany jako nośnik.
Liczba zwierząt
Test powinien być zaprojektowany z ustalonymi z góry czułością i siłą. Częstotliwość samorzutnej mutacji obserwowana w odpowiedniej grupie kontrolnej w dużym stopniu wpłynie na liczbę badanych chromosomów, które należy poddać analizie.
Droga podawania substancji testowej
Poddanie działaniu substancji może odbywać się drogą pokarmową, przez wstrzyknięcie lub przez ekspozycję na gazy lub opary. Substancja testowa może być podawana w roztworze cukru. W przypadku gdy zaistnieje taka konieczność, substancje mogą zostać rozpuszczone w 0,7 % roztworze NaCl oraz wstrzyknięte do klatki piersiowej lub brzucha.
Użycie negatywnych i pozytywnych grup kontrolnych
Należy rozważyć użycie negatywnych (użycie nośnika) i pozytywnych grup kontrolnych. Jednakże w przypadku dostępności do odpowiednich laboratoryjnych danych bazowych nie jest wymagane wprowadzenie równoczesnych grup kontrolnych.
Poziomy dawek
Należy zastosować trzy poziomy dawek. W celu dokonania wstępnej analizy można zastosować jeden poziom dawki substancji testowej, której wielkość będzie oscylować na minimalnym tolerowanym poziomie stężenia lub poziomie stężenia wywołującym pewne objawów i toksyczności. Odnośnie do substancji nietoksycznych należy użyć maksymalną stosowaną wielkość stężenia substancji testowej.
Procedura
Dzikie samce (trzy lub pięciodniowe) poddawane są działaniu substancji testowej oraz indywidualnie używane do krycia dziewiczych samic pochodzących z zasobu Muller-5 lub innego właściwie oznaczonego zasobu (z wielokrotnymi odwróconymi chromosomami X). Samice zastępowane są nowymi dziewiczymi samicami co dwa lub trzy dni, w celu objęcia całego cyklu komórek zarodkowych. Potomstwo tych samic jest analizowane pod względem wystąpienia skutków śmiertelności odpowiadających wpływowi na dojrzałe plemniki, spermatydy średniego i późnego stadium, spermatydy wczesnego stadium, spermatocyty i spermatogonia w czasie poddania działaniu.
Heterozygotyczne samice F1 pochodzące z powyższych krzyżówek kryte są indywidualnie (tj. jedna samica na fiolkę) ich braćmi. W pokoleniu F2 każda kultura liczona jest pod względem braku dzikich samców. Jeżeli okaże się, iż kultura powstała od samic F1 przenoszących cechę śmiertelności w rodzicielskim chromosomie X (tj. nie zaobserwowano żadnych samców z badanym chromosomem), córki takich samic z tym samym genotypem należy zbadać w celu ustalenia, iż cecha śmiertelności jest powtarzana w następnym pokoleniu.
2. DANE
Dane należy przedstawić w formie tabeli w celu wykazania liczby zbadanych chromosomów X, liczby niepłodnych samców oraz liczby chromosomów z cechą letalną przy każdej wielkości stężenia oraz w każdym okresie krycia dla każdego samca poddanego działaniu substancji testowej. Należy odnotować liczbę klastrów różnego rozmiaru na danego samca. Niniejsze wyniki powinny zostać potwierdzone oddzielnym badaniem.
Odpowiednie metody statystyczne powinny być użyte w ocenie cech letalnych sprzężonych z płcią. Skupianie się recesywnych cech letalnych pochodzących od jednego samca powinno być wzięte pod uwagę i przeanalizowane przy pomocy odpowiedniej metody statystycznej.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:
- zasoby: zastosowane zasoby lub szczepy Drosophila, wiek owadów, liczba samców poddanych badaniu, liczba bezpłodnych samców, liczba ustalonych kultur F2, liczba kultur F2 bez potomstwa, liczba chromosomów przenoszących cechę letalną, wykrytą w każdej fazie komórki zarodkowej,
- kryteria dla określenia wielkości badanych grup,
- warunki badania: szczegółowy opis badania i zasada pobierania próbek, poziomy ekspozycji, dane dotyczące toksyczności, negatywne (rozpuszczalnik) i pozytywne grupy kontrolne, odpowiednio do potrzeb,
- kryteria służące ocenie mutacji letalnych,
- zależność między objawami a poziomem ekspozycji, jeżeli to możliwe,
- dane dotyczące analizy,
- analiza wyników,
- interpretacja wyników.
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
4. ODNIESIENIA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
B.21. BADANIE PRZEMIANY KOMÓRKOWEJ SSAKÓW IN VITRO
1. METODA
1.1. WSTĘP
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
1.2. DEFINICJE
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Systemy hodowli komórkowej ssaków mogą być zastosowane w celu wykrycia zmian fenotypowych in vitro wywołanych substancjami chemicznymi związanymi ze złośliwymi przemianami in vivo. Powszechnie używane komórki, takie jak C3H10TV2, 3T3, SHE, szczura Fischera i testowe polegają na ocenie zmian w morfologii komórki, formowania skupisk czy zależności od zakotwiczenia w półstałym agarze. Istnieją systemy rzadziej stosowane, które pozwalają wykryć inne zmiany fizjologiczne lub morfologiczne w komórkach w następstwie ekspozycji na substancję rakotwórczą. Żadne testy końcowe badania in vitro nie mają ustalonego bezpośredniego powiązania z nowotworem. Niektóre systemy badawcze są w stanie wykryć aktywatory guzów. Cytototoksyczność można ustalić przez określenie wpływu badanego materiału na zdolności formowania kolonii (wydajność klonowania) lub wskaźniki wzrostu kultury. Pomiar cytotoksyczności ma na celu ustalenie, że ekspozycja na działanie substancji testowej jest istotna pod względem toksykologicznym, ale nie może być wykorzystywana w celu obliczenia częstotliwości przemian we wszystkich próbach, ponieważ niektóre mogą obejmować długotrwałą inkubację i/lub pasażowanie.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE Brak.
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ
Przygotowania
Komórki
W zależności od stosowanego badania przemian dostępne są różne linie komórkowe lub komórki podstawowe. Badacz musi zapewnić, iż komórki wykorzystywane w przeprowadzanym badaniu wykazują właściwe zmiany fenotypowe w następstwie poddania działaniu znanym czynnikom rakotwórczym oraz że badanie, przeprowadzane w laboratorium badacza, jest potwierdzone i posiada udokumentowaną wiarygodność.
Pożywka kultur
Należy zastosować pożywkę oraz warunki doświadczalne właściwe dla prób przemiany komórkowej.
Substancja testowa
Substancja testowa może zostać przygotowana na pożywce hodowlanej lub rozpuszczona lub zawieszona we właściwych nośnikach przed rozpoczęciem badania komórek. Stężenie końcowe nośnika w systemie hodowli nie powinno wpływać na żywotność komórki, tempo wzrostu ani na częstotliwość przemian.
Aktywacja metaboliczna
Komórki należy poddać działaniu substancji testowej zarówno w obecności jak i przy braku obecności właściwego systemu aktywacji metabolicznej. Alternatywnie, w przypadku użycia rodzaju komórek z wrodzoną aktywacją metaboliczną, wskaźnik charakteru aktywności powinien być znany, aby był właściwy dla badanej klasy chemicznej.
Warunki badania
Użycie negatywnych i pozytywnych grup kontrolnych
Pozytywne grupy kontrolne, używając zarówno bezpośrednio działającego związku, jak i związku wymagającego metabolicznej aktywacji, należy włączyć do każdego badania; należy uwzględnić również negatywną grupę kontrolną, której podawany jest nośnik.
Poniższe substancje są przykładami substancji, które mogą być użyte jako pozytywne grupy kontrolne:
- związki działające bezpośrednio:
- etylometanosulfonian,
- ß-propiolakton,
- związki wymagające aktywacji metabolicznej:
- acetylaminofluoren,
- 4-dimetyloaminoazobenzen,
- 7,12-dimetylobenzantracen.
W odpowiednich przypadkach można włączyć dodatkową pozytywną grupę kontrolną tej samej klasy chemicznej co związek używany w badaniu.
Stężenia oddziałującej substancji
Należy użyć kilka stężeń substancji testowej. Niniejsze stężenia powinny wywołać objawy toksyczności z nimi związane, przy najwyższym stężeniu powodować niski poziom komórek pozostałych przy życiu oraz poziom żywotności komórek przy najniższym stężeniu, oscylujący w przybliżeniu na tym samym poziomie, co przy stężeniu użytym w negatywnej grupie kontrolnej. Odpowiednio, substancje nierozpuszczalne w wodzie należy badać do granicy ich rozpuszczalności, wykorzystując właściwe procedury. Dla substancji nietoksycznych łatwo rozpuszczalnych w wodzie wyższe stężenie substancji testowej należy rozpatrywać dla każdego przypadku oddzielnie.
Procedura
Komórki należy poddać działaniu substancji przez określony okres czasu, w zależności od stosowanego systemu badań, może to dotyczyć ponownego dawkowania wraz ze zmianą pożywki do hodowli (i w miarę potrzeby, świeżą mieszaninę aktywacji metabolicznej) w przypadku długotrwałej ekspozycji na działanie substancji testowej. Komórki nieposiadające odpowiedniej wrodzonej aktywności metabolicznej należy poddać ekspozycji na substancję testową w obecności i bez obecności właściwego systemu aktywności metabolicznej. Pod koniec okresu ekspozycji komórki są przepłukiwane w celu usunięcia substancji testowej i hodowane w warunkach odpowiednich dla monitorowania momentu pojawienia się zmienionego fenotypu i zasięgu transformacji. Wszelkie wyniki potwierdzane są niezależnym badaniem.
2. DANE
Dane powinny być opracowane w formie tabeli i mogą wymagać uwzględnienia różnorodności form zgodnie z metodą oznaczenia, która została użyta, np. zliczanie płytek, płytki pozytywne bądź ilość stransformowa-nych komórek. Jeżeli jest to odpowiednia metoda, ilość komórek, które przeżyły, powinna być wyrażona jako procent poziomu kontroli i częstotliwości występowania ekspresji wyrażonej jako stosunek ilości komórek stransformowanych do komórek, które przeżyły ekspozycję. Dane należy przeanalizować za pomocą właściwych metod statystycznych.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:
- rodzaj użytej komórki, liczba kultur komórkowych, metody utrzymania kultur komórkowych,
- warunki badania: stężenie substancji, użyty nośnik, czas inkubacji, czas trwania oraz częstotliwość badania, gęstość komórkowa podczas badania, rodzaj użytego egzogenicznego systemu aktywacji metabolicznej, pozytywne i negatywne grupy kontrolne, specyfikacja kontrolowanego fenotypu, zastosowany system wyboru (odpowiednio do potrzeb), racjonalna podstawa wyboru dawkowania,
- metody stosowane do liczenia żywych i zmienionych komórek,
- statystyczna analiza,
- analiza wyników,
- interpretacja wyników.
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
4. ODNIESIENIA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
B.22. BADANIE DOMINUJĄCEGO GENU LETALNEGO GRYZONIA
Skreślono tę metodę badania, ponieważ nie jest już uznawana za odpowiednią do generowania informacji na temat właściwości toksykologicznych substancji chemicznych do celów rozporządzenia (WE) nr 1907/2006. Metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.23. BADANIE ABERRACJI CHROMOSOMOWEJ SPERMATOGONIOW U SSAKÓW
1. METODA
Metoda ta jest powtórzeniem OECD TG 483, badania aberracji chromosomowej spermatogoniów u ssaków (1997).
1.1. WPROWADZENIE
Celem badania aberracji chromosomowej spermatogoniów u ssaków in vivo jest zidentyfikowanie substancji, które powodują strukturalne aberracje chromosomowe w spermatogoniach ssaków (1)(2)(3)(4)(5). Strukturalne aberracje mogą występować w dwóch typach, chromosomowym lub chromatydowym. W przypadku mutagenów chemicznych większość wywołanych aberracji jest typu chromatydowego, ale mogą pojawiać się aberracje typu chromosomowego. Metoda ta jest przeznaczona do pomiaru aberracji liczbowych oraz nie jest rutynowo wykorzystywana do tego celu. Mutacje chromosomowe oraz powiązane z nimi zdarzenia są przyczyną wielu ludzkich chorób genetycznych.
Badanie to dokonuje pomiaru zdarzeń chromosomowych w komórkach zarodków oraz z tego względu podejrzewa się, iż przewiduje wprowadzenie dziedzicznych mutacji w komórkach zarodków.
Zazwyczaj w tym badaniu wykorzystywane są gryzonie. Niniejsze badanie cytogenetyczne in vivo wykrywa aberracje chromosomowe podczas mitotycznego podziału spermatogoniów. Inne komórki docelowe nie podlegają tej metodzie.
W celu wykrycia aberracji typu chromatydowego w spermatogoniach pierwszy podział komórki mitotycznej następujący po poddaniu działaniu substancji powinien zostać zbadany, zanim te zmiany patologiczne są zgubione w toku dalszych podziałów komórkowych. Dalsze informacje ze spermatogoniów macierzystych mogą być uzyskane w drodze mejotycznej analizy w odniesieniu do aberracji typu chromosomowego w metafazie diakinezy jeżeli komórki poddane działaniu substancji stają się spermatocytami.
Niniejsze badanie in vivo przeznaczone jest do zbadania, czy mutageny komórek somatycznych są również czynne w komórkach zarodników. Dodatkowo badanie spermatogoniów jest właściwe do celów oceny zagrożenia mutagenności, w związku z czym pozwala na uwzględnienie czynników metabolizmu in vivo, farmakokinetyków oraz procesów naprawy DNA.
Pewna ilość generacji spermatogoniów jest obecna w badaniu z widmem czułości na przetwarzanie chemiczne. Zatem wykryte aberracje przedstawiają zagregowaną reakcję poddanych działaniu substancji populacji spermatogoniów z większą ilością zróżnicowanych spermatogoniów przeważających. W zależności od ich pozycji w jądrze różne generacje spermatogoniów mogą być narażone na ogólny obieg, ze względu na barierę komórek Sertoli oraz barierę krew-jądro.
Jeżeli istnieją dowody na to, że substancja lub odpowiedni metabolit oddziałujący nie dotrze do komórki docelowej, właściwe jest wykorzystanie tego badania.
Zob. także Ogólne wprowadzenie do części B.
1.2. DEFINICJE
Aberracja typu chromatydowego: strukturalne uszkodzenie chromosomu, wyrażone jako pękanie pojedynczych chromatydów lub pękanie oraz ponowne łączenie między chromatydami.
Aberracja typu chromosomowego: strukturalne uszkodzenie chromosomu, wyrażone jako pękanie pojedynczych chromatydów lub pękanie oraz ponowne łączenie obu chromatydów w identycznej lokalizacji.
Szczelina: achromatyczne uszkodzenie mniejsze niż szerokość chromatydu, powodujące minimalne wypaczeniu chromatydu.
Aberracja liczbowa: zmiana w liczbie chromosomów w odniesieniu do normalnej liczby charakterystycznej dla wykorzystywanych komórek.
Poliploidalność: wielokrotność liczby chromosomów haploidalnych (n) inna niż liczba diploidalna (np. 3n, 4n itd.).
Aberracja strukturalna: zmiana w strukturze chromosomu, wykrywalna przez badanie mikroskopowe etapu metafazy podziału komórek, zaobserwowana jako usunięcia oraz fragmenty, zmiany (zachodzące - wewnątrz oraz między chromosomami).
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Zwierzęta są poddane działaniu substancji badanej odpowiednią drogą poddania działaniu substancji oraz są uśmiercane w odpowiednim czasie po poddaniu ich działaniu substancji badanej. Przed uśmierceniem zwierzęta są poddawane działaniu substancji zatrzymującej metafazę (np. kolchicyna lub Colcemid®). Preparaty chromosomowe są sporządzane z komórek zarodników oraz barwione, a komórki metafazy są analizowane pod kątem aberracji chromosomowych.
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.4.1. Preparaty
1.4.1.1. Wybór gatunków zwierząt
Powszechnie wykorzystywane są samce chomika chińskiego oraz myszy. Jednakże mogą być wykorzystane w badaniu samce innych odpowiednich gatunków saków. Powszechnie wykorzystywane szczepy laboratoryjne młodych, zdrowych, dojrzałych zwierząt powinny zostać wykorzystane. W trakcie przeprowadzania badania różnice w masie ciała zwierząt powinny być minimalne oraz nie powinny przekraczać ± 20 % średniej masy.
1.4.1.2. Warunki przetrzymywania i karmienia
Ogólne warunki określone w Ogólnym wprowadzeniu do części B są stosowane, chociaż celem w odniesieniu do wilgotności powinien być poziom 50-60 %.
1.4.1.3. Preparaty zwierzęce
Zdrowe, młode, dojrzałe samce są losowo przypisywane do grup kontrolnych oraz grup poddawanych działaniu substancji badanej. Klatki powinny być urządzone w taki sposób, aby możliwe skutki negatywne wynikające z umieszczenia w klatce były zminimalizowane. Zwierzęta są identyfikowane w niepowtarzalny sposób. Zwierzęta są aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przez przynajmniej pięć dni przed rozpoczęciem badania.
1.4.1.4. Przygotowanie dawek
Substancje badane stałe powinny zostać rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach oraz rozcieńczone, jeżeli stosowne, przed dawkowaniem zwierzętom. Substancje badane płynne mogą być dawkowane bezpośrednio lub mogą zostać rozpuszczone przed dawkowaniem. Powinny zostać wykorzystane świeżo przygotowywane substancje, chyba że dane dotyczące stabilności wskazują iż dopuszczalne jest składowanie substancji.
1.4.2. Warunki badawcze
1.4.2.1 Rozpuszczalnik/nośnik
Rozpuszczalnik/nośnik nie powinien wywoływać skutków toksycznych przy wykorzystywanych dawkach oraz nie powinien mieć możliwości reagowania chemicznego z substancją badaną. Jeśli wykorzystywane są inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/nośniki, ich włączenie do doświadczenia powinno być wsparte danymi wskazującymi ich zgodność. Zaleca się, o ile to możliwe, aby w pierwszej kolejności rozważone zostało wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/nośników.
1.4.2.2. Kontrole
Równoległe pozytywne i negatywne (rozpuszczalnik/nośnik) kontrole powinny zostać objęte każdym badaniem. Z wyjątkiem poddawania działaniu substancji badanej, zwierzęta w grupie kontrolnej powinny być przedmiotem identycznych działań w porównaniu ze zwierzętami w grupie poddanej działaniu substancji.
Kontrole pozytywne powinny wywoływać strukturalne aberracje w spermatogoniach, jeżeli są podawane na poziomie poddania działaniu substancji, w odniesieniu do którego oczekuje się wykrywalnego wzrostu powyżej tło.
Dawki kontroli pozytywnych powinny zostać dobrane tak, aby wyniki były jasne, ale nie ujawniały bezpośrednio tożsamości zakodowanych szkiełek mikroskopowych badającemu. Dopuszczalne jest, aby pozytywne kontrole podawane były inną drogą niż substancje badane oraz aby ich próbki pobierane były tylko jeden raz. Wykorzystanie substancji chemicznych kontroli pozytywnych powiązanych z klasą chemiczną może być brane pod uwagę, jeżeli są one dostępne. Przykłady substancji pozytywnych kontroli obejmują:
| Substancja | Nr CAS | Nr Einecs |
| Cyklofosfamid Cyklophosfamid monohydrat | 50-18-0 6055-19-2 | 200-015-4 |
| Cykloheksyloamina | 108-91-8 | 203-629-0 |
| Mitomycyna C | 50-07-7 | 200-008-6 |
| Krylamid monomeryczny | 79-06-1 | 201-173-7 |
| Trietylenomelamina | 51-18-3 | 200-083-5 |
Negatywne kontrole, poddane działaniu rozpuszczalnika lub nośnika oraz w innym przypadku poddane działaniu w ten sam sposób co grupy poddane działaniu substancji, powinny zostać objęte badaniem w odniesieniu do każdego pobierania próbek, chyba że dopuszczalna jest wewnątrz zwierzęca zdolność do życia oraz częstotliwości komórek z aberracjami chromosomowymi są wykazane przez dane historyczne. Dodatkowo, powinny zostać również wykorzystane kontrole bez poddawania działaniu substancji, chyba że istnieją historyczne lub opublikowane dane wykazujące, że przez wybrany rozpuszczalnik/nośnik nie są wywoływane żadne szkodliwe lub mutagenne skutki.
1.5. PROCEDURA
1.5.1. Liczba zwierząt
Każda grupa poddana działaniu substancji oraz grupa kontrolna musi obejmować przynajmniej pięć nadających się do analizy samców.
1.5.2. Harmonogram poddania działaniu substancji
Substancje badane są zazwyczaj podawane raz lub dwa razy (np. jako pojedyncza dawka lub jako dwa zabiegi poddawania działaniu substancji). Substancje badane mogą być również podawane jako dawka podzielona, np. dwa zabiegi poddania działaniu substancji tego samego dnia w odstępie czasu nie większym niż kilka godzin, w celu ułatwienia podawania dużych objętości substancji. Inne reżimy dawki powinny być naukowo uzasadnione.
W grupie najwyższej dawki wykorzystywane są dwa okresy pobierania próbek po poddaniu działaniu substancji badanej. Ze względu na to, że na kinetykę komórkową może mieć wpływ substancja badana, wykorzystywany jest jeden wczesny oraz jeden późny okres pobierania próbek w około 24-48 godzin po poddaniu działania substancji badanej. W odniesieniu do dawek innych niż dawka najwyższa powinien zostać uwzględniony 24-godzinny okres pobierania próbek lub 1,5 długości trwania cyklu komórkowego, chyba że w odniesieniu do innych okresów pobierania próbek uważa się, iż są one odpowiednie dla wykrycia skutków (6).
Dodatkowo mogą zostać wykorzystane inne okresy pobierania próbek. Na przykład w przypadku substancji chemicznych, które mogą wywoływać aberracje opóźnione lub mogą wywierać skutki niezależne od S, odpowiednie mogą być wcześniejsze okresy pobierania próbek (1).
Odpowiedniość powtarzanych harmonogramów poddawania działaniu substancji musi zostać zidentyfikowana na zasadzie jednostkowych przypadków. Po powtarzanym zabiegu - poddania działaniu substancji - zwierzę powinno następnie zostać uśmiercone w 24 godziny (1,5 długości cyklu komórkowego) po ostatnim zabiegu poddania działaniu substancji. Dodatkowe okresy pobierania próbek mogą zostać wykorzystane w przypadku, gdy jest to stosowne.
Przed uśmierceniem zwierzętom wstrzykuje się wewnątrzotrzewnowo odpowiednią dawkę substancji zatrzymującej metafazę (np. Colcemid® lub kolchicynę). Następnie pobiera się próbkę ze zwierząt w odpowiednich odstępach czasu. W odniesieniu do myszy ten odstęp czasu wynosi 3-5 godzin, w odniesieniu do chomików chińskich ten odstęp czasu wynosi w przybliżeniu 4-5 godzin.
1.5.3. Poziomy dawek
Jeżeli przeprowadzane jest badanie ustalające dawkę, ponieważ nie istnieją dostępne odpowiednie dane, powinno zostać ono przeprowadzone w tym samym laboratorium, wykorzystując ten sam reżim gatunku, szczepu oraz poddania działaniu substancji, który ma zostać wykorzystany w badaniu głównym (7). Jeżeli istnieje toksyczność, wykorzystywane są trzy poziomy dawek w odniesieniu do pierwszego okresu pobierania próbek. Te poziomy dawek powinny obejmować zakres od maksymalnej do małej toksyczności lub do jej braku. W czasie późniejszego okresu pobierania próbek muszą zostać wykorzystane jedynie najwyższe dawki. Najwyższa dawka określana jest jako dawka wywołująca oznaki toksyczności, tak że wyższe dawki oparte na tym samym reżimie dawkowania mogłyby wywołać śmiertelność.
Substancje o szczególnej aktywności biologicznej przy niskotoksycznych dawkach (takie jak hormony oraz mitogeny) mogą stanowić wyjątki w odniesieniu do kryteriów ustalania dawek oraz powinny być oceniane na zasadzie jednostkowych przypadków. Najwyższa dawka może być również określona jako dawka wytwarzająca niektóre wskazania toksyczności w spermatogoniach (np. zmniejszenie wskaźnika mitotycznego podziału spermatogoniów do pierwszej oraz drugiej fazy mejotycznej; redukcja ta nie powinna przekroczyć 50 %).
1.5.4. Badanie ograniczone
Jeżeli badanie w oparciu o jeden poziom dawek w odniesieniu do zwierząt o przynajmniej 2.000 mg/kg masy ciała, wykorzystujące pojedyncze poddanie działaniu substancji lub dwa zabiegi poddania działaniu substancji tego samego dnia, nie daje dostrzegalnych skutków toksycznych oraz jeżeli nie podejrzewa się genotoksyczności w oparciu o dane dotyczące substancji powiązanych strukturalnie, wówczas przeprowadzenie pełnego badania może nie być konieczne. Spodziewane poddanie człowieka działaniu substancji może wykazać potrzebę wykorzystania większej dawki w badaniu ograniczonym.
1.5.5. Dawkowanie
Badana substancja jest zazwyczaj podawana przez zgłębnik żołądkowy lub odpowiednią rurkę intubacyjną, lub przez wstrzyknięcie wewnątrzotrzewnowe. Mogą być dopuszczalne inne drogi poddania działaniu substancji, w przypadku gdy mogą być uzasadnione. Maksymalna objętość płynu, jaka może być podana przez zgłębnik lub wstrzyknięcie jednorazowo zależy od wielkości badanego zwierzęcia. Objętość nie powinna przekraczać 2 ml/100 kg masy ciała. Wykorzystanie pojemności wyższych niż te musi być uzasadnione. Z wyjątkiem substancji podrażniających lub żrących, które będą w normalnych warunkach ujawniać pogorszone skutki z większymi stężeniami, zmienność w badanej objętości powinna zostać zminimalizowana przez dostosowanie stężenia w celu zapewnienia stałej objętości przy wszystkich poziomach dawek.
1.5.6. Przygotowanie chromosomów
Bezpośrednio po uśmierceniu zawiesiny komórkowe uzyskiwane są z jednego lub obu badań, poddanego działaniu roztworu hipotonicznego oraz stabilizowane. Następnie komórki są rozprowadzane na szkiełkach mikroskopowych oraz barwione.
1.5.7. Analiza
W odniesieniu do każdego zwierzęcia powinno zostać poddane analizie przynajmniej 100 dobrze rozprowadzonych metafaz (np. minimum 500 metafaz na grupę). Liczba ta może zostać zmniejszona, jeżeli zaobserwowane są duże liczby aberracji. Wszystkie szkiełka mikroskopowe, włącznie z tymi z pozytywnych i negatywnych kontroli, powinny być niezależnie kodowane przed przeprowadzeniem analizy mikroskopowej. Ze względu na to, że skutkiem procedur stabilizacji często jest zerwanie proporcji udziału metafaz ze stratą chromosomów, komórki oceniane powinny zawierać liczbę centromerów równą 2n ± 2.
2. DANE
2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW
Dane dotyczące poszczególnych zwierząt powinny zostać przedstawione w formie tabelarycznej. Jednostką doświadczalną jest zwierzę. W odniesieniu do każdego zwierzęcia liczba komórek z aberracjami chromosomowymi oraz liczba aberracji przypadających na komórkę powinny zostać ocenione. Różne typy strukturalnej aberracji chromosomowej powinny być wymienione wraz z ich ilościami oraz częstotliwościami w odniesieniu do grupy poddanej działaniu substancji oraz grupy kontrolnej. Szczeliny są oddzielnie odnotowywane oraz zgłaszane, ale ogólnie nie są włączane do częstotliwości aberracji ogółem.
Jeżeli obserwuje się zarówno mitozę, jak i mejozę, powinien zostać oznaczony wskaźnik podziału mitotycznego spermatogoniów w odniesieniu do pierwszej i drugiej metafazy majotycznej, jako miara cytotoksyczności dla wszystkich poddanych działaniu substancji oraz zwierząt poddanych kontroli negatywnej w całkowitej próbce 100 dzielących się komórek na zwierzę, w celu ustalenia możliwego skutku cytotoksycznego. Jeżeli zaobserwowana jest jedynie mitoza, wskaźnik mitozy powinien zostać oznaczony w przynajmniej 1.000 komórek przypadających na zwierzę.
2.2. OCENA ORAZ INTERPRETACJA WYNIKÓW
Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak związany z dawką wzrost względnej ilości komórek z aberracjami chromosomowymi lub wyraźny wzrost w ilości komórek z aberracjami w pojedynczej dawce przy jednym pobieraniu próbek. Biologiczne znaczenie wyników powinno zostać wzięte pod uwagę w pierwszej kolejności. Metody statystyczne mogą zostać wykorzystane jako metody pomocnicze w przeprowadzaniu oceny wyników (8). Jednakże znaczenie statystyczne nie powinno być jedynym czynnikiem określającym w odniesieniu do reakcji pozytywnej. Wyniki niejednoznaczne powinny zostać wyjaśnione przez dalsze badanie, w szczególności wykorzystując modyfikację warunków doświadczalnych.
Substancja badana, w odniesieniu do której wyniki nie spełniają powyższych kryteriów, uważana jest za niemutagenną w tym badaniu.
Chociaż większość doświadczeń będzie dawała w jasny sposób pozytywne lub negatywne wyniki, w rzadkich przypadkach zestaw danych będzie wykluczał dokonanie ostatecznej oceny dotyczącej aktywności badanej substancji. Wyniki mogą pozostać niejednoznaczne lub sporne niezależnie od liczby powtórzonych doświadczeń.
Wyniki pozytywne z badania aberracji chromosomowych spermatogoniów in vivo wskazują, że substancja badana wywołuje aberracje chromosomowe w komórkach zarodków badanych gatunków. Wyniki negatywne wskazują, że w warunkach badawczych substancja badana nie jest mutagenna w badanym gatunku.
Prawdopodobieństwo, że substancja badana lub jej metabolity docierają do tkanki docelowej, powinno zostać omówione.
3. SPRAWOZDAWCZOŚĆ
SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
Rozpuszczalnik/nośnik:
- uzasadnienie wyboru nośnika,
- rozpuszczalność oraz stabilność substancji w rozpuszczalniku/nośniku, jeżeli jest znana. Badane zwierzęta:
- wykorzystane gatunki/szczepy
- liczba oraz wiek zwierząt,
- źródło, warunki przetrzymywania, odżywianie itd.,
- indywidualna masa ciała zwierzęcia na początku badania, w tym zakres masy ciała, średnie oraz stan dardowe odstępstwa w odniesieniu do każdej z grup.
Warunki badania:
- dane dotyczące studium określającego zakres badania, jeżeli zostało przeprowadzone,
- racjonalne uzasadnienie wyboru poziomu dawek,
- racjonalne uzasadnienie wyboru drogi podawania substancji,
- szczegóły dotyczące substancji badanej,
- szczegóły dotyczące podawania substancji badanej,
- racjonalne uzasadnienie czasów uśmiercania,
- zmiana stężenia substancji badanej w odżywianiu/wodzie pitnej (ppm) na rzeczywistą dawkę (mg/kg masy ciała/dzień), jeżeli ma zastosowanie,
- szczegóły dotyczące jakości wody oraz żywności,
- szczegółowy opis poddania działaniu substancji oraz harmonogramów pobierania próbek,
- metody pomiaru toksyczności,
- tożsamość substancji zatrzymującej metafazę, jej stężenie oraz czas trwania poddania działaniu substancji,
- metody przygotowania szkiełek mikroskopowych,
- kryteria w odniesieniu do aberracji oceniających,
- liczba poddanych analizie komórek przypadających na zwierzę,
- kryteria uznawania badania za pozytywne, negatywne lub niejednoznaczne. Wyniki:
- oznaki toksyczności,
- indeks mitotyczny,
- stosunek podziału mitotycznego spermatogoniów w odniesieniu do pierwszej i drugiej metafazy mejotycznej,
- typ oraz liczba aberracji, podany oddzielnie dla każdego zwierzęcia,
- całkowita liczba aberracji przypadająca na grupę,
- liczba komórek z aberracjami przypadająca na grupę,
- relacja miedzy dawką a reakcją, w miarę możliwości,
- analizy statystyczne, jeżeli istnieją,
- dane dotyczące równoległych kontroli negatywnych,
- dane dotyczące historycznych kontroli negatywnych i pozytywnych, rozpuszczalnik/nośnik), wraz z zakresami, średnimi oraz standardowymi odchyleniami,
- dane dotyczące równoległych kontroli pozytywnych,
- zmiany w poliploidalności, jeżeli je dostrzeżono. Omówienie wyników.
Wnioski.
4. ODNIESIENIA
(1) Adler, I. D., (1986), Clastogenic Potential in Mouse Spermatogonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Specifications, w: Genetic Toxicology of Environmental Chemicals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, C, Lambert, B. and Magnusson, J. (eds) Liss, New York, pp. 477-484.
(2) Adler, I. D., (1984), Cytogenetic tests in Mammals, w: Mutagenicity Testing: a Practical Approach, (ed.) S. Venitt and J. M. Parry, IRL Press, Oxford, Washington DC, pp. 275-306.
(3) Evans, E. P., Breckon, G. and Ford, C. E. (1964), An Air-drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Testes, Cytogenetics and Cell Genetics, 3, pp. 289-294.
(1) (4) Richold, M, Ashby J., Chandley A., Gatehouse, D. G. and Henderson, L. (1990), In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 115-141.
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y. (1978), A New Method for Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes, Mutation Res., 52, pp. 207-209.
(6) Adler, I. D., Shelby M. D., Bootman,J., Favor,J., Generoso, W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N. (1994), International Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mammalian Germ Cell Tests, Mutation Res., 312, pp. 313-318.
(7) Fielder, R. J., Allen, J. A., Boobis, A. R, Botham, P. A., Doe, J., Esdaile, D. J., Gatehouse, D. G., Hodson-Walker, G., Morton, D. B., Kirkland, D. J. and Richold, M. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group: Dose setting in Invivo Mutagenicity Assays, Mutagenesis, 7, pp. 313-319.
(8) Lovell, D. P, Anderson, D., Albanese, R, Amphlett, G. E., Clarc, G., Ferguson, R, Richold, M., Pap-worth, D. G. and Savage J. R. K. (1989), Statistical Analysis of In vivo Cytogenetic Assays, in: D. J. Kirkland (ed.), Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, pp. 184-232.
B.24. TEST PLAMKOWY U MYSZY
1. METODA
1.1. WSTĘP
Zob. Wprowadzenie ogólne część E.
1.2. DEFINICJE
Zob. Wprowadzenie ogólne część E.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Niniejszy test jest testem in vivo u myszy, u których rozwijające się zarodki eksponowane są na działanie substancji chemicznych. Komórkami docelowymi u rozwijających się zarodków są melanoblasty a docelowe geny są genami, które kontrolują pigmentację sierści. Rozwijające się zarodki są heterozygotyczne dla wielu takich genów odpowiedzialnych za kolor sierści. Mutacja wewnątrz lub strata (przez różnorodne procesy) allelu dominującego takiego genu w melanoblaście prowadzi do ekspresji fenotypu recesywnego w komórkach potomnych, ujawniając się w postaci plamki o zmienionym kolorze na futrze myszy. Liczona jest liczba potomstwa z takimi plamkami, mutacjami, a ich częstotliwość porównywana jest z potomstwem wywodzącym się od zarodków poddanych jedynie działaniu rozpuszczalnika. Test plamkowy u myszy wykrywa domniemane somatyczne mutacje w komórkach płodów.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE
Brak.
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ
Przygotowania
Jeżeli to możliwe, substancje testowe rozpuszczane są lub zawieszane w izotonicznym roztworze soli. Substancje chemiczne nierozpuszczalne w wodzie są rozpuszczane lub zawieszane we właściwych nośnikach. Zastosowany nośnik nie powinien ani kolidować z testową substancją chemiczną, ani powodować jakichkolwiek objawów toksyczności. Należy zastosować świeże preparaty testowej substancji chemicznej.
Zwierzęta badane
Myszy szczepu T (nieagouti, a/a; szynszyla, różowe oczy, cchp/cchp; brązowe, b/b; jaśniejsze, o krótkich uszach, d se/d se; łaciate, s/s) są krzyżowane zarówno ze szczepem HT (jasne, nieagouti, brachypodia, pa a bp/pa a bp; grafitowe kędzierzawe ln fz/ln fz; perłowe pe/pe), jak i ze szczepem C57 BL (nie-agouti, a/a). Inne właściwie krzyżówki, takie jak między NMR1 (nie-agouti, a/a; albinos, c/c) a DBA (nie-agouti, a/a; brązowe, b/b; jaśniejsze d/d) mogą być stosowane pod warunkiem, że ich potomstwo będzie typu nie-agouti.
Liczba i płeć
Odpowiednia liczna ciężarnych samic poddana jest badaniu w celu uzyskania właściwej liczby żywego potomstwa w odniesieniu do każdego poziomu użytej dawki. Właściwy rozmiar próbki jest regulowany liczbą plamek zaobserwowanych u badanych myszy oraz skalą danych kontrolnych. Negatywny wynik akceptowany jest jedynie wtedy, gdy w wynikach uwzględniono co najmniej 300 osobników potomstwa pochodzących od samic poddanych działaniu substancji testowej o najwyższej wielkości dawki.
Użycie negatywnych i pozytywnych grup kontrolnych
Powinny zostać udostępnione dane z równoległej grupy kontrolnej w odniesieniu do myszy poddanych jedynie działaniu nośnika (negatywne grupy kontrolne). Dane bazowe grup kontrolnych, pochodzące z tego samego laboratorium, mogą zostać włączone w celu podniesienia czułości testu, pod warunkiem iż są one jednorodne. Należy udostępnić dane z pozytywnej grupy kontrolnej ostatnio uzyskane w tym samym laboratorium w związku z poddaniem działaniu substancji chemicznej, o której wiadomo, iż wywołuje objawy mutageniczności, w przypadku braku wykrycia mutageniczności związanej z działaniem testowej substancji chemicznej.
Droga podawania substancji
Zwyczajowe drogi podawania substancji to intubacja drogą pokarmową lub przez iniekcję dootrzewnową stosowane u ciężarnych samic. W odpowiednich przypadkach stosuje się podawanie substancji przez drogi inhalacyjne lub inne drogi podawania substancji testowej.
Poziomy dawek
Stosuje się co najmniej dwa poziomy dawek, włączając jeden skutkujący objawami toksyczności lub obniżoną wielkością miotu. W przypadku nietoksycznych substancji chemicznych należy zastosować ekspozycję na maksymalny stosowany poziom dawki.
Procedura
Poddanie działaniu dawki jednorazowej zazwyczaj stosowane jest w 8, 9 lub 10 dniu ciąży, licząc dzień 1 jako dzień, w którym po raz pierwszy zaobserwowano czop nasienia w pochwie. Dni te odpowiadają 7,25, 8,25 i 9,25 dniom po poczęciu. Po tym okresie można zastosować kolejne podanie dawki.
Analiza
Potomstwo jest oznaczane oraz liczone pod względem plamek między trzecim i czwartym tygodniem po urodzeniu. Wyróżnia się trzy klasy plamek:
a) białe plamki do 5 mm linii środkowo-brzusznej, które przypuszczalnie powodowane są uśmiercaniem komórek (WMVS);
b) żółte, podobne do agouti, cętka występujące na sutku, genitaliach, gardle, w okolicach pach i pachwin oraz w okolicach środka czoła, które przypuszczalnie są wynikiem braku różnicowania (MDS); oraz
c) zabarwione oraz białe plamki losowo rozmieszczone na sierści, które przypuszczalnie wywodzą się z mutacji somatycznych (RS).
Wszystkie trzy klasy są odnotowane jako wyniki, ale jedynie ostatnia, RS, posiada przydatność genetyczną. Problemy z rozróżnieniem między MDS a RS można rozwiązać przez fluorescencyjną mikroskopię próbek sierści.
Należy odnotować oczywiste rażące nieprawidłowości morfologiczne występujące u potomstwa.
2. DANE
Dane przedstawiane są jako ogólna liczba liczonego potomstwa oraz liczba osobników, u których zaobserwowano jedną lub więcej plamek mutacji somatycznej. Dane z grupy badanej oraz negatywnej są porównywane za pomocą odpowiednich metod. Dane przedstawiane są również na tle poszczególnych miotów.
3. SPRAWOZDAWCZOŚĆ
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:
- szczepy zastosowane w krzyżówkach,
- liczba ciężarnych samic w grupie badanej i grupach kontrolnych,
- średnia wielkość miotu w grupie badanej i grupach kontrolnych w chwili urodzenia oraz po zakończeniu ssania,
- wielkość dawki (dawek) testowej substancji chemicznej,
- zastosowany rozpuszczalnik,
- dzień ciąży, w którym podano substancję testową,
- droga podawania substancji testowej,
- ogólna liczba badanego potomstwa oraz liczba potomstwa z WMVS, MDS i RS w grupie badanej i grupach kontrolnych,
- rażące nieprawidłowości morfologiczne,
- związek między poziomem dawki a reakcją osobników z RS, jeżeli to możliwe,
- analiza statystyczna,
- analiza wyników,
- interpretacja wyników.
3.2. ANALIZA I INTERPRETACJA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
4. ODNIESIENIA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
B.25. TRANSLOKACJA DZIEDZICZNOŚCI U MYSZY
Skreślono tę metodę badania, ponieważ nie jest już uznawana za odpowiednią do generowania informacji na temat właściwości toksykologicznych substancji chemicznych do celów rozporządzenia (WE) nr 1907/2006. Metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.26. BADANIE TOKSYCZNOŚCI PODPRZEWLEKŁEJ DROGĄ POKARMOWĄ - STUDIUM TOKSYCZNOŚCI NA GRYZONIACH METODĄ POWTARZANEJ 90-DNIOWEJ DAWKI DROGĄ POKARMOWĄ
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.27. BADANIE TOKSYCZNOŚCI PODPRZEWLEKŁEJ DROGĄ POKARMOWĄ - BADANIA TOKSYCZNOŚCI NA NIEGRYZONIACH METODĄ POWTARZANEJ 90-DNIOWEJ DAWKI DROGĄ POKARMOWĄ
1. METODA
Niniejsza metoda badania toksyczności podprzewlekłej drogą pokarmową jest kopią OECD TG 409 (1998).
1.1. WPROWADZENIE
Przy oszacowaniu i ocenie cech toksyczności substancji chemicznej oznaczenie podprzewlekłej toksyczności drogą pokarmową, stosując powtarzane dawki, może być prowadzone po początkowej informacji o toksyczności, uzyskanej z 28-dniowych badań toksyczności ostrej lub powtarzanej. 90-dniowe badanie dostarcza informacji o możliwym niebezpieczeństwie dla zdrowia, które prawdopodobnie powstanie z powtarzanego narażenia przez okres szybkiego rozwoju do wczesnej dorosłości. Badanie dostarczy informacji na temat głównych toksycznych działań, wskaże zaatakowane organy i możliwości akumulacji, dostarczy oceny poziomu ekspozycji nie powodującego negatywnych skutków, którą stosuje się przy wyborze poziomów dawki dla badań przewlekłych i ustalania kryteriów bezpieczeństwa dla narażenia ludzi.
Metoda badania umożliwia określenie u gatunków należących do niegryzoni negatywnych skutków ekspozycji na działanie chemiczne oraz powinna być wykorzystywana tylko:
- w przypadku gdy skutki zaobserwowane w innych badaniach wymagają wyjaśnienia/charakterystyki dla drugiego gatunku niegryzoni, lub
- w przypadku gdy badania toksykokinetyczne wskazują, że wykorzystanie właściwego gatunku niegryzoni jest najbardziej trafnym wyborem ze zwierząt laboratoryjnych, lub
- w przypadku gdy inne właściwe przyczyny usprawiedliwiają wykorzystanie gatunku niegryzoni. Zob. także Ogólne wprowadzenie część B.
1.2. DEFINICJE
Dawka: jest ilością podawanej substancji badanej. Dawka jest wyrażana wagowo (g, mg) lub jako waga substancji badanej na jednostkę wagi badanego zwierzęcia (np. mg/kg), lub jako stężenie stałe żywieniowe (ppm).
Dawkowanie: jest ogólnym pojęciem obejmującym dawkę, jej częstotliwość i czas podawania dawki.
NOAEL: jest skrótem od poziomu, przy którym nie obserwuje się niekorzystnych skutków, oraz jest najwyższym poziomem dawki, gdzie nie obserwuje się niekorzystnych efektów zależnych od podawanej substancji.
1.3. ZASADA METODY BADANIA
Substancja badana jest codziennie podawana doustnie w stopniowanych dawkach, kilku grupom zwierząt doświadczalnych, jeden poziom dawki na grupę przez okres 90 dni. W czasie okresu podawania zwierzęta są ściśle obserwowane na oznaki zatrucia. Zwierzęta, które zmarly lub zostały zabite w czasie trwania badania, są poddawane sekcji zwłok po zakończeniu badania; zwierzęta, które przeżyły są również zabijane i poddawane sekcji zwłok.
1.4. OPIS METODY BADANIA
1.4.1. Dobór gatunków zwierząt
Zwykle wykorzystywanym gatunkiem niegryzoni jest pies, który powinien być określonej rasy; często wykorzystywany jest pies gończy. Inne gatunki, np. małe świnie, mogą być również wykorzystane. Naczelne nie są zalecane, a ich wykorzystanie powinno być uzasadnione. Powinny być wykorzystane młode, zdrowe zwierzęta, a w przypadku psa wskazane jest rozpoczęcie dawkowania w wieku 4-6 miesięcy i nie późniejszym niż dziewięć miesięcy. W przypadku gdy badanie jest prowadzone jako wstępne do badań toksyczności przewlekłej długoterminowej, w obu badaniach należy wykorzystać ten sam gatunek/rasę.
1.4.2. Przygotowanie zwierząt
Powinny być wykorzystane młode zdrowe zwierzęta, zaaklimatyzowane w warunkach laboratoryjnych i nie będące przedmiotem wcześniejszych procedur eksperymentalnych. Czas trwania aklimatyzacji zależy od wybranych gatunków badanych i ich źródła pochodzenia. Zalecane jest przynajmniej pięć dni w odniesieniu do psów albo celowo hodowanej trzody od rezydenta kolonii i co najmniej dwa tygodnie w odniesieniu do zwierząt z zewnętrznych źródeł. Zwierzęta badane powinny charakteryzować się gatunkiem, szczepem, źródłem, płcią, wagą i/lub wiekiem. Zwierzęta powinny być losowo wyznaczane do doświadczeń kontrolnych i grup traktowanych. Klatki powinny być rozmieszczone w taki sposób, aby możliwy wpływ wynikający z ich umieszczania był zminimalizowany. Każde zwierzę musi być oznakowane niepowtarzalnym numerem identyfikacyjnym.
1.4.3. Przygotowanie dawek
Substancja badana jest podawana w postaci pokarmu lub wody pitnej, przez zgłębnik lub w kapsułkach. Metoda podawania drogą pokarmową jest zależna od celu badania oraz właściwości fizyko-chemicznych badanego materiału.
Tam gdzie jest to konieczne, badaną substancje rozpuszcza się lub wykonuje zawiesinę w odpowiednim nośniku. Zalecane jest, aby tam gdzie to jest możliwe, rozważyć wpierw użycie roztworu lub zawiesiny wodnej, a następnie rozważyć wykonanie roztworu/zawiesiny w oleju (np. w oleju kukurydzianym) i dopiero następnie w innych nośnikach. Dla nośników różnych od wody muszą być znane cechy toksyczności. Powinna być określona stabilność badanej substancji w warunkach podawania dawek.
1.5. PROCEDURA
1.5.1. Ilość i płeć zwierząt
Co najmniej osiem zwierząt (cztery samice i cztery samce) należy wykorzystać w odniesieniu do każdego poziomu dawki. Jeśli planuje się zabijanie w trakcie, liczba powinna być zwiększona o przewidzianą ilość zwierząt do zabicia przed zakończeniem badań. Liczba zwierząt na końcu badania musi być odpowiednia do celów wnikliwego oszacowania toksycznych skutków. W oparciu o uprzednią znajomość substancji lub bliskiego odpowiednika należy rozważyć włączenie dodatkowej, satelickiej grupy ośmiu zwierząt (po cztery każdej płci) do grupy kontrolnej i grupy najwyżej dawkowanej do celów obserwacji po okresie czasu traktowania, odwracalności lub trwałości jakichkolwiek skutków toksycznych. Czas trwania tego okresu po traktowaniu powinien być ustalony odpowiednio w odniesieniu do obserwowanych skutków.
1.5.2. Poziomy dawek
Stosuje się co najmniej trzy poziomy dawek i równoczesne doświadczenie kontrolne, poza przypadkiem gdy prowadzone jest badanie graniczne (zob. 1.5.3). Poziomy dawek mogą być oparte na wynikach powtarzanej dawki lub badaniach ustalania zakresu oraz powinny uwzględniać wszelkie istniejące dane toksykologiczne i toksykokinetyczne, dostępne w odniesieniu do badanej substancji lub związanych z nią materiałów. Poza ograniczeniami natury fizykochemicznej i działaniami biologicznymi substancji badanej, poziom najwyższej dawki musi być wybrany w celu wzbudzenia objawów toksycznych, ale nie spowodowania śmierci czy też poważnych cierpień. Opadająca sekwencja poziomu dawki musi być wybrana w celu pokazania reakcji związanej z dawkowaniem i poziomem, przy którym nie obserwuje się negatywnych skutków (NOAEL) przy najniższym poziomie dawki. Dwa do czterech zachodzące przedzialy są często optymalne do ustalenia opadających poziomów dawki i dodanie czwartej grupy badanej jest często polecane dla zastosowania bardzo dużych odstępów (np. więcej niż współczynnik 6-10) między dawkowaniami.
Grupa kontrolna musi być grupą nietraktowaną lub grupą kontrolną nośnika, jeśli nośnik jest używany do podawania substancji badanej. Zwierzęta w grupie kontrolnej, poza nietraktowaniem jej substancją badaną, są obsługiwane w identyczny sposób jak w zwierzęta w grupach badanych. Jeśli stosowany jest nośnik, grupa kontrolna musi otrzymywać nośnik w maksymalnie stosowanej objętości. Gdy substancja badana jest podawana w diecie i powoduje zmniejszenie zapotrzebowania żywieniowego, wtedy grupa kontrolna z pary żywieniowej może być pomocna w rozróżnieniu między zmniejszeniem spowodowanym odczuwaniem smaku lub zmianami toksykologicznymi w modelu badania.
Następujące cechy nośnika i innych dodatków muszą być rozważone jako właściwe: wpływ wchłaniania, rozkładu, metabolizmu, retencji badanej substancji, wpływ właściwości chemicznych substancji badanej, mogące zmienić jej cechy toksyczności, oraz wpływy zapotrzebowania na żywność i wodę lub żywieniowy status zwierząt.
1.5.3. Badanie graniczne
Jeśli badanie przy jednym poziomie dawki, równoważnym co najmniej 1.000 mg/kg masy ciała/dzień, stosując procedurę opisaną w odniesieniu do niniejszego badania, powoduje, że nie obserwuje się negatywnych skutków oraz jeśli nie oczekuje się toksyczności na podstawie danych substancji strukturalnie związanych, wtedy pełne badania z zastosowaniem trzech poziomów nie wydają się konieczne. Badanie graniczne ma zastosowanie z wyjątkiem sytuacji, gdy narażenie ludzi wskazuje potrzebę zastosowania wyższego poziomu dawki.
1.5.4. Podawanie dawek
Zwierzętom dozuje się substancję badaną przez siedem dni każdego tygodnia w okresie 90 dni. Każdy inny sposób dozowania, na przykład pięć dni w tygodniu, wymaga uzasadnienia. Gdy substancja badana jest podawana przez zgłębnik, musi być to wykonane w pojedynczej dawce, przy użyciu sondy przelykowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. Maksymalna objętość cieczy, która może być podana w jednym momencie, zależy od rozmiarów zwierzęcia badanego. Zwykle objętość powinna być utrzymywana na możliwe najmniejszym poziomie. Z wyjątkiem substancji drażniących i żrących, które zwykle ujawniają silniejsze działanie przy wyższym stężeniu, zmienności w objętości badanej muszą być zminimalizowane przez ustawienie stężenia tak, aby zapewnić stałą objętość we wszystkich poziomach dozowania.
W odniesieniu do substancji podawanych w pokarmie lub wodzie pitnej istotne jest zapewnienie, aby ilości danej substancji badanej nie kolidowały z normalnym odżywianiem lub równowagą wodną. Gdy substancja badana jest podawana w pokarmie - w stałym stężeniu w pokarmie (ppm) albo w stałym poziomie dawki - może być zastosowana w odniesieniu do masy ciała zwierzęcia; wykorzystana alternatywa musi być określona. W odniesieniu do substancji podawanej przez zgłębnik, dawka musi być podana w podobnej porze każdego dnia i regulowana tak by utrzymać stały poziom dawki w odniesieniu do masy ciała zwierzęcia. W przypadku gdy badanie 90-dniowe jest stosowane jako wstępne do badań długoterminowych toksyczności przewlekłej, w obu badaniach powinien być użyty podobny pokarm.
1.5.5. Obserwacje
Okres obserwacji powinien wynosić przynajmniej 90 dni. Zwierzęta w grupie satelickiej, zaplanowanej do dalszej obserwacji, muszą być trzymane przez stosowny okres bez traktowania w celu wykrycia wytrzymałości na lub powrotu do normy od działań toksycznych.
Ogólne kliniczne obserwacje powinny być dokonywane przynajmniej raz na dzień, najlepiej o tej (tych) samej(-ych) porze (porach) każdego dnia, uwzględniając szczytowy okres przewidywanego działania po dozowaniu. Stan kliniczny zwierząt powinien być rejestrowany. Co najmniej dwa razy dziennie, zwykle na początku i pod koniec każdego dnia, wszystkie zwierzęta są kontrolowane w zakresie oznak zachorowań i śmiertelności.
Przynajmniej raz przed pierwszą ekspozycją (uwzględnić w granicach porównania) i raz tygodniowo później należy dokonać szczegółowej obserwacji klinicznej na wszystkich zwierzętach. Obserwacje te powinny być dokonywane poza klatką domową, najlepiej w warunkach standardowych za każdym razem w podobnych porach. Powinny one być starannie zapisane, najlepiej przez zastosowanie systemów punktacji, wyraźnie określonych przez laboratorium badawcze. Należy dołożyć starań w celu zapewnienia, aby zmiany w warunkach obserwacji były minimalne. Oznaki zauważone powinny obejmować zmiany na skórze, futrze, oczach, błonach śluzowych, występowania wydzielin i czynności autonomiczne (np. łzawienie, piloerekcja, rozmiar źrenic, zmieniony rytm oddychania), lecz nie powinny być ograniczone tylko do nich. Zmiany w chodzie, postawie i reakcja na obchodzenie się, jak również obecność zachowań klonicznych i tonicznych, stereotypów (np. nadmierne zajmowanie się sobą, kolowacizna) lub dziwaczne zachowanie (np. samo-okaleczanie, chodzenie wstecz) także muszą być zarejestrowane.
Badanie oftalmologiczne przy użyciu oftalmoskopu lub równoważnego odpowiedniego przyrządu musi być wykonane przed podawaniem dawek badanej substancji i przy ukończeniu badań, najlepiej na wszystkich zwierzętach, ale przynajmniej w grupach wysokiej dawki i kontrolnej. Jeśli wykryto zmiany w oczach, należy przebadać wszystkie zwierzęta.
1.5.5.1. Waga ciała i i spożycie pokarmu/wody
Wszystkie zwierzęta powinny być ważone przynajmniej raz na tydzień. Pomiary spożycia pokarmu powinny być dokonywane przynajmniej co tydzień. Jeśli substancja badana jest podawana w wodzie pitnej, spożycie wody musi być także mierzone przynajmniej cotygodniowo. Spożycie wody może być także rozważone w odniesieniu do badań pokarmowych lub zgłębnika, w czasie których pragnienie może się zmienić.
1.5.5.2. Biochemia kliniczna i hematologia
Próbki krwi powinny być pobrane z nazwanego siedliska i przechowywane, jeśli ma to zastosowanie, we właściwych warunkach. Na końcu okresu badania próbki są zbierane tuż przed procedurą zabijania zwierząt lub jako jej część.
Hematologia, włączając hematokryt, stężenie hemoglobiny, liczba erytrocytów, całkowita i różnicowa liczba leukocytów, liczba płytek krwi i pomiar potencjału krzepliwości takiego jak czas krzepliwości, czas protrombinowy i tromboplastynowy, powinna być zbadana na początku badania, następnie albo w odstępach miesięcznych albo w środku okresu badania oraz ostatecznie pod koniec okresu badania.
Oznaczenia biochemii klinicznej do badań głównych skutków toksycznych w tkankach, w szczególności działań na nerki i wątrobę, powinny być wykonane na próbkach krwi, uzyskanych od każdego zwierzęcia na początku, następnie albo odstępach miesięcznych albo w środku okresu badania oraz ostatecznie pod koniec okresu badania. Dziedzinami badań, które muszą być rozważone, są równowaga elektrolitów, metabolizm węglowodanów oraz funkcje wątroby i nerek. Na wybór specyficznych badań wpływają obserwacje sposobu działania substancji badanej. Zwierzęta powinny być przetrzymane przez okres odpowiedni do gatunku przed
pobieraniem próbek krwi. Zalecane oznaczenia obejmują wapń, fosfor, chlorki, sód, potas, glukozę, aminotransferazę alaninową, aminotransferaze asparaginową, dekarboksylazę ornityny, gamma glutamylową transpeptydazę, azot mocznikowy, albuminy, kreatyninę krwi, całkowitą bilirubinę i całkowitą surowicę białkową.
Oznaczenia analityczne w moczu powinny być wykonane przynajmniej na początku, następnie w środku i pod koniec badania, stosując zebraną czasowo objętość moczu. Oznaczenia moczu obejmują przejrzystość, objętość, osmolality lub ciężar właściwy, pH, białka, glukoza i komórki krwi. Inne parametry dodatkowo mogą być oznaczane w miarę potrzeb rozszerzenia badania zaobserwowanego(-ych) skutku(-ów).
Ponadto należy rozważyć zastosowanie do badań surowicy znaczników ogólnego uszkodzenia tkanek. Inne oznaczenia, które mogą być niezbędne do odpowiedniej oceny toksykologicznej, obejmują lipidy, hormony, równowagę kwasowo-zasadową, metahemoglobinę, inhibitory cholinoesterazy. Dodatkowe badania kliniczne mogą być wykorzystywane, gdy niezbędne jest rozszerzenie badania zaobserwowanych skutków. Mogą być one potrzebne do określenia niektórych związków chemicznych w niektórych klasach lub na zasadzie jednostkowych przypadków.
Ogólnie, potrzebne jest elastyczne podejście, w zależności od gatunku oraz obserwowanych i/lub spodziewanych skutków pochodzących od danej substancji.
1.5.5.3. Całościowa sekcja zwłok
Wszystkie zwierzęta w badaniu podlegają pełnej, szczegółowej brutto sekcji zwłok, która obejmuje staranne badanie zewnętrznej powierzchni organu, wszystkie otwory i czaszkowe, piersiowe i brzuszne jamy i ich zawartości. Wątroba, nerka, nadnercza, jądra, najądrza, macica, jajniki, grasica, śledziona, mózg i serce wszystkich zwierząt (oddzielnie od tych, które okazały się konające i/lub zabite w międzyczasie) powinny być okrojone z wszelkich przylegających tkanek, odpowiednio, i należy tak szybko jak to możliwe pomierzyć ich mokrą wagę po sekcji w celu zapobieżenia wyschnięciu.
Następujące tkanki powinny być zakonserwowane w najwłaściwszym środku utrwalającym dla obu typów tkanek i zamierzonych kolejnych badań histopatologicznych: wszystkie całkowite uszkodzenia, mózg (reprezentatywne obszary, włączając płaszcz mózgowy, móżdżek i szpik/mostek), rdzeń kręgowy (na trzech poziomach: karkowym, środkowo-piersiowym i lędźwiowym), przysadka, tarczyca, przytarczyczka, grasica, przełyk, gruczoły ślinowe, żołądek, małe i duże jelita (włączając plamy Peyera), wątroba, trzustka, nerki, nadnercza, śledziona, serce, tchawica i płuca (zabezpieczone przez inflację utrwaloną a następnie zanurzoną), aorta, gonady, macica, dodatkowe organy płciowe, żeńskie gruczoły sutkowe, prostata, pęcherz moczowy, pęcherzyk żółciowy (mysz), węzły limfatyczne (najlepiej jeden węzeł pokrywający drogę podawania i drugi odległy od drogi podawania, aby objąć działania na układ), nerw peryferyjny (kulszowy lub piszczelowy) zalecany w dużej bliskości od mięśnia, fragment kości szpikowej (i/lub świeża kość z zassanym szpikiem), skóra i oczy (jeśli zaobserwowano zmiany podczas badań oftalmologicznych). Kliniczne i inne wyniki badań mogą zasugerować konieczność zbadania dodatkowych tkanek. Także jakiekolwiek organy uznane za mogące być celem w oparciu o znane właściwości badanej substancji powinny być zakonserwowane.
1.5.5.4. Histopatologia
Pełna histopatologia powinna być przeprowadzona na zakonserwowanych ciałach i tkankach wszystkich zwierząt z grupy kontrolnej i wysokodawkowanej. Badania te powinny być rozciągnięte na wszystkie inne dawkowane grupy, jeśli w wysokodawkowanej grupie obserwuje się zmiany związane z działaniem środka.
Należy przebadać wszystkie zmiany patologiczne.
Jeśli używa się grupy satelickiej, histopatologia powinna być przeprowadzona na tkankach i ciałach, określonych jako wykazujące działanie, w grupach traktowanych.
2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
2.1. DANE
Należy przedstawić dane osobnika. Dodatkowo, wszystkie dane powinny być zestawione w postaci tabelarycznej, przedstawiając w odniesieniu do każdej badanej grupy liczbę zwierząt na początku badania, liczbę zwierząt, które poniosły śmierć podczas trwania badania lub które zabito z przyczyn humanitarnych wraz z czasem, w którym nastąpiła śmierć lub humanitarne zabicie, liczbę wykazującą oznaki zatrucia, opis obserwowanych oznak zatrucia, włączając czas zaistnienia, czas trwania, stopień ciężkości każdego działania toksycznego, liczbę zwierząt wykazującą zmiany patologiczne, typ zmian patologicznych i procent zwierząt obrazujący każdy typ zmiany patologicznej.
Gdy ma to zastosowanie, wyniki liczbowe powinny być szacowane właściwymi i ogólnie przyjętymi metodami statystycznymi. Metody statystyczne i dane poddawane analizie, powinny być wybrane w czasie przygotowania projektu badań.
2.2. SPRAWOZDANIE DOTYCZĄCE BADAŃ
Sprawozdanie dotyczące badań musi zawierać następujące informacje:
2.2.1. Substancja użyta w badaniu:
- charakter fizyczny, czystość i właściwości fizyko-chemiczne,
- dane identyfikacyjne,
- nośnik (jeśli jest to stosowne): uzasadnienie wyboru nośnika, jeśli jest różny od wody.
2.2.2. Gatunki użyte w badaniu:
- użyte gatunki i szczep,
- ilość, wiek i płeć zwierząt,
- źródło, warunki zamieszkiwania, pokarm itp.,
- waga osobnicza zwierząt przy rozpoczęciu badania.
2.2.3. Warunki badania:
- racjonalne uzasadnienie wybranego poziomu dawkowania,
- szczegółowe informacje dotyczące składu badanej substancji/przygotowanie pokarmu, uzyskane stężenie, stabilność i jednorodność przygotowania,
- szczegółowe informacje dotyczące podawania substancji badanej,
- dawka rzeczywista (mg/kg waga ciała/dzień), wskaźnik konwersji pokarm/woda pitna stężenia badanej substancji (ppm) do dawki rzeczywistej, jeśli ma to zastosowanie,
- szczegółowe informacje dotyczące jakości żywności i wody.
2.2.4. Wyniki:
- waga ciała oraz zmiany wagi ciała,
- spożycie żywności i wody, jeśli ma to zastosowanie,
- dane reakcji na zatrucie według płci i poziomu dawki, włączając oznaki zatrucia,
- charakter, surowość i czas trwania obserwacji klinicznych (stan odwracalny czy nie),
- wyniki badania oftalmologicznego,
- ocena czynności sensorycznych, siły zacisku i czynności motorycznych (gdy jest to dostępne),
- badania hematologiczne z odpowiednimi wartościami poziomów tolerancji,
- biochemiczne badania kliniczne z odpowiednimi wartościami poziomów tolerancji,
- końcowa waga ciała, waga organów i proporcje wagi organ/ciało,
- ustalenia sekcji zwłok,
- szczegółowy opis wszystkich histopatologicznych wyników badań,
- dane dotyczące absorpcji, jeśli jest to dostępne,
- statystyczne opracowanie wyników, tam gdzie jest to stosowne.
Omówienie wyników.
Wnioski.
B.28. BADANIE PODCHRONICZNEJ TOKSYCZNOŚCI SKÓRY - 90-DNIOWE BADANIA POWTARZANEGO DAWKOWANIA NA SKÓRZE Z WYKORZYSTANIEM GATUNKÓW GRYZONI
1. METODA
1.1. WSTĘP
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
1.2. DEFINICJE
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Brak
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Substancja testowa jest nanoszona codziennie na skórę, w stopniowanych dawkach, kilku grupom zwierząt badanych, jedna dawka na grupę przez okres 90 dni. W okresie podawania dawki zwierzęta obserwowane są codziennie celem wykrycia objawów toksyczności. Zwierzęta, które zdechną w czasie trwania badania, poddawane są sekcji zwłok, a na zakończenie badania zwierzęta pozostałe przy życiu są zabijane i również poddawane sekcji zwłok.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE
Brak.
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ
Przygotowania
Zwierzęta podlegają warunkom przebywania i żywieniowym ustalonym do celów badania przez co najmniej pięć dni przed rozpoczęciem badania. Przed rozpoczęciem badania młode zdrowe zwierzęta są losowo przydzielane do grup badanych i kontrolnych. Tuż przed rozpoczęciem badania futro zostaje ostrzyżone w części grzbietowej tułowia badanych zwierząt. Można zastosować golenie, ale powinno być przeprowadzone około 24 godziny przed rozpoczęciem badania. Ponowne strzyżenie lub golenie jest zazwyczaj potrzebne w przybliżeniu co tydzień. Podczas strzyżenia lub golenia futra należy uważać, aby nie otrzeć skóry. Nie mniej niż 10 % powierzchni skóry powinno zostać oczyszczone w celu podania substancji testowej. Należy uwzględnić wagę zwierząt w chwili podjęcia decyzji o powierzchni oczyszczanej skóry oraz o powierzchni jej pokrycia. Badając substancje stałe, które mogą być ścierane w odpowiednich przypadkach, substancja testowa powinna być odpowiednio nawilżana wodą lub, w miarę potrzeby, za pomocą odpowiedniego nośnika w celu zapewnienia dobrego kontaktu ze skórą. Płynne substancje testowe na ogół są aplikowane nierozcieńczone. Substancja aplikowana jest zasadniczo przez pięć do siedmiu dni w tygodniu.
Warunki badania
Zwierzęta badane
Wykorzystywać można dorosłe szczury, króliki lub świnki morskie. W chwili rozpoczęcia badania rozpiętość różnicy wagowej powinna wynosić ± 20 % wagi średniej. W przypadku przeprowadzania podchronicznych badań na skórze jako badań wstępnych do badań długoterminowych ten sam gatunek i szczep powinny być wykorzystane w obu badaniach.
Liczba i płeć
Co najmniej 20 zwierząt (10 samic i 10 samców) ze zdrową skórą powinno być wykorzystanych na każdym z poziomów dawek. Samice powinny być nieciężarne i takie, które nie rodziły. Jeżeli planowane są zgony zwierząt, ich liczba powinna zostać powiększona o liczbę zwierząt planowanych do uśmiercenia przed zakończeniem badań. Ponadto grupa satelitarna w ilości 20 zwierząt (10 zwierząt każdej płci) może zostać poddana wysokiej dawce przez okres 90 dni i obserwowana pod względem odwracalności, odporności, lub opóźnionego wystąpienia toksycznych skutków przez 28 dni po przeprowadzeniu czynności badawczych.
Poziomy dawek
Powinny zostać wykorzystane co najmniej trzy poziomy dawek łącznie z dawką kontrolną lub kontrolą nośnika, jeżeli jest stosowany. Okres ekspozycji na substancję powinien wynosić co najmniej sześć godzin dziennie. Substancję należy stosować o podobnych porach każdego dnia, a ilość stosowanej substancji dostosowana jest do odpowiednich odstępów czasu (tygodniowych lub dwutygodniowych), w celu utrzymania stałej dawki w odniesieniu do wagi ciała zwierząt. Oprócz stosowania substancji testowej, zwierzęta grupy kontrolnej powinny być traktowane w identyczny sposób co obiekty grupy badanej. W przypadku użycia nośnika w celu usprawnienia dawkowania grupa kontrolna przyjmuje dawki w ten sam sposób co grupy badane oraz otrzymuje tę samą ilość nośnika co ilość podawana grupie otrzymującej najwyższą dawkę. Najwyższa dawka powinna wywołać objawy toksyczności, ale nie powinna powodować lub powodować niewiele przypadków śmiertelności. Najniższa dawka nie powinna powodować żadnych objawów toksyczności. W przypadku rozważenia ekspozycji człowieka najniższa dawka powinna ją przekraczać. Najlepiej było by, gdyby średnia dawka wywoływała minimalne, dające się zaobserwować skutki toksyczności. W przypadku użycia więcej niż jednej średniej dawki należy rozszerzyć stosowane poziomy dawek w celu wywołania stopniowania skutków toksyczności. W grupach otrzymujących niskie oraz średnie dawki, oraz w grupach kontrolnych jakiekolwiek przypadki śmiertelności powinny być nieliczne w celu umożliwienia dokonania miarodajnej oceny wyników badań.
W przypadku gdy aplikowanie substancji testowej powoduje poważne podrażnienia skóry, stężenie powinno zostać obniżone, co może doprowadzić do zmniejszenia lub braku innych objawów toksyczności w grupie najwyższego dawkowania. Jeżeli skóra została poważnie uszkodzona, konieczne może okazać się zakończenie bieżących badań i podjęcie nowych badań z niższymi stężeniami.
Test graniczny
Jeżeli wstępne badanie przy dawce w wysokości 1.000 mg/kilogram lub przy wyższej dawce związanej z ewentualną ekspozycją człowieka wywołuje żadnych objawów toksyczności, dalsze badanie może być uznane za niepotrzebne.
Okres obserwacji
Zwierzęta badane powinny być codziennie obserwowane w celu wykrycia objawów toksyczności. Czas zgonu oraz czas pojawienia się i zaniku objawów toksyczności należy odnotować.
Procedura
Zwierzęta powinny zostać umieszczone w osobnych klatkach. Zwierzęta należy poddać działaniu substancji testowej najlepiej siedem dni w tygodniu, przez okres 90 dni.
Zwierzęta z grup satelitarnych przeznaczone do obserwacji uzupełniających powinny być trzymane przez dodatkowy okres 28 dni bez podawania jakichkolwiek substancji w celu stwierdzenia regeneracji lub odporności na skutki toksyczności. Czas ekspozycji powinien wynosić sześć godzin dziennie.
Substancja testowa powinna być aplikowana w sposób jednolity na powierzchni, która stanowi około 10 % ogólnej powierzchni ciała. W odniesieniu do substancji wysokotoksycznych pokryty obszar powierzchni ciała może być mniejszy ale pozostała powierzchnia powinna być pokryta tak cienką i jednolitą warstwą jak to możliwe.
W czasie ekspozycji substancja testowa wchodzi w kontakt ze skórą za pomocą porowatego opatrunku z gazy i nie drażniącej taśmy. Następnie badane miejsce powinno być w odpowiedni sposób okryte w celu utrzymania opatrunku z gazy oraz substancji testowej i zapewnienia, że zwierzę nie będzie w stanie spożyć substancji testowej. W celu zapobieżenia spożycia substancji testowej mogą zostać zastosowane środki zabezpieczające ale całkowite unieruchomienie nie jest zalecaną metodą.
Na zakończenie okresu ekspozycji, pozostała substancja testowa powinna zostać usunięta, w przypadku gdy to możliwe, za pomocą wody lub innej właściwej metody oczyszczania skóry.
Wszystkie zwierzęta powinny być obserwowane codziennie a objawy toksyczności powinny być odnotowane włączając porę ich rozpoczęcia, stopień oraz czas trwania. Obserwacje zwierząt w klatkach powinny obejmować zmiany zachodzące na ich skórze i futrze, zmiany oczu i błony śluzowej a także zmiany układu oddechowego, krążenia oraz autonomicznego i centralnego układu nerwowego, czynności somatomotorycznych oraz schematów zachowań. Powinny być dokonywane pomiary spożycia żywności oraz pomiary wagi ciała zwierząt raz w tygodniu. Regularne obserwacje zwierząt są konieczne w celu zapewnienia, że nie dochodzi do strat na zwierzętach w wyniku takich przypadków jak kanibalizm, autoliza tkanek lub nieprawidłowe umieszczenie. Na końcu okresu badania wszystkie zwierzęta pozostałe przy życiu z niesatelitarnej grupy badanej zostają zabite i poddane sekcji zwłok. Zwierzęta konające powinny być usuwane i poddawane sekcji zwłok po stwierdzeniu takiego faktu.
Wszystkie zwierzęta, włączając zwierzęta z grup kontrolnych, zwyczajowo poddawane są następującym badaniom:
a) Badanie oftalmologiczne z wykorzystaniem oftalmoskopu lub podobnego sprzętu, powinno zostać przeprowadzone przed zastosowaniem substancji testowej oraz zakończeniem badań, najlepiej na wszystkich zwierzętach, a co najmniej na zwierzętach z grupy najwyższej dawki i grupy kontrolnej. W przypadku wykrycia zmian w oczach należy przebadać wszystkie zwierzęta.
b) Hematologia, włączając hematokryt, badanie stężenia hemoglobiny, ilości krwinek czerwonych, ogólnej ilości krwinek białych i obraz białokrwinkowy, pomiar wskaźników krzepliwości krwi takich jak czas krzepnięcia, czas protrombinowy, czas tromboplastynowy, czy ilość płytek krwi powinny zostać zbadane na końcu okresu badania.
c) Powinno zostać przeprowadzone oznaczenie klinicznej biochemii krwi na końcu okresu badania. Obszarami zainteresowania uważanymi za właściwe dla wszystkich badań są: równowaga elektrolityczna, metabolizm węglowodanów, funkcje wątroby i nerek. Wybór szczególnych badań będzie uzależniony od obserwacji formy i działania substancji. Sugerowane ustalenia to: pomiar wapnia, fosforu, chlorku, sodu, potasu, stężenie glukozy na czczo (z okresem głodzenia stosownym do gatunku zwierzęcia), transaminaza pirogronianowo-glutaminowa surowicy(1), transaminaza szczawiowooctowoglutamylowa surowicy(2), dekarboksylazy ornityny, transpeptydaza gammaglutamylowa, mocznika azotu, albuminy, kreatyny krwi całkowitej bilirubiny oraz całkowitej surowicy białka. Inne ustalenia, które mogą być niezbędne do właściwej analizy toksykologicznej obejmują badania lipidów, hormonów, równowagi kwasowo-zasadowej, czynności metahemoglobiny i cholinoesteraza. Dodatkowa biochemia kliniczna może zostać zastosowana w miarę potrzeby w celu rozszerzenia badań odnośnie obserwowanych skutków.
d) Analiza moczu nie jest wymagana jako badanie rutynowe, ale jedynie w przypadku spodziewanej lub obserwowanej toksyczności.
Jeżeli dane bazowe są niewłaściwe, należy zwrócić uwagę na określenie parametrów hematologicznych i klinicznej biochemii przed rozpoczęciem dawkowania.
Całkowita sekcja zwłok
Wszystkie zwierzęta powinny być poddane całkowitej sekcji zwłok, która obejmuje badanie zewnętrznej powierzchni ciała, wszelkich otworów, jamy czaszkowej, klatki piersiowej i jamy brzusznej oraz ich zawartości. Wątroba, nerki, nadnercza oraz jądra powinny być zważone niezwłocznie po przeprowadzeniu sekcji w celu uniknięcia wyschnięcia. Poniższe organy i tkanki powinny być zachowane w odpowiednim pojemniku w celu ewentualnego przyszłego badania histopatologicznego: wszelkie zmiany patologiczne, mózg - włączając części rdzenia/most, móżdżek i kora mózgowa, przysadka mózgowa, tarczyca/przytarczyca, tkanki grasicy, (tchawica), płuca, serce, aorta, gruczoły ślinowe, wątroba, śledziona, nerki, nadnercza, trzustka, gruczoły płciowe, macica, dodatkowe organy genitaliów, woreczek żółciowy (jeżeli obecny), przełyk, żołądek, dwunastnica, jelito czcze, talerz, jelito ślepe, okrężnica, odbytnica, pęcherz moczowy, przedstawiciel pachowych węzłów chłonnych, (żeńskie gruczoły malene), (umięśnienie uda), nerwy obwodowe, (oczy), (mostek wraz ze szpikiem kostnym), (kość udowa, włączając powierzchnie stawowe), i (rdzeń kręgowy w trzech poziomach - szyjny, śródpiersiowy i lędźwiowy) i (oczodołowe gruczoły łzo we). Tkanki wymienione w nawiasach będą wymagały przebadania w przypadku powstania objawów toksyczności lub zaangażowania danych organów.
Badania histopatologiczne
a) Pełna histopatologia powinna zostać przeprowadzona na normalnej i badanej skórze oraz na organach i tkankach zwierząt w grupie kontrolnej i grupie najwyższego dawkowania.
b) Wszelkie zmiany patologiczne powinny zostać zbadane.
c) Organy docelowe działania substancji w grupach innego dawkowania powinny zostać zbadane.
d) W przypadku gdy wykorzystywane są szczury, płuca zwierząt w grupach niskiego i średniego dawkowania powinny zostać poddane badaniu histopatologicznemu w celu stwierdzenia dowodów infekcji, ponieważ badanie to dostarcza dogodnej analizy stanu zdrowia zwierząt. Przeprowadzanie dalszych badań histopatologicznych nie musi być wymagane jako rutynowe w odniesieniu do zwierząt w tych grupach ale zawsze musi być przeprowadzane na organach, które wykazują objawów zmian patologicznych w grupie najwyższego dawkowania.
e) W przypadku wykorzystywania grupy satelitarnej histopatologia powinna zostać przeprowadzona na tkankach i organach zidentyfikowanych jako te wykazujące skutki w grupach poddanych badaniu.
2. DANE
Dane powinny zostać podsumowane w formie tabeli, wykazującej liczbę zwierząt każdej badanej grupy na początku badań, liczbę zwierząt wykazujących zmiany patologiczne, rodzaj zmian oraz procent zwierząt wykazujących każdy z rodzajów zmian. Wyniki powinny zostać oszacowane właściwą metodą statystyczną. Można zastosować każdą uznaną metodę statystyczną.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań zawiera, w miarę możliwości, następujące informacje:
- gatunek lub szczep, źródło, warunki środowiska, pożywienie,
- warunki badania,
- dawkowanie (włączając nośnik, jeżeli został użyty) oraz jego stężenie,
- dane dotyczące reakcji na toksyczność ze względu na płeć i dawkę,
- brak skutków,
- czas zgonu podczas badań lub informacja o tym, czy zwierzęta przetrwały do czasu ich zakończenia,
- opis skutków toksyczności lub innych,
- okres obserwacji każdego nietypowego objawu i późniejszego postępowania,
- brak skutków,
- dane dotyczące wagi ciała i pożywienia,
- wyniki badań oftalmologicznych,
- zastosowane badania hematologiczne oraz wszystkie wyniki,
- zastosowane kliniczne badania biochemiczne oraz wszystkie wyniki (włączając wyniki wszelkich analiz moczu),
- wyniki badań sekcji zwłok,
- szczegółowy opis wszystkich wyników badań histopatologicznych,
- statystyczne ujęcie wyników, jeżeli to możliwe,
- analiza wyników,
- interpretacja wyników.
3.2 ANALIZA I INTERPRETACJA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
4. ODNIESIENIA
Zob. Wprowadzenie ogólne część B.
______
(1) Obecnie znane pod nazwą aminontransferaza alaninowa surowicy.
(2) Obecnie znane pod nazwą aminotransferaza asparaginianowa surowicy.
B.29. TOKSYCZNOŚĆ PODPRZEWLEKŁA - NARAŻENIE INHALACYJNE: BADANIE 90-DNIOWE
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.30. BADANIA TOKSYCZNOŚCI PRZEWLEKŁEJ
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.31. BADANIE PRZEDURODZENIOWEJ TOKSYCZNOŚCI ROZWOJOWEJ
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.32. BADANIE RAKOTWÓRCZOŚCI
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.33. ŁĄCZONE BADANIA TOKSYCZNOŚCI PRZEWLEKŁEJ/RAKOTWÓRCZOŚCI
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.34. BADANIE TOKSYCZNOŚCI REPRODUKCJI JEDNEGO POKOLENIA
Skreślono tę metodę badania, ponieważ nie jest już uznawana za odpowiednią do generowania informacji na temat właściwości toksykologicznych substancji chemicznych do celów rozporządzenia (WE) nr 1907/2006. Metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.35. DWUPOKOLENIOWE BADANIE TOKSYCZNOŚCI REPRODUKCYJNEJ
Skreślono tę metodę badania, ponieważ nie jest już uznawana za odpowiednią do generowania informacji na temat właściwości toksykologicznych substancji chemicznych do celów rozporządzenia (WE) nr 1907/2006. Metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.36. TOKSYKOKINETYKA
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna z dotyczącą badań wytyczą OECD nr 417 (2010). Badania toksykokinetyki badanej substancji chemicznej prowadzone są w celu uzyskania odpowiednich informacji na temat wchłaniania, dystrybucji, biotransformacji (tj. metabolizmu) i wydalania tej substancji, a także aby pomóc w powiązaniu stężenia lub dawki z obserwowaną toksycznością oraz w zrozumieniu mechanizmu toksyczności danej substancji. Toksykokinetyka może pomóc w zrozumieniu badań toksykologicznych poprzez wykazanie, że zwierzęta doświadczalne są systematycznie narażane na działanie badanej substancji chemicznej, oraz ujawnienie krążących grup funkcyjnych (macierzystej substancji chemicznej/metabolitów). Podstawowe parametry toksykokinetyczne określone na podstawie tych badań dostarczą również informacji na temat potencjału akumulacji badanej substancji chemicznej w tkankach lub narządach oraz potencjału indukcji biotransformacji w wyniku narażenia na badaną substancję chemiczną.
2. Dane toksykokinetyczne mogą pomóc w ocenie adekwatności i znaczenia danych dotyczących toksyczności dla zwierząt na potrzeby ekstrapolacji na zagrożenie dla ludzi lub oceny ryzyka. Dodatkowo badania toksykokinetyczne mogą dostarczyć przydatnych informacji dla celów określenia poziomów dawkowania w badaniach toksyczności (kinetyka liniowa w porównaniu z kinetyką nieliniową), skutków drogi podania, biodostępności oraz zagadnień związanych z projektem badania. Określone typy danych toksykokinetycznych można wykorzystać do opracowania fizjologicznego modelu toksykokinetycznego (PBTK).
3. Istnieją ważne zastosowania dla danych dotyczących metabolitów/toksykokinetyki, takie jak wskazywanie możliwej toksyczności i charakteru działania oraz ich związku z poziomem dawkowania i drogą narażenia. Ponadto dane dotyczące metabolizmu mogą dostarczyć informacji przydatnych do oceny toksykologicznego znaczenia narażenia na egzogennnie wytwarzane metabolity badanej substancji chemicznej.
4. Wystarczające dane toksykokinetyczne posłużą jako poparcie dalszej dopuszczalności i zastosowania ilościowych zależności struktura-aktywność, podejścia przekrojowego lub podejścia polegającego na grupowaniu w ramach oceny bezpieczeństwa chemikaliów. Dane kinetyczne można również wykorzystać do oceny znaczenia toksykologicznego innych badań (np. in vivo/in vitro).
5. Niniejsza metoda badawcza ma zastosowanie do podawania badanej substancji chemicznej drogą pokarmową, chyba że wymienia się inną drogę podawania (zob. zwłaszcza pkt 74-78).
WSTĘPNE ROZWAŻANIA
6. W systemach regulacji istnieją różne wymogi i potrzeby związane z pomiarem punktów końcowych i parametrów związanych z toksykokinetyką dla różnych klas substancji chemicznych (np. pestycydów, produktów biobójczych, chemikaliów przemysłowych). W przeciwieństwie do większości metod badawczych w niniejszej metodzie opisano badanie toksykokinetyczne, które obejmuje wiele pomiarów i punktów końcowych. W przyszłości może dojść do opracowania kilku nowych metod badawczych lub wytycznych, aby opisać każdy punkt końcowy odrębnie i w sposób bardziej szczegółowy. W przypadku niniejszej metody badawczej to, które badania lub oceny są przeprowadzane, jest określone zgodnie z wymogami lub potrzebami każdego systemu regulacji.
7. Istnieje wiele badań, które można przeprowadzić, aby ocenić zachowanie toksykokinetyczne badanej substancji chemicznej dla celów regulacyjnych. Niemniej jednak w zależności od określonych potrzeb regulacyjnych lub sytuacji nie wszystkie z tych możliwych badań mogą być konieczne dla oceny badanej substancji chemicznej. Projekt badań toksykokionetycznych wymaga elastyczności i uwzględnienia cech badanej substancji chemicznej będących przedmiotem zainteresowania. W niektórych przypadkach konieczne może być tylko rozpatrzenie określonego zestawu pytań, aby uwzględnić zagrożenie i ryzyko związane z badaną substancją chemiczną. W niektórych sytuacjach dane toksykokinetyczne można zgromadzić w ramach oceny w innych badaniach toksykologicznych. W innych przypadkach konieczne mogą być dodatkowe lub bardziej rozległe badania toksykokinetyczne, zależnie od potrzeb regulacyjnych lub jeżeli w trakcje oceny badanej substancji chemicznej pojawią się nowe pytania.
8. Przed przeprowadzeniem badania laboratorium badawcze powinno wziąć pod uwagę wszystkie dostępne informacje na temat badanej substancji chemicznej oraz jej istotnych metabolitów i analogów w celu poprawienia jakości badania oraz uniknięcia niepotrzebnego wykorzystania zwierząt. Może to obejmować dane pochodzące z innych właściwych metod badawczych (badań in vivo, in vitro lub ocen in silico). Właściwości fizykochemiczne, takie jak: współczynnik podziału oktanol/woda (wyrażony jako log POW), pKa, rozpuszczalność w wodzie, prężność pary, masa cząsteczkowa substancji chemicznej, mogą być przydatne przy planowaniu badania i interpretacji wyników. Można je ustalić za pomocą odpowiednich metod opisanych w stosownych metodach badawczych.
OGRANICZENIA
9. Niniejsza metoda badawcza nie została opracowana do zastosowania w szczególnych okolicznościach, takich jak u zwierząt ciężarnych lub w okresie laktacji oraz u potomstwa, ani do oceny potencjalnych pozostałości u zwierząt narażonych na działanie substancji, od których lub z których pozyskuje się żywność. Dane uzyskane z badania B.36 mogą jednak zapewnić podstawowe informacje na potrzeby zaprojektowania konkretnych badań do takich celów. Niniejsza metoda badawcza nie jest przeznaczona do badania nanomateriałów. Sprawozdanie ze wstępnego przeglądu wytycznych OECD dotyczących badań w zakresie ich zastosowania do nanomateriałów wskazuje na to, że TG 417 (równoważna niniejszej metodzie badawczej B.36) może nie mieć zastosowania do nanomateriałów (1).
DEFINICJE
10. Definicje stosowane dla celów niniejszej metody badawczej przedstawiono w dodatku.
TROSKA O DOBROSTAN ZWIERZĄT
11. Wytyczne dotyczące humanitarnego traktowania zwierząt są dostępne w wytycznej OECD (GD) nr 19 (2). Zaleca się, aby we wszystkich badaniach in vivo i in vitro opisanych w niniejszej metodzie badawczej korzystać z wytycznej OECD GD nr 19.
OPIS METOD
Badania pilotażowe
12. Zaleca i poleca się korzystanie z badań pilotażowych na potrzeby wyboru parametrów doświadczalnych dla badań toksykokinetycznych (np. metabolizmu, bilansu masy, procedur analitycznych, zakresu dawkowania, wydychania CO2 itd.). Opis niektórych z tych parametrów może nie wymagać użycia substancji chemicznych znakowanych izotopowo.
Wybór zwierząt
Gatunek
13. Gatunek zwierzęcia (i szczep) wykorzystywany w badaniu toksykokinetycznym powinien być taki sam jak gatunek wykorzystany w innych badaniach toksykologicznych przeprowadzonych nad daną badaną substancją chemiczną. Zazwyczaj wykorzystywanym gatunkiem powinien być szczur, gdyż jest to gatunek szeroko wykorzystywany do badań toksykologicznych. Wykorzystanie innych lub dodatkowych gatunków może być uzasadnione, jeżeli kluczowe badania toksykologiczne wskazują na oznaki znacznej toksyczności u tych gatunków lub jeżeli wykazano, że ich toksyczność/toksykokinetyka ma większe znaczenie dla ludzi. Należy podać uzasadnienie wyboru gatunku i szczepu zwierząt.
14. O ile nie wspomniano inaczej, w niniejszej metodzie badawczej szczura określa się gatunkiem badanym. W celu wykorzystania innych badanych gatunków konieczna może być modyfikacja pewnych aspektów tej metody.
Wiek i szczep
15. Zaleca się wykorzystanie zdrowych, młodych, dorosłych zwierząt (zazwyczaj w wieku 6-12 tygodni w chwili dawkowania; zob. też pkt 13 i 14). W przypadku wykorzystywania zwierząt innych niż młode dorosłe osobniki należy podać uzasadnienie. Na początku badania wszystkie zwierzęta powinny być w podobnym wieku. Odchylenie masy poszczególnych zwierząt nie powinno przekraczać ± 20 % średniej masy badanej grupy. Najlepiej byłoby, gdyby wykorzystywany szczep był taki sam jak szczep wykorzystany do otrzymania bazy danych toksykologicznych dotyczących badanej substancji chemicznej.
Liczba i płeć zwierząt
16. Dla każdej zbadanej dawki należy wykorzystać przynajmniej cztery zwierzęta jednej płci. Płeć wykorzystanych zwierząt należy uzasadnić. Należy rozważyć wykorzystanie obu płci (czterech samców i czterech samic), jeżeli istnieją dowody potwierdzające znaczne różnice w toksyczności związane z płcią.
Warunki przetrzymywania i karmienia
17. W okresie badania zwierzęta na ogół należy przetrzymywać oddzielnie. Przetrzymywanie w grupach może być uzasadnione w szczególnych okolicznościach. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 h światła, 12 h ciemności. Temperatura w pomieszczeniach dla zwierząt doświadczalnych powinna wynosić 22 °C (± 3 °C), a względna wilgotność 30-70 %. Do karmienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej.
Badana substancja chemiczna
18. Znakowana izotopowo badana substancja chemiczna z wykorzystaniem węgla 14C powinna być stosowana we wszystkich aspektach badania związanych z bilansem masy i identyfikacją metabolitów; jeżeli jednak można wykazać, że:
- bilans masy i identyfikację metabolitów można odpowiednio ocenić za pomocą badanej substancji chemicznej nieznakowanej izotopowo,
- swoistość i czułość analityczna metody stosowanej wraz z niepromieniotwórczą badaną substancją chemiczną są równe tym, które można uzyskać przy użyciu badanej substancji chemicznej znakowanej izotopowo, lub wyższe,
wówczas nie trzeba stosować znakowanej izotopowo badanej substancji chemicznej. Ponadto można stosować inne promieniotwórcze stabilne izotopy, w szczególności jeśli dany pierwiastek w całości lub częściowo odpowiada za toksyczność badanej substancji chemicznej. Jeżeli to możliwe, znakowanie izotopowe powinno znajdować się w centralnej części cząsteczki, która jest metabolicznie stabilna (nie podlega wymianie, nie jest usuwana metabolicznie jako CO2 i nie staje się częścią puli fragmentów jednowęglowych organizmu). Znakowanie wielu miejsc lub określonych regionów cząsteczki może być niezbędne do śledzenia przebiegu metabolizmu badanej substancji chemicznej.
19. Znakowane i nieznakowane izotopowo badane substancje chemiczne należy analizować za pomocą odpowiednich metod, aby określić czystość i tożsamość. Czystość radiochemiczna badanej promieniotwórczej substancji chemicznej powinna być możliwie najwyższa z możliwych dla danej substancji (w idealnych warunkach powinna być wyższa niż 95 %). Należy dołożyć rozsądnych starań, aby zidentyfikować zanieczyszczenia obecne na poziomie 2 % lub wyższym. Należy podać czystość wraz z tożsamością i odsetkiem wszelkich zidentyfikowanych zanieczyszczeń. W poszczególnych programach regulacji przewidziane może być zapewnienie dodatkowych wytycznych pomocnych w definiowaniu i specyfikacji badanych substancji chemicznych złożonych z mieszanin, a także metod ustalania czystości.
Wybór dawki
Badanie pilotażowe
20. Zazwyczaj do badania pilotażowego wystarczy pojedyncza dawka doustna. Dawka ta powinna być nietoksyczna, lecz wystarczająco wysoka, aby umożliwić identyfikację metabolitów w wydalinach (i w stosownych przypadkach w osoczu), jak również spełniać określony cel badania pilotażowego, o którym mowa w pkt 12 niniejszej metody badawczej.
Badania główne
21. W przypadku badań głównych preferowane są co najmniej dwie dawki, ponieważ informacje zebrane z przynajmniej dwóch grup otrzymujących dawki mogą pomóc w określeniu dawek w innych badaniach toksyczności oraz pomóc w ocenie dawka-odpowiedź w ramach już dostępnych badań toksyczności.
22. W przypadku podawania dwóch dawek obie dawki powinny być wystarczająco wysokie, aby umożliwić identyfikację metabolitów w wydalinach (i w stosownych przypadkach w osoczu). Przy wyborze dawki należy uwzględnić informacje pochodzące z dostępnych danych dotyczących toksyczności. Jeżeli informacje takie nie są dostępne (np. pochodzące z badań toksyczności ostrej doustnej, w których odnotowano kliniczne oznaki toksyczności, lub z badań toksyczności wywołanej powtarzanym dawkowaniem), można rozważyć taką wartość wyższej dawki, która jest niższa od szacowanej wartości LD50 (droga doustna i droga dermalna) lub LC50 (droga inhalacyjna) lub niższa od niższej wartości szacowanego przedziału toksyczności ostrej. Niższa dawka powinna stanowić pewien ułamek wyższej dawki.
23. W przypadku badania wyłącznie jednego poziomu dawkowania najlepiej byłoby, gdyby dawka była wystarczająco wysoka, aby umożliwić identyfikację metabolitów w wydalinach (i w stosownych przypadkach w osoczu), jednocześnie nie wywołując widocznej toksyczności. Jeżeli drugiego poziomu dawkowania nie uwzględniono, należy to uzasadnić.
24. Jeżeli istnieje potrzeba ustalenia skutków dawki dla procesów kinetycznych, dwie dawki mogą być niewystarczające i przynajmniej jedna dawka powinna być wystarczająco duża, aby nasycić te procesy. Jeżeli pole pod krzywą (AUC) stężenia w osoczu w czasie między dwiema dawkami wykorzystanymi w badaniu głównym nie jest liniowe, jest to silna przesłanka, że gdzieś pomiędzy tymi dwoma poziomami dawkowania występuje nasycenie jednego procesu kinetycznego lub większej ich liczby.
25. W przypadku badanych substancji chemicznych o niskiej toksyczności należy zastosować maksymalną dawkę 1 000 mg/kg masy ciała (droga doustna i droga dermalna; podawanie drogą inhalacyjną - zob. rozdział B.2 niniejszego załącznika; zazwyczaj dawka ta nie przekracza 2 mg/l). Okoliczności specyficzne dla danej substancji chemicznej mogą wymagać zastosowania większej dawki w zależności od potrzeb regulacyjnych. Wybór dawki zawsze należy uzasadnić.
26. Toksykokinetyka pojedynczej dawki i dane dotyczące dystrybucji w tkankach mogą być wystarczające do określenia potencjału akumulacji lub trwałości. W pewnych okolicznościach potrzebne jednak może być podanie powtarzane (i) aby w bardziej kompletny sposób zbadać potencjał akumulacji lub trwałości bądź zmiany w toksykokinetyce (tj. na przykład w indukcji i inhibicji enzymatycznej); lub (ii) zgodnie z wymogami mającego zastosowanie systemu regulacji. W badaniach z zastosowaniem powtarzanego dawkowania w pewnych okolicznościach również konieczne może być powtarzane podanie dużej dawki, chociaż zazwyczaj wystarcza powtarzane podanie małej dawki (zob. także pkt 57).
Podawanie badanej substancji chemicznej
27. Badaną substancję chemiczną należy rozpuścić lub sporządzić jednorodną zawiesinę w tym samym nośniku, który wykorzystano w innych badaniach toksyczności doustnej dotyczących podawania danej badanej substancji chemicznej za pomocą sondy, jeżeli takie informacje na temat nośnika są dostępne. Należy przedstawić uzasadnienie wyboru nośnika. Wybór nośnika i objętość dawki należy uwzględnić w projekcie badania. Zwyczajową metodą podawania jest podawanie przez sondę, jednak podawanie substancji w kapsułkach żelatynowych lub zmieszanej z pokarmem może być w określonych sytuacji korzystniejsze (w obu przypadkach należy przedstawić uzasadnienie). Należy zapewnić weryfikację rzeczywistej dawki podanej każdemu zwierzęciu.
28. Maksymalna objętość cieczy, jaką można podać jednorazowo za pomocą sondy, zależy od wielkości badanego zwierzęcia, rodzaju nośnika oraz tego, czy przed podaniem badanej substancji chemicznej wstrzymuje się podawanie pokarmu. Należy przedstawić uzasadnienie podawania lub ograniczenia podawania pokarmu przed podaniem dawki. Zwykle objętość powinna być utrzymywana na możliwie niskim poziomie, jaki jest praktyczny dla nośników wodnych lub bezwodnych. Objętość dawki zazwyczaj nie powinna przekraczać 10 ml/kg masy ciała w przypadku gryzoni. Objętość nośników stosowanych w przypadku bardziej lipofilnych badanych substancji chemicznych może rozpoczynać się od 4 ml/kg masy ciała. W odniesieniu do powtarzanego dawkowania, gdzie codzienne wstrzymywanie podawania pokarmu byłoby niewskazane, należy rozważyć mniejszą objętość dawki (np. 2-4 ml/kg masy ciała). W miarę możliwości można rozważyć zastosowanie objętości dawki zgodnej z dawką badanej substancji chemicznej podawaną drogą pokarmową przez sondę w ramach innych badań.
29. Podawanie dożylne badanej substancji chemicznej i pomiar tej substancji we krwi lub w wydalinach można wykorzystać do ustalenia biodostępności lub względnego wchłaniania po podaniu doustnym. W przypadku badania po podaniu dożylnym podaje się pojedynczą dawkę (zwykle odpowiadającą mniejszej dawce podawanej drogą doustną, lecz jej nieprzekraczającej - zob. wybór dawki) badanej substancji chemicznej z zastosowaniem odpowiedniego nośnika. Materiał ten należy podawać w odpowiedniej objętości (np. 1 ml/kg masy ciała) w wybranym miejscu podania co najmniej czterem zwierzętom odpowiedniej płci (jeśli jest to uzasadnione, można wykorzystać obie płci, zob. pkt 16). W przypadku dożylnego podania badanej substancji chemicznej konieczne jest przygotowanie w pełni rozpuszczonej dawki lub zawiesiny. Nośnik dla podania dożylnego nie powinien zakłócać integralności ani przepływu krwi. Jeśli badana substancja chemiczna podawana jest we wlewie, szybkość wlewu powinna być podana i ujednolicona pomiędzy zwierzętami, pod warunkiem że stosowana jest pompa infuzyjna. Należy zastosować znieczulenie w przypadku wprowadzania kaniuli do żyły szyjnej (w celu podania badanej substancji chemicznej lub pobrania krwi) lub jeżeli do podania wykorzystuje się tętnicę udową. Należy rozważyć rodzaj znieczulenia, ponieważ może mieć on wpływ na toksykokinetykę. Przed podaniem badanej substancji chemicznej wraz z nośnikiem zwierzętom należy umożliwić odpowiednią regenerację.
30. W przypadku konkretnych badanych substancji chemicznych zastosowanie mogą mieć inne drogi podania, takie jak droga dermalna i inhalacyjna (zob. pkt 74-78), biorąc pod uwagę cechy fizykochemiczne tych substancji i spodziewane zastosowanie przez człowieka lub narażenie ludzi.
Pomiary
Bilans masy
31. Bilans masy określa się poprzez zsumowanie odsetka podanej (promieniotwórczej) dawki wydalonej w moczu, kale i wydychanym powietrzu oraz odsetka obecnego w tkankach, reszcie ciała i materiale wypłukanym z klatki (zob. pkt 46). Na ogół całkowity odzysk podanej badanej substancji chemicznej (promieniotwórczej) rzędu > 90 % uważa się za wystarczający.
Wchłanianie
32. Wstępne oszacowanie absorpcji można uzyskać poprzez wyłączenie odsetka dawki w przewodzie pokarmowym lub w kale z pomiaru bilansu masy. Obliczanie odsetka wchłaniania - zob. pkt 33. Badanie wydalin - zob. pkt 44-49. Jeżeli dokładnego stopnia wchłaniania po podaniu dawki drogą doustną nie można określić na podstawie badań bilansu masy (np. jeżeli więcej niż 20 % podanej dawki występuje w kale), konieczne mogą być dalsze badania. Badania te mogą obejmować albo 1) podanie badanej substancji chemicznej drogą doustną i pomiar tej substancji w żółci; albo 2) podanie badanej substancji chemicznej drogą doustną i dożylną oraz pomiar badanej substancji chemicznej netto w moczu, wydychanym powietrzu i ciele dla każdej z obu tych dróg podania. W obu projektach badania pomiar promieniotwórczości wykonuje się jako zastępczą metodę swoistej analizy chemicznej badanej substancji chemicznej i metabolitów.
33. W przypadku przeprowadzania badania wydalania z żółcią zazwyczaj stosuje się doustną drogę podawania. W badaniu tym wprowadza się kaniulę do przewodów żółciowych co najmniej czterech zwierząt odpowiedniej płci (lub w uzasadnionych przypadkach obu płci) i podaje pojedynczą dawkę badanej substancji chemicznej. Po podaniu tej substancji wydalanie promieniotwórczości/badanej substancji chemicznej w żółci należy monitorować tak długo, jak będzie to konieczne do oszacowania odsetka podanej dawki, która jest wydalana tą drogą, co można wykorzystać do bezpośredniego obliczenia stopnia wchłaniania po podaniu doustnym w następujący sposób:
Wartość procentowa wchłaniania = (ilość w żółci + moczu + wydychanym powietrzu + ciele bez zawartości przewodu pokarmowego)/podana ilość × 100
34. W przypadku niektórych klas badanych substancji chemicznych może wystąpić bezpośrednie wydzielanie wchłoniętej dawki przez błony jelitowe. W takiej sytuacji pomiaru % dawki w kale po doustnym podaniu dawki kaniulą wprowadzoną w drogi żółciowe szczura nie uważa się za wartość reprezentatywną dla niewchłoniętej dawki. Zaleca się, aby w przypadkach, w których sądzi się, że zachodzi wydzielanie jelitowe, % wchłoniętej dawki opierał się na wchłanianiu obliczonym poprzez porównanie wydalania po podaniu dawki drogą doustną i drogą dożylną (szczur nienaruszony lub z kaniulą wprowadzoną w drogi żółciowe) (zob. pkt 35). Zaleca się również, aby w przypadku, gdy oznaczanie ilościowe wydzielania jelitowego uważa się za konieczne, mierzone były wydaliny u szczura z kaniulą wprowadzoną w drogi żółciowe po podaniu dawki drogą dożylną.
Biodostępność
35. Biodostępność można określić na podstawie kinetyki osocza/krwi w odniesieniu do grup, które daną substancję otrzymują drogą doustną i dożylną, jak opisano w pkt 50-52, poprzez specyficzną analizę chemiczną badanej substancji lub istotnych metabolitów, a tym samym nie wymaga to stosowania badanej substancji chemicznej znakowanej izotopowo. Biodostępność (F) badanej substancji chemicznej lub istotnych metabolitów można zatem obliczyć w następujący sposób:
F = (AUCexp/AUCIV) × (dawkaIV/dawkaexp)
gdzie AUC jest polem pod krzywą stężenia w osoczu w czasie, a exp jest doświadczalną drogą podania (doustną, dermalną lub inhalacyjną).
36. Dla celów zastosowania w ocenie ryzyka skutków ogólnoustrojowych biodostępność składnika toksycznego jest na ogół preferowana nad odsetek wchłaniania, gdy porównuje się stężenia ogólnoustrojowe pochodzące z badań na zwierzętach z analogicznymi danymi z biomonitoringu uzyskanymi z badań narażenia pracowników. Sytuacja może stać się bardziej złożona, jeżeli dawki znajdują się w zakresie nieliniowym, dlatego ważne jest, aby w przesiewowych badaniach toksykokinetycznych dawki określać w zakresie liniowym.
Dystrybucja w tkankach
37. Wiedza o dystrybucji badanej substancji chemicznej lub jej metabolitów w tkankach jest ważna dla identyfikacji tkanek docelowych, a także dla zrozumienia podstawowych mechanizmów toksyczności oraz dla uzyskania informacji dotyczących potencjału akumulacji i trwałości badanej substancji chemicznej i metabolitów. Odsetek całkowitej (promieniotwórczej) dawki w tkankach i w reszcie ciała należy zbadać przynajmniej na zakończenie doświadczenia związanego z wydalaniem (tzn. zazwyczaj do 7 dni po podaniu dawki lub wcześniej, w zależności od zachowania badanej substancji chemicznej). W przypadku niewykrycia badanej substancji chemicznej w tkankach w chwili zakończenia badania (np. ponieważ z powodu krótkiego okresu półtrwania badana substancja mogła zostać usunięta przed zakończeniem badania) należy zachować ostrożność, aby zapobiec błędnej interpretacji danych. W tego typu sytuacji dystrybucję w tkankach należy zbadać w chwili, gdy stężenie badanej substancji chemicznej (lub metabolitu) osiąga odpowiednio szczytowe stężenie w krwi/osoczu (Tmax) lub szczytowy poziom wydzielania z moczem (zob. pkt 38). Ponadto pobieranie tkanek w dodatkowych punktach czasowych może być konieczne dla określenia dystrybucji badanej substancji chemicznej lub jej metabolitów w tkankach, ocenienia (w stosownych przypadkach) zależności od czasu, pomocniczo dla określenia bilansu masy lub wymagane przez właściwy organ. Do tkanek, które należy pobrać, należą: wątroba, tłuszcz, przewód pokarmowy, nerka, śledziona, krew pełna, reszta ciała, tkanki organu docelowego i wszelkie inne tkanki (np. tarczyca, erytrocyty, organy rozrodcze, skóra, oko (szczególnie u zwierząt zabarwionych)) mające potencjalne znaczenie przy toksykologicznej ocenie badanej substancji chemicznej. Należy rozważyć analizę dodatkowych tkanek w tych samych punktach czasowych, aby zmaksymalizować wykorzystanie zwierząt, i w przypadku gdy toksyczność dla organu docelowego obserwuje się w badaniach toksyczności podprzewlekłej lub przewlekłej. Należy również podać stężenie rezydualne (promieniotwórczość) i współczynniki podziału tkanki/osocze (krew).
38. Ocena dystrybucji w tkankach w dodatkowych punktach czasowych, takich jak moment szczytowego stężenia w osoczu/krwi (np. Tmax) lub szczytowego poziomu wydzielania z moczem, uzyskana z odpowiednich badań kinetyki osocza/krwi lub wydalin, również może być potrzebna lub wymagana przez właściwy organ. Informacje te mogą być przydatne dla zrozumienia toksyczności oraz potencjału akumulacji i trwałości badanej substancji chemicznej i metabolitów. Należy podać uzasadnienie wyboru próbek; próbki do analizy na ogół powinny być takie same, jak określone powyżej (zob. pkt 37).
39. Oznaczanie ilościowe promieniotwórczości na potrzeby badań dystrybucji w tkankach można przeprowadzić poprzez wycięcie organów, ich homogenizację, spalenie lub rozpuszczenie, a następnie poddanie uwięzionych pozostałości analizie za pomocą scyntylacyjnego licznika cieczowego. Pewne techniki, obecnie znajdujące się na różnych etapach rozwoju, np. ilościowa autoradiografia całego ciała i mikroskopowa autoradiografia receptorów, mogą okazać się przydatne przy określaniu dystrybucji badanej substancji chemicznej w organach lub tkankach (3) (4).
40. W przypadku dróg narażenia innych niż droga doustna należy pobrać i przeanalizować określone tkanki, takie jak płuca - w badaniach inhalacyjnych lub skóra - w badaniach z zastosowaniem dermalnej drogi podania. Zob. pkt 74-78.
Metabolizm
41. Wydaliny (i w stosownych przypadkach osocze) należy zbierać w celu identyfikacji i pomiaru ilościowego niezmienionej badanej substancji chemicznej i metabolitów zgodnie z opisem w pkt 44-49. Dopuszczalne jest łączenie wydalin, aby ułatwić identyfikację metabolitu w danej grupie otrzymującej dawkę. Zalecane jest profilowanie metabolitów pochodzących z każdego okresu. Jeżeli uniemożliwia to brak próbki lub promieniotwórczość, dopuszczalne jest jednak łączenie moczu i kału z kilku punktów czasowych, lecz niedopuszczalne jest łączenie wydalin z grup różnej płci lub otrzymujących odmienne dawki. W celu zbadania moczu, kału, pozostałości promieniotwórczości u zwierząt poddanych działaniu substancji i w stosownych przypadkach żółci należy wykorzystać odpowiednie metody ilościowe i jakościowe.
42. Należy dołożyć rozsądnych starań, aby zidentyfikować wszystkie metabolity obecne na poziomie 5 % podanej dawki lub wyższym oraz określić układ metaboliczny badanej substancji chemicznej. Badaną substancję chemiczną, którą scharakteryzowano w wydalinach jako stanowiącą co najmniej 5 % podanej dawki, należy zidentyfikować. Identyfikacja odnosi się do dokładnego strukturalnego określenia składników. Zazwyczaj identyfikacji towarzyszy albo chromatografia równoległa metabolitu o znanych standardach z zastosowaniem dwóch odmiennych układów, albo techniki umożliwiające pozytywną identyfikację strukturalną, takie jak spektrometria masowa, spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) itd. W przypadku chromatografii równoległej technik chromatograficznych wykorzystujących tę samą fazę stacjonarną przy dwóch różnych układach rozpuszczalników nie uważa się za odpowiednią weryfikację tożsamości metabolitu za pomocą dwóch metod, ponieważ metody te nie są niezależne. Identyfikację poprzez chromatografię równoległą należy przeprowadzić z zastosowaniem dwóch odmiennych, niezależnych analitycznie układów, takich jak chromatografia cienkowarstwowa w normalnym i odwróconym układzie faz (TLC) i wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC). O ile rozdzielanie chromatograficzne charakteryzuje się wystarczającą jakością, dodatkowe potwierdzenie za pomocą metod spektroskopowych nie jest potrzebne. Ewentualnie jednoznaczną identyfikację można również uzyskać, korzystając z metod dostarczających informacje strukturalne, takich jak: chromatografia cieczowa/spektometria masowa (LC-MS) lub chromatografia cieczowa/tandemowa spektometria masowa (LC-MS/MS), chromatografia gazowa/spektometria masowa (GCMS) oraz spektometria NMR.
43. Jeżeli identyfikacja metabolitów obecnych na poziomie 5 % podanej dawki lub wyższym jest niemożliwa, w sprawozdaniu końcowym należy przedstawić uzasadnienie/wyjaśnienie. Aby uzyskać lepsze zrozumienie szlaku metabolicznego na potrzeby oceny zagrożenia lub ryzyka związanego z badaną substancją chemiczną, właściwa może być identyfikacja metabolitów stanowiących mniej niż 5 % podanej dawki. W miarę możliwości należy podać potwierdzenie strukturalne. Może ono obejmować profilowanie w osoczu, krwi lub innych tkankach.
Wydalanie
44. Szybkość i stopień wydalania podanej dawki należy określić poprzez pomiar odsetka odzyskanej (promieniotwórczej) dawki z moczu, kału i wydychanego powietrza. Dane te pomogą również w określeniu bilansu masy. Ilości badanej substancji chemicznej (promieniotwórczości) wydalonej w moczu, kale i wydychanym powietrzu należy określać w odpowiednich odstępach czasowych (zob. pkt 47-49). Doświadczenia z powtarzanym dawkowaniem należy odpowiednio zaprojektować, aby umożliwić zbieranie danych dotyczących wydalin w celu zrealizowania celów opisanych w pkt 26. Umożliwi to porównanie z doświadczeniami z pojedynczą dawką.
45. Jeżeli badanie pilotażowe wykazało, że w wydychanym powietrzu nie jest wydalana istotna ilość badanej substancji chemicznej (promieniotwórczości) (zgodnie z pkt 49), wówczas w ostatecznym badaniu wydychane powietrze nie musi być gromadzone.
46. Każde zwierze należy umieścić w oddzielnej jednostce metabolicznej w celu zebrania wydalin (moczu, kału i wydychanego powietrza). Na koniec każdego okresu zbierania (zob. pkt 47-49) jednostkę metaboliczną należy spłukać odpowiednim rozpuszczalnikiem (tzw. "materiał wypłukany z klatki"), aby zapewnić maksimum odzysku badanej substancji chemicznej (promieniotwórczości). Zbieranie wydalin należy zakończyć 7 dnia lub po odzyskaniu co najmniej 90 % podanej dawki, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej.
47. Całkowitą ilość badanej substancji chemicznej (promieniotwórczości) w moczu należy określić dla przynajmniej dwóch punktów czasowych w pierwszym dniu zbierania, z czego jeden punkt powinien mieć miejsce 24 godziny po podaniu dawki, a następnie każdego dnia aż do zakończenia badania. Zachęca się wybranie więcej niż dwóch punktów zbierania moczu w pierwszym dniu (np. po 6, 12 i 24 godzinach). Należy przeanalizować wyniki badań pilotażowych, aby uzyskać informacje dotyczące innych lub dodatkowych punktów czasowych w odniesieniu do zbierania moczu. Należy podać uzasadnienie harmonogramu zbierania.
48. Całkowitą ilość badanej substancji chemicznej (promieniotwórczości) w kale należy określać codziennie, począwszy od 24 godzin od podania dawki aż do zakończenia badania, chyba że badania pilotażowe wskazują na inne lub dodatkowe punkty czasowe w odniesieniu do zbierania kału. Należy podać uzasadnienie innego harmonogramu zbierania kału.
49. Gromadzenie wydychanego CO2 i innych lotnych materiałów można przerwać w danym doświadczeniu badawczym, jeżeli w wydychanym powietrzu wykryto mniej niż 1 % podanej dawki w okresie zbierania powietrza wynoszącym 24 godziny.
Badania przebiegu w czasie
Kinetyka osocza/krwi
50. Celem tych badań jest uzyskanie szacunków dotyczących podstawowych parametrów toksykokinetycznych [np. Cmax, Tmax, okres półtrwania (t1/2), pole pod krzywą] w odniesieniu do badanej substancji chemicznej. Badania te można przeprowadzać w ramach jednej dawki lub - co bardziej prawdopodobne - przy co najmniej dwóch dawkach. Dawkę należy określić zgodnie z charakterem doświadczenia lub zagadnieniem, którego ono dotyczy. Dane dotyczące kinetyki mogą być potrzebne w odniesieniu do takich kwestii, jak biodostępność badanej substancji chemicznej, lub dla celów wyjaśnienia skutków dawki dla klirensu (np. czy klirens jest nasycony w sposób zależny od dawki).
51. Na potrzeby tych badań w każdej grupie otrzymującej dawkę powinny znaleźć się co najmniej cztery zwierzęta jednej płci. Płeć wykorzystanych zwierząt należy uzasadnić. Należy rozważyć wykorzystanie obu płci (czterech samców i czterech samic), jeżeli istnieją dowody potwierdzające znaczne różnice w toksyczności związane z płcią.
52. Po podaniu badanej substancji chemicznej (znakowanej izotopowo) należy pobrać próbki krwi od każdego zwierzęcia w odpowiednich punktach czasowych za pomocą odpowiedniej metody pobierania próbek. Rozmiar i liczba próbek krwi, które można uzyskać od pojedynczego zwierzęcia, mogą być ograniczone potencjalnymi skutkami powtarzanego pobierania próbek na zdrowie/fizjologię zwierzęcia lub czułością metody analitycznej. Próbki należy poddać analizie w odniesieniu do każdego zwierzęcia. W pewnych okolicznościach (np. przy charakterystyce metabolitu) konieczne może się okazać łączenie próbek pochodzących od więcej niż jednego zwierzęcia. Próbki zbiorcze należy wyraźnie zidentyfikować i podać wyjaśnienie łączenia próbek. W przypadku stosowania badanej substancji chemicznej znakowanej izotopowo właściwa może być analiza obecnej promieniotwórczości ogółem. W takiej sytuacji promieniotwórczość ogółem należy przeanalizować w krwi pełnej i osoczu lub w osoczu i krwinkach czerwonych, aby umożliwić obliczenie współczynnika podziału krew/osocze. W innych okolicznościach konieczne może być bardziej szczegółowe badanie wymagające identyfikacji związku macierzystego lub metabolitów bądź oceny wiązań białkowych.
Kinetyka innych tkanek
53. Celem tych badań jest uzyskanie informacji na temat przebiegu w czasie, aby odpowiedzieć na pytania związane z takimi kwestiami, jak: charakter działania toksycznego, bioakumulacja lub biotrwałość, poprzez określenie poziomów badanej substancji chemicznej w różnych tkankach. Wybór tkanek i liczba ocenianych punktów czasowych będą zależeć od kwestii, którą należy zbadać, i od bazy danych toksykologicznych dotyczących badanej substancji chemicznej. W projekcie tych dodatkowych badań kinetyki tkanek należy uwzględnić informacje zgromadzone zgodnie z opisem zawartym w pkt 37-40. Badania te mogą obejmować dawkowanie jednorazowe lub powtarzane. Należy przedstawić szczegółowe uzasadnienie zastosowanego podejścia.
54. Powody przeprowadzania badań kinetycznych innych tkanek mogą obejmować:
- dowody na wydłużony okres półtrwania w krwi, co wskazuje na możliwość akumulacji badanej substancji chemicznej w różnych tkankach, lub
- chęć sprawdzenia, czy w określonych tkankach osiągnięto poziom w stanie ustalonym (np. w badaniach z powtarzanym dawkowaniem, nawet jeżeli mogło dojść do widocznego osiągnięcia poziomu stężenia badanej substancji chemicznej we krwi w stanie ustalonym, może potrzebne być upewnienie się, że stan ustalony został osiągnięty również w tkankach docelowych).
55. W przypadku tego rodzaju badań przebiegu w czasie odpowiednią dawkę badanej substancji chemicznej należy podać drogą doustną co najmniej czterem zwierzętom na dawkę w każdym punkcie czasowym i monitorować w wybranych tkankach przebieg dystrybucji w czasie. Można wykorzystać tylko jedną płeć, chyba że zaobserwowano toksyczność zależną od płci. To, czy analiza obejmie promieniotwórczość ogółem, czy substancję macierzystą lub metabolity, będzie też zależało od kwestii, której badanie dotyczy. Ocenę dystrybucji w tkance należy przeprowadzić za pomocą odpowiednich technik.
Indukcja/inhibicja enzymatyczna
56. Badania dotyczące możliwych skutków indukcji/inhibicji enzymatycznej lub biotransformacji badanej substancji chemicznej mogą być konieczne w co najmniej jednym z następujących przypadków:
1) dostępne dowody wskazują na zależność pomiędzy biotransformacją badanej substancji chemicznej a zwiększoną toksycznością;
2) dostępne dane dotyczące toksyczności wskazują na nieliniową zależność pomiędzy dawką a metabolizmem;
3) wyniki badań dotyczących identyfikacji metabolitów wskazują na identyfikację potencjalnie toksycznego metabolitu, który mógł zostać wytworzony poprzez ścieżkę enzymatyczną wywołaną przez badaną substancję chemiczną;
4) w odniesieniu do wyjaśnienia skutków, co do których zakłada się, że są związane ze zjawiskiem indukcji enzymatycznej;
5) jeżeli w profilu metabolicznym badanej substancji zaobserwowano zmiany istotne pod względem toksykologicznym w ramach doświadczeń in vitro lub in vivo prowadzonych na innych gatunkach lub w innych warunkach, konieczne może być scharakteryzowanie zaangażowanych enzymów (np. enzymy fazy I, takie jak izoenzymy układu monooksygenaz zależnych od cytochromu P450, enzymy fazy II, takie jak izoenzymy siarkotransferazy lub transferaza urydynodifosfoglukuronowa bądź wszelkie inne istotne enzymy). Informacje te można wykorzystać do oceny zasadności wykorzystania danego gatunku w ekstrapolacji gatunkowej.
57. Należy zastosować odpowiednie protokoły badania służące do oceny zmian w toksykokinetyce związanych z badaną substancją chemiczną, poddane stosownej walidacji i uzasadnione. Przykładowy projekt badania obejmuje powtarzane podawanie badanej substancji chemicznej nieznakowanej izotopowo, następnie podanie w 14. dniu pojedynczej dawki znakowanej izotopowo lub powtarzane podawanie badanej substancji chemicznej znakowanej izotopowo i pobieranie próbek w 1., 7. i 14. dniu w celu określenia profilów metabolitów. Powtarzane podawanie badanej substancji chemicznej znakowanej izotopowo może również dostarczyć informacji na temat bioakumulacji (zob. pkt 26).
METODY UZUPEŁNIAJĄCE
58. Uzupełniające rodzaje podejścia wykraczające poza doświadczenia in vivo opisane w niniejszej metodzie badawczej mogą dostarczyć przydatnych informacji na temat wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu i eliminacji badanej substancji chemicznej u niektórych gatunków.
Wykorzystywanie informacji z badań in vitro
59. W badaniach in vitro z zastosowaniem odpowiednich układów badawczych można rozważyć kilka kwestii dotyczących metabolizmu badanej substancji chemicznej. Do badania możliwych metabolitów można wykorzystywać świeżo wyizolowane lub hodowane hepatocyty i frakcje subkomórkowe (np. mikrosomy i cytozol lub frakcję S9) wątroby. Metabolizm miejscowy w organie docelowym, np. w płucu, może mieć znaczenie dla oceny ryzyka. Dla tych celów użyteczne mogą być mikrosomalne frakcje tkanek docelowych. Badania z mikrosomami mogą być przydatne, jeżeli chodzi o uwzględnienie potencjalnych różnic płci i etapu życia oraz scharakteryzowanie parametrów enzymatycznych (Km i Vmax), które mogą pomóc w ocenie zależności metabolizmu od dawki w odniesieniu do poziomów narażenia. Ponadto mikrosomy mogą być przydatne do identyfikowania konkretnych enzymów mikrosomalnych biorących udział w metabolizmie badanej substancji chemicznej, które mogą być istotne w ekstrapolacji gatunkowej (zob. też pkt 56). Potencjał indukcji biotransformacji można również badać przy użyciu frakcji subkomórkowych wątroby (np. mikrosomów i cytozolu) zwierząt wcześniej poddanych działaniu danej badanej substancji chemicznej, in vitro poprzez badania indukcji w hepatocytach lub z wykorzystaniem określonych linii komórkowych oddających odpowiednie enzymy. W pewnych okolicznościach i w odpowiednich warunkach można wziąć pod uwagę użycie frakcji subkomórkowych pochodzących z tkanek ludzkich w celu określenia potencjalnych różnic między gatunkami pod względem biotransformacji. Te wyniki badań in vitro mogą również być przydatne do opracowania modeli PBTK (5).
60. Badania wchłaniania przez skórę in vitro mogą dostarczyć dodatkowych informacji na potrzeby scharakteryzowania wchłaniania (6).
61. Na potrzeby kwestii podobnych do tych, w których bada się mikrosomy wątroby, można wykorzystywać pierwotne hodowle komórkowe z komórek wątroby i płaty świeżej tkanki. W niektórych przypadkach można uzyskać odpowiedź na konkretne pytania przy użyciu linii komórkowych o określonej ekspresji odpowiedniego enzymu lub modyfikowanych linii komórkowych. W pewnych sytuacjach przydatne może być przeanalizowanie za pomocą badań in vitro zahamowania i indukowania określonych izoenzymów cytochromu P450 (np. CYP1A1, 2E1, 1A2 i in.) lub enzymów fazy II przez związek macierzysty. Uzyskane informacje mogą być użyteczne w odniesieniu do związków o podobnej strukturze.
Wykorzystywanie danych toksykokinetycznych z badań toksyczności jako informacji uzupełniających
62. Analiza próbek krwi, tkanek lub wydalin uzyskanych podczas przeprowadzania wszelkich innych badań toksyczności może dostarczyć danych na temat biodostępności, zmian stężenia w osoczu w czasie (pole pod krzywą, Cmax), potencjału bioakumulacji, klirensu oraz zmian metabolizmu i kinetyki zależnych od płci lub etapu życia.
63. Rozważania dotyczące projektu badania można wykorzystać, aby odpowiedzieć na pytania odnoszące się do: nasycenia szlaków wchłaniania, biotransformacji lub wydalania przy wyższych poziomach dawkowania; działania nowych szlaków metabolicznych przy większych dawkach oraz ograniczenia toksycznych metabolitów do wyższych dawek.
64. W innych rozważaniach związanych z oceną zagrożenia można uwzględniać takie kwestie, jak:
- związana z wiekiem wrażliwość wynikająca z różnic w statusie bariery krewmózg, zdolności metabolicznej nerek lub zdolnościach detoksykacyjnych,
- wrażliwość subpopulacji wynikająca z różnic w zdolności do biotransformacji lub innych różnic toksykokinetycznych,
- stopień narażenia płodu poprzez transfer przezłożyskowy substancji chemicznych lub noworodka poprzez laktację.
Korzystanie z modelowania toksykokinetycznego
65. Modele toksykokinetyczne mogą być przydatne do różnych aspektów oceny zagrożenia i ryzyka, na przykład do przewidzenia narażenia ogólnoustrojowego i dawki w odniesieniu do tkanek wewnętrznych. Ponadto mogą zapewnić odpowiedzi na określone pytania dotyczące charakteru działania. Modele te mogą stanowić podstawę ekstrapolacji w odniesieniu do gatunku, dróg narażenia i schematów dawkowania oraz podstawę oceny ryzyka dla ludzi. Dane przydatne do opracowania fizjologicznych modeli toksykokinetycznych (PBTK) dla badanej substancji chemicznej podawanej danemu gatunkowi obejmują 1) współczynniki podziału; 2) stałe biochemiczne i parametry fizjologiczne; 3) parametry wchłaniania dla poszczególnych dróg narażenia; oraz 4) dane kinetyczne in vivo do oceny modelu [np. parametry klirensu dla odpowiednich (> 10 %) dróg wydalania, Km i Vmax dla metabolizmu]. Dane doświadczalne wykorzystane do opracowywania modelu należy wygenerować za pomocą wiarygodnych naukowo metod, a wyniki modelu poddać walidacji. Parametry specyficzne dla badanej substancji chemicznej i gatunku, takie jak: współczynniki wchłaniania, podział krewtkanka i stałe metaboliczne, często określa sie w celu ułatwienia opracowania modeli nieopartych na przedziałach lub modeli fizjologicznych (7).
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
66. Zaleca się, aby sprawozdanie z badania zawierało spis treści.
Treść sprawozdania
67. Treść sprawozdania powinna obejmować informacje uwzględnione w niniejszej metodzie badawczej, które należy uporządkować w sekcje i punkty w następujący sposób:
Streszczenie
68. Ta sekcja sprawozdania z badania powinna zawierać streszczenie projektu badania i opis zastosowanych metod. Należy w niej również podkreślić kluczowe wyniki dotyczące bilansu masy, charakteru i ilości metabolitów, pozostałości w tkankach, klirensu, potencjału bioakumulacji, różnic związanych z płcią itd. Streszczenie należy przedstawić w sposób na tyle szczegółowy, aby umożliwić ocenę wyników.
Wprowadzenie
69. Ta sekcja sprawozdania powinna obejmować cele badania, jego uzasadnienie i projekt, a także odpowiednie źródła i informacje wprowadzające.
Materiały i metody
70. Ta sekcja sprawozdania powinna zawierać szczegółowy opis wszystkich istotnych informacji, w tym:
a) Badana substancja chemiczna
Ta podsekcja powinna zawierać identyfikację badanej substancji chemicznej: nazwę chemiczną, strukturę molekularną, jakościowe i ilościowe oznaczenie jej składu chemicznego, czystość chemiczną i w miarę możliwości rodzaj i ilości jakichkolwiek zanieczyszczeń. Powinna również obejmować informacje dotyczące właściwości fizykochemicznych, w tym stanu skupienia, barwy, całkowitej rozpuszczalności lub współczynnika podziału, stabilności oraz w stosownych przypadkach działania żrącego. W stosownych przypadkach należy przedstawić informacje na temat izomerów. Jeżeli badana substancja chemiczna jest znakowana izotopowo, w tej podsekcji należy podać następujące informacje: typ nuklidu promieniotwórczego, pozycję znacznika, aktywność właściwą i czystość radiochemiczną.
Należy podać typ lub opis wszelkich nośników, rozpuszczalników, nośników zawiesin oraz emulgatorów lub innych materiałów wykorzystywanych do podawania badanej substancji chemicznej.
b) Badane zwierzęta
Ta podsekcja powinna zawierać informacje na temat badanych zwierząt, w tym dotyczące wyboru i uzasadnienia wyboru gatunku, szczepu i wieku w chwili rozpoczęcia badania, płci, jak również masy ciała, stanu zdrowia i hodowli.
c) Metody
Ta podsekcja powinna zawierać szczegółowe informacje na temat projektu badania i zastosowanej metodyki. Powinna obejmować opis:
(1) w stosownych przypadkach - uzasadnienia wszelkich zmian drogi narażeniu i warunków narażenia;
(2) uzasadnienia wyboru poziomów dawkowania;
(3) w stosownych przypadkach - opis badań pilotażowych wykorzystanych w układzie doświadczalnym dalszych badań. Należy przedstawić dane potwierdzające badanie pilotażowe;
(4) sposobu przygotowywania roztworów dawek oraz rodzaju rozpuszczalnika lub nośnika, jeżeli został użyty;
(5) liczby grup badanych i liczby zwierząt na grupę;
(6) poziomów dawkowania i objętości dawek (oraz aktywności właściwej dawki w przypadku zastosowania izotopów promieniotwórczych);
(7) drogi i metody podawania;
(8) częstotliwości dawkowania;
(9) okresu wstrzymania podawania pokarmu (jeżeli zastosowano);
(10) promieniotwórczości na zwierzę ogółem;
(11) postępowania ze zwierzętami;
(12) pobierania próbek i postępowania z nimi;
(13) metod analitycznych wykorzystanych w celu oddzielenia, pomiaru ilościowego i identyfikacji metabolitów;
(14) granicy wykrywalności w odniesieniu do zastosowanych metod;
(15) innych zastosowanych pomiarów i procedur doświadczalnych (w tym walidacji metod wykorzystanych do analizy metabolitów).
d) Analiza statystyczna
Jeżeli do analizy wyników badania zastosowano analizę statystyczną, wówczas sprawozdanie powinno zawierać wystarczające informacje dotyczące użytych metod analizy i oprogramowania komputerowego, tak aby niezależny recenzent/statystyk mógł dokonać powtórnej oceny i odtworzyć analizę.
W przypadku badań z wykorzystaniem modeli układów, takich jak fizjologiczny model toksykokinetyczny (PBTK), prezentacja modeli powinna obejmować pełny opis modelu, aby umożliwić jego niezależną rekonstrukcję i walidację (zob. pkt 65 i dodatek: Definicje).
Wyniki
71. Wszystkie dane należy zestawić w formie tabeli z odpowiednią oceną statystyczną oraz opisać w tekście tej sekcji. Dane z pomiarów promieniotwórczości należy streścić i przedstawić w formie odpowiedniej dla badania, zwykle w ekwiwalentach mikrogramów lub miligramów na masę próbki, chociaż można zastosować także inne jednostki. Sekcja ta powinna zawierać ilustracje graficzne wyników, kopię reprezentatywnych danych chromatograficznych i spektrometrycznych, nazwy/oznaczenie ilościowe metabolitów oraz proponowane szlaki metaboliczne, w tym strukturę molekularną metabolitów. Ponadto w stosownych przypadkach należy zawrzeć w tej sekcji następujące informacje:
(1) ilość i procent odzysku promieniotwórczości w moczu, kale, wydychanym powietrzu oraz w płynach pozostałych po myciu klatek z moczu i kału.
- w przypadku badań z zastosowaniem dermalnej drogi podania należy również uwzględnić dane dotyczące odzysku badanej substancji chemicznej ze skóry poddanej działaniu substancji i płynów pozostałych po przemywaniu skóry oraz rezydualnej promieniotwórczości w skórze, opisując przy tym urządzenie i jednostkę metaboliczną, a także wyniki badania przemywania skóry. Dalsze omówienie - zob. pkt 74-77,
- w przypadku badań z zastosowaniem inhalacyjnej drogi podania należy również uwzględnić dane dotyczące odzysku badanej substancji chemicznej z płuc i tkanek nosa (8). Dalsze omówienie - zob. pkt 78;
(2) dystrybucję w tkankach, wyrażoną jako procent podanej dawki i stężenia (w ekwiwalentach mikrogramów na gram tkanki), oraz proporcje tkanki do krwi lub tkanki do osocza;
(3) bilans materiałowy opracowany na podstawie każdego badania wiążącego się z testami tkanek ciała i wydalin;
(4) stężenie w osoczu i parametry toksykokinetyczne (biodostępność, pole pod krzywą, Cmax, Tmax, klirens, okres półtrwania) po podaniu właściwą drogą (drogami) narażenia;
(5) szybkość i stopień wchłaniania badanej substancji chemicznej po podaniu właściwą drogą (drogami) narażenia;
(6) ilości badanej substancji chemicznej i metabolitów (wyrażone jako procent podanej dawki) zebranych w wydalinach;
(7) odniesienie do danych w załączeniu, zawierających dane dotyczące poszczególnych zwierząt w odniesieniu do wszystkich punktów końcowych pomiarów (np. dawkowanie, procent odzysku, stężenia, parametry toksykokinetyczne itp.);
(8) rysunek, na którym przedstawione są proponowane szlaki metaboliczne i struktura molekularna metabolitów.
Omówienie i wnioski
72. W tej sekcji autor lub autorzy powinni:
(1) podać proponowany szlak metaboliczny na podstawie wyników metabolizmu i rozmieszczenia badanej substancji chemicznej;
(2) omówić ewentualne różnice między gatunkami i płciami pod względem rozmieszczenia lub biotransformacji badanej substancji chemicznej;
(3) zestawić w formie tabeli i omówić w stosownych przypadkach rodzaj i ilość metabolitów, klirens, potencjał bioakumulacji oraz poziom pozostałości związku macierzystego lub metabolitów w tkankach, a także możliwe zmiany parametrów toksykokinetycznych uwarunkowane dawką;
(4) włączyć do tej sekcji wszelkie istotne dane toksykokinetyczne uzyskane w trakcie prowadzenia badań toksyczności;
(5) podać zwięzłą konkluzję, którą mogą potwierdzać wyniki badania;
(6) dodać sekcje (w razie potrzeby lub w stosownych przypadkach).
73. Dodatkowe sekcje należy wykorzystać do zamieszczenia potwierdzających danych bibliograficznych, tabel, rysunków, dodatków itp.
ALTERNATYWNE DROGI NARAŻENIA
Droga dermalna
Poddawanie działaniu substancji drogą dermalną
74. Niniejsza sekcja zawiera szczegółowe informacje na temat badania toksykokinetyki badanej substancji chemicznej podawanej drogą dermalną. W odniesieniu do wchłaniania przez skórę należy zapoznać się z rozdziałem B.44 niniejszego załącznika [Absorpcja przez skórę: metoda in vivo (9)]. W przypadku innych punktów końcowych, takich jak dystrybucja i metabolizm, można stosować niniejszą metodę badawczą B.36. Przy poddawaniu działaniu badanej substancji chemicznej drogą dermalną należy zastosować co najmniej jeden poziom dawkowania. Badana substancja chemiczna (np. czysty, rozcieńczony lub zmieszany materiał zawierający badaną substancję chemiczną, który nakładany jest na skórę) powinna być taka sama (lub być realistycznym surogatem) jak substancja, na której działanie narażeni mogą być ludzie lub inne potencjalne gatunki docelowe. Poziom (poziomy) dawkowania należy wybrać zgodnie z pkt 20-26 niniejszej metody badawczej. Czynniki, które można wziąć pod uwagę przy doborze dawki na skórę, obejmują oczekiwane narażenie ludzi lub dawki, przy których w innych badaniach toksyczności dermalnej zaobserwowano toksyczność. Dawka (dawki) na skórę należy w razie potrzeby rozpuścić w odpowiednim nośniku i aplikować w ilości odpowiedniej do dostarczenia dawki. Tuż przed badaniem należy wystrzyc sierść na grzbietowej powierzchni tułowia badanych zwierząt. Można zastosować golenie, lecz należy je przeprowadzić około 24 godziny przed rozpoczęciem badania. Podczas przycinania lub golenia sierści należy uważać, aby nie uszkodzić skóry, gdyż mogłoby to zmienić jej przepuszczalność. Na potrzeby zastosowania badanej substancji chemicznej należy usunąć sierść z ok. 10 % powierzchni ciała. W przypadku substancji wysoce toksycznych można je nanieść na powierzchnię mniejszą niż ok. 10 %, jednak należy dążyć do tego, aby pokryć jak największy obszar cienką i równomierną warstwą. We wszystkich grupach w badaniu narażenia dermalnego należy wykorzystać taką samą powierzchnię poddawania działaniu substancji. Powierzchnię, na którą dawkowana jest substancja, trzeba chronić odpowiednią dobrze umocowaną osłoną. Zwierzęta powinny być trzymane oddzielnie.
75. Należy przeprowadzić badanie przemywania skóry w celu oszacowania ilości aplikowanej dawki badanej substancji chemicznej, którą można usunąć ze skóry przez umycie łagodnym mydłem i wodą powierzchni skóry poddanej działaniu tej substancji. Badanie to może również pomóc w określeniu bilansu masy, gdy badana substancja chemiczna podawana jest drogą dermalną. Dla celów tego badania przemywania skóry należy dwóm zwierzętom podać pojedynczą dawkę badanej substancji chemicznej. Wyboru poziomu dawkowania dokonuje się zgodnie z pkt 23 niniejszej metody badawczej (zob. również pkt 76, w którym omówiono czasu kontaktu ze skórą). Ilości badanej substancji chemicznej odzyskane w płynach pozostałych po przemywaniu należy określić, aby oszacować skuteczność usuwania tej substancji poprzez mycie.
76. Badaną substancję chemiczną należy nałożyć na skórę i trzymać przez co najmniej 6 godzin, o ile nie uniemożliwia tego działanie żrące tej substancji. Po zdjęciu osłony obszar poddany działaniu substancji należy umyć zgodnie z procedurą określoną w badaniu przemywania skóry (zob. pkt 75). Zarówno osłonę, jak i płyny pozostałe po przemywaniu należy poddać analizie pod kątem pozostałości badanej substancji chemicznej. Na zakończenie badania każde zwierzę należy humanitarnie uśmiercić zgodnie z (2) i usunąć skórę poddawaną działaniu substancji. Odpowiedni wycinek tej skóry należy poddać analizie w celu określenia pozostałości badanej substancji chemicznej (promieniotwórczości).
77. Dla celów toksykokinetycznej oceny produktów farmaceutycznych potrzebne mogą być odmienne procedury, zgodne z odpowiednim systemem regulacji.
Droga inhalacyjna
78. Należy zastosować jedno stężenie (lub w razie potrzeby większą liczbę stężeń) badanej substancji chemicznej. Stężenie (stężenia) należy wybrać zgodnie z pkt 20-26 niniejszej metody badawczej. Zabiegi poddawania działaniu substancji drogą inhalacyjną należy przeprowadzać przy użyciu przyrządu z maską inhalacyjną umożliwiającą narażenie tylko przez nos lub tylko głowy, aby zapobiec wchłanianiu substancji innymi drogami narażenia (8). Jeżeli stosowane są inne warunki narażenia inhalacyjnego, należy udokumentować uzasadnienie zmiany procedury. Czas trwania narażenia drogą inhalacyjną powinien być określony; typowe narażenie trwa 4-6 h.
BIBLIOGRAFIA:
(1) OECD (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their Applicability to Manufactured Nanomaterials, Series on the Safety of Manufactured Nanomaterials nr 15, ENV/JM/MONO(2009)21, OECD, Paryż.
(2) OECD (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation; Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 19, ENV/JM/MONO(2000), OECD, Paryż.
(3) Solon E G, Kraus L (2002). Quantitative wholebody autoradiography in the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance, J Pharm and Tox Methods 46: 73-81.
(4) Stumpf WE (2005). Drug localization and targeting with receptor microscopic autoradiography. J. Pharmaco-logical and Toxicological Methods 51: 25-40.
(5) Loizou G, Spendiff M, Barton HA, Bessems J, Bois FY, d'Yvoire MB, Buist H, Clewell HJ 3rd, Meek B, Gundert-Remy U, Goerlitz G, Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for physiologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps. Regulatory Toxicology and Pharmacology 50: 400-411.
(6) Rozdział B.45 niniejszego załącznika. Absorpcja przez skórę: metoda in vitro.
(7) IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-BasedPharmacokinetic Models in Risk Asses-sment. IPCS Harmonization Project Document nr 9. Genewa, Światowa Organizacja Zdrowia, Międzynarodowy Program Bezpieczeństwa Chemicznego.
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing, Series on Testing and Assessment nr 39, ENV/JM/MONO(2009)28, OECD, Paryż.
(9) Rozdział B.44 niniejszego załącznika. Absorpcja przez skórę: metoda in vivo.
(10) Barton HA, i in. (2006). The Acquisition and Application of Absorption, Distribution, Metabolism, and Excre-tion (ADME) Data in Agricultural Chemical Safety Assessments, Critical Reviews in Toxicology 36: 9-35.
(11) Gibaldi M i Perrier D, (1982), Pharmacokinetics, wyd. drugie, Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork.
Dodatek
DEFINICJE
Wchłanianie: proces absorpcji chemikaliów w głąb tkanek lub przez tkanki. Wchłanianie dotyczy związku macierzystego i wszystkich jego metabolitów. Nie mylić z "biodostępnością".
Akumulacja (bioakumulacja): wzrost ilości badanej substancji chemicznej w czasie w tkankach (zwykle tkankach tłuszczowych w następstwie powtarzanego narażenia); jeśli ilość badanej substancji chemicznej wprowadzana do organizmu jest większa niż szybkość, z jaką jest wydalana, organizm gromadzi tę substancję i może dojść do osiągnięcia toksycznego stężenia badanej substancji chemicznej.
ADME: akronim "Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion" (ang. wchłanianie, dystrybucja, metabolizm i wydalanie).
AUC: (pole pod krzywą stężenia w osoczu w czasie): pole pod krzywą na wykresie stężenia badanej substancji chemicznej w osoczu w czasie. Oznacza ono całkowitą ilość badanej substancji chemicznej wchłoniętą przez organizm we wcześniej określonym czasie. W warunkach liniowych AUC (od czasu zerowego do nieskończoności) jest proporcjonalne do całkowitej ilości badanej substancji chemicznej wchłoniętej przez organizm, niezależnie od tempa wchłaniania.
Autoradiografia: (autoradiografia całego ciała): stosowana w celu jakościowego lub ilościowego określenia umiejscowienia w tkankach badanej promieniotwórczej substancji chemicznej; w technice tej wykorzystuje się kliszę rentgenowską lub - od niedawna - obrazowanie cyfrowe z użyciem fosforu w celu zwizualizowania radioaktywnie znakowanych cząsteczek lub fragmentów cząsteczek poprzez rejestrowanie promieniowania emitowanego w badanym obiekcie. W porównaniu z sekcją narządów ilościowa autoradiografia całego ciała może mieć pewne zalety dla oceny dystrybucji badanej substancji chemicznej oraz oceny całkowitego odzysku i rozkładu materiału promieniotwórczego w tkankach. Jedną z istotnych zalet jest na przykład to, że autoradiografia może być stosowana na zabarwionym modelu zwierzęcym w celu ocenienia ewentualnego łączenia się badanej substancji chemicznej z melaniną, która może wiązać się z pewnymi cząsteczkami. Mimo że technika ta może zapewnić obejmujący całe ciało wygodny przegląd miejsc wiązania o dużej zdolności i niskim powinowactwie, może ona jednak być ograniczona pod względem rozpoznawania swoistych miejsc docelowych, takich jak miejsca wiązania receptorów, gdzie wykrycie wymaga stosunkowo wysokiej rozdzielczości oraz wysokiej czułości. W przypadku korzystania z autoradiografii doświadczenia mające na celu określenie bilansu masy podawanego związku należy przeprowadzać jako odrębną grupę lub w ramach oddzielnego badania, począwszy od doświadczenia dotyczącego dystrybucji w tkankach, polegającego na homogenizacji wszystkich wydalin (które mogą również obejmować wydychane powietrze) i całych ciał oraz poddaniu ich analizie za pomocą scyntylacyjnego licznika cieczowego.
Wydalanie z żółcią: wydalanie z dróg żółciowych.
Bioakumulacja: zob. "akumulacja".
Biodostępność: ułamek podanej dawki, jaki dociera do krążenia ogólnego lub jest udostępniany na miejscu aktywności fizjologicznej. Zazwyczaj biodostępność badanej substancji chemicznej odnosi się do związku macierzystego, lecz może dotyczyć też jego metabolitu. Uwzględnia się w jej ramach tylko jedną formę chemiczną. Uwaga: biodostępność i wchłanianie nie są tożsame. Różnica między np. wchłanianiem po podaniu doustnym (tj. obecnością w ścianie jelita i krążeniu wrotnym) a biodostępnością (tj. obecnością w krwi w krążeniu ogólnym i w tkankach) może być spowodowana między innymi rozkładem chemicznym wskutek metabolizmu w ścianie jelita lub wypływu z powrotem do światła jelita lub pierwszym przejściem przez wątrobę (10). Biodostępność składnika toksycznego (związku macierzystego lub metabolitu) jest krytycznym parametrem w ocenie ryzyka dla ludzi (ekstrapolacja dawki dużej do małej, ekstrapolacja drogi do drogi), służącym wyprowadzeniu wartości wewnętrznej z zewnętrznego NOAEL lub BMD (zastosowana dawka). W odniesieniu do skutków dla wątroby po podaniu drogą pokarmową wystarcza wchłanianie po podaniu doustnym, jednak dla każdego skutku innego niż występujący w miejscu wprowadzenia danej substancji to biodostępność, nie wchłanianie, jest na ogół bardziej wiarygodnym parametrem na potrzeby dalszego zastosowania w ocenie ryzyka.
Biotrwałość: zob. "trwałość".
Biotransformacja: (zwykle enzymatyczna) przemiana chemiczna badanej substancji chemicznej w inną substancję chemiczną zachodząca w ciele. Synonim "metabolizmu".
Cmax: maksymalne (szczytowe) stężenie we krwi (osoczu/surowicy krwi) po podaniu lub maksymalne (szczytowe) wydalanie (z moczem lub kałem) po podaniu.
Klirens: ilościowa miara szybkości, z jaką badana substancja chemiczna jest usuwana z krwi, osocza lub określonej tkanki w jednostce czasu.
Przedział: strukturalna lub biochemiczna część (lub jednostka) ciała, tkanki lub komórki, która jest oddzielona od reszty.
Ścieżki detoksykacji: szereg etapów prowadzących do eliminacji toksycznych chemikaliów z organizmu poprzez przemianę metaboliczną lub wydalenie.
Dystrybucja: rozproszenie badanej substancji chemicznej i jej pochodnych w całym organizmie.
Enzymy/izoenzymy: białka, które katalizują reakcje chemiczne. Izoenzymy są enzymami, które katalizują podobne reakcje chemiczne, lecz różnią się sekwencją aminokwasów.
Parametry enzymatyczne: Km: stała Michaelisa oraz Vmax: prędkość maksymalna.
Wydalanie: proces lub procesy, w drodze których podana badana substancja chemiczna lub jej metabolity są usuwane z organizmu
Egzogennie: wprowadzony spoza organizmu lub układu lub wytworzony poza nimi.
Ekstrapolacja: wywodzenie jednej nieznanej wartości lub większej ich liczby w oparciu o to, co jest znane lub zostało zaobserwowane.
Okres półtrwania (t1/2): czas, jaki musi upłynąć, by stężenie badanej substancji chemicznej zmniejszyło się o połowę w danym przedziale. Zazwyczaj odnosi się do stężenia w osoczu lub ilości badanej substancji chemicznej w całym organizmie.
Indukcja/indukcja enzymatyczna: synteza enzymów w odpowiedzi na bodziec środowiskowy lub cząsteczkę induktora.
Liniowość/kinetyka liniowa: proces jest liniowy pod względem kinetyki, gdy wszystkie prędkości wnikania między przedziałami są proporcjonalne do obecnych ilości lub stężeń, tj. są pierwszego rzędu. W związku z tym wartości klirensu i dystrybucji są stałe, podobnie jak okresy półtrwania. Osiągane stężenia są proporcjonalne do szybkości dawkowania (narażenia), a akumulacja jest łatwiejsza do przewidzenia. Liniowość/nieliniowość można ocenić przez porównanie odpowiednich parametrów, np. pola pod krzywą po różnych dawkach lub po narażeniu jednorazowym i powtarzanym. Brak zależności od dawki może wskazywać na nasycenie enzymów biorących udział w metabolizmie danego związku chemicznego, zwiększenie pola pod krzywą po powtarzanym narażaniu w porównaniu z narażeniem jednorazowym może świadczyć o zhamowaniu metabolizmu, a zmniejszenie pola pod krzywą może być oznaką indukcji metabolizmu [zob. również (11)].
Bilans masy: rozliczanie badanej substancji chemicznej wchodzącej do układu i wychodzącej z niego.
Bilans materiałowy: zob. "bilans masy".
Mechanizm (charakter) toksyczności/mechanizm (charakter) działania: mechanizm działania odnosi się do konkretnych interakcji biochemicznych, przez które badana substancja chemiczna powoduje swój skutek. Charakter działania odnosi się do bardziej ogólnych szlaków prowadzących do toksyczności badanej substancji chemicznej.
Metabolizm: synonim "biotransformacji".
Metabolity: produkty metabolizmu lub procesów metabolicznych.
Wchłanianie po podaniu doustnym: procent dawki badanej substancji chemicznej wchłonięty z miejsca podania (tj. z przewodu pokarmowego). Ten krytyczny parametr można wykorzystać, aby dowiedzieć się, jaki ułamek podanej badanej substancji chemicznej dociera do żyły wrotnej, a później do wątroby.
Współczynnik podziału: znany także jako współczynnik dystrybucji, jest miarą różnicowej rozpuszczalności substancji chemicznej w dwóch rozpuszczalnikach.
Szczytowe poziomy stężenia we krwi (osoczu/surowicy krwi): maksymalne (szczytowe) stężenie we krwi (osoczu/ surowicy krwi) po podaniu (zob. także "Cmax").
Trwałość (biotrwałość): długotrwała obecność substancji chemicznej (w układzie biologicznym) ze względu na odporność na rozkład/eliminację.
Przekrój: informacje na temat punktu końcowego jednej substancji chemicznej lub większej ich liczby są wykorzystywane do przewidywania punktu końcowego docelowej substancji chemicznej.
Mikroskopowa autoradiografia receptorowa (lub mikroautoradiografia receptorowa): technika ta może być wykorzystywania do badania interakcji ksenobiotyków z określonymi miejscami tkanek lub populacjami komórek, jak na przykład w badaniach dotyczących wiązania receptorów lub określonego charakteru działania, które mogą wymagać wysokiej rozdzielczości oraz wysokiej czułości, jakie mogą być niemożliwe do osiągnięcia przy użyciu innych technik, takich jak autoradiografia całego ciała.
Droga podania (doustna, dożylna, dermalna, inhalacyjna itp.): odnosi się do sposobu wprowadzenia substancji chemicznych do ciała (np. doustnie za pomocą sondy, doustnie z pokarmem, przez skórę, przez drogi oddechowe, dożylnie itd.).
Nasycenie: stan, w którym co najmniej jeden z procesów kinetycznych (np. wchłanianie, metabolizm lub klirens) ma wartość maksymalną (odczyt "nasycony").
Czułość: zdolność metody lub instrumentu do rozróżniania reakcji pomiarowych reprezentujących różne poziomy przedmiotowej zmiennej.
Poziomy stężenia we krwi (osoczu) w stanie ustalonym: stan nierównowagi otwartego układu, w którym wszystkie siły działające na ten układ są dokładnie równoważone przez siły przeciwstawne w taki sposób, że wszystkie jego elementy mają niezmienne stężenie, mimo że substancja płynie przez układ.
Modelowanie układów (fizjologiczny model toksykokinetyczny, model farmakokinetyczny, farmakokinetycznymodel fizjologiczny, model biologiczny itp.): abstrakcyjny model, w którym używa się języka matematycznego do opisu zachowania układu.
Tkanka docelowa: tkanka, w której przejawia się główne szkodliwe działanie substancji toksycznej.
Badana substancja chemiczna: jakakolwiek substancja chemiczna lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.
Dystrybucja w tkankach: odwracalny ruch badanej substancji chemicznej z jednego miejsca w ciele do drugiego. Dystrybucję w tkankach można badać poprzez wycięcie organów, ich homogenizację, spalenie i poddanie analizie za pomocą scyntylacyjnego licznika cieczowego bądź też jakościową lub ilościową autoradiografię całego ciała. Pierwsza z tych metod jest przydatna do uzyskania stężenia i procentu odzysku z tkanek i reszty ciała takich samych zwierząt, lecz może nie mieć rozdzielczości pozwalającej na zbadanie wszystkich tkanek, a całkowity odzysk może być mniejszy niż w warunkach idealnych (< 90 %). Zob. definicja drugiej metody powyżej.
Tmax: czas do osiągnięcia Cmax.
Toksykokinetyka (farmakokinetyka): badanie wchłanianie, dystrybucji, metabolizmu i wydalania substancji chemicznych względem czasu.
Walidacja modeli: proces oceny odpowiedniości modelu do spójnego opisania dostępnych danych toksykokinetycznych. Modele mogą być oceniane poprzez statystyczne i wizualne porównanie modelowych prognoz z wartościami doświadczalnymi w stosunku do wspólnej zmiennej niezależnej (np. czasu). Należy uzasadnić zakres oceny w odniesieniu do zamierzonego zastosowania modelu.
B.37. OPÓŹNIONA NEUROTOKSYCZNOŚĆ SUBSTANCJI FOSFOROORGANICZNYCH PO DUŻEJ EKSPOZYCJI
1. METODA
1.1. WPROWADZENIE
Przy ocenie i oszacowaniu skutków toksycznych substancji ważne jest rozważenie potencjału niektórych klas substancji do wywoływania określonych typów neurotoksyczności, które mogą nie być wykryte w innych badaniach toksyczności. Zaobserwowano, że niektóre substancje fosforoorganiczne powodują opóźnioną neurotoksyczność i powinny być wzięte pod uwagę jako związki, które mogą być zaliczone do oszacowania.
Testy sortujące in vitro mogłyby być zastosowane, aby rozpoznać te substancje, które mogą powodować opóźnioną polineuropatię; jednakże negatywne wyniki badań in vitro nie są dowodem, że substancja testowana nie jest substancją neurotoksyczną
Zob. także Wprowadzenie ogólne część B.
1.2. DEFINICJE
Substancje fosforoorganiczne obejmują nienaładowane estry fosforoorganiczne, tioestry i bezwodniki pochodnych organicznych kwasu fosforowego(V), kwasu fosfonowego i kwasów fosforoamidowych i ich tio-pochodnych lub inne substancje, które mogą wywoływać opóźnioną neurotoksyczność obserwowaną czasami w tej klasie substancji.
Opóźniona neurotoksyczność jest objawem powiązanym z przedłużonym zwłocznym początkiem ataksji, obwodową aksonopatią w rdzeniu kręgowym i nerwach obwodowych, i zahamowaniem i starzeniem esterazy wywołującej neuropatię (NTE) w obojętnej tkance.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Substancja odniesienia może być testowana na pozytywnej grupie kontrolnej jako środek w celu wykazania, że w warunkach testu laboratoryjnego reakcja badanego gatunku nie zmieniła się znacząco.
Przykładem szeroko stosowanego środka neurotoksycznego jest ortofosforan(V) tritoilu (CAS 78-30-8, EINECS 201-103-5, nomenklatura CAS: kwas ortofosforowy(V), ester tris(2-metylofenylowy), znany jako fosforan trikrezylu.
1.4. ZASADA METODY BADANIA
Substancja testowana jest podawana doustnie w pojedynczej dawce kurom domowym, które zostały zabezpieczone przed ostrymi skutkami cholinergicznymi, gdzie właściwe. Zwierzęta są obserwowane przez 21 dni pod kątem anomalii behawioralnych, ataksji, i paraliżu. Pomiary biochemiczne, w szczególności zahamowanie esterazy wywołującej neuropatię (NTE), przeprowadza się na kurach losowo wybranych z każdej grupy, prawidłowo 24 i 48 godzin po dawkowaniu. Dwadzieścia jeden dni po ekspozycji pozostałe kury są zabijane i przeprowadzane jest badanie histopatologiczne wybranych obojętnych tkanek.
1.5. OPIS METODY BADANIA
1.5.1. Przygotowania
Zdrowe, młode, dorosłe kury, wolne od kolidujących chorób wirusowych i leków oraz bez nieprawidłowości w sposobie chodzenia, powinny być losowo przydzielane do grupy badanej i kontrolnej oraz aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przez co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem badania.
Powinno się stosować klatki i zagrody wystarczająco obszerne, aby umożliwić swobodne poruszanie się kur i niezakłóconą obserwację sposobu chodzenia.
Dawkowanie substancji testowanej powinno prawidłowo przebiegać drogą doustną, stosując aplikowanie bezpośrednio do żołądka, w kapsułkach żelatynowych lub metodą porównywalną. Ciecze powinny być podawane nierozcieńczone lub rozpuszczone w odpowiednim nośniku, takim jak olej kukurydziany; substancje stałe powinny być, w miarę możliwości, rozpuszczone, ponieważ duże dawki substancji stałych w żelatynie mogą nie być absorbowane wydajnie. W przypadku nośników niewodnych powinna być znana charakterystyka toksyczna nośnika, a jeżeli nie jest znana, powinna być określona przed testem.
1.5.2. Warunki testu
1.5.2.1. Zwierzęta badane
Zalecana jest młoda, dorosła, kura domowa nioska (Gallus gallus domesticus), w wieku 8-12 miesięcy. Powinny być wykorzystane odmiany i rasy standardowej wielkości, które prawidłowo powinny być wcześniej hodowane w warunkach umożliwiających swobodne poruszanie się.
1.5.2.2. Liczba i płeć
Oprócz grupy badanej powinna być stosowana zarówno grupa kontrolna nośnika, jak i pozytywna grupa kontrolna. Grupa kontrolna nośnika powinna być traktowana w sposób identyczny, jak grupa badana z wyjątkiem tego, że podawanie substancji testowanej jest pominięte.
W każdej grupie ptaków należy wykorzystać wystarczającą liczbę kur tak, aby co najmniej sześć ptaków można było zabić do celów oznaczenia biochemicznego (trzy w każdym z dwóch punktów czasowych) i sześć mogło przeżyć okres 21-dniowej obserwacji do celów patologii.
Pozytywna grupa kontrolna może być poddawana badaniu w tym samym czasie lub też może ona być ostatnią grupą kontrolną w historii badania. Powinna składać się z co najmniej sześciu kur, poddawanych działaniu znanego opóźnionego środka neurotoksycznego, trzy kury przeznaczone są do celów biochemii i trzy do celów patologii. Zalecane jest okresowe uaktualnianie przeszłych danych. W przypadku gdy jakiś istotny element (np. rasa, żywienie, warunki przebywania) w przebiegu badania został zmieniony przez laboratorium wykonujące, należy uzyskać nowe pozytywne dane kontrolne.
1.5.2.3. Poziomy dawki
Aby oszacować poziom dawki, który ma być zastosowany w badaniu głównym, należy przeprowadzić badanie wstępne przy użyciu odpowiedniej liczby kur i grup poziomów dawki. Typowy i nieunikniony jest pewien poziom śmiertelności w badaniu wstępnym, w celu określenia właściwej dawki do badania głównego. Jednakże aby zapobiec śmierci z powodu ostrych skutków cholinergicznych może być użyta atropina lub inny środek ochronny, o którym wiadomo, że nie koliduje z opóźnionymi reakcjami neurotoksycznymi. Rozmaite metody badania mogą być stosowane w celu oszacowania maksymalnej, niewywołującej śmierci dawki substancji testowanej (zob. metoda B.l bis). Poprzednie dane dotyczące kur lub inne dane toksykologiczne mogą być pomocne przy doborze dawki.
W głównym badaniu poziom dawki substancji testowanej powinien być możliwie najwyższy, biorąc pod uwagę wyniki wstępnego badania doboru dawki i górną dawkę graniczną wynoszącą 2.000 mg/kg masy ciała. Jakakolwiek śmiertelność, która może wystąpić, nie powinna zakłócić przeżycia 21 dni przez wystarczającą liczbę zwierząt do celów biochemii (sześć) i histologii (sześć). Powinna być użyta atropina lub inny środek ochronny, o którym wiadomo, że nie koliduje z opóźnionymi reakcjami neurotoksycznymi, w celu zapobieżenia śmierci z powodu ostrych skutków cholinergicznych.
1.5.2.4. Test graniczny
Jeżeli test przy poziomie dawki wynoszącym co najmniej 2.000 mg/kg masy ciała/dzień, z zastosowaniem procedury opisanej dla tego badania, nie powoduje widocznych objawów toksycznych i jeżeli nie należałoby spodziewać się toksyczności na podstawie danych, dotyczących substancji strukturalnie pokrewnych, wtedy badanie z zastosowaniem większej dawki może nie być konieczne. Ten test graniczny stosowany jest z wyjątkiem przypadków, w których ekspozycja ludzi wskazuje na konieczność użycia wyższego poziomu dawki.
1.5.2.5. Okres obserwacji
Okres obserwacji powinien wynosić 21 dni.
1.5.3. Procedura
Po podaniu środka ochronnego, aby zapobiec śmierci z powodu ostrych skutków cholinergicznych, substancja testowana jest podawana w pojedynczej dawce.
1.5.3.1. Ogólne obserwacje
Obserwacje powinny rozpocząć się bezpośrednio po ekspozycji. Wszystkie kury powinny być starannie obserwowane kilka razy w ciągu pierwszych 2 dni i od tego czasu co najmniej raz dziennie przez okres 21 dni lub do zaplanowanego zabicia. Wszystkie oznaki toksyczności powinny być odnotowywane, w tym czas rozpoczęcia, typ, ostrość i czas trwania anomalii behawioralnych. Ataksja powinna być mierzona według porządkowej skali klasyfikacyjnej, składającej się z co najmniej czterech poziomów, paraliż powinien być odnotowany. Co najmniej dwa razy w tygodniu wszystkie kury wybrane do celów patologii powinny być wyjmowane z klatek i poddawane okresowej wymuszonej aktywności motorycznej, takiej jak wspinanie się po drabinie, aby ułatwić obserwację minimalnych skutków toksycznych. Zwierzęta konające oraz zwierzęta przejawiające ostre cierpienie i ból powinny być usuwane, gdy zostanie to zauważone, humanitarnie zabite i poddane sekcji zwłok.
1.5.3.2. Masa ciała
Wszystkie kury powinny być ważone tuż przed podaniem substancji testowanej i od tego czasu co najmniej raz w tygodniu.
1.5.3.3. Biochemia
Sześć losowo wybranych kur z grup badanych i z grupy kontroli nośnika, i trzy kury z pozytywnej grupy kontrolnej (jeżeli grupa ta jest poddawana badaniu jednocześnie) powinny być zabite w ciągu kilku dni po dawkowaniu, mózg i lędźwiowy rdzeń kręgowy powinien być przygotowany i poddany analizie aktywności zahamowania esterazy wywołującej neuropatię. Dodatkowo może być przydatne przygotowanie i poddanie tkanki nerwu kulszowego analizie aktywności zahamowania esterazy wywołującej neuropatię. Prawidłowo, trzy ptaki grupy kontrolnej i każdej grupy badanej są zabijane po 24 godzinach i trzy po 48 godzinach, podczas gdy trzy kury z pozytywnej grupy kontrolnej powinny być zabite po 24 godzinach. Jeżeli obserwacja klinicznych oznak zatrucia (często może to być ocenione przez obserwację czasu rozpoczęcia oznak cholinergicznych) wskazuje, że środek toksyczny może być usuwany bardzo powoli, bardziej pożądane może być pobranie próbki tkanki od trzech ptaków, w każdym z dwóch terminów między 24 a 72 godziną po dawkowaniu.
Analizy acetylocholinoesterazy (AChE) mogą być również wykonane na tych próbkach, jeżeli uzna się to za właściwe. Jednakże może mieć miejsce spontaniczna reaktywacja AChE in vivo, co może prowadzić do zbyt niskiego oszacowania potencji substancji jako inhibitora AChE.
1.5.3.4. Sekcja zwłok
Sekcja zwłok wszystkich zwierząt (zabitych planowo i zabitych jako konające) powinna obejmować obserwację wyglądu mózgu i rdzenia kręgowego.
1.5.3.5. Badanie histopatologiczne
Obojętna tkanka zwierząt przeżywających okres obserwacji, nieużyta w badaniach biochemicznych, powinna być poddana badaniu mikroskopowemu. Tkanki powinny być przygotowane in situ, stosując techniki perfuzji. Odcinki powinny obejmować móżdżek (środkowy - wzdłużny poziom), rdzeń przedłużony, rdzeń kręgowy i nerwy obwodowe. Odcinki rdzenia kręgowego powinny być pobrane z górnego segmentu karkowego, okolic środkowopiersiowych i lędźwiowo-krzyżowych. Powinny być pobrane odcinki z okolic obwodowych nerwu piszczelowego i jego odgałęzienia do mięśnia brzuchatego łydki oraz nerwu kulszowego. Odcinki powinny być zabarwione odpowiednią mieliną i barwnikami charakterystycznymi dla aksonów.
2. DANE
Negatywne wyniki w punktach końcowych wybranych w tej metodzie (biochemia, histopatologia i obserwacja behawioralna) prawidłowo nie wymagałyby dalszego badania, dotyczącego opóźnionej neurotoksyczności. Niejednoznaczne lub nieprzekonujące wyniki dla tych punktów końcowych mogą wymagać dalszej oceny.
Powinny zostać dostarczone indywidualne zwierząt. Dodatkowo, wszystkie dane powinny być podsumowane w formie tabeli, przedstawiając dla każdej grupy badanej liczbę zwierząt na początku testu, liczbę zwierząt wykazujących zmiany patologiczne, skutki behawioralne i biochemiczne, typy i ostrość tych zmian patologicznych lub skutków i procent zwierząt okazujących każdy typ i ostrość zmiany patologicznej lub skutku.
Wyniki badania powinny być ocenione pod względem częstotliwości, ostrości, i korelacji skutków behawioralnych, biochemicznych i histopatologicznych oraz jakichkolwiek innych obserwowanych w grupach badanych i kontrolnych.
Wyniki liczbowe powinny być ocenione z zastosowaniem odpowiedniej i ogólnie akceptowanej metody statystycznej. Metody statystyczne powinny być wybrane podczas planowania badania.
3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
SPRAWOZDANIE Z TESTU Sprawozdanie z testu obejmuje, jeżeli możliwe, następujące informacje:
Zwierzęta badane:
- wykorzystana rasa,
- liczba i wiek zwierząt,
- źródło, warunki przebywania zwierząt itp.,
- indywidualna waga zwierząt na początku testu. Warunki testu:
- szczegóły dotyczące przygotowania substancji testowanej, trwałości i homogeniczności, w odpowiednich przypadkach,
- uzasadnienie wyboru nośnika,
- szczegóły podawania substancji testowanej,
- szczegóły jakości pożywienia i wody,
- racjonalna podstawa wyboru dawki,
- parametry podawanych dawek, w tym dane szczegółowe dotyczące nośnika, objętości i formy fizycznej podawanych substancji,
- tożsamość i szczegóły podawania jakiegokolwiek środka ochronnego. Wyniki:
- dane dotyczące masy ciała,
- dane dotyczące reakcji toksycznej według grup, w tym śmiertelność,
- natura, ostrość i czas trwania obserwacji klinicznych (czy odwracalne czy nie),
- szczegółowy opis metod biochemicznych i wyników,
- wyniki sekcji zwłok,
- szczegółowy opis wszystkich wyników histopatologicznych,
- gdzie właściwe, statystyczna obróbka wyników.
Rozpatrzenie wyników
Wnioski.
4. BIBLIOGRAFIA
Niniejsza metoda jest analogiczna do OECD TG 418.
B.38. OPÓŹNIONA NEUROTOKSYCZNOŚĆ SUBSTANCJI FOSFOROORGANICZNYCH. 28-DNIOWE BADANIE WIELOKROTNEJ DAWKI
1. METODA
1.1. WPROWADZENIE
Przy ocenie i oszacowaniu skutków toksycznych substancji ważne jest rozważenie potencjału niektórych klas substancji do wywoływania określonych typów neurotoksyczności, które mogą nie być wykrywane podczas innych badań toksyczności. Zaobserwowano, że niektóre substancje fosforoorganiczne powodują opóźnioną neurotoksyczność i powinny być wzięte pod uwagę jako związki, które mogą być zaliczone do oszacowania.
Testy sortujące in vitro mogłyby być zastosowane w celu rozpoznania tych substancji, które mogą powodować opóźnioną polineuropatię; jednakże negatywne wyniki badań in vitro nie są dowodem na to, że substancja testowana nie jest substancją neurotoksyczną.
Ten 28-dniowy test opóźnionej neurotoksyczności dostarcza informacji, dotyczących możliwych zagrożeń zdrowia, które mogą się pojawiać się pod wpływem wielokrotnych ekspozycji przez ograniczony okres czasu. Dostarczy on informacji dotyczących reakcji na dawkę i może zapewnić oszacowanie poziomu braku obserwowanych niekorzystnych skutków, który może być przydatny przy ustalaniu kryteriów bezpieczeństwa dla ekspozycji.
Zob. także Wprowadzenie ogólne część B.
1.2. DEFINICJE
Substancje fosforoorganiczne obejmują nienaładowane estry fosforoorganiczne, tioestry i bezwodniki pochodnych organicznych kwasu fosforowego(V), kwasu fosfonowego i kwasów fosforoamidowych i ich tio-pochodnych lub inne substancje, które mogą wywoływać opóźnioną neurotoksyczność obserwowaną czasami w tej klasie substancji.
Opóźniona neurotoksyczność jest objawem związanym z przedłużonym zwłocznym początkiem ataksji, obwodową aksonopatią w rdzeniu kręgowym i nerwach obwodowych, i zahamowaniem i starzeniem esterazy wywołującej neuropatię (NTE) w obojętnej tkance.
1.3. ZASADA METODY BADANIA
Dzienne dawki substancji testowanej są podawane domowym kurom doustnie przez 28 dni. Zwierzęta są obserwowane co najmniej raz dziennie pod kątem anomalii behawioralnych, ataksji i paraliżu do 14 dnia po ostatniej dawce. Przeprowadzane są pomiary biochemiczne, w szczególności zahamowanie esterazy wywołującej neuropatię (NTE), na kurach losowo wybranych z każdej grupy, prawidłowo 24 i 48 godzin po ostatniej dawce. Dwa tygodnie po ostatniej dawce pozostałe kury są zabijane i przeprowadzane jest badanie histopatologiczne wybranych obojętnych tkanek.
1.4. OPIS METODY BADANIA
1.4.1. Przygotowania
Zdrowe, młode, dorosłe kury, wolne od kolidujących chorób wirusowych i leków oraz bez nieprawidłowości w sposobie chodzenia, powinny zostać losowo przydzielone do grupy badanej i kontrolnej oraz aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przez co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem badania.
Powinny być stosowane klatki i zagrody wystarczająco obszerne, aby umożliwić swobodne poruszanie się kur i niezakłóconą obserwację sposobu chodzenia.
Dawkowanie doustne powinno być prowadzone każdego dnia, 7 dni w tygodniu, najlepiej stosując aplikowanie bezpośrednio do żołądka lub w kapsułkach żelatynowych. Ciecze powinny być podawane nierozcieńczone lub rozpuszczone w odpowiednim nośniku, takim jak olej kukurydziany; substancje stałe powinny być w miarę możliwości rozpuszczone, ponieważ duże dawki substancji stałych w kapsułkach żelatynowych mogą nie być absorbowane wydajnie. W przypadku nośników niewodnych powinna być znana charakterystyka toksyczna nośnika, a jeżeli nie jest znana, powinna być określona przed testem.
1.4.2. Warunki testu
1.4.2.1. Badane zwierzęta
Zalecana jest młoda, dorosła, domowa, kura nioska (Gallus gallus domesticus), w wieku 8-12 miesięcy. Wykorzystane powinny być odmiany i rasy standardowej wielkości, które prawidłowo powinny być wcześniej hodowane w warunkach umożliwiających swobodne poruszanie się.
1.4.2.2. Liczba i płeć
Zasadniczo, powinny być wykorzystane co najmniej trzy grupy badane i grupa kontrolna nośnika. Grupa kontrolna nośnika powinna być traktowana w sposób identyczny jak grupa badana z wyjątkiem tego, że podawanie substancji testowanej jest pominięte.
W każdej grupie ptaków należy wykorzystać wystarczającą liczbę kur, tak aby co najmniej sześć ptaków można było zabić do celów oznaczeń biochemicznych (trzy w każdym z dwóch punktów czasowych) i aby po zakończeniu działań badawczych sześć kur mogło przeżyć okres 14-dniowej obserwacji do celów patologii.
1.4.2.3. Poziomy dawki
Poziomy dawki powinny być wybierane, biorąc pod uwagę trzy wyniki testu ostrej opóźnionej neurotoksyczności i jakiekolwiek inne istniejące, osiągalne dane dotyczące toksyczności i kinetyki testowanego związku. Powinien być wybrany najwyższy poziom dawki w celu wywołania objawów zatrucia, najlepiej opóźnionej neurotoksyczności, ale nie śmierci lub widocznego cierpienia. Od tego czasu powinna być dobrana malejąca sekwencja poziomów dawki, w celu wykazania wszystkich reakcji powiązanych z dawkowaniem i braku zaobserwowania niekorzystnych objawów przy najmniejszym poziomie dawki.
1.4.2.4. Test graniczny
Jeżeli test przy poziomie dawki wynoszącym co najmniej 1.000 mg/kg masy ciała/dzień, z zastosowaniem procedury opisanej dla tego badania, nie wywołuje widocznych objawów toksycznych i jeżeli nie należałoby spodziewać się toksyczności na podstawie danych, dotyczących substancji strukturalnie pokrewnych, to badanie z zastosowaniem większej dawki może nie być konieczne. Ten test graniczny stosuje się z wyjątkiem przypadków, w których spodziewana ekspozycja ludzi wskazuje na konieczność użycia wyższego poziomu dawki.
1.4.2.5. Okres obserwacji
Wszystkie zwierzęta powinny być obserwowane co najmniej raz dziennie podczas okresu ekspozycji i 14 dni po nim, chyba że planowana jest sekcja zwłok.
1.4.3. Procedura
Substancja testowana jest dawkowana siedem dni w tygodniu przez okres 28 dni
1.4.3.1. Ogólne obserwacje
Obserwacje powinny rozpocząć się bezpośrednio po rozpoczęciu działań badawczych. Wszystkie kury powinny być starannie obserwowane co najmniej raz dziennie w każdym z 28 dni terapii i przez 14 dni po dawkowaniu lub do zaplanowanego zabicia. Wszystkie oznaki toksyczności powinny być odnotowane, w tym czas rozpoczęcia, typ, ostrość i czas trwania. Obserwacje powinny uwzględniać anomalie behawioralne, ale nie powinny być do nich ograniczone. Ataksja powinna być mierzona na porządkowej skali klasyfikacyjnej składającej się z co najmniej czterech poziomów, należy odnotować paraliż. Co najmniej dwa razy w tygodniu kury powinny być wyjęte z klatek i poddane okresowej wymuszonej aktywności motorycznej, takiej jak wspinanie się po drabinie, w celu ułatwienia obserwacji minimalnych skutków toksycznych. Zwierzęta konające, przejawiające ostre cierpienie i ból powinny być usuwane, gdy zostanie to zauważone, humanitarnie zabite i poddane sekcji zwłok.
1.4.3.2. Masa ciała
Wszystkie kury powinny być ważone tuż przed pierwszym podaniem substancji testowanej i od tego czasu co najmniej raz w tygodniu.
1.4.3.3. Biochemia
Sześć losowo wybranych kur z grup badanych i z grupy kontroli nośnika powinno zostać zabitych w ciągu kilku dni od przyjęcia ostatniej dawki. Mózg i lędźwiowy rdzeń kręgowy powinien być przygotowany i poddany analizie aktywności zahamowania esterazy (NTE) wywołującej neuropatię. Dodatkowo może być przydatne przygotowanie i poddanie tkanki nerwu kulszowego analizie aktywności zahamowania esterazy
wywołującej neuropatię. Prawidłowo, trzy ptaki grupy kontrolnej i każdej grupy badanej są zabijane po 24 godzinach i trzy po 48 godzinach od ostatniej dawki. Jeżeli dane z badania ostrej toksyczności lub innych badań (np. toksykokinetycznych) wskazują, że inne terminy zabijania po końcowym dawkowaniu są bardziej pożądane niż podane, powinny być one zastosowane, a racjonalna podstawa udokumentowana.
Analizy acetylocholinoesterazy (AChE) mogą być również wykonane na tych próbkach, jeżeli jest to uznane za właściwe. Jednakże może mieć miejsce spontaniczna reaktywacja AChE in vivo i w efekcie prowadzić do zbyt niskiego oszacowania potencjału substancji jako inhibitora AChE.
1.4.3.4. Sekcja zwłok
Sekcja zwłok wszystkich zwierząt (zabitych planowo i zabitych jako konające) powinna obejmować obserwację wyglądu mózgu i rdzenia kręgowego.
1.4.3.5. Badanie histopatologiczne
Obojętna tkanka zwierząt przeżywających okres obserwacji, nie użyta w badaniach biochemicznych powinna być poddana badaniu mikroskopowemu. Tkanki powinny być przygotowane in situ, stosując techniki perfuzji. Odcinki powinny obejmować móżdżek (środkowy - wzdłużny poziom), rdzeń przedłużony, rdzeń kręgowy, i nerwy obwodowe. Odcinki rdzenia kręgowego powinny być pobrane z górnego segmentu karku, okolic środkowopiersiowych i lędźwiowo-krzyżowych. Powinny być pobrane odcinki z okolic obwodowych nerwu piszczelowego i jego odgałęzienia do mięśnia brzuchatego łydki oraz nerwu kulszowego. Odcinki powinny być zabarwione odpowiednią mieliną i barwnikami charakterystycznymi dla aksonów. Początkowo badanie mikroskopowe powinno być przeprowadzone na zakonserwowanych tkankach wszystkich zwierząt grupy kontrolnej i grupy wysokiej dawki. W przypadku gdy istnieją dowody skutków w grupie wysokiej dawki, badanie mikroskopowe powinno być również przeprowadzone na kurach z grup niskiej i pośredniej dawki.
2. DANE
Negatywne wyniki w punktach końcowych wybranych w tej metodzie (biochemia, histopatologia i obserwacja behawioralna) prawidłowo nie wymagałyby dalszego badania, dotyczącego opóźnionej neurotoksyczności. Niejednoznaczne lub nieprzekonujące wyniki dla tych punktów końcowych mogą wymagać dalszej oceny.
Powinny zostać dostarczone dane indywidualne zwierząt. Dodatkowo wszystkie dane powinny być podsumowane w formie tabeli, przedstawiając dla każdej grupy badanej liczbę zwierząt na początku testu, liczbę zwierząt wykazujących zmiany patologiczne, skutki behawioralne i biochemiczne, typy i ostrość tych zmian patologicznych lub skutków oraz procent zwierząt okazujących każdy typ i ostrość zmiany patologicznej lub skutku.
Wyniki badania powinny być ocenione pod względem częstotliwości, ostrości, i korelacji skutków behawioralnych, biochemicznych i histopatologicznych oraz jakichkolwiek innych obserwowanych w każdej z grup badanych i kontrolnych.
Wyniki liczbowe powinny być ocenione za pomocą odpowiedniej i ogólnie akceptowanej metody statystycznej. Metody statystyczne powinny być wybrane podczas planowania badania.
3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
SPRAWOZDANIE Z TESTU
Sprawozdanie z testu obejmuje, jeżeli możliwe, następujące informacje:
Zwierzęta badane:
- wykorzystana rasa,
- liczba i wiek zwierząt,
- źródło, warunki, w których przebywają zwierzęta itp.,
- indywidualna waga zwierząt na początku testu.
Warunki testu:
- szczegóły dotyczące przygotowania substancji testowanej, trwałości i homogeniczności; w odpowiednich przypadkach,
- uzasadnienie wyboru nośnika,
- szczegóły podawania substancji testowanej,
- szczegóły jakości pożywienia i wody,
- racjonalna podstawa wyboru dawki,
- parametry podawanych dawek, w tym szczegóły dotyczące nośnika, objętości i formy fizycznej podawanych materiałów,
- racjonalna podstawa wyboru innych terminów oznaczenia biochemicznego, jeżeli są one inne niż 24 i 48 h.
Wyniki:
- dane dotyczące masy ciała,
- dane dotyczące reakcji toksycznej według grupy,
- w tym śmiertelność,
- natura, ostrość i czas trwania obserwacji klinicznych (czy odwracalne, czy nie),
- szczegółowy opis metod biochemicznych i wyników,
- wyniki sekcji zwłok,
- szczegółowy opis wszystkich wyników histopatologicznych,
- statystyczna obróbka wyników, gdzie jest to właściwe. Rozpatrzenie wyników.
Wnioski.
4. BIBLIOGRAFIA
Niniejsza metoda jest analogiczna do OECD TG 419.
B.39. TEST POREPERACYJNEJ SYNTEZY DNA Z KOMÓRKAMI WĄTROBY SSAKÓW IN VIVO
Skreślono tę metodę badania, ponieważ nie jest już uznawana za odpowiednią do generowania informacji na temat właściwości toksykologicznych substancji chemicznych do celów rozporządzenia (WE) nr 1907/2006. Metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.40. BADANIE NISZCZENIA SKÓRY METODĄ IN VITRO: TEST PRZEZSKÓRNEGO OPORU ELEKTRYCZNEGO (TER)
1. METODA
Opisywana metoda badania jest zgodna z OECD TG 430 (2004).
1.1. WSTĘP
Zniszczenie skóry oznacza powstawanie nieodwracalnych uszkodzeń tkanek skórnych w wyniku kontaktu z substancją testową (jak zdefiniowano w Globalnie Zharmonizowanym Systemie Klasyfikacji i Oznakowania Produktów Chemicznych (GHS))(1). Metoda ta umożliwia stosowanie procedury, w której ocena poziomu uszkadzania skóry nie jest przeprowadzana na żywych zwierzętach.
Do tej pory ocena zniszczenia skóry wiązała się zwykle z użyciem zwierząt laboratoryjnych (2). Potrzeba wyeliminowania bólu i cierpienia zwierząt została uwzględniona w modyfikacji metody badania B.4, umożliwiającej określenie zniszczenia skóry przy użyciu alternatywnych metod in vitro, bez zadawania zwierzętom bólu i cierpienia.
Pierwszym krokiem w kierunku zdefiniowania alternatywnych testów, które mogłyby zostać zastosowane do celów regulacyjnych, było przeprowadzenie badań prewalidacyjnych (3). Następnie przeprowadzono formalne badania walidacyjne (6)(7)(8) oceny zniszczenia skóry metodami in vitro (4)(5). Wyniki tych badań oraz inne publikacje stały się podstawą zalecenia, że do oceny niszczenia skóry in vivo można stosować następujące testy (9)(10)(11): test modelu skóry ludzkiej (zob. metoda badania B.40 bis) oraz test przezskórnego oporu elektrycznego (niniejsza metoda).
Badania walidacyjne oraz opublikowane wyniki innych badań wskazują, że test przezskórnego oporu elektrycznego (TER)(12)(13) pozwala na wiarygodne rozróżnienie znanych substancji niszczących skórę i nieniszczących skóry (5)(9).
Test przedstawiony w opisie tej metody umożliwia identyfikację związków i mieszanin chemicznych uszkadzających skórę. Ponadto w połączeniu z dowodami uzyskanymi na podstawie innych dostępnych informacji (np. pH, związek między strukturą a aktywnością, dane dotyczące człowieka i zwierząt) umożliwia identyfikację związków i mieszanin, które nie niszczą skóry (1)(2)(11)(14). Nie dostarcza informacji o podrażnieniach skóry, nie umożliwia także dzielenia substancji uszkadzających na podkategorie, jak dopuszczono w Globalnie Zharmonizowanym Systemie Klasyfikacji (GHS) (1).
Zaleca się, aby w celu pełnej oceny miejscowego działania na skórę po pojedynczej ekspozycji postępować zgodnie z sekwencyjną strategią przedstawioną w dodatku do metody badania B.4 (2) i w Globalnie Zharmonizowanym Systemie (GHS) (1). Ta strategia testowa obejmuje przeprowadzenie testów in vitro zniszczenia skóry (jak przedstawiono w opisie metody) i podrażnienia skóry przed rozważaniem przeprowadzenia badań na żywych zwierzętach.
1.2. DEFINICJE
Zniszczenie skóry in vivo: oznacza spowodowanie nieodwracalnych uszkodzeń skóry: a mianowicie widocznej martwicy skóry w warstwie naskórka i skóry właściwej w wyniku kontaktu z substancją testową w okresie do 4 godzin. Typowymi objawami zniszczenia skóry są wrzody, krwawienie, krwawiące strupy oraz, pod koniec 14-dniowego okresu obserwacji, odbarwienie skóry spowodowane zbieleniem, pojawianie się całkowitych łysin i blizn. W przypadku wątpliwych uszkodzeń należy zastosować metody histopatologiczne.
Przezskórny opór elektryczny (TER): jest miarą impedancji skóry, wartością oporu elektrycznego w kiloomach. Jest to prosta i pewna metoda ocena funkcjonowania bariery skórnej przez rejestrowanie przy użyciu mostka Wheatstone'a przechodzenia przez skórę jonów.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Tabela 1
Chemiczne substancje odniesienia
| Nazwa | Nr EINECS | NrCAS | |
| 1,2-diaminopropan | 201-155-9 | 78-90-0 | Silne działanie niszczące |
| Kwas akrylowy | 201-177-9 | 79-10-7 | Silne działanie niszczące |
| 2-tert. Butylofenol | 201-807-2 | 88-18-6 | Działanie niszczące |
| Wodorotlenek potasu (10 %) | 215-181-3 | 1310-58-3 | Działanie niszczące |
| Kwas siarkowy (10 %) | 231-639-5 | 7664-93-9 | Działanie niszczące |
| Kwas oktanowy (kwas kapry-lowy) | 204-677-5 | 124-07-02 | Działanie niszczące |
| 4-amino-1,2,4-triazol | 209-533-5 | 584-13-4 | Brak działania niszczącego |
| Eugenol | 202-589-1 | 97-53-0 | Brak działania niszczącego |
| Bromek fenetylu | 203-130-8 | 103-63-9 | Brak działania niszczącego |
| Tetrachloroetylen | 204-825-9 | 27-18-4 | Brak działania niszczącego |
| Kwas izostearynowy | 250-178-0 | 30399-84-9 | Brak działania niszczącego |
| 4-(metylotio)-benzaldehyd | 222-365-7 | 3446-89-7 | Brak działania niszczącego |
Większość z wymienionych związków chemicznych pochodzi z wykazu chemikaliów przygotowanego na potrzeby międzynarodowego studium atestacyjnego ECVAM (4). Ich wybór opiera się na następujących kryteriach:
(i) taka sama liczba substancji niszczących, jak i nieniszczących;
(ii) dostępne w handlu substancje należące do większości stosownych klas związków chemicznych;
(iii) uwzględnienie zarówno silnie niszczących jak i słabiej niszczących substancji, aby umożliwić rozróżnianie na podstawie właściwości niszczących;
(iv) wybór chemikaliów, które mogą być poddawane obróbce w laboratorium nie stwarzając zagrożeń innych niż zniszczenie skóry.
1.4. ZASADA METODY BADANIA
Materiał testowy jest nakładany na okres do 24 godzin na naskórkową powierzchnię krążków skórnych w dwuczęściowym systemie testowym, w którym krążki pełnią funkcję przegrody między dwoma częściami. Krążki skóry pobierane są od szczurów w wieku 28-30 dni uśmiercanych w humanitarny sposób. Materiały uznawane są za niszczące na podstawie ich zdolności do uszkadzania struktury warstwy rogowej i zaburzania funkcji izolacyjnej, co mierzone jest spadkiem TER poniżej poziomu progowego (12). W przypadku TER u szczurów przyjęto wartość graniczną 5 kO; wartość tę ustalono na podstawie wielu danych dla szerokiego zakresu związków chemicznych, dla których znaczna większość wartości było albo wyraźnie wyższych (często >10 kO) albo znacznie niższych (często < 3 kO) od tej wartości (12). Generalnie materiały, które w przypadku zwierząt nie niszczą skóry, tylko ją podrażniają lub w ogóle jej nie podrażniają nie powodują spadku TER poniżej tej wartości graniczną. Co więcej, zastosowanie innych preparatów skóry lub innego sprzętu może zmienić wartość graniczną, powodując konieczność dalszej walidacji.
Etap wiązania barwnika jest włączony do procedury testowej mającej potwierdzić dodatnie wyniki TER, w tym wartości w pobliżu 5 kO. Etap wiązania barwnika pozwala na stwierdzenie, czy wzrost przepuszczalności jonów jest spowodowany fizycznym zniszczeniem warstwy rogowej. Wykazano, że metoda TER z wykorzystaniem skóry szczurów świadczy o potencjale niszczącym in vivo, badanym metodą badania B.4 (2) u królików. Należy zauważyć, że test in vivo na królikach jest w porównaniu z testem wycinka ludzkiej skóry wysoce konserwatywny, jeśli chodzi o potencjał niszczenia skóry (15).
1.5. OPIS METODY BADANIA
1.5.1. Zwierzęta
Szczury są gatunkiem preferowanym, ponieważ wcześniej wykazano wrażliwość ich skóry na substancje chemiczne (10). Wiek (w momencie pobierania skóry) i linia szczurów mają zasadnicze znaczenie, bowiem od tego zależy, czy mieszki włosowe są w stanie w stanie uśpienia poprzedzającym fazę wzrostu włosa u dorosłych osobników.
Włosy z grzbietu i boku ciała młodych, około 22-dniowych samców lub samic szczurów (pochodzących od linii Wistar lub podobnych), są starannie usuwane mała pincetą. Następnie zwierzęta są czyszczone przez staranne przetarcie, natomiast miejsca, z których usuwano włosy, są pokrywane roztworem antybiotyku (zawierającym na przykład streptomycynę, penicylinę, chloramfenikol i amfoterycynę w stężeniach zapewniających zahamowanie rozwoju bakterii). Zwierzęta są przemywane antybiotykiem powtórnie trzeciego lub czwartego dnia po pierwszym przemyciu i są poddawane eksperymentowi w ciągu trzech dni od drugiego przemycia, kiedy warstwa rogowa ulegnie regeneracji po usuwaniu włosów.
1.5.2. Przygotowanie krążków skóry
Zwierzęta są zabijane w sposób humanitarny, kiedy mają 28-30 dni; wiek ma tu szczególne znaczenie. Z grzbietu i boków ciała każdego zwierzęcia pobierana jest skóra, z której następnie usuwa się starannie nadmiar tłuszczu podskórnego. Pobierane są krążki skóry o średnicy około 20 mm. Przed użyciem krążków skóra może być przechowywana, jeśli wykazano, że dane dla kontroli pozytywnej i negatywnej są równoważne z danymi uzyskanymi przy użyciu świeżej skóry.
Każdy krążek skóry jest umieszczany nad jednym z końców rurki TFE (politetrafluoroetylenowej), przy czym trzeba dopilnować, aby powierzchnia naskórkowa przylegała do rurki. Na koniec rury nakładany jest gumowy pierścień, który utrzymuje skórę w odpowiedniej pozycji, a nadmiar tkanki jest odcinany. Wymiary rurki i pierścienia pokazano na rysunku 2. Połączenie między rurką PTFE a gumowym pierścieniem jest następnie starannie uszczelniane wazeliną. Rurka jest następnie mocowana sprężynowym zaciskiem wewnątrz komory receptorowej zawierającej roztwór MgSO4 (154 mM) (rysunek 1). Krążek skóry powinien być całkowicie zanurzony w roztworze MgSO4. Z jednej skóry szczura można otrzymać 10-15 krążków.
Przed rozpoczęciem testów dla każdej skóry zwierzęcej mierzy się opór elektryczny dwóch krążków skórnych, co stanowi procedurę kontroli jakości. Aby reszta krążków mogła zostać użyta do testów, wartości oporu dla obu krążków powinny być wyższe niż 10 kΩ. Jeśli wartość oporu jest mniejsza niż 10 kΩ, resztę krążków z tej skóry należy wyrzucić.
1.5.3. Nakładanie substancji testowej i kontrolnej
Aby zapewnić odpowiednią jakość testu, w każdym badaniu należy równocześnie stosować kontrolę pozytywną i negatywną. Należy używać krążków ze skóry jednego zwierzęcia. Jako substancji kontroli pozytywnej i negatywnej zaleca się używać odpowiednio 10 M kwasu solnego i wody destylowanej.
Płynne substancje testowe nakłada się równomiernie na powierzchnię naskórkową wewnątrz rurki (150 μL). Aby mieć pewność w czasie badania materiałów stałych, że pokryta jest cała powierzchnia, na krążek nakłada się równomiernie odpowiednią ilość materiału stałego. Do substancji stałej dodaje się wodę dejonizowaną (150 uL) i delikatnie potrząsa się rurką. W celu zapewnienia maksymalnego kontaktu cząstek stałych ze skórą może być konieczne albo ich podgrzanie do 30 oC, aby je stopić lub zmiękczyć, albo zmielenie, aby otrzymać granulat lub proszek.
Dla każdej substancji testowej i kontrolnej stosuje się trzy krążki skóry. Substancje testowe nakłada się na 24 godziny przy temperaturze 20-23 oC. Substancja testowa jest zmywana strumieniem wody wodociągowej o temperaturze 30 oC do momentu, aż nie da się już usunąć więcej materiału.
1.5.4. Pomiary TER
Impedancja skóry jest mierzona jako TER za pomocą niskonapięciowego mostka Wheatstone'a przy zastosowaniu prądu zmiennego (13). Ogólne dane techniczne mostka to napięcie robocze 1-3 V, prąd zmienny 50-100 Hz sinusoidalny lub prostokątny i zakres pomiaru co najmniej 0,1-30 kΩ Mostek stosowany w badaniach walidacyjnych mierzy indukcyjność, opór bierny pojemnościowy i opór do wartości odpowiednio 2.000 H, 2.000 μF oraz 2 MΩ, przy częstotliwości 100 Hz lub 1 kHz i przy połączeniach szeregowych lub równoległych. Do celów oceny poziomu niszczenia skóry TER dokonuje się pomiarów oporu przy częstotliwości 100 Hz i przy zastosowaniu połączeń szeregowych. Przed dokonaniem pomiaru oporu elektrycznego zmniejsza się napięcie skóry przez dodanie dostatecznej ilości 70 % etanolu, aby pokryć naskórek. Po paru sekundach usuwa się etanol z rurki, a tkankę uwadnia przez dodanie 3 mL roztworu MgSO4 (154 mM). W celu zmierzenia oporu krążka skóry w kΩ, po obu jego stronach są umieszczane elektrody mostka (rysunek 1). Wymiary elektrod i długość elektrod obnażonych poniżej zacisku szczękowego są pokazane na rysunku 2. W czasie pomiaru oporu zacisk przymocowany do wewnętrznej elektrody opiera się na szczycie rurki PTFE, aby mieć pewność, że w roztworze MgSO4 zanurzony jest ciągły odcinek elektrody. Elektroda zewnętrzna umieszczona jest wewnątrz części receptorowej, na jej dnie. Należy utrzymywać stałą odległość między zaciskiem szczękowym a dnem rurki PTFE (rysunek 2), ponieważ odległość ma wpływ na otrzymywane wartości oporu. W związku z tym odległość między wewnętrzną elektrodą a krążkiem skóry powinna być stała i minimalna (1-2 mm).
Jeśli zmierzona wartość oporu jest większa niż 20 kΩ, może to być spowodowane pozostałościami substancji testowej pokrywającej naskórkową powierzchnię krążka skóry. Można próbować usunąć tę warstwę, na przykład zatykając rurkę palcem w rękawiczce i potrząsając rurką przez około 10 sekund; usuwa się roztwór MgSO4 i powtarza pomiar oporu przy zastosowaniu nowej porcji MgSO4.
Na otrzymane wartości TER mogą mieć wpływ charakterystyka i wymiary aparatu testowego oraz zastosowana procedura eksperymentalna. Na podstawie danych uzyskanych przy użyciu określonej aparatury i procedury, przedstawionych w opisie tej metody, ustalono 5 kΩ próg poziomu niszczenia skóry. Jeśli warunki testu zostaną zmienione lub jeśli stosuje się inną aparaturę, zastosowanie mogą znajdować inne progi i wartości kontrolne. Tak więc konieczne jest dokonanie kalibracji metodyki i wartości progów oporu przez zbadanie szeregu wzorców wybranych spośród substancji chemicznych użytych w badaniu walidacyjnym (4)(5) lub spośród związków chemicznych podobnych do badanych substancji. Zestaw odpowiednich substancji wzorcowych zamieszczono w tabeli 1.
1.5.5. Metody wiązania barwników
Działanie niektórych materiałów nieniszczących skóry może prowadzić do zmniejszenia oporu poniżej wartości granicznej 5 kΩ, umożliwiając przechodzenie jonów przez warstwę rogową i w ten sposób redukując opór elektryczny (5). Na przykład obojętne związki organiczne oraz związki powierzchniowo czynne (w tym detergenty, emulgatory i inne surfaktanty) mogą usuwać ze skóry tłuszcz, powodując, że bariera skórna staje się bardziej przepuszczalna dla jonów. Tak więc, jeśli wartości TER substancji testowych są niższe niż lub zbliżone do 5 kΩ przy braku widocznego uszkodzenia, należy dla tkanek kontrolnych i badanych przeprowadzić test przenikania barwnika, aby stwierdzić, czy uzyskane wartości TER są wynikiem zwiększonej przepuszczalności skóry czy jej uszkodzenia (3)(5). W tym drugim przypadku, jeśli uszkodzona jest warstwa rogowa, barwnik sulforodamina B szybko przenika w głąb skóry i zabarwia leżącą głębiej tkankę. Ten szczególny barwnik nie wchodzi w reakcję z wieloma różnymi związkami chemicznymi i nie ma na niego wpływu procedura ekstrakcji opisana poniżej.
1.5.5.1. Stosowanie barwnika sulforodaminy B i jego usuwanie
Po pomiarze TER siarczan magnezu jest usuwany z rurki i skóra jest poddawana dokładnym oględzinom, aby sprawdzić, czy są na niej widoczne uszkodzenia. Jeśli nie ma oczywistych dużych uszkodzeń, na naskórkową powierzchnię każdego krążka skóry nakładany jest na dwie godziny barwnik sulforodamina B (Acid Red 52; C.I. 45100; numer EINECS 222-529-8; numer CAS 3520-42-1), 150 uL 10 % (masa/obj.), rozpuszczony w wodzie destylowanej. Krążki skóry są następnie przemywane wodą wodociągową w temperaturze nie wyższej od pokojowej przez około 10 sekund, aby usunąć wszelki zbędny/niezwiązany barwnik. Każdy krążek skóry jest starannie usuwany z rurki PTFE i umieszczany w fiolce (np. 20 mL szklanej fiolce scyntylacyjnej) zawierającej wodę dejonizowaną (8 mL). Fiolki są delikatnie wstrząsane przez 5 minut, aby usunąć cały nadmiar niezwiązanego barwnika. Procedura płukania jest powtarzana, po czym krążki skóry są wyjmowane i umieszczane w fiolkach zawierających 5 ml 30 % (masa/obj.) roztworu sodowego siarczanu dodecylu (SDS) w wodzie destylowanej i inkubowane przez noc w 60 oC.
Po inkubacji wszystkie krążki skóry są wyjmowane i usuwane, a pozostały roztwór jest wirowany przez 8 minut w temperaturze 21 oC (względna siła odśrodkowa ~ 175 × g). Próbka o objętości 1 mL supernatantu jest rozpuszczana w stosunku 1 do 5 (obj./obj) [tj. 1 mL + 4 mL] z 30 % (masa/obj.) SDS w wodzie destylowanej. Gęstość optyczną (OD) mierzy się przy 565 nm.
1.5.5.2. Obliczanie zawartości barwnika
Zawartość barwnika sulforodaminy B na krążek obliczana jest na podstawie wartości OD (5) (współczynnik molowy ekstynkcji sulforodaminy B przy 565 nm = 8,7 × 104; ciężar cząsteczkowy = 580). Zawartość barwnika jest określana dla wszystkich krążków skóry przy zastosowaniu odpowiedniej krzywej kalibracyjnej, a następnie dla wszystkich powtórzeń liczona jest średnia.
2. DANE
Wartości oporu (kΩ) i średnie zawartości barwnika (ug/krążek) dla materiału testowego, jak również dla kontroli pozytywnej i negatywnej, powinny być tam gdzie to właściwe przedstawione w formie tabelarycznej (poszczególne dane z prób i średnie ± S.D.), w tym dane dla powtórzeń/powtarzanych eksperymentów, średnie i poszczególne dane.
2.1. INTERPRETACJA WYNIKÓW
Średnie wyniki TER są uznawane, jeśli w testującym laboratorium wartości otrzymane w jednoczesnych próbach kontroli pozytywnej i negatywnej mieszczą się w zakresie dopuszczalnym dla metody. Dopuszczalne zakresy oporu dla metodyki i aparatury opisanych powyżej podano w poniższej tabeli:
| Kontrola | Substancja | Zakres oporu (kΩ) |
| Pozytywna | 10 M kwas solny | 0,5- 1,0 |
| Negatywna | Woda destylowana | 10-25 |
Średnie wyniki wiązania barwnika są akceptowane pod warunkiem, że wartości otrzymane w równoczesnych testach kontrolnych mieszczą się w przedziałach akceptowanych dla metody. Sugerowane dopuszczalne zakresy zawartości barwnika dla substancji kontrolnych dla metodyki i aparatury opisanych powyżej zamieszczono w poniższej tabeli:
| Kontrola | Substancja | Zakres zawartości barwnika (μg/krążek) |
| Pozytywna | 10 M kwas solny | 40-100 |
| Negatywna | Woda destylowana | 15-35 |
Substancja testowa uznawana jest za nieniszczącą skóry:
(i) jeśli średnia wartość TER otrzymana dla substancji testowej jest większa niż 5 kΩ lub
(ii) średnia wartość TER jest niższa od lub równa 5 kΩ; i
- krążek skóry nie wykazuje niewątpliwych uszkodzeń, i
- średnia zawartość barwnika na krążek jest znacznie niższa od średniej zawartości barwnika na krążek w równoczesnej kontroli pozytywnej z 10 M HC1.
Substancja testowa uznawana jest za niszczącą skórę:
(i) jeśli średnia wartość TER jest niższa od lub równa 5 kΩ, a krążek skóry jest niewątpliwie uszkodzony; lub
(ii) średnia wartość TER jest niższa od lub równa 5 kΩ; i
- krążek skóry nie wykazuje niewątpliwych uszkodzeń, ale
- średnia zawartość barwnika na krążek jest wyższa lub równa średniej zawartości barwnika na krążek w równoczesnej kontroli pozytywnej z 10 M HC1.
3. SPRAWOZDAWCZOŚĆ
3.1. SPRAWOZDANIE DOTYCZĄCE BADANIA
Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
Substancje testową i kontrolną:
- nazwy chemiczne, takie jak nazwa IUPAC lub CAS oraz numer CAS, jeśli jest znany,
- czystość i skład substancji lub preparatu (w procentach masy) i właściwości fizyczne,
- właściwości fizyko-chemiczne, takie jak stan skupienia, pH, stabilność, rozpuszczalność w wodzie stosownie do warunków przeprowadzania badania;
- postępowanie z substancjami testowym/kontrolnymi przed rozpoczęciem badań, jeśli znajduje zastosowanie (np. podgrzewanie, mielenie),
- stabilność, jeśli jest znana. Zwierzęta testowe:
- linia i płeć,
- wiek zwierząt w momencie pobierania skóry,
- źródło, warunki w pomieszczeniu, dieta itd.,
- szczegóły dotyczące przygotowania skóry. Warunki testu:
- krzywe kalibracyjne dla aparatury testowej,
- krzywe kalibracyjne dla parametrów testu wiązania barwnika,
- szczegóły zastosowanej procedury testowej do pomiaru TER,
- szczegółowe informacje na temat procedury testowej stosowanej do oceny wiązania barwnika; w stosownych przypadkach,
- opis wszelkich modyfikacji procedur testowych,
- opis zastosowanych kryteriów oceny. Wyniki:
- tabele zawierające dane z badań TER i testu wiązania barwnika (jeśli to znajduje zastosowanie) dla poszczególnych zwierząt i poszczególnych próbek skóry,
- opis wszelkich obserwowanych skutków. Dyskusja wyników.
Wnioski
4. BIBLIOGRAFIA
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mono(2001)6.
(2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/Corrosion.
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C, Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R, Ponec, M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M. (1995). A prevalidation study on in vitro skin corrosivity testing. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, 219-255.
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, A.P., and Worth, A.P. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 1. Selection and distribution of the test chemicals. Toxic, in Vitro 12, 471-482.
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, PA., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.-G., and Liebsch, M. (1998). The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxic, in Vitro 12, 483-524.
(6) Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods, 62pp.
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L, Combes, R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, CA., Repetto, G., Sladowski. D., Spielmann, H., and Zucco, F. (1995). Practical aspects of the validation of toxicity test procedures. The report and recommendations of ECVAM workshops. ATLA 23, 129-147.
(8) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (1997). Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No. 97-3981. National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf
(9) ECVAM (1998). ECVAM News & Views. ATLA 26, 275-280.
(10) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods). (2002). ICCVAM evaluation of EpiDermTM, EPISKINTM (EPI-200), and the Rat Skin Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro test methods for assessing dermal corrosivity potential of chemicals. NIH Publication No. 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
(11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st - 2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27th March 2002, OECD ENV7EHS, available upon request from the Secretariat
(12) Oliver, G.J.A., Pemberton, MA., and Rhodes, C. (1986). An invitro skin corrosivity test -modificationsand validation. Fd. Chem. Toxicol. 24, 507-512.
(13) Botham, PA., Hall, T.J., Dennett, R, McCall, J.C., Basketter, DA., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, J. (1992). The skin corrosivity test invitro: results of an interlaboratory trial. Toxic, in Vitro 6, 191-194.
(14) Worth A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham PA., Curren RD, Earl L.K., Esdaile D.J., Liebsch M (1998). An Evaluation of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26: 709-720.
(15) Basketter, DA., Chamberlain, M., Griffiths, HA., Rowson, M., Whittle, E., York, M. (1997). The classification of skin irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, 845-852.
(16) Oliver G.JA, Pemberton MA and Rhodes C. (1988). An In Vitro model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial Validation. Toxic. in Vitro. 2, 7-17.
Rysunek 1
Aparatura do testu TER skóry szczura
Rysunek 2
Wymiary rurek politetrafluoroetylenowej (PFTE) i receptorowej oraz stosowane elektrody
Najważniejsze elementy urządzenia przedstawionego powyżej:
- wewnętrzna średnica rurki PTFE,
- długość elektrod w stosunku do rurki PTFE i rurki receptorowej, dobrana tak, aby elektrody nie dotykały do krążka skóry i żeby standardowa długość elektrody stykała się z roztworem MgSO4,
- ilość roztworu MgSO4 w rurce receptorowej powinna zapewniać wysokość słupa cieczy odpowiednią do jej poziomu w rurce PFTE, jak pokazano na rysunku 1,
- krążek skóry powinien być wystarczająco mocno przymocowany do rurki PFTE, tak aby opór elektryczny był rzeczywistą miarą właściwości skóry.
B.40. BIS BADANIE ZNISZCZENIA SKÓRY METODĄ IN VITRO: BADANIE MODELU SKÓRY LUDZKIEJ
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.41. BADANIE FOTOTOKSYCZNOŚCI 3T3 NRU IN VITRO
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.42. DZIAŁANIE UCZULAJĄCE NA SKÓRĘ: BADANIE LOKALNYCH WĘZŁÓW CHŁONNYCH
WSTĘP
1. Wytyczne OECD w odniesieniu do badania chemikaliów i opracowane według nich metody badań UE są okresowo poddawane przeglądowi w związku z postępem naukowym, zmieniającymi się potrzebami regulacyjnymi oraz troską o dobrostan zwierząt. Pierwotna metoda badania (TM) przy określaniu działania uczulającego na skórę u myszy - badanie lokalnych węzłów chłonnych (LLNA); wytyczna OECD nr 429 dotycząca badań; rozdział B.42 niniejszego załącznika) została przyjęta już wcześniej (1). Szczegóły walidacji LLNA i przegląd powiązanej bibliografii opublikowano w (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11). Zaktualizowana metoda LLNA opiera się na ocenie doświadczeń i danych naukowych (12). Jest to druga TM opracowywana w celu oceny potencjału działania uczulającego na skórę przez chemikalia (substancje i mieszaniny) u zwierząt. Druga TM (tj. wytyczna OECD nr 406 dotycząca badań; rozdział B.6 niniejszego załącznika) wykorzystuje badania na świnkach morskich, w szczególności test maksymalizacji na świnkach morskich oraz test Buehlera (13). LLNA jest korzystniejsza od metody B.6 i wytycznej OECD nr 406 (13) dotyczącej badań w odniesieniu do dobrostanu zwierząt. Ta zaktualizowana LLNA TM obejmuje zestaw norm efektywności (PS) (dodatek 1), które mogą być wykorzystywane do oceny statusu zatwierdzenia nowych lub zmodyfikowanych metod badania, które są funkcjonalnie i pod względem mechanistycznym podobne do LLNA, zgodnie z zasadami określonymi w wytycznych OECD nr 34 (14).
2. LLNA bada fazę indukcyjną uczulenia skóry i dostarcza danych ilościowych odpowiednich dla dokonania oceny dawka-reakcja. Trzeba zauważyć, że łagodne/umiarkowane czynniki uczulające, które zalecane są jako odpowiednie pozytywne substancje kontrolne dla metod testów na świnkach morskich (tj. B.6; wytyczna OECD nr 406 dotycząca badań) (13) są również właściwe do stosowania w LLNA (6) (8) (15). Ograniczone podejście LLNA (rLLNA), w którym można by wykorzystywać do 40 % mniej zwierząt, jest również opisane jako opcja w tej TM (16) (17) (18). Metoda rLLNA może być wykorzystywana, jeśli istnieje potrzeba regulacyjna, aby potwierdzić negatywne oczekiwania co do potencjału działania uczulającego na skórę, pod warunkiem przestrzegania wszystkich innych specyfikacji protokołów LLNA, jak to opisano w niniejszej TM. Przewidywania negatywnego wyniku powinny opierać się na wszystkich dostępnych informacjach, o których mowa w pkt 4. Przed zastosowaniem podejścia rLLNA należy przedstawić jasne uzasadnienie i naukowe przesłanki uzasadniające jego stosowanie. Jeżeli, wbrew oczekiwaniom, uzyskuje się w rLLNA pozytywny lub niejednoznaczny wynik, konieczne mogą być dodatkowe badania w celu interpretacji lub wyjaśnienia nieprawidłowości. Metody rLLNA nie należy wykorzystywać do identyfikacji zagrożeń ze strony badanych substancji uczulających skórę w przypadku, gdy potrzebne są informacje dotyczące zależności dawka-reakcja w celach takich, jak dokonanie podziału na podkategorie na potrzeby rozporządzenia (WE) nr 1272/2008 w sprawie klasyfikacji, oznakowania i pakowania substancji i mieszanin oraz Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów ONZ.
DEFINICJE
3. Definicje są zamieszczone w dodatku 2.
ZAŁOŻENIA WSTĘPNE I OGRANICZENIA
4. LLNA jest alternatywną metodą identyfikowania potencjalnych chemikaliów uczulających skórę. Nie oznacza to, że należy koniecznie we wszystkich przypadkach stosować LLNA zamiast testu na świnkach morskich (tj. B.6; wytyczna OECD nr 406 dotycząca badań) (13), a tylko, że badanie to ma tę samą wartość merytoryczną i może zostać zastosowane jako badanie alternatywne, którego pozytywne lub negatywne wyniki nie wymagają już dalszego potwierdzenia Laboratorium badawcze powinno uwzględnić wszystkie dostępne informacje na temat badanej substancji przed rozpoczęciem badań. Informacje te powinny obejmować tożsamość i budowę chemiczną badanej substancji; jej właściwości fizyko-chemiczne; wyniki innych badań toksyczności in vitro lub in vivo badanej substancji i dane toksykologiczne dotyczące strukturalnie pokrewnych substancji chemicznych. Informacje te należy uwzględnić w celu ustalenia, czy LLNA jest odpowiednia dla substancji (ze względu na niezgodność ograniczonych rodzajów chemikaliów z LLNA - zob. pkt 5) oraz do pomocy przy doborze dawek.
5. Będąc metodą in vivo, LLNA nie eliminuje wykorzystania zwierząt w określaniu alergicznego kontaktowego działania uczulającego. Daje jednak potencjalne możliwości obniżenia liczby zwierząt potrzebnych do tego celu. Co więcej, LLNA oferuje znacznie bardziej udoskonalony sposób wykorzystywania zwierząt (mniej bólu i cierpienia) do badania alergicznego kontaktowego działania uczulającego. LLNA opiera się na obserwacji zjawisk immunologicznych zachodzących podczas fazy indukcyjnej uczulania. W odróżnieniu od testów na świnkach morskich (tj. B.6; wytyczna OECD nr 406 dotycząca badań) (13), test LLNA nie wymaga wywoływania reakcji nadwrażliwości skóry poprzez prowokację. Ponadto LLNA nie wymaga zastosowania adiuwanta, jak wymaga tego test maksymalizacji na świnkach morskich (13). Tym samym LLNA zmniejsza ból i cierpienie zwierząt. Niezależnie od przewagi LLNA nad metodami B.6 i wytyczną OECD nr 406 dotyczącą badań, należy przyznać, że istnieją pewne ograniczenia, które mogą spowodować konieczność wykorzystania B.6 lub wytycznej OECD nr 406 (13) dotyczącej badań (np. fałszywe wyniki negatywne dla LLNA w przypadku niektórych metali, fałszywe wyniki pozytywne w przypadku niektórych środków drażniących skórę [takich jak niektóre chemikalia powierzchniowo czynne] lub rozpuszczalność badanej substancji) (19) (20). Ponadto klasy chemiczne lub substancje zawierające grupy funkcjonalne, co do których wykazano, że działają jako potencjalne czynniki zakłócające (21), mogą wymagać użycia badań na świnkach morskich (tj. B.6; wytyczna OECD dotycząca badań nr 406) (13). Co więcej, na podstawie ograniczonej bazy danych walidacyjnych, która składała się głównie z form użytkowych pestycydów, otrzymanie pozytywnego wyniku dla tego rodzaju badanych substancji jest bardziej prawdopodobne w przypadku LLNA niż w przypadku testów na świnkach morskich (22). Jednak podczas badania form użytkowych można rozważyć wykorzystanie podobnych substancji o znanych wynikach jako substancji referencyjnych w celu wykazania, że LLNA działa prawidłowo (zob. pkt 16). Poza tymi przypadkami zidentyfikowanych ograniczeń LLNA powinna być stosowana do badania wszelkich substancji, chyba że istnieją właściwości związane z tymi substancjami, które mogą zakłócać dokładność LLNA.
ZASADA BADANIA
6. Podstawową zasadą u podłoża LLNA jest fakt, iż czynniki uczulające wywołują pierwotną proliferację limfocytów w węźle chłonnym odprowadzającym limfę z miejsca przyłożenia badanej substancji. Ta proliferacja jest proporcjonalna do zastosowanej dawki oraz potencjału zastosowanego alergenu i jest prostym środkiem uzyskania ilościowego pomiaru uczulenia. Proliferacja jest mierzona przez porównanie średniej proliferacji w każdej badanej grupie do średniej proliferacji w grupie kontrolnej otrzymującej nośnik (VC). Określa się stosunek średniej proliferacji w każdej grupie poddanej działaniu środka do średniej proliferacji w równoległej grupie VC, który jest nazywany wskaźnikiem stymulacji (SI) i powinien wynosić ≥ 3 zanim substancja badana zostanie zaklasyfikowana jako potencjalny czynnik uczulający skórę. Procedury opisane w niniejszym dokumencie są oparte na wykorzystaniu do pomiaru in vivo znakowania markerem promieniotwórczym zwiększonej liczby komórek rozmnażających się wegetatywnie w odprowadzających usznych węzłach chłonnych. Można jednak zastosować inne punkty końcowe do oceny liczby rozmnażających się komórek, pod warunkiem że wymogi PS są całkowicie spełnione (dodatek 1).
OPIS BADANIA
Dobór gatunków zwierząt
7. Mysz jest gatunkiem preferowanym do tego badania. Używa się młodych, dorosłych samic myszy szczepów CBA/Ca lub CBA/J, które nie rodziły i nie są ciężarne. Na początku doświadczenia samice powinny mieć 8-12 tygodni, a zróżnicowanie mas ciała poszczególnych zwierząt powinno być minimalne i nie przekraczać 20 % średniej masy ciała. Można ewentualnie wykorzystać inne szczepy i samce, jeżeli otrzymano wystarczające dowody na to, że nie istnieją znaczące specyficzne różnice w reakcji na LLNA w zależności od szczepu i/lub płci.
Warunki w pomieszczeniach dla zwierząt i pożywienie
8. Myszy powinny być trzymane w grupach (23), chyba że istnieją odpowiednie naukowe przesłanki dla trzymania myszy pojedynczo. Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 22 ± 3 °C. Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50-60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin światła, 12 godzin ciemności. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej.
Przygotowanie zwierząt
9. Zwierzęta wybierane są losowo i znakowane w sposób umożliwiający indywidualną identyfikację (ale nie przez jakiekolwiek znaki na uszach) i trzymane w klatkach przez co najmniej pięć dni przed rozpoczęciem dawkowania w celu umożliwienia zaaklimatyzowania do warunków laboratoryjnych. Przed rozpoczęciem podawania bada się wszystkie zwierzęta w celu upewnienia się, że nie mają żadnych zauważalnych zmian skórnych.
Przygotowanie roztworów dozujących
10. Stałe substancje powinny zostać rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach oraz rozcieńczone, jeżeli jest to odpowiednie, przed zastosowaniem na uchu myszy. Chemikalia płynne można zastosować czyste lub rozcieńczone przed dawkowaniem. Chemikalia nierozpuszczalne, takie jak te najczęściej spotykane w wyrobach medycznych, należy poddać ekstrakcji w warunkach wyjątkowych w odpowiednim rozpuszczalniku w celu wykrycia wszystkich możliwych do wyekstrahowania składników do badania przed zastosowaniem na uchu myszy. Substancje badane należy przygotowywać codziennie, chyba że dane dotyczące stabilności wykazują dopuszczalność składowania.
Sprawdzenie wiarygodności
11. Pozytywne substancje kontrolne (PC) wykorzystuje się do wykazania właściwego działania badania poprzez reakcję badanej substancji uczulającej z odpowiednią i powtarzalną czułością, dla której wielkość reakcji jest dobrze scharakteryzowana. Włączanie kolejnych PC jest zalecane, ponieważ potwierdza się w ten sposób kompetencje laboratorium do skutecznego przeprowadzenia każdego badania i umożliwia dokonanie oceny odtwarzalności i porównywalności wewnątrz- i międzylaboratoryjnej. Niektóre organy regulacyjne wymagają PC dla każdego badania i w związku z tym użytkownicy są zachęcani do przeprowadzenia konsultacji z właściwymi organami przed rozpoczęciem LLNA. Odpowiednio zaleca się rutynowe wykorzystywanie równoległej PC, aby uniknąć potrzeby dodatkowych badań na zwierzętach do spełnienia tych wymagań, które mogą powstać w związku ze stosowaniem okresowej PC (zob. pkt 12). PC powinna dać w teście LLNA odpowiedź pozytywną na poziom narażenia na działanie, przy którym oczekuje się wzrostu wskaźnika stymulacji (SI) > 3 więcej niż w grupie kontroli negatywnej (NC). Dawkę PC należy dobrać w taki sposób, by nie powodować nadmiernego podrażnienia skóry lub ogólnoustrojowej toksyczności, a indukcja była powtarzalna, ale nie nadmierna (tj. SI > 20 byłyby zbyt wysokie). Preferowana PC to 25 % aldehydu cynamonowego heksylu (Chemical Abstracts Service [CAS] nr 101-86-0) w acetonie: oliwie z oliwek (w proporcji objętościowej 4:1 v/v) i 5 % merkaptobenzotiazolu (CAS nr 149-30-4) w N,N,-dimetyloformamidzie (zob. dodatek 1, tabela 1). Mogą zaistnieć okoliczności, w których można użyć innych PC spełniających powyższe kryteria, pod warunkiem że istnieje po temu odpowiednie uzasadnienie.
12. Pomimo że zaleca się włączenie równoległej grupy PC, mogą zaistnieć sytuacje, w których okresowe badanie PC (tj. w odstępach nie dłuższych niż 6 miesięcy) może okazać się wystarczające w przypadku laboratoriów, które regularnie przeprowadzają badanie LLNA (tj. przeprowadzają badanie LLNA co najmniej raz na miesiąc) i dysponują wcześniejszymi danymi z pozytywnych kontroli, świadczącymi o tym, że laboratorium jest w stanie uzyskiwać odtwarzalne i dokładne wyniki w pozytywnych kontrolach. Można wykazać odpowiedni poziom biegłości w wykonywaniu badania LLNA, uzyskując stałe pozytywne wyniki PC w co najmniej 10 niezależnych badaniach przeprowadzonych w rozsądnym terminie (tj. w okresie krótszym niż rok).
13. Należy zawsze włączać równoległą grupę PC, jeśli zachodzi proceduralna zmiana w LLNA (np. zmiana przeszkolonego personelu, zmiany w metodzie badania materiałów i/lub odczynników, zmiany w metodzie badania urządzenia, zmiana źródła zwierząt testowych), a przedmiotowe zmiany powinny być udokumentowane w laboratoryjnych sprawozdaniach. Należy zwrócić uwagę na wpływ tych zmian na odpowiedniość ustalonych wcześniej danych przy określaniu konieczności zgromadzenia nowej bazy danych, aby udokumentować spójność wyników PC.
14. Badacze powinni być świadomi, że decyzja o przeprowadzeniu badania PC na zasadzie okresowej zamiast równolegle wywiera wpływ na odpowiedniość i akceptowalność negatywnych wyników badań uzyskanych bez równoległej PC w okresie pomiędzy każdym okresowym badaniem PC. Na przykład, jeżeli w okresowych PC uzyskany zostaje wynik fałszywie negatywny, negatywne wyniki substancji badanej uzyskane w okresie między ostatnim dopuszczalnym okresowym badaniem PC i niedopuszczalnym okresowym badaniem PC mogą być kwestionowane. Należy dokładnie rozważyć tego rodzaju skutki przy podejmowaniu decyzji, czy należy włączyć równoległą PC, czy tylko przeprowadzać PC na zasadzie okresowej. Należy również wziąć pod uwagę możliwość wykorzystania mniejszej liczby zwierząt w ramach grupy równoległej PC, jeżeli jest to naukowo uzasadnione, oraz jeżeli laboratorium może wykazać, w oparciu o wcześniej zgromadzone dane, że można wykorzystać mniejszą liczbę myszy (12).
15. Chociaż substancja kontroli pozytywnej powinna być testowana w nośniku, o którym wiadomo, że wywołuje konsekwentną reakcję (np. aceton: oliwa z oliwek; w proporcji objętościowej 4:1, v/v), mogą jednak zaistnieć pewne sytuacje wynikające z przepisów, w których przetestowanie w niestandardowym nośniku (o formulacji odpowiedniej klinicznie/chemicznie) może być również konieczne (24). Jeżeli równoległa PC jest badana w innym nośniku niż substancja badana, wówczas należy włączyć oddzielną VC w odniesieniu do równoległej PC.
16. W przypadkach gdy ocenia się substancje badane konkretnej klasy chemicznej lub dające pewien zakres reakcji, substancje wzorcowe mogą służyć także temu, aby wykazać, czy metoda badawcza jest odpowiednia dla dokonania oceny potencjalnego działania uczulającego na skórę tego rodzaju badanych substancji. Odpowiednie substancje wzorcowe powinny posiadać następujące właściwości:
- strukturalne i funkcjonalne podobieństwo do klasy badanej substancji,
- znane właściwości fizyczne i chemiczne,
- dane potwierdzające z LLNA,
- dane potwierdzające z innych modeli zwierzęcych i/lub ludzkich.
PROCEDURA BADANIA
Liczba zwierząt i poziomy dawek
17. W każdej grupie badanej powinny być użyte nie mniej niż cztery zwierzęta, z minimalną liczbą trzech stężeń badanej substancji oraz negatywną grupą kontrolną otrzymującą jedynie nośnik badanej substancji i pozytywną grupą kontrolną (równoległą lub najnowszą, zgodnie z podejściem laboratorium, bierze się pod uwagę pkt 11-14). Należy rozważyć zbadanie wielu dawek PC, szczególnie gdy badanie PC jest prowadzone na zasadzie nieregularnej. Z wyjątkiem zastosowania substancji badanej, ze zwierzętami grup kontrolnych należy się obchodzić w sposób identyczny jak ze zwierzętami grup badanych.
18. Dobór dawek i wybór nośnika powinien być oparty na zaleceniach podanych w pozycjach (3) i (5) bibliografii. Kolejne dawki zazwyczaj wybiera się z odpowiedniego szeregu stężeń, takich jak 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Do wyboru szeregu stężeń należy dołączyć odpowiednie naukowe uzasadnienie. O ile są dostępne, należy uwzględnić wszystkie istniejące informacje toksykologiczne (np. o ostrej toksyczności i o podrażnieniu skóry) oraz o strukturalnych i fizykochemicznych właściwościach badanej substancji (i/lub substancji zbliżonych pod względem budowy) przy wyborze trzech kolejnych stężeń, tak aby najwyższe stężenie maksymalizowało narażenie, nie doprowadzając jednak do ogólnoustrojowej toksyczności i/lub nadmiernego miejscowego podrażnienia skóry (3) (25). W przypadku braku takich informacji może okazać się konieczne przeprowadzenie badania wstępnego (zob. pkt 21-24)
19. Nośnik nie powinien zakłócać wyniku badania lub wpływać na niego oraz powinien być wybrany na podstawie maksymalizowania rozpuszczalności w celu uzyskania najwyższego osiągalnego stężenia, dając jednocześnie możliwość uzyskania roztworu/zawiesiny nadającej się do podania substancji badanej. Zalecanymi nośnikami są aceton: oliwa z oliwek (w proporcji objętościowej 4:1 v/v), N,N-dimetyloformamid, metyloetyloketon, glikol propylenowy i sulfotlenek dimetylowy (19), ale mogą być użyte inne, jeśli przedstawi się wystarczające uzasadnienie naukowe. W niektórych sytuacjach może okazać się konieczne użycie, jako dodatkowej kontroli, rozpuszczalnika odpowiedniego ze względów klinicznych, lub postaci handlowej, w której badana substancja wprowadzana jest na rynek. Szczególną uwagę należy zwrócić na zapewnienie, aby hydrofilne substancje badane zostały włączone do systemu nośnika, który nawilża skórę i nie spływa z niej natychmiast, przez włączenie odpowiednich środków zwiększających rozpuszczalność (np. 1 % Pluronic ® L92). A zatem należy unikać roztworów całkowicie wodnych.
20. Przetwarzanie węzłów chłonnych z poszczególnych myszy umożliwia ocenę zmienności pomiędzy zwierzętami oraz statystyczne porównanie różnicy między substancją badaną i pomiarami grupy VC (zob. pkt 35). Ponadto dokonanie oceny możliwości obniżenia liczby myszy w grupie PC jest wykonalne wówczas, gdy gromadzone są dane dotyczące poszczególnych zwierząt (12). Co więcej, niektóre organy regulacyjne wymagają zbierania danych dotyczących poszczególnych zwierząt. Niemniej jednak połączenie danych dotyczących zwierząt może być uznane za możliwe do przyjęcia przez niektóre organy regulacyjne i w takich przypadkach użytkownicy mogą mieć możliwość gromadzenia indywidualnych lub połączonych danych dotyczących zwierząt.
Badanie wstępne
21. W przypadku braku informacji pozwalającej określić najwyższą dawkę, jaka ma zostać zbadana (zob. pkt 18), należy przeprowadzić badanie wstępne w celu określenia właściwego poziomu dawki do badania w metodzie LLNA. Celem badania wstępnego jest opracowanie wytycznych dotyczących wyboru maksymalnej dawki, jaką należy stosować w głównym badaniu LLNA, w przypadku gdy nie dysponuje się informacjami na temat stężenia powodującego toksyczność ogólnoustrojową (zob. pkt 24) i/lub nadmierne miejscowe podrażnienie skóry (zob. pkt 23). Maksymalny poziom badanej dawki powinien wynosić 100 % substancji badanej w przypadku cieczy lub maksymalne możliwe stężenie w przypadku ciał stałych lub zawiesin.
22. Badanie wstępne przeprowadza się w warunkach identycznych do tych, w jakich przeprowadza się główne badanie LLNA, z tym że nie przeprowadza się oceny proliferacji węzła chłonnego oraz można wykorzystać mniejszą liczbę zwierząt w grupie badanej. Zaleca się jedno lub dwa zwierzęta w grupie badanej. Wszystkie myszy będą obserwowane codziennie pod kątem jakichkolwiek klinicznych oznak toksyczności ogólnoustrojowej lub miejscowego podrażnienia skóry w miejscu zastosowania. Masy ciała są rejestrowane przed badaniem i przed jego zakończeniem (dzień 6.). Obydwoje uszu każdej myszy bada się pod kątem wystąpienia rumienia i ocenia przy wykorzystaniu tabeli 1 (25). Pomiary grubości ucha są przeprowadzane przy wykorzystaniu grubościomierza (np. cyfrowych mikrometrów lub grubościomierzem Peacock Dial) w dniu 1. (przed podaniem substancji), w dniu 3. (około 48 godzin następujących po podaniu pierwszej dawki) oraz w dniu 6. Ponadto w dniu 6. grubość ucha można określić za pomocą kolczykownicy do pomiaru masy, co powinno być przeprowadzone po uśmierceniu zwierząt w humanitarny sposób. Nadmierne miejscowe podrażnienie skóry jest sygnalizowane wystąpieniem rumienia o wyniku ≥ 3 i/lub zwiększeniem grubości ucha ≥ 25 % w dniu pomiaru (26) (27). Najwyższa dawka wybrana do głównego badania LLNA to następna niższa dawka w szeregu stężeń badania wstępnego (zob. pkt 18), która nie wywołuje ogólnoustrojowej toksyczności i/lub nadmiernego miejscowego podrażnienia skóry.
Tabela 1
Ocena punktowa rumienia
| Objawy | Wynik |
| Brak rumienia | 0 |
| Bardzo lekki rumień (prawie niewidoczny) | |
| Wyraźny rumień | 2 |
| Rumień umiarkowany do mocnego | |
| Mocny rumień (czerwień przypominająca barwę mięsa czerwonego) do form obrzęku wykluczających klasyfikację rumienia | 4 |
23. Oprócz 25 % zwiększenia grubości ucha (26) (27), do zidentyfikowania substancji drażniących w metodzie LLNA wykorzystywano też statystycznie istotne zwiększenie grubości ucha u myszy badanych w porównaniu z myszami kontrolnymi (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). O ile jednak statystycznie znaczące zwiększenie może wystąpić przy grubości ucha mniejszej niż 25 %, to nie udało się go powiązać z nadmiernym podrażnieniem (30) (32) (33) (34).
24. Następujące obserwacje kliniczne mogą wskazywać na toksyczność ogólnoustrojową (35) (36), jeśli są wykorzystywane jako część zintegrowanej oceny i w związku z tym mogą określać maksymalne dawki do stosowania w LLNA: zmiany w funkcjach układu nerwowego (np. piloerekcja, ataksja, drżenia oraz konwulsje); zmiany w zachowaniu (na przykład agresja, zmiany w czyszczeniu, wyraźna zmiana w poziomie aktywności); zmiany w sposobie oddychania (np. zmiany w częstotliwości i intensywności oddychania, takie jak duszność, dyszenie oraz rzężenie), a także zmiany w konsumpcji żywności i wody. Ponadto w ocenie należy wziąć pod uwagę oznaki stanów zwiększonej senności i/lub brak reakcji oraz wszelkie objawy kliniczne sygnalizujące coś więcej niż niewielki lub chwilowy ból i cierpienie, lub > 5 % spadek masy ciała od dnia 1. do dnia 6. czy śmiertelność. Zwierzęta konające oraz zwierzęta wykazujące oczywiste oznaki bólu czy oznaki ostrego i przewlekłego strachu powinny zostać uśmiercone w sposób humanitarny (37).
Harmonogram doświadczalny głównego badania
25. Harmonogram doświadczalny badania jest następujący:
- Dzień 1: Indywidualnie określić i odnotować wagę każdego zwierzęcia oraz wszelkie obserwacje kliniczne. Stosuje się 25 μl właściwego roztworu lub samego nośnika, lub kontroli pozytywnej (równoległej lub najnowszej, na podstawie polityki laboratoryjnej, bierze się pod uwagę pkt 11-15), na część grzbietową każdego ucha.
- Dzień 2 i 3: Powtórzyć procedurę stosowania przeprowadzoną w dniu 1.
- Dzień 4 i 5: Bez podawania.
- Dzień 6: Zanotować masę każdego zwierzęcia. Podać w iniekcji 250 μl sterylnego roztworu chlorku sodu buforowanego fosforanami (PBS) zawierającego 20 μCi (7,4 × 105 Bq) (3H) -metylotymidyny znakowanej trytem wszystkim zwierzętom badanym i kontrolnym przez żyłę ogonową. Alternatywnie podać w iniekcji 250 μl sterylnego PBS zawierającego 2 μCi (7,4 × 104 Bq) 125I-jododezoksyuridiny i 10-5M fluorodezoksyuridiny wszystkim myszom przez żyłę ogonową. Pięć godzin (5 h) później uśmiercić w sposób humanitarny zwierzęta. Wyciąć uszne węzły chłonne z każdego ucha myszy i przetwarzać razem w PBS dla każdego zwierzęcia (traktowanie w ujęciu osobniczym); alternatywnie wyciąć i zebrać węzły chłonne z każdego ucha w PBS z każdej grupy badanej (traktowanie zbiorcze w ujęciu grupowym). Informacje i schematy identyfikacji i rozbioru węzła chłonnego można znaleźć w pozycji (12). Do celów dalszego monitorowania miejscowych reakcji skóry w badaniu głównym, w protokole badania można uwzględnić dodatkowe parametry, takie jak punktacja rumienia ucha lub pomiar grubości ucha (zrobiony za pomocą grubościomierza lub za pomocą kolczykownicy do pomiaru masy w czasie sekcji).
Przygotowanie zawiesiny komórek
26. Zostaje przygotowana jedna wspólna porcja zawiesiny z komórek węzła chłonnego (LNC) usuniętych obustronnie u pojedynczych zwierząt albo z połączonych grup badanych przez delikatne mechaniczne rozdzielenie agregatów na siateczce ze stali nierdzewnej o oczkach wielkości 200 μm lub za pomocą innych możliwych do przyjęcia technik służących tworzeniu jednokomórkowych zawiesin. Komórki węzłów chłonnych są przemywane dwukrotnie pozostałym PBS, a DNA jest strącane 5 % kwasem trichlorooctowym (TCA) w 4 oC przez 18 godzin (3). Peletki są albo zawieszane ponownie w 1 mL TCA i przenoszone do fiolek scyntylacyjnych zawierających 10 mL płynu scyntylacyjnego do policzenia 3H, lub też przenoszone bezpośrednio do fiolek do liczenia impulsów gamma, w celu liczenia impulsów 125I.
Określenie proliferacji komórek (wbudowanie związku promieniotwórczego)
27. Wbudowanie 3H-metylotymidyny mierzone jest przez liczenie impulsów βscyntylacji jako liczba rozpadów na minutę (DPM). Wbudowywanie 125I-jododezoksyuridiny mierzone jest jako impulsy 125I i również wyrażane jako DPM. W zależności od zastosowanego podejścia, wbudowanie wyrażane jest jako DPM/mysz (ujęcie osobnicze) lub DPM/grupa badana (ujęcie zbiorcze).
Ograniczone podejście LLNA
28. W pewnych sytuacjach, jeśli zachodzi potrzeba regulacyjna, aby potwierdzić negatywne oczekiwania co do potencjału działania uczulającego na skórę, można zastosować fakultatywny protokół rLLNA (16) (17) (18) z wykorzystaniem mniejszej liczby zwierząt, pod warunkiem że są przestrzegane wszystkie inne specyfikacje protokołu LLNA w tej TM. Przed zastosowaniem podejścia rLLNA należy przedstawić jasne uzasadnienie i naukowe przesłanki uzasadniające jego stosowanie. Jeżeli uzyskuje się wynik pozytywny lub niejednoznaczny, mogą się okazać konieczne dodatkowe badania w celu interpretacji lub wyjaśnienia nieprawidłowości.
29. Zmniejszenie liczby grup badanych jest jedyną różnicą między protokołami badania metod LLNA i rLLNA i z tego powodu rLLNA nie dostarcza informacji na temat relacji między dawką a reakcją. Dlatego też rLLNA nie należy stosować w przypadku, gdy potrzebne są informacje na temat relacji między dawką a reakcją. Podobnie jak w wielodawkowym LLNA, stężeniem substancji badanej ocenianym w rLLNA powinno być maksymalne stężenie, które nie wywołuje widocznej ogólnoustrojowej toksyczności i/lub nadmiernego miejscowego podrażnienia skóry u myszy (zob. pkt 18).
OBSERWACJE
Obserwacje kliniczne
30. Zwierzęta poddaje się starannej obserwacji klinicznej raz dziennie pod kątem jakichkolwiek oznak klinicznych, czy to miejscowego podrażnienia w miejscu zastosowania czy też ogólnoustrojowej toksyczności. Wszystkie obserwacje kliniczne są systematycznie odnotowywane w postaci zapisów prowadzonych dla każdej myszy. Plany monitorowania powinny obejmować kryteria umożliwiające szybką identyfikację tych myszy, które wykazują oznaki toksyczności ogólnoustrojowej, nadmiernego miejscowego podrażnienia skóry lub żrącego działania na skórę, w celu eutanazji (37).
Masy ciała
31. Jak wskazano w pkt 25, indywidualne masy ciała określane są na początku badania i przy planowanym humanitarnym uśmierceniu zwierząt.
OBLICZANIE WYNIKÓW
32. Wyniki dla każdej grupy badanej są wyrażane jako SI. Jeżeli zastosowano ujęcie osobnicze, SI otrzymuje się przez podzielenie średniej wartości DPM/mysz w obrębie każdej grupy dawkowania badanej substancji i grupy pozytywnej kontroli przez średnią wartość DPM/zwierzę dla grupy kontrolnej rozpuszczalnika/nośnika. Średnie SI dla grup VC wynosi zatem jeden. Przy zastosowaniu ujęcia zbiorczego, SI otrzymuje się przez podzielenie zbiorczego wbudowania związku promieniotwórczego dla każdej grupy badanej przez wbudowanie w zbiorczej próbie grupy VC; to daje średnie SI.
33. W procesie decyzyjnym wynik uznawany jest za pozytywny, jeśli SI ≥ 3. Jednakże siła reakcji na dawkę, znaczenie statystyczne i spójność reakcji rozpuszczalnik/nośnik i PC mogą również być stosowane przy ustalaniu, czy wynik graniczny można uznać za pozytywny (4) (5) (6).
34. Jeżeli zachodzi potrzeba objaśnienia otrzymanych wyników, należy rozważyć różne własności badanej substancji, w tym rozważyć, czy jest strukturalnie pokrewna znanym czynnikom uczulającym, czy powoduje nadmierne podrażnienie skóry u myszy, a także rozważyć charakter zaobserwowanej relacji dawka-reakcja. Te i inne względy omówione są szczegółowo gdzie indziej (7).
35. Gromadzenie danych dotyczących radioaktywności na poziomie poszczególnych myszy umożliwi analizę statystyczną danych w odniesieniu do obecności i relacji dawka-reakcja. Ocena statystyczna może obejmować ocenę relacji między dawką a reakcją, jak również odpowiednio dostosowane porównania badanych grup (np. grupa badana w parach w porównaniu do równoległej grupy kontrolnej otrzymującej nośnik). Analizy statystyczne mogą obejmować np. regresję liniową lub badanie Williamsa w celu dokonania oceny tendencji w relacji między dawką a reakcją oraz badanie Dunnetta w odniesieniu do porównań par. Przy wyborze właściwej metody analizy statystycznej danych prowadzący badanie powinien zachować świadomość możliwej nierówności wariancji lub innych powiązanych problemów, które mogą spowodować konieczność transformacji danych lub przeprowadzenia nieparametrycznej analizy statystycznej. W każdym przypadku prowadzący badanie musi liczyć się z koniecznością przeprowadzenia obliczeń SI i analiz statystycznych z wykorzystaniem pewnych punktów danych i bez nich (tzw. "wartości odstające").
DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
Dane
36. Dane należy przedstawić w formie tabeli. Przy wykorzystaniu podejścia w ujęciu osobniczym należy przedstawić wartości DMP dla poszczególnych zwierząt, średnią wartość DPM/zwierzę w danej grupie, związana wartość błędu (np. SD, SEM), oraz średnie SI dla każdej grupy badanej porównywane z równoległą grupą VC. Przy wykorzystaniu ujęcia zbiorczego należy wskazać średnią/medianę DPM i średnie SI dla każdej grupy badanej porównane z równoległą grupą VC.
Sprawozdanie z badań
37. Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje: Substancje: badana i kontrolna:
- dane identyfikacyjne (np. numery CAS lub WE, jeśli są dostępne); źródło: czystość; znane zanieczyszczenia; numer partii),
- cechy fizyczne i własności fizykochemiczne (np. lotność, stabilność, rozpuszczalność),
- jeżeli jest to mieszanina, skład i względne udziały procentowe składników.
Rozpuszczalnik/nośnik:
- dane identyfikacyjne (czystość; stężenie, tam gdzie stosowne; wykorzystane objętości),
- uzasadnienie wyboru nośnika.
Zwierzęta badane:
- źródło, z którego pochodzą myszy szczepu CBA,
- status mikrobiologiczny zwierząt, jeśli jest znany,
- liczba i wiek zwierząt,
- źródło pochodzenia zwierząt, warunki środowiska, pokarm itp.
Warunki badania:
- szczegóły przygotowania i stosowania substancji badanej,
- uzasadnienie doboru dawek (łącznie z wynikami z badania wstępnego, jeśli było przeprowadzane),
- nośnik i użyte stężenia substancji testowej oraz całkowita ilość zastosowanej substancji badanej,
- szczegóły dotyczące jakości pożywienia i wody (włączając w to rodzaj/źródło diety, źródło wody),
- szczegóły dotyczące poddania działaniu substancji oraz harmonogramów pobierania próbek,
- metody pomiaru toksyczności,
- kryteria uznawania badań za pozytywne lub negatywne,
- szczegóły dotyczące protokołu odchyleń i wyjaśnienie, w jaki sposób odchylenie ma wpływ na planowanie badań i ich wynik.
Sprawdzenie wiarygodności:
- podsumowanie wyników ostatniego sprawdzenia wiarygodności, w tym informacji o wykorzystanej substancji badanej, stężeniach i nośniku,
- równoległe i/lub wcześniejsze pozytywne i negatywne dane kontroli laboratorium prowadzącego badanie,
- jeżeli nie włączono równoległej grupy PC, data i sprawozdanie laboratoryjne z ostatniego okresowego PC i sprawozdanie wyszczególniające wcześniejsze dane dotyczące PC dla danego laboratorium, uzasadniające przyczyny dla których nie przeprowadzono PC równolegle.
Wyniki:
- masa poszczególnych myszy na początku dawkowania i przy planowanym uśmierceniu; jak również średnia i opis powiązanego błędu (np. SD, SEM) w odniesieniu do każdej grupy badanej,
- przebieg czasowy pojawienia się i oznaki toksyczności, w tym podrażnień skóry w miejscu podania, jeśli takie wystąpiły, u każdego zwierzęcia,
- tabelę indywidualnych (podejście w ujęciu osobniczym) lub średnich/mediana (ujęcie zbiorcze) wartości DPM oraz SI dla każdej grupy badanej,
- średnią oraz opis powiązanego błędu (np. SD, SEM) dla wartości DPM/mysz dla każdej grupy badanej i wyniki analizy wartości odstających dla każdej grupy badanej przy zastosowaniu podejścia osobniczego,
- obliczone SI i odpowiednią miarę zmienności, uwzględniającą zmienność między zwierzętami w obu grupach: substancji badanej i kontrolnej przy użyciu podejścia osobniczego,
- relacja dawka-reakcja,
- analizy statystyczne, tam gdzie stosowne.
Omówienie wyników:
- krótki komentarz do wyników, analiza zależności reakcji od dawki oraz w stosownych przypadkach, analizy statystyczne, z wnioskiem czy substancja testowa powinna być uznana za czynnik uczulający skórę.
BIBLIOGRAFIA
(1) OECD (2002), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay. OECD Guideline for the Testing of Chemicals No 429, Paryż. Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(2) Kimber, I. and Basketter, D.A. (1992), The murine local lymph node assay; collaborative studies and new directions: A commentary, Food Chem. Toxicol., 30, 165-169.
(3) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes, E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications, Toxicol., 93, 1-31.
(4) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise, J. Toxicol. Environ. Health, 53, 563-79.
(5) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation, Food Chem. Toxicol., 34, 999-1002.
(6) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 34, 985-997.
(7) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests, Food Chem. Toxicol., 36, 327-33.
(8) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins, Toxicol., 146, 49-59.
(9) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 258-273.
(10) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34, 274-286.
(11) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process, Reg. Toxicol. Pharmacol, 34: 249-257.
(12) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostępny na stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]
(13) OECD (1992), Skin Sensitisation. OECD Guideline for Testing of Chemicals No 406, OECD, Paryż. Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(14) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO(2005)14, OECD, Paryż. Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(15) Dearman, R.J., Hilton, J., Evans, P., Harvey, P., Basketter, D.A. and Kimber, I. (1998), Temporal stability of local lymph node assay responses to hexyl cinnamic aldehyde, J. Appl. Toxicol., 18, 281-284.
(16) Kimber, I., Dearman, R.J., Betts, C.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Kern, P.S., Patlewicz, G.Y. and Basketter, D.A. (2006), The local lymph node assay and skin sensitisation: a cut-down screen to reduce animal requirements? Contact Dermatitis, 54, 181-185.
(17) ESAC (2007), Statement on the Reduced Local Lymph Node Assay (rLLNA), European Commission Directorate General, Joint Research Centre, Institute for Health and Consumer Protection, European Centre for the Validation of Alternative Methods, Kwiecień 2007. Dostępny na stronie: [http://ecvam.jrc.it/ft_doc/ESAC26_statement_rLLNA_20070525-1.pdf]
(18) ICCVAM (2009), The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) Test Method Evaluation Report. The Reduced Murine Local Lymph Node Assay: An Alternative Test Method Using Fewer Animals to Assess the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals and Products, NIH Publication Number 09-6439, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostępny na stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
(19) ICCVAM (1999), The Murine Local Lymph Node Assay: A Test Method for Assessing the Allergic Contact Dermatitis Potential of Chemicals/Compounds, The Results of an Independent Peer Review Evaluation Coordi-nated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM), NIH Publication No. 99-4494, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostępny na stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
(20) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT), Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.
(21) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrilo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH, Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96.
(22) ICCVAM (2009), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Assessment of the Validity of the LLNA for Testing Pesticide Formulations and Other Products, Metals, and Substances in Aqueous Solutions, NIH Publication Number 10-7512, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, dostępne na stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/]
(23) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
(24) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH, Toxicol., 238, 71-89.
(25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 404, Paryż, France. Dostępny na stronie: http://www.oecd.org/document/40/0,3343,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances, Toxicologist, 96, 235.
(27) ICCVAM (2009), Non-radioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostępny na stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf]
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodii-mide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice, Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions, Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals, Toxicol. Meth., 8, 245-256.
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods, Drug. Chem. Toxicol., 22, 491-506.
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68.
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract, Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.
(35) OECD (1987), Acute Dermal Toxicity, OECD Guideline for Testing of Chemicals No 402, Paryż, France. Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(36) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences, Available at: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]
(37) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph, Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paryż. Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
Dodatek 1
Normy efektywności do celów oceny proponowanych podobnych do LLNA lub zmodyfikowanych metodbadania działania uczulającego na skórę
WSTĘP
1. Normy efektywności służą przede wszystkim ustaleniu, w jaki sposób określić, czy nowe metody badań, zarówno zastrzeżone (tj. chronione prawem autorskim czy znakiem towarowym, zarejestrowane), jak i niezastrzeżone, są wystarczająco dokładne i wiarygodne w odniesieniu do konkretnych celów badawczych. Te normy efektywności, opracowane na podstawie zatwierdzonych i zaakceptowanych metod badawczych, mogą być wykorzystane do oceny wiarygodności i dokładności innych podobnych metod (nazywanych potocznie metodami "metoo"), które opierają się na podobnych zasadach naukowych i mierzą lub przewidują te same skutki biologiczne lub toksyczne (14).
2. Przed przyjęciem zmodyfikowanych metod (tj. proponowanych ewentualnych usprawnień do zatwierdzonej metody badań) należy dokonać oceny w celu określenia wpływu proponowanych zmian na działanie badania oraz zakres, w jakim zmiany takie mają wpływ na informacje dostępne dla innych elementów procesu zatwierdzania. W zależności od liczby i charakteru proponowanych zmian, wygenerowanych danych i towarzyszącej tym zmianom dokumentacji, powinny one być poddawane takiemu samemu procesowi walidacji, jak opisano w odniesieniu do nowego badania, lub, w stosownych przypadkach, ograniczonej ocenie wiarygodności i istotności przy użyciu sprawdzonej normy efektywności (14).
3. Podobne lub zmodyfikowane metody zaproponowane w ramach tej TM należy poddać ocenie w celu określenia ich wiarygodności i dokładności przy użyciu substancji chemicznych reprezentujących pełne spektrum ocen LLNA. W celu uniknięcia nieuzasadnionego wykorzystywania zwierząt zaleca się, aby naukowcy opracowujący modele zasięgnęli opinii właściwych władz przed rozpoczęciem badania walidacyjnego zgodnie z normami efektywności i wytycznymi zamieszczonymi w niniejszej TM.
4. Niniejsze normy efektywności opierają się na normach US-ICCVAM, EC-ECVAM oraz japońskiej zharmonizowanej normie efektywności JaCVAM (12), służących do oceny wiarygodności metod podobnych do LLNA lub zmodyfikowanych jej wersji. Norma efektywności składa się z zasadniczych elementów metody badania, zalecanych substancji odniesienia i norm dotyczących dokładności i wiarygodności, które proponowana metoda powinna spełniać lub przewyższać.
I. Istotne elementy metody badania
5. W celu zagwarantowania, że zmodyfikowana wersja metody LLNA lub metoda podobna do niej jest pod względem funkcjonalnym i mechanistycznym analogiczna do LLNA i mierzy ten sam biologiczny skutek, w protokole metody badania powinny zostać uwzględnione następujące elementy:
- substancja badana powinna być stosowana miejscowo na obu uszach myszy,
- proliferacja limfocytów powinna być mierzona w węzłach chłonnych odprowadzających z miejsca stosowania badanej substancji,
- proliferacja limfocytów powinna być mierzona w fazie indukcyjnej uczulenia skóry,
- wybraną dla badanej substancji najwyższą dawką powinno być maksymalne stężenie, które nie wywołuje ogólnoustrojowej toksyczności i/lub nadmiernego miejscowego podrażnienia skóry u myszy. Dla pozytywnej chemicznej substancji odniesienia, najwyższa dawka powinna być co najmniej tak duża, jak wartości LLNA EC3 odpowiednich chemicznych substancji odniesienia (zob. tabela 1) bez wywoływania ogólnoustrojowej toksyczności i/lub nadmiernego miejscowego podrażnienia skóry u myszy,
- powinna zostać włączona równoległa VC do każdego badania oraz, w stosownych przypadkach, powinny być również wykorzystane równoległe PC,
- w grupie badanej powinny być wykorzystane co najmniej cztery zwierzęta,
- można gromadzić indywidualne lub zbiorcze dane z badań na zwierzętach.
Jeżeli którekolwiek z tych kryteriów nie jest spełnione, wówczas dane normy efektywności nie mogą być wykorzystywane do zatwierdzania podobnych lub zmodyfikowanych metod.
II. Minimalny wykaz chemicznych substancji odniesienia
6. W normach US-ICCVAM, EC-ECVAM oraz japońskiej zharmonizowanej normie efektywności JaCVAM (12) zidentyfikowano 18 podstawowych chemicznych substancji odniesienia, które należy wykorzystywać, i cztery nieobowiązkowe chemiczne substancje odniesienia (tj. substancje, które w LLNA: DA dają fałszywie dodatnie lub fałszywie ujemne wyniki, jeśli porównać je do wyników badań na ludziach i na świnkach morskich (B.6 i wytyczna OECD nr 406 dotycząca badań) (13), i z tego względu umożliwiają wykazanie, że dana metoda działa równie dobrze jak LLNA lub ją przewyższa), które włączono do normy efektywności dotyczącej LLNA. W celu zidentyfikowania tych substancji chemicznych posłużono się następującymi kryteriami:
- wykaz chemicznych substancji odniesienia reprezentuje typy substancji zazwyczaj badane w odniesieniu do potencjalnego działania uczulającego na skórę i do zakresu reakcji, które LLNA jest w stanie mierzyć lub przewidywać,
- substancje mają ściśle określone chemiczne struktury,
- udostępniono dla każdej substancji dane LLNA z badań na świnkach morskich (tj. B.6; wytyczna OECD nr 406 dotycząca badań) (13) oraz, tam gdzie możliwe, dane z badań na ludziach, oraz
- substancje były łatwo dostępne z handlowego źródła.
Zalecane chemiczne substancje odniesienia przedstawiono w tabeli 1. Badania przy użyciu proponowanych chemicznych substancji odniesienia powinny być oceniane w nośniku, z którym są wymienione w tabeli 1. W sytuacjach, w których wymieniona w wykazie substancja nie jest dostępna, można stosować inne substancje spełniające kryteria doboru, z odpowiednim uzasadnieniem.
Tabela 1
Zalecane w normie efektywności LLNA chemiczne substancje odniesienia
| Numer | Substancje chemiczne(1) | Nr CAS | Forma | Nośnik(2) | EC3 %(3) | N(4) | 0,5x - 2,0x EC3 | Rzeczywisty zakres EC3 | LLNA w porównaniu z badaniami na świnkach morskich | LLNA w porównaniu z badaniami na ludziach |
| 1 | 5-chloro-2-metylo-4-izotiazolino-3-on (CMI)/2-metylo-4-izotiazolino-3-on (MI)(5) | 26172-55-4/2682-20-4 | Ciecz | DMF | 0,009 | 1 | 0,0045-0,018 | NC | +/+ | +/+ |
| 2 | DNCB | 97-00-7 | Stała | AOO | 0,049 | 15 | 0,025-0,099 | 0,02-0,094 | +/+ | +/+ |
| 3 | 4-fenylenodiamina | 106-50-3 | Stała | AOO | 0,11 | 6 | 0,055-0,22 | 0,07-0,16 | +/+ | +/+ |
| 4 | Chlorek kobaltu | 7646-79-9 | Stała | DMSO | 0,6 | 2 | 0,3-1,2 | 0,4-0,8 | +/+ | +/+ |
| 5 | Izoeugenol | 97-54-1 | Ciecz | AOO | 1,5 | 47 | 0,77-3,1 | 0,5-3,3 | +/+ | +/+ |
| 6 | 2-merkaptobenzotiazol | 149-30-4 | Stała | DMF | 1,7 | 1 | 0,85-3,4 | NC | +/+ | +/+ |
| 7 | Cytral | 5392-40-5 | Ciecz | AOO | 9,2 | 6 | 4,6-18,3 | 5,1-13 | +/+ | +/+ |
| 8 | HCA | 101-86-0 | Ciecz | AOO | 9,7 | 21 | 4,8-19,5 | 4,4-14,7 | +/+ | +/+ |
| 9 | Eugenol | 97-53-0 | Ciecz | AOO | 10,1 | 11 | 5,05-20,2 | 4,9-15 | +/+ | +/+ |
| 10 | Benzoesan fenylu | 93-99-2 | Stała | AOO | 13,6 | 3 | 6,8-27,2 | 1,2-20 | +/+ | +/+ |
| 11 | Alkohol cynamonowy | 104-54-1 | Stała | AOO | 21 | 1 | 10,5-42 | NC | +/+ | +/+ |
| 12 | Imidazolidynylomocznik | 39236-46-9 | Stała | DMF | 24 | 1 | 12-48 | NC | +/+ | +/+ |
| 13 | Metakrylan metylu | 80-62-6 | Ciecz | AOO | 90 | 1 | 45-100 | NC | +/+ | +/+ |
| 14 | Chlorobenzen | 108-90-7 | Ciecz | AOO | 25 | 1 | NA | NA | -/- | -/(*) |
| 15 | Alkohol izopropylowy | 67-63-0 | Ciecz | AOO | 50 | 1 | NA | NA | -/- | -/+ |
| 16 | Kwas mlekowy | 50-21-5 | Ciecz | DMSO | 25 | 1 | NA | NA | -/- | -/ (*) |
| 17 | Salicylan metylu | 119-36-8 | Ciecz | AOO | 20 | 9 | NA | NA | -/- | -/- |
| 18 | Kwas salicylowy | 69-72-7 | Stała | AOO | 25 | 1 | NA | NA | -/- | -/- |
| Nieobowiązkowe substancje, które mają wykazać poprawę wyników w odniesieniu do LLNA |
| 19 | Sól sodowa siarczanu dodecylu | 151-21-3 | Stała | DMF | 8,1 | 5 | 4,05-16,2 | 1,5-17,1 | +/- | +/- |
| 20 | Dimetakrylan glikolu etylenowego | 97-90-5 | Ciecz | MEK | 28 | 1 | 14-56 | NC | +/- | +/+ |
| 21 | Ksylen | 1330-20-7 | Ciecz | AOO | 95,8 | 1 | 47,9-100 | NC | +/(**) | +/- |
| 22 | Chlorek niklu | 7718-54-9 | Stała | DMSO | 5 | 2 | NA | NA | -/+ | -/+ |
| Skróty: AOO = aceton: oliwa z oliwek (w proporcji objętościowej 4: 1 v/v); nr CAS = Numer w Chemical Abstracts Service = Serwisie Dokumentacji Chemicznej; DMF = N, N-dimetyloformamid; DMSO = sulfotlenek dimetylowy; DNCB = 2,4-chlorodinitrobenzen; EC 3 = szacowane stężenie konieczne do wyprodukowania wskaźnika stymulacji 3; GP = wynik testów na świnkach morskich (tj. B. 6 lub wytyczna OECD nr 406 dotycząca badań) (13); HCA = aldehyd cynamonowy heksylu; Liq = ciecz; LLNA = wynik badania lokalnych węzłów chłonnych na myszach (tj. B. 42 lub wytyczna OECD nr 429 dotycząca badań) (1); MEK = keton metyloetylowy; ND = nie dotyczy, ponieważ wskaźnik stymulacji < 3; NC = nieobliczone, ponieważ dane zostały uzyskane z jednego badania; SOL = stałe; veh = badany nośnik. (*) Przypuszcza się, że u ludzi nie wywołuje uczulenia ze względu na fakt, że nie stwierdzono oznak klinicznych testu skórnego, nie jest on uwzględniony w teście skórnym plasterkowym z zestawem alergenów, a także nie stwierdzono przypadków działania uczulającego na człowieka. (**) GP brak dostępnych danych. (1) Substancje należy przygotowywać codziennie, chyba że dane dotyczące stabilności wykazują dopuszczalność składowania. (2) Ze względu na potencjalny wpływ różnych nośników na efektywność LLNA należy zastosować zalecany dla każdej chemicznej substancji odniesienia nośnik (24) (32). (3) Wartość średnia, w przypadku gdy była dostępna więcej niż jedna wartość EC3. W odniesieniu do negatywnych substancji (tj. o wskaźniku stymulacji < 3) podano najwyższe badane stężenie. (4) Liczba badań LLNA, z których dane zostały uzyskane. (5) Dostępny w handlu jako Kathon CG (nr CAS 55965-84-9), mieszanina CMI I MI w proporcji 3:1. Odpowiednie stężenia dla każdego składnika wahają się między 1,1 % a 1.25 % (CMI) oraz 0,3 % a 0,45 % (MI). Składniki nieaktywne to: sole magnezu (od 21,5 % do 24 %) i azotan miedzi (od 0,15 % do 0,17 %), natomiast pozostała postać użytkowa to 74 % - 77 % wody. Kathon CG jest łatwo dostępny w firmach Sigma-Aldrich i Rohm and Haas (obecnie Dow Chemical Corporation). |
III. Zdefiniowane normy wiarygodności i dokładności
7. Dokładność podobnej lub zmodyfikowanej metody LLNA powinna być taka sama, jak określona w normie efektywności LLNA, ocenionej przy użyciu 18 podstawowych chemicznych substancji odniesienia, jakie powinny być stosowane, lub ją przewyższać. Zastosowanie nowej lub zmodyfikowanej metody powinno prowadzić do poprawnej klasyfikacji w oparciu o decyzję "tak/nie". Jednak nowa lub zmodyfikowana metoda może nie zaklasyfikować poprawnie wszystkich z podstawowych chemicznych substancji odniesienia, jakie powinny być stosowane. Jeżeli na przykład jeden z czynników słabo uczulających został nieprawidłowo zaklasyfikowany, uzasadnienie nieprawidłowej klasyfikacji i odpowiednie dodatkowe dane (np. wyniki testów, na podstawie których prawidłowo zaklasyfikowano inne substancje z fizycznymi, chemicznymi i uczulającymi właściwościami podobnymi do tych posiadanych przez nieprawidłowo zaklasyfikowaną chemiczną substancję odniesienia) mogłoby być uznane za świadczące o równoważnej efektywności. W takich okolicznościach status zatwierdzenia nowej lub zmodyfikowanej metody LLNA będzie oceniany na zasadzie jednostkowych przypadków.
Odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna
8. W celu określenia odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej nowa lub zmodyfikowana metoda LLNA powinna być oceniona przy wykorzystaniu substancji uczulającej, która jest dobrze scharakteryzowana w LLNA. Z tego względu normy efektywności LLNA opierają się na zmienności wyników z powtórzonych badań aldehydu cynamonowego heksylu (HCA). Aby ocenić wiarygodność wewnątrzlaboratoryjną, należy wyprowadzić oszacowane wartości progowe stężenia dla HCA cztery razy, w co najmniej jednotygodniowych odstępach czasu. Potwierdzeniem dopuszczalnej wewnątrzlaboratoryjnej odtwarzalności jest zdolność laboratorium do uzyskania, w każdym badaniu HCA, oszacowanych wartości progowych dla HCA między 5 % i 20 %, tj. o zakresie 0,5-2,0 razy średnia EC3 określona dla HCA (10 %) w LLNA (zob. tabela 1).
Odtwarzalność międzylaboratoryjna
9. Odtwarzalność międzylaboratoryjna nowej lub zmodyfikowanej metody LLNA powinna być oceniona przy użyciu dwóch substancji uczulających, które są dobrze scharakteryzowane w LLNA. Normy efektywności LLNA opierają się na zmienności wyników z badań HCA i 2,4-chlorodinitrobenzenu (DNCB) w różnych laboratoriach. Oszacowane wartości progowe stężenia powinny być ustalane niezależnie, w wyniku pojedynczego badania przeprowadzonego przynajmniej w trzech różnych laboratoriach. Aby wykazać dopuszczalną odtwarzalność międzylaboratoryjną, każde laboratorium powinno uzyskać oszacowane wartości progowe stężenia wielkości od 5 % do 20 % dla HCA i od 0,025 % do 0,1 % dla DNCB, tj. o zakresie 0,5-2,0 razy średnia EC3 stężeń określonych dla HCA (10 %) i DNCB (0,05 %), odpowiednio, w LLNA (zob. tabela 1).
Dodatek 2
Definicje
Dokładność: bliskość zgodności pomiędzy wynikami zastosowania metody badania a przyjętymi wartościami odniesienia. Jest to miara efektywności metody badania i jeden z aspektów jej istotności. Pojęcia tego często używa się zamiennie z pojęciem "zgodność" na oznaczenie odsetka prawidłowych wyników uzyskiwanych przy użyciu metody badania (14).
Substancja wzorcowa: uczulająca lub nieuczulająca substancja wykorzystywana jako norma dla celów porównania z substancją badaną. Substancja wzorcowa powinna mieć następujące cechy: (i) stałe i wiarygodne źródło(-a); (ii) podobieństwo strukturalne i funkcjonalne do badanej klasy substancji; (iii) znane właściwości fizykochemiczne; (iv) dane potwierdzające występowanie znanych skutków; oraz (v) znany potencjał w zakresie pożądanych reakcji.
Oszacowany próg stężenia (ECt): oszacowane stężenie substancji badanej, niezbędne do wyprodukowania wskaźnika stymulacji, który jest oznaką pozytywnej reakcji.
Oszacowane stężenie 3 (EC3): oszacowane stężenie substancji badanej, niezbędne do wyprodukowania wskaźnika stymulacji o wartości 3.
Fałszywy wynik negatywny: substancja badana w wyniku zastosowania metody badania oznaczona niewłaściwie jako negatywna lub nieaktywna, podczas gdy w rzeczywistości jest pozytywna lub aktywna.
Fałszywy wynik pozytywny: substancja badana w wyniku zastosowania metody badania oznaczona niewłaściwie jako pozytywna lub aktywna, podczas gdy w rzeczywistości jest negatywna lub nieaktywna.
Zagrożenie: możliwość wywierania negatywnego wpływu na zdrowie lub środowisko. Niekorzystny wpływ przejawia się tylko wtedy, gdy istnieje wystarczające narażenie.
Odtwarzalność międzylaboratoryjna: miernik zakresu, w jakim różne wykwalifikowane laboratoria, przy użyciu tego samego protokołu i testując tę samą badaną substancję, mogą przynieść jakościowo i ilościowo podobne wyniki. Odtwarzalność międzylaboratoryjna jest określana w procesach poprzedzających walidację i obejmujących walidację i wskazuje, w jakim stopniu badanie można z powodzeniem przekazywać między laboratoriami: nazywana jest również odtwarzalnością międzylaboratoryjną (14).
Odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna: ustalenie stopnia, w jakim wykwalifikowani pracownicy w tym samym laboratorium mogą z powodzeniem odtworzyć wyniki, stosując szczegółowy protokół w różnych momentach. Nazywana również odtwarzalnością laboratoryjną (14).
Badanie metoo: potoczne określenie metody badania, która jest strukturalnie i funkcjonalnie podobna do zwalidowanych i zaakceptowanych zgodnie z referencyjną metodą badania. Taka metoda badania kwalifikowałaby się do wykorzystania jako walidacja "doganiająca". Zamiennie wykorzystana z podobną metodą badania (14).
Wynik odstający: wynik odstający jest obserwacją, która znacznie różni się od innych wartości w losowej próbce z populacji.
Normy efektywności (PS): normy oparte na zwalidowanej metodzie badania, zapewniające podstawę do oceny porównywalności proponowanej metody badania, która jest podobna do metody referencyjnej pod względem mechanistycznym i funkcjonalnym. Uwzględnia się: (i) istotne elementy metody badania; (ii) podstawowy wykaz chemicznych substancji odniesienia, wybranych spośród substancji chemicznych wykorzystywanych w celu wykazania akceptowalnej efektywności zwalidowanej metody badania; oraz (iii) podobny poziom dokładności i wiarygodności, na podstawie wyników uzyskanych dla zatwierdzonej metody badania, który proponowana metoda badania powinna osiągnąć przy ocenie z wykorzystaniem minimalnego wykazu chemicznych substancji odniesienia (14).
Zastrzeżona metoda badawcza: metoda badania, której produkcja i dystrybucja jest ograniczona poprzez patenty, prawa autorskie, znaki towarowe itp.
Zapewnienie jakości: proces zarządzania, w którym przestrzeganie norm i wymogów w zakresie badań laboratoryjnych, oraz procedur dotyczących dokumentacji i dokładności przekazywania danych jest oceniane przez osoby niezależne od tych, które przeprowadzają badania.
Chemiczne substancje odniesienia: substancje chemiczne wybrane do wykorzystania w procesie walidacji, dla których reakcje w systemie badań referencyjnych in vitro, jak i in vivo lub odpowiednie dla badań gatunki są już znane. Te substancje powinny być reprezentatywne dla klas substancji chemicznych, w odniesieniu do których - zgodnie z oczekiwaniami - będzie stosowana dana metoda badawcza i powinny reprezentować pełny zakres reakcji, jakich można się spodziewać po substancjach chemicznych, w odniesieniu do których środek może być stosowany, od reakcji silnych przez słabe aż do negatywnych. Różne zestawy chemicznych substancji odniesienia mogą być wymagane na różnych etapach procesu zatwierdzania, a także w odniesieniu do różnych metod badawczych i zastosowań badania (14).
Istotność: opis powiązania badania z oczekiwanym skutkiem oraz czy jest ono znaczące i użyteczne dla konkretnego celu. Jest to zakres, w jakim badanie prawidłowo mierzy lub przewiduje biologiczny oczekiwany skutek. Istotność obejmuje uwzględnienie dokładności (zgodności) metody badania (14).
Wiarygodność: miernik zakresu, w jakim metoda badania może zostać wykonana w sposób odtwarzalny w jednym laboratorium i pomiędzy laboratoriami w dłuższym okresie czasu, w przypadku jej wykonywania przy użyciu tego samego protokołu. Ocenia się ją poprzez obliczenie odtwarzalności wewnątrz- i międzylaboratoryjnej (14).
Działanie uczulające na skórę: proces immunologiczny, do którego dochodzi w przypadku, gdy osobnik wrażliwy jest narażony miejscowo na wywołujący uczulenie chemiczny alergen, powodujący immunologiczną reakcję skórną, co może prowadzić do uczulania przez kontakt ze skórą.
Wskaźnik stymulacji (SI): wartość obliczona dla oceny potencjalnego działania uczulającego na skórę przez substancję badaną, który wyraża się stosunkiem proliferacji w grupach poddanych działaniu środka do proliferacji w równoległej grupie kontrolnej nośnika.
Substancja badana (określana także jako badana substancja chemiczna): każda substancja lub mieszanina, badana za pomocą niniejszej TM.
Zwalidowana metoda badania: metoda badania, w odniesieniu do której zakończono badania walidacyjne w celu określenia jej istotności (w tym dokładności) i wiarygodności w odniesieniu do konkretnego celu. Należy zauważyć, że zwalidowana metoda badania może nie wykazywać dostatecznej efektywności z punktu widzenia dokładności i wiarygodności, aby można było ją uznać za dopuszczalną w odniesieniu do danego celu (14).
B.43. BADANIE NEUROTOKSYCZNOŚCI U GRYZONI
1. METODA
Ta metoda badania jest odpowiednikiem TG 424 (1997).
Ta metoda badania została zaprojektowana w celu uzyskania danych potrzebnych do potwierdzenia lub bliższego scharakteryzowania potencjalnej neurotoksyczności związków chemicznych względem dorosłych zwierząt. Można ją albo łączyć z istniejącymi metodami testowania wielokrotnej dawki, albo wykorzystywać w odrębnym badaniu. W celu uzyskania pomocy w projektowaniu badań opartych na tej metodzie zaleca się zapoznanie się z dokumentem zawierającym wytyczne OECD dotyczące strategii i metod badania neurotoksyczności (1). Jest to szczególnie ważne, jeżeli rozważa się modyfikacje obserwacji i procedur badania zalecanych do rutynowego wykorzystania tej metody. Dokument zawierający wytyczne przygotowano w celu ułatwienia wyboru innych procedur testowych do wykorzystywania w konkretnych okolicznościach.
Ocena neurotoksyczności rozwojowej nie jest tematem omawianej metody.
1.1. WPROWADZENIE
W ocenie i ewaluacji charakterystyki toksycznej substancji chemicznych ważne jest rozparzenie potencjału wywoływania skutków neurotoksycznych. Już metoda testowania ogólnoustrojowej toksyczności dawki wielokrotnej zawiera obserwacje, które mogą być badaniami sortującymi pod kątem potencjalnej neurotoksyczności. Omawiana metoda testowa może być wykorzystana do zaprojektowania badania zmierzającego do uzyskania bliższej informacji lub potwierdzenia skutków neurotoksycznych obserwowanych w badaniach ogólnoustrojowej toksyczności dawki wielokrotnej. Jednakże rozpatrywanie potencjalnej neurotoksyczności pewnych klas związków chemicznych może wskazywać, że może być ona właściwiej oceniona za pomocą omawianej metody, bez wcześniejszego wskazania potencjalnej neurotoksyczności w badaniu ogólnoustrojowej toksyczności dawki wielokrotnej. Tego rodzaju ewentualne wskazania obejmują na przykład:
- obserwacje oznak neurologicznych lub zmian neuropatologicznych w badaniach innych niż badania ogólnoustrojowej toksyczności dawki wielokrotnej, lub
- strukturalna zależność lub inne informacje wiążące je ze znanymi substancjami neurotoksycznymi.
Ponadto mogą być jeszcze inne przypadki, kiedy wykorzystanie omawianej metody jest właściwe; w celu uzyskania dodatkowych szczegółów, zob. (1).
Ta metoda została opracowana w taki sposób, że można ją dostosować do konkretnych potrzeb potwierdzenia specyficznej neurotoksyczności histopatologicznej i behawioralnej związku chemicznego, jak również charakteryzowania i ilościowego określania reakcji neurotoksycznej.
W przeszłości utożsamiano neurotoksyczność z neuropatią obejmującą zmiany neuropatologiczne lub dysfunkcje neurologiczne, takie jak napady, paraliż lub drżenie. Chociaż neuropatia jest ważnym objawem klinicznym neurotoksyczności, w tej chwili wiadomo już, że jest wiele innych oznak toksyczności względem układu nerwowego (np. utrata koordynacji motorycznej, niedobory czucia, dysfunkcje uczenia się i pamięci), które mogą nie ujawniać się w badaniach neuropath i innych typach badań.
Omawiana metoda badania neurotoksyczności zaprojektowana została w celu wykrywania głównych skutków neurobehawioralnych i neuropatologicznych u dorosłych gryzoni. Chociaż skutki behawioralne, nawet przy braku zmian morfologicznych mogą odzwierciedlać niekorzystny wpływ na organizm, nie wszystkie zmiany behawioralne są specyficzne dla systemu nerwowego. A zatem wszelkie obserwowane zmiany należy interpretować w powiązaniu z korelacyjnymi danymi histopatologicznymi, hematologicznymi lub biochemicznymi jak również danymi dotyczącymi innych rodzajów toksyczności ogólnoustrojowej. Testowanie potrzebne w tej metodzie do scharakteryzowania i ilościowego określenia reakcji neurotoksycznych obejmuje specyficzne procedury histopatologiczne i behawioralne, które mogą być dalej potwierdzone przez badania elektrofizjologiczne i/lub biochemiczne (1)(2)(3)(4).
Czynniki neurotoksyczne mogą oddziaływać na wiele celów w obrębie układu nerwowego i to za pośrednictwem różnych mechanizmów. Ponieważ nie ma jednego zestawu testów, który potrafiłby dokładni ocenić potencjał neurotoksyczny wszelkich substancji, może być konieczne wykorzystywanie innych testów in vivo lub in vitro specyficznych względem obserwowanego lub przewidywanego rodzaju neurotoksyczności.
Niniejsza metoda badania może być również wykorzystana w połączeniu z wytycznymi podanymi w dokumencie OECD dotyczącym strategii i metod badania neurotoksyczności (1) do zaprojektowania badań zmierzających do bliższego scharakteryzowania lub zwiększenia czułości ilościowego określania reakcji na dawkę, albo lepszej oceny poziomu dawkowania, przy którym nie obserwuje się niekorzystnych skutków lub potwierdzenia znanych, lub podejrzewanych zagrożeń związanych z danym związkiem chemicznym. Na
przykład można zaprojektować badania zmierzające do zidentyfikowania i oceny mechanizmu(-ów) neurotoksycznych lub uzupełnienia danych dostępnych w ramach wykorzystania podstawowych procedur obserwacji neurobehawioralnych i neuropatologicznych. Badania takie nie muszą dublować danych, które można by uzyskać przez zastosowanie standardowych procedur zalecanych w niniejszej metodzie, jeżeli takie dane sąjuż dostępne albo nie zostały uznane za konieczne do interpretacji wyników tego badania.
Badanie neurotoksyczności, wykorzystywane odrębnie albo w połączeniu z innymi, dostarcza informacji, które mogą:
- stwierdzić, czy testowany związek chemiczny wpłynął na układ nerwowy w sposób trwały czy odwracalny,
- przyczynić się do scharakteryzowania zmian w układzie nerwowym związanych z ekspozycją na związek chemiczny, oraz do zrozumienia mechanizmu leżącego u podłoża jego oddziaływania,
- określić zależności reakcji od dawki i czasu, w celu ocenienia poziomu dawkowania, przy którym nie obserwuje się niekorzystnych skutków (który można wykorzystać do ustalenia kryteriów bezpieczeństwa w odniesieniu do danego związku chemicznego).
Omawiana metoda testowa wykorzystuje doustną drogę podawania testowanej substancji. Inne drogi podawania (np. naskórna lub wziewna) mogą być właściwsze i mogą wymagać modyfikacji zalecanych procedur. Wybór drogi podawania zależy od profilu narażenia ludzi oraz dostępnych informacji w zakresie toksykologii i kinetyki.
1.2. DEFINICJE
Niekorzystny skutek: jakakolwiek mająca związek z terapią zmiana w stosunku do danych bazowych, która zmniejsza zdolność organizmu do przeżycia, rozmnażania lub przystosowania się do środowiska.
Dawka: jest ilością podawanej substancji testowej. Dawka wyrażana jest w jednostkach wagowych (g, mg) lub jako waga substancji testowej na jednostkę masy badanego zwierzęcia (np. mg/Kg), lub jako stałe stężenie pożywienia (ppm).
Dawkowanie: jest terminem ogólnym obejmującym dawkę, częstotliwość i czas trwania dawkowania.
Neurotoksyczność: jest niekorzystną zmianą struktury lub funkcji układu nerwowego wynikającą z ekspozycji na czynnik chemiczny, biologiczny lub fizyczny.
Czynnik neurotoksyczny: to jakikolwiek czynnik chemiczny, biologiczny lub fizyczny o potencjale powodowania skutków neurotoksycznych.
NOAEL: jest skrótem oznaczającym poziom, przy którym nie obserwuje się niekorzystnych skutków i jest najwyższą dawką lub poziomem ekspozycji, przy zastosowaniu którego nie obserwuje się niekorzystnych wyników terapii.
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Testowany związek chemiczny podawany jest drogą doustną, w postaci pewnego zakresu dawek, kilku grupom gryzoni laboratoryjnych. Wymagane są zazwyczaj dawki wielokrotne, zaś reżim dawkowania może obejmować 28 dni, podchronicznej (90 dni) lub chronicznej toksyczności (1 rok lub dłużej). Procedury opisane w niniejszej metodzie badawczej mogą być również użyte w badaniu neurotoksyczności ostrej. Zwierzęta bada się w celu wykrycia lub scharakteryzowania behawioralnych i/lub neurologicznych nieprawidłowości. Zakres zachowań, na które czynniki neurotoksyczne mogą wpływać, oceniany jest w każdym okresie obserwacji. Na koniec badania podgrupę zwierząt każdej z płci poddaje się perfuzji in situ, a następnie preparuje i bada skrawki mózgu, rdzenia kręgowego i nerwów obwodowych.
Jeżeli badanie przeprowadza się jako odrębne badanie w celu sortowania pod kątem neurotoksyczności lub scharakteryzowania efektów neurotoksycznych, zwierzęta z każdej grupy, nieużyte do perfuzji i następczego badania histopatologicznego (zob. tabela 1), mogą zostać wykorzystane do konkretnych procedur neurobehawioralnych, neuropatologicznych i elektrofizjologicznych, które mogą uzupełnić dana otrzymane w standardowych badaniach wymaganych w niniejszej metodzie (1). Tego rodzaju dodatkowe procedury mogą być szczególnie użyteczne w przypadkach kiedy obserwacje empiryczne lub przewidywane skutki wskazują na jakiś szczególny rodzaj lub docelowy organ działania neurotoksycznego. Alternatywnie, pozostałe zwierzęta mogą zostać wykorzystane do ocen, jakich wymaga metoda badania toksyczności dawki wielokrotnej u gryzoni.
Jeżeli procedury powyższej metody badania łączone są z objętymi innymi metodami, należy użyć wystarczającej liczby zwierząt potrzebnej do osiągnięcia celów obu badań.
1.4. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.4.1. Wybór gatunków zwierząt
Szczur jest pożądanym gatunkiem zwierzęcia do badań, chociaż można użyć innego gatunku gryzonia, z podaniem uzasadnienia. Należy prowadzić badania na młodych dorosłych, zdrowych osobnikach powszechnie używanych szczepów laboratoryjnych. Samice powinny być nieciężarne i takie, które nie rodziły. Dawkowanie powinno się zazwyczaj zacząć najszybciej jak to możliwe po zakończeniu ssania, najlepiej nie później niż w wieku sześciu tygodni, w każdym razie zanim zwierzęta osiągną wiek dziewięciu tygodni. Jednakże jeżeli badanie łączone jest z innym badaniem, wymagania co do wieku mogą wymagać zmodyfikowania. Na początku badania zmienność ciężaru zwierząt powinna być minimalna i nie przekraczać ± 20 % średniego ciężaru dla każdej płci. Kiedy przeprowadza się krótkotrwałe badanie z zastosowaniem dawki wielokrotnej jako wstępne badanie do badania długoterminowego, w obu badaniach należy użyć zwierząt tego samego szczepu pochodzących z tego samego źródła.
1.4.2. Warunki przebywania i warunki żywieniowe
Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 22 oC (± 3 oC). Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50-60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Należy zminimalizować sporadyczne głośne hałasy. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej. Na wybór diety może mieć wpływ potrzeba zapewnienia odpowiedniej domieszki substancji testowanej przy podawaniu metodą powyższą. Zwierzęta mogą być trzymane pojedynczo lub umieszczane w klatkach w małych grupach o tej samej płci.
1.4.3. Przygotowanie zwierząt
Zdrowe, młode zwierzęta są losowo przydzielane do grup badanych i kontrolnych. Klatki powinny być ustawione w taki sposób, żeby zminimalizować możliwy wpływ położenia klatki. Zwierzęta są identyfikowane jednoznacznie i przetrzymywane w klatkach przez co najmniej pięć dni przed rozpoczęciem badania, żeby umożliwić aklimatyzację do warunków laboratoryjnych.
1.4.4. Droga podawania i przygotowanie dawek
Ta metoda dotyczy konkretnie podawania doustnego substancji testowej. Podawanie może odbywać się przez rurkę, w pożywieniu, wodzie pitnej lub w kapsułkach. Można użyć innych dróg podawania (np. naskórnej lub wziewnej), ale może to wymagać modyfikacji zalecanych procedur. Wybór drogi podawania zależy od profilu narażenia ludzi oraz dostępnych informacji w zakresie toksykologii i kinetyki. Należy wskazać racjonalne uzasadnienie wyboru drogi podawania, jak również wynikające z niego modyfikacje procedury tej metody testowej.
W przypadku gdy to konieczne, substancja testowana jest rozpuszczona lub ma postać zawiesiny w odpowiednim nośniku. Zaleca się, aby - jeżeli to możliwe - najpierw było rozważone użycie wodnego roztworu/zawiesiny, następnie roztworu/emulsji w oleju (np. olej kukurydziany), a potem możliwy roztwór w innym nośniku. Musi być znana charakterystyka toksyczna nośnika. Ponadto należy uwzględnić następujące charakterystyki nośnika lub innych domieszek: skutek wywierany na absorpcję, dystrybucję, metabolizm, oraz na zatrzymywanie lub ekskrecję substancji testowej; skutki wywierane na chemiczne własności substancji testowej, które mogą zmienić jej charakterystykę toksyczną; należy również uwzględnić wpływ na pobieranie pokarmu lub wody, lub stan odżywienia zwierząt.
1.5. PROCEDURY
1.5.1. Liczba i płeć zwierząt
Kiedy badanie prowadzone jest jako odrębne, do oceny szczegółowych obserwacji klinicznych należy użyć co najmniej 20 zwierząt (10 samców i 10 samic) w każdej z grup dawkowania i kontrolnej. Co najmniej pięć samców i pięć samic należy poddać perfuzji in situ i wykorzystać do szczegółowych badań neurohistopatologicznych na zakończenie badania. W przypadkach kiedy obserwacje kliniczne pod kątem oznak skutków neurotoksycznych prowadzone są tylko w odniesieniu do ograniczonej liczby zwierząt, należy rozważyć włączenie tych zwierząt do grupy wybranych do perfuzji. Jeżeli badanie prowadzone jest w połączeniu z badaniem toksyczności dawki wielokrotnej, należy użyć odpowiedniej liczby zwierząt potrzebnej do osiągnięcia celów obu badań. Minimalne liczby zwierząt dla różnych kombinacji badań podano w tabeli 1. Jeżeli planowane jest uśmiercanie w czasie trwania badania lub rozważa się prowadzenie grup zwierząt zdrowiejących w celu obserwacji odwracalności, utrzymywania się lub opóźnionych skutków toksycznych, lub rozważa się obserwacje uzupełniające, wtedy należy zwiększyć liczbę zwierząt aby zapewnić, że wystarczy ich do celów obserwacji i badań histopatologicznych.
1.5.2. Grupy badane i grupa kontrolna
Zasadniczo, powinny być wykorzystane co najmniej trzy grupy badane i grupa kontrolna, jednak jeżeli z oceny innych danych należałoby oczekiwać braku objawów przy dawce 1.000 mg/kg masy ciała/dzień, może być przeprowadzony test graniczny. Jeżeli nie są dostępne odpowiednie dane, może być wykonane badanie wyników zakresowych, pomagające w określeniu dawek, które mają być użyte. Z wyjątkiem zastosowania
substancji testowanej, ze zwierzętami grupy kontrolnej powinno się obchodzić w sposób identyczny, jak z podmiotami grupy badanej. Jeżeli przy podawaniu substancji testowanej jest stosowany nośnik, grupa kontrolna powinna otrzymać największą użytą objętość nośnika. Z wyjątkiem zastosowania substancji testowanej, ze zwierzętami grup kontrolnych powinno się obchodzić w sposób identyczny, jak ze zwierzętami grup badanych. Jeżeli przy podawaniu substancji testowanej jest stosowany nośnik, grupa kontrolna powinna otrzymać największą użytą objętość nośnika.
1.5.3. Sprawdzenie niezawodności
Laboratorium wykonujące badanie powinno przedstawić dane wykazujące jego zdolność do przeprowadzenia badania oraz czułość używanych metod. Dane te powinny udowadniać zdolność do wykrywania i ilościowego określania stosownych zmian w punktach końcowych zalecanych do obserwacji, takich jak objawy autonomiczne, reaktywność czuciowa, siła uchwytu i aktywność motoryczna. Informacje o związkach chemicznych, które powodują różne rodzaje reakcji neurotoksycznych i mogą zostać użyte jako substancje do kontroli pozytywnej można znaleźć w pozycjach bibliograficznych (2)-(9). Mogą zostać użyte wcześniej uzyskane dane jeżeli istotne aspekty procedury pozostają takie same. Zalecane jest okresowe uaktualnianie przeszłych danych. Należy uzyskać nowe dane wykazujące zachowaną czułość procedur w przypadku gdy jakiś istotny element w przebiegu badania lub procedurach został zmieniony przez laboratorium wykonujące.
1.5.4 Wybór dawki
Poziomy dawki powinny być wybierane poprzez wzięcie pod uwagę jakichkolwiek istniejących danych o toksyczności i danych kinetycznych osiągalnych dla substancji testowanej lub materiałów pokrewnych. Powinien zostać wybrany najwyższy poziom dawki, w celu wywołania skutków neurotoksycznych lub wyraźnych toksycznych skutków ogólnoustrojowych. Od tego czasu malejąca sekwencja poziomów dawki powinna być dobierana w taki sposób, aby wykazać wszelkie reakcje powiązane z dawkowaniem i brak obserwowanych objawów niekorzystnych przy najmniejszym poziomie dawki (NOAEL). W zasadzie poziomy dawek powinny być tak dobrane, aby pierwotne skutki działania toksycznego na układ nerwowy dały się odróżnić od skutków odnoszących się do toksyczności ogólnoustrojowej. Dwa do trzech interwałów są często optymalne dla ustalenia malejących poziomów dawki i dodanie czwartej grupy badanej jest często bardziej pożądane niż stosowanie bardzo dużych interwałów (np. współczynnik większy od 10) między dawkowaniem. Tam, gdzie dostępna jest racjonalna ocena ekspozycji ludzi, powinna być ona również wzięta pod uwagę.
1.5.5. Test graniczny
Jeżeli test przy jednym poziomie dawki równym co najmniej 1.000 mg/kg masy ciała/dzień, przy stosowaniu procedur opisanych dla tego badania, nie wywołuje widocznych objawów neurotoksycznych i jeżeli nie należałoby spodziewać się toksyczności na podstawie danych dotyczących substancji strukturalnie pokrewnych, wtedy pełne badanie przy użyciu trzech poziomów dawki może nie być konieczne. Ten test graniczny stosuje się z wyjątkiem przypadków, w których ekspozycja ludzi może wskazać na konieczność zastosowania w teście granicznym wyższego poziomu dawki doustnej. W odniesieniu do innych dróg podawania, na przykład wziewnej lub stosowania na skórę, własności fizyczne substancji testowanej mogą często wyznaczać najwyższy możliwy do osiągnięcia poziom ekspozycji. Dawka testu granicznego do przeprowadzenia badania doustnej toksyczności ostrej powinna wynosić co najmniej 2.000 mg/kg.
1.5.6. Podawanie dawek
Zwierzętom podaje się dawki substancji testowej raz dziennie, przez siedem dni w tygodniu, przez okres co najmniej 28 dni; stosowanie podawania przez pięć dni lub przez krótszy okres ekspozycji wymaga uzasadnienia. Kiedy substancja testowana podawana jest wprost do żołądka, powinna być podawana w jednorazowej dawce przy użyciu rurki lub odpowiedniej kaniuli dotchawicznej. Maksymalna objętość cieczy, która może być podana jednorazowo, zależy od wielkości badanych zwierząt. Objętość ta nie powinna przekraczać 1 ml/100 g masy ciała; jednakże w przypadku roztworów wodnych można rozważyć użycie do 2 ml/100 g masy ciała. Poza substancjami drażniącymi i korozyjnymi, które normalnie ujawniają zaostrzone objawy przy wyższych stężeniach, zmienność objętości w teście powinna być zminimalizowana przez dostosowanie stężenia, tak aby zapewnić stałą objętość dla wszystkich poziomów dawki.
W przypadku substancji podawanych w pożywieniu lub wodzie pitnej ważne jest zapewnienie, aby wymagane ilości substancji testowanej nie kolidowały z prawidłową równowagą odżywiania lub wody. W przypadku gdy substancja testowana jest podawana w pożywieniu, może być stosowane stałe stężenie żywieniowe (ppm) albo stały poziom dawki w odniesieniu do masy ciała zwierząt; użyta opcja musi być wyszczególniona. W przypadku substancji podawanej bezpośrednio do żołądka dawka powinna być podawana każdego dnia o podobnym czasie, i w razie konieczności modyfikowana, żeby utrzymać stały poziom dawki w odniesieniu do masy ciała zwierzęcia. W przypadku gdy badanie wielokrotnej dawki jest przeprowadzane jako badanie wstępne do badania długoterminowego, w obu badaniach powinna być stosowana podobna dieta. W badaniach toksyczności ostrej, jeżeli pojedyncza dawka nie jest możliwa, może ona być podawana w mniejszych częściach przez okres nieprzekraczający 24 godzin.
1.6. OBSERWACJE
1.6.1. Częstotliwość obserwacji i badań
W badaniach dawki wielokrotnej okres obserwacji obejmuje okres dawkowania, w badaniach toksyczności ostrej, należy przestrzegać 14-dniowego okresu poobserwacyjnego. U zwierząt w grupie satelitarnej, którą trzyma się bez ekspozycji w okresie po terapii, obserwacje powinny objąć również i ten okres.
Obserwacje należy prowadzić z wystarczającą częstotliwością by zmaksymalizować prawdopodobieństwo wykrycia nieprawidłowości w zachowaniu i/lub nieprawidłowości neurologicznych. Obserwacje powinny być przeprowadzane najlepiej każdego dnia o tej samej porze, biorąc pod uwagę szczytowy okres przewidywanych objawów po dawkowaniu. Częstotliwość obserwacji klinicznych i funkcjonalnych zestawiono w tabeli 2. Jeżeli dane kinetyczne, lub inne dane pochodzące z poprzednich badań wskazują na potrzebę wyznaczenia innych punktów czasowych, badań lub okresów poobserwacyjnych, w celu otrzymania jak największej ilości informacji, można przyjąć odmienny harmonogram. Należy przedstawić racjonalne powody zmian w harmonogramie.
1.6.1.1. Obserwacje ogólnego stanu zdrowia oraz zachorowalności/śmiertelności
Należy uważnie obserwować wszystkie zwierzęta, co najmniej raz dziennie, pod kątem ogólnego stanu zdrowia, jak również co najmniej dwa razy dziennie, pod kątem zachorowalności i śmiertelności.
1.6.1.2. Szczegółowe obserwacje kliniczne
Należy prowadzić szczegółowe obserwacje kliniczne wszystkich zwierząt wybranych do tego celu (zob. tabela 1), jeden raz przed pierwszą ekspozycją (aby uwzględnić porównanie w obrębie podmiotów), i od tego czasu w różnych odstępach czasu, w zależności od czasu trwania badania (zob. tabela 2). Szczegółowe obserwacje kliniczne w satelitarnych grupach zdrowiejących zwierząt powinny zostać przeprowadzone pod koniec okresu zdrowienia. Szczegółowe obserwacje kliniczne powinny być przeprowadzane na zewnątrz klatki macierzystej na znormalizowanej powierzchni. Powinny być one dokładnie odnotowywane przy użyciu systemów punktowania zawierających kryteria lub skale punktowe dla każdego pomiaru w obserwacjach. Kryteria zastosowanych skal powinny być wyraźnie zdefiniowane przez laboratorium testujące. Należy podjąć wysiłki, aby zagwarantować, że zmiany warunków badania są minimalne (niepowiązane systematycznie z terapią) oraz że obserwacje są przeprowadzane najlepiej przez obserwatorów nieświadomych rzeczywiście zastosowanej terapii.
Zaleca się prowadzenie obserwacji w sposób ustrukturalizowany, w którym dokładnie zdefiniowane kryteria (w tym definicja normalnego "zakresu") stosowane są systematycznie do każdego zwierzęcia w każdym okresie obserwacji. Należy dostatecznie udokumentować "normalny zakres". Wszelkie zaobserwowane objawy powinny być odnotowywane. Gdzie to możliwe, należy również odnotować wielkość obserwowanych objawów. Obserwacje kliniczne powinny obejmować, ale nie powinny być do nich ograniczone, zmiany w skórze, futrze, oczach, błonach śluzowych, wystąpienie wydzielin i wydalin oraz aktywność wegetatywną (np. łzawienie, podniesienie sierści, rozmiar źrenicy, niezwykła forma oddychania i/lub oddychanie przez jamę ustną, wszelkie niezwykłe oznaki oddawania moczu lub defekacji oraz odbarwiony mocz).
Należy również odnotowywać wszelkie niezwykłe reakcje w odniesieniu do postawy, poziomu aktywności (np. podwyższenie lub obniżenie poziomu eksploracji znormalizowanej powierzchni) i koordynacji ruchowej. Należy także odnotowywać zmiany w sposobie chodzenia (np. chód kaczkowaty, ataksja), postawie (np. wygięty grzbiet), i reakcji na dotyk, przenoszenie i inne bodźce ze środowiska, jak również obecność ruchów drgawkowych lub kurczowych, konwulsji lub drżenia, stereotypy (np. nadmierne czyszczenie się, niezwykłe ruchy głową, powtarzające się krążenie w kółko), lub dziwne zachowania (np. gryzienie lub nadmierne wylizywanie, samookaleczanie, chodzenie do tyłu, wydawanie dźwięków) lub agresję.
1.6.1.3. Obserwacje funkcjonalne
Podobnie jak szczegółowe obserwacje kliniczne, obserwacje funkcjonalne należy również przeprowadzić raz przed ekspozycją i później, często, u wszystkich zwierząt wybranych w tym celu (zob. tabela 1). Częstotliwość obserwacji funkcjonalnych zależy również od czasu trwania badania (zob. tabela 2). Dodatkowo, oprócz obserwacji podanych w tabeli 2, należy również przeprowadzić obserwacje funkcjonalne satelitarnej grupy zwierząt zdrowiejących, jak najbliżej terminu końcowego uśmiercenia. Badania funkcjonalne powinny obejmować reaktywność na bodźce różnego typu (np. słuchowe, wzrokowe i czucia głębokiego (5)(6)(7)), ocenę siły uchwytu (8) oraz ocenę aktywności motorycznej (9). Aktywność motoryczną należy mierzyć urządzeniem automatycznym umożliwiającym wykrywanie zarówno wzrostu jak i spadku aktywności. Jeżeli zastosowano inny zdefiniowany system, powinien on dokonywać pomiaru ilościowego, należy też wykazać jego niezawodność. Należy przetestować każde urządzenie, aby zapewnić niezawodność w czasie oraz spójność pomiędzy urządzeniami. Bliższe szczegóły procedur, które można przeprowadzać, podane są w odpowiednich pozycjach bibliografii. Jeżeli brak jest danych (np. struktura-działanie, dane epidemiologiczne, inne badania toksykologiczne) wskazujących potencjalne skutki neurotoksyczne, należy rozważyć włączenie bardziej specjalistycznych obserwacji funkcji sensorycznej, aktywności motorycznej i modelu zachowania lub uczenia się i pamięci, w celu bardziej szczegółowego zbadania tych potencjalnych skutków. Dalsze szczegóły bardziej wyspecjalizowanych obserwacji i ich zastosowania są podane w (1).
Wyjątkowo z obserwacji funkcjonalnych mogą być wyłączone zwierzęta, które ujawniają oznaki zatrucia w stopniu, który mógłby znacząco kolidować z wykonaniem obserwacji funkcjonalnej. Należy podać uzasadnienie wyłączenia zwierząt z obserwacji funkcjonalnej.
1.6.2. Masa ciała i spożycie pożywienia/wody
W badaniach trwających do 90 dni, wszystkie zwierzęta powinny być ważone co najmniej raz w tygodniu. Pomiary spożycia pożywienia (i wody, jeżeli substancja testowana podawana jest z wodą pitną) powinny być wykonywane co najmniej raz na tydzień. W badaniach długoterminowych należy ważyć zwierzęta raz na tydzień przez pierwsze 13 tygodni, później zaś co najmniej raz na 4 tygodnie. Należy dokonywać pomiarów
spożycia pożywienia (i wody jeżeli substancja testowana podawana jest w tym ośrodku) co najmniej raz na tydzień przez pierwsze 13 tygodni, a następnie w około trzymiesięcznych odstępach, jeżeli stan zdrowia lub zmiany wagi ciała wymuszą stosowanie innej procedury.
1.6.3. Oftalmologia
W przypadku badań trwających dłużej niż 28 dni badanie oftalmologiczne z wykorzystaniem oftalmoskopu lub podobnego sprzętu powinno zostać przeprowadzone przed podaniem substancji testowej oraz przed zakończeniem badań, najlepiej na wszystkich zwierzętach, ale co najmniej na zwierzętach grupy najwyższego dawkowania i grupy kontrolnej. W przypadku wykrycia zmian w oczach należy przebadać wszystkie zwierzęta. W badaniach długoterminowych należy przeprowadzić badanie oftalmologiczne również w 13 tygodniu. Nie ma potrzeby przeprowadzania badania oftalmologicznego, jeżeli takie dane są już dostępne z innych badań o podobnym okresie trwania i przy podobnych poziomach dawek.
1.6.4. Hematologia i biochemia kliniczna
Kiedy badanie neurotoksyczności prowadzone jest w połączeniu z badaniem ogólnoustrojowej toksyczności dawki wielokrotnej, należy przeprowadzić badania hematologiczne i oznaczenia w zakresie biochemii klinicznej według zasad podanych w odpowiedniej metodzie badania toksyczności ogólnoustrojowej. Próbki należy pobierać w taki sposób, żeby zminimalizować jakikolwiek potencjalny wpływ na zachowania o podłożu neurologicznym.
1.6.5. Histopatologia
Należy zaplanować badanie neuropatologiczne w celu uzupełnienia i poszerzenia obserwacji poczynionych podczas fazy in vivo badania. Tkanki pobrane od co najmniej 5 zwierząt/płeć/grupę (zob. tabela 1 i następny akapit) należy utrwalić in situ, stosując powszechnie przyjęte techniki perfuzji i utrwalania (zob. poz. bibliograficzna (3), rozdział 5, i poz. bibliograficzna (4), rozdział 50). Należy odnotować widoczne oglądowo zmiany. Jeżeli badanie jest przeprowadzane jako odrębne badanie sortujące pod kątem neurotoksyczności lub w celu scharakteryzowania skutków neurotoksycznych, można wykorzystać pozostałe zwierzęta do konkretnych procedur neurobehawioralnych (10)(11), neuropatologicznych (10)(11)(12)(13), neurochemicznych (10)(11)(14)(15) lub elektrofizjologcznych (10)(11)(16)(17), którymi można uzupełniać procedury i badania opisane powyżej; można też powiększyć o nie liczbę zwierząt badanych histopatologicznie. Tego rodzaju dodatkowe procedury są szczególnie użyteczne w przypadkach, kiedy obserwacje empiryczne lub przewidywane skutki wskazują na jakiś szczególny rodzaj lub docelowy organ działania neurotoksycznego (2) (3). Alternatywnie, można wykorzystać pozostałe zwierzęta również do rutynowych badań histopatologicznych, jakie opisano w metodzie badań dawki wielokrotnej.
Wszystkie preparaty tkanek zatopione w parafinie należy poddać ogólnej procedurze barwienia, jak np. hematoksyliną i eozyną (H&E), i zbadać pod mikroskopem. Jeżeli zaobserwuje się oznaki neuropatii obwodowej lub podejrzewa ich obecność, należy zbadać próbki tkanki nerwów obwodowych zatopione w tworzywie. Oznaki kliniczne mogą również sugerować dodatkowe lokalizacje do zbadania lub też zastosowanie specjalnych procedur barwienia. Wytyczne dotyczące dodatkowych miejsc do zbadania można znaleźć w (3)(4). Pomocne mogą być także właściwe specjalne barwniki ujawniające konkretne rodzaje zmian patologicznych (18).
Należy zbadać histologicznie reprezentatywne skrawki z centralnego i obwodowego układu nerwowego (zob. poz. bibliograficzna (3), rozdział 5, i poz. bibliograficzna (4), rozdział 50). Obszary badane powinny zwykle obejmować: przodomózgowie, centralną część móżdżku, w tym przekrój przez hipokamp, śródmózgowie, móżdżek, most, rdzeń przedłużony, oko z nerwem wzrokowym i siatkówką, rdzeń kręgowy na poziomie rozszerzenia szyjnego i lędźwiowego, zwoje korzeni grzbietowych, włókna korzeni brzusznych i grzbietowych, proksymalny nerw kulszowy, proksymalny nerw piszczelowy (w kolanie) oraz mięśniowe odgałęzienia nerwu piszczelowego. Skrawki z rdzenia kręgowego i nerwów obwodowych powinny obejmować zarówno przekroje poprzeczne jak i wzdłużne. Należy uwzględnić unaczynienie układu nerwowego. Należy również zbadać próbkę mięśnia szkieletowego, szczególnie mięśnia łydki. Szczególną uwagę należy poświęcić tym okolicom, których struktury komórkowe i włókna w centralnym i obwodowym układzie nerwowym znane są ze szczególnej podatności na działanie czynników neurotoksycznych.
W pozycjach bibliograficznych (3)(4) można znaleźć wskazówki dotyczące zmian neuropatologicznych typowych dla zmian wynikających z ekspozycji na czynnik toksyczny. Zaleca się dokonywanie badań w etapach, w których skrawki z grupy wysokiego dawkowania porównywane są najpierw ze skrawkami z grupy kontrolnej. Jeżeli nie zostaną zaobserwowane żadne zmiany neuropatologiczne w próbach z tych grup, nie jest wymagana dalsza analiza. Jeżeli zostaną zaobserwowane zmiany w grupie wysokiego dawkowania, próba każdej potencjalnie dotkniętej tkanki z grup pośredniego i niskiego dawkowania powinna zostać zakodowana i następnie zbadana sekwencyjnie.
Jeżeli w obserwacjach jakościowych zostaną zauważone dowody jakichkolwiek zmian neuropatologicznych, należy przeprowadzić badanie we wszystkich obszarach układu nerwowego wykazujących te zmiany. Skrawki z potencjalnie dotkniętych okolic, ze wszystkich grup dawkowania, należy zakodować i badać losowo bez znajomości kodu. Należy odnotować częstość i ciężkość każdej zmiany. Kiedy zostaną ocenione wszystkie grupy dawkowania, można rozkodować oznaczenia i przeprowadzić analizę statystyczną w celu oszacowania zależności reakcji od dawki. Należy opisać przykłady zmian o różnym stopniu ciężkości.
Zmiany neuropatologiczne powinny być oceniane w kontekście obserwacji i pomiarów, jak również innych danych z wcześniejszych lub jednocześnie prowadzonych badań toksyczności ogólnoustrojowej testowanej substancji.
2. DANE
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW
Powinny zostać dostarczone dane indywidualne zwierząt. Dodatkowo wszystkie dane powinny być podsumowane w formie tabeli przedstawiającej dla każdej grupy badanej lub kontrolnej liczbę zwierząt na początku testu, liczbę zwierząt, które znaleziono martwe podczas testu lub uśmiercono z powodów humanitarnych i czas każdej śmierci lub humanitarnego uśmiercenia, liczbę zwierząt wykazujących oznaki toksyczności, opis obserwowanych oznak zatrucia, w tym czas rozpoczęcia, okres trwania, rodzaj i ciężkość wszelkich skutków zatrucia, liczbę zwierząt wykazujących zmiany patologiczne, typ zmian(-y).
2.2. OCENA I INTERPRETACJA WYNIKÓW
Objawy stwierdzone w badaniu należy ocenić w kategoriach częstości występowania, ciężkości i korelacji skutków neurobehawioralnych i neuropatologicznych (również neurochemicznych i elektrofizjologicznych, jeżeli włączono dodatkowe badania) oraz wszelkich innych zaobserwowanych skutków niekorzystnych. W przypadkach, gdy jest to możliwe, wyniki liczbowe powinny być ocenione za pomocą odpowiedniej i ogólnie akceptowanej metody statystycznej. Metody statystyczne powinny być wybrane podczas planowania badania.
3. SPRAWOZDAWCZOŚĆ
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań musi zawierać następujące informacje:
Substancja testowa:
- cechy fizyczne (w tym izomeria, czystość i własności fizykochemiczne),
- dane identyfikacyjne. Nośnik (w stosownych przypadkach):
- uzasadnienie wyboru nośnika. Zwierzęta badane:
- wykorzystany gatunek/szczep,
- liczba, wiek i płeć zwierząt,
- źródło, warunki przebywania zwierząt, aklimatyzacja, dieta, itp.,
- - indywidualne masy ciała zwierząt na początku testu. Warunki testu:
- szczegóły dotyczące przygotowania formy użytkowej substancji testowanej/pożywienia, osiąganego stężenia, trwałości i homogeniczności preparatu,
- wyszczególnienie podawanych dawek, obejmujące szczegóły nośnika, objętości i cech fizycznych podawanego materiału;
- szczegóły podawania substancji testowanej,
- racjonalna podstawa wyboru poziomu dawki,
- racjonalna podstawa wyboru drogi podawania i czasu trwania ekspozycji,
- jeżeli ma zastosowanie, przeliczenie stężenia substancji testowanej w pożywieniu/wodzie pitnej (ppm) na rzeczywistą dawkę (mg/kg masy ciała/dzień),
- szczegóły jakości pożywienia i wody. Procedury obserwacji i testów:
- szczegóły przydzielania zwierząt każdej grupy do podgrup poddawanych perfuzji,
- szczegóły systemów punktowych, zawierające kryteria i skale punktowe dla każdego pomiaru w szczegółowych obserwacjach klinicznych,
- szczegóły obserwacji funkcjonalnych pod kątem oceny reaktywności na bodźce różnego typu (np. słuchowe, wzrokowe i czucia głębokiego; oceny siły uchwytu oraz oceny aktywności motorycznej (wraz ze szczegółami urządzeń automatycznych wykrywających aktywność); oraz innych użytych procedur,
- szczegóły badań oftalmologicznych oraz, w stosownych przypadkach, badań hematologicznych oraz klinicznych prób biochemicznych wraz z odpowiednimi wartościami bazowymi,
- szczegóły konkretnych procedur neurobehawioralnych, neuropatologicznych, neurochemicznych i elektrofizj ologicznych.
Wyniki:
- masa ciała/zmiany masy ciała w tym masa ciała w chwili uśmiercenia,
- spożycie pokarmu i spożycie wody, w stosownych przypadkach,
- dane dotyczące reakcji toksycznej w rozbiciu na płcie i poziomy dawek, w tym oznaki toksyczności lub śmiertelność,
- charakter, ciężkość i czas trwania (rozpoczęcie i dalszy przebieg) obserwacji klinicznych (zarówno odwracanych jak i nieodwracalnych),
- szczegółowy opis wszystkich wyników obserwacji funkcjonalnych,
- stwierdzenia sekcji zwłok,
- szczegółowy opis wszystkich stwierdzeń neurobehawioralnych, neuropatologicznych, i neurochemicznych, jeśli takie są dostępne,
- dane dotyczące absorpcji i metabolizmu, w stosownych przypadkach,
- statystyczna obróbka wyników, w stosownych przypadkach, Dyskusja wyników:
- informacje o reakcji na dawkę,
- związek jakichkolwiek skutków toksycznych z wnioskiem dotyczącym neurotoksycznego potencjału badanego związku chemicznego,
- poziom dawkowania, przy którym nie obserwuje się niekorzystnego skutku. Wnioski:
- zachęca się do zamieszczenia konkretnego stwierdzenia dotyczącego ogólnej neurotoksyczności badanego związku chemicznego.
4. BIBLIOGRAFIA
(1) OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strategies and Test Methods. OECD, Paris, In Preparation.
(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. In preparation.
(3) World Health Organization (WHO) (1986). Environmental Health Criteria document 60: Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Chemicals.
(4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. (1980). Experimental and Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.
(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B. (1980). Utility of the Neurological Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, 999-1003.
(6) Gad, S.C. (1982). A Neuromuscular Screen for Use in Industrial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, 691-704.
(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., 108, 267-283.
(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxicol., 1, 233-236.
(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C. (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 599-609.
(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds. (1992). Neurotoxicology Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.
(11) Chang, L.W., ed. (1995). Principles of Neurotoxicology. Marcel Dekker, New York.
(12) Broxup, B. (1991). Neuopathology as a screen for Neurotoxicity Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, 689-695.
(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C. (1992). Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydroxyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, 343-352.
(14) O'Callaghan, J.P. (1988). Neurotypic and Gliotypic Proteins as Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, 445-452.
(15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B. (1988). Acute Exposure of the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, 368-378.
(16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G. (1982). Electrophysiological Techniques inNeurotoxico-logy In: Nervous System Toxicology Mitchell, CL. ed. Raven Press, New York, pp 299-335.
(17) Johnson, B.L. (1980). Electrophysiological Methods in neurotoxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicology Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co., Baltimore/ London, pp. 726-742.
(18) Bancroft, J.D. and Steven A. (1990). Theory and Pratice of Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Techniques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livingstone.
Tabela 1
Minimalne liczby zwierząt w grupach potrzebne w sytuacji, kiedy badanie neurotoksyczności przeprowadzane jest odrębnie lub w połączeniu z innymi badaniami
| BADANIE NEUROTOKSYCZNOŚCI PRZEPROWADZONE JAKO: | ||||
| Odrębne badanie | Połączone z badaniem 28-dniowym | Połączone z badaniem 90-dniowym | Połączone z badaniem toksyczności chronicznej | |
| Całkowita liczba zwierząt na grupę | 10 samców i 10 samic | 10 samców i 10 samic | 15 samców i 15 samic | 25 samców i 25 samic |
| Liczba zwierząt wybrana do obserwacji funkcjonalnych, w tym szczegółowych obserwacji klinicznych | 10 samców i 10 samic | 10 samców i 10 samic | 10 samców i 10 samic | 10 samców i 10 samic |
| Liczba zwierząt wybranych do perfuzji in situ i neurohistopatologii | 5 samców i 5 samic | 5 samców i 5 samic | 5 samców i 5 samic | 5 samców i 5 samic |
| Liczba zwierząt wybranych do badań dawki wielokrotnej/obserwacji toksyczności podchronicznej/chronicznej, hematologii, biochemii klinicznej, histopatologii itp., jak wskazano to w odnośnych wytycznych | 5 samców i 5 samic | 10 samców † i 10 samic † | 20 samców † i 20 samic † | |
| Dodatkowe obserwacje w stosownych przypadkach | 5 samców i 5 samic | |||
| † Wliczając w to pięć zwierząt wybranych do obserwacji funkcjonalnych i szczegółowych obserwacji klinicznych, stanowiących część badania neurotoksyczności |
Tabela 2
Częstotliwość obserwacji klinicznych i funkcjonalnych
| Rodzaj obserwacji | Czas trwania badania | |||
| Ostra | 28-dniowe | 90-dniowe | Chroniczna | |
| U wszystkich zwierząt | Ogólny stan zdrowotny | codziennie | codziennie | codziennie | codziennie |
| Zachorowalność/ śmiertelność | dwa razy dziennie | dwa razy dziennie | dwa razy dziennie | dwa razy dziennie | |
| U zwierząt wybranych do obserwacji funkcjonalnych | Szczegółowe obserwacje kliniczne | - przed pierwszą ekspozycją - w okresie 8 godzin od dawkowania, w momencie oczekiwanego - maksymalnego skutku w 7 i 14 dniu po dawko waniu | - przed pierwszą ekspozycją - następnie raz na tydzień | - przed pierwszą ekspozycją - raz w pierwszym lub drugim tygodniu ekspozycji - następnie raz na miesiąc | - przed pierwszą ekspozycją - raz na koniec pierwszego miesiąca ekspozycji - następnie raz na trzy miesiące |
| Obserwacje funkcjonalne | - przed pierwszą ekspozycją - w okresie 8 godzin od dawkowania, w momencie oczekiwanego maksymalnego skutku - w 7 i 14 dniu po dawkowaniu skutku | - przed pierwszą ekspozycją - w czwartym tygodniu terapii, najbliżej końca okresu ekspozycji jak to możliwe | - przed pierwszą ekspozycją - raz w pierwszym lub drugim tygodniu ekspozycji - następnie raz na miesiąc | - przed pierwszą ekspozycją - raz, na koniec pierwszego miesiąca ekspozycji - następnie raz na trzy miesiące |
B.44. ABSORPCJA PRZEZ SKÓRĘ: METODA IN VIVO
1. METODA
Opisywana metoda badania jest zgodna z wytyczną OECD nr 427 (2004).
1.1. WPROWADZENIE
Ekspozycja na wiele substancji chemicznych następuje głównie przez skórę, natomiast większość badań toksykologicznych na zwierzętach laboratoryjnych skupia się na doustnej drodze podawania. Badanie in vivo wchłaniania przez skórę opisane w tej instrukcji dostarcza informacji niezbędnych do ekstrapolowania wyników badań wchłaniania doustnego i wykorzystywania ich do sporządzania oceny bezpieczeństwa po ekspozycji przez skórę.
Zanim substancja dostanie się do układu krążenia, musi ona przejść przez wiele warstw komórek skóry. W przypadku większości substancji o szybkości wchłaniania decyduje warstwa rogowa, składająca się z martwych komórek. Przepuszczalność skóry zależy zarówno od lipofilności substancji chemicznej i grubości zewnętrznej warstwy naskórka, jak również czynników takich, jak masa cząsteczkowa i stężenie substancji. Ogólnie rzecz biorąc, skóra szczurów i królików jest bardziej przepuszczalna niż skóra ludzka, natomiast przepuszczalność skóry świnek morskich i małp bardziej przypomina przepuszczalność skóry ludzkiej.
Metody mierzenia wchłaniania przez skórę można podzielić na dwie kategorie: in vivo i in vitro. Metoda in vivo może dostarczyć istotnych informacji o wchłanianiu przez skórę u różnych gatunków laboratoryjnych. Metody in vitro zostały opracowane później. W metodach tych wykorzystuje się transport przez skórę zwierzęcą lub ludzką, pełnej lub niepełnej grubości, do zbiornika płynu. Metodę in vitro przedstawiono osobno w opisie innej metody badania (1). W celu doboru najwłaściwszej metody w danej sytuacji zaleca się skonsultować wytyczną OECD na temat przeprowadzania badań wchłaniania przez skórę (2), bowiem zawiera ona więcej szczegółowych informacji na temat stosowalności obu metod.
Opisywana poniżej metoda in vivo pozwala na określenie stopnia przenikania substancji testowej przez skórę do systemu. Technika ta jest powszechnie stosowana od wielu lat (3)(4)(5)(6)(7). Wprawdzie badania wchłaniania przez skórę in vitro mogą w wielu przypadkach być odpowiednie, w niektórych sytuacjach potrzebnych danych dostarczyć mogą jedynie badania in vivo.
Zalety metody in vivo polegają na tym, że stosując ją, wykorzystuje się nienaruszony fizjologicznie i metabolicznie system, używa się gatunków wspólnych dla wielu badań nad toksycznością, zaś metoda po modyfikacji może być stosowana do badań na innych gatunkach. Wadami są konieczność użycia żywych zwierząt, potrzeba stosowania materiałów znakowanych promieniotwórczo w celu uzyskania wiarygodnych wyników, trudności z określeniem wczesnej fazy wchłaniania oraz różnice w przepuszczalności skóry preferowanych gatunków (szczur) i człowieka. Skóra zwierzęca jest na ogół bardziej przepuszczalna i w związku z tym badania prowadzone z jej wykorzystaniem mogą prowadzić do przeszacowania wchłaniania przez skórę u ludzi (6)(8)(9). Na żywych zwierzętach nie należy testować substancji żrących lub korozyjnych.
1.2. DEFINICJE
Dawka niepochłonięta: jest to dawka spłukana z powierzchni skóry po ekspozycji i wszelkie substancje obecne w miejscach nieprzepuszczalnych, w tym wszelkie substancje, o których wiadomo, że wyparowały ze skóry w czasie ekspozycji.
Dawka pochłonięta (in vivo): obejmuje substancję obecną w moczu, materiale wypłukanym z klatki, odchodach, wydychanym powietrzu (jeśli mierzono), krwi, tkankach (jeśli pobierano) oraz innych częściach ciała po usunięciu skóry w miejscu nałożenia substancji.
Dawka wchłanialna: jest masą substancji obecnej na lub w skórze po zmyciu.
1.3. ZASADA METODY BADANIA
Substancja testowa, najlepiej znakowana izotopem promieniotwórczym, nakładana jest na wystrzyżoną skórę zwierzęcia w odpowiedniej dawce lub dawkach, w takiej postaci, w jakiej jest normalnie używana. Aby zapobiec zjedzeniu przez zwierzę preparatu testowego pozostającego w kontakcie ze skórą przez określony czas, zabezpiecza się go odpowiednim opatrunkiem (nieokluzyjnym, semiokluzyjnym lub okluzyjnym). Pod koniec okresu ekspozycji opatrunek jest usuwany, a skóra czyszczona odpowiednim środkiem czyszczącym. Opatrunek i materiały użyte do czyszczenia są zachowane do analizy i zakładany jest świeży opatrunek. Przed, w trakcie i po okresie ekspozycji zwierzęta są umieszczane w oddzielnych klatkach metabolicznych. W tych okresach do celów analizy pobierane są wydaliny i wydychane powietrze. Pobieranie wydychanego powietrza nie jest konieczne, jeśli istnieje dostatecznie dużo informacji, że lotne metabolity promieniotwórcze powstają w niewielkich ilościach lub nie tworzą się wcale. Zwykle bada się kilka grup zwierząt, które poddaje się działaniu preparatu testowego. Jedna grupa jest zabijana po zakończeniu okresu ekspozycji. Inne grupy są zabijane później zgodnie z harmonogramem (2). Na koniec okresu pobierania próbek zabijane są pozostałe zwierzęta, pobierana jest krew do analizy, skóra w miejscu nałożenia substancji wycinana do analizy, a ciało poddawane badaniu w poszukiwaniu niewydalonego materiału. Próbki są badane w odpowiedni sposób i oznaczany jest poziom wchłaniania przez skórę (6)(8)(9).
1.4. OPIS METODY BADANIA
1.4.1. Dobór gatunków zwierząt
Najczęściej wykorzystuje się do tego celu szczury, ale można również użyć linii bezwłosych i gatunków, których intensywność wchłaniania przez skórę jest podobna do tej u człowieka (3)(6)(7)(8)(9). Należy użyć młodych, dorosłych zwierząt jednej płci (standardowo używa się samców) i linii powszechnie wykorzystywanych w laboratoriach. Na początku badań zróżnicowanie masy zwierząt nie powinno przekraczać ± 20 % średniej masy. Na przykład odpowiednie są samce szczurów o masie w zakresie 200-250 g, zwłaszcza o masie z górnej połowy tego zakresu.
1.4.2. Liczba oraz płeć zwierząt
Do każdego preparatu testowego i każdego zaplanowanego czasu zabijania należy użyć co najmniej czterech zwierząt jednej płci. Każda grupa zwierząt jest zabijana po różnym czasie, na przykład na koniec okresu ekspozycji (zwykle po 6 lub 24 godzinach) i następnie po kolejnych okresach (np. 48 i 72 godzinach). Jeśli są dostępne dane świadczące o istotnej różnicy między samcami i samicami w zakresie toksyczności skórnej, należy wybrać bardziej wrażliwą płeć. Jeśli brak takich danych, można użyć zwierząt dowolnej płci.
1.4.3. Warunki w pomieszczeniach dla zwierząt i pożywienie
Temperatura w pomieszczeniu ze zwierzętami doświadczalnymi powinna wynosić 22 oC (± 3 oC). Mimo że wilgotność względna powinna poza okresem sprzątania pomieszczenia wynosić co najmniej 30 % i raczej poniżej 70 %, należy starać się ją utrzymać na poziomie 50-60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin światła, 12 godzin ciemności. Stosować można konwencjonalny pokarm laboratoryjny, który powinien być dostępny bez ograniczeń, podobnie jak woda. W czasie badań, a najlepiej także w okresie aklimatyzacji, zwierzęta są trzymane w osobnych klatkach metabolicznych. Należy zminimalizować możliwość rozsypywania pokarmu lub rozlewania wody, ponieważ może to mieć wpływ na wyniki.
1.4.4. Przygotowanie zwierząt
Zwierzęta są indywidualnie znakowane w celu umożliwienia identyfikacji osobników i trzymane w swoich klatkach przez co najmniej pięć dni przed rozpoczęciem badań w celu zapewnienia aklimatyzacji do warunków laboratoryjnych.
Po okresie aklimatyzacji i około 24 godziny przed zastosowaniem dawki na skórze każdego zwierzęcia w rejonie barków i grzbietu zostanie wystrzyżona skóra. Przepuszczalność skóry uszkodzonej jest inna niż skóry nieuszkodzonej, należy więc uważać, aby nie zranić zwierzęcia. Po wystrzyżeniu skóry i około 24 godziny przed nałożeniem substancji testowej na skórę (zob. część 1.4.7) powierzchnię skóry należy przetrzeć acetonem, aby usunąć łój. Dodatkowe przemywanie mydłem i wodą nie jest zalecane, ponieważ wszelkie resztki mydła mogą zwiększać wchłanianie substancji testowej. Aby umożliwić przeprowadzenie wiarygodnych obliczeń wchłaniania w przeliczeniu na 1 cm2 powierzchnia skóry, na którą nakładana jest substancja musi być wystarczająco duża, najlepiej co najmniej 10 cm2. Taką powierzchnię można uzyskać u szczurów o masie 200-250 g. Po przygotowaniu zwierzęta są wkładane z powrotem do klatek metabolicznych.
1.4.5. Substancja testowa
Substancja testowa jest substancją, której właściwości przenikania są poddawane badaniu. W idealnym przypadku substancja testowa powinna być znakowana izotopami promieniotwórczymi.
1.4.6. Przygotowanie do badania
Preparat substancji testowej (np. czysty, rozcieńczony lub materiał przygotowany według receptury, zawierający nakładaną na skórę substancję) powinien być taki sam (lub być realistycznym surogatem) jak substancja, na której działanie narażani są ludzie lub inne gatunki docelowe. Każda różnica między preparatem a wykorzystywaną substancją musi być uzasadniona. W razie potrzeby badaną substancję rozpuszcza się lub sporządza jej zawiesinę w odpowiednim podłożu. W przypadku podłoża innego niż woda powinna być znana charakterystyka absorpcji oraz potencjalne interakcje z substancją testową.
1.4.7. Nakładanie na skórę
Na powierzchni skóry wyznacza się miejsce nakładania o określonej powierzchni. Następnie równomiernie nakłada się na to miejsce preparat testowy. Jego ilość powinna zwykle imitować potencjalną ekspozycję u człowieka, zwykle 1-5 mg/cm2 w przypadku substancji stałej i do 10 μl/cm2 w przypadku płynu. Zastosowanie jakiejkolwiek innej ilości powinno być uzasadnione oczekiwanymi warunkami użycia, celami badania lub fizycznymi właściwościami preparatu testowego. Po nałożeniu preparatu miejsce nałożenia musi być chronione przed wylizywaniem przez zwierzę. Przykład typowego urządzenia pokazano na rysunku 1. Zazwyczaj miejsce nakładania powinno być chronione nieokluzyjnym opatrunkiem (np. przepuszczalną nylonową gazą). W przypadku dawek nieograniczonych miejsce nakładania powinno być przykryte opatrunkiem okluzyjnym. W przypadku gdy parowanie półlotnych substancji testowych zmniejsza wskaźnik odzysku substancji testowej do niedopuszczalnego poziomu (zob. także część 1.4.10 akapit pierwszy), konieczne jest zebranie wyparowanej substancji do filtra z węgla aktywowanego, pokrywającego urządzenie do nakładania (zob. rysunek 1). Ważne jest, żeby żadne urządzenie nie uszkadzało skóry, nie absorbowało substancji testowej, ani nie wchodziło z nią w reakcję. Zwierzęta wkłada się z powrotem do klatek metabolicznych, w celu zebrania wydalin.
1.4.8. Czas trwania ekspozycji i pobieranie próbek
Czas trwania ekspozycji jest czasem między nałożeniem a usunięciem preparatu przez zmycie go ze skóry. Należy zastosować odpowiedni czas ekspozycji (zwykle 6 lub 24 godziny), dostosowując go do czasu trwania ekspozycji u ludzi. Po okresie ekspozycji zwierzęta są trzymane w klatkach metabolicznych do czasu planowego uśmiercenia. Przez cały czas trwania badania zwierzęta powinny być regularnie obserwowane pod kątem oznak toksyczności lub anormalnych reakcji. Po zakończeniu okresu ekspozycji należy zaobserwować, czy na skórze narażonej na działanie substancji nie wystąpią objawy podrażnienia.
Klatki metaboliczne powinny pozwolić na oddzielne pobieranie moczu i kału przez cały czas badania. Powinny także umożliwiać pobieranie znakowanego węglem 14C dwutlenku węgla oraz lotnych związków węgla 14C, które należy poddać analizie, jeśli pojawiają się większe ilości (> 5 %). Dla każdej grupy i w trakcie każdego pobierania próbek należy osobno pobrać mocz, kał i płyny, w których znalazła się badana substancja (np. dwutlenek węgla 14C i lotne związki 14C). Jeśli jest wystarczająco dużo danych świadczących, że tworzy się niewiele lotnych promieniotwórczych metabolitów lub nie tworzą się one wcale, można stosować klatki otwarte.
Wydaliny są zbierane podczas ekspozycji, do 24 godzin po pierwszym kontakcie ze skórą, następnie codziennie do końca eksperymentu. Zazwyczaj wystarczają trzy okresy pobierania wydalin, jednak zakładane przeznaczenie preparatu testowego lub istniejące dane kinetyczne mogą wskazywać na potrzebę pobrania tego materiału w innych lub dodatkowych terminach.
Na zakończenie okresu ekspozycji urządzenie zabezpieczające jest zdejmowane z każdego zwierzęcia i zatrzymywane do osobnej analizy. Skóra w miejscu poddania działaniu substancji testowej powinna być u wszystkich zwierząt co najmniej trzykrotnie przemyta środkiem czyszczącym przy użyciu odpowiednich tamponów. Należy uważać, aby nie doprowadzić do skażenia innych części ciała. Środek czyszczący powinien być reprezentatywny dla środków stosowanych do zwykłych czynności higienicznych, np. wodny roztwór mydła. Na koniec należy wysuszyć skórę. Wszystkie tampony i płyny pozostałe po przemywaniu muszą być zachowane do analizy. Zwierzętom tworzącym grupy badane przez dłuższy okres należy przed włożeniem ich z powrotem do klatek nałożyć świeży opatrunek, chroniący miejsce poddane działaniu substancji testowej.
1.4.9. Procedury końcowe
W każdej grupie zwierzęta należy uśmiercić zgodnie z harmonogramem i pobrać krew do badań. Urządzenie ochronne lub opatrunek należy zdjąć w celu poddania analizie. Z każdego zwierzęcia powinien zostać pobrany i poddany analizie fragment skóry z miejsca nałożenia substancji oraz podobny, ostrzyżony fragment skóry, który nie był poddany działaniu substancji. Skóra z miejsca poddanego działaniu substancji testowej może zostać podzielona na frakcje, by oddzielić warstwę rogową od głębszej warstwy naskórka w celu uzyskania dokładniejszych informacji na temat rozmieszczenia substancji testowej. Określenie takiego odkładania się substancji w okresie po ekspozycji powinno dostarczyć pewnych danych na temat losu wszystkich substancji testowych w warstwie rogowej. Aby ułatwić dzielenie skóry (po ostatnim myciu skóry i uśmierceniu zwierzęcia), należy zdjąć opatrunek ochronny. Skóra z miejsca nałożenia substancji testowej, wraz z pierścieniem dookoła, jest wycinana i rozpinana na płytce. Przy zastosowaniu delikatnego nacisku na powierzchnię skóry przykleja się kawałek taśmy klejącej. Następnie odkleja się go wraz z częścią warstwy rogowej. Kolejne paski taśmy są naklejane, dopóki taśma przestanie przywierać do powierzchni skóry po usunięciu całej warstwy rogowej. Wszystkie paski taśmy pochodzące od jednego zwierzęcia mogą być umieszczone razem w jednym pojemniku, do którego dodaje się środek trawiący tkanki w celu rozpuszczenia fragmentów warstwy rogowej. Przed poddaniem reszty ciała analizie mającej określić dawkę wchłoniętą przez organizm, można pobrać wszelkie potencjalne tkanki docelowe. Ciała poszczególnych osobników należy zachować do analizy. Zwykle wystarcza analiza całkowitej zawartości. Do odrębnej analizy można pobrać określone organy (jeśli tak zalecono w innych badaniach). Do wcześniej zebranych próbek moczu należy dodać mocz obecny w pęcherzu w momencie uśmiercania zwierzęcia. Po zebraniu wydalin z klatek metabolicznych w zaplanowanym terminie uśmiercania zwierzęcia całe klatki powinny zostać umyte odpowiednim rozpuszczalnikiem. Podobnie należy poddać analizie inne urządzenia, które mogły ulec skażeniu.
1.4.10. Analiza
We wszystkich badaniach należy osiągnąć odpowiednią wartość odzysku (tj. średnio 100 ± 10 % radioaktywności). Poziom odzysku poza tym przedziałem powinien zostać uzasadniony. Wielkość zastosowanej dawki w każdej próbie powinna zostać przeanalizowana przy użyciu odpowiednio udokumentowanych procedur.
Dla każdej procedury nakładania dawki w opracowaniu statystycznym powinna się znaleźć miara wariancji dla powtórzeń.
2. DANE
W przypadku każdego zwierzęcia w każdym okresie pobierania próbek dla testowanej substancji i/lub jej metabolitów należy przeprowadzić następujące pomiary. Poza danymi indywidualnymi należy podać średnie dla danych pogrupowanych według czasów pobierania.
- ilość związana z urządzeniami ochronnymi,
- ilość, która może zostać usunięta ze skóry,
- ilość substancji w/na skórze, której nie można zmyć ze skóry,
- ilość w próbce krwi,
- ilość w wydalinach i wydychanym powietrzu (jeśli znajduje to zastosowanie),
- ilość pozostająca w martwym ciele i wszelkich organach pobranych do oddzielnej analizy.
Oznaczenie ilości substancji testowej i/lub metabolitów w wydalinach, wydychanym powietrzu, krwi i w martwym ciele umożliwi określenie całkowitej ilości zaabsorbowanej w każdym punkcie czasowym. Można również dokonać obliczenia ilości substancji chemicznej wchłanianej na 1 cm2 skóry poddanej działaniu substancji testowej.
3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badania musi zawierać wymagania określone w protokole, w tym uzasadnienie użytego systemu testowego i powinien obejmować, co następuje:
Substancja testowa:
- dane identyfikacyjne (np. numer CAS, jeśli dostępny; źródło; czystość (czystość radiochemiczna); znane zanieczyszczenia; numer partii),
- własności fizyczne, właściwości fizykochemiczne (np. pH, lotność, rozpuszczalność, stabilność, masa cząsteczkowa i log Pow).
Preparat testowy:
- forma i uzasadnienie użycia,
- szczegółowe dane o preparacie testowym, ilość zastosowanej substancji, uzyskane stężenia, podłoże, stabilność i homogeniczność.
Zwierzę testowe:
- wykorzystany gatunek/szczep,
- liczba, wiek i płeć zwierząt,
- źródło zwierząt, warunki przetrzymywania zwierząt, pokarm, itd.,
- masa poszczególnych zwierząt na początku testu. Warunki badania:
- szczegółowe informacje na temat podawania preparatu testowego (miejsce nakładania, metody pobierania próbek, okluzja/bez okluzji, objętość, ekstrakcja, wykrywanie),
- szczegółowe informacje o pokarmie i jakości wody. Wyniki:
- wszelkie oznaki toksyczności,
- dane tabelaryczne dotyczące wchłaniania (wyrażone jako tempo, ilość lub procent),
- sumaryczne wartości odzysku w eksperymencie,
- interpretacja wyników, porównanie z wszelkimi dostępnymi danymi na temat wchłaniania przez skórę związku testowego.
Omówienie wyników.
Wnioski.
4. LITERATURA
(1) Testing Method B.45. Skin Absorption: In vitro Method.
(2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris.
(3) ECETOC (1993) Percutaneous Absorption. European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph No. 20.
(4) Zendzian RP (1989) Skin Penetration Method suggested for Environmental Protection Agency Requirements.J. Am. Coll. Toxicol. 8(5), 829-835.
(5) Kemppainen BW, Reifenrath WG (1990) Methods for skin absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.
(6) EPA (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Applications. Exposure Assessment Group, Office of Health and Environmental Assessment.
(7) EPA (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and Toxic Substances.
(8) Bronaugh R.L., Wester RC, Bucks D., Maibach H.I. and Sarason R (1990) In vivo percutaneous absorption of fragrance ingredients in reshus monkeys and humans. Fd. Chem. Toxic. 28, 369-373.
(9) Feldman R.J. and Maibach H.I. (1970) Absorption of some organic compounds through the skin in man. J. Invest Dermatol. 54, 399-404.
Rysunek 1
Przykład konstrukcji typowego urządzenia stosowanego do wyznaczania i zabezpieczenia miejsca stosowania substancji na skórze w trakcie badań in vivo wchłaniania przez skórę
B.45. ABSORPCJA PRZEZ SKÓRĘ: METODA IN VITRO
1. METODA
Opisywana metoda badania jest zgodna z wytyczną OECD nr 428 (2004).
1.1. WPROWADZENIE
Metoda ta została opracowana, aby dostarczyć informacji na temat wchłaniania substancji testowej nakładanej na wycinek skóry. Może być stosowana w połączeniu z metodą badania wchłaniania przez skórę in vivo (1) lub oddzielnie. Zaleca się, aby przy opracowywaniu badań opartych na tej metodzie korzystać z wytycznej OECD dotyczącej badań wchłaniania przez skórę (2). Wytyczna została opracowana, aby ułatwić wybór odpowiednich procedur in vitro, nadających się do stosowania w określonych okolicznościach, w celu zapewnienia wiarygodności wyników uzyskanych tą metodą.
Metody pomiaru wchłaniania przez skórę oraz ilości substancji dostającej się do organizmu przez skórę można podzielić na dwie kategorie: in vivo i in vitro. Metody in vivo badania wchłaniania przez skórę są dobrze opracowane i dostarczają informacji o farmakokinetyce u wielu różnych gatunków. Informacje o metodzie in vivo przedstawiono osobno w opisie innej metody badania (1). Także metody in vitro są stosowane do pomiaru wchłaniania przez skórę od wielu lat. Wprawdzie nie przeprowadzono formalnych badań walidacyjnych metod in vitro składających się na niniejszą metodę badania, jednakże specjaliści OECD zgodzili się w 1999 r., że istnieje wystarczająco dużo udokumentowanych danych na poparcie metody in vitro (3). Więcej szczegółowych informacji uzasadniających to poparcie, w tym znaczną liczbę bezpośrednich porównań metod in vitro i in vivo, zamieszczono w wytycznej (2). Istnieją monografie, w których omówiono ten temat i przedstawiono szczegółowy zakres stosowania metody in vitro (4)(5)(6)(7)(8)(9)(10)(11)(12). Metody in vitro umożliwiają pomiar rozprzestrzeniania się substancji chemicznych w głąb skóry i na jej powierzchni, a następnie do zbiornika płynu. W badaniu używa się zarówno martwej skóry, służącej wyłącznie do pomiaru dyfuzji, jak i skóry świeżej, aktywnej metabolicznie, pozwalającej na równoczesne badanie dyfuzji i metabolizmu skóry. Takie metody znalazły zastosowanie przy porównywaniu przenikania związków chemicznych zawartych w różnych substancjach chemicznych w głąb skóry i przez skórę, mogą też umożliwić uzyskanie użytecznych modeli oceny wchłaniania przezskórnego u ludzi.
Stosowanie metody in vitro może być niemożliwe we wszystkich warunkach i w przypadku wszystkich kategorii związków chemicznych. Można korzystać z metody badania in vitro do wstępnej oceny jakościowej przenikania przez skórę. W niektórych przypadkach konieczne może być na dalszym etapie przeprowadzenie badań in vivo. W celu dokładniejszego poznania sytuacji, w których metoda in vitro byłaby odpowiednia, należy sięgnąć do wytycznej (2). Dodatkowe szczegółowe informacje przydatne przy podejmowaniu decyzji zamieszczono w (3).
W opisie metody zawarto ogólne zasady pomiaru wchłaniania przez skórę i dopływu substancji testowej przy użyciu wycinka skóry. Możliwe jest użycie skóry wielu gatunków ssaków, w tym człowieka. Właściwości skóry związane z przepuszczalnością są zachowywane po wycięciu jej fragmentu z organizmu, ponieważ główną barierę przenikania stanowi martwa warstwa rogowa. Aktywny transport substancji chemicznych przez skórę nie został stwierdzony. Wykazano, że skóra ma zdolność metabolizowania niektórych związków chemicznych podczas wchłaniania przezskórnego (6), jednak proces ten nie zmniejsza ilości rzeczywiście wchłanianej dawki, choć może mieć wpływ na naturę substancji dostającej się do krwi.
1.2. DEFINICJE
Dawka niepochłonięta: jest to dawka spłukana z powierzchni skóry po ekspozycji i wszelkie substancje obecne w miejscach nieprzykrytych, w tym wszelkie substancje, o których wiadomo, że wyparowały ze skóry w czasie ekspozycji.
Dawka pochłonięta (in vitro): masa substancji testowej docierającej do płynu receptorowego lub układu krążenia w określonym czasie.
Dawka wchłanialna (in vitro): jest masą substancji obecnej na lub w skórze po zmyciu.
1.3. ZASADA METODY BADANIA
Substancja testowa, która może być znakowana izotopem promieniotwórczym jest nakładana na powierzchnię próbki skóry oddzielającej dwie części komory dyfuzyjnej. Substancja pozostaje na skórze w określonych warunkach, przez określony czas, zanim zostanie usunięta w trakcie odpowiedniej procedury mycia. Próbki płynu receptorowego są pobierane w odstępach czasowych w trakcie całego badania i analizowane pod kątem obecności substancji testowej i/lub metabolitów.
W przypadku stosowania systemów aktywnych metabolicznie można odpowiednimi metodami analizować metabolity substancji testowej. Na koniec eksperymentu, w razie potrzeby, rozmieszczenie substancji testowej i jej metabolitów jest wyrażane ilościowo.
W odpowiednich warunkach przedstawionych w opisie tej metody oraz w wytycznej (2), absorpcja substancji testowej w określonym czasie jest mierzona za pomocą analizy płynu receptorowego i badanej skóry. Substancja testowa pozostająca w skórze jest uznawana za zaabsorbowaną, chyba że uda się wykazać, iż poziom absorpcji można ustalić wyłącznie na podstawie wartości płynu receptorowego. Analiza innych komponentów (materiał spłukany ze skóry i pozostający w obrębie warstw skóry) umożliwia dalszą ocenę danych, w tym całkowitego rozmieszczenia substancji testowej i odzysku wyrażonego w procentach.
Aby wykazać sprawność i wiarygodność systemu testów w przeprowadzającym je laboratorium, należy dysponować wynikami odnoszącymi się do odpowiednich substancji wzorcowych, a wyniki te powinny być zgodne z publikacjami na temat wykorzystywanej metody. Wymóg ten można spełnić przeprowadzając test przy użyciu odpowiedniej substancji wzorcowej (najlepiej o lipofilności zbliżonej do lipofilności substancji testowej) równocześnie przy użyciu substancji testowej albo dostarczając odpowiednich danych historycznych dla różnych substancji wzorcowych o zróżnicowanej lipofilności (np. kofeina, kwas benzoesowy i testosteron).
1.4. OPIS METODY BADANIA
1.4.1. Komora dyfuzyjna
Komora dyfuzyjna składa się z dwóch części, donorowej i receptorowej, pomiędzy którymi umieszczona jest skóra (przykład typowego układu przedstawiono na rysunku 1). Komora powinna zapewnić szczelność wokół skóry, pozwalać na łatwe pobieranie próbek i dobre mieszanie roztworu receptorowego pozostającego w kontakcie ze spodnią częścią skóry oraz sprawną regulację temperatury komory i jej zawartości. Dopuszczalny jest zarówno układ statyczny, jak i przepływ przez komory dyfuzyjne. W czasie ekspozycji ograniczonej dawki substancji testowej części donorowe są zwykle otwarte. Jednak w przypadku stosowania nieograniczonych dawek lub przy pewnych scenariuszach stosowania dawek ograniczonych, części donorowe mogą pozostawać zamknięte.
1.4.2. Płyn receptorowy
Preferowane jest stosowanie płynu receptorowego o fizjologicznej przewodności, można jednak stosować również inne płyny, jeśli ich użycie jest uzasadnione. Należy dostarczyć precyzyjnych danych o składzie płynu receptorowego. Należy zapewnić odpowiednią rozpuszczalność substancji testowej w płynie receptorowym, tak aby nie stanowił bariery absorpcji. Ponadto płyn receptorowy nie powinien wpływać na kompletność preparatu skóry. W systemach przepływowych szybkość przepływu nie powinna hamować dyfuzji substancji testowej do płynu receptorowego. W systemie komory statycznej płyn powinien być nieustannie mieszany, a próbki powinny być pobierane regularnie. Jeśli przedmiotem badań jest metabolizm, płyn receptorowy musi zapewnić żywotność skóry przez cały czas trwania eksperymentu.
1.4.3. Preparaty skóry
Można użyć skóry ludzkiej lub zwierzęcej. Uznaje się, że zastosowanie ludzkiej skóry podlega międzynarodowym zastrzeżeniom i warunkom etycznym. Wprawdzie preferowana jest żywa skóra, można jednak użyć również skóry martwej, pod warunkiem że można wykazać kompletność wycinka. Jako błony do dyfuzji można użyć preparatu naskórka (wyizolowanego metodami enzymatycznymi, cieplnymi lub chemicznymi) lub płata skóry niepełnej grubości (zwykle o grubości 200-400 μm) przygotowanego za pomocą dermatomu. Płat skóry pełnej grubości może być użyty, jednakże należy unikać zbyt dużej grubości (ca > 1 mm), chyba że ma on służyć do oznaczenia ilości substancji chemicznej w warstwach skóry. Wybór gatunku, miejsca anatomicznego i techniki preparacji musi być uzasadniony. Wymagane są odpowiednie dane z co najmniej czterech powtórzeń na każdy preparat testowy.
1.4.4. Kompletność preparatu skóry
Właściwe przygotowanie preparatu skóry ma zasadnicze znaczenie. Nieodpowiednie postępowanie może spowodować uszkodzenie warstwy rogowej, dlatego należy sprawdzać kompletność przygotowanej próbki skóry. W przypadku badania metabolizmu skóry należy używać świeżo pobranych wycinków skóry przy zachowaniu warunków, o których wiadomo, że sprzyjają zachowaniu aktywności metabolicznej. Generalnie zaleca się użyć wycinka skóry w ciągu 24 godzin od jego pobrania, jednak dopuszczalny okres przechowywania może być różny, w zależności od systemu enzymatycznego uczestniczącego w metabolizmie oraz od temperatury przechowywania (13). Jeśli preparaty skórne były przed użyciem przechowywane, należy przedstawić dane dowodzące, że funkcja bariery została zachowana.
1.4.5. Substancja testowa
Substancja testowa jest substancją, której właściwości przenikania są poddawane badaniu. W idealnym przypadku substancja testowa powinna być znakowana izotopami promieniotwórczymi.
1.4.6. Preparat testowy
Preparat substancji testowej (np. czysty, rozcieńczony lub materiał przygotowany według receptury, zawierający substancję nakładaną na skórę) powinien być taki sam (lub być realistycznym surogatem) jak substancja, na działanie której mogą być narażeni ludzie lub inne gatunki docelowe. Każda różnica między preparatem a wykorzystywaną substancją musi być uzasadniona.
1.4.7. Stężenia i formy substancji testowych
Zwykle stosuje się więcej niż jedno stężenie substancji testowej, sięgające górnej granicy potencjalnych dawek, na które narażany jest człowiek. Należy także rozważyć poddanie testom różnych typowych form substancji.
1.4.8 Nakładanie na skórę
W normalnych warunkach człowiek jest narażany na działanie ograniczonych dawek substancji chemicznej. Z tego powodu należy nakładać testowaną substancję w sposób imitujący ekspozycję, na jaką narażany jest człowiek. Zwykle należy stosować 1-5 mg/cm2 w przypadku substancji stałej i do 10 μl/cm2 w przypadku płynów. Zastosowanie określonej ilości powinno być uzasadnione oczekiwanymi warunkami użycia, celami badania lub fizycznymi właściwościami preparatu testowego. Na przykład dawki nakładane na skórę mogą być nieograniczone tam gdzie nakładane są duże objętości na jednostkę powierzchni skóry.
1.4.9. Temperatura
Temperatura wpływa na dyfuzję bierną substancji chemicznych (i wobec tego na wchłanianie przez skórę). Komora dyfuzyjna i skóra powinny mieć stałą temperaturę, zbliżoną do normalnej temperatury skóry: 32 ± 1 oC. Różne konstrukcje komory dyfuzyjnej wymagają zastosowania różnej temperatury łaźni wodnych lub bloków grzewczych, aby mieć pewność, że receptor/skóra odpowiadają normie fizjologicznej. Wilgotność powinna mieścić się w przedziale 30-70 %.
1.4.10. Czas trwania ekspozycji i pobieranie próbek
Ekspozycja skóry na preparat testowy może trwać przez cały czas trwania eksperymentu lub przez krótszy czas (np. w celu imitacji określonego rodzaju ekspozycji, na którą narażany jest człowiek). Nadmiar preparatu testowego należy zmyć ze skóry za pomocą odpowiedniego środka czyszczącego, a spłukany materiał zebrać w celu poddania go analizie. Procedura usuwania preparatu testowego zależy od przewidywanych warunków stosowania i należy ją uzasadnić. W celu uzyskania odpowiedniej charakterystyki profilu absorpcji zwykle wymagany jest 24-godzinny okres pobierania próbek. Ponieważ po okresie dłuższym niż 24 godziny stan skóry może zacząć się pogarszać, czas pobierania próbek nie powinien zazwyczaj przekraczać 24 godzin. W przypadku substancji testowych szybko wnikających w skórę może to nie być konieczne, jednak w przypadku substancji testowych, które wnikają powoli, mogą być konieczne dłuższe okresy pobierania próbek. Częstotliwość pobierania próbek płynu receptorowego powinna umożliwić graficzne przedstawienie profilu absorpcyjnego substancji testowej.
1.4.11. Procedury końcowe
Wszystkie elementy systemu testowego powinny być poddane analizie. Należy również oznaczyć wielkość odzysku. Obejmuje to część donorową komory dyfuzyjnej, spłukiwanie powierzchni skóry, preparat skórny oraz płyn receptorowy/komorę receptorową. W niektórych przypadkach skóra może być frakcjonowana na powierzchnię eksponowaną i powierzchnię pod kryzą komory oraz na frakcje warstwy rogowej, naskórka i skóry właściwej, poddawane odrębnym analizom.
1.4.12. Analiza
We wszystkich badaniach należy osiągnąć odpowiedni poziom odzysku (celem powinna być średnia 100 ± 10 % promieniotwórczości, wszelkie odchylenia należy uzasadnić). Analizie przy użyciu odpowiedniej techniki powinna zostać poddana substancja testowa obecna w płynie receptorowym, materiale zmytym z powierzchni skóry i wypłukanym z aparatury.
2. DANE
Należy opisać wyniki analizy płynu receptorowego, rozmieszczenie testowanej substancji chemicznej w systemie testowym oraz zmiany profilu absorpcji w czasie. Jeśli ekspozycja polega na stosowaniu dawki ograniczonej, należy obliczyć ilość substancji spłukiwanej ze skóry, ilość związaną ze skórą (i w różnych warstwach skóry, jeśli jest to przedmiotem analizy) oraz ilość substancji obecnej w płynie receptorowym (współczynnik oraz ilość lub procent stosowanej dawki). Czasami możliwe jest określenie absorpcji przez skórę przy wykorzystaniu wyłącznie danych o płynie receptorowym. Jeśli jednak w momencie zakończenia badań w skórze pozostaje substancja testowa, może być konieczne uwzględnienie jej przy obliczaniu całkowitej zaabsorbowanej ilości (zob. poz. bibliograficzna (3) pkt 66). W przypadku zastosowania do ekspozycji dawki nieograniczonej, dane mogą pozwolić na obliczenie stałej przenikalności (Kp). W ostatnim przypadku procent zaabsorbowanej substancji nie ma znaczenia.
3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badania musi zawierać wymagania określone w protokole, w tym uzasadnienie użycia systemu testowego, i powinno obejmować, co następuje:
Substancja testowa:
- właściwości fizyczne i fizykochemiczne (przynajmniej masa cząsteczkowa i log Pow), czystość (czystość radiochemiczna),
- informacje identyfikacyjne (np. nr partii),
- rozpuszczalność w płynie receptorowym. Preparat testowy:
- forma i uzasadnienie użycia,
- homogeniczność. Warunki badania:
- źródło i miejsce pobrania skóry, metodę preparacji, warunki przechowywania przed użyciem, wszelkie wstępne zabiegi (oczyszczanie, traktowanie antybiotykami itd.), pomiary kompletności skóry, status metaboliczny, uzasadnienie użycia,
- konstrukcję komory, skład płynu receptorowego, szybkość przepływu płynu receptorowego oraz czas i procedury pobierania próbek,
- szczegóły dotyczące nakładania preparatu testowego i kwantyfikacja stosowanej dawki,
- czas trwania ekspozycji,
- szczegółowe informacje dotyczące usuwania preparatu testowego ze skóry, np. spłukiwanie skóry,
- szczegółowe dane o skórze i wszelkich technikach frakcjonowania użytych do podziału skóry,
- procedury mycia komory i sprzętu,
- metody pobierania próbek, techniki ekstrakcji, granice wykrywania i walidacja metod analitycznych. Wyniki:
- ogólna ilość substancji odzyskiwanej w toku eksperymentu (dawka zastosowana materiał zmyty ze skóry + skóra + płyn receptorowy + płyn z płukania komory),
- tabelaryczne zestawienie odzysków w poszczególnych częściach komory,
- profil absorpcji,
- dane tabelaryczne dotyczące wchłaniania (wyrażone jako tempo, ilość lub procent). Omówienie wyników.
Wnioski.
4. LITERATURA
(1) Testing Method B.44. Skin Absorption: In vivo Method.
(2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin Absorption Studies. OECD, Paris.
(3) OECD (2000). Report of the Meeting of the OECD Extended Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, Annex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.
(4) Kemppainen B.W. and Reifenrath W.G. (1990). Methods for skin absorption. CRC Press, Boca Raton.
(5) Bronaugh RL. and Collier, S.W. (1991). Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Studies, in In vitro Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals and Applications, R.L. Bronaugh and H.I. Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, pp. 237-241.
(6) Bronaugh R.L. and Maibach H.I. (1991). In vitro Percutaneous Absorption: Principles, Fundamentals and Applications. CRC Press, Boca Raton.
(7) European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals (1993). Monograph No. 20, Percutaneous Absorption, ECETOC, Brussels.
(8) Diembeck W., Beck H., Benech-Kieffer F., Courtellemont P, Dupuis J., Lovell W., Paye M., Spengler J., Steiling W (1999). Test Guidelines for In Vitro Assessment of Dermal Absorption and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingredients, Fd Chem Tox, 37, 191-205.
(9) Recommended Protocol for In vitro Percutaneous Absorption Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No. 65.
(10) Howes D., Guy R, Hadgraft J., Heylings J.R. et al. (1996). Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM Workshop Report ATLA 24, 81 R10.
(11) Schaefer H. and Redelmeier TE. (1996). Skin barrier: principles of percutaneous absorption. Karger, Basel.
(12) Roberts M.S. and Walters K.A. (1998). Dermal absorption and toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.
(13) Jewell, C, Heylings, J.R, Clowes, H.M. And Williams, F.M. (2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitrochlorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74: 356-365.
Rysunek 1
Przykład typowej konstrukcji statycznej komory dyfuzyjnej do badań in vitro wchłaniania przezskórnego
B.46. DZIAŁANIE DRAŻNIĄCE NA SKÓRĘ IN VITRO: BADANIE NA MODELU ZREKONSTRUOWANEGO LUDZKIEGO NASKÓRKA'
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B. 47 METODA BADANIA ZMĘTNIENIA I PRZEPUSZCZALNOŚCI ROGÓWKI U BYDŁA DO CELÓW IDENTYFIKACJI SUBSTANCJI ŻRĄCYCH I SILNIE DRAŻNIĄCYCH DLA OCZU
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B. 48 METODA BADANIA NA IZOLOWANYM OKU KURZYM DO CELÓW IDENTYFIKACJI SUBSTANCJI ŻRĄCYCH I SILNIE DRAŻNIĄCYCH DLA OCZU
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.49. BADANIE MIKROJĄDROWE IN VITRO W KOMÓRKACH SSAKÓW
WSTĘP
1. Badanie mikrojądrowe in vitro (MNvit) jest badaniem genotoksyczności w celu wykrywania mikrojądra (MN) w cytoplazmie komórek w interfazie. Mikrojądra mogą pochodzić odpowiednio z acentrycznych fragmentów chromosomów (tj. nieposiadających centromera), lub z całych chromosomów, które nie są w stanie migrować do biegunów w stadium anafazy podziału komórek. To badanie wykrywa klastogenne i aneugenne działanie chemikaliów (substancji i mieszanin) (1) (2) w komórkach, w których doszło do podziału komórek podczas narażenia na działanie substancji badanej lub po nim. Niniejsza metoda badania (TM) dopuszcza stosowanie protokołów z inhibitorem polimeryzacji aktyny cytochalazyną B (cytoB) i bez niego. Dodanie cytoB przed ukierunkowaną mitozą umożliwia określenie i selektywną analizę częstotliwości występowania mikrojąder w komórkach, które ukończyły jedną mitozę, ponieważ takie komórki są dwujądrowe (3) (4). Niniejsza TM pozwala również na stosowanie protokołów bez zahamowania cytokinezy, pod warunkiem że istnieją dowody na to, że badana populacja komórek przeszła mitozę.
2. Oprócz badania MNvit wykorzystywanego do identyfikowania chemikaliów (substancji i mieszanin), które powodują powstawanie mikrojąder, informacji na temat mechanizmów uszkadzania chromosomu i formowania mikro-jąder mogą dostarczyć również: zahamowanie cytokinezy, immunochemiczne oznakowanie kinetochorów lub hybrydyzacja z sondami centromerowymi/telomerowymi (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Procedury oznaczania i hybrydyzacji mogą być wykorzystywane w przypadku, gdy następuje wzrost procesu formowania mikrojąder i badający zamierza ustalić, czy ten wzrost jest skutkiem klastogennych lub aneugennych zdarzeń.
3. Mikrojądra stanowią uszkodzenie, które zostało przekazane do komórek potomnych, podczas gdy aberracje chromosomowe znalezione w komórkach metafazy mogą nie być przekazywane. Ponieważ mikrojądra w komórkach w stadium interfazy można stosunkowo obiektywnie ocenić, pracownicy laboratorium muszą tylko określić, czy komórki się podzieliły i ile spośród komórek zawiera mikrojądro. W rezultacie preparaty mogą być ocenione względnie szybko, a analizy mogą być zautomatyzowane. Badanie staje się wydajniejsze, bo można oceniać tysiące zamiast setek komórek poddanych działaniu. Wreszcie, ponieważ mikrojądra mogą tworzyć się z chromosomów opóźnionych, istnieje możliwość wykrycia czynników wywołujących aneuploidię, które trudno badać w konwencjonalnych badaniach aberracji chromosomalnych, np. wytyczna ODCE dotycząca badań nr 473 (rozdział B.10 niniejszego załącznika) (17). Jednak badanie MNvit nie pozwala na różnicowanie chemikaliów wywołujących poliploidalność od tych wywołujących działanie klastogenne bez specjalnych technik, takich jak badanie FISH, opisane w pkt 2.
4. Badanie MNvit jest metodą in vitro, w której zazwyczaj wykorzystuje się hodowane komórki ludzkie lub gryzoni. Dostarcza ona kompleksowych podstaw do badania in vitro potencjalnego działania powodującego uszkodzenia chromosomowe, ponieważ można wykryć zarówno aneugeny, jak i klastogeny.
5. Badanie MNvit jest solidne i skuteczne w odniesieniu do różnych rodzajów komórek, oraz w obecności lub przy braku cytoB. Istnieje dużo danych na poparcie ważności badania MNvit z wykorzystaniem różnych linii komórkowych gryzoni (CHO, V79, CHL/IU i L5178Y) i ludzkich limfocytów (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30), (31). Obejmują one w szczególności międzynarodowe badania walidacyjne koordynowane przez Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) i sprawozdania z International Workshop on Genotoxicity Testing (międzynarodowych warsztatów z badań genotoksycznych) (4) (16). Dostępne dane zostały również poddane ponownej ocenie w oparciu o analizę ciężaru dowodów w retrospektywnym badaniu walidacyjnym przez Europejskie Centrum Uznawania Metod Alternatywnych (ECVAM) Komisji Europejskiej i metoda badania została zatwierdzona jako naukowo uzasadniona przez naukowy komitet doradczy ECVAM (ESAC) (32) (33) (34). Opisano wykorzystywanie ludzkich komórek z linii limfoblastoidów TK6 (35), komórek HepG2 (36) (37) i komórek zarodka chomika syryjskiego (38), pomimo że nie zostały one wykorzystane w badaniach walidacyjnych.
DEFINICJE
6. Definicje są zamieszczone w dodatku 1.
UWAGI WSTĘPNE
7. Badania przeprowadzane in vitro wymagają zazwyczaj wykorzystania egzogenicznego źródła aktywacji metabolicznej, chyba że komórki są metabolicznie wydolne w odniesieniu do badanych substancji. Egzogeniczny system aktywacji metabolicznej nie jest w stanie całkowicie naśladować warunków in vivo. Należy dołożyć wszelkich starań, aby uniknąć warunków, które mogłyby prowadzić do zniekształconych pozytywnych wyników nieodzwierciedlających wewnętrznej mutagenności, a które mogą wynikać ze zmian w pH lub w stężeniu osmolalnym lub być spowodowane przez wysokie poziomy cytotoksyczności (39) (40) (41). Jeśli badana substancja chemiczna powoduje zmianę w pH podłoża w momencie dodania, pH należy dostosować, najlepiej za pomocą buforowania roztworu podstawowego w taki sposób, aby wszystkie objętości we wszystkich badanych stężeniach oraz w odniesieniu do wszystkich kontroli pozostawały takie same.
8. Dla celów analizy indukcji mikrojąder istotne jest, aby mitoza miała miejsce zarówno w hodowlach komórkowych poddanych działaniu substancji, jak i w niepoddanych temu działaniu. Najpełniejsze informacje w zakresie obliczania mikrojąder można uzyskać na podstawie badań komórek, które ukończyły jedną mitozę w trakcie poddawania działaniu substancji badanej lub po nim.
ZASADA BADANIA
9. Hodowle komórek ludzi lub ssaków są poddawane działaniu substancji badanej zarówno z egzogenicznym źródłem aktywacji metabolicznej, jak i bez niego, chyba że wykorzystuje się komórki o odpowiedniej zdolności metabolizowania. Stosowany równolegle rozpuszczalnik/nośnik (VC) i pozytywne substancje kontrolne (PC) są zawarte we wszystkich badaniach.
10. Komórki są hodowane w trakcie narażenia na działanie substancji badanej lub po nim przez okres, w którym uszkodzenia chromosomów lub wrzeciona mogą doprowadzić do tworzenia się mikrojąder w komórkach interfazy. Do indukcji aneuploidii substancja badana powinna zwykle być obecna w trakcie mitozy. Zebrane i zabarwione komórki interfazy są analizowane pod kątem obecności mikrojąder. W warunkach idealnych do powstania mikrojąder powinno dochodzić jedynie w tych komórkach, które ukończyły mitozę podczas narażenia na substancję badaną lub w okresie po narażeniu, jeżeli jest stosowany. W hodowlach, które były poddane działaniu substancji z blokerem cytokinezy można to osiągnąć poprzez liczenie jedynie komórek dwujądrowych. W przypadku braku blokera cytokinezy ważne jest, aby wykazać, że w poddanych analizie komórkach prawdopodobnie doszło do podziału komórek podczas narażenia na działanie substancji badanej lub po nim. Dla wszystkich protokołów ważne jest, aby wykazać, że proliferacja komórek miała miejsce zarówno w hodowlach kontrolnych, jak i w poddanych działaniu substancji, a także należy oszacować zakres cytotoksyczności wywołanej przez substancję lub cytostazy w hodowlach (lub w hodowlach równoległych), które są oceniane pod kątem zawartości mikrojąder.
OPIS BADANIA
Preparaty
11. Można wykorzystywać hodowane podstawowe limfocyty krwi obwodowej ludzi (5) (19) (42) (43) oraz komórki z szeregu linii komórkowych gryzoni, takich jak CHO, V79, CHL/IU i L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Stosowanie innych linii komórkowych i typów powinno być uzasadnione na podstawie ich wykazanej efektywności w badaniu, zgodnie z kryteriami dopuszczalności opisanymi w odpowiednim rozdziale. Ponieważ podstawowa częstość występowania mikrojąder będzie miała wpływ na wrażliwość próby, zaleca się wykorzystywanie typów komórek, o niskiej, stałej częstości powstawania mikrojąder.
12. Limfocyty krwi obwodowej ludzi należy uzyskać od młodych (między 18 a 35 rokiem życia), zdrowych, niepalących osób, które ostatnio nie były narażone, o ile wiadomo, na działanie genotoksycznych substancji chemicznych lub na promieniowanie. Jeżeli dla celów stosowania łączy się komórki pochodzące od większej liczby dawców niż jeden, należy określić liczbę dawców. Częstość powstawania mikrojąder wzrasta wraz z wiekiem i tendencja ta jest wyraźniejsza w przypadku kobiet niż mężczyzn (44), dlatego należy to uwzględnić przy wyborze dawców komórek do łącznego poddawania działaniu.
Pożywki i warunki hodowli kultury
13. W utrzymywaniu hodowli powinny być stosowane odpowiednie warunki podłoża hodowli oraz inkubacji (naczynia do hodowli, stężenie CO2, temperatura oraz wilgotność). Ustanowione linie komórkowe oraz szczepy powinny być rutynowo sprawdzane pod kątem stabilności zmiennej liczby chromosomów oraz nieobecności zanieczyszczenia mykoplazmą oraz nie powinny być wykorzystywane, jeżeli są zanieczyszczone lub w przypadku, gdy liczba chromosomów uległa zmianie. Powinien być znany normalny czas cyklów komórkowych w warunkach hodowli stosowanej w laboratorium przeprowadzającym badania. Jeżeli stosowana jest metoda z blokerem cyto-kinezy wówczas stężenie inhibitorów cytokinezy powinno być dostosowane do danego rodzaju komórek oraz należy wykazać, że jest ona w stanie wyprodukować wystarczającą liczbę komórek dwujądrowych dla celów oceny.
Przygotowanie hodowli
14. Ustanowione linie komórkowe oraz szczepy: Komórki są rozmnażane z hodowli podstawowej, siane na podłożu hodowlanym w takiej gęstości, aby hodowle nie zrastały się w warstwach, a hodowle w zawiesinie nie osiągały nadmiernego zagęszczenia przed czasem pobierania, oraz inkubowane w temperaturze 37 °C.
15. Limfocyty: Krew pełną poddaną działaniu antykoagulantu (np. heparyny) lub oddzielone limfocyty hoduje się w obecności mitogenu np. fitohemoaglutyniny (PHA) przed narażeniem na działanie substancji badanej i cytoB.
Aktywacja metaboliczna
16. Zewnątrzpochodny układ metabolizujący należy stosować w przypadku, gdy stosuje się komórki o niewłaściwej wewnątrzpochodnej pojemności metabolicznej. Najbardziej powszechnie wykorzystywanym systemem jest uzupełniana współczynnikiem frakcja pomitochondrialna (S9) przygotowana z wątroby gryzoni otrzymujących czynniki pobudzające enzymy takie jak Aroclor 1254 (45) (46) lub kombinacja fenobarbitonu oraz β-nafoflavonu (46) (47) (48) (49). To ostatnie połączenie nie pozostaje w sprzeczności z Konwencją sztokholmską w sprawie trwałych zanieczyszczeń organicznych (50) i rozporządzeniem (WE) nr 850/2004 dotyczącym trwałych zanieczyszczeń organicznych (66) i okazało się tak skuteczne jak Aroclor 1254 w wywołaniu oksydaz wieloczynnościowych (46) (47) (48) (49). Frakcja S9 jest zazwyczaj wykorzystywana w stężeniach o zakresie 1-10 % (v/v) w końcowym podłożu badawczym. Warunki systemu aktywacji metabolicznej mogą być uzależnione od klasy badanej substancji chemicznej i w niektórych przypadkach właściwe może okazać się wykorzystanie więcej niż jednego stężenia S9.
17. Genetycznie skonstruowane linie komórkowe oddające szczególne dla ludzi lub gryzoni enzymy aktywujące mogą sprawić, że zewnątrzpochodny system aktywacji metabolicznej stanie się niepotrzebny i mogą być stosowane jako komórki badane. W takich przypadkach wybór wykorzystywanych linii komórkowych powinien być uzasadniony naukowo, np. poprzez istotność oksydaz wieloczynnościowych dla metabolizmu substancji badanej (51) i ich zdolność do reagowania na znane klastogeny i aneugeny (zob. oddzielny rozdział dotyczący kryteriów dopuszczalności). Należy uwzględnić fakt, że badana substancja może nie być metabolizowana przez wyrażoną oksydazę wieloczynnościową; W takim przypadku negatywne wyniki nie wskazują na to, że badana substancja nie może wywołać procesu powstawania mikrojąder.
Preparat substancji badanej
18. Stałe substancje chemiczne należy rozpuścić w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach oraz rozcieńczyć, jeżeli jest to odpowiednie, zanim komórki zostaną poddane działaniu substancji badanej. Płynne substancje badane mogą być dodawane bezpośrednio do układu badawczego i/lub rozcieńczane przed poddaniem komórek działaniu substancji badanej. Gazy lub lotne substancje chemiczne powinny być badane za pomocą odpowiednich modyfikacji standardowych protokołów, takich jak poddawanie komórek działaniu substancji badanej w szczelnie zamkniętych naczyniach (52) (53). Należy wykorzystywać świeże preparaty substancji badanej, chyba że dane dotyczące stabilności wskazują, iż dopuszczalne jest składowanie substancji
Warunki badania
Rozpuszczalniki/nośniki
19. Rozpuszczalnik/nośnik nie powinien reagować z substancją badaną, lub uniemożliwiać przeżywania komórek lub utrzymania działania S9 przy wykorzystywanym stężeniu. Jeśli są stosowane inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/nośniki (np. woda, podłoże hodowli komórkowych, sulfotlenek dimetylu), ich stosowanie powinno być wsparte danymi wskazującymi ich zgodność z substancją badaną oraz brak ich toksyczności genetycznej. Zaleca się, o ile to możliwe, aby w pierwszej kolejności rozważone zostało wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/ nośników.
Wykorzystanie cytoB jako blokera cytokinezy
20. Jedną z najistotniejszych kwestii w wykonywaniu badania MNvit jest zapewnienie, że oceniane komórki zakończyły mitozę podczas poddania działaniu substancji badanej lub w okresie po poddaniu, jeżeli jest stosowany. CytoB to czynnik, który był powszechnie stosowany do zahamowania cytokinezy, ponieważ hamuje on polimeryzację aktyny, a tym samym zapobiega oddzielaniu komórek potomnych po mitozie, doprowadzając do tworzenia komórek dwujądrowych (5) (54) (55). Z tego względu liczenie mikrojąder można ograniczyć do komórek, które przeszły mitozę w trakcie ich poddawania działaniu substancji badanej lub po nim. Wpływ substancji badanej na kinetykę proliferacji komórek może być mierzony jednocześnie. CytoB powinno być wykorzystywane jako bloker cytokinezy w przypadku, gdy są stosowane ludzkie limfocyty, ponieważ czas cyklu komórkowego będzie różny dla różnych hodowli i różnych dawców oraz ze względu na to, że nie wszystkie limfocyty będą reagować na PHA. Inne metody zostały wykorzystane podczas badania linii komórkowych, aby ustalić, czy oceniane komórki się podzieliły; zostały one omówione poniżej (zob. pkt 26).
21. Laboratorium powinno określić odpowiednie stężenie cytoB dla każdego rodzaju komórek do osiągnięcia optymalnej częstości powstawania komórek dwujądrowych w hodowlach kontrolnych z wykorzystaniem rozpuszczalnika/nośnika. Odpowiednie stężenie cytoB zwykle wynosi między 3 i 6 μg/ml.
Pomiar proliferacji komórek i cytotoksyczności oraz wybór stężeń narażenia
22. Przy ustalaniu najwyższego stężenia badanej substancji, które ma być badane, należy unikać stężeń, które mogą dawać zniekształcone pozytywne wyniki, takich jak te, które powodują nadmierną cytotoksyczność, opad w podłożu hodowlanym i znaczne zmiany pH lub osmolalności (39) (40) (41).
23. Dokonuje się pomiaru proliferacji komórek, aby upewnić się, że komórki poddane działaniu substancji przeszły mitozę podczas badania oraz że poddawanie działaniu substancji jest prowadzone na odpowiednim poziomie cytotoksyczności (zob. pkt 29). Cytotoksyczność powinna być oznaczana z aktywacją metaboliczną oraz bez niej w komórkach wymagających aktywacji metabolicznej, z wykorzystaniem względnego wzrostu liczby komórek (RICC) lub względnego podwojenia populacji (RPD) (zob. wzory w dodatku 2), chyba że wykorzystuje się cytoB. Gdy wykorzystuje się cytoB cytotoksyczność można określić, wykorzystując wskaźnik replikacji (RI) (zob. wzór w dodatku 2).
24. Poddawanie działaniu substancji badanej hodowli z cytoB i pomiar względnych częstości występowania komórek jednojądrowych, dwujądrowych i wielojądrowych w hodowli składają się na metodę dokładnego ilościowego określania wpływu na proliferację komórek i działanie cytotoksyczne lub cytostatyczne substancji badanej (5) oraz zapewnia, że liczone są jedynie komórki, w których dokonał się podział podczas poddawania działaniu substancji badanej lub po nim.
25. W badaniach z cytoB cytostatyczność/cytotoksyczność można określić ilościowo na podstawie wskaźnika proliferacji blokera cytokinezy (CBPI) (5) (26) (56) lub można ją uzyskać z RI dla co najmniej 500 komórek na hodowlę (zob. wzory w dodatku 2). Gdy wykorzystuje się cytoB do oceny proliferacji komórek, należy określić CBPI lub RI na podstawie co najmniej 500 komórek na hodowlę. Pomiary te, między innymi, można wykorzystać do oszacowania cytotoksyczności przez porównanie wartości w hodowlach, które zostały poddane działaniu substancji badanej oraz w hodowlach kontrolnych. Ocena innych markerów cytotoksyczności (np. zrastanie się, liczba komórek, apoptoza, martwica, liczenie metafaz) może dostarczyć użytecznych informacji.
26. W badaniach bez cytoB należy wykazać, że w ocenianych komórkach w hodowli dokonał się podział podczas poddawania działaniu substancji badanej lub po nim, inaczej można otrzymać fałszywie ujemne reakcje. Wśród metod, które zostały wykorzystane dla zapewnienia, że oceniane są komórki po podziale, można wyliczyć włączenie i późniejsze wykrywanie bromodeoksyurydyny (BrdU) w celu identyfikacji odtworzonych komórek (57), tworzenie się klonów, gdy komórki z trwałych linii komórkowych są poddawane działaniu i oceniane in situ na szkiełku mikroskopowym (wskaźnik proliferacji (PI)) (25) (26) (27) (28) lub pomiar względnego podwojenia populacji (RPD) czy względnego wzrostu liczby komórek (RICC) lub inne sprawdzone metody (16) (56) (58) (59) (zob. wzory w dodatku 2). Ocena innych markerów cytotoksyczności lub cytostazy (np. zrastanie się, liczba komórek, apoptoza, martwica, liczenie metafaz) może dostarczyć użytecznych informacji.
27. Co najmniej trzy nadające się do analizy stężenia badanej substancji powinny zostać poddane ocenie. Aby to osiągnąć, konieczne może okazać się przeprowadzanie doświadczenia z wykorzystaniem większej liczby stężeń o niewielkiej rozpiętości pomiędzy nimi i przeanalizowanie powstawania mikrojąder w tych stężeniach, przy zapewnieniu odpowiedniego zakresu cytotoksyczności. Alternatywnym sposobem postępowania jest wstępne zbadanie cytotoksyczności w celu ograniczenia zakresu ostatecznych badań.
28. Najwyższe stężenie powinno mieć na celu spowodowanie 55 ± 5 % cytotoksyczności. Wyższe poziomy mogą powodować uszkodzenie chromosomu jako drugorzędny skutek cytotoksyczności (60). W przypadku gdy pojawia się cytotoksyczność, wybrane stężenia badanej substancji powinny obejmować zakres od stężenia powodującego 55 ± 5 % cytotoksyczności do stężenia wywołującego niewielką cytotoksyczność lub jej brak.
29. Jeżeli nie występuje ani cytotoksyczność, ani opad, najwyższe stężenie badanej substancji powinno odpowiadać 0,01 M, 5 mg/mL lub 5 μl/mL, w zależności od tego, które ze stężeń jest najniższe. Stężenia wybrane do analizy powinny w zasadzie być rozdzielone o nie więcej niż 10. W przypadku substancji badanych, które wykazują gwałtowny wzrost krzywej stężenie-reakcja, konieczne może okazać się zmniejszenie rozpiętości pomiędzy stężeniami substancji badanej, tak aby możliwa była również ocena hodowli o umiarkowanych i niskich zakresach toksyczności.
30. Gdy czynnikiem ograniczającym jest rozpuszczalność, maksymalnym stężeniem, jeśli nie jest ono ograniczone przez cytotoksyczność, powinno być najniższe stężenie, przy którym widoczny jest minimalny opad w hodowlach, pod warunkiem że nie istnieją żadne zakłócenia oceny. Oceny opadu należy dokonać za pomocą metod takich, jak mikroskopia świetlna, obserwując opad, który utrzymuje się lub pojawia podczas hodowli (pod koniec poddawania działaniu substancji badanej).
Kontrole
31. Równoległe kontrole pozytywne i kontrole z zastosowaniem rozpuszczalnika/nośnika zarówno z aktywacją metaboliczną, jak i bez niej powinny zostać uwzględnione w każdym doświadczeniu.
32. PC są potrzebne, aby wykazać zdolność komórek, a także protokołu badań, do rozpoznawania klastogenów i aneugenów oraz aby potwierdzić zdolność metaboliczną preparatu S9. PC powinna wykorzystywać znane czynniki wywołujące powstawanie mikrojąder w stężeniach, od których oczekuje się wytworzenia odtwarzalnego oraz wykrywalnego wzrostu poza tło, i wykazywać czułość systemu. Stężenia pozytywnych kontroli powinny zostać wybrane tak, aby skutki były jasne, ale by badającemu nie ujawniały bezpośrednio tożsamości zakodowanych szkiełek laboratoryjnych.
33. Klastogen, który wymaga aktywacji metabolicznej (np. cyklofosfamid; benzo[a]piren), powinien być wykorzystany, by wykazać zarówno wydolność metaboliczną, jak i zdolność systemu badania do wykrywania klastogenów. Można użyć innych PC, jeśli jest to uzasadnione. Jako że niektóre wymagające aktywacji metabolicznej PC mogą działać bez egzogenicznej aktywacji metabolicznej w pewnych warunkach poddawania działaniu substancji badanej lub w niektórych liniach komórkowych, potrzeba aktywacji metabolicznej i działalnie preparatu S9 powinny zostać zbadane w wybranej linii komórkowej i w wybranych stężeniach.
34. W chwili obecnej nie są znane anaugeny wymagające aktywacji metabolicznej dla ich działania genotoksycznego (16). Obecnie przyjęte PC w odniesieniu do działania aneugenicznego to, na przykład, kolchicyna i winblastyna. Inne substancje chemiczne mogą być wykorzystane, o ile powodują powstawanie mikrojąder wyłącznie lub przede wszystkim poprzez działanie aneugeniczne. Aby uniknąć konieczności stosowania dwóch PC (na klastogenność i aneugenność) bez aktywacji metabolicznej, kontrola aneugenności może służyć jako PC bez S9, a kontrola klastogenności może być stosowana do badania adekwatności stosowanego systemu aktywacji metabolicznej. PC zarówno na klastogenność, jak i aneugenność powinny być wykorzystywane w komórkach, które nie wymagają stosowania S9. Zalecane PC są zawarte w dodatku 3.
35. Wykorzystanie PC powiązanych z klasą chemiczną może być brane pod uwagę, jeżeli są dostępne odpowiednie substancje chemiczne. Wszystkie PC powinny być właściwe dla rodzaju komórki oraz warunków aktywacji.
36. Kontrole z zastosowaniem rozpuszczalnika/nośnika powinny zostać włączone w ramach każdego okresu pobierania hodowli. Ponadto NC niepoddane działaniu substancji badanej (brak rozpuszczalnika/nośnika) powinny być również wykorzystywane, chyba że istnieją opublikowane lub historyczne laboratoryjne dane dotyczące kontroli wykazujące, że wybrany rozpuszczalnik w zastosowanych stężeniach nie powoduje szkodliwych skutków.
PROCEDURA BADANIA
Harmonogram poddawania działaniu substancji
37. Aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo wykrycia aneugenu lub klastogenu oddziaływującego na określonym etapie cyklu komórkowego, ważne jest, by wystarczającą liczbę komórek poddać działaniu substancji badanej na wszystkich etapach ich cykli komórkowych. Harmonogram poddawania działaniu substancji linii komórkowych i hodowli komórek podstawowych różni się nieznacznie od harmonogramu stosowanego w odniesieniu do limfocytów, które wymagają stymulacji mitogenicznej do rozpoczęcia cyklu komórkowego i o których mowa w pkt 41-43 (16).
38. Teoretyczne rozważania wraz z opublikowanymi danymi (18) wskazują na to, że większość aneugenów i klastogenów wykrywa się na skutek poddawania działaniu substancji przez krótki okres czasu, od 3 do 6 godzin, w obecności S9 i przy jej braku, po czym usuwa się badaną substancję i pozostawia na okres wzrostu trwający 1,5-2,0 cykli komórkowych (6). Próbki komórek pobiera się w czasie równoważnym zwykłej (tj. takiej jak w momencie niepoddawania działaniu substancji) długości cyklu komórkowego pomnożonej przez 1,5-2,0 po rozpoczęciu lub na końcu poddawania działaniu substancji (zob. tabela 1). Okres pobierania próbek i odzyskiwania może zostać przedłużony, jeżeli wiadomo lub podejrzewa się, że substancja badana ma wpływ na szybkość cyklu komórek (np. gdy bada się nuklozydowe substancje analogiczne).
39. Ze względu na potencjalne działanie cytotoksyczne preparatu S9 na hodowane komórki ssaków, przedłużone narażenie na działanie substancji badanej o długości 1,5-2,0 zwykłych cykli komórkowych stosuje się tylko w nieobecności S9. W przypadku przedłużonego poddawania działaniu substancji istnieją możliwości poddawania komórek działaniu substancji badanej w obecności cytoB lub bez cytoB. Z tych opcji można korzystać w sytuacjach, w których może istnieć niepewność co do możliwych reakcji między substancją badaną a cytoB.
40. Proponowane harmonogramy poddawania komórek działaniu substancji przedstawiono w tabeli 1. Te ogólne harmonogramy poddawania działaniu substancji mogą ulec zmianie w zależności od stabilności i reaktywności substancji badanej lub określonych właściwości wzrostowych danych komórek. Poddawanie działaniu substancji należy rozpocząć i zakończyć w momencie wykładniczego wzrostu komórek. Harmonogramy te przedstawiono bardziej szczegółowo poniżej w pkt 41-47.
Tabela 1
Czas poddawania komórek działaniu substancji i czas pobierania hodowli w badaniu MNvit
| Limfocyty, komórki podstawowe i linie komórkowe poddane działaniu cytoB | + S9 | Poddawać działaniu przez 3-6 godzin w obecności S9; usunąć S9 oraz podłoże poddania działaniu; dodać świeże podłoże i cytoB; pobierać 1,5-2,0 zwykłych cykli komórkowych później. |
| - S9 Krótkie narażenie na działanie | Poddawać działaniu substancji przez 3-6 godzin; usunąć podłoże poddawania działaniu; dodać świeże podłoże i cytoB; pobierać 1,5-2,0 zwykłych cykli komórkowych później. | |
| - S9 Przedłużone narażenie na działanie | Wariant A: Poddawać działaniu substancji przez 1,5-2,0 zwykłych cykli komórkowych w obecności cytoB; pobierać pod koniec okresu narażenia. Wariant B: Poddawać działaniu substancji przez 1,5-2,0 zwykłych cykli komórkowych; usunąć substancję badaną; dodać świeże podłoże i cytoB; pobierać 1,5-2,0 zwykłych cykli komórkowych później. |
| Linie komórkowe poddawane działaniu substancji bez cytoB (identyczne z przedstawionymi powyżej harmonogramami poddawania działaniu substancji, z tym wyjątkiem, że nie zostało dodane cytoB) |
Limfocyty, komórki podstawowe i linie komórkowe poddane działaniu cytoB
41. Najbardziej skutecznym podejściem w odniesieniu do limfocytów jest rozpoczęcie narażenia na działanie substancji badanej na 44-48 godzin po stymulacji PHA, kiedy przestanie dochodzić do synchronizacji cykli (5). W badaniu początkowym komórki są poddawane działaniu substancji badanej przez 3 do 6 godzin w obecności S9 i przy jej braku. Usuwa się podłoże poddania działaniu i zastępuje świeżym podłożem zawierającym cytoB, a komórki są pobierane 1,5-2,0 zwykłych cykli komórkowych później.
42. Jeżeli obydwa początkowe badania polegające na krótkotrwałym (3-6 godzin) poddaniu działaniu substancji są negatywne lub niejednoznaczne, stosuje się przedłużone narażenie na działanie bez S9. Istnieją dwie opcje poddawania działaniu i obie są równie akceptowalne. Jednakże może okazać się bardziej stosowne stosowanie opcji A w odniesieniu do pobudzonych limfocytów, wówczas gdy wzrost wykładniczy może maleć w 96 godzin po stymulacji. Ponadto hodowle komórek, które nie osiągnęły stanu przegęszczenia w chwili końcowego pobierania prób w wariancie B.
- Wariant A: komórki są poddawane działaniu substancji badanej przez 1,5-2,0 zwykłych cykli komórkowych i pobierane po zakończeniu poddawania działaniu.
- Wariant B: komórki są poddawane działaniu substancji badanej przez 1,5-2,0 zwykłych cykli komórkowych. Podłoże poddania działaniu substancji jest usuwane i zastępowane świeżym podłożem, a komórki są pobierane po przeprowadzeniu dodatkowych 1,5-2,0 zwykłych cykli komórkowych.
43. Komórki podstawowe i linie komórkowe należy poddawać działaniu w sposób podobny do limfocytów, z wyjątkiem tego, że nie trzeba stymulować ich za pomocą PHA przez 44-48 godzin. Komórki inne niż limfocyty powinny być narażone na działanie w taki sposób, żeby pod koniec badania komórki nadal były w logarytmicznej fazie wzrostu.
Linie komórkowe bez cytoB
44. Komórki powinny być poddawane działaniu substancji przez 3-6 godzin w obecności S9 i przy jej braku. Usuwa się podłoże poddania działaniu i zastępuje świeżym podłożem, a komórki są pobierane 1,5-2,0 zwykłych cykli komórkowych później.
45. Jeżeli obydwa początkowe badania polegające na krótkotrwałym (3-6 godzin) poddaniu działania substancji są negatywne lub niejednoznaczne, stosuje się przedłużone narażenie na działanie (bez S9). Istnieją dwie opcje poddawania działaniu i obie są równie akceptowalne:
- Wariant A: komórki są poddawane działaniu substancji badanej przez 1,5-2,0 zwykłych cykli komórkowych i pobierane po zakończeniu poddawania działaniu.
- Wariant B: komórki są poddawane działaniu substancji badanej przez 1,5-2,0 zwykłych cykli komórkowych. Podłoże poddania działaniu substancji jest usuwane i zastępowane świeżym podłożem, a komórki są pobierane po przeprowadzeniu dodatkowych 1,5 - 2,0 zwykłych cykli komórkowych.
46. W monowarstwach mogą być obecne komórki mitotyczne (można je rozpoznać po okrągłym kształcie i fakcie, że oddzielają się od powierzchni) pod koniec 3-6 godzin poddawania działaniu substancji. Z uwagi na łatwość oddzielania się, komórki mitotyczne mogą zostać utracone w momencie, gdy usuwane jest podłoże zawierające badaną substancję. Należy zadbać o to, by zostały pobrane w momencie mycia hodowli i zwrócone do hodowli, aby uniknąć w momencie pobierania utraty komórek, które są w trakcie mitozy i w których może dochodzić do powstawania mikrojąder.
Liczba hodowli
47. Hodowle reprodukcyjne powinny być stosowane dla każdego stężenia substancji badanej oraz w odniesieniu do hodowli z wykorzystaniem rozpuszczalnika/nośnika oraz negatywnych hodowli kontrolnych. Gdy można wykazać minimalne zmiany między hodowlami reprodukcyjnymi na podstawie historycznych danych laboratoryjnych, dopuszczalne jest wykorzystanie pojedynczych hodowli. Jeżeli wykorzystywane są pojedyncze hodowle, zalecane jest zbadanie większej liczby stężeń.
Pobieranie komórek i przygotowywanie szkiełek mikroskopowych
48. Każdą kulturę pobiera się oddzielnie i oddzielnie poddaje działaniu substancji. Przygotowanie komórek może obejmować hipotoniczne przetwarzanie komórek, ale etap ten nie jest konieczny, jeśli komórki rozprowadzono odpowiednio w inny sposób. Można wykorzystać różne techniki do przygotowania szkiełka, pod warunkiem że uzyskuje się wysokiej jakości preparaty komórkowe do celów oceny. Cytoplazmę komórek należy zachować w celu umożliwienia wykrycia mikrojąder oraz (w metodzie z wykorzystaniem blokera cytokinezy) przeprowadzenia wiarygodnej identyfikacji komórek dwujądrowych.
49. Szkiełka można barwić przy użyciu różnych metod, takich jak Giemsa lub fluorescencyjne szczególne barwniki DNA (59). Wykorzystanie szczególnego barwnika DNA (np. oranż akrydynowy (61) lub Hoechst 33258 plus pyronina-Y (62)) może wyeliminować niektóre spośród artefaktów związanych z barwnikiem nienadającym się do szczególnego szczepu DNA. W celu określenia treści mikrojądra (chromosom/fragment chromosomu) można zastosować przeciwciała antykinetochorowe, FISH z wykorzystaniem pancentromerycznych sond DNA lub syntezę in situ przy udziale startera ze starterami szczególnymi dla pancentromerów, wraz z odpowiednim barwieniem kontrastowym DNA, jeżeli informacje dotyczące mechanizmu ich powstawania są przedmiotem zainteresowania (15) (16). Inne metody rozróżnienia między klastogenami i aneugenami mogą być wykorzystane, o ile okazały się skuteczne.
Analiza
50. Wszystkie szkiełka mikroskopowe, włącznie z tymi z rozpuszczalnikiem/nośnikiem i tymi dotyczącymi kontroli, powinny być niezależnie kodowane przed przeprowadzeniem analizy mikroskopowej. Alternatywnie, kodowane próbki mogą być analizowane przy pomocy zatwierdzonej automatycznej cytometrii przepływowej lub analizy obrazowej.
51. W hodowlach poddanych działaniu cytoB częstość powstawania mikrojąder powinna być analizowana w co najmniej 2 000 komórek dwujądrowych przypadających na stężenie (co najmniej 1 000 komórek dwujądrowych na hodowlę; dwie hodowle na stężenie). Jeżeli wykorzystywane są pojedyncze hodowle, przynajmniej 2 000 komórek dwujądrowych przypadających na stężenie powinno być oceniane z danej hodowli. Jeżeli dostępnych do celów oceny jest zasadniczo mniej niż 1 000 komórek dwujądrowych przypadających na hodowlę lub 2 000 w przypadku hodowli pojedynczej na każde stężenie oraz jeżeli nie wykryto znacznego wzrostu liczby mikro-jąder, należy powtórzyć badanie, stosując więcej komórek lub mniej toksyczne stężenia, w zależności od tego, co bardziej właściwe. Należy zwrócić uwagę, by nie oceniać komórek dwujądrowych o nieregularnych kształtach lub w przypadku, gdy dwa jądra różnią się znacznie pod względem wielkości; nie należy również mylić komórek dwujądrowych ze źle rozprowadzonymi komórkami wielojądrowymi. Komórki zawierające więcej niż dwa jądra główne nie powinny być analizowane pod kątem zawartości mikrojąder, ponieważ podstawowa częstość powstawania mikrojąder może być wyższa w tych komórkach (63) (64). Ocena komórek wielojądrowych jest dopuszczalna, jeżeli wykazano, że substancja badana zakłóca działanie cytoB.
52. W liniach komórkowych badanych bez poddawania działaniu cytoB mikrojądra powinny być oceniane w przynajmniej 2 000 komórkach dla każdego stężenia (przynajmniej 1 000 komórek na hodowlę; dwie hodowle na stężenie). W przypadku gdy jest stosowana tylko jedna hodowla na stężenie, przynajmniej 2 000 komórek powinno zostać ocenione z tej hodowli.
53. Gdy jest stosowane cytoB, należy określić CBPI lub RI, aby ocenić proliferację komórek (zob. dodatek 2), używając co najmniej 500 komórek na hodowlę. Jeśli poddawanie działaniu odbywa się przy nieobecności cytoB, konieczne jest uzyskanie dowodów, że oceniane komórki podległy proliferacji, jak omówiono w pkt 24-27.
Kryteria dopuszczalności
54. Laboratorium, w którym proponuje się wykonanie badania MNvit opisanego w niniejszej TM powinno wykazać, że jest w stanie w sposób wiarygodny i dokładny wykrywać substancje chemiczne o znanym działaniu aneugennym i klastogennym, z aktywacją metaboliczną i bez niej, jak również znane negatywne chemikalia, wykorzystując substancje chemiczne odniesienia wymienione w dodatku 3. Jako dowód zdolności do wykonania niniejszej TM prawidłowo laboratorium powinno przedstawić dane świadczące o tym, że komórki oceniane pod kątem tworzenia mikrojąder ukończyły jeden jądrowy podział, gdy badanie przeprowadza się bez użycia cytoB.
55. Chemikalia wymienione w dodatku 3 są zalecane do stosowania jako chemiczne substancje odniesienia. Można dodać zastępcze lub dodatkowe substancje chemiczne, jeśli ich działanie jest znane oraz jeśli powodują one powstawanie mikrojąder za pomocą takich samych mechanizmów działania, a także jeśli wykazano, że są odpowiednie dla chemikaliów, które będą badane przy wykorzystaniu procedury MNvit. Uzasadnienie mogłoby obejmować badanie walidacyjne z wykorzystaniem wielu różnorodnych substancji lub skoncentrowane na mniejszej ich liczbie na podstawie klasy chemicznej substancji badanej lub mechanizmu uszkadzania.
56. Kontrole z wykorzystaniem rozpuszczalnika/nośnika i niepoddane działaniu hodowle powinny dawać w rezultacie odtwarzalnie niską i stałą częstość powstawania mikrojąder (zazwyczaj 5-25 mikrojąder/1 000 komórek dla rodzajów komórek określonych w pkt 11). Inne rodzaje komórek mogą mieć różne zakresy reakcji, które należy ustalić podczas walidowania ich dla celów wykorzystania w badaniu MNvit. Należy wykorzystać dane z kontroli negatywnych, z wykorzystaniem rozpuszczalnika oraz kontroli pozytywnych w celu ustalenia historycznych zakresów kontroli. Wartości te należy wykorzystać do ustalenia adekwatności równoczesnych NC/PC dla celów eksperymentu.
57. Jeżeli proponuje się wprowadzenie nieznacznych zmian do badania (np. wykorzystanie automatycznych raczej niż ręcznych technik oceny, zastosowanie nowego rodzaju komórek), wówczas należy wykazać skuteczność zmiany, zanim zmieniony protokół zostanie uznany za możliwy do stosowania. Wykazanie skuteczności obejmuje udowodnienie, że można wykryć główne mechanizmy uszkadzania chromosomów oraz zyski lub straty oraz że odpowiednie pozytywne i negatywne wyniki można osiągnąć w odniesieniu do klasy danej substancji, lub wielu substancji, które mają być badane.
DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
Opracowanie wyników
58. Jeżeli zastosowano technikę z blokerem cytokinezy, do oceny mechanizmu indukcji mikrojąder stosowane są jedynie komórki dwujądrowe z mikrojądrami (niezależnie od liczby mikrojąder przypadających na komórkę). Ocena liczby komórek z jednym, dwoma lub większą liczbą mikrojąder może dostarczyć użytecznych informacji, ale nie jest obowiązkowa.
59. Należy określić równoczesne pomiary cytotoksyczności oraz/lub cytostazy w odniesieniu do wszystkich poddanych działaniu substancji hodowli oraz hodowli kontrolnych z wykorzystaniem rozpuszczalnika/nośnika (58). Należy obliczyć CBPI lub RI dla wszystkich poddanych działaniu substancji hodowli oraz hodowli kontrolnych w charakterze pomiaru opóźnienia cyklu komórkowego, kiedy stosowana jest metoda z blokerem cytokinezy. W przypadku braku cytoB powinny być zastosowane RPD lub RICC lub PI (zob. dodatek 2).
60. Należy dostarczyć dane dotyczące poszczególnych hodowli. Dodatkowo wszelkie dane powinny być podsumowane w formie tabelarycznej.
61. Substancje chemiczne powodujące w badaniu MNvit powstawanie mikrojąder mogą doprowadzać do niego na skutek tego, że powodują uszkodzenia chromosomów czy ich utratę lub na skutek połączenia tych dwóch zjawisk. Dalsze analizy z wykorzystaniem przeciwciał antykinetochorowych, sond szczególnych dla centromerów in situ lub innych metod mogą służyć do określania, czy mechanizm indukcji mikrojąder jest spowodowany działaniem klastogennym czy aneugennym.
Ocena i interpretacja wyników
62. Nie istnieje wymóg sprawdzania przez dodatkowe badanie wyraźnie pozytywnych lub negatywnych reakcji. Niejednoznaczne wyniki mogą być wyjaśniane w drodze analizy kolejnych 1 000 komórek z wszystkich hodowli, aby uniknąć strat związanych z utratą anonimowości próby. Jeśli takie podejście nie przesądzi o wyniku, należy przeprowadzić dalsze badania. Modyfikacja parametrów badawczych w celu poszerzenia zakresu ocenionych warunków powinna zostać rozważona w dalszych doświadczeniach, jeśli to stosowne. Parametry badawcze, które mogą być zmodyfikowane, obejmują zakres stężenia, terminy poddawania działaniu substancji i pobierania komórek i/lub warunki aktywacji metabolicznej.
63. Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak związany ze stężeniem wzrost lub statystycznie istotny wzrost w liczbie komórek zawierających mikrojądra. Biologiczne znaczenie wyników powinno zostać wzięte pod uwagę w pierwszej kolejności. Uwzględnienie, czy zaobserwowane wartości są w obrębie historycznych zakresów kontroli, czy też poza nimi może stanowić wskazówkę przy ocenie biologicznego znaczenia reakcji. Można wykorzystać odpowiednie metody statystyczne jako metody pomocnicze w przeprowadzaniu oceny wyników (65). Jednakże wyniki badań statystycznych powinny być oceniane w odniesieniu do zależności dawka-reakcja. Należy również wziąć pod uwagę odtwarzalność oraz dane historyczne.
64. Chociaż większość eksperymentów przyniesie wyraźnie pozytywne lub negatywne wyniki, w niektórych przypadkach uzyskane dane uniemożliwią dokonanie ostatecznego osądu o działaniu badanej substancji. Tego rodzaju niejednoznaczne lub sporne wyniki można uzyskiwać niezależnie od tego, ile razy powtarza się doświadczenie.
65. Wyniki pozytywne z badania MNvit wskazują, że substancja badana wywołuje uszkodzenia chromosomów lub ich utratę w hodowlanych komórkach ssaków. Wyniki negatywne wskazują, że w warunkach badawczych substancja badana nie wywołuje uszkodzeń w chromosomach i/lub zysków lub strat chromosomów w hodowlanych komórkach ssaków.
Sprawozdanie z badania
66. Sprawozdanie z badania powinno zawierać co najmniej następujące informacje, o ile są one istotne dla przebiegu badania:
Badana substancja chemiczna:
- dane identyfikacyjne i numer w rejestrze Chemical Abstract Services oraz numer WE,
- stan skupienia i czystość,
- właściwości fizykochemiczne istotne dla przeprowadzenia badania,
- reaktywność badanej substancji chemicznej w rozpuszczalniku/nośniku lub w hodowli komórkowej mediów.
Rozpuszczalnik/nośnik:
- uzasadnienie wyboru rozpuszczalnika/nośnika,
- rozpuszczalność oraz stabilność substancji badanej w rozpuszczalniku/nośniku.
Komórki:
- typ i źródło wykorzystywanych komórek,
- odpowiedniość wykorzystywanych komórek,
- nieobecność mykoplazmy, jeżeli ma zastosowanie,
- informacja dotycząca długości cyklu komórkowego, czasu podwojenia lub indeksu proliferacji,
- jeżeli stosuje się limfocyty, płeć, wiek, liczbę dawców krwi, jeśli ma to zastosowanie,
- jeżeli stosuje się limfocyty - informacja o tym, czy narażona jest krew pełna czy wydzielone limfocyty,
- liczba przejść, jeżeli ma zastosowanie,
- metoda utrzymania hodowli komórek, jeżeli ma zastosowanie,
- zmienna liczba chromosomów,
- zwykła (kontrola ujemna) długość cyklu komórkowego.
Warunki badania:
- dane identyfikacyjne substancji blokującej cytokinezę (np. cytoB), o ile jest wykorzystywana i jej stężenie oraz czas narażenia komórek,
- racjonalne uzasadnienie wyboru stężeń oraz liczby hodowli, w tym np. dane dotyczące cytotoksyczności oraz ograniczeń rozpuszczalności, jeżeli są dostępne,
- skład podłoża, stężenie CO2, jeżeli ma zastosowanie,
- stężenia substancji badanej,
- stężenia (i/lub objętość) nośnika oraz dodanej substancji badanej,
- temperatura i czas inkubacji,
- czas trwania poddania działaniu substancji,
- okres pobierania po poddaniu działaniu,
- gęstość komórki w czasie osadzania, jeżeli właściwe,
- rodzaj oraz skład systemu aktywacji metabolicznej, w tym kryteria dopuszczalności,
- substancje chemiczne kontroli pozytywnych i kontrole negatywne,
- metody przygotowania szkiełek mikroskopowych oraz stosowane techniki barwienia,
- kryteria identyfikacji mikrojąder,
- liczba poddanych analizie komórek,
- metody pomiaru cytotoksyczności,
- wszelkie dodatkowe informacje dotyczące cytotoksyczności,
- kryteria uznawania badań za pozytywne, negatywne lub niejednoznaczne,
- stosowana(-e) metoda (-y) analizy statystycznej,
- metody, takie jak wykorzystanie przeciwciał kinetochorowych, stosowane w celu określenia, czy mikrojądra zawierają całe lub rozdrobnione chromosomy, jeśli ma to zastosowanie.
Wyniki:
- zastosowany pomiar cytotoksyczności, np. CBPI lub RI w przypadku metody z wykorzystaniem blokera cytokinezy; RICC, RPD lub PI, gdy nie były wykorzystywane metody z wykorzystaniem blokera cytokinezy; inne uwagi w stosownych przypadkach, np. zrastanie się komórek, apoptoza, martwica, liczenie metafaz, częstotliwość występowania komórek dwujądrowych,
- oznaki strącania,
- dane dotyczące pH oraz osmolalności podłoża poddania działaniu substancji, jeżeli są określone,
- definicja komórek dopuszczalnych do celów analizy,
- dystrybucja jedno-, dwu- i wielojądrowych komórek, jeżeli stosowana jest metoda z wykorzystaniem blokera cytokinezy,
- liczba komórek z mikrojądrami, podana oddzielnie dla każdej hodowli poddanej działaniu substancji i hodowli kontrolnej, wraz z informacją, czy to z komórek jedno- czy dwujądrowych, w stosownych przypadkach,
- zależność stężenie-reakcja, o ile to możliwe,
- dane dotyczące substancji chemicznej stosowanej jako równoczesna negatywna (rozpuszczalnik/nośnik) oraz pozytywna kontrola (stężenia i rozpuszczalniki,
- historyczne dane dotyczące substancji chemicznej stosowanej jako równoczesna negatywna (rozpuszczalnik/ nośnik) oraz pozytywna kontrola, wraz z zakresami, średnimi oraz standardowymi odchyleniami i przedziałem ufności (np. 95 %),
- analiza statystyczna; wartości p, jeśli istnieją; Omówienie wyników
Wnioski
BIBLIOGRAFIA
(1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1-4.
(2) Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, 3-15.
(3) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, 233-246.
(4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167-172.
(5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), 1084-1104.
(6) Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, 193-198.
(7) Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, 34-43.
(8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, 9-20.
(9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with bioti-nylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, 297-302.
(10) Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, 329-334.
(11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic damage induced in human lympho-cytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, 205-213.
(12) Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, 519-525.
(13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, 9-20.
(14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, 233-245.
(15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, 211-219.
(16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153-163.
(17) OECD (1997), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paryż. Dostępny na stronie: [www.oecd.org/env/testguidelines]
(18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, 13-36.
(19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, 37-60.
(20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, 61-87.
(21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, 88-124.
(22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, 125-152.
(23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, 187-208.
(24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, 45-59.
(25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and Madle, S. (1998), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutation-sforschung, Mutation Res., 410, 81-116.
(26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells - comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, 183-190.
(27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. (1999), The application of the micro-nucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, 55-71.
(28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells - results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, 137-163.
(29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, 123-134.
(30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and Sofuni, T. (1999), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, 569-580.
(31) Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, 1-152.
(32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. 25. konferencja ESAC, 16-17 listopada, 2006 r., dostępny na stronie: [http://ecvam.jrc.it/index.htm]
(33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, dostępne na stronie: [http://ecvam.jrc.it/ index.htm]
(34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, 271-283.
(35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, 105-115.
(36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, 257-260.
(37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of humanderived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, 315-328.
(38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, 61-70.
(39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, 147-205.
(40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, 297-305.
(41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789-886.
(42) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, 29-36.
(43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, 11-18.
(44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen. 37, 31-45.
(45) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, 173-215.
(46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55-65.
(47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175-177.
(48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.
(49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51-59.
(50) UNEP (2001 r.), Konwencja Sztokholmska w sprawie trwałych zanieczyszczeń organicznych, Program Narodów Zjednoczonych ds. Ochrony Środowiska (UNEP). Dostępny na stronie: [http://www.pops.int/]
(51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, 247-274.
(52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. Nowy Jork, Plenum, pp. 91-103.
(53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, 795-801.
(54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, 35-44.
(55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, 103-112.
(56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to "Report from the in vitro micronucleus assay working group", Mutation Res., 564, 97-100.
(57) Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, 61-65.
(58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1-3.
(59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in wholeblood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169-184.
(60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191-201.
(61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241-247.
(62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269-275.
(63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241-247.
(64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65-75.
(65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. Nowy Jork, NY, pp. 463-467.
(66) Rozporządzenie (WE) nr 850/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 29 kwietnia 2004 r. dotyczące trwałych zanieczyszczeń organicznych i zmieniające dyrektywę 79/117/EWG, Dz.U. L 229 z 30.4.2004, s. 5.
Dodatek 1
Definicje
Aneugen: każda substancja lub proces, który poprzez reakcję z elementami mitotycznego i mejotycznego cyklu podziału komórek prowadzi do aneuploidii w komórkach lub organizmach.
Aneuploidia: wszelkie odchylenia od zwykłej diploidalnej (lub haploidalnej) liczby chromosomów w pojedynczym chromosomie lub w większej ich liczbie, ale nie w całym zestawie(-ach) chromosomów (poliploidalność).
Apoptoza: zaprogramowana śmierć komórki, na którą składa się szereg etapów prowadzących do rozpadu komórek w cząstki otoczone błoną, które są następnie eliminowane przez fagocytozę lub wydalanie.
Proliferacja komórek: wzrost liczby komórek powstały w wyniku mitotycznego podziału komórek.
Centromer: region DNA chromosomu, w którym obydwie chromatydy się łączą i do którego są przyczepione obydwa kinetochory, jeden obok drugiego.
Klastogen: każda substancja lub proces, który powoduje strukturalne aberracje chromosomalne w populacjach komórek lub organizmów.
Cytokineza: proces podziału komórki następujący bezpośrednio po mitozie, mający na celu utworzenie dwóch komórek potomnych, z których każda zawiera jedno jądro.
Wskaźnik proliferacji blokera cytokinezy (CBPI): odsetek komórek w trakcie drugiego podziału w populacji poddanej działaniu substancji w stosunku do hodowli kontrolnej niepoddawanej działaniu (zob. dodatek 2).
Cytostaza: hamowanie wzrostu komórek (zob. wzór w dodatku 2).
Cytotoksyczność: szkodliwe skutki dla struktury lub funkcji komórek, ostatecznie powodujące śmierć komórki.
Genotoksyczny: termin ogólny, obejmujący wszystkie rodzaje uszkodzeń DNA lub chromosomu, w tym przerwy, przegrupowania adduktów, mutacje, aberracje chromosomowe i aneuploidię. Nie wszystkie rodzaje skutków genotoksycznych powodują mutacje lub stałe uszkodzenia chromosomu.
Komórki w interfazie: komórki nie w fazie mitozy.
Kinetochor: struktura zawierająca białko na centromerze chromosomu, do której przyczepiają się włókna wrzeciona kariokinetycznego w trakcie podziału komórki, umożliwiając uporządkowane przemieszczanie się chromosomów potomnych do biegunów komórek potomnych.
Mikrojądra: małe jądra, oddzielone oraz występujące dodatkowo w stosunku do jądra głównego komórek, wytwarzane w trakcie telofazy mitozy lub mejozy przez opóźnione fragmenty chromosomów lub całe chromosomy.
Mitoza: podział jądra komórkowego, na który zazwyczaj składają się profaza, prometafaza, metafaza, anafaza i telofaza.
Indeks mitotyczny: stosunek komórek w metafazie podzielony przez całkowitą liczbę komórek zaobserwowanych w populacji komórek; wskazanie stopnia proliferacji komórek tej populacji.
Mutagenny: tworzy dziedziczne zmiany w sekwencji(-ach) pary zasad DNA w genach lub w strukturze chromosomów (aberracje chromosomowe).
Nondysjunkcja: nierozdzielenie się pary chromatyd i brak odpowiedniego ich rozdziału do komórek potomnych, w wyniku czego powstają komórki potomne z nieprawidłową liczbą chromosomów.
Poliploidalność: liczbowe aberracje chromosomowe w komórkach lub organizmach, obejmujące cały zestaw(-y) chromosomów, a nie pojedyncze chromosomy (aneuploidia).
Wskaźnik proliferacji (PI): metoda pomiaru cytotoksyczności, kiedy nie stosuje się cytoB (zob. wzór w dodatku 2).
Względny wzrost liczby komórek (RICC): metoda pomiaru cytotoksyczności, kiedy nie stosuje się cytoB (zob. wzór w dodatku 2).
Względne podwojenie populacji (RPD): metoda pomiaru cytotoksyczności, kiedy nie stosuje się cytoB (zob. wzór w dodatku 2).
Wskaźnik replikacji (RI): odsetek zakończonych cykli podziału komórkowego w hodowli poddanej działaniu substancji w stosunku do hodowli kontrolnej niepoddawanej działaniu, podczas okresu narażenia i odzysku (zob. wzór w dodatku 2).
Substancja badana (określana także jako badana substancja chemiczna): każda substancja lub mieszanina, badana za pomocą niniejszej TM.
Dodatek 2
Wzory do celów oceny cytotoksyczności
1. Kiedy stosuje się cytoB ocena cytotoksyczności powinna opierać się na wskaźniku proliferacji blokera cytokinezy (CBPI) lub wskaźniku replikacji (RI) (16) (58). CBPI określa średnią liczbę cykli komórkowych przypadających na komórkę w okresie narażenia na cytoB i może być wykorzystane do obliczenia proliferacji komórek. RI określa względną liczbę jąder w hodowlach poddawanych działaniu substancji w stosunku do hodowli kontrolnych i może być wykorzystane do obliczenia % cytostazy:
% cytostazy = 100 - 100{(CBPIT - 1) ÷ (CBPIC - 1)}
oraz
T = hodowla poddana działaniu substancji badanej
C = nośnik kultury kontrolnej
gdzie:
Dlatego też wartość CBPI równa 1 (wszystkie komórki są jednojądrowe) jest równoważna 100 % cytostazy.
Cytostaza = 100 - RI
T = hodowle poddawane działaniu substancji
C = hodowle kontrolne
2. Tym samym wartość RI równa 53 % oznacza, że w porównaniu do liczby komórek, które podzieliły się i utworzyły komórki dwu- i wielojądrowe w hodowli kontrolnej, jedynie 53 % tej liczby podzieliło się w hodowli poddanej działaniu, czyli cytostaza wynosi 47 %.
3. Kiedy nie stosuje się cytoB, zaleca się przeprowadzenie oceny cytotoksyczności w oparciu o względny wzrost liczby komórek (RICC) lub względne podwojenie populacji (RPD) (58), ponieważ oba te wskaźniki uwzględniają odsetek populacji komórek, które się podzieliły.
gdzie:
Podwojenie populacji = [log (liczby komórek po poddaniu działaniu ÷ początkowa liczba komórek)] ÷ log 2
4. Dlatego też RICC lub RPD równe 53 % oznacza 47 % cytotoksyczności/cytostazy.
5. Stosując wskaźnik proliferacji (PI), można dokonać oceny cytotoksyczności poprzez liczenie klonów składających się z 1 komórki (cl1), 2 komórek (cl2), 3 - 4 komórek (cl4) i 5 do 8 komórek (cl8)
6. PI został wykorzystany jako cenny i wiarygodny parametr cytotoksyczności również w przypadku linii komórkowych hodowanych in situ w nieobecności cytoB (25) (26) (27) (28).
Dodatek 3
Chemiczne substancje odniesienia zalecane dla oceny efektywności(1)
| Kategoria | Chemikalia | Nr CAS | Nr WE |
| 1. Klastogeny czynne bez aktywacji metabolicznej |
| Arabinozyd cytozyny | 147-94-4 | 205-705-9 | |
| Mitomycyna C | 50-07-7 | 200-008-6 |
| 2. Klastogeny wymagające aktywacji metabolicznej |
| Benzo(a)piren | 50-32-8 | 200-028-5 | |
| Cyklofosfamid | 50-18-0 | 200-015-4 |
| 3. Aneugeny |
| Kolchicyna | 64-86-8 | 200-598-5 | |
| Winblastyna | 143-67-9 | 205-606-0 |
| 4. Substancje negatywne |
| ftalan di(2-etyloheksylu) | 117-81-7 | 204-211-0 | |
| Kwas nalidyksowy | 389-08-2 | 206-864-7 | |
| Piren | 129-00-0 | 204-927-3 | |
| Chlorek sodu | 7647-14-5 | 231-598-3 |
| (1) Substancje chemiczne odniesienia są chemikaliami zalecanymi do stosowania. Zastąpienie lub dodanie substancji chemicznych do wykazu chemicznych substancji odniesienia może nastąpić, jeśli wiadomo, że ich działanie powoduje powstawanie mikrojąder w wyniku takich samych mechanizmów działania, i jeśli wykazano, że są odpowiednie dla chemikaliów, które będą badane przy wykorzystaniu procedury MNvit. W zależności od celu, uzasadnienie mogłoby obejmować badanie walidacyjne z wykorzystaniem wielu różnorodnych substancji lub skoncentrowane na mniejszej ich liczbie na podstawie klasy chemicznej substancji badanej lub mechanizmu uszkadzania. |
B.50. DZIAŁANIE UCZULAJĄCE NA SKÓRĘ: BADANIE LOKALNYCH WĘZŁÓW CHŁONNYCH DA
WSTĘP
1. Wytyczne OECD w odniesieniu do badania chemikaliów i metody badań UE są okresowo poddawane przeglądowi w związku z postępem naukowym, zmieniającymi się potrzebami regulacyjnymi oraz troską o dobrostan zwierząt. Pierwsza metoda badania (TM) (B.42) przy określaniu działania uczulającego na skórę u myszy - badanie lokalnych węzłów chłonnych (LLNA; wytyczna OECD 429 dotycząca badań) została poddana przeglądowi (1). Szczegóły walidacji LLNA i przegląd powiązanej bibliografii opublikowano w (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). W LLNA radioizotopy tymidyny lub jodyny są stosowane do pomiaru proliferacji limfocytów i w związku z tym badanie ma ograniczone zastosowanie w przypadku, gdy nabycie, zastosowania lub usuwanie promieniotwórczości jest problematyczne. Badanie LLNA: DA (opracowane przez Daicel Chemical Industries, Ltd.) jest niepromieniotwórczym wariantem badania LLNA, dzięki któremu, poprzez wykorzystanie bioluminescencji, udaje się dokonać pomiaru ilościowego zawartości adenozynotrifosforanu (ATP), służącego za wskaźnik proliferacji limfocytów. Badanie LLNA: DA zostało zatwierdzone i poddane przeglądowi oraz zalecone przez międzynarodowy panel ds. wzajemnych przeglądów jako przydatne do rozpoznawania chemikaliów uczulających skórę i jej nieuczulających, z pewnymi zastrzeżeniami (10) (11) (12) (13). Ta TM jest zaprojektowana dla celów oceny potencjału uczulenia skóry przez chemikalia (substancje i mieszaniny) u zwierząt. Rozdział B.6 niniejszego załącznika oraz wytyczna OECD dotycząca badań nr 406 wykorzystują badania na świnkach morskich, w szczególności test maksymalizacji na śwince morskiej oraz test Buehlera (14). Metoda LLNA (rozdział B.42 niniejszego załącznika; wytyczna OECD dotycząca badań nr 429) oraz jej dwa niepromieniotwórcze warianty: LLNA: DA (rozdział B.50 niniejszego załącznika; wytyczna OECD dotycząca badań nr 442 A) oraz LLNA: BrdU-ELISA (rozdział B.51 niniejszego załącznika; wytyczna OECD dotycząca badań nr 442 B) zapewniają bardziej ograniczone i udoskonalone wykorzystanie zwierząt w porównaniu z badaniami na świnkach morskich opisanymi w B.6 i w wytycznej OECD dotyczącej badań nr 406 (14).
2. Podobnie jak metoda LLNA, LLNA: DA bada fazę indukcyjną uczulenia skóry i dostarcza danych ilościowych odpowiednich dla dokonania oceny dawka-reakcja. Ponadto zdolność do wykrywania substancji działających uczulająco na skórę bez konieczności korzystania z izotopowego oznaczania DNA eliminuje możliwość narażenia zawodowego na działanie promieniotwórcze oraz kwestie związane z usuwaniem odpadów. To z kolei może pozwolić na zwiększone wykorzystanie myszy w celu wykrycia substancji działających uczulająco na skórę, co może doprowadzić do dalszego ograniczenia stosowania świnek morskich do badania odporności na działanie uczulające na skórę (tj. B6; wytyczna OECD dotycząca badań nr 406) (14).
DEFINICJE
3. Definicje są zamieszczone w dodatku 1.
ZAŁOŻENIA WSTĘPNE I OGRANICZENIA
4. LLNA: DA to zmodyfikowana metoda LLNA do wykrywania chemikaliów potencjalnie uczulających skórę, ze szczególnymi ograniczeniami. Nie oznacza to, że należy koniecznie we wszystkich przypadkach stosować LLNA: DA zamiast LLNA lub badań na śwince morskiej (tj. B.6; wytyczna OECD dotycząca badań nr 406) (14), a tylko, że badanie to ma tę samą wartość merytoryczną i może zostać zastosowane jako badanie alternatywne, którego pozytywne lub negatywne wyniki nie wymagają już dalszego potwierdzenia (10) (11). Laboratorium badawcze powinno uwzględnić wszystkie dostępne informacje na temat badanej substancji przed rozpoczęciem badań. Informacje te powinny obejmować tożsamość i budowę chemiczną badanej substancji; jej właściwości fizykochemiczne; wyniki innych badań toksyczności in vitro lub in vivo badanej substancji i dane toksykologiczne dotyczące strukturalnie pokrewnych substancji chemicznych. Należy uwzględnić te informacje przy określaniu, czy metoda LLNA: DA jest odpowiednia do badania danej substancji (z uwagi na niekompatybilność niektórych rodzajów chemikaliów z metodą LLNA DA [zob. pkt 5] oraz przy wyborze dawki.
5. Będąc metodą in vivo, LLNA: DA nie eliminuje wykorzystania zwierząt w określaniu alergicznego kontaktowego działania uczulającego. Może ona jednak ograniczyć stosowanie zwierząt do tego celu w porównaniu z badaniami na świnkach morskich (B.6; wytyczna OECD dotycząca badań nr 406) (14). Co więcej, LLNA oferuje znacznie bardziej wyrafinowany sposób wykorzystywania zwierząt (mniej bólu i cierpienia) do badania alergicznego kontaktowego działania uczulającego, gdyż w odróżnieniu od B.6 i wytycznej OECD dotyczącej badań nr 406 metoda DA nie wymaga wywoływania reakcji nadwrażliwości skóry poprzez prowokację. Pomimo zalet LLNA: DA i jej przewagi nad B.6 i wytyczną OECD dotyczącą badań nr 406 (14), istnieją pewne ograniczenia, które mogą spowodować konieczność wykorzystania B.6 lub wytycznej OECD dotyczącej badań nr 406 (np. badanie niektórych metali, fałszywe wyniki pozytywne w przypadku niektórych środków drażniących skórę [takich jak niektóre substancje powierzchniowo czynne] (6) (1 oraz rozdział B.42 w niniejszym załączniku), rozpuszczalność badanej substancji). Ponadto klasy chemiczne lub substancje zawierające grupy funkcjonalne, co do których wykazano, że działają jako potencjalne czynniki zakłócające (16), mogą wymagać użycia badań na świnkach morskich (tj. B.6; wytyczna OECD dotyczącej badań nr 406 (14)). Zalecono stosowanie ograniczeń wskazanych w LLNA (1 oraz rozdział B.42 w niniejszym załączniku) również w odniesieniu do LLNA: DA (10). Ponadto wykorzystanie LLNA: DA może okazać się nieodpowiednie w przypadku badania substancji, które wpływają na poziom ATP (np. substancji działających jako inhibitory ATP) lub tych, które wpływają na pomiar międzykomórkowego ATP (np. z uwagi na obecność enzymów rozkładających ATP, obecność międzykomórkowego ATP w węźle chłonnym). Oprócz tych zidentyfikowanych przypadków metoda LLNA: DA powinna być odpowiednia do badania wszelkich substancji, chyba że istnieją właściwości związane z tymi substancjami, które mogą wpływać na dokładność badania LLNA: DA. Ponadto należy uwzględnić możliwość otrzymania pozytywnych wyników granicznych gdy wartości wskaźnika stymulacji (SI) kształtują się pomiedzy 1,8 a 2,5 (zob. pkt 31-32). Opiera się to na bazie danych uzyskanej przy zatwierdzaniu 44 substancji z wykorzystaniem SI ≥ 1,8 (zob. pkt 6), gdzie za pomocą LLNA: DA poprawnie zidentyfikowano wszystkie 32 LLNA substancje uczulające, lecz niewłaściwie oznaczono trzy z 12 LLNA substancji nieuczulających o wartościach SI pomiędzy 1,8 i 2,5 (tj. graniczne wartości dodatnie) (10). Jednak w związku z tym, że ten sam zestaw danych był stosowany do ustalania wartości SI i obliczania przewidywalnych właściwości badania, przytoczone wyniki mogą być zawyżonym szacunkiem prawdziwych przewidywalnych właściwości.
ZASADA METODY BADANIA
6. Podstawową zasadą u podłoża LLNA: DA jest fakt, że czynniki uczulające wywołują proliferację limfocytów w węźle chłonnym odprowadzającym limfę z miejsca przyłożenia środka chemicznego. Ta proliferacja jest proporcjonalna do zastosowanej dawki oraz potencjału zastosowanego alergenu i jest prostym środkiem uzyskania ilościowego pomiaru uczulenia. Proliferacja jest mierzona przez porównanie średniej proliferacji w każdej badanej grupie do średniej proliferacji w grupie kontrolnej otrzymującej nośnik (VC). Określa się stosunek średniej proliferacji w każdej grupie poddanej działaniu środka do średniej proliferacji w równoległej grupie VC, który jest nazywany wskaźnikiem stymulacji (SI) i powinien wynosić ≥ 1,8 zanim substancja badana zostanie zaklasyfikowana jako potencjalny czynnik uczulający skórę. Procedury opisane w niniejszym dokumencie są oparte na wykorzystaniu pomiaru zawartości ATP na podstawie bioluminescencji (o której wiadomo, że jest zgodna z liczbą żywych komórek) (17) do wykrycia zwiększonej liczby rozmnażających się wegetatywnie komórek w odprowadzających usznych węzłach chłonnych (18) (19). Metoda z wykorzystaniem bioluminescencji posługuje się enzymem lucyferazy do katalizowania zjawiska powstawania światła z ATP i lucyferyny zgodnie z następującą reakcją:
Natężenie emitowanego światła jest liniowo powiązane ze stężeniem ATP i mierzy się je za pomocą luminometra. Badanie z wykorzystaniem lucyferyny-lucyferazy jest czułą metodą ilościowego pomiaru ATP wykorzystywaną w szerokim wachlarzu zastosowań (20).
OPIS BADANIA
Dobór gatunków zwierząt
7. Mysz jest gatunkiem preferowanym do tego badania. Badania walidacyjne dla LLNA: DA były przeprowadzane wyłącznie na szczepie CBA/J, który z tego względu uznaje się za szczep preferowany (12) (13). Wykorzystuje się młode dorosłe samice myszy, które są nieródkami i nie są w ciąży. Na początku doświadczenia samice powinny mieć 8-12 tygodni, a zróżnicowanie mas ciała poszczególnych zwierząt powinno być minimalne i nie przekraczać 20 % średniej masy ciała. Można ewentualnie wykorzystać inne szczepy i samce, jeżeli dysponuje się danymi świadczącymi o tym, że nie istnieją znaczące różnice w reakcji na LLNA: DA w zależności od szczepu i/lub płci.
Warunki w pomieszczeniach dla zwierząt i pożywienie
8. Myszy powinny być trzymane w grupach (21), chyba że istnieją odpowiednie naukowe przesłanki dla trzymania myszy pojedynczo. Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 22 ± 3 °C. Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50-60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin światła, 12 godzin ciemności. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej.
Przygotowanie zwierząt
9. Zwierzęta wybierane są losowo i znakowane w sposób umożliwiający indywidualną identyfikację (ale nie przez jakiekolwiek znaki na uszach) i trzymane w klatkach przez co najmniej pięć dni przed rozpoczęciem dawkowania w celu umożliwienia zaaklimatyzowania do warunków laboratoryjnych. Przed rozpoczęciem podawania bada się wszystkie zwierzęta w celu upewnienia się, że nie mają żadnych zauważalnych zmian skórnych.
Przygotowanie roztworów dozujących
10. Stałe substancje powinny zostać rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach oraz rozcieńczone, jeżeli jest to odpowiednie, przed zastosowaniem na uchu myszy. Chemikalia płynne można zastosować czyste lub rozcieńczone przed dawkowaniem. Chemikalia nierozpuszczalne, takie jak te najczęściej spotykane w wyrobach medycznych, należy poddać ekstrakcji w wyjątkowych warunkach w odpowiednim rozpuszczalniku w celu wykrycia wszystkich możliwych do wyekstrahowania składników do badania przed zastosowaniem na uchu myszy. Substancje badane należy przygotowywać codziennie, chyba że dane dotyczące stabilności wykazują dopuszczalność składowania.
Sprawdzenie wiarygodności
11. Pozytywne substancje kontrolne (PC) wykorzystuje się do wykazania właściwego działania badania poprzez ich reakcję z odpowiednią i powtarzalną czułością na badaną substancję uczulającą, dla której wielkość reakcji jest dobrze scharakteryzowana. Włączanie równoległej PC jest zalecane, ponieważ potwierdza się w ten sposób kompetencje laboratorium do skutecznego przeprowadzenia każdego badania i umożliwia dokonanie oceny odtwarzalności i porównywalności wewnątrz- i międzylaboratoryjnej. Niektóre organy regulacyjne mogą wymagać także PC dla każdego badania i w związku z tym zachęca się użytkowników do konsultacji z właściwymi organami przed rozpoczęciem LLNA: DA. Odpowiednio zaleca się rutynowe wykorzystywanie równoległej PC, aby uniknąć potrzeby dodatkowych badań na zwierzętach do spełnienia tych wymagań, które mogą powstać w związku ze stosowaniem okresowej PC (zob. pkt 12). PC powinna dać w teście LLNA: DA reakcję pozytywną na poziomie narażania, przy którym oczekuje się wzrostu wskaźnika stymulacji (SI) ≥ 1,8 większego niż w grupie kontroli negatywnej (NC). Dawkę PC należy dobrać w taki sposób, by nie powodować nadmiernego podrażnienia skóry lub ogólnoustrojowej toksyczności, a indukcja była powtarzalna, ale nie nadmierna (tj. SI > 10 byłyby uznane za zbyt wysokie). Preferowane PC to 25 % aldehyd cynamonowy heksylu (Chemical Abstracts Service [CAS] nr 101-86-0) i 25 % eugenol (numer CAS 97-53-0) w acetonie: oliwa z oliwek (w proporcji objętościowej 4:1 v/v). Mogą zaistnieć okoliczności, w których można użyć innych PC spełniających powyższe kryteria, pod warunkiem że istnieje po temu odpowiednie uzasadnienie.
12. Pomimo że zaleca się włączenie równoległej grupy PC, mogą zaistnieć sytuacje, w których okresowe badanie PC (tj. w odstępach nie dłuższych niż 6 miesięcy) może okazać się wystarczające w przypadku laboratoriów, które regularnie przeprowadzają badanie LLNA: DA (tj. przeprowadzają badanie LLNA: DA co najmniej raz na miesiąc) i dysponują wcześniejszymi danymi z pozytywnych kontroli, świadczącymi o tym, że laboratorium jest w stanie uzyskiwać odtwarzalne i dokładne wyniki w pozytywnych kontrolach. Można wykazać odpowiedni poziom biegłości w wykonywaniu badania LLNA: DA, uzyskując stałe pozytywne wyniki PC w co najmniej 10 niezależnych badaniach przeprowadzonych w rozsądnym terminie (tj. w okresie krótszym niż rok).
13. Należy zawsze włączać równoległą grupę PC, jeśli zachodzi proceduralna zmiana w LLNA: DA (np. zmiana przeszkolonego personelu, zmiany w metodzie badania materiałów i/lub odczynników, zmiany w metodzie badania urządzenia, zmiana źródła badanych zwierząt), a przedmiotowe zmiany powinny być udokumentowane w laboratoryjnych sprawozdaniach. Należy zwrócić uwagę na wpływ tych zmian na odpowiedniość ustalonych wcześniej danych przy określaniu konieczności zgromadzenia nowej bazy danych, aby udokumentować spójność wyników PC.
14. Badacze powinni być świadomi, że decyzja o przeprowadzeniu badania PC na zasadzie okresowej zamiast równolegle wywiera wpływ na odpowiedniość i akceptowalność negatywnych wyników badań uzyskanych bez równoległej PC w okresie pomiędzy każdym okresowym badaniem PC. Na przykład, jeżeli w okresowych PC uzyskany zostaje wynik fałszywie negatywny, negatywne wyniki substancji badanej uzyskane w okresie między ostatnim dopuszczalnym okresowym badaniem PC i niedopuszczalnym okresowym badaniem PC mogą być kwestionowane. Należy dokładnie rozważyć tego rodzaju skutki przy podejmowaniu decyzji, czy należy włączyć równoległą PC, czy tylko przeprowadzać PC na zasadzie okresowej. Należy również wziąć pod uwagę możliwość wykorzystania mniejszej liczby zwierząt w ramach grupy równoległej PC, jeżeli jest to naukowo uzasadnione oraz jeżeli laboratorium może wykazać, w oparciu o wcześniej zgromadzone dane, że można wykorzystać mniejszą liczbę myszy (22).
15. Chociaż substancja kontroli pozytywnej powinna być testowana w nośniku, o którym wiadomo, że wywołuje konsekwentną reakcję (np. aceton: oliwa z oliwek; w proporcji objętościowej 4:1, v/v), mogą jednak zaistnieć pewne sytuacje wynikające z przepisów, w których przetestowanie w niestandardowym nośniku (o formulacji odpowiedniej klinicznie/chemicznie) może być również konieczne (23). Jeżeli równoległa PC jest badana w innym nośniku niż substancja badana, wówczas należy włączyć oddzielną VC w odniesieniu do równoległej PC.
16. W przypadkach, gdy ocenia się substancje badane konkretnej klasy chemicznej lub zakres reakcji, substancje wzorcowe mogą być użyteczne, także aby wykazać, że metoda badawcza jest odpowiednia dla wykrywania potencjalnego działania uczulającego na skórę przez tego rodzaju substancje. Odpowiednie substancje wzorcowe powinny posiadać następujące właściwości:
- strukturalne i funkcjonalne podobieństwo do klasy badanej substancji,
- znane właściwości fizyczne i chemiczne,
- dane potwierdzające z LLNA: DA,
- dane potwierdzające z innych modeli zwierzęcych i/lub ludzkich.
PROCEDURA BADANIA
Liczba zwierząt i poziomy dawek
17. W każdej grupie badanej powinny być wykorzystane nie mniej niż cztery zwierzęta, z minimalną liczbą trzech stężeń substancji badanej oraz równoległą grupą NC otrzymującą jedynie nośnik substancji badanej i grupą kontrolną PC (równoległą lub najnowszą, na podstawie polityki laboratoryjnej, biorąc pod uwagę pkt 11-15). Należy rozważyć zbadanie wielu dawek PC, szczególnie gdy badanie PC jest prowadzone na zasadzie nieregularnej. Z wyjątkiem zastosowania substancji badanej, ze zwierzętami grup kontrolnych należy się obchodzić w sposób identyczny jak ze zwierzętami grup badanych.
18. Dobór dawek i wybór nośnika powinien być oparty na zaleceniach podanych w pozycjach (2) i (24) bibliografii. Kolejne dawki zazwyczaj wybiera się z odpowiedniego szeregu stężeń takich, jak 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Do wyboru szeregu stężeń należy dołączyć odpowiednie naukowe uzasadnienie. O ile są dostępne, należy uwzględnić wszystkie istniejące informacje toksykologiczne (np. o ostrej toksyczności i o podrażnieniu skóry) oraz o strukturalnych i fizykochemicznych właściwościach badanej substancji (i/lub substancji zbliżonych pod względem budowy) przy wyborze trzech kolejnych stężeń, tak aby najwyższe stężenie maksymalizowało narażenie, nie doprowadzając jednak do ogólnoustrojowej toksyczności i/lub nadmiernego miejscowego podrażnienia skóry (24) (25). W przypadku braku takich informacji może okazać się konieczne przeprowadzenie badania wstępnego (zob. pkt 21-24)
19. Nośnik nie powinien zakłócać wyniku badania lub wpływać na niego oraz powinien być wybrany na podstawie maksymalizowania rozpuszczalności w celu uzyskania najwyższego osiągalnego stężenia, dając jednocześnie możliwość uzyskania roztworu/zawiesiny nadającej się do podania substancji badanej. Zalecanymi nośnikami są aceton: oliwa z oliwek (w proporcji objętościowej 4:1 v/v), N,N-dimetyloformamid, metylo etylo keton, glikol propylenowy i sulfotlenek dimetylowy (6), ale mogą być użyte inne, jeśli przedstawi się wystarczające uzasadnienie naukowe. W niektórych sytuacjach może okazać się konieczne użycie, jako dodatkowej kontroli, rozpuszczalnika odpowiedniego ze względów klinicznych, lub postaci handlowej, w której badana substancja wprowadzana jest na rynek. Szczególną uwagę należy zwrócić na zapewnienie, aby substancje hydrofilne zostały włączone do systemu nośnika, który nawilża skórę i nie spływa z niej natychmiast, przez włączenie odpowiednich środków zwiększających rozpuszczalność (np. 1 % Pluronic ® L92). A zatem należy unikać roztworów całkowicie wodnych.
20. Przetwarzanie węzłów chłonnych z poszczególnych myszy umożliwia ocenę zmienności pomiędzy zwierzętami oraz statystyczne porównanie różnicy między substancją badaną i pomiarami grupy VC (zob. pkt 33). Ponadto dokonanie oceny możliwości obniżenia liczby myszy w grupie PC jest wykonalne jedynie wówczas, gdy gromadzone są dane dotyczące poszczególnych zwierząt (22). Co więcej, niektóre organy regulacyjne wymagają zbierania danych dotyczących poszczególnych zwierząt. Regularne gromadzenie danych dotyczących poszczególnych zwierząt stanowi o dobrostanie zwierząt dzięki temu, że unika się powielania badań, do którego dochodziłoby w przypadku, gdyby wyniki dotyczące substancji badanej pierwotnie zebrane w jeden sposób (np. poprzez połączenie danych dotyczących zwierząt) miały zostać rozpatrzone w późniejszym terminie przez organy regulacyjne zgodnie z innymi wymogami (np. w ramach danych dotyczących poszczególnych zwierząt).
Badanie wstępne
21. W przypadku braku informacji pozwalającej określić najwyższą dawkę, jaka ma zostać zbadana (zob. pkt 18), należy przeprowadzić badanie wstępne w celu określenia właściwego poziomu dawki do badania w metodzie LLNA: DA. Celem badania wstępnego jest opracowanie wytycznych dotyczących wyboru maksymalnej dawki, jaką należy stosować w głównym badaniu LLNA: DA, w przypadku gdy nie dysponuje się informacjami na temat stężenia powodującego toksyczność ogólnoustrojową (zob. pkt 24) i/lub nadmierne miejscowe podrażnienie skóry (zob. pkt 23). Maksymalny poziom badanej dawki powinien wynosić 100 % substancji badanej w przypadku cieczy lub maksymalne możliwe stężenie w przypadku ciał stałych lub zawiesin.
22. Badanie wstępne przeprowadza się w warunkach identycznych do tych, w jakich przeprowadza się główne badanie LLNA: DA, z tym że nie przeprowadza się oceny proliferacji węzła chłonnego oraz można wykorzystać mniejszą liczbę zwierząt w grupie badanej. Zaleca się jedno lub dwa zwierzęta w grupie badanej. Wszystkie myszy będą obserwowane codziennie pod kątem jakichkolwiek klinicznych oznak toksyczności ogólnoustrojowej lub miejscowego podrażnienia skóry w miejscu zastosowania. Masy ciała są rejestrowane przed badaniem i przed jego zakończeniem (dzień 8.). Obydwoje uszu każdej myszy bada się pod kątem wystąpienia rumienia i ocenia przy wykorzystaniu tabeli 1 (25). Pomiary grubości ucha są przeprowadzane przy wykorzystaniu grubościomierza (np. cyfrowych mikrometrów lub grubościomierza Peacock Dial) w dniu 1. (przed podaniem substancji), w dniu 3. (około 48 godzin następujących po podaniu pierwszej dawki) oraz w dniu 7. (24 godziny przed zakończeniem badania) i dniu 8. Ponadto w dniu 8. grubość ucha można określić za pomocą kolczykownicy do pomiaru masy, co powinno być przeprowadzone po uśmierceniu zwierząt w humanitarny sposób. Nadmierne miejscowe podrażnienie skóry jest sygnalizowane przez rumień o wyniku ≥ 3 i/lub zwiększenie grubości ucha o ≥ 25 % w dniu pomiaru (26) (27). Najwyższa dawka wybrana do głównego badania LLNA: DA to następna niższa dawka w szeregu stężeń badania wstępnego (zob. pkt 18), która nie wywołuje ogólnoustrojowej toksyczności i/lub nadmiernego miejscowego podrażnienia skóry.
Tabela 1
Ocena punktowa rumienia
| Objawy | Wynik |
| Brak rumienia | 0 |
| Bardzo lekki rumień (prawie niewidoczny) | 1 |
| Wyraźny rumień | 2 |
| Rumień umiarkowany do mocnego | 3 |
| Mocny rumień (czerwień przypominająca barwę mięsa czerwonego) do form obrzęku wykluczających klasyfikację rumienia | 4 |
23. Oprócz 25 % zwiększenia grubości ucha 26) (27), do zidentyfikowania substancji drażniących w metodzie LLNA wykorzystywano też statystycznie istotne zwiększenie grubości ucha u myszy badanych w porównaniu z myszami kontrolnymi (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). O ile jednak statystycznie znaczące zwiększenie może wystąpić przy grubości ucha mniejszej niż 25 %, to nie udało się go powiązać z nadmiernym podrażnieniem (30) (31) (32) (33) (34).
24. Następujące obserwacje kliniczne mogą wskazywać na toksyczność ogólnoustrojową (35), jeśli są wykorzystywane jako część zintegrowanej oceny i w związku z tym mogą określać maksymalne dawki do stosowania w LLNA: DA: zmiany w funkcjach układu nerwowego (np. piloerekcja, ataksja, drżenia, oraz konwulsje); zmiany w zachowaniu (na przykład agresja, zmiany w czyszczeniu, wyraźna zmiana w poziomie aktywności); zmiany w sposobie oddychania (np. zmiany w częstotliwości i intensywności oddychania, takie jak duszność, dyszenie oraz rzężenie), a także zmiany w konsumpcji żywności i wody. Ponadto w ocenie należy wziąć pod uwagę oznaki stanów zwiększonej senności i/lub brak reakcji oraz wszelkie objawy kliniczne sygnalizujące coś więcej niż chwilowy ból i cierpienie, lub > 5 % spadek masy ciała od dnia 1. do dnia 8. czy śmiertelność. Zwierzęta konające oraz zwierzęta wykazujące objawy silnego bólu i zagrożenia należy humanitarnie uśmiercić (36).
Harmonogram doświadczalny głównego badania
25. Harmonogram doświadczalny badania jest następujący:
- Dzień 1: Indywidualnie określić i odnotować wagę każdego zwierzęcia oraz wszelkie obserwacje kliniczne. Nałożyć 1 % roztworu wodnego dodecylo siarczanu sodu (SLS) na część grzbietową każdego ucha przy użyciu pędzla zanurzonego w roztworze SLS, tak aby cała grzbietowa część każdego ucha została pokryta za pomocą czterech do pięciu pociągnięć pędzla. Po godzinie od momentu podania SLS nakłada się 25 μl właściwego roztworu substancji badanej lub samego nośnika lub kontroli pozytywnej (równoległej lub najnowszej, na podstawie polityki laboratoryjnej, biorąc pod uwagę pkt 11-15), na część grzbietową każdego ucha.
- Dni 2, 3 i 7: Powtórzyć przeprowadzoną w dniu 1. procedurę wstępnego poddania działaniu 1 % wodnego roztworu SLS i nałożenia substancji badanej.
- Dni 4, 5 i 6: Bez podawania.
- Dzień 8: Zanotować wagę każdego zwierzęcia oraz wszelkie obserwacje kliniczne. Około 24 do 30 godzin po rozpoczęciu stosowania w dniu 7. należy uśmiercić zwierzęta w sposób humanitarny. Wyciąć uszne węzły chłonne z każdego ucha myszy i przetwarzać oddzielnie w roztworze chlorku sodu buforowanym fosforanami (PBS) dla każdego zwierzęcia. Informacje i schematy identyfikacji i rozbioru węzła chłonnego można znaleźć w pozycji (22). Do celów dalszego monitorowania miejscowych reakcji skóry w badaniu głównym, w protokole badania można uwzględnić dodatkowe parametry, takie jak punktacja rumienia ucha lub pomiar grubości ucha (zrobiony za pomocą grubościomierza lub za pomocą kolczykownicy do pomiaru masy w czasie sekcji).
Przygotowanie zawiesiny komórek
26. Przygotowuje się jednokomórkową zawiesinę z komórek węzła chłonnego (LNC) usuniętych obustronnie dla każdego zwierzęcia, przez umieszczenie węzłów chłonnych pomiędzy dwoma szkiełkami mikroskopowymi i zastosowanie lekkiego nacisku w celu rozdrobnienia węzłów. Po upewnieniu się, że tkanki zostały rozprowadzone cienką warstwą, należy rozdzielić oba szkiełka. Zawiesić tkanki z obu szkiełek w PBS, trzymając każde szkiełko pod kątem nad szalką Petriego i płucząc przy użyciu PBS i jednocześnie zeskrobując tkankę ze szkiełka skrobakiem do komórek. Ponadto węzły chłonne u zwierząt z grupy kontroli negatywnej są niewielkie, tak więc ostrożne działanie ma istotne znaczenie dla uniknięcia sztucznego wpływu na wartości SI. Do płukania szkiełek należy wykorzystać całkowitą objętość 1 mL PBS. Zawiesinę LNC w szalce Petriego należy homogenizować lekko za pomocą skrobaka do komórek. 20 μL alikwoty zawiesiny LNC zbiera się następnie za pomocą mikropipety, przy czym należy uważać aby nie zebrać widocznej dla oka membrany, a następnie miesza się z 1,98 mL PBS, tak aby otrzymać 2 mL próbki. Następnie przygotowuje się drugą 2 mL próbkę zgodnie z tą samą procedurą, tak aby przygotowane zostały dwie próbki dla każdego zwierzęcia.
Określenie proliferacji komórkowych (pomiar zawartości ATP limfocytów)
27. Wzrost zawartości ATP w węzłach chłonnych jest mierzony za pomocą metody lucyferyny-lucyferazy z zastosowaniem zestawu do pomiaru ATP, który mierzy bioluminescencję w umownych jednostkach luminescencyjnych (RLU). Czas badania od momentu uśmiercenia zwierząt do pomiaru zawartości ATP dla każdego osobnika powinien być jednolity, w ciągu około 30 minut, ponieważ uważa się, że zawartość ATP stopniowo maleje wraz z upływem czasu od momentu uśmiercenia zwierząt (12). Zatem serię procedur, poczynając od usunięcia usznych węzłów chłonnych aż do pomiaru ATP, należy zakończyć w ciągu 20 minut zgodnie z wcześniej ustalonym harmonogramem, takim samym dla każdego zwierzęcia. Pomiar luminescencji ATP należy przeprowadzić w każdej 2 mL próbce w taki sposób, aby w odniesieniu do każdego osobnika przeprowadzano łącznie dwa pomiary ATP. Ustala się wówczas średnią wartość luminescencji ATP i wykorzystuje ją w późniejszych obliczeniach (zob. pkt 30).
OBSERWACJE
Obserwacje kliniczne
28. Zwierzęta poddaje się starannej obserwacji klinicznej raz dziennie pod kątem jakichkolwiek oznak klinicznych, czy to miejscowego podrażnienia w miejscu zastosowania, czy też ogólnoustrojowej toksyczności. Wszystkie obserwacje kliniczne są systematycznie odnotowywane w postaci zapisów prowadzonych dla każdej myszy. Plany monitorowania powinny obejmować kryteria umożliwiające szybką identyfikację tych myszy, które wykazują oznaki toksyczności ogólnoustrojowej, nadmiernego miejscowego podrażnienia skóry lub żrącego działania na skórę, w celu eutanazji (36).
Masy ciała
29. Jak wskazano w pkt 25, indywidualne masy ciała określane są na początku badania i przy planowanym humanitarnym uśmierceniu zwierząt.
OBLICZANIE WYNIKÓW
30. Wyniki dla każdej grupy badanej są wyrażane jako średni SI. SI otrzymuje się przez podzielenie średniej wartości RLU/mysz w obrębie każdej grupy dawkowania substancji badanej oraz grupy PC przez średnią RLU/mysz obliczoną dla grupy rozpuszczalnika/VC. Średnie SI dla grup VC wynosi zatem jeden.
31. Proces decyzyjny uznaje wynik za pozytywny, gdy SI ≥ 1,8 (10). Jednakże siła reakcji na dawkę, znaczenie statystyczne i spójność reakcji rozpuszczalnik/nośnik i PC mogą również być stosowane przy ustalaniu, czy wynik graniczny (tj. wartość SI pomiędzy 1,8 a 2,5) można uznać za pozytywny (2) (3) (37).
32. W przypadku granicznego wyniku pozytywnego o wartości SI pomiędzy 1,8 i 2,5 użytkownicy mogą rozważyć dodatkowe informacje, takie jak relacja dawka-reakcja, oznaki toksyczności ogólnoustrojowej lub nadmiernego podrażnienia oraz, w stosownych przypadkach, istotność statystyczna wraz z wartościami SI w celu potwierdzenia, czy wyniki te są pozytywne (10). Należy również rozważyć różne własności substancji badanej, w tym rozważyć, czy jest ona strukturalnie pokrewna znanym czynnikom uczulającym, czy powoduje nadmierne podrażnienie skóry u myszy, oraz zaobserwowany charakter relacji dawka-reakcja. Te i inne względy omówione są szczegółowo gdzie indziej (4).
33. Gromadzenie danych dotyczących poszczególnych myszy umożliwi analizę statystyczną danych w odniesieniu do obecności i relacji dawka-reakcja. Ocena statystyczna może obejmować ocenę relacji między dawką a reakcją, jak również odpowiednio dostosowane porównania badanych grup (np. grupę badaną w parach w porównaniu z równoległą grupą kontrolną otrzymującą nośnik/rozpuszczalnik). Analizy statystyczne mogą obejmować np. regresję liniową lub badanie Williamsa w celu dokonania oceny tendencji w relacji między dawką a reakcją oraz badanie Dunnetta w odniesieniu do porównań par. Przy wyborze właściwej metody analizy statystycznej danych prowadzący badanie powinien zachować świadomość możliwej nierówności wariancji lub innych powiązanych problemów, które mogą spowodować konieczność transformacji danych lub przeprowadzenia nieparametrycznej analizy statystycznej. W każdym przypadku prowadzący badanie musi liczyć się z koniecznością przeprowadzenia obliczeń SI i analiz statystycznych z wykorzystaniem pewnych punktów danych i bez nich (tzw. "wartości odstające").
DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
Dane
34. Dane powinny być podsumowane w formie tabelarycznej pokazującej wartości RLU odnoszące się do poszczególnych zwierząt, średnie wartości RLU/zwierzę w danej grupie, związana wartość błędu (np. SD, SEM), oraz średnie SI dla każdej grupy badanej porównywane z równoległą grupą kontrolną z zastosowaniem rozpuszczalnika/nośnika.
Sprawozdanie z badań
35. Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:
Badane i kontrolne substancje chemiczne:
- numery identyfikujące (np. CAS lub WE, jeśli są dostępne); źródło: czystość; znane zanieczyszczenia; numer partii),
- cechy fizyczne i własności fizykochemiczne (np. lotność, stabilność, rozpuszczalność),
- jeżeli jest to mieszanina, skład i względne udziały procentowe składników.
Rozpuszczalnik/nośnik:
- dane identyfikacyjne (czystość; stężenie, tam gdzie stosowne; wykorzystane objętości),
- uzasadnienie wyboru nośnika.
Zwierzęta badane:
- źródło, z którego pochodzą myszy szczepu CBA,
- status mikrobiologiczny zwierząt, jeśli jest znany,
- liczba i wiek zwierząt,
- źródło pochodzenia zwierząt, warunki środowiska, pokarm itp.
Warunki badania:
- źródło, numer partii i dane producenta dotyczące zapewniania/kontroli jakości dla zestawu ATP,
- szczegóły przygotowania i stosowania substancji badanej,
- uzasadnienie doboru dawek (łącznie z wynikami z badania wstępnego, jeśli było przeprowadzane),
- nośnik i użyte stężenia substancji testowej oraz całkowita ilość zastosowanej substancji badanej,
- szczegóły dotyczące jakości pożywienia i wody (włączając w to rodzaj/źródło diety, źródło wody),
- szczegóły dotyczące poddania działaniu substancji oraz harmonogramów pobierania próbek,
- metody pomiaru toksyczności,
- kryteria uznawania badań za pozytywne lub negatywne,
- szczegóły dotyczące protokołu odchyleń i wyjaśnienie, w jaki sposób odchylenie ma wpływ na planowanie badań i ich wyniki.
Sprawdzenie wiarygodności:
- podsumowanie wyników ostatniego sprawdzenia wiarygodności badań, w tym informacji o wykorzystanej substancji badanej, stężeniach i nośniku,
- dane dotyczące równoległej lub wcześniejszej kontroli pozytywnej i dotyczące równoległej negatywnej (rozpuszczalnik/nośnik) kontroli z laboratorium testującego,
- jeżeli nie włączono równoległej grupy PC, data i sprawozdanie laboratoryjne z ostatniego okresowego PC i sprawozdanie wyszczególniające wcześniejsze dane dotyczące PC dla danego laboratorium, uzasadniające przyczyny dla których nie przeprowadzono PC równolegle.
Wyniki:
- masa poszczególnych myszy na początku dawkowania i przy planowanym uśmierceniu; jak również średnia i opis powiązanego błędu (np. SD, SEM) w odniesieniu do każdej grupy badanej,
- przebieg czasowy pojawienia się i oznaki toksyczności, w tym podrażnień skóry w miejscu podania, jeśli takie wystąpiły, u każdego zwierzęcia,
- godzina uśmiercenia i godzina pomiaru ATP dla każdego zwierzęcia,
- tabela wartości RLU dla poszczególnych myszy i wartości SI dla każdej grupy badanej,
- średni oraz powiązany okres błędu (np. SD, SEM) dla RLU/mysz dla każdej grupy badanej i wyniki analizy obserwacji nietypowych dla każdej grupy badanej,
- obliczone SI i właściwe pomiary zmienności, uwzględniające zmienność pomiędzy zwierzętami w odniesieniu do grup substancji badanej i grup kontrolnych,
- relacja dawka-reakcja,
- analizy statystyczne, tam gdzie stosowne.
Omówienie wyników:
- krótki komentarz do wyników, analiza zależności reakcji od dawki oraz w stosownych przypadkach, analizy statystyczne, z wnioskiem, czy substancja testowa powinna być uznana za czynnik uczulający skórę.
BIBLIOGRAFIA
(1) OECD (2010), Skin Sensitisation: Local Lymph Node Assay, Test Guideline No. 429, Guidelines for the Testing of Chemicals, OECD, Paryż. Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(2) Chamberlain, M. and Basketter, D.A. (1996), The local lymph node assay: status of validation. Food Chem, Toxicol., 34, 999-1002.
(3) Basketter, D.A., Gerberick, G.F., Kimber, I. and Loveless, S.E. (1996), The local lymph node assay: A viable alternative to currently accepted skin sensitisation tests. Food Chem, Toxicol., 34, 985-997.
(4) Basketter, D.A., Gerberick, G.F. and Kimber, I. (1998), Strategies for identifying false positive responses in predictive sensitisation tests. Food Chem. Toxicol., 36, 327-333.
(5) Van Och, F.M.M., Slob, W., De Jong, W.H., Vandebriel, R.J. and Van Loveren, H. (2000), A quantitative method for assessing the sensitising potency of low molecular weight chemicals using a local lymph node assay: employment of a regression method that includes determination of uncertainty margins. Toxicol., 146, 49-59.
(6) ICCVAM (1999), The murine local lymph node Assay: A test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals/compounds: The results of an independent peer review evaluation coordinated by the Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICETAM). NIH Publication No: 99-4494. Research Triangle Park, N.C. Dostępny na stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna/llnarep.pdf]
(7) Dean, J.H., Twerdok, L.E., Tice, R.R., Sailstad, D.M., Hattan, D.G., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: II. Conclusions and recommendations of an independent scientific peer review panel. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 258-273.
(8) Haneke, K.E., Tice, R.R., Carson, B.L., Margolin, B.H., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: III. Data analyses completed by the national toxicology program interagency center for the evaluation of alternative toxicological methods. Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 274-286.
(9) Sailstad, D.M., Hattan, D., Hill, R.N., Stokes, W.S. (2001), ICCVAM evaluation of the murine local lymph node assay: I. The ICCVAM review process.Reg. Toxicol. Pharmacol. 34, 249-257.
(10) ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report. Nonradioactive local lymph node assay: modified by Daicel Chemical Industries, Ltd., based on ATP content test method protocol (LLNA: DA). NIH Publication No. 10-7551 A/B. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostępny na stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/llna-DA/TMER.htm]
(11) ICCVAM (2009), Independent Scientific Peer Review Panel Report: Updated validation status of new versions and applications of the murine local lymph node assay: a test method for assessing the allergic contact dermatitis potential of chemicals and products. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostępny na stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/LLNAPRPRept2009.pdf].
(12) Idehara, K., Yamagishi, G., Yamashita, K. and Ito, M. (2008), Characterization and evaluation of a modified local lymph node assay using ATP content as a non-radio isotopic endpoint.J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 1-10.
(13) Omori, T., Idehara, K., Kojima, H., Sozu, T., Arima, K., Goto, H., Hanada, T., Ikarashi, Y., Inoda, T., Kanazawa, Y., Kosaka, T., Maki, E., Morimoto, T., Shinoda, S., Shinoda, N., Takeyoshi, M., Tanaka, M., Uratani, M., Usami, M., Yamanaka, A., Yoneda, T., Yoshimura, I. and Yuasa, A. (2008), Interlaboratory validation of the modified murine local lymph node assay based on adenosine triphosphate measurement. J. Pharmacol. Toxicol. Meth., 58, 11-26.
(14) OECD (1992), Skin Sensitisation, Test Guideline No. 406, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paryż. Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(15) Kreiling, R., Hollnagel, H.M., Hareng, L., Eigler, L., Lee, M.S., Griem, P., Dreessen, B., Kleber, M., Albrecht, A., Garcia, C. and Wendel, A. (2008), Comparison of the skin sensitising potential of unsaturated compounds as assessed by the murine local lymph node assay (LLNA) and the guinea pig maximization test (GPMT). Food Chem. Toxicol., 46, 1896-1904.
(16) Basketter, D., Ball, N., Cagen, S., Carrillo, J.C., Certa, H., Eigler, D., Garcia, C., Esch, H., Graham, C., Haux, C., Kreiling, R. and Mehling, A. (2009), Application of a weight of evidence approach to assessing discordant sensitisation datasets: implications for REACH. Reg. Toxicol. Pharmacol., 55, 90-96.
(17) Crouch, S.P., Kozlowski, R., Slater, K.J. and Fletcher J. (1993), The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Meth., 160, 81-88.
(18) Ishizaka, A., Tonooka, T. and Matsumoto, S. (1984), Evaluation of the proliferative response of lymphocytes by measurement of intracellular ATP. J. Immunol. Meth., 72, 127-132.
(19) Dexter, S.J., Cámara, M., Davies, M. and Shakesheff, K.M. (2003), Development of a bioluminescent ATP assay to quantify mammalian and bacterial cell number from a mixed population. Biomat., 24, 27-34.
(20) Lundin A. (2000), Use of firefly luciferase in ATP-related assays of biomass, enzymes, and metabolites. Meth. Enzymol., 305, 346-370.
(21) ILAR (1996), Institute of Laboratory Animal Research (ILAR) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 7th ed. Washington, DC: National Academies Press.
(22) ICCVAM (2009), Recommended Performance Standards: Murine Local Lymph Node Assay, NIH Publication Number 09-7357, Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Science. Dostępny na stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/immunotox_docs/llna-ps/LLNAPerfStds.pdf]
(23) McGarry, H.F. (2007), The murine local lymph node assay: regulatory and potency considerations under REACH. Toxicol., 238, 71-89.
(24) Kimber, I., Dearman, R.J., Scholes E.W. and Basketter, D.A. (1994), The local lymph node assay: developments and applications. Toxicol., 93, 13-31.
(25) OECD (2002), Acute Dermal Irritation/Corrosion, Test Guideline No. 404, Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paryż. Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(26) Reeder, M.K., Broomhead, Y.L., DiDonato, L. and DeGeorge, G.L. (2007), Use of an enhanced local lymph node assay to correctly classify irritants and false positive substances. Toxicologist, 96, 235.
(27) ICCVAM (2009), Nonradioactive Murine Local Lymph Node Assay: Flow Cytometry Test Method Protocol (LLNA: BrdU-FC) Revised Draft Background Review Document. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostępny na stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/immunotox/fcLLNA/BRDcomplete.pdf].
(28) Hayes, B.B., Gerber, P.C., Griffey, S.S. and Meade, B.J. (1998), Contact hypersensitivity to dicyclohexylcarbodiimide and diisopropylcarbodiimide in female B6C3F1 mice. Drug. Chem. Toxicol., 21, 195-206.
(29) Homey, B., von Schilling, C., Blumel, J., Schuppe, H.C., Ruzicka, T., Ahr, H.J., Lehmann, P. and Vohr, V.W. (1998), An integrated model for the differentiation of chemical-induced allergic and irritant skin reactions. Toxicol. Appl. Pharmacol., 153, 83-94.
(30) Woolhiser, M.R., Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1998), A combined murine local lymph node and irritancy assay to predict sensitisation and irritancy potential of chemicals. Toxicol. Meth., 8, 245-256.
(31) Hayes, B.B. and Meade, B.J. (1999), Contact sensitivity to selected acrylate compounds in B6C3F1 mice: relative potency, cross reactivity, and comparison of test methods. Drug Chem. Toxicol., 22, 491-506.
(32) Ehling, G., Hecht, M., Heusener, A., Huesler, J., Gamer, A.O., van Loveren, H., Maurer, T., Riecke, K., Ullmann, L., Ulrich, P., Vandebriel, R. and Vohr, H.W. (2005), A European inter-laboratory validation of alternative endpoints of the murine local lymph node assay: first round. Toxicol., 212, 60-68.
(33) Vohr, H.W. and Ahr, H.J. (2005), The local lymph node assay being too sensitive? Arch. Toxicol., 79, 721-728.
(34) Patterson, R.M., Noga, E. and Germolec, D. (2007), Lack of evidence for contact sensitisation by Pfiesteria extract. Environ. Health Perspect., 115, 1023-1028.
(35) ICCVAM (2009), Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC: National Institute of Environmental Health Sciences. Dostępny na stronie: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/Tox_workshop.htm]
(36) OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7, OECD, Paryż. Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(37) Kimber, I., Hilton, J., Dearman, R.J., Gerberick, G.F., Ryan, C.A., Basketter, D.A., Lea, L., House, R.V., Ladies, G.S., Loveless, S.E. and Hastings, K.L. (1998), Assessment of the skin sensitisation potential of topical medicaments using the local lymph node assay: An interlaboratory exercise. J. Toxicol. Environ. Health, 53, 563-79.
(38) OECD (2005), Guidance Document on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment, Environment, Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 34, ENV/JM/MONO (2005)14, OECD, Paryż. Dostępny na stronie: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
Dodatek 1
DEFINICJE
Dokładność: bliskość zgodności pomiędzy wynikami zastosowania metody badania a przyjętymi wartościami odniesienia. Jest to miara efektywności metody badania i jeden z aspektów jej istotności. Pojęcia tego często używa się zamiennie z pojęciem "zgodność" na oznaczenie odsetka prawidłowych wyników uzyskiwanych przy użyciu metody badania (38).
Substancja wzorcowa: uczulająca lub nieuczulajaca substancja wykorzystywana jako norma dla celów porównania z substancją badaną. Substancja wzorcowa powinna mieć następujące cechy: (i) stałe i wiarygodne źródło(-a); (ii) podobieństwo strukturalne i funkcjonalne do badanej klasy substancji; (iii) znane właściwości fizykochemiczne; (iv) dane potwierdzające występowanie znanych skutków; oraz (v) znany potencjał w zakresie pożądanych reakcji.
Fałszywy wynik negatywny: substancja, która w wyniku zastosowania metody badania została oznaczona niewłaściwie jako negatywna lub nieaktywna, podczas gdy w rzeczywistości jest pozytywna lub aktywna.
Fałszywy wynik pozytywny: substancja, która w wyniku zastosowania metody badania została oznaczona niewłaściwie jako pozytywna lub aktywna, podczas gdy w rzeczywistości jest negatywna lub nieaktywna.
Zagrożenie: możliwość wywierania negatywnego wpływu na zdrowie lub środowisko. Niekorzystny wpływ przejawia się tylko wtedy, gdy istnieje wystarczające narażenie.
Odtwarzalność międzylaboratoryjna: miernik zakresu, w jakim różne wykwalifikowane laboratoria, przy użyciu tego samego protokołu i testując tę samą badaną substancję, mogą przynieść jakościowo i ilościowo podobne wyniki. Odtwarzalność międzylaboratoryjna jest określana w procesach poprzedzających walidację i obejmujących walidację i wskazuje, w jakim stopniu badanie można z powodzeniem przekazywać między laboratoriami: nazywana jest również odtwarzalnością międzylaboratoryjną (38).
Odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna: ustalenie stopnia, w jakim wykwalifikowani pracownicy w tym samym laboratorium mogą z powodzeniem odtworzyć wyniki, stosując szczegółowy protokół w różnych momentach. Nazywana również odtwarzalnością laboratoryjną (38).
Wynik oddstający: wynik odstający jest obserwacją, która znacznie różni się od innych wartości w losowej próbce z populacji.
Zapewnienie jakości: proces zarządzania, w którym przestrzeganie norm i wymogów w zakresie badań laboratoryjnych, oraz procedur dotyczących dokumentacji i dokładności przekazywania danych, jest oceniane przez osoby niezależne od tych, które przeprowadzają badania.
Wiarygodność: miernik zakresu, w jakim metoda badania może zostać wykonana w sposób odtwarzalny w jednym laboratorium i pomiędzy laboratoriami w dłuższym okresie czasu, w przypadku jej wykonywania przy użyciu tego samego protokołu. Ocenia się ją poprzez obliczenie odtwarzalności wewnątrz- i międzylaboratoryjnej (38).
Działanie uczulające na skórę: proces immunologiczny, do którego dochodzi w przypadku, gdy osobnik wrażliwy jest narażony miejscowo na wywołujący uczulenie chemiczny alergen, powodujący immunologiczną reakcję skórną, co może prowadzić do uczulania przez kontakt ze skórą.
Wskaźnik stymulacji (SI): wartość obliczona dla oceny potencjalnego działania uczulającego na skórę przez substancję badaną, który wyraża się stosunkiem proliferacji w grupach poddanych działaniu środka do proliferacji w równoległej grupie kontrolnej nośnika.
Substancja badana (określana także jako badana substancja chemiczna): każda substancja lub mieszanina, badana za pomocą niniejszej TM.
B.51. DZIAŁANIE UCZULAJĄCE NA SKÓRĘ: BADANIE LOKALNYCH WĘZŁÓW CHŁONNYCH BRDUELISA
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.52. OSTRA TOKSYCZNOŚĆ INHALACYJNA - METODA KLAS OSTREJ TOKSYCZNOŚCI
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna dotyczącej badań wytycznej OECD nr 436 (2009). Dotyczącą badań ostrej toksyczności inhalacyjnej wytyczną nr 403 przyjęto po raz pierwszy w 1981 r., następnie jednak wprowadzano do niej zmiany (zob. rozdział B.2 niniejszego załącznika (1)). Opracowanie metody klas ostrej toksyczności dla toksyczności inhalacyjnej (2) (3) (4) uznano za właściwe po przyjęciu zmienionej metody klas ostrej toksyczności dla toksyczności doustnej (rozdział B.1 tris niniejszego załącznika) (5). Retrospektywna ocena działania badawczej metody klas ostrej toksyczności dla ostrej toksyczności inhalacyjnej wykazała, że metoda ta jest odpowiednia do zastosowania na potrzeby klasyfikacji i oznakowania (6). Badawcza metoda klas ostrej toksyczności dla toksyczności inhalacyjnej pozwoli na przeprowadzenie szeregu działań z zastosowaniem określonych stężeń docelowych w celu ustanowienia klasyfikacji toksyczności badanej substancji chemicznej. Jako kluczowy punkt końcowy stosuje się śmiertelność, jednak zwierzęta doświadczające silnego bólu lub stresu, cierpiące lub które nieuchronnie czeka zgon, należy w humanitarny sposób uśmiercić w celu zminimalizowania ich cierpienia. Wytyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego są dostępne w wytycznych OECD nr 19 (7).
2. Wytyczne dotyczące przeprowadzania i interpretacji wyników niniejszej metody badawczej można znaleźć w dotyczących badania ostrej toksyczności inhalacyjnej wytycznych nr 39 (GD 39) (8).
3. Definicje zastosowane w kontekście niniejszej metody badawczej przedstawiono w dodatku 1 oraz w GD 39 (8).
4. Niniejsza metoda badawcza umożliwia uzyskanie informacji na temat niebezpiecznych właściwości badanej substancji chemicznej oraz pozwala na jej ocenę i klasyfikację zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1272/2008 dotyczącym klasyfikacji substancji chemicznych powodujących ostrą toksyczność (9). Jeśli wymagana jest estymacja punktowa wartości LC50 lub analizy zależności stężenie-odpowiedź, odpowiednią metodą badawczą, jaką należy zastosować, jest metoda opisana w rozdziale B.2 niniejszego załącznika (1). Dalsze wytyczne dotyczące wyboru metody badawczej można znaleźć w GD 39 (8). Niniejsza metoda badawcza nie jest w szczególności przeznaczona do badania materiałów specjalnych, takich jak słabo rozpuszczalne materiały izometryczne lub włókniste czy też wytworzone nanomateriały.
ZAŁOŻENIA WSTĘPNE
5. Aby zminimalizować wykorzystanie zwierząt, przed rozważeniem wykonania badania według niniejszej metody badawczej laboratorium badawcze powinno wziąć pod uwagę wszystkie dostępne informacje na temat badanej substancji chemicznej, w tym wyniki istniejących badań, dzięki którym można byłoby uniknąć wykonywania dodatkowych badań. Informacje, które mogą być pomocne w doborze najbardziej odpowiedniego gatunku, szczepu, płci, sposobu narażenia oraz odpowiednich stężeń do badania obejmują nazwę, strukturę chemiczną i właściwości fizykochemiczne badanej substancji chemicznej; wyniki wszelkich badań toksyczności in vitro lub in vivo; spodziewane zastosowania i potencjalne narażenie ludzi; dostępne dane dotyczące (Q)SAR oraz dane toksykologiczne na temat strukturalnie powiązanych związków. Stężeń, w przypadku których przewiduje się, że powodują silny ból i stres z powodu swojego działania żrącego(1) lub silnie drażniącego, nie należy badać za pomocą niniejszej metody badawczej [zob. GD 39 (8)].
ZASADA BADANIA
6. Zasada niniejszego badania polega na uzyskaniu wystarczających informacji na temat ostrej toksyczności inhalacyjnej badanej substancji chemicznej za pomocą procedury sekwencyjnej podczas okresu narażenia trwającego 4 godziny, w celu umożliwienia jej klasyfikacji. Dla poszczególnych celów regulacyjnych mogą obowiązywać inne czasy trwania narażenia. Na każdym etapie badania z określonym stężeniem bada się 3 zwierzęta każdej płci. W zależności od upadkowości lub stanu agonalnego zwierząt do stwierdzenia ostrej toksyczności badanej substancji chemicznej mogą wystarczyć 2 etapy. Jeśli udowodniono, że jedna z płci jest bardziej podatna na działanie substancji, badanie można kontynuować z wykorzystaniem jedynie osobników takiej bardziej podatnej płci. Wynik poprzedniego etapu określi działania w ramach kolejnego etapu, na przykład:
a) dalsze badania nie są konieczne;
b) badanie trzech zwierząt każdej płci; lub
c) badanie z wykorzystaniem 6 zwierząt jedynie płci bardziej podatnej na działanie substancji, tj. szacunki niższych wartości granicznych klasy toksyczności należy oprzeć na badaniach z wykorzystaniem 6 zwierząt w każdej grupie otrzymującej określone stężenie, niezależnie od płci takich zwierząt.
7. Zwierzęta w stanie agonalnym lub zwierzęta wykazujące oczywiste oznaki bólu czy oznaki ostrego i przewlekłego stresu powinny zostać uśmiercone w humanitarny sposób i uwzględnione w interpretacji wyników badań w ten sam sposób, co zwierzęta padłe w trakcie badania. Kryteria podejmowania decyzji co do uśmiercenia zwierząt w stanie agonalnym lub cierpiących silny ból oraz wytyczne dotyczące rozpoznawania przewidywalnego lub nieuchronnie zbliżającego się zgonu zawarto w wytycznych OECD nr 19 dotyczących humanitarnego punktu końcowego (7).
OPIS METODY
Wybór gatunku zwierząt
8. Należy wykorzystać zdrowe, młode, dorosłe zwierzęta pochodzące ze szczepów powszechnie wykorzystywanych w laboratoriach. Preferowanym gatunkiem jest szczur, a w przypadku wykorzystania innego gatunku należy podać uzasadnienie.
Przygotowanie zwierząt
9. Samice powinny być nieródkami i nie mogą być w ciąży. W dniu narażenia zwierzęta powinny być młodymi dorosłymi osobnikami w wieku 8-12 tygodni, a ich masa ciała powinna mieścić się w zakresie ± 20 % średniej masy dla każdej płci zwierząt w tym samym wieku poddanych uprzednio narażeniu. Zwierzęta wybiera się losowo i oznacza w sposób umożliwiający identyfikację poszczególnych osobników. Zwierzęta przetrzymuje się w klatkach przez co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem badania, aby umożliwić ich aklimatyzację do warunków laboratoryjnych. Zwierzęta powinny również być przyzwyczajane do przyrządów używanych w badaniu przez krótki okres przed rozpoczęciem badania, ponieważ zmniejszy to ich stres spowodowany wprowadzeniem do nowego środowiska.
Hodowla zwierząt
10. Temperatura w pomieszczeniach, w których przetrzymuje się zwierzęta doświadczalne, powinna wynosić 22 ± 3 °C. Najlepiej byłoby, gdyby wilgotność względna była utrzymywana w przedziale 30-70 %, chociaż może to być niemożliwe w przypadku stosowania wody jako nośnika. Przed narażeniem i po nim zwierzęta na ogół należy trzymać w klatkach w grupach podzielonych według płci i badanego stężenia, lecz liczba zwierząt w klatce nie powinna przeszkadzać w dokładnej obserwacji każdego zwierzęcia, a także powinna umożliwiać zminimalizowanie strat w zwierzętach spowodowanych kanibalizmem i walkami. Jeżeli zwierzęta mają być poddane narażeniu tylko przez nos, konieczne może być przyzwyczajenie ich do rur unieruchamiających. Rury unieruchamiające nie powinny powodować u zwierząt nadmiernego stresu fizycznego, termicznego ani stresu związanego z unieruchomieniem. Unieruchomienie może wpłynąć na fizjologiczne punkty końcowe, takie jak temperatura ciała (hipertermia) lub minutowa pojemność oddechowa. Jeżeli dostępne są dane ogólne, na podstawie których można wykazać, że takie zmiany nie występują w znaczącym stopniu, uprzednia adaptacja do rur unieruchamiających nie jest konieczna. Zwierzęta, których cała powierzchnia ciała jest narażana na działanie aerozolu, w trakcie narażenia powinny być trzymane oddzielnie, aby zapobiec filtrowaniu badanego aerozolu przez futro innych zwierząt w tej samej klatce. Można stosować konwencjonalne oraz certyfikowane pasze laboratoryjne, z wyjątkiem okresów poddawania narażeniu, podczas których stosuje się nieograniczony dostęp do wody pitnej z miejscowej instalacji wodociągowej. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin światła, 12 godzin ciemności.
Komory inhalacyjne
11. Przy wyborze komory inhalacyjnej należy wziąć pod uwagę charakter badanej substancji chemicznej i cel badania. Preferowaną drogą narażenia jest narażenie tylko przez nos (pojęcie to obejmuje narażenie tylko głowy, narażenie tylko przez nos lub narażenie tylko pyska). Narażenie tylko przez nos jest na ogół preferowane w badaniach aerozoli ciekłych lub stałych oraz par, które mogą skraplać się, tworząc aerozole. Narażenie całego ciała może lepiej sprzyjać osiągnięciu szczególnych celów badania, taki wybór należy jednak uzasadnić w sprawozdaniu z badania. Aby zagwarantować stabilność atmosfery przy zastosowaniu komory do poddawania narażeniu całego ciała, całkowita objętość badanych zwierząt nie powinna przekraczać 5 % objętości komory. Zasady technik narażenia tylko przez nos i przez powierzchnię całego ciała oraz ich szczególne zalety i wady omówiono w GD 39 (8).
WARUNKI NARAŻENIA NA DZIAŁANIE SUBSTANCJI
Stosowanie stężeń
12. Zaleca się stosowanie stałego okresu poddania narażeniu trwającego cztery godziny, z wyjątkiem okresu wyrównywania stężeń. W przypadku konieczności spełnienia konkretnych wymogów można zastosować inne okresy trwania narażenia, należy to jednak uzasadnić w sprawozdaniu z badania [zob. GD 39 (8)]. Zwierzęta poddane działaniu aerozoli w komorach do poddawania narażeniu całego ciała należy przetrzymywać pojedynczo, aby zapobiec połykaniu badanej substancji chemicznej przy wylizywaniu innych zwierząt znajdujących się w tej samej klatce. W okresie narażenia na działanie substancji należy wstrzymać podawanie paszy. Podczas całego okresu poddawania narażeniu całego ciała można zapewnić dostęp do wody.
13. Zwierzęta są poddawane narażaniu na działanie badanej substancji chemicznej w formie gazu, pary, aerozolu lub mieszaniny tych postaci. Stan fizyczny, który ma być przedmiotem badania, zależy od właściwości fizykochemicznych badanej substancji chemicznej, wybranego stężenia lub formy fizycznej, która najprawdopodobniej będzie występować podczas postępowania z badaną substancją chemiczną i jej stosowania. Badane substancje chemiczne o charakterze higroskopijnym oraz reaktywne chemicznie należy badać w suchej atmosferze. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć osiągnięcia stężenia wybuchowego.
Rozkład wielkości cząstek
14. W odniesieniu do wszystkich aerozoli oraz par, które mogą skraplać się, tworząc aerozole, należy dokonać klasyfikacji cząstek według wielkości. W celu umożliwienia narażenia na działanie danej substancji wszystkich odpowiednich części dróg oddechowych zaleca się aerozole o średnicy aerodynamicznej mediany rozkładu masowego (MMAD) wynoszącej od 1 do 4 μm przy geometrycznym standardowym odchyleniu (σg) równym od 1,5 do 3,0 (8) (13) (14). Należy dołożyć uzasadnionych starań, aby spełnić tę normę, jednak w razie niemożności jej osiągnięcia należy przedstawić specjalistyczną opinię. Przykładowo pary metali mogą zawierać cząstki mniejsze niż przewiduje to norma, a cząstki naładowane, włókna i materiały higroskopijne (których rozmiar zwiększa się w wilgotnym środowisku układu oddechowego) mogą tę normę przekraczać.
Przygotowanie badanej substancji chemicznej w nośniku
15. Do uzyskania odpowiedniego stężenia i rozmiaru cząstek badanej substancji chemicznej w atmosferze można zastosować nośnik. Zasadniczo preferowanym nośnikiem powinna być woda. Materiały stałe można poddać obróbce mechanicznej w celu uzyskania wymaganego zróżnicowania wielkości cząstek, jednak należy zachować ostrożność, aby badana substancja chemiczna nie uległa rozkładowi ani zmianom. W przypadkach, w których można przypuszczać, że w wyniku procesów mechanicznych zmienił się skład badanej substancji chemicznej (np. w skrajnych temperaturach powstających na skutek tarcia przy nadmiernie intensywnym mieleniu), należy go zweryfikować metodami analitycznymi. Należy dołożyć odpowiednich starań, aby uniknąć zanieczyszczenia badanej substancji chemicznej. Nie ma potrzeby badania materiałów granulowanych niemających charakteru sypkiego, które są celowo przygotowywane tak, aby nie ulegały wdychaniu. Należy wykonać próbę na ścieranie w celu wykazania, że przy wykorzystywaniu materiału granulowanego nie powstają cząstki respirabilne. Jeżeli w wyniku próby na ścieranie powstaną cząstki respirabilne, należy wykonać badanie toksyczności inhalacyjnej.
Zwierzęta kontrolne
16. Wykorzystanie równoległej ujemnej (poddanej działaniu powietrza) grupy kontrolnej nie jest konieczne. W przypadku wykorzystania nośnika innego niż woda w celu wytworzenia atmosfery na potrzeby badania należy użyć grupy kontrolnej nośnika tylko wtedy, gdy brak jest dostępnych danych historycznych na temat toksyczności inhalacyjnej. Jeżeli badanie toksyczności dla badanej substancji chemicznej zmieszanej z nośnikiem nie wykaże toksyczności, wynika z tego, że dany nośnik jest nietoksyczny w badanych stężeniach, a zatem nie ma potrzeby tworzenia grupy kontrolnej nośnika.
MONITOROWANIE WARUNKÓW NARAŻENIA NA DZIAŁANIE SUBSTANCJI
Przepływ powietrza w komorze
17. Przepływ powietrza przez komorę należy starannie kontrolować i monitorować w sposób ciagły, jak również rejestrować podczas narażania na działanie substancji nie rzadziej niż co godzinę. Monitorowanie stężenia (lub stabilności) badanej substancji w atmosferze uzyskanej na potrzeby badania jest integralnym pomiarem wszystkich parametrów dynamicznych i umożliwia w sposób pośredni kontrolę wszystkich istotnych parametrów dynamicznych w zakresie wytwarzania atmosfery. Należy w szczególności uwzględnić kwestię zapobiegania ponownemu wdychaniu w komorach przeznaczonych do narażenia wyłącznie przez nos w przypadkach, gdy przepływ powietrza przez układ podawania substancji jest nieodpowiedni do zapewnienia dynamicznego przepływu powietrza zawierającego badaną substancję chemiczną. Istnieją zalecane metody, które można zastosować do wykazania, że w wybranych warunkach ponowne wdychanie nie zachodzi (8) (15). Stężenie tlenu powinno wynosić co najmniej 19 %, a stężenie dwutlenku węgla nie powinno przekraczać 1 %. Jeżeli istnieją powody, by przypuszczać, że norma ta nie może zostać osiągnięta, należy mierzyć stężenia tlenu i dwutlenku węgla.
Temperatura i wilgotność względna w komorze
18. W komorze należy utrzymywać temperaturę na poziomie 22 ± 3 °C. Wilgotność względną w strefie oddychania zwierząt - zarówno dla narażenia tylko przez nos, jak i dla narażenia całego ciała - należy monitorować i rejestrować co najmniej trzykrotnie podczas okresów poddawania działaniu substancji trwających do 4 godzin, a podczas okresów krótszych - co godzinę. Należy utrzymywać wilgotność względną w przedziale 30-70 %, choć może to być nieosiągalne (np. przy badaniu mieszanin opartych na wodzie) lub niemożliwe do zmierzenia w przypadku zakłócenia danej metody badawczej przez badaną substancję chemiczną.
Badana substancja chemiczna: stężenie nominalne
19. Tam, gdzie to możliwe, należy obliczyć i zarejestrować stężenie nominalne w komorze badawczej. Stężenie nominalne jest to masa wytworzonej badanej substancji chemicznej podzielona przez całkowitą objętość powietrza przepuszczonego przez system komory. Stężenie nominalne nie służy do charakteryzowania narażenia zwierząt, lecz porównanie stężenia nominalnego i stężenia rzeczywistego umożliwia określenie w przybliżeniu efektywności wytwarzania substancji badanej w układzie badawczym, a tym samym można je wykorzystać do wykrywania problemów związanych z takim wytwarzaniem.
Badana substancja chemiczna: stężenie rzeczywiste
20. Stężenie rzeczywiste jest to stężenie badanej substancji chemicznej w strefie oddychania zwierząt w komorze inhalacyjnej. Stężenie rzeczywiste można uzyskać za pomocą metod swoistych (np. bezpośredniego pobierania próbek, metod adsorpcji lub reakcji chemicznej, a następnie charakterystyki analitycznej) lub metod nieswoistych, takich jak analiza grawimetryczna przy zastosowaniu filtra. Zastosowanie metody grawimetrycznej jest akceptowalne tylko w przypadku aerozoli proszkowych zawierających jeden składnik lub aerozoli cieczy o niskiej lotności i należy wtedy przed badaniem wykonać odpowiednią, swoistą dla badanej substancji chemicznej charakterystykę. Za pomocą metody grawimetrycznej można również określić stężenie wieloskładnikowego aerozolu proszkowego. Do tego jednak konieczne są dane analityczne, za pomocą których można wykazać, że skład materiału znajdującego się w powietrzu jest podobny do składu materiału wyjściowego. W razie braku takich informacji może być konieczna ponowna analiza badanej substancji chemicznej (najlepiej znajdującej się w powietrzu) w toku badania, w regularnych odstępach czasowych. W przypadku środków w formie aerozoli, które mogą ulec odparowaniu lub sublimacji, należy wykazać, że stosując wybraną metodę, zebrano wszystkie fazy. W sprawozdaniu z badania należy podać stężenia docelowe, nominalne i rzeczywiste, ale w analizach statystycznych do wyliczenia wartości stężeń śmiertelnych uwzględnia się tylko stężenia rzeczywiste.
21. Jeżeli to możliwe, należy używać badanej substancji chemicznej pochodzącej z jednej partii, a badaną próbkę należy przechowywać w warunkach zapewniających jej czystość, jednorodność i stabilność. Przed rozpoczęciem badania należy scharakteryzować badaną substancję chemiczną, w tym określić jej czystość oraz, o ile jest to wykonalne z technicznego punktu widzenia, nazwę oraz ilości zidentyfikowanych domieszek i zanieczyszczeń. Można to wykazać, między innymi, za pomocą następujących danych: czasu retencji i względnej powierzchni sygnału, masy cząsteczkowej uzyskanej w drodze spektrometrii masowej lub chromatografii gazowej bądź innych oszacowań. Mimo że identyfikacja badanej próbki nie należy do obowiązków laboratorium badawczego, rozsądne może być potwierdzenie przez to laboratorium charakterystyki, którą przedstawił sponsor, przynajmniej w ograniczonym zakresie (np. co do koloru, cech fizycznych itp.).
22. Podczas narażenia należy utrzymywać możliwie niezmienną atmosferę i monitorować ją stale lub co pewien czas, w zależności od metody analitycznej. Jeżeli stosuje się pobieranie próbek co pewien czas, podczas czterogodzinnego badania należy pobierać próbki powietrza w komorze nie rzadziej niż dwa razy podczas badania. Jeżeli z powodu ograniczonej prędkości przepływu powietrza lub niskich stężeń jest to niemożliwe, można pobrać jedną próbkę na cały okres narażenia. W razie wystąpienia znacznych fluktuacji pomiędzy próbkami dla kolejnych badanych stężeń należy pobrać cztery próbki na okres narażenia. Wartości stężeń w komorze dla poszczególnych próbek nie powinny odbiegać od stężenia średniego w komorze o więcej niż ± 10 % w przypadku gazów i par oraz o więcej niż ± 20 % w przypadku aerozoli ciekłych lub stałych. Należy obliczyć i zapisać okres wyrównania stężeń w komorze (t95). Czas trwania narażenia obejmuje czas wprowadzania badanej substancji chemicznej do komory przy uwzględnieniu czasu potrzebnego do osiągnięcia t95. Wytyczne dotyczące szacowania t95 można znaleźć w GD 39 (8).
23. W przypadku bardzo złożonych mieszanin składających się z par/gazów i aerozoli (np. w przypadku atmosfer spalania i badanych substancji chemicznych wydzielanych ze specjalnych produktów/urządzeń do zastosowania końcowego) każda faza może zachowywać się inaczej w komorze inhalacyjnej, należy zatem wybrać co najmniej jedną substancję wskaźnikową (analit) z każdej fazy (para/gaz i aerozol) - zazwyczaj jest to główna substancja czynna mieszaniny. Jeżeli badana substancja chemiczna jest mieszaniną, należy podać stężenie analityczne w odniesieniu do całej mieszaniny, a nie tylko substancji czynnej lub składnika aktywnego (analitu). Dodatkowe informacje na temat stężeń rzeczywistych można znaleźć w GD 39 (8).
Badana substancja chemiczna: rozkład wielkości cząstek
24. Rozkład wielkości cząstek aerozoli należy określać co najmniej dwa razy podczas każdego czterogodzinnego okresu narażenia za pomocą impaktora kaskadowego lub innego instrumentu, takiego jak aerodynamiczny spektrometr pomiaru cząstek. Jeżeli można wykazać równoważność wyników uzyskanych za pośrednictwem impaktora kaskadowego lub innego instrumentu, to ten inny instrument może być stosowany przez cały okres badania. W celu potwierdzenia sprawności zatrzymywania cząstek przez instrument główny należy równolegle do tego instrumentu stosować drugie urządzenie, takie jak filtr grawimetryczny lub odpylacz/bełkotka. Stężenie masowe uzyskane na podstawie analizy wielkości cząstek powinno mieścić się w rozsądnych granicach stężenia masowego uzyskanego poprzez analizę filtrów [zob. GD 39 (8)]. Jeśli można wykazać równoważność w początkowej fazie badania, dalsze pomiary potwierdzające można pominąć. Ze względu na dobrostan zwierząt należy podjąć środki mające na celu zminimalizowanie ilości danych niejednoznacznych, które mogą prowadzić do konieczności powtórzenia narażenia. Klasyfikację cząstek według wielkości należy przeprowadzić w odniesieniu do par, jeżeli istnieje jakakolwiek możliwość tworzenia się aerozolu wskutek kondensacji par lub jeśli cząstki są wykrywane w atmosferze parowej mającej potencjał tworzenia faz mieszanych (zob. pkt 14).
PROCEDURA
Badanie główne
25. W każdym etapie wykorzystuje się trzy zwierzęta każdej płci lub sześć zwierząt płci bardziej podatnej na działanie substancji. Jeśli gatunki gryzoni inne niż szczury poddaje się narażeniu tylko przez nos, maksymalne okresy narażenia można dostosować, by zminimalizować charakterystyczny dla danego gatunku stres. Poziom stężenia do zastosowania w dawce wyjściowej wybiera się spośród jednego z czterech określonych poziomów i taki wyjściowy poziom stężenia powinien być poziomem, co do którego istnieje największe prawdopodobieństwo, że wywoła on toksyczność u niektórych ze zwierząt narażanych. Plany badania w przypadku gazów, par i aerozoli (przedstawione w dodatkach 2-4) przedstawiają badanie wartości granicznych dla kategorii z rozporządzenia CLP 1-4 (9) dla gazów (100, 500, 2 500, 20 000 ppm/4h) (dodatek 2), dla par (0,5; 2; 10; 20 mg/l/4h) (dodatek 3) i dla aerozoli (0,05; 0,5; 1; 5 mg/l/4h) (dodatek 4). Kategoria 5, której nie wdrożono rozporządzeniem (WE) nr 1272/2008 (9), dotyczy stężeń powyżej odpowiednich stężeń granicznych. Dla każdego stężenia wyjściowego stosuje się odpowiedni plan badania. W zależności od liczby zwierząt uśmierconych z powodów humanitarnych lub zwierząt padłych, procedurę badania przeprowadza się zgodnie ze wskazanymi strzałkami aż do etapu, na którym możliwe jest dokonanie kategoryzacji.
26. Odstępy czasowe między podawaniem dawek w każdej grupie poddawanej narażeniu określa się na podstawie czasu wystąpienia, długości trwania i cieżkości oznak toksyczności. Należy odwlec narażenie zwierząt przy kolejnym poziomie stężenia do momentu, gdy można w sposób uzasadniony uznać, że uprzednio badane zwierzęta przeżyły. Zaleca się przerwę długości trzech lub czterech dni między narażeniem z zastosowaniem kolejnych poziomów stężenia, w celu umożliwienia obserwacji opóźnionego działania toksycznego. Taki odstęp czasowy można odpowiednio dostosować, np. w przypadku niejednoznacznych reakcji.
Badanie graniczne
27. Badanie graniczne stosuje się wtedy, gdy badana substancja chemiczna jest znana lub można się spodziewać, że jest ona praktycznie nietoksyczna, tj. powoduje efekt toksyczny dopiero powyżej stężenia granicznego przewidzianego przepisami. Informacje na temat toksyczności badanej substancji chemicznej można uzyskać na podstawie wiedzy na temat podobnych zbadanych substancji lub podobnych mieszanin, z uwzględnieniem nazwy i zawartości procentowej składników, o których wiadomo, że mają znaczenie z punktu widzenia toksyczności. W sytuacji niewystarczającej ilości lub braku informacji na temat toksyczności badanej substancji chemicznej lub w przypadku gdy oczekuje się, że taka substancja jest toksyczna, należy przeprowadzić badanie główne [dalsze wytyczne można znaleźć w GD 39 (8)].
28. W ramach normalnej procedury narażeniu poddaje się trzy zwierzęta każdej płci, lub sześć zwierząt płci bardziej podatnej na działanie substancji, przy stężeniach na poziomie odpowiednio 20 000 ppm w przypadku gazów, 20 mg/l w przypadku pary i 5 mg/l w przypadku pyłów/mgieł (jeśli jest to osiągalne), co stanowi badanie graniczne w ramach niniejszej metody badawczej. Przy badaniu aerozoli celem podstawowym powinno być osiągnięcie cząstek o respirabilnych rozmiarach (np. średnica aerodynamiczna mediany rozkładu masowego (MMAD) na poziomie 1-4 μm). Jest to możliwe w przypadku większości badanych substancji chemicznych przy stężeniu 2 mg/l. Badanie aerozoli przy stężeniu większym niż 2 mg/l należy przeprowadzać tylko wtedy, jeśli można osiągnąć rozmiar cząstek umożliwiający ich wdychanie [zob. GD 39 (8)]. Zgodnie z GHS (16) w trosce o dobrostan zwierząt odradza się badania przy stężeniu wyższym niż stężenie graniczne. Badanie w ramach kategorii GHS 5 (16), która nie jest wdrażana rozporządzeniem (WE) nr 1272/2008 (9), należy brać pod uwagę tylko w przypadku znacznego prawdopodobieństwa, że wyniki takich badań przyniosą bezpośrednie korzyści dla ochrony zdrowia ludzi, a w sprawozdaniu z badania należy podać uzasadnienie. W przypadku badanych substancji chemicznych, które mogą spowodować wybuch, należy dołożyć starań w celu uniknięcia warunków sprzyjających wybuchowi. Aby uniknąć zbędnego wykorzystania zwierząt, należy przed badaniem granicznym przeprowadzić test próbny bez udziału zwierząt w celu upewnienia się, że warunki w komorze do przeprowadzenia badania granicznego są możliwe do osiągnięcia.
OBSERWACJE
29. Zwierzęta w trakcie okresu narażenia należy często poddawać obserwacji klinicznej. Po narażeniu należy prowadzić obserwacje kliniczne - w dniu narażenia co najmniej dwukrotnie, lub częściej, jeśli wskazuje na to reakcja zwierząt na poddawanie działaniu substancji, a po tym dniu co najmniej raz dziennie przez łącznie 14 dni. Długość okresu obserwacji nie jest określona, należy ją jednak ustalić na podstawie charakteru i czasu wystąpienia objawów klinicznych oraz długości okresu zdrowienia. Czas, w jakim pojawiają się i zanikają oznaki toksyczności, jest istotny, szczególnie w przypadku tendencji do występowania opóźnionych oznak toksyczności. Wszystkie obserwacje są systematycznie zapisywane w ewidencji prowadzonej osobno dla każdego zwierzęcia. Zwierzęta, u których stwierdzono stan agonalny, oraz zwierzęta wykazujące objawy silnego bólu lub stresu należy ze względu na ich dobrostan uśmiercić w sposób humanitarny. Przy badaniu pod kątem klinicznych oznak toksyczności należy zachować ostrożność, aby nie pomylić początkowego złego wyglądu i przejściowych zmian oddechowych, będących skutkiem procedury narażenia, ze skutkami związanymi z poddawaniem zwierząt działaniu badanej substancji chemicznej. Należy przestrzegać zasad i kryteriów streszczonych w wytycznych dotyczących humanitarnego punktu końcowego (7). W przypadku uśmiercenia zwierząt z przyczyn humanitarnych lub stwierdzenia ich zgonu należy możliwie najdokładniej zapisać czas zgonu.
30. Obserwacje zwierząt w klatkach powinny obejmować zmiany skóry i sierści, oczu i błon śluzowych; jak również zmiany w układzie oddechowym i układzie krążenia, zmiany w autonomicznym i ośrodkowym układzie nerwowym oraz zmiany w aktywności somatycznej i sposobie zachowania. O ile to możliwe, należy odnotować rozróżnienie pomiędzy skutkami miejscowymi i ogólnoustrojowymi. Szczególną uwagę należy poświęcić obserwacjom drżenia, konwulsji, ślinotoku, biegunki, letargu, snu i śpiączki. Pomiar temperatury w odbycie może dostarczyć dodatkowych dowodów potwierdzających odruchowe spowolnienie oddechu lub hipo-/hipertermię w związku z poddawaniem działaniu substancji lub przetrzymywaniem w zamknięciu.
Masa ciała
31. Należy odnotowywać masy ciała poszczególnych zwierząt: raz podczas okresu aklimatyzacji, w dniu narażenia przed narażeniem (dzień 0), oraz przynajmniej w dniach 1, 3 i 7 (a następnie co tydzień), jak również w momencie zgonu lub eutanazji, jeśli nastąpi ona później niż w dniu 1. Masę ciała uznaje się za krytyczny wskaźnik toksyczności, zatem zwierzęta wykazujące stały spadek wagi na poziomie ≥ 20 %, w porównaniu z wartościami przed badaniem, należy ściśle monitorować. Po zakończeniu okresu po narażeniu zwierzęta, które przeżyły, są ważone i humanitarnie uśmiercane.
Patologia
32. Wszystkie badane zwierzęta, w tym te, które padły podczas badań lub zostały poddane eutanazji i wyeliminowane z badań ze względu na ich dobrostan, należy poddać pełnemu rozpoznaniu histopatologicznemu. Jeżeli sekcji zwłok nie można przeprowadzić natychmiast po znalezieniu martwego zwierzęcia, zwierzę należy schłodzić (nie zamrozić) do temperatury wystarczająco niskiej do zminimalizowania autolizy. Sekcję zwłok należy przeprowadzić możliwie szybko, zwykle w ciągu jednego lub dwóch dni. W odniesieniu do każdego zwierzęcia należy odnotować wszystkie makroskopowe zmiany patologiczne ze szczególnym uwzględnieniem wszelkich zmian w drogach oddechowych.
33. Można rozważyć przeprowadzenie dodatkowych, uprzednio zaprojektowanych testów w celu zwiększenia wartości interpretacyjnej badania, np. pomiaru masy płuc u szczurów, które przeżyły, czy dostarczenia dowodów na podrażnienie poprzez badanie dróg oddechowych pod mikroskopem. Można również objąć badaniem organy wykazujące wyraźne zmiany patologiczne u zwierząt, które przeżyły 24 lub więcej godzin, oraz organy, co do których wiadomo lub można oczekiwać, że narażenie miało na nie wpływ. Z mikroskopowego badania całych dróg oddechowych można uzyskać użyteczne informacje na temat badanych substancji chemicznych, które reagują z wodą, takich jak kwasy i badane substancje chemiczne o właściwościach higroskopijnych.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Dane
34. Należy podać dane dotyczące masy ciała i wyników sekcji zwłok dotyczące poszczególnych zwierząt. Dane z obserwacji klinicznych należy zestawić w postaci tabeli, przedstawiając w odniesieniu do każdej badanej grupy liczbę wykorzystanych zwierząt, liczbę zwierząt wykazujących specyficzne oznaki toksyczności, liczbę zwierząt padłych w trakcie trwania badania lub uśmierconych z przyczyn humanitarnych, czas zgonu poszczególnych zwierząt, opis skutków toksycznych oraz ich przebieg w czasie i odwracalność, a także wyniki sekcji zwłok.
Sprawozdanie z badania
35. Sprawozdanie z badania powinno w stosownych przypadkach zawierać następujące informacje:
Badane zwierzęta i ich hodowla
- opis warunków przetrzymywania w klatkach, w tym: liczba (lub zmiana liczby) zwierząt na klatkę, ściółka, temperatura otoczenia i wilgotność względna, fotoperiod i określenie diety,
- wykorzystany gatunek/szczep oraz uzasadnienie zastosowania gatunków innych niż szczur,
- liczba, wiek i płeć zwierząt,
- metoda randomizacji,
- szczegółowe informacje na temat jakości pożywienia i wody (w tym rodzaj/źródło diety oraz źródło wody),
- opis wszelkich przygotowań przed badaniem, w tym diety, kwarantanny i leczenia chorób.
Badana substancja chemiczna
- cechy fizyczne, czystość oraz w stosownych przypadkach właściwości fizykochemiczne (w tym izomeryzacja),
- dane identyfikacyjne i numer w rejestrze Chemical Abstract Services (CAS), jeżeli jest znany.
Nośnik
- uzasadnienie zastosowania nośnika oraz uzasadnienie wyboru nośnika (jeżeli jest inny niż woda),
- dane historyczne lub równoległe wykazujące, że nośnik nie zakłóca wyniku badania.
Komora inhalacyjna
- szczegółowy opis komory inhalacyjnej, w tym jej rozmiary i objętość,
- źródło i opis wyposażenia wykorzystywanego do celów narażenia zwierząt, jak również do wytwarzania atmosfery,
- wyposażenie do pomiaru temperatury, wilgotności, wielkości cząstek i stężenia rzeczywistego,
- źródło powietrza, metoda oczyszczania dostarczanego/pobieranego powietrza oraz system klimatyzacji,
- metody kalibracji wyposażenia w celu zapewnienia jednorodnej atmosfery na potrzeby badania,
- różnica ciśnienia (dodatnia lub ujemna),
- porty narażenia w komorze (narażenie tylko przez nos); lokalizacja zwierząt w układzie (narażenie całego ciała),
- jednorodność/stabilność w czasie atmosfery na potrzeby badania,
- lokalizacja czujników temperatury i wilgotności oraz pobieranie próbek powietrza w komorze,
- natężenie przepływu powietrza, natężenie przepływu powietrza/port narażenia (narażenie tylko przez nos) lub ładunek zwierząt/komorę (narażenie całego ciała),
- informacje na temat wyposażenia stosowanego do pomiaru zawartości tlenu i dwutlenku węgla, w stosownych przypadkach,
- czas potrzebny do wyrównania stężeń w komorze inhalacyjnej (t95),
- liczba zmian objętości na godzinę,
- urządzenia pomiarowe (w stosownych przypadkach).
Dane ekspozycji
- uzasadnienie wyboru docelowego stężenia w badaniu głównym,
- stężenia nominalne (całkowita masa badanej substancji chemicznej wprowadzonej do komory inhalacyjnej podzielona przez objętość powietrza przepuszczonego przez komorę),
- rzeczywiste stężenia badanej substancji chemicznej w próbkach ze strefy oddychania zwierząt; w przypadku mieszanin, które tworzą heterogeniczne formy fizyczne (gazy, pary, aerozole), każdą substancję można analizować oddzielnie,
- wszystkie stężenia substancji w powietrzu należy podawać w jednostkach masy (np. mg/l, mg/m3 itp.), w nawiasie można podać również jednostki objętości (np. ppm, ppb itp.),
- rozkład wielkości cząstek, średnica aerodynamiczna mediany rozkładu masowego (MMAD) oraz geometryczne odchylenie standardowe (σg), w tym metody ich obliczania. Należy odnotować poszczególne analizy wielkości cząstek.
Warunki badania
- szczegółowe informacje na temat przygotowania badanej substancji chemicznej, w tym szczegóły dotyczące wszelkich procedur zastosowanych w celu zmniejszenia rozmiaru cząstek substancji stałych lub przygotowania roztworów badanej substancji chemicznej. W przypadkach gdy procesy mechaniczne mogły wpłynąć na zmianę składu badanej substancji chemicznej, należy zamieścić wyniki analiz mających na celu weryfikację składu badanej substancji chemicznej,
- opis (najlepiej wraz ze schematem) wyposażenia wykorzystywanego do wytworzenia atmosfery na potrzeby badania i narażania zwierząt na jej działanie,
- szczegółowe informacje na temat zastosowanej metody analizy chemicznej oraz walidacji metody (w tym wydajność odzysku badanej substancji chemicznej ze środka do pobierania próbek),
- uzasadnienie wyboru badanych stężeń.
Wyniki
- tabelaryczne zestawienie temperatury, wilgotności i przepływu powietrza w komorze,
- tabelaryczne zestawienie danych dotyczących nominalnego i rzeczywistego stężenia w komorze,
- tabelaryczne zestawienie danych dotyczących wielkości cząstek, w tym danych dotyczących gromadzenia próbek analitycznych, zróżnicowania wielkości cząstek oraz obliczenia średnicy aerodynamicznej mediany rozkładu masowego (MMAD) i σg,
- tabelaryczne zestawienie danych dotyczących reakcji i poziomu stężenia dla każdego zwierzęcia (tj. zwierząt wykazujących oznaki toksyczności, w tym śmiertelność, rodzaj, ostrość, czas pojawienia się i czas trwania objawów),
- masy ciała poszczególnych zwierząt zarejestrowane w trakcie badania, data i godzina zgonu, jeśli nastąpił przed planową eutanazją; przebieg w czasie oznak toksyczności i informacje, czy były one odwracalne w przypadku każdego zwierzęcia,
- wyniki sekcji zwłok oraz badań histopatologicznych w odniesieniu do każdego zwierzęcia, jeżeli są dostępne,
- klasyfikacja kategorii według rozporządzenia CLP oraz wartość graniczna LC50.
Omówienie i interpretacja wyników
- szczególny nacisk należy położyć na opis metod zastosowanych w celu spełnienia kryteriów niniejszej metody badawczej, np. dotyczących stężenia granicznego lub rozmiaru cząstek,
- należy uwzględnić respirabilność cząstek w świetle wyników ogólnych, szczególnie jeżeli nie można było spełnić kryterium wielkości cząstek,
- w ogólnej ocenie badania należy uwzględnić spójność metod zastosowanych w celu określenia nominalnego i rzeczywistego stężenia oraz relacji między stężeniem rzeczywistym a nominalnym,
- należy uwzględnić prawdopodobną przyczynę zgonu i dominujący sposób działania (ogólnoustrojowy w porównaniu z miejscowym),
- należy przedstawić wyjaśnienie, jeżeli zaistniała konieczność humanitarnego uśmiercenia zwierząt wykazujących oznaki bólu lub objawy ostrego i przewlekłego stresu, zgodnie z kryteriami zawartymi w wytycznych OECD dotyczących humanitarnego punktu końcowego (7).
BIBLIOGRAFIA:
(1) Rozdział B.2 niniejszego załącznika. Toksyczność ostra (inhalacyjna).
(2) Holzhütter HG, Genschow E, Diener W i Schlede E (2003). Dermal and Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric Evaluations for the Globally Harmonized Classification System. Arch. Toxicol. 77: 243-254.
(3) Diener W, Kayser D i Schlede E (1997). The Inhalation AcuteToxicClass Method; Test Procedures and Biometric Evaluations. Arch. Toxicol. 71: 537-549.
(4) Diener W i Schlede E (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to LD/LC50 Tests. ALTEX 1: 129-134.
(5) Rozdział B.1 tris niniejszego załącznika. Ostra toksyczność doustna - metoda klas ostrej toksyczności.
(6) OECD (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment nr 105, OECD, Paryż. Tekst dostępny pod adresem: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment nr 19.Tekst dostępny pod adresem: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(8) OECD (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment nr 39, OECD, Paryż. Tekst dostępny pod adresem: [http://www. oecd.org/env/testguidelines]
(9) Rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1272/2008 z dnia 16 grudnia 2008 r. w sprawie klasyfikacji, oznakowania i pakowania substancji i mieszanin, zmieniające i uchylające dyrektywy 67/548/EWG i 1999/45/WE oraz zmieniające rozporządzenie (WE) nr 1907/2006 (Dz.U. L 353 z 31.12.2008, s. 1).
(10) Rozdział B.40 niniejszego załącznika. Badanie niszczenia skóry metodą in vitro: test przezskórnego oporu elektrycznego (TER).
(11) Rozdział B.40 bis niniejszego załącznika. Badanie zniszczenia skóry metodą in vitro: badanie modelu skóry ludzkiej.
(12) OECD (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. OECD Guideline for testing of chemicals nr 435, OECD, Paryż. Tekst dostępny pod adresem: [http://www.oecd.org/env/testguidelines]
(13) Phalen RF (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques. (2 wydanie) Informa Healthcare, Nowy Jork.
(14) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, Society of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests. Fund. Appl. Toxicol. 18: 321-327.
(15) Pauluhn J i Thiel A (2007). A Simple Approach to Validation of DirectedFlow NoseOnly Inhalation Chambers. J. Appl. Toxicol. 27: 160-167
(16) ONZ (2007), Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS) ONZ, ST/SG/ AC.10/30, ONZ Nowy Jork i Genewa. Tekst dostępny pod adresem: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_welcome_e.html]
______
(1) Do oceny działania żrącego można wykorzystać ocenę specjalistyczną opartą na takich dowodach, jak: wyniki badań z udziałem ludzi lub zwierząt, istniejące dane (in vitro), np. rozdział B.40 (10), B.40 bis (11) niniejszego załącznika lub wytyczna OECD TG 435 (12), wartości pH, informacje dotyczące podobnych substancji chemicznych lub inne istotne dane.
Dodatek 1
DEFINICJA
Badana substancja chemiczna: jakakolwiek substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.
Dodatek 2
Procedura, jaką należy zastosować przy każdym z wyjściowych stężeń w przypadku gazów (ppm/4h)
Uwagi ogólne(1)
Dla każdego stężenia wyjściowego odpowiednie plany badań zawarte w niniejszym dodatku przedstawiają procedurę, jaką należy zastosować.
Dodatek 2a: Stężenie wyjściowe wynosi 100 ppm
Dodatek 2b: Stężenie wyjściowe wynosi 500 ppm
Dodatek 2c: Stężenie wyjściowe wynosi 2 500 ppm
Dodatek 2d: Stężenie wyjściowe wynosi 20 000 ppm
W zależności od liczby zwierząt uśmierconych z powodów humanitarnych lub zwierząt padłych procedurę badania przeprowadza się zgodnie ze wskazanymi strzałkami.
______
(1) Poniższe tabele odnoszą się do Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS). Jego odpowiednikiem na poziomie UE jest rozporządzenie (WE) nr 1272/2008. W przypadku ostrej toksyczności inhalacyjnej rozporządzenie (WE) nr 1272/2008 (9) nie wdraża kategorii 5.
Dodatek 2a
Acute Inhalation Toxicity:
Test Procedure with a starting concentration of 100 ppm/4 h for gases
Dodatek 2b
Acute Inhalation Toxicity:
Test Procedure with a starting concentration of 500 ppm/4h for gases
Dodatek 2c
Acute Inhalation Toxicity:
Test Procedure with a starting concentration of 2 500 ppm/4h for gases
Dodatek 2d
Acute Inhalation Toxicity: Test
Procedure with a starting concentration of 20 000 ppm/4h for gases
Dodatek 3
Procedura, jaką należy zastosować przy każdym z wyjściowych stężeń w przypadku par (mg/l/4h)
Uwagi ogólne(1)
Dla każdego stężenia wyjściowego odpowiednie plany badań zawarte w niniejszym dodatku przedstawiają procedurę, jaką należy zastosować.
Dodatek 3a: Stężenie wyjściowe wynosi 0,5 mg/l
Dodatek 3b: Stężenie wyjściowe wynosi 2,0 mg/l
Dodatek 3c: Stężenie wyjściowe wynosi 10 mg/l
Dodatek 3d: Stężenie wyjściowe wynosi 20 mg/l
W zależności od liczby zwierząt uśmierconych z powodów humanitarnych lub zwierząt padłych procedurę badania przeprowadza się zgodnie ze wskazanymi strzałkami.
______
(1) Poniższe tabele odnoszą się do Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS). Jego odpowiednikiem na poziomie UE jest rozporządzenie (WE) nr 1272/2008. W przypadku ostrej toksyczności inhalacyjnej rozporządzenie (WE) nr 1272/2008 (9) nie wdraża kategorii 5.
Dodatek 3a
Acute Inhalation Toxicity:
Test procedure with a starting concentration of 0.5 mg/L/4h for vapours
Dodatek 3b
Acute Inhalation Toxicity:
Test procedure with a starting concentration of 2 mg/L/4h for vapours
Dodatek 3c
Acute Inhalation Toxicity:
Test procedure with a starting concentration of 10 mg/L/4h for vapours
Dodatek 3d
Acute Inhalation Toxicity:
Test procedure with a starting concentration of 20 mg/L/4h for vapours
Dodatek 4
Procedura, jaką należy zastosować przy każdym z wyjściowych stężeń w przypadku aerozoli (mg/l/4h)
Uwagi ogólne(1)
Dla każdego stężenia wyjściowego odpowiednie plany badań zawarte w niniejszym dodatku przedstawiają procedurę, jaką należy zastosować.
Dodatek 4a: Stężenie wyjściowe wynosi 0,05 mg/l
Dodatek 4b: Stężenie wyjściowe wynosi 0,5 mg/l
Dodatek 4c: Stężenie wyjściowe wynosi 1 mg/l
Dodatek 4d: Stężenie wyjściowe wynosi 5 mg/l
W zależności od liczby zwierząt uśmierconych w sposób humanitarny lub martwych zwierząt procedura badań przebiega zgodnie z kierunkiem wyznaczanym przez strzałki.
______
(1) Poniższe tabele odnoszą się do Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS). Jego odpowiednikiem na poziomie UE jest rozporządzenie (WE) nr 1272/2008. W przypadku ostrej toksyczności inhalacyjnej rozporządzenie (WE) nr 1272/2008 (9) nie wdraża kategorii 5.
Dodatek 4a
Acute Inhalation Toxicity:
Test procedure with a starting concentration of 0.05 mg/L/4h for vapours
Dodatek 4b
Acute Inhalation Toxicity:
Test procedure with a starting concentration of 0.5 mg/L/4h for aerosols
Dodatek 4c
Acute inhalation toxicity:
Test procedure with a starting concentration of 1 mg/L/4h for aerosols
Dodatek 3d
Acute Inhalation Toxicity:
Test procedure with a starting concentration of 20 mg/L/4h for vapours"
B.53. BADANIE NEUROTOKSYCZNOŚCI ROZWOJOWEJ
WPROWADZENIE
Dodatek
DEFINICJE:
DEFINICJE:
Substancja chemiczna oznacza substancję lub mieszaninę.
CV odnosi się do współczynnika zmienności i oznacza stosunek odchylenia standardowego rozkładu do jego średniej arytmetycznej.
CYP oznacza monooksygenazy cytochromu P450, rodzinę genów i enzymów z nich produkowanych, które uczestniczą w katalizie szeregu różnych reakcji biochemicznych, w tym w syntezie i metabolizmie hormonów sterydowych.
DPM oznacza liczbę rozpadów na minutę. Jest to liczba atomów w danej ilości materiału radioaktywnego, która uległa rozpadowi w ciągu jednej minuty.
E2 to 17β-estradiol, najważniejszy estrogen w układach u ssaków.
Komórki H295R są ludzkimi komórkami raka nadnercza, które posiadają właściwości fizjologiczne strefowo niezróżnicowanych komórek nadnercza ludzkiego płodu i które wydzielają wszystkie enzymy szlaku steroidogenezy. Można je otrzymać z amerykańskiego zbioru typów kultur (ATCC).
Podłoże do zamrażania używane jest do zamrażania i przechowywania zamrożonych komórek. Podłoże to zawiera podłoże wyjściowe oraz BD NuSerum i sulfotlenek dimetylu.
Zakres liniowy oznacza zakres w ramach krzywej wzorcowej w odniesieniu do systemu do pomiaru hormonów, w którym wyniki są proporcjonalne do stężenia analitu obecnego w próbce.
LOQ oznacza granicę oznaczalności i stanowi najniższą ilość substancji chemicznej, jaką można odróżnić od braku tej substancji (wartość ślepej próby) przy określonej granicy ufności. Do celów omawianej metody granicę oznaczalności zazwyczaj definiuje producent systemów badań, jeżeli nie jest ona określona w inny sposób.
LOEC oznacza najniższe stężenie, przy którym obserwuje się zmiany, czyli najniższe stężenie, przy którym reakcja w teście jest statystycznie różna w porównaniu z kontrolą rozpuszczalnika.
NOEC oznacza najwyższe stężenie, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian, czyli najwyższe badane stężenie, jeżeli test nie daje reakcji dodatniej.
Pasaż oznacza ilość podziałów komórek po inicjacji kultury z zamrożonego zapasu. Wstępnemu pasażowi, który przeprowadzono z zamrożonego zapasu, przypisuje się wartość jeden (1). Komórki, które zostały podzielone jednokrotnie, oznacza się jako pasaż 2 itd.
PBS oznacza roztwór chlorku sodu buforowany fosforanami metodą Dulbecco.
Kontrola jakości, oznaczana skrótem QC, odnosi się do pomiarów niezbędnych do zapewnienia ważności danych.
Płytka kontroli jakości jest płytką 24-dołkową zawierającą dwa stężenia substancji kontroli dodatniej i ujemnej do celów monitorowania efektywności nowej partii komórek lub do celów zapewniania kontroli dodatniej na potrzeby testu podczas badania substancji chemicznych.
Próba jest niezależnym badaniem, w którym wykorzystuje się nowy zestaw roztworów i kontroli.
Podłoże wyjściowe stanowi podstawę do przygotowania innych odczynników. Podłoże to zawiera mieszaninę pożywki Dulbecco's zmodyfikowanego podłoża Eagle'a i podłoża odżywczego Hama F-12 w stosunku 1:1 w 15 mM bufora HEPES, niezawierającego czerwieni fenolowej ani wodorowęglanu sodu. Wodorowęglan sodu dodaje się jako bufor, zob. dodatek II do sprawozdania z walidacji (4).
Podłoże wzbogacone zawiera podłoże wyjściowe oraz BD Nu-Serum i najwyższej jakości mieszaninę ITS+, zob. dodatek II do sprawozdania z walidacji (4).
Steroidogeneza jest syntetycznym szlakiem prowadzącym od cholesterolu do różnych hormonów sterydowych. Niektóre półprodukty na szlaku syntezy sterydów, takie jak progesteron i testosteron, same w sobie są ważnymi hormonami, ale odgrywają również rolę prekursorów dla hormonów powstających na dalszych etapach szlaku syntezy.
T oznacza testosteron, jeden z dwóch najważniejszych androgenów w układach ssaków.
Badana substancja chemiczna oznacza każdą substancję lub mieszaninę badaną za pomocą opisywanej metody badawczej.
Płytka do badań jest płytką, na której komórki H295R poddawane są działaniu badanych substancji chemicznych. Płytki do badań zawierają kontrolę rozpuszczalnika i badaną substancję chemiczne w siedmiu poziomach stężenia po trzy płytki dla każdego stężenia.
Trypsyna 1X jest rozcieńczonym roztworem trypsyny, enzymu należącego do proteaz serynowych wytwarzanych przez trzustkę, stosowanym do oddzielania komórek od płytki do hodowli komórek, zob. dodatek III do sprawozdania z walidacji (4).
B.58. BADANIE MUTACJI GENOWEJ KOMÓREK SOMATYCZNYCH I GERMINALNYCH U GRYZONI TRANSGENICZNYCH
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.59.
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.60.
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.61.
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.66.
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.68.
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.69.
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
B.71.
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 2.
CZĘŚĆ C: METODY USTALANIA EKOTOKSYCZNOŚCI
C.1. TOKSYCZNOŚĆ OSTRA DLA RYB
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 3.
C.2. BADANIE NAGŁEGO UNIERUCHOMIENIA DAPHNIA SP.
1. METODA
Opisywana metoda badania nagłego unieruchomienia jest zgodna z OECD TG 202 (2004).
1.1. WSTĘP
Metoda ta jest stosowana w badaniu ostrej toksyczności oceniającym toksyczność w odniesieniu do rozwielitek. Istniejące metody badania były stosowane w możliwym zakresie (1)(2)(3).
1.2. DEFINICJE
W ramach tej metody stosowane są następujące definicje:
EC50: jest stężeniem, które według szacunków powoduje unieruchomienie 50 % rozwielitek w podanym okresie ekspozycji. Jeśli stosowana jest inna definicja, należy to zgłosić, podając jednocześnie odniesienie do niej.
Unieruchomienie: te zwierzęta, które nie są w stanie pływać w ciągu 15 sekund po łagodnym potrząśnięciu naczyniem do badania, są uznawane za unieruchomione (nawet jeśli nadal mogą poruszać czułkami).
1.3. ZASADA METODY BADANIA
Młode rozwielitki w wieku poniżej 24 godzin na początku badania są przez 48 godzin poddawane działaniu badanej substancji o zróżnicowanym stężeniu. Unieruchomienie jest rejestrowane po 24 oraz po 48 godzinach i porównywane z wartościami kontrolnymi. Wyniki są analizowane w celu obliczenia EC50 po 48 godz. (definicje zamieszczono w części 1.2). Nie jest konieczna ocena EC50 po 24 godz.
1.4. INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI
Rozpuszczalność w wodzie i ciśnienie pary badanej substancji powinny być znane, jak również powinna być dostępna niezawodna metoda określania ilościowego substancji w roztworach testowych o udokumentowanej wydajności i granicy określenia. Pomocnymi informacjami są m.in. wzór strukturalny, czystość substancji, stabilność w wodzie lub pod wpływem światła, Pow i wyniki badania podatności na rozkład biologiczny (zob. metoda C.4).
Uwaga: Instrukcje dotyczące badanych substancji, których właściwości fizykochemiczne utrudniają ich przebadanie, zamieszczono w (4).
1.5. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Można przeprowadzić badanie EC50 substancji odniesienia w celu sprawdzenia, czy warunki są właściwe. Zaleca się użycie do tego celu substancji toksycznych stosowanych w międzynarodowych próbach pierścieniowych (1)(5)(1). Badania z substancją odniesienia należy przeprowadzać co miesiąc, a co najmniej dwa razy do roku.
1.6. KRYTERIA JAKOŚCI
Przy uznawaniu ważności badania stosuje się następujące kryteria:
- w kontrolach, także w kontroli wykorzystującej czynnik rozcieńczający, zostało unieruchomionych nie więcej niż 10 % rozwielitek,
- stężenie rozpuszczonego tlenu w naczyniach kontrolnych i naczyniach do badania powinno wynosić na końcu badania > 3 mg/l.
Uwaga: W przypadku pierwszego kryterium unieruchomienie lub inne oznaki choroby lub stresu, na przykład odbarwienie, nietypowe zachowanie, takie jak utknięcie przy powierzchni, powinno wykazywać nie więcej niż 10% kontrolnych rozwielitek.
1.7. OPIS METODY BADANIA
1.7.1. Przyrządy
Naczynia do badania i inne elementy wyposażenia mające kontakt z roztworami testowymi powinny być w całości wykonane ze szkła lub innych chemicznie obojętnych materiałów. Naczyniami do badania będą zwykle szklane probówki lub zlewki; należy je czyścić przed każdym użyciem, stosując standardowe procedury laboratoryjne. Naczynia do badania powinny być luźno przykryte, aby zmniejszyć utratę wody na skutek parowania i uniknąć dostawania się kurzu do roztworu. Substancje lotne powinny być badane w całkowicie wypełnionych i zamkniętych naczyniach, wystarczająco dużych, aby nie dopuścić do ograniczania ilości lub nadmiernego spadku poziomu tlenu (zob. część 1.6 i 1.8.3 ustęp pierwszy).
Dodatkowo należy używać niektórych lub wszystkich z następujących urządzeń: tlenomierz (z mikroelektrodą lub innym odpowiednim wyposażeniem do mierzenia poziomu tlenu w próbkach o niskiej zawartości tlenu); pehametr; odpowiedni aparat do kontroli temperatury; Sprzęt do określania całkowitego węgla organicznego (TOC); sprzęt do oznaczania chemicznego zapotrzebowania tlenu (ChZT), sprzęt do oznaczania twardości itd.
1.7.2. Badane organizmy
Zalecanym gatunkiem jest Daphnia magna Straus, ale do badania można użyć także innych, nadających się do tego celu gatunków (np. Daphnia pulex). Zwierzęta powinny być w wieku niższym niż 24 godziny na początku badania i aby zmniejszyć zróżnicowanie, zaleca się, aby nie było to potomstwo pierwszego pokolenia. Powinny one pochodzić ze zdrowej populacji (tj. nie wykazywać oznak stresu, takich jak wysoka śmiertelność, obecność samców i obecność jaj przetrwalnikowych, opóźnienia w produkcji pierwszego pokolenia, obecność odbarwionych zwierząt itd.). Wszystkie organizmy używane do określonego badania powinny pochodzić z hodowli założonych z tej samej populacji rozwielitek. Hodowane zwierzęta muszą być trzymane w warunkach hodowli (światło, temperatura, pożywka) podobnych do warunków stosowanych później w badaniu. Jeśli pożywka w hodowli rozwielitek w badaniu różni się od pożywki w rutynowych hodowlach, właściwym postępowaniem jest wprowadzenie okresu aklimatyzacji przed badaniem. Z tego powodu pokolenie rodzicielskie rozwielitek powinno być trzymane w wodzie do rozcieńczania w temperaturze do badania przez co najmniej 48 godzin przed rozpoczęciem badania.
1.7.3. Woda hodowlana i woda do rozcieńczania
Woda naturalna (powierzchniowa lub gruntowa), woda regenerowana lub odchlorowana mogą być użyte jako woda do hodowli rozwielitek i woda do rozcieńczania substancji, jeśli rozwielitki przeżyją w niej w czasie hodowli, aklimatyzacji i badania, nie wykazując oznak stresu. Jako wodę do badania można stosować każdy rodzaj wody, której charakterystyka zgodna jest z charakterystyką chemiczną wody nadającej się do rozcieńczania, jak opisano w załączniku 1. W czasie trwania badania jej jakość nie powinna się zmieniać. Woda regenerowana może być przygotowana przed dodanie do wody dejonizowanej lub destylowanej określonych ilości odczynników o czystości odpowiedniej do analizy. Przykłady wody regenerowanej podano w (1) i (6) oraz w załączniku 2. Należy pamiętać, że w przypadku badania substancji zawierającej metale należy unikać pożywek zawierających czynniki chelatujące, takie jak M4 i M7 opisane w załączniku 2. Wartość pH powinna utrzymywać się w przedziale 6-9. Dla Daphnia magna zalecana twardość powinna wynosić między 140 a 250 mg/l (CaCO3), dla innych gatunków Daphnia może być stosowana woda o mniejszej twardości. Woda do rozcieńczania może być przed użyciem do badania napowietrzona, tak aby tlen rozpuszczony osiągnął stan nasycenia.
Jeśli stosowana jest woda naturalna, jej parametry jakości powinny być sprawdzane co najmniej dwa razy do roku lub zawsze, kiedy istnieje podejrzenie, że mogły one znacznie się zmienić (zob. poprzedni ustęp i załącznik 1). Należy także sprawdzać zawartość metali ciężkich (np. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni). Jeśli używana jest woda odchlorowana, pożądane jest przeprowadzanie codziennej analizy zawartości chloru. Jeśli woda do rozcieńczania pochodzi z wód powierzchniowych lub gruntowych, należy dokonać pomiaru przewodności i zawartości całkowitego węgla organicznego (TOC) lub chemicznego zapotrzebowania tlenu (ChZT).
1.7.4. Roztwory testowe
Roztwory testowe o wybranych stężeniach są zwykle przygotowywane przez rozcieńczenie roztworu podstawowego. Roztwory podstawowe należy przygotowywać, rozpuszczając badaną substancję w wodzie do rozcieńczania. Jeśli to tylko możliwe, należy unikać stosowania rozpuszczalników, emulgatorów czy środków dyspergujących. W niektórych przypadkach takie związki mogą być jednak potrzebne do przygotowania roztworu podstawowego o odpowiednim stężeniu. Informacje na temat odpowiednich rozpuszczalników, emulgatorów i środków dyspergujących podano w (4). W żadnym przypadku substancja badana w roztworach testowych nie powinna przekraczać granicy rozpuszczalności w wodzie do rozcieńczania.
Badanie powinno być przeprowadzone bez regulacji pH. Jeśli pH nie utrzymuje się w przedziale 6-9, można przeprowadzić drugie badanie przed dodaniem badanej substancji, dostosowując pH roztworu podstawowego do pH wody do rozcieńczania. Dostosowanie pH powinno zostać przeprowadzone w taki sposób, żeby stężenie roztworu podstawowego nie zostało istotnie zmienione i nie została spowodowana żadna reakcja chemiczna lub wytrącenie badanej substancji. Zaleca się stosowanie HCl i NaOH.
1.8. PROCEDURA
1.8.1. Warunki ekspozycji
1.8.1.1. Grupy badane i kontrolne
Naczynia do badania są napełniane odpowiednimi objętościami wody do rozcieńczania i roztworami badanych substancji. Stosunek powietrza do wody w naczyniu powinien być identyczny w grupie kontrolnej i badanej. Rozwielitki są następnie umieszczane w naczyniach do badania. Dla każdego badanego stężenia i kontroli należy użyć co najmniej 20 zwierząt podzielonych na cztery grupy po pięć zwierząt w każdej. Na każde zwierzę powinno przypadać co najmniej 2 ml roztworu badanego (tj. roztwór o objętości 10 ml dla pięciu rozwielitek na naczynie do badania). Badanie może być przeprowadzane przy zastosowaniu odnawiania semistatycznego lub przepływu przez system, jeśli badana substancja nie jest stabilna.
Oprócz właściwych serii kontrolnych należy przeprowadzić jedną serię kontrolną wody do rozcieńczania i, jeśli jest to właściwe, jedną serię kontrolną zawierającą czynnik rozpuszczający.
1.8.1.2. Badane stężenia
Jeśli nie ma danych o toksyczności badanej substancji, można przeprowadzić badanie zakresu, pozwalające określić zakres stężeń stosowanych w ostatecznych badaniach. W tym celu rozwielitki umieszcza się w szeregu roztworów o znacznie różniących się od siebie stężeniach badanej substancji. Działaniu każdego ze stężeń przez 48 godzin lub mniej powinno być poddanych pięć rozwielitek, żadne powtórzenia nie są konieczne. Okres ekspozycji może być krótszy (np. 24 godzin lub mniej), jeśli dane odpowiednie do celów badania określającego zakres stężeń można uzyskać w krótszym okresie.
Należy zastosować co najmniej pięć stężeń. Powinny one tworzyć szereg geometryczny, najlepiej o stosunku stężeń nieprzekraczającym 2,2. Jeśli zastosowano mniej niż pięć stężeń, należy przedstawić uzasadnienie. Najlepiej jeśli najwyższe badane stężenie powoduje stuprocentowe unieruchomienie, a najniższe badane stężenie nie powoduje widocznych skutków.
1.8.1.3. Warunki inkubacji
Temperatura powinna mieścić się w przedziale 18-22 oC i w żadnym badaniu nie powinna zmieniać się o więcej niż ± 1 oC. Zaleca się cykl 16 godzin oświetlenia, 8 godzin ciemności. Całkowita ciemność również jest dopuszczalna, zwłaszcza w przypadku badanych substancji niestabilnych w świetle.
W czasie badania nie należy doprowadzać powietrza do naczyń do badania. Badanie powinno być przeprowadzone bez regulacji pH. W czasie badania rozwielitki nie powinny być karmione.
1.8.1.4. Czas trwania
Czas trwania badania wynosi 48 godzin.
1.8.2. Obserwacje
W każdym naczyniu do badania należy sprawdzać obecność unieruchomionych rozwielitek po 24 i 48 godzinach od rozpoczęcia badania (definicje zamieszczono w części 1.2). Poza unieruchomieniem należy odnotować wszelkie odchylenia od normy w zachowaniu lub wyglądzie.
1.8.3. Pomiary analityczne
Zawartość tlenu rozpuszczonego i pH mierzy się na początku i na końcu badania w kontroli(-ach) i w roztworze badanej substancji o największym stężeniu. Stężenie tlenu rozpuszczonego w roztworach kontrolnych powinno spełniać kryterium ważności (zob. część 1.6). W normalnych warunkach pH nie powinno się różnić w poszczególnych badaniach o więcej niż 1,5 jednostki. Pomiary temperatury przeprowadza się zwykle w naczyniach kontrolnych i w ich otaczającym powietrzu. Temperaturę najlepiej mierzyć stale w czasie trwania badania lub przynajmniej na początku i na końcu badania.
Stężenie badanej substancji powinno być mierzone przynajmniej w roztworach badanych o najwyższym i o najniższym stężeniu, na początku i na końcu badania (4). Zaleca się, aby wyniki opierały się na mierzonych stężeniach. Jeśli jednak istnieją dane wskazujące, że stężenie badanej substancji jest skutecznie utrzymywane w granicach ± 20 % wartości nominalnej lub zmierzonej wartości początkowej przez cały czas trwania badania, to wyniki mogą opierać się na wartości nominalnej lub zmierzonej wartości początkowej.
1.9. BADANIE GRANICZNE
Stosując procedury opisane w niniejszej metodzie, można przeprowadzić badanie graniczne przy stężeniu 100 mg/l badanej substancji lub w stężeniu do granicy rozpuszczalności w środku stosowanym w badaniu (zależnie od tego, która wartość jest niższa) w celu wykazania, że EC50 jest większe niż dane stężenie. Badanie graniczne powinno być przeprowadzone przy użyciu 20 rozwielitek (najlepiej podzielonych na cztery grupy po pięć osobników) i tej samej liczby zwierząt w kontroli. Jeśli nastąpi unieruchomienie, należy przeprowadzić pełne badanie. Należy zanotować wszystkie odchylenia od normy w zachowaniu.
2. DANE
Dane powinny być podsumowane w formie tabelarycznej, dla każdej grupy badanej i kontrolnej przy każdej obserwacji należy podać liczbę użytych rozwielitek i unieruchomienie. Procent osobników unieruchomionych po 24 i 48 godzinach jest przedstawiany w funkcji stężenia badania. Dane są analizowane przy użyciu właściwych metod statystycznych (np. analiza probitowa itd.) w celu obliczenia nachylenia krzywych i EC50 przy 95 % poziomie ufności (p = 0,05) (7)(8).
W przypadku gdy standardowe metody obliczania EC50 nie mają zastosowania do otrzymanych danych, do oszacowania EC50 należy zastosować najwyższe stężenie niepowodujące unieruchomienia i najniższe stężenie powodujące 100 % unieruchomienia (wartość tę oblicza się jako średnią geometryczną tych dwóch stężeń).
3. SPRAWOZDAWCZOŚĆ
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące dane:
Badana substancja:
- cechy fizyczne i istotne właściwości fizykochemiczne,
- chemiczne dane identyfikacyjne, w tym czystość. Badany gatunek:
- źródło i gatunek Daphnia, dostawca (jeśli znany) i zastosowane warunki hodowli (w tym źródło, rodzaj i ilość pożywienia, częstotliwość karmienia).
Warunki badania:
- opis naczyń do badania: typ naczyń, objętość roztworu, liczba rozwielitek w naczyniu do badania, liczba naczyń do badania (powtórzeń) dla każdego stężenia,
- metody przygotowania roztworu podstawowego i badanych roztworów, w tym zastosowanie wszelkich rozpuszczalników lub środków dyspergujących,
- szczegółowe informacje o wodzie do rozcieńczania: źródło i właściwości wody (pH, twardość, stosunek Ca/Mg, stosunek Na/K, zasadowość, przewodność itd.); skład regenerowanej wody, jeśli taka jest stosowana,
- warunki inkubacji: temperatura, natężenie i cykliczność oświetlenia, rozpuszczony tlen, pH itd.
Wyniki:
- liczba i procent rozwielitek, które były unieruchomione lub wykazywały jakiekolwiek objawy niekorzystnego działania substancji (w tym zachowanie odbiegające od normy) w roztworach kontrolnych i badanych przy okazji każdej obserwacji, oraz opis charakteru obserwowanych zmian,
- wyniki i dane badania przeprowadzonego z substancja odniesienia, jeśli takie dane są dostępne,
- nominalne stężenia badania i wynik wszystkich analiz służących określeniu stężenia badanej substancji w naczyniach do badania; należy również przedstawić informacje o wydajności stosowanej metody oraz dokładności oznaczania,
- wyniki wszystkich pomiarów parametrów fizykochemicznych temperatury, pH i zawartości rozpuszczonego tlenu przeprowadzonych w czasie badania,
- EC50 po 48 godzinach dla unieruchomienia wraz z przedziałami ufności i wykresy dopasowanego modelu użytego do obliczeń, nachylenia krzywych odpowiedzi na dawkę i ich błąd standardowy; procedury statystyczne użyte do określenia EC50 (dane dla unieruchomienia po 24 godzinach powinny także być przedstawione, jeżeli były rejestrowane),
- wyjaśnienie wszelkich odstępstw od metody badania oraz określenie czy te odstępstwa miały wpływ na wyniki badań.
4. BIBLIOGRAFIA
(1) ISO 6341. (1996). Water quality - Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - Acute toxicity test. Third edition, 1996.
(2) EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guidelines - Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater Daphnids.
(3) Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute Lethality Test Using Daphnia spp. EPS 1/RM/ 11. Environment Canada, Ottawa, Ontario, Canada.
(4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. Nr. 23. Paris 2000.
(5) Commission of the European Communities. Study D8369. (1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to Daphnia.
(6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 211: Daphnia magna Reproduction Test, adopted September 1998.
(7) Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC50. In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 - American Society for Testing and Materials. Pp. 65-84.
(8) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 3rd ed. London. Griffin, Weycombe, UK.
______
(1) Wyniki tych wewnętrznych badań laboratoryjnych i technicznego sprostowania w sprawie ISO 6341 dają EC50 po 24 h dichromianu potasu (K2Cr2O7) w przedziale 0,6-1,7 mg/l.
ZAŁĄCZNIK 1
NIEKTÓRE WŁAŚCIWOŚCI CHEMICZNE NADAJĄCEJ SIĘ DO BADAŃ WODY DO ROZCIEŃCZANIA
| Substancja | Stężenie |
| Pył zawieszony | < 20 mg/l |
| Całkowity węgiel organiczny | < 2 mg/l |
| Amoniak niezjonizowany | < 1 μg/l |
| Chlor resztkowy | < 10 μg/l |
| Pestycydy fosforoorganiczne razem | < 50 ng/l |
| Pestycydy grupy węglowodorów chlorowanych razem plus polichlorowane bifenyle | < 50 ng/l |
| Całkowity chlor organiczny | < 25 ng/1 |
ZAŁĄCZNIK 2
PRZYKŁADY WŁAŚCIWEJ REGENEROWANEJ WODY DO BADANIA
Woda do badania ISO (1)
| Roztwory podstawowe (pojedyncza substancja) | W celu przygotowania zregenerowanej wody dodać następujące objętości roztworów podstawowych do 1 litra wody(*) | |
| Substancja | Ilość dodawana do 1 litra wody(*) | |
| Chlorek wapnia CaCl2, 2H2O | 11,76 g | 25 ml |
| Siarczan magnezu MgSO4, 7H2O | 4,93 g | 25 ml |
| Wodorowęglan sodu NaHCO3 | 2,59 g | 25 ml |
| Chlorek potasu KC1 | 0,23 g | 25 ml |
| (*) Woda o odpowiedniej czystości, np. dejonizowana, destylowana lub poddana osmozie odwróconej, najlepiej mająca przewodność nieprzekraczającą 10 μS.cm-1. |
Pożywki Elendta M7 i M4
Aklimatyzacja do pożywek Elendta M4 i M7
W niektórych laboratoriach napotkano trudności przy przenoszeniu rozwielitek do pożywek M4 i M7. Osiągnięto jednak pewne pomyślne wyniki, stosując aklimatyzację stopniową, tzn. przenosząc rozwielitki z własnej pożywki do 30 % roztworu, następnie do 60 %, a później 100 % roztworu Elendta. Konieczne może być stosowanie okresu aklimatyzacji nawet przez miesiąc.
Przygotowanie
Pierwiastki śladowe
Najpierw przygotowuje się osobne roztwory podstawowe (I) poszczególnych pierwiastków śladowych w wodzie o odpowiedniej czystości, np. dejonizowanej, destylowanej lub poddanej osmozie odwróconej. Z poszczególnych roztworów podstawowych (I) przygotowywany jest drugi, pojedynczy, roztwór podstawowy (II), który zawiera wszystkie elementy śladowe (roztwór łączony), tj.:
| Roztwor podstawowy (pojedyncza substancja) | Ilość dodana do wody (mg/l) | Stężenie (odnoszące się do pożywki M4) | W celu przygotowania kombinowanego roztworu II dodaċ następujące ilości roztworu podstawowego I do wody (ml/1) | |
| M4 | M7 | |||
| H3 BO3 | 57.190 | 20.000-krotne | 1,0 | 0,25 |
| MnCl2.4H2O | 7.210 | 20.000-krotne | 1,0 | 0,25 |
| LiCl | 6.120 | 20.000-krotne | 1,0 | 0,25 |
| RbCl | 1.420 | 20.000-krotne | 1,0 | 0,25 |
| SrCl2.6H2O | 3.040 | 20.000-krotne | 1,0 | 0,25 |
| NaBr | 320 | 20.000-krotne | 1,0 | 0,25 |
| Na2MoO4.2H2O | 1.230 | 20.000-krotne | 1,0 | 0,25 |
| CuCl2.2H2O | 335 | 20.000-krotne | 1,0 | 0,25 |
| ZnCl2 | 260 | 20.000-krotne | 1,0 | 1,0 |
| CoCl2.6H2O | 200 | 20.000-krotne | 1,0 | 1,0 |
| KI | 65 | 20.000-krotne | 1,0 | 1,0 |
| Na2 SeO3 | 43,8 | 20.000-krotne | 1,0 | 1,0 |
| NH4VO3 | 11,5 | 20.000-krotne | 1,0 | 1,0 |
| Na2 EDTA.2H2O | 5.000 | 2.000-krotne | - | - |
| FeS04.7H2O | 1.991 | 2.000-krotne | - | - |
| Zarowno roztwor Na 2 EDTA jak i FeSO4 są przygotowywane oddzielnie, zlevane razem i niezwłocznie umieszczane w autoklawie. Daje to: |
| roztwor 21 Fe-EDT | 1.000-krotne | 20,0 | 5,0 |
Pożywki M4 i M7
Pożywki M4 i M7 są przygotowywane przy użyciu roztworu podstawowego II, makroskładników i witamin w następujący sposób:
| Ilość dodana do wody (mg/l) | Stężenie (odnoszące się do pożywki M4) | Ilość roztworu p odstawowego II dodanego w celu otrzymania pożywkki (ml/1) | ||
| M4 | M7 | |||
| Roztwor podstawowy II (połączone pierwiastki śladowe) | 20-krotne | 50 | 50 | |
| Roztwory podstawowe makro składników (pojedyncza substancja) | ||||
| CaCl2 • 2H2O | 293.800 | 1.000-krotne | 1,0 | 1,0 |
| MgS04 • 7H2O | 246.600 | 2.000-krotne | 0,5 | 0,5 |
| KCl | 58.000 | 10.000-krotne | 0,1 | 0,1 |
| NaHCO3 | 64.800 | 1.000-krotne | 1,0 | 1,0 |
| Na2 SiO3 • 9H2O | 50.000 | 5.000-krotne | 0,2 | 0,2 |
| NaNO3 | 2.740 | 10.000-krotne | 0,1 | 0,1 |
| KH2PO4 | 1.430 | 10.000-krotne | 0,1 | 0,1 |
| K2HPO4 | 1.840 | 10.000-krotne | 0,1 | 0,1 |
| Łączony roztwór podstawowy witamin | - | 10.000-krotne | 0,1 | 0,1 |
| Łączony roztwor podstawowy witamin przygotowuje się przez dodanie 3 witamin do 1 litra wody, jak przedstawiono poniżej. |
| Hydrochlorek tiaminy | 750 | 10.000-krotne | ||
| Cyjanokobalami na (B12) | 10 | 10.000-krotne | ||
| Biotyna | 7,5 | 10.000-krotne |
Roztwór podstawowy złożony z witamin jest przechowywany zamrożony w niewielkich alikwotach. Witaminy są dodawane do pożywki na krótko przed użyciem.
UWAGA: Aby uniknąć wytrącania się soli w czasie przygotowywania kompletnych pożywek, dodać alikwoty roztworów podstawowych do około 500-800 ml dejonizowanej wody, a następnie uzupełnić do 1 litra.
UWAGA: Informacje o pierwszej publikacji na temat pożywki M4 można znaleźć w pracy Elendt B.P. (1990). Selenium deficiency in Crustacea; an ultrastructual approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, 25-33.
C.3. BADANIE ZAHAMOWANIA WZROSTU SŁODKOWODNYCH GLONÓW I CYJANOBAKTERII
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD nr 201 (2006, załącznik skorygowany w 2011). Stwierdzono potrzebę rozszerzenia zakresu tej metody badawczej, tak aby objąć nią dodatkowe gatunki i zaktualizować ją, by spełniała wymagania w zakresie oceny zagrożenia oraz klasyfikacji substancji chemicznych. Korekty dokonano na podstawie szerokich doświadczeń praktycznych, postępu naukowego w dziedzinie badań nad toksycznością glonów oraz rozległego zastosowania regulacyjnego, które nastąpiło od czasu pierwotnego przyjęcia.
2. Zastosowane definicje są podane w dodatku 1.
ZASADA BADANIA
3. Celem niniejszego badania jest określenie wpływu substancji chemicznej na wzrost słodkowodnych mikroglonów lub cyjanobakterii. Użyte do badania rosnące wykładniczo organizmy naraża się na działanie badanej substancji chemicznej w kulturach statycznych przez okres wynoszący zwykle 72 godziny. Pomimo stosunkowo krótkiego czasu trwania badania, skutki można ocenić na przestrzeni kilku pokoleń.
4. Reakcja układu polega na ograniczeniu wzrostu w szeregu kultur glonów (badanych jednostek) narażonych na działanie różnych stężeń badanej substancji chemicznej. Reakcję ocenia się jako funkcję stężenia ekspozycyjnego w odniesieniu do średniego wzrostu kultur w kontrpróbach kontrolnych niepoddanych narażeniu. W celu pełnego wyrażenia reakcji układu na skutki toksyczne (dla zapewnienia optymalnej wrażliwości) kulturom umożliwia się nieograniczony wzrost wykładniczy w dostatecznych warunkach odżywczych i przy stałym świetle przez okres wystarczający do pomiaru zmniejszenia właściwej szybkości wzrostu.
5. Wzrost i zahamowanie wzrostu określa się ilościowo poprzez pomiary biomasy glonów w funkcji czasu. Biomasę glonów określa się jako suchą masę przypadającą na objętość, np. mg glonów/litr roztworu do badań. Sucha masa jest jednak trudna do zmierzenia i w związku z tym używa się parametrów zastępczych. Ze wspomnianych parametrów zastępczych najczęściej używa się liczby komórek. Do innych takich parametrów należy objętość komórek, fluorescencja, gęstość optyczna itp. Należy znać przelicznik pomiędzy mierzonym parametrem zastępczym a biomasą.
6. Punktem końcowym badania jest zahamowanie wzrostu wyrażone jako logarytmiczny przyrost biomasy (średnia właściwa szybkość wzrostu) w okresie narażenia. Na podstawie średniej właściwej szybkości wzrostu zarejestrowanej w serii roztworów do badań wyznacza się stężenie powodujące zahamowanie szybkości wzrostu o określoną wartość procentową (np. 50 %) i wyraża się je jako ErCx (np. ErC50).
7. Dodatkową zmienną zależną użytą w niniejszej metodzie badawczej jest przyrost, który może być potrzebny do spełnienia określonych wymagań regulacyjnych w niektórych krajach. Jest on określony jako biomasa na końcu okresu narażenia minus biomasa na początku okresu narażenia. Na podstawie uzysku zarejestrowanego w serii roztworów do badań oblicza się stężenie powodujące zahamowanie przyrostu o określone x % (np. 50 %) i wyraża się je jako EyCx (np. EyC50).
8. Ponadto można statystycznie określić najniższe stężenie, przy którym obserwuje się zmiany (LOEC), oraz stężenie, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC).
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ
9. Informacje na temat badanej substancji chemicznej, które mogą być przydatne przy ustalaniu warunków badania, obejmują wzór strukturalny, czystość, stabilność w świetle, stabilność w warunkach badania, właściwości pochłaniania światła, stałą dysocjacji oraz wyniki badań przemiany, w tym biodegradowalność w wodzie.
10. Należy znać rozpuszczalność w wodzie, współczynnik podziału oktanol/woda (Pow) oraz prężność pary badanej substancji chemicznej i powinna być dostępna potwierdzona metoda określania ilościowego substancji chemicznej w roztworach do badań z podaną wydajnością odzysku i granicą wykrywalności.
WAŻNOŚĆ BADANIA
11. Aby badanie było ważne, powinny być spełnione następujące kryteria wykonania:
- Biomasa w kulturach kontrolnych powinna wzrosnąć wykładniczo co najmniej 16-krotnie w ciągu 72-godzinnego okresu badania. Odpowiada to właściwej szybkości wzrostu wynoszącej 0,92 dnia- 1. W przypadku najczęściej stosowanych gatunków szybkość wzrostu jest zazwyczaj znacznie większa (zob. dodatek 2). Kryterium to może nie być spełnione, gdy stosuje się gatunki, które wzrastają wolniej niż wymienione w dodatku 2. W takim przypadku okres badania można przedłużyć, aby uzyskać co najmniej 16-krotny wzrost w kulturach kontrolnych, przy czym wzrost musi być wykładniczy w całym okresie badania. Okres badania można skrócić do co najmniej 48 godzin, aby utrzymać nieograniczony wzrost wykładniczy w trakcie badania, pod warunkiem że osiągnięty zostanie co najmniej 16-krotny wzrost.
- Średni współczynnik zmienności w przypadku właściwej szybkości wzrostu dla poszczególnych odcinków (dni 0-1, 1-2 i 2-3 w przypadku 72-godzinnych badań) w kulturach kontrolnych (zob. dodatek 1 pod hasłem "współczynnik zmienności") nie może przekraczać 35 %. Obliczanie właściwej szybkości wzrostu dla poszczególnych odcinków przedstawiono w pkt 49. Kryterium to ma zastosowanie do średniej wartości współczynników zmienności obliczonej dla kontrprób kultur kontrolnych.
- Współczynnik zmienności średniej właściwej szybkości wzrostu w ciągu całego okresu badania w kontrpróbach kultur kontrolnych nie może przekroczyć 7 % w badaniach z udziałem Pseudokirchneriella subcapitata i Desmodesmus subspicatus. W przypadku innych rzadziej badanych gatunków wartość ta nie powinna przekraczać 10 %.
SUBSTANCJA CHEMICZNA ODNIESIENIA
12. Sposobem sprawdzenia procedury badania może być zbadanie substancji chemicznych odniesienia, takich jak 3,5-dichlorofenol stosowany w międzynarodowym badaniu międzylaboratoryjnym (1). Jako substancję chemiczną odniesienia dla zielenic można również zastosować dichromian potasowy. Wskazane jest badanie substancji chemicznej odniesienia co najmniej dwa razy w roku.
ZASTOSOWANIE BADANIA
13. Niniejsza metoda badawcza jest najłatwiejsza do stosowania w odniesieniu do substancji chemicznych rozpuszczalnych w wodzie, które w warunkach badania prawdopodobnie pozostaną w wodzie. W przypadku badania substancji lotnych, silnie adsorbujących, zabarwionych, mających niską rozpuszczalność w wodzie, lub substancji chemicznych, które mogą wpływać na dostępność składników pokarmowych lub minerałów w pożywce, mogą być wymagane pewne modyfikacje opisywanej procedury (np. układ zamknięty, kondycjonowanie naczyń badawczych). Wskazówki dotyczące pewnych stosownych modyfikacji podano w (2), (3) i (4).
OPIS METODY BADAWCZEJ
Aparatura
14. Naczynie badawcze i inna aparatura, która wchodzi w kontakt z roztworami do badań, powinny być wykonane całkowicie ze szkła lub innego chemicznie obojętnego materiału. Sprzęt należy gruntownie umyć, aby żadne zanieczyszczenia organiczne lub nieorganicznie nie zakłócały wzrostu glonów ani składu roztworów do badań.
15. Naczyniami badawczymi są zwykle kolby szklane o wymiarach umożliwiających uzyskanie dostatecznej objętości kultury do pomiarów podczas badania i na wystarczające przenikanie masy CO2 z atmosfery (zob. pkt 30). Należy zauważyć, że objętość cieczy musi być wystarczająca dla oznaczeń analitycznych (zob. pkt 37).
16. Ponadto wymagane mogą być niektóre lub wszystkie spośród następujących urządzeń:
- urządzenia do hodowli kultur: zalecana jest kabina lub komora, w której wybrana temperatura inkubacji może być utrzymywana w granicach ± 2 °C;
- przyrządy do pomiaru światła: należy zauważyć, że na wartość pomiarową będzie mieć wpływ metoda pomiaru natężenia światła, w szczególności typ receptora (kolektora). Pomiary należy wykonywać najlepiej przy użyciu receptora sferycznego (4 π) (który reaguje na bezpośrednie i odbite światło ze wszystkich kątów powyżej i poniżej płaszczyzny pomiaru) lub receptora 2 π (który reaguje na światło ze wszystkich kątów powyżej płaszczyzny pomiaru);
- aparatura do określania biomasy glonów. Pomiaru liczby komórek, która jest najczęściej stosowanym parametrem zastępczym dla biomasy glonów, można dokonać za pomocą elektronicznego licznika cząstek, mikroskopu z komorą do liczenia oraz cytometru przepływowego. Inne parametry zastępcze biomasy można mierzyć za pomocą cytometru przepływowego, fluorymetru, spektrofotometru lub kolorymetru. Pomocny w obliczeniu jest przelicznik wiążący liczbę komórek z suchą masą. W celu zapewnienia przydatnych pomiarów przy niskich stężeniach biomasy, gdy używa się spektrofotometru, niezbędne może być użycie kuwet o długości ścieżki światła wynoszącej co najmniej 4 cm.
Organizmy użyte do badania
17. Można użyć kilku gatunków niezwiązanych mikroglonów i cyjanobakterii. Wykazano, że w przypadku stosowania procedury badania określonej w niniejszej metodzie badawczej odpowiednie są szczepy wymienione w dodatku 2.
18. Jeżeli wykorzystuje się inne gatunki, należy podać szczep lub pochodzenie. Należy potwierdzić, że przez cały okres badania w panujących warunkach można utrzymać wykładniczy wzrost glonów użytych do badania.
Pożywka
19. Zaleca się dwie alternatywne pożywki - pożywkę OECD i pożywkę AAP. Składy tych pożywek przedstawiono w dodatku 3. Należy zwrócić uwagę, że początkowa wartość pH i pojemność buforowa (regulowanie wzrostu pH) tych dwóch pożywek są różne. Dlatego wyniki badań mogą być różne, w zależności od użytej pożywki, zwłaszcza gdy badane są jonizujące substancje chemiczne.
20. Do niektórych celów, np. gdy bada się metale i czynniki chelatujące lub gdy wykonuje się badanie przy różnych wartościach pH, konieczna może być modyfikacja pożywki wzrostowej. Użycie zmodyfikowanej pożywki należy szczegółowo opisać i uzasadnić (3) (4).
Stężenie początkowej biomasy
21. Początkowa biomasa w badanych kulturach musi być taka sama we wszystkich badanych kulturach i dostatecznie mała, aby umożliwić wzrost wykładniczy w całym okresie inkubacji bez ryzyka wyczerpania składników pokarmowych. Początkowa biomasa nie może przekraczać 0,5 mg/l w przeliczeniu na suchą masę. Zaleca się następujące początkowe stężenia komórek:
Pseudokirchneriella subcapitata 5 × 103 - 104 komórek/ml
Desmodesmus subspicatus 2-5 × 103 komórek/ml
Navicula pelliculosa 104 komórek/ml
Anabaena flos-aquae 104 komórek/ml
Synechococcus leopoliensis 5 × 104 - 105 komórek/ml
Stężenia badanej substancji chemicznej
22. Zakres stężenia, w którym mogą wystąpić skutki, można wyznaczyć na podstawie wyników badań ustalających zakres. Do końcowego badania ostatecznego należy wybrać co najmniej pięć stężeń uporządkowanych w szereg geometryczny, w którym każde kolejne stężenie jest co najwyżej 3,2 raza wyższe od poprzedniego. W przypadku badanych substancji chemicznych wykazujących płaską krzywą zależności stężenie-odpowiedź uzasadnione może być zastosowanie wyższej krotności. Zaleca się, aby szereg stężeń obejmował zakres powodujący zahamowanie tempa wzrostu glonów o 5-75 %.
Kontrpróby i próby kontrolne
23. Projekt badania powinien obejmować trzy kontrpróby przy każdym badanym stężeniu. Jeżeli wyznaczenie NOEC nie jest wymagane, projekt badania można zmienić, zwiększając liczbę stężeń i zmniejszając liczbę kontrprób przypadających na stężenie. Liczba kontrprób kontrolnych musi wynosić co najmniej trzy, a najlepiej powinna być dwukrotnie większa od liczby kontrprób użytych w przypadku każdego badanego stężenia.
24. Do analitycznych oznaczeń stężeń badanej substancji chemicznej można sporządzić oddzielny zestaw roztworów do badań (zob. pkt 36 i 38).
25. Gdy do rozpuszczenia badanej substancji chemicznej używa się rozpuszczalnika, wówczas w projekcie badania należy przewidzieć dodatkowe próby kontrolne zawierające rozpuszczalnik o takim samym stężeniu jak w badanych kulturach.
Przygotowanie kultury inokulum
26. W celu przystosowania badanych glonów do warunków badania oraz dopilnowania, aby znajdowały się one w fazie wzrostu wykładniczego, gdy są użyte do inokulacji roztworów do badań, kulturę inokulum w pożywce przygotowuje się 2-4 dni przez rozpoczęciem badania. Biomasę glonów należy dostosować, aby umożliwić przeważanie wzrostu wykładniczego w kulturze inokulum do czasu rozpoczęcia badania. Kulturę inokulum inkubuje się w takich samych warunkach jak kultury do badania. Należy zmierzyć przyrost biomasy w kulturze inokulum, aby upewnić się, że wzrost zawiera się w normalnym zakresie dla badanego szczepu w warunkach hodowli. Przykładową procedurę hodowli glonów opisano w dodatku 4. Aby uniknąć synchronicznego podziału komórek podczas badania, wymagany może być drugi etap reprodukowania kultury inokulum.
Sporządzenie roztworów do badań
27. Wszystkie roztwory do badań muszą zawierać takie same stężenia pożywki i taką samą początkową biomasę glonów do badania. Roztwory do badań o wybranych stężeniach sporządza się zwykle przez zmieszanie roztworu podstawowego badanej substancji chemicznej z pożywką i kulturą inokulum. Roztwory podstawowe sporządza się zwykle, rozpuszczając substancję chemiczną w pożywce.
28. Aby dodać do pożywki substancje chemiczne o małej rozpuszczalności w wodzie jako nośniki można użyć rozpuszczalników, np. acetonu, alkoholu t-butylowego i dimetyloformamidu (2)(3). Stężenie rozpuszczalnika nie powinno przekraczać 100 µl/l i takie samo stężenie rozpuszczalnika należy dodać do wszystkich kultur (w tym z próbami kontrolnymi) w badanej serii.
Inkubacja
29. Należy przykryć naczynia badawcze korkami przepuszczającymi powietrze. Naczynia wstrząsa się i umieszcza w urządzeniu do hodowli kultur. Podczas badania niezbędne jest utrzymanie glonów w zawiesinie i umożliwienie wnikania CO2. W tym celu należy stosować ciągłe wstrząsanie lub mieszanie. Kultury należy utrzymywać w temperaturze 21-24 °C, regulowanej z dokładnością do ± 2 °C. Dla gatunków innych niż wymienione w dodatku 2, np. gatunków tropikalnych, odpowiednie mogą być wyższe temperatury, pod warunkiem że spełnione będą kryteria ważności. Zaleca się rozmieścić kolby losowo i codziennie zmieniać ich położenie w inkubatorze.
30. Wartość pH pożywki kontrolnej nie powinna wzrosnąć w trakcie badania o więcej niż 1,5 jednostki. W przypadku metali i substancji chemicznych, które częściowo jonizują się przy pH zbliżonym do pH badania, konieczne może być ograniczenie odchylenia pH w celu otrzymania odtwarzalnych i jednoznacznych wyników. Odchylenie rzędu < 0,5 jednostek pH jest technicznie wykonalne i można je osiągnąć, zapewniając należytą szybkość wnikania masy CO2 z otaczającego powietrza do roztworu do badań, np. przez zwiększanie szybkości wstrząsania. Inną możliwością jest zmniejszenie zapotrzebowania na CO2 przez zmniejszenie początkowej biomasy albo skrócenie czasu trwania badania.
31. Powierzchnia, na której następuje inkubacja kultur, powinna mieć zapewnione ciągłe, równomierne oświetlenie fluorescencyjne np. typu "chłodnego światła białego" albo "światła dziennego". Szczepy glonów i cyjanobakterii różnią się pod względem zapotrzebowania na światło. Natężenie światła należy dobrać w taki sposób, aby odpowiadało ono organizmowi użytemu do badania. Dla zalecanych gatunków zielenic należy wybrać natężenie światła na poziomie roztworów do badań w przedziale 60-120 µEm- 2 s- 1, zmierzone w czynnym fotosyntetycznie zakresie długości fal 400-700 nm przy użyciu odpowiedniego receptora. Niektóre gatunki, w szczególności Anabaena flos-aquae, rosną dobrze przy niższych natężeniach światła, a przy wyższych mogą ulec uszkodzeniu. Dla takich gatunków należy wybrać średnie natężenie światła w zakresie 40-60 µE m- 2 s- 1. (W przypadku przyrządów do pomiaru światła kalibrowanych w luksach zalecanemu natężeniu światła 60-120 µEm- 2 s- 1 odpowiada w przybliżeniu równoważny zakres 4 440-8 880 luksów dla chłodnego światła białego). Natężenie światła należy utrzymywać w zakresie ± 15 % od średniego natężenia światła na powierzchni inkubacji.
Czas trwania badania
32. Badanie zwykle trwa 72 godzin. Można jednak zastosować krótsze albo dłuższe okresy trwania badania, pod warunkiem że spełnione mogą zostać kryteria ważności podane w pkt 11.
Pomiary i oznaczenia analityczne
33. Biomasę glonów w każdej kolbie ustala się co najmniej raz dziennie w okresie badania. Jeżeli pomiary dokonywane są na małych objętościach pobranych z roztworu do badań za pomocą pipety, wówczas objętości takich nie należy uzupełniać.
34. Pomiar biomasy wykonuje się poprzez ręczne zliczanie komórek za pomocą mikroskopu lub elektronicznego licznika cząstek (określając liczbę komórek lub objętość). Można zastosować alternatywne techniki, np. cytometrię przepływową, fluorescencję chlorofilu in vitro albo in vivo (5) (6) lub gęstość optyczną, pod warunkiem że można wykazać zadowalającą korelację z biomasą w całym zakresie biomasy występującym w badaniu.
35. Należy zmierzyć pH roztworów na początku i na końcu badania.
36. Jeśli dostępna jest procedura analityczna dla oznaczania badanej substancji chemicznej w zastosowanym zakresie stężenia, roztwory do badań należy poddać analizie celem sprawdzenia początkowych stężeń i utrzymania stężeń ekspozycyjnych w trakcie badania.
37. Analiza stężenia badanej substancji chemicznej na początku i końcu badania niskiego i wysokiego badanego stężenia oraz stężenia zbliżonego do oczekiwanego EC50 może być wystarczająca, jeśli prawdopodobne jest, że stężenia ekspozycyjne będą odbiegać od wartości nominalnych w trakcie badania o mniej niż 20 %. Gdy natomiast jest mało prawdopodobne, że stężenia pozostaną w granicach 80-120 % stężenia nominalnego, zaleca się analizę wszystkich badanych stężeń na początku i końcu badania. W przypadku badania substancji chemicznych lotnych, nietrwałych lub silnie adsorbujących zaleca się dodatkowe pobieranie próbek do analizy w odstępach 24-godzinnych w ciągu okresu narażenia, aby dokładniej ustalić stratę badanej substancji chemicznej. W przypadku tych substancji chemicznych konieczne mogą okazać się dodatkowe kontrpróby. We wszystkich przypadkach oznaczenie stężeń badanej substancji chemicznej musi być wykonywane tylko na jednym naczyniu z kontrpróbą przy każdym badanym stężeniu (lub na połączonych zawartościach naczyń z kontrpróbą).
38. Pożywki sporządzone specjalnie do analizy stężeń ekspozycyjnych podczas badania należy potraktować dokładnie tak samo jak pożywki użyte do badania, tzn. należy je zaszczepić glonami i inkubować w identycznych warunkach. Jeżeli wymagana jest analiza stężenia rozpuszczonej badanej substancji chemicznej, konieczne może być oddzielenie glonów od pożywki. Oddzielenia należy dokonać najlepiej przez odwirowanie przy małej sile grawitacji, wystarczającej do osadzenia się glonów.
39. Jeżeli istnieją dowody, że stężenie badanej substancji chemicznej zostało zadowalająco utrzymane w granicach ± 20 % nominalnego lub zmierzonego początkowego stężenia w ciągu całego badania, to analizę wyników można oprzeć na nominalnych lub zmierzonych początkowych wartościach. Jeśli odchylenie od nominalnego lub zmierzonego początkowego stężenia nie mieści się w zakresie ± 20 %, to analizę wyników należy oprzeć na średnim geometrycznym stężeniu w ciągu narażenia lub na modelach opisujących spadek stężenia badanej substancji chemicznej (3) (7).
40. Badanie zahamowania wzrostu glonów odbywa się w bardziej dynamicznym układzie badawczym niż większość innych krótkookresowych badań toksyczności dla organizmów wodnych. W rezultacie faktyczne stężenia ekspozycyjne mogą być trudne do określenia, zwłaszcza dla adsorbujących substancji chemicznych badanych w niskich stężeniach. W takich przypadkach zniknięcie badanej substancji chemicznej z roztworu przez adsorpcję do rosnącej masy glonów nie oznacza jej utraty z układu badawczego. Podczas analizy wyniku badania należy sprawdzić, czy zmniejszeniu stężenia badanej substancji chemicznej w trakcie badania towarzyszy spadek zahamowania wzrostu. Jeżeli tak się dzieje, można rozważyć zastosowanie odpowiedniego modelu opisującego spadek stężenia badanej substancji chemicznej (7). W przeciwnym razie wskazane może być przeprowadzenie analizy w oparciu o wyniki uzyskane przy początkowych (nominalnych lub zmierzonych) stężeniach.
Pozostałe obserwacje
41. Należy przeprowadzić obserwacje mikroskopowe w celu sprawdzenia, czy wygląd kultury inokulum jest normalny i zdrowy oraz zaobserwowania ewentualnego nietypowego wyglądu glonów (który może być spowodowany narażeniem na badaną substancję chemiczną) na końcu badania.
Badanie graniczne
42. W niektórych okolicznościach, na przykład gdy badanie wstępne wskazuje, że badana substancja chemiczna nie ma skutków toksycznych w stężeniach do 100 mg/l lub do jej rozpuszczalności granicznej w pożywce (w zależności od tego, która wartość jest niższa), można przeprowadzić badanie graniczne polegające na porównaniu reakcji w grupie kontrolnej i jednej grupie badanej (o stężeniu 100 mg/l lub równym granicznej rozpuszczalności). Zdecydowanie zaleca się, aby takie badanie było poparte analizą stężenia ekspozycyjnego. Do badania granicznego stosują się wszystkie poprzednio opisane warunki badania i kryteria ważności, z tym że liczba kontrprób poddawanych zabiegowi powinna wynosić co najmniej sześć. Zmienne zależne w grupie badanej i w grupie kontrolnej można analizować przy użyciu testu statystycznego do porównywania średnich, np. testu t-Studenta. Jeżeli wariancje obydwu grup są nierówne, należy wykonać test t-Studenta dostosowany dla nierównych wariancji.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Wykreślenie krzywych wzrostu
43. Biomasa w naczyniach badawczych może być wyrażona w jednostkach parametru zastępczego użytego do pomiaru (np. liczby komórek, fluorescencji).
44. Należy zestawić w postaci tabelarycznej oszacowane stężenie biomasy w badanych kulturach i w kontrolnych wraz ze stężeniami badanego materiału i czasami pomiaru zarejestrowanymi z dokładnością co najmniej do pełnych godzin, aby sporządzić wykresy krzywych wzrostu. Na tym pierwszym etapie mogą być przydatne zarówno skale logarytmiczne, jak i liniowe, lecz skale logarytmiczne są obowiązkowe i na ogół dają lepszy obraz zmienności przebiegu wzrostu w okresie badania. Należy zwrócić uwagę, że wzrost wykładniczy w wyniku wykreślenia na skali logarytmicznej tworzy prostą linię, a nachylenie linii (kierunek i kąt nachylenia) oznacza właściwą szybkość wzrostu.
45. Za pomocą wykresów należy zbadać, czy kultury kontrolne wzrastają wykładniczo w spodziewanym tempie w trakcie całego badania. Należy krytycznie zbadać wszystkie punkty danych oraz wygląd wykresów i sprawdzić dane surowe i procedury pod kątem możliwych błędów. Należy sprawdzić w szczególności wszelkie punkty danych, które wydają się stanowić odchylenia spowodowane błędem systematycznym. Jeżeli jest oczywiste, że można stwierdzić lub uznać za wysoce prawdopodobne błędy proceduralne, to określony punkt danych oznacza się jako wartość oddaloną i nie ujmuje się go w późniejszej analizie statystycznej. (Zerowe stężenie glonów w jednym z dwóch lub trzech naczyń z kontrpróbą może oznaczać, że naczynie to nie zostało poprawnie zaszczepione lub że zostało niewłaściwie wyczyszczone). Powody odrzucenia punktu danych jako wartości oddalonej należy wyraźnie podać w sprawozdaniu z badania. Akceptowanymi powodami są wyłącznie (rzadkie) błędy proceduralne, a nie tylko niedostateczna dokładność. Procedury statystyczne dotyczące identyfikacji wartości oddalonych mają ograniczone zastosowanie do zagadnienia tego typu i nie mogą zastąpić wiedzy fachowej. Wskazane jest, aby wartości oddalone (zaznaczone jako takie) zachować wśród punktów danych przedstawionych w późniejszej graficznej lub tabelarycznej prezentacji danych.
Zmienne zależne
46. Celem badania jest określenie wpływu badanej substancji chemicznej na wzrost glonów. W niniejszej metodzie badawczej opisuje się dwie zmienne zależne, gdyż różne jurysdykcje mają różne preferencje i potrzeby regulacyjne. Aby wyniki badania były akceptowalne we wszystkich jurysdykcjach, wpływ należy ocenić przy użyciu obydwu zmiennych zależnych a) i b) opisanych poniżej.
a) średnia właściwa szybkość wzrostu: tę zmienną zależną oblicza się na podstawie logarytmicznego dziennego przyrostu biomasy w okresie badania;
b) przyrost: tą zmienną zależną jest biomasa na końcu badania po odjęciu początkowej biomasy.
47. Należy zauważyć, że wartości toksyczności obliczone przy użyciu tych dwóch zmiennych zależnych nie są porównywalne i różnicę tę należy uwzględnić przy wykorzystywaniu wyników badania. Jeżeli spełnione są warunki badania określone w niniejszej metodzie badawczej, wartości ECx oparte na średniej właściwej szybkości wzrostu (ErCx) będą zwykle wyższe od wyników opartych na przyroście (EyCx) ze względu na podstawę matematyczną tych podejść. Nie należy interpretować tego jako różnicy wrażliwości pomiędzy tymi dwiema zmiennymi zależnymi, lecz jedynie jako stwierdzenie, że wartości te są różne pod względem matematycznym. Pojęcie średniej właściwej szybkości wzrostu opiera się na ogólnym przebiegu wzrostu wykładniczego glonów w nieograniczonych kulturach, gdzie toksyczność szacuje się na podstawie wpływu na szybkość wzrostu, przy czym nie jest ona zależna od bezwzględnego poziomu właściwej szybkości wzrostu próby kontrolnej, nachylenia krzywej zależności stężenie-odpowiedź ani czasu trwania badania. Natomiast wyniki oparte na zmiennej zależnej w postaci przyrostu są zależne od wszystkich tych pozostałych zmiennych. EyCx jest zależne od właściwej szybkości wzrostu gatunków glonów użytych w każdym badaniu oraz od maksymalnej właściwej szybkości wzrostu, która może być różna dla różnych gatunków, a nawet dla różnych szczepów glonów. Tej zmiennej zależnej nie powinno się używać do porównywania wrażliwości na substancje toksyczne pomiędzy gatunkami glonów lub nawet różnymi ich szczepami. Choć z naukowego punktu widzenia preferuje się szacowanie toksyczności z wykorzystaniem średniej właściwej szybkości wzrostu, oszacowania toksyczności na podstawie przyrostu są również objęte niniejszą metodą badawczą, co pozwala spełnić obecne wymogi regulacyjne istniejące w niektórych krajach.
Średnia szybkość wzrostu
48. Średnią właściwą szybkość wzrostu dla konkretnego okresu oblicza się jako logarytmiczny przyrost biomasy z równania dla każdego naczynia z grupami kontrolnymi i próbami poddawanymi badaniu [1]:
(dzień-1) [1],
gdzie:
µi-j to średnia właściwa intensywność wzrostu od momentu i do j;
Xi to biomasa w czasie i;
Xj to biomasa w czasie j.
Dla każdej grupy badanej i kontrolnej należy obliczyć średnią wartość szybkości wzrostu wraz z oszacowaniami wariancji.
49. Obliczyć średnią właściwą szybkość wzrostu w całym okresie badania (zwykle dni 0-3), wykorzystując nominalnie zaszczepioną biomasę jako wartość początkową zamiast zmierzonej wartości początkowej, ponieważ w ten sposób zwykle uzyskuje się większą dokładność. Jeżeli urządzenie używane do pomiaru biomasy pozwala na dostatecznie dokładne określenie małej biomasy inokulum (np. cytometr przepływowy), wówczas można użyć zmierzonego początkowego stężenia biomasy. Należy również ocenić szybkość wzrostu dla poszczególnych odcinków, obliczoną jako właściwa szybkość wzrostu dla każdego dnia w trakcie badania (dni 0-1, 1-2 i 2-3), oraz zbadać, czy szybkość wzrostu w grupie kontrolnej pozostaje stała (zob. kryteria ważności, pkt 11). Właściwa szybkość wzrostu znacząco niższa w pierwszym dniu od ogólnej średniej właściwej szybkości wzrostu może oznaczać fazę zwłoki. Podczas gdy fazę zwłoki można zminimalizować i praktycznie wyeliminować w kulturach kontrolnych przez odpowiednie rozmnożenie kultury pierwotnej, faza zwłoki w kulturach narażonych może oznaczać regenerację po początkowym wstrząsie toksycznym lub zmniejszonym narażeniu wskutek straty badanej substancji chemicznej (w tym jej sorpcji na biomasie glonów) po początkowym narażeniu. Stąd można określić szybkość wzrostu dla poszczególnych odcinków, aby ocenić skutki badanej substancji chemicznej występujące w ciągu okresu narażenia. Znaczące różnice pomiędzy szybkością wzrostu dla poszczególnych odcinków a średnia szybkością wzrostu świadczą o odchyleniu od stałego wzrostu wykładniczego i uzasadniają dokładne zbadanie krzywych wzrostu.
50. Należy obliczyć procentowe zahamowanie tempa wzrostu dla każdej kontrpróby poddawanej badaniu za pomocą równania [2]:
gdzie:
% Ir = procentowe zahamowanie średniej właściwej szybkości wzrostu;
µC = średnia wartość średniej właściwej szybkości wzrostu (µ) w grupie kontrolnej;
µT = średnia właściwa szybkość wzrostu dla kontrpróby poddawanej badaniu.
51. Jeżeli do sporządzenia roztworów do badań użyto rozpuszczalników, przy obliczaniu procentowego zahamowania należy użyć prób kontrolnych z rozpuszczalnikiem zamiast prób kontrolnych bez rozpuszczalnika.
Przyrost
52. Przyrost oblicza się jako biomasę na końcu badania po odjęciu biomasy na początku badania dla każdego naczynia z próbami kontrolnymi i badanymi. Dla każdego badanego stężenia i próby kontrolnej należy obliczyć średnią wartość przyrostu wraz z oszacowaniami wariancji. Dla każdej kontrpróby poddawanej badaniu można obliczyć procentowe zahamowanie przyrostu (% I) w następujący sposób:
[3]
gdzie:
% I = procentowe zahamowanie przyrostu;
YC = średnia wartość przyrostu w grupie kontrolnej;
YT = wartość przyrostu dla badanej kontrpróby.
Wykreślenie krzywej zależności stężenie-odpowiedź
53. Należy wykreślić procentową wartość zahamowania w funkcji logarytmu stężenia badanej substancji chemicznej i dokładnie zbadać wykres, pomijając każdy punkt danych, który został potraktowany jako wartość oddalona w pierwszej fazie. Należy dopasować ciągłą linię pomiędzy punktami danych "na oko" lub za pomocą komputerowej interpolacji, aby uzyskać pierwsze wrażenie dotyczące zależności stężenie-odpowiedź, a następnie kontynuować z zastosowaniem bardziej szczegółowej metody, najlepiej komputerowej metody statystycznej. W zależności od zamierzonego wykorzystania danych, jakości (dokładności) i ilości danych, jak również dostępności narzędzi do analizy danych, można podjąć decyzję (co niekiedy będzie uzasadnione) o przerwaniu analizy danych na tym etapie i można po prostu odczytać główne wartości EC50 i EC10 (lub EC20) z dopasowanej "na oko" krzywej (zob. również sekcja dotycząca skutków stymulujących poniżej). Niezastosowanie metody statystycznej może wynikać z następujących uzasadnionych powodów:
- dane nie są odpowiednie do tego, aby metody komputerowe przyniosły wyniki bardziej wiarygodne od uzyskanych na podstawie wiedzy fachowej - w takich sytuacjach niektóre programy komputerowe mogą nawet nie dostarczyć wiarygodnego rozwiązania (iteracje mogą nie osiągnąć zbieżności itp.);
- efektu stymulacji wzrostu nie można w zadowalający sposób przetworzyć za pomocą dostępnych programów komputerowych (zob. poniżej).
Procedury statystyczne
54. Celem jest uzyskanie ilościowej zależności stężenie-odpowiedź za pomocą analizy regresji. Możliwe jest zastosowanie ważonej regresji liniowej po przeprowadzeniu transformacji linearyzującej danych odpowiedzi -na przykład do jednostek probit, logit albo Weibulla (8), lecz preferowane są procedury regresji nieliniowej, które lepiej sprawdzają się w przypadku nieuniknionych nieregularności danych i odchyleń od gładkich rozkładów. Przy zbliżaniu się do zerowego albo całkowitego zahamowania nieregularności takie mogą zostać powiększone przez transformację, zakłócając analizę (8). Należy zwrócić uwagę, że standardowe metody analizy przy użyciu transformat probit, logit albo Weibulla są przeznaczone do stosowania do danych binarnych (np. dotyczących śmiertelności lub przeżywalności) i muszą zostać zmodyfikowane, aby uwzględnić dane dotyczące wzrostu lub biomasy. Szczegółowe procedury wyznaczania wartości ECx na podstawie danych ciągłych można znaleźć w (9), (10) i (11). Zastosowanie analizy regresji nieliniowej jest opisane szczegółowo w dodatku 5.
55. Dla każdej zmiennej zależnej, która ma być analizowana, należy zastosować zależność stężenie-odpowiedź do obliczenia oszacowań punktowych wartości ECx. W miarę możliwości dla każdego oszacowania należy określić granice ufności na poziomie 95 %. Zgodność danych odpowiedzi z modelem regresji należy ocenić graficznie lub statystycznie. Analizę regresji należy przeprowadzić z zastosowaniem odpowiedzi z poszczególnych kontrprób, a nie średnich z grup badanych. Jeśli jednak dopasowanie krzywej nieliniowej jest trudne lub nie udaje się z powodu zbyt dużego rozrzutu danych, problem ten można ominąć, wykonując regresję na średnich z grup, co jest praktycznym sposobem na ograniczenie wpływu podejrzewanych wartości oddalonych. Wybór tej opcji należy zaznaczyć w sprawozdaniu z badania jako odstępstwo od normalnej procedury wynikłe stąd, że dopasowania krzywej za pomocą indywidualnych kontrprób nie przyniosły zadowalającego rezultatu.
56. Oszacowania wartości EC50 i granice ufności można również otrzymać przy użyciu interpolacji liniowej z zastosowaniem metody bootstrap (13), jeżeli dostępne modele/metody regresji są nieodpowiednie do danych.
57. W celu oszacowania LOEC, a następnie NOEC, w odniesieniu do wpływu badanej substancji chemicznej na intensywność wzrostu, konieczne jest porównanie średnich z grup badanych przy użyciu technik analizy wariancji (ANOVA). Średnią dla każdego stężenia należy następnie porównać ze średnią kontrolną przy użyciu odpowiedniej metody wielokrotnego porównania lub testu trendu. Przydatny może być test Dunnetta lub test Williamsa (12)(14)(15)(16)(17). Należy ocenić, czy przyjęte w ANOVA założenie jednorodności wariancji nadal obowiązuje. Ocenę tę można przeprowadzić graficznie albo za pomocą formalnego testu (17). Odpowiednimi do tego celu testami są testy Levene'a lub Bartletta. Niespełnienie założenia o jednorodności wariancji można niekiedy skorygować za pomocą transformacji logarytmicznej danych. Jeżeli niejednorodność wariancji jest ekstremalna i nie można jej skorygować przez transformację, należy rozważyć analizę za pomocą takich metod jak regresyjne testy Jonckheere'a. Dodatkowe wskazówki dotyczące wyznaczania NOEC można znaleźć w (11).
58. W wyniku najnowszych osiągnięć naukowych zaleca się odstąpienie od stosowania pojęcia NOEC i zastąpienie go opartymi o regresję oszacowaniami punktowymi wartości ECx. Dla opisywanego badania glonów nie ustalono odpowiedniej wartości x. Wydaje się, że odpowiedni jest przedział 10-20 % (w zależności od wybranej zmiennej zależnej), a najlepiej należy podać zarówno EC10, jak i EC20.
Stymulacja wzrostu
59. Przy niskich stężeniach obserwuje się niekiedy stymulację wzrostu (zahamowanie ujemne). Może to wynikać z hormezy ("toksycznej stymulacji") albo z dodania stymulujących czynników wzrostu z materiałem badanym do użytej minimalnej pożywki. Należy zwrócić uwagę, że dodanie nieorganicznych składników odżywczych nie powinno mieć bezpośrednich skutków, ponieważ pożywka powinna zachować nadmiar składników odżywczych w ciągu całego badania. Stymulację niskodawkową można zwykle pominąć w obliczeniach EC50, chyba że jest skrajna. Jeżeli jednak jest ona skrajna albo jeżeli ma być obliczona wartość ECx dla małego x, wówczas mogą być wymagane specjalne procedury. Należy w miarę możliwości unikać usuwania reakcji stymulujących z analizy danych i jeżeli dostępne oprogramowanie do dopasowywania krzywych nie może zaakceptować drobnej stymulacji, wówczas można posłużyć się interpolacją liniową z metodą bootstrap. Jeżeli stymulacja jest skrajna, można rozważyć zastosowanie modelu hormezy (18).
Nietoksyczne zahamowanie wzrostu
60. Materiały badane pochłaniające światło mogą przyczyniać się do ograniczenia tempa wzrostu, ponieważ zacienienie zmniejsza ilość dostępnego światła. Takie fizyczne typy skutków należy oddzielić od skutków toksycznych przez zmodyfikowanie warunków badania, a te pierwsze skutki podać osobno w sprawozdaniu. Wskazówki można znaleźć w (2) i (3).
SPRAWOZDANIE Z BADANIA
61. Sprawozdanie z badania musi zawierać poniższe informacje. Badana substancja chemiczna:
- właściwości fizyczne i, w stosownych przypadkach, właściwości fizykochemiczne, w tym graniczna rozpuszczalność w wodzie;
- dane identyfikacyjne substancji chemicznej (np. numer CAS), w tym czystość (zanieczyszczenia). Badany gatunek:
- szczep, dostawca lub źródło oraz zastosowane warunki kultury.
Warunki badania:
- data rozpoczęcia badania i czas jego trwania;
- opis projektu badania: naczynia badawcze, objętości kultur, zagęszczenie biomasy na początku badania;
- skład pożywki;
- badane stężenia i kontrpróby (np. liczba kontrprób, liczba badanych stężeń oraz zastosowany ciąg geometryczny);
- opis sporządzania roztworów do badań, w tym użycia rozpuszczalników itp.
- urządzenie do hodowli kultur;
- natężenie i jakość światła (źródło, jednorodność);
- temperatura;
- badane stężenia: badane stężenia nominalne oraz wszelkie wyniki analiz ustalających stężenia badanej substancji chemicznej w naczyniach badawczych. Należy odnotować sprawność metody oraz granicę oznaczalności w zestawie badań;
- wszelkie odstępstwa od niniejszej metody badawczej;
- metoda określania biomasy oraz dowody korelacji pomiędzy mierzonym parametrem a suchą masą. Wyniki:
- wartości pH na początku i na końcu badania w przypadku wszystkich zabiegów;
- biomasa dla każdej kolby w każdym punkcie pomiarowym oraz metoda pomiaru biomasy;
- krzywe wzrostu (wykres zależności biomasy od czasu);
- obliczone zmienne zależne dla każdej kontrpróby poddanej zabiegowi wraz z wartościami średnimi i współczynnikiem zmienności dla kontrprób;
- graficzne przedstawienie zależności stężenie/skutek;
- oszacowania toksyczności dla zmiennych zależnych, np. EC50, EC10, EC20 oraz związane z nimi przedziały ufności. LOEC i NOEC, jeżeli zostały obliczone, oraz metody statystyczne użyte do ich wyznaczenia;
- jeżeli zastosowano ANOVA - wielkość wpływu, który można wykryć (np. najmniejsza znacząca różnica);
- wszelka stymulacja wzrostu stwierdzona w którymkolwiek zabiegu;
- wszelkie inne zaobserwowane skutki, np. morfologiczne zmiany glonów;
- omówienie wyników, w tym ewentualny wpływ na wynik badania będący skutkiem odstępstw od niniejszej metody badawczej.
BIBLIOGRAFIA
(1) Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (1993). ISO 8692: Water quality - Algal growth inhibition test.
(2) Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (1998). ISO/DIS 14442. IWater quality - Guidance for algal growth inhibition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water.
(3) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Publikacje na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa. Seria dotycząca badań i oceny, nr 23. Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju, Paryż.
(4) Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (1998). ISO 5667-16 Water quality - Sampling - Part 16: Guidance on Biotesting of Samples.
(5) Mayer, P., Cuhel, R. i Nyholm, N. (1997). A simple in vitro fluorescence method for biomass measurements in algal growth inhibition tests. Water Research 31: 2 525-2 531.
(6) Slovacey, R.E. i Hanna, P.J. (1997). In vivo fluorescence determinations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceanography 22: 919-925
(7) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. i Batley, G.E. (2003). Effect of declining toxicant concentrations on algal bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem. 22: 2073-2079.
(8) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984). Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.
(9) Nyholm N., Sørensen P.S., Kusk K.O. i Christensen E.R. (1992). Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.
(10) Bruce, R.D. i Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11: 1485-1494.
(11) OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju, Paryż.
(12) Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121
(13) Norberg-King T.J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.
(14) Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.
(15) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.
(16) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 519-531.
(17) Draper, N.R. i Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, wydanie 2. Wiley, Nowy Jork.
(18) Brain, P. i Cousens, R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
Dodatek 1
Definicje
Do celów niniejszej metody badawczej użyto następujących definicji i skrótów.
Biomasa jest to sucha masa materii żywej obecnej w populacji, przypadająca na objętość, np. mg glonów/litr roztworu do badań. Zwykle "biomasę" określa się w postaci masy, lecz w niniejszym badaniu słowo to użyte jest w odniesieniu do masy przypadającej na objętość. Ponadto w niniejszym badaniu zwykle mierzy się również surogaty biomasy, takie jak liczba komórek, fluorescencja itp., w związku z czym określenie "biomasa" odnosi się także do tych pomiarów zastępczych.
Substancja chemiczna oznacza substancję lub mieszaninę.
Współczynnik zmienności jest bezwymiarową miarą zmienności parametru, określoną jako stosunek odchylenia standardowego do średniej. Może on być również wyrażony jako wartość procentowa. Średni współczynnik zmienności średniej właściwej szybkości wzrostu w kulturach kontrolnych kontrprób należy obliczyć w następujący sposób:
1. obliczyć procentowy współczynnik zmienności średniej właściwej szybkości wzrostu z szybkości wzrostu dla poszczególnych dni/odcinków dla odnośnej kontrpróby;
2. obliczyć wartość średnią ze wszystkich wartości obliczonych w punkcie 1, aby otrzymać średni współczynnik zmienności właściwej szybkości wzrostu dla poszczególnych dni/odcinków w kontrpróbach kultur kontrolnych.
ECxjest stężeniem badanej substancji chemicznej rozpuszczonej w pożywce, powodującym zmniejszenie wzrostu organizmu użytego do badania o x % (np. 50 %) w danym okresie narażenia (który należy wyraźnie określić, jeśli odbiega od pełnego lub normalnego czasu trwania badania). Aby jednoznacznie oznaczyć wartość stężenia efektywnego (EC) wynikającą z szybkości wzrostu albo przyrostu, w odniesieniu do szybkości wzrostu używa się symbolu "ErC", a w odniesieniu do przyrostu - symbolu "EyC".
Pożywka jest to kompletne syntetyczne podłoże, na którym glony wzrastają, gdy są narażone na działanie badanej substancji chemicznej. Badana substancja chemiczna jest zwykle rozpuszczona w pożywce.
Szybkość wzrostu (średnia właściwa szybkość wzrostu) jest to logarytmiczny przyrost biomasy w okresie narażenia.
Najniższe stężenie, przy którym obserwuje się zmiany (LOEC) jest to najniższe badane stężenie, przy którym obserwuje się, że substancja chemiczna ma statystycznie istotny wpływ na ograniczenie wzrostu (przy p < 0,05) w porównaniu z grupą kontrolną w danym czasie narażenia. Jednakże wszystkie badane stężenia powyżej LOEC muszą mieć szkodliwy skutek równy lub większy niż te, które są obserwowane przy LOEC. W przypadku gdy te dwa warunki nie mogą być spełnione, należy szczegółowo wyjaśnić, w jaki sposób wybrano LOEC (a następnie NOEC).
Stężenie, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC) jest to badane stężenie bezpośrednio poniżej LOEC.
Zmienna zależna jest to zmienna służąca do szacowania toksyczności, uzyskana z dowolnych zmierzonych parametrów opisujących biomasę za pomocą różnych metod obliczania. W przypadku niniejszej metody badawczej zmiennymi zależnymi są szybkość wzrostu i przyrost, które otrzymuje się bezpośrednio z pomiaru biomasy albo z pomiaru dowolnego ze wspomnianych surogatów.
Właściwa szybkość wzrostu jest to zmienna zależna określona jako iloraz różnicy logarytmów naturalnych parametru obserwacji (w niniejszej metodzie badawczej - biomasy) i odnośnego okresu.
Badana substancja chemiczna oznacza dowolną substancję lub mieszaninę badaną za pomocą niniejszej metody badawczej.
Przyrost jest to wartość zmiennej pomiarowej na końcu okresu narażenia minus wartość zmiennej pomiarowej na początku okresu narażenia, wyrażająca przyrost biomasy w trakcie badania.
Dodatek 2
Szczepy nadające się do wykorzystania w badaniu
Zielenice
Pseudokirchneriella subcapitata (znana wcześniej jako Selenastrum capricornutum), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG
Desmodesmus subspicatus (znana wcześniej jako Scenedesmus subspicatus), 86.81 SAG
Okrzemki
Navicula pelliculosa, UTEX 664
Cyjanobakterie
Anabaena flos-aquae, UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A
Synechococcus leopoliensis, UTEX 625, CCAP 1405/1
Źródła szczepów
Zalecane szczepy dostępne są w kulturach pojedynczych glonów z następujących zbiorów (w kolejności alfabetycznej):
ATCC: American Type Culture Collection
10801 University Boulevard
Manassas, Virginia 20110-2209
STANY ZJEDNOCZONE
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa
Institute of Freshwater Ecology,
Windermere Laboratory
Far Sawrey, Ambleside
Cumbria LA22 0LP
ZJEDNOCZONE KRÓLESTWO
SAG: Collection of Algal Cultures
Inst. Plant Physiology
University of Göttingen
Nikolausberger Weg 18
37073 Göttingen
NIEMCY
UTEX Culture Collection of Algae
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology
School of Biological Sciences
the University of Texas at Austin
Austin, Texas 78712
STANY ZJEDNOCZONE.
Wygląd i cechy charakterystyczne zalecanych gatunków
| P. subcapitata | D. subspicatus | N. pelliculosa | A. flos-aquae | S. leopoliensis | |
| Wygląd | Zakrzywione, skręcone pojedyncze komórki | Owalne, głównie pojedyncze komórki | Pałeczki | Łańcuchy owalnych komórek | Pałeczki |
| Rozmiar (dł. × szer.) µm | 8-14 × 2-3 | 7-15 × 3-12 | 7,1 × 3,7 | 4,5 × 3 | 6 × 1 |
| Objętość komórek (µm3/ko-mórka) | 40-601 (1) | 60-801 (1) | 40-501 (1) | 30-401 (1) | 2,5 (2) |
| Sucha masa komórek (mg/komórka) | 2-3 × 10- 8 | 3-4 × 10- 8 | 3-4 × 10- 8 | 1-2 × 10- 8 | 2-3 × 10- 9 |
| Szybkość wzrostu (3) (dzień- 1) | 1,5-1,7 | 1,2-1,5 | 1,4 | 1,1-1,4 | 2,0-2,4 |
| (1) Zmierzone za pomocą elektronicznego licznika cząstek. (2) Obliczone na podstawie rozmiaru. (3) Najczęściej obserwowana szybkość wzrostu w pożywce OECD przy natężeniu światła wynoszącym około 70 µE m- 2 s- 1 i 21 ° C. |
Specjalne zalecenia dotyczące hodowli i prowadzenia kultur gatunków zalecanych do użycia w badaniach
Pseudokirchneriella subcapitata i Desmodesmus subspicatus
Zielenice te są zasadniczo łatwe do utrzymania na różnych pożywkach hodowlanych. Informacje dotyczące odpowiednich pożywek są dostępne w placówkach posiadających zbiory kultur. Komórki występują zazwyczaj pojedynczo, a pomiary zagęszczenia komórek można z łatwością wykonać za pomocą elektronicznego licznika cząstek lub mikroskopu.
Anabaena flos-aquae
W celu utrzymania kultury wyjściowej stosować można różne pożywki. Szczególnie istotne jest, aby w hodowlach okresowych nie dopuścić do przekroczenia fazy logarytmicznego wzrostu podczas odnawiania, ponieważ odzysk w tym momencie jest utrudniony.
Anabaena flos-aquae tworzy agregaty upakowanych łańcuchów komórek. Wielkość tych agregatów różni się w zależności od warunków hodowli. W przypadku liczenia komórek pod mikroskopem może zachodzić konieczność rozbicia tych skupisk; ewentualnie do obliczenia biomasy używa się elektronicznego licznika cząstek.
Aby ograniczyć zmienność wyników obliczeń, można rozbijać podpróbki metodą sonikacji. Sonikacja trwająca dłużej niż wymaga tego rozbicie łańcuchów na krótsze odcinki może spowodować zniszczenie komórek. W przypadku każdego zabiegu natężenie i czas trwania sonikacji muszą być identyczne.
Aby łatwiej było skompensować zmienność wyników liczenia, należy policzyć na hemocytometrze dostateczną liczbę pól (co najmniej 400 komórek). Pozwoli to zwiększyć wiarygodność mikroskopowych oznaczeń gęstości.
Po uprzednim rozbiciu łańcuchów komórek metodą sonifikacji z zachowaniem ostrożności, do wyznaczenia całkowitej objętości komórek Anabaena można użyć elektronicznego licznika cząstek. Energia procesu sonifikacji musi zostać wyregulowana, aby nie doprowadzić do rozerwania komórek.
Użyć wstrząsarki lub podobnej odpowiedniej metody w celu zapewnienia dobrego wymieszania i jednorodności zawiesiny glonów użytej do zaszczepiania naczyń badawczych.
Naczynia badawcze należy umieścić na blacie wstrząsarki o ruchu obrotowym lub posuwistozwrotnym, nastawionej na około 150 obrotów na minutę. Innym rozwiązaniem jest zastosowanie wstrząsania przerywanego, aby zmniejszyć tendencję bakterii Anabaena do zbijania się w skupiska. W przypadku tworzenia się skupisk należy dołożyć starań, aby uzyskać próbki reprezentatywne dla pomiarów biomasy. Przed pobraniem próbek może zajść potrzeba energicznego wstrząsania w celu rozbicia skupisk glonów.
Synechococcus leopoliensis
W celu utrzymania hodowli kultury wyjściowej stosować można różne pożywki. Informacje dotyczące odpowiednich pożywek są dostępne w placówkach posiadających zbiory kultur.
Synechococcus leopoliensis rozwija się w postaci odosobnionych komórek mających kształt laseczek. Komórki są bardzo małe, przez co liczenie mikroskopowe na potrzeby pomiarów biomasy jest skomplikowane. Przydatne są elektroniczne liczniki cząstek przystosowane do liczenia cząstek o minimalnych rozmiarach wynoszących około 1 µm. Można zastosować również pomiary fluorometryczne in vitro.
Navicula pelliculosa
W celu utrzymania hodowli kultury wyjściowej stosować można różne pożywki. Informacje dotyczące odpowiednich pożywek są dostępne w placówkach posiadających zbiory kultur. Należy zwrócić uwagę, że pożywka musi zawierać krzemian.
W pewnych warunkach wzrostu Navicula pelliculosa może tworzyć skupiska. Z uwagi na wytwarzanie lipidów komórki glonów wykazują niekiedy tendencję do gromadzenia się w warstwie powierzchniowej. Aby w takich okolicznościach uzyskać próbki reprezentatywne, należy zastosować szczególne środki podczas pobierania podpróbek do określania biomasy. Konieczne może być energiczne mieszanie, np. z użyciem wstrząsarki.
Dodatek 3
Pożywki
Można stosować jedną z dwóch wymienionych poniżej pożywek:
- pożywkę OECD: pierwotna pożywka według dotyczącej badań wytycznej OECD nr 201, zgodna również z normą ISO 8692;
- pożywka AAP (US EPA), zgodna również z ASTM.
Do przygotowania tych pożywek należy użyć odczynników lub substancji chemicznych do analiz oraz wody dejonizowanej.
Skład pożywki AAP (US EPA) i pożywki OECD TG 201
| Składnik | AAP | OECD |
| mg/l | mM | mg/l | mM | |
| NaHCO3 | 15,0 | 0,179 | 50,0 | 0,595 |
| NaNO3 | 25,5 | 0,300 | ||
| NH4Cl | 15,0 | 0,280 | ||
| MgCl2∙ 6(H2O) | 12,16 | 0,0598 | 12,0 | 0,0590 |
| CaCl2∙ 2(H2O) | 4,41 | 0,0300 | 18,0 | 0,122 |
| MgSO4∙ 7(H2O) | 14,6 | 0,0592 | 15,0 | 0,0609 |
| K2HPO4 | 1,044 | 0,00599 | ||
| KH2PO4 | 1,60 | 0,00919 | ||
| FeCl3∙ 6(H2O) | 0,160 | 0,000591 | 0,0640 | 0,000237 |
| Na2EDTA∙ 2(H2O) | 0,300 | 0,000806 | 0,100 | 0,000269* |
| H3BO3 | 0,186 | 0,00300 | 0,185 | 0,00299 |
| MnCl2∙ 4(H2O) | 0,415 | 0,00201 | 0,415 | 0,00210 |
| ZnCl2 | 0,00327 | 0,000024 | 0,00300 | 0,0000220 |
| CoCl2∙ 6(H2O) | 0,00143 | 0,000006 | 0,00150 | 0,00000630 |
| Na2MoO4∙ 2(H2O) | 0,00726 | 0,000030 | 0,00700 | 0,0000289 |
| CuCl2∙ 2(H2O) | 0,000012 | 0,00000007 | 0,00001 | 0,00000006 |
| pH | 7,5 | 8,1 |
Stosunek molowy EDTA do żelaza nieznacznie przekracza jeden. Zapobiega to strącaniu się żelaza, a jednocześnie zminimalizowane jest chelatowanie jonów metali ciężkich.
W badaniu z użyciem okrzemka Navicula pelliculosa obydwie pożywki należy uzupełnić Na2SiO3 9H20, aby uzyskać stężenie 1,4 mg Si/l.
Wartość pH pożywki uzyskuje się przy zachowaniu równowagi pomiędzy układem węglanowym pożywki a ciśnieniem cząstkowym CO2 w powietrzu atmosferycznym. Przybliżona zależność pomiędzy pH w temp. 25 °C a stężeniem molowym dwuwęglanu jest następująca:
pHeq = 11.30 + log[HCO3]
Przy 15 mg NaHCO3/l, pHeq = 7,5 (pożywka U.S. EPA), a przy 50 mg NaHCO3/l, pHeq = 8,1 (pożywka OECD).
Skład pierwiastkowy pożywek przeznaczonych do badań
| Pierwiastek | AAP | OECD |
| mg/l | mg/l | |
| C | 2,144 | 7,148 |
| N | 4,202 | 3,927 |
| P | 0,186 | 0,285 |
| K | 0,469 | 0,459 |
| Na | 11,044 | 13,704 |
| Ca | 1,202 | 4,905 |
| Mg | 2,909 | 2,913 |
| Fe | 0,033 | 0,017 |
| Mn | 0,115 | 0,115 |
Przygotowanie pożywki OECD
| Składnik odżywczy | Stężenie w roztworze podstawowym |
| Roztwór podstawowy 1: | |
| makroskładniki odżywcze | |
| NH4Cl | 1,5 g/l |
| MgCl2∙ 6H2O | 1,2 g/l |
| CaCl2∙ 2H2O | 1,8 g/l |
| MgSO4∙ 7H2O | 1,5 g/l |
| KH2PO4 | 0,16 g/l |
| Roztwór podstawowy 2: | |
| żelazo | |
| FeCl3∙ 6H2O | 64 mg/l |
| Na2EDTA∙ 2H2O | 100 mg/l |
| Roztwór podstawowy 3: | |
| pierwiastki śladowe | |
| H3BO3 | 185 mg/l |
| MnCl2∙ 4H2O | 415 mg/l |
| ZnCl2 | 3 mg/l |
| CoCl2∙ 6H2O | 1,5 mg/l |
| CuCl2∙ 2H2O | 0,01 mg/l |
| Na2MoO4∙ 2H2O | 7 mg/l |
| Roztwór podstawowy 4: | |
| wodorowęglan | |
| NaHCO3 | 50 g/l |
| Na2SiO3∙ 9H20 |
Roztwory podstawowe poddać sterylizacji na filtrze membranowym (średnia średnica porów 0,2 µm) lub w autoklawie (120 °C, 15 minut). Roztwory przechowywać bez dostępu światła w temperaturze 4 °C.
Roztworów podstawowych 2 i 4 nie poddawać sterylizacji w autoklawie, tylko na filtrze membranowym.
Przygotować pożywkę, dodając do wody roztwory podstawowe 1-4 w odpowiedniej objętości:
do 500 ml wysterylizowanej wody dodać:
10 ml roztworu podstawowego 1;
1 ml roztworu podstawowego 2;
1 ml roztworu podstawowego 3;
1 ml roztworu podstawowego 4;
Uzupełnić wysterylizowaną wodą do 1 000 ml.
Zapewnić wystarczająco dużo czasu na osiągnięcie równowago między pożywką i CO2, w razie potrzeby stosując przez kilka godzin barbotaż sterylnym, przefiltrowanym powietrzem.
Przygotowanie pożywki U.S. EPA
1. Dodać 1 ml każdego roztworu podstawowego wymienionego w pkt 2.1-2.7 do około 900 ml wody dejonizowanej lub destylowanej, a następnie uzupełnić do 1 l.
2. Roztwory podstawowe makroskładników odżywczych sporządza się, rozpuszczając poniższe substancje w 500 ml wody dejonizowanej lub destylowanej. Odczynniki w pkt 2.1, 2.2, 2.3 oraz 2.4 można połączyć w jeden roztwór podstawowy.
2.1 NaNO312,750 g.
2.2 MgCl2∙ 6H2O6,082 g.
2.3 CaCl2∙ 2H2O2,205 g.
2.4 Roztwór podstawowy mikroskładnika odżywczego (zob. pkt 3).
2.5 MgSO4∙ 7H2O7,350 g.
2.6 K2HPO40,522 g.
2.7 NaHCO37,500 g.
2.8 Na2SiO3∙ 9H2OZob. uwaga 1.
Uwaga 1: Stosować wyłącznie w odniesieniu do gatunków okrzemków używanych do badania. Można dodać bezpośrednio (202,4 mg) lub za pośrednictwem roztworu podstawowego, aby otrzymać w pożywce stężenie końcowe Si wynoszące 20 mg/l.
3. Roztwór podstawowy mikroskładników odżywczych sporządza się, rozpuszczając poniższe substancje w 500 ml wody dejonizowanej lub destylowanej:
3.1 H3BO392,760 mg.
3.2 MnCl2∙ 4H2O207,690 mg.
3.3 ZnCl21,635 mg.
3.4 FeCl3∙ 6H2O79,880 mg.
3.5 CoCl2∙ 6H2O0,714 mg.
3.6 Na2MoO4∙ 2H2O3,630 mg.
3.7 CuCl2∙ 2H2O0,006 mg.
3.8 Na2EDTA∙ 2H2O150,000 mg [sól dwusodowa kwasuetyleno-diaminotetraoctowego];
3.9 Na2SeO4∙ 5H2O0,005 mg Zob. uwaga 2.
Uwaga 2: Stosować tylko w pożywce dla kultur wyjściowych gatunków okrzemków.
4. Wyregulować pH do 7,5 ± 0,1 za pomocą 0,1 N lub 1,0 N NaOH lub HCl.
5. Przefiltrować pożywkę do sterylnego pojemnika przez filtr membranowy 0,22 mm, jeżeli ma być użyty licznik cząstek, a w przeciwnym wypadku - filtr 0,45 mm.
6. Do czasu użycia pożywkę należy przechowywać bez dostępu światła w temperaturze około 4 °C.
Dodatek 4
Przykład procedury hodowli glonów
Obserwacje ogólne
Celem hodowli na podstawie niniejszej procedury jest uzyskanie hodowli glonów do badań toksyczności.
Należy zastosować odpowiednie metody, aby nie dopuścić do zainfekowania hodowli glonów bakteriami. Pożądane mogą być kultury akseniczne, jednak należy utworzyć i używać monogatunkowej hodowli glonów.
Wszystkie czynności muszą być wykonywane w warunkach sterylnych, aby zapobiec zanieczyszczeniu bakteriami i innymi glonami.
Sprzęt i materiały
Zob. metoda badawcza: Aparatura.
Procedury otrzymywania kultur glonów
Przygotowanie roztworów składników odżywczych (pożywki):
Wszystkie sole odżywcze pożywki przygotowuje się w postaci stężonych roztworów podstawowych i przechowuje się w chłodnym miejscu bez dostępu światła. Roztwory te sterylizuje się, filtrując je lub sterylizując w autoklawie.
Pożywkę sporządza się, dodając odpowiednią ilość roztworu podstawowego do sterylnej wody destylowanej i uważając, aby nie doszło do zakażenia. Do odżywki w postaci stałej dodaje się 0,8 % agaru.
Kultura wyjściowa:
Kultury wyjściowe są to nieduże hodowle glonów, które przenosi się regularnie na świeże podłoże, tak aby pełniły rolę początkowego materiału do badań. Jeżeli hodowle nie są regularnie zużywane, rozprzestrzeniają się, tworząc pasma na ukośnych powierzchniach agaru w próbówce. Pasma przenosi się na świeże podłoże co najmniej raz na dwa miesiące.
Kultury wyjściowe hoduje się w kolbach stożkowych zawierających odpowiednią pożywkę (pojemność około 100 ml). Gdy glony inkubuje się w 20 °C przy stałym oświetleniu, przy czym wymagane jest cotygodniowe ich przenoszenie.
Podczas przenoszenia pewna ilość starej hodowli jest przenoszona za pomocą sterylnych pipet do kolby ze świeżą pożywką, tak aby początkowe stężenie gatunków charakteryzujących się szybkim wzrostem było około 100 razy mniejsze niż w starej hodowli.
Szybkość wzrostu gatunku można wyznaczyć za pomocą krzywej wzrostu. Jeżeli jest ona znana, możliwe jest oszacowanie zagęszczenia, przy którym hodowlę należy przenieść do nowej pożywki. Należy to zrobić, zanim hodowla osiągnie fazę zamierania.
Hodowla wstępna:
Celem hodowli wstępnej jest wytworzenie odpowiedniej ilości glonów nadającej się do inokulacji badanych hodowli. Hodowlę wstępną inkubuje się w warunkach badania i wykorzystuje podczas fazy wzrostu wykładniczego, zwykle po okresie inkubacji wynoszącym 2-4 dni. Hodowle glonów należy odrzucić, w przypadku gdy występują w nich komórki zdeformowane lub anormalne.
Dodatek 5
Analiza danych za pomocą regresji nieliniowej
Założenia ogólne
Odpowiedź w badaniach glonów i badaniach wzrostu innych mikroorganizmów, czyli wzrost biomasy, ma z natury rzeczy charakter zmiennej ciągłej lub metrycznej - intensywność procesu, jeżeli zastosowano szybkość wzrostu oraz jego całkę po czasie, jeżeli wybrana została biomasa. Obydwie zmienne odniesione są do odpowiedniej średniej odpowiedzi nienarażonych kontrpróbek kontrolnych, wykazujących maksymalną odpowiedź w odniesieniu do narzuconych warunków, przy czym światło i temperatura stanowią podstawowe decydujące czynniki w badaniu z użyciem glonów. Układ jest rozłożony lub jednorodny, a biomasę można postrzegać jako kontinuum bez uwzględniania poszczególnych komórek. Rozkład wariancji typu odpowiedzi w takim układzie wiąże się wyłącznie z czynnikami doświadczalnymi (zwykle opisywanymi przez logarytmiczno-normalne lub normalne rozkłady błędu). Stanowi to przeciwieństwo typowych odpowiedzi pomiaru aktywności biologicznej z danymi binarnymi, w przypadku których często przyjmuje się, że dominującą składową wariancji jest tolerancja poszczególnych organizmów (zazwyczaj o rozkładzie dwumianowym). Odpowiedzi próby kontrolnej są tu na poziomie zerowym lub tła.
Jeżeli sytuacja nie jest skomplikowana, znormalizowana lub względna reakcja "r" maleje monotonicznie od 1 (zahamowanie zerowe) do 0 (zahamowanie 100-procentowe). Należy zwrócić uwagę, że ze wszystkimi reakcjami związany jest błąd i że pozorne ujemne zahamowania można obliczyć jedynie jako wynik błędu przypadkowego.
Analiza regresji
Modele
Celem analizy regresji jest ilościowe opisanie krzywej zależności stężenie-odpowiedź w postaci matematycznej funkcji regresji Y = f (C), lub częściej F (Z), gdzie Z = log C. Zastosowana jako odwrotność C = f- 1 (Y) pozwala obliczyć wielkości ECx, w tym EC50, EC10 i EC20 oraz ich 95 % granic ufności. Wykazano, że kilka prostych matematycznych postaci funkcji z powodzeniem opisuje zależności stężenie-odpowiedź uzyskiwane w badaniach nad zahamowaniem rozwoju glonów. Do funkcji tych należy na przykład równanie logistyczne, niesymetryczne równanie Weibulla oraz funkcja rozkładu logarytmiczno-normalnego, przy czym wszystkie one są krzywymi sigmoidalnymi dążącymi asymptotycznie do zera dla C ! 0 oraz do jedności dla C ! nieskończoności.
Zaproponowano ostatnio zastosowanie modeli opartych na ciągłych funkcjach progowych (np. modelu Kooijmana "dla zahamowania wzrostu populacji", Kooijman i in., 1996), które może też stanowić alternatywne rozwiązanie w stosunku do modeli asymptotycznych. Model ten zakłada brak efektów przy stężeniach poniżej pewnego progu, EC0+, który szacuje się, ekstrapolując zależności stężenie-odpowiedź w celu wyznaczenia punktu przecięcia z osią stężeń przy użyciu prostej funkcji ciągłej, która nie jest różniczkowalna w punkcie początkowym.
Należy zwrócić uwagę, że analiza ta może być prostą minimalizacją resztowych sum kwadratów odchyleń (przy założeniu stałej wariancji) albo ważonych kwadratów, jeżeli kompensowana jest heterogeniczność wariancji.
Procedura
Procedurę można opisać pokrótce w następujący sposób: wybrać odpowiednie równanie funkcyjne Y = f(C) i dopasować je do danych za pomocą regresji nieliniowej. Aby uzyskać jak najwięcej informacji na podstawie danych, zamiast średnich wartości kontrprób najlepiej jest wykorzystać wyniki pomiarów wykonanych w każdej kolbie oddzielnie. Jeżeli natomiast wariancja jest wysoka, to zgodnie z praktycznym doświadczeniem średnie wartości kontrprób mogą zapewnić dokładniejszą estymację matematyczną, w mniejszym stopniu obciążoną błędami systematycznymi danych, niż to ma miejsce w przypadku zachowania każdego poszczególnego punktu danych.
Należy wykreślić dopasowaną krzywą i nanieść zmierzone dane oraz zbadać, czy dopasowanie krzywej jest odpowiednie. Narzędziem szczególnie przydatnym w tym celu może być analiza reszt. Jeżeli zależność funkcyjna wybrana w celu dopasowania zależności stężenie-odpowiedź nie opisuje dobrze całej krzywej lub istotnej jej części, takiej jak odpowiedź przy niskich stężeniach, to należy wybrać inną możliwość dopasowania krzywej - np. krzywą niesymetryczną, taką jak funkcja Weibulla, zamiast symetrycznej. Ujemne zahamowania mogą stwarzać na przykład problemy w przypadku funkcji rozkładu logarytmiczno-normalnego i również wymagać zastosowania alternatywnej funkcji regresji. Nie zaleca się przypisywania takim ujemnym wartościom zerowej lub małej dodatniej wartości, ponieważ powoduje to zniekształcenie rozkładu błędów. Aby oszacować wielkości EClowx odpowiednie może być
wykonanie oddzielnych dopasowań krzywej na częściach krzywej, takich jak część o małym zahamowaniu. Obliczyć z dopasowanego równania (za pomocą "oszacowania odwrotnego" C = f- 1(Y)) charakterystyczne oszacowania punktowe ECx i podać oszacowanie EC50 jako minimum oraz jedno lub dwa oszacowania EClow x. Doświadczenie wynikające z badań praktycznych wskazuje, że precyzja badania glonów zwykle umożliwia dość dokładne oszacowanie na poziomie zahamowania równym 10 %, jeżeli istnieje dostateczna liczba punktów danych, o ile przy niskich stężeniach nie występuje stymulacja, stanowiąca czynnik zakłócający. Dokładność oszacowania EC20 jest często znacznie większa niż EC10, ponieważ EC20 zazwyczaj znajduje się w środkowej części krzywej zależności stężenie-odpowiedź, która jest w przybliżeniu liniowa. Niekiedy EC10 może być trudne w interpretacji z powodu stymulacji wzrostu. Tak więc, chociaż EC10 zwykle da się uzyskać z dostateczną dokładnością, zaleca się, aby w sprawozdaniu zawsze podawać również EC20.
Współczynniki ważenia
Wariancja doświadczalna na ogół nie jest stała i zwykle zawiera składową proporcjonalną, a zatem korzystne jest rutynowe zastosowanie metody ważonej regresji. Do takiej analizy przyjmuje się zazwyczaj współczynniki ważenia odwrotnie proporcjonalne do wariancji:
Wi = 1/Var(ri)
Wiele programów analizy regresyjnej dopuszcza opcję ważonej analizy regresji ze współczynnikami ważenia podanymi w tabeli. Dogodne jest znormalizowanie współczynników ważenia przez pomnożenie ich przez n/Σwi (n jest liczbą punktów danych), tak aby ich suma równała się jedności.
Normalizowanie odpowiedzi
Normalizowanie za pomocą średniej odpowiedzi próby kontrolnej stwarza pewne zasadnicze problemy i prowadzi do dość skomplikowanej struktury wariancji. Dzieląc odpowiedzi przez średnią odpowiedź próby kontrolnej w celu uzyskania procentowego poziomu zahamowania, wprowadza się dodatkowy błąd spowodowany błędem średniej kontrolnej. Współczynniki ważenia w regresji i granice ufności należy skorygować pod względem kowariancji za pomocą próby kontrolnej (Draper i Smith, 1981), chyba że błąd ten jest bardzo mały. Należy zwrócić uwagę, że wysoka dokładność oszacowanej średniej odpowiedzi próby kontrolnej jest ważna dla zminimalizowania ogólnej wariancji dla względnej odpowiedzi. Wariancja ta jest następująca:
(Indeks dolny "i" odnosi się do poziomu stężenia "i", a indeks dolny 0 do prób kontrolnych)
Yi = Odpowiedź względna = ri/r0 = 1 - I = f(Ci)
przy wariancji Var(Y i) = Var (ri/r0) ≅ (∂ Yi/∂ ri)2 Var(ri) + ((∂ Yi/∂ r0)2 Var(r0)
a ponieważ (∂ Yi/∂ ri) = 1/r0 oraz (∂ Y i/∂ r0) = ri/r02
mając dane o rozkładzie normalnym oraz mi i m0 kontrprób: Var(ri) = σ 2/mi
całkowita wariancja względnej odpowiedzi, Yi, staje się zatem:
Var(Yi) = σ 2/(r02 mi) + ri2 σ2/r04 m0
Błąd średniej próby kontrolnej jest odwrotnie proporcjonalny do pierwiastka kwadratowego z liczby uśrednionych kontrprób prób kontrolnych i niekiedy uzasadnione może być uwzględnienie danych historycznych i w ten sposób znaczne zmniejszenie błędu. Alternatywna procedura nie polega na normalizowaniu danych i dopasowaniu bezwzględnych odpowiedzi, w tym danych z odpowiedzi prób kontrolnych, lecz na wprowadzeniu, jako dodatkowego parametru, wartości odpowiedzi kontrolnej, która będzie dopasowana za pomocą regresji nieliniowej. W przypadku używanego zwykle dwuparametrowego równania regresji metoda ta wymaga dopasowania trzech parametrów - a tym samym większej liczby punktów danych niż nieliniowa regresja danych - które są normalizowane za pomocą zadanej odpowiedzi próby kontrolnej.
Odwrotne przedziały ufności
Obliczanie przedziałów ufności regresji nieliniowej za pomocą oszacowania odwrotnego jest dość złożone i nie jest dostępne jako opcja standardowa w zwykłych pakietach statystycznych programów komputerowych. Przybliżone granice ufności można otrzymać za pomocą standardowych programów regresji nieliniowej z reparametryzacją (Bruce i Versteeg, 1992), co polega na przepisaniu równania matematycznego z żądanymi oszacowaniami punktowymi, np. EC10 i EC50, jako parametrami, które mają być oszacowane. (Weźmy funkcję I = f (α, β, stężenie) i wykorzystajmy definicyjne zależności f (α, β, EC10) = 0,1 i f (α, β, EC50) = 0,5, aby w miejsce f α, β, stężenie) podstawić równoważną funkcję g (EC10, EC50, stężenie)).
Bardziej bezpośrednie obliczenie (Andersen i in. 1998) przeprowadza się, zachowując pierwotne równanie i stosując rozwinięcie w szereg Taylora wokół średnich ri i r0.
Ostatnio popularne stały się metody "bootstrap". Metody takie wykorzystują dane zmierzone oraz wielokrotne losowanie ze zwracaniem przeprowadzone za pomocą generatora liczb losowych do szacowania empirycznego rozkładu wariancji.
BIBLIOGRAFIA
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentrations in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632.
Draper, N.R. i Smith, H. (1981). Applied Regression Analysis, wydanie 2. Wiley, Nowy Jork.
Bruce, R.D. i Versteeg, D.J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Ecotoxicity Data. Environ. Toxicol. Chem.11, 1485-1494.
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. i Nyholm, N. (1998). Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420.
C.4. OZNACZENIE BIODEGRADOWALNOŚCI
CZĘŚĆ I. ROZWAŻANIA OGÓLNE
I.1. WPROWADZENIE
Opisano sześć metod pozwalających na sortowanie substancji chemicznych w celu biodegradowalności w aerobowych wodnych podłożach:
a) rozpuszczalny węgiel organiczny (DOC) metoda "Die-Away" (metoda C.4-A);
b) zmodyfikowane badanie przesiewowe OECD - DOC metoda "Die-Away" (metoda C.4-B);
c) wydzielanie ditlenku węgla (CO2) (Zmodyfikowane badanie Sturma) (metoda C.4-C);
d) respirometria manometryczna (metoda C.4-D);
e) zamkniętej butli (metoda C.4-E);
f) MITI (Ministerstwo Handlu Międzynarodowego i Przemysłu - Japonia) (Metoda C.4-F).
Zwykłe i ogólne rozważania do wszystkich sześciu badań podano w części I metody. Punkty specyficzne dla poszczególnych metod podano w częściach II-VII. Dodatki zawierają definicje, wzory i materiał wiodący.
Ćwiczenie porównawcze międzynarodowego laboratorium OECD, przeprowadzone w 1988 r., pokazały ze metody dają zgodne wyniki. Jednakże w zależności od fizycznych charakterystyk badanych substancji jedna lub inne metody są zalecane.
I.2. WYBÓR ODPOWIEDNIEJ METODY
W celu wybrania najbardziej odpowiedniej metody podstawowe jest posiadanie informacji na temat rozpuszczalności chemicznej, prężności pary i charakterystyk adsorpcji. Powinna być znana struktura chemiczna i wzór w celu obliczenia teoretycznych wartości i/lub sprawdzenia wartości pomierzonych parametrów, na przykład ThOD, ThCO2, DOC, TÓC, COD (zob. załącznik I i II).
Badania substancji chemicznych rozpuszczalnych w wodzie w co najmniej 100 mg/l mogą być oszacowane wszystkimi metodami, pod warunkiem że są one nielotne i nieabsorbujące. Dla tych substancji chemicznych, które są słabo rozpuszczalne w wodzie, lotne lub adsorbujące, odpowiednie metody wskazano w tabeli 1. Sposób w który substancje chemiczne słabo rozpuszczalne w wodzie można przygotować opisano w załączniku III. Średnio lotne substancje chemiczne mogą być badane metodą DOC (metoda "Die-Away"), jeżeli jest wystarczająca przestrzeń na gaz w naczyniach pomiarowych (które powinny być odpowiednio zakorkowane). W tym przypadku należy ustawić kontrolę abiotyczną, by nie pozwolić na jakiekolwiek straty fizyczne.
Tabela 1
Stosowalność metod badania
| Badanie | Metoda analityczna | Odpowiedniość dla substancji, które są: | ||
| Słabo rozpuszczalne | lotne | adsorbujące | ||
| DOC Die-Away | Rozpuszczalny węgiel organiczny | - | - | +/- |
| Zmod. OECD Die-Away | Rozpuszczalny węgiel organiczny | - | - | +/- |
| Wydzielanie CO2 | Respirometria: wydzielanie CO2 | + | - | + |
| Respirometria manometryczna | Respirometria manometryczna: zużycie tlenu | + | +/- | + |
| Zamkniętej butla | Respirometria: rozpuszczony tlen | +/- | + | + |
| MITI | Respirometria: zużycie tlenu | + | +/- | + |
Wymagane są informacje na temat czystości lub względnych stosunków głównych składników badanego materiału w celu interpretacji uzyskanych wyników, szczególnie gdy wyniki są niskie lub marginalne.
Informacje na temat toksyczności badanej substancji w stosunku do bakterii (załącznik IV) są bardzo użyteczne dla wyboru odpowiednich stężeń badania i mogą być podstawowe dla prawidłowej interpretacji niskich wartości biodegradacji.
I.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
W celu sprawdzenia procedury chemiczne substancje odniesienia spełniające kryteria łatwej biodegradowalności są badane przez umieszczenie w odpowiedniej kolbie równolegle do zwykłego przebiegu badania.
Odpowiednimi substancjami chemicznymi są anilina (świeżo destylowana), octan sodu i benzoesan sodu. Te chemiczne substancje odniesienia całkowicie degradują się w tych metodach, nawet gdy nie dodano przezornie inokulum.
Zasugerowano, że należy szukać chemicznej substancji odniesienia, która by była łatwo biodegradowalna, lecz wymagałaby dodania inokulum. Zaproponowano wodoroftalan potasu lecz potrzeba uzyskać więcej dowodów dla tej substancji przed jej zaakceptowaniem jako substancji odniesienia.
W badaniach respirometrycznych, związki zawierające azot oddziaływują na pobieranie tlenu z powodu procesu nitryfikacji (zob. załączniki II i V).
I.4. ZASADA METOD BADAŃ
Roztwór lub zawiesinę substancji badanej na podłożu mineralnym jest zaszczepiany i inkubowany w warunkach aerobowych w ciemności lub rozproszonym świetle. Ilość DOC w roztworze badanym powinna być utrzymywana tak mała jak to możliwe w porównaniu z ilością DOC spodziewanej w substancji badanej. Wykonuje się poprawkę na aktywność endogeniczną inokulum przez prowadzenie równoległych badań ślepych z inokulum, ale bez substancji badanej, chociaż endogeniczna aktywność komórek w obecności substancji nie tak samo dokładnie odpowiada tej w kontroli endogenicznej. Substancja odniesienia jest równolegle badana w celu sprawdzenia operacji procedury.
Ogólnie biorąc, degradacja jest wykonywana przez oznaczanie parametrów takich jak DOC, tworzenie CO2 i pobrany tlen, wykonywane są pomiary w dostatecznie częstych odstępach czasu pozwalających na identyfikację początku i końca biodegradacji. Przy zastosowaniu automatycznych respirometrów pomiar staje się ciągły. DOC jest czasem mierzony dodatkowo do innych parametrów, lecz jest to zwykle wykonywane tylko na początku i końcu badania. Stosuje się także specyficzną analizę chemiczną do oceny pierwotnej degradacji substancji badanej i do oznaczenia stężenia wszystkich utworzonych substancji pośrednich (obligatoryjne w badaniu MITI).
Zwykle badanie biegnie przez 28 dni. Badanie jednakże można zakończyć przed upływem 28 dni, to jest wtedy kiedy krzywa biodegradacji osiąga plateau dla co najmniej 3 oznaczeń. Badania można także wydłużyć ponad 28 dni, jeżeli krzywa pokazuje, że biodegradacja rozpoczęła się natomiast nie osiągnięto plateau 28 dnia.
I.5. KRYTERIA JAKOŚCI
I.5.1. Odtwarzalność
Z powodu istoty biodegradacji oraz stosowania mieszanych populacji bakteryjnych oznaczenia przeprowadzać co najmniej zdublowane.
Ze zwykłego doświadczenia wynika, iż im większe jest stężenie drobnoustrojów wstępnie dodanych do podłoża badawczego, tym mniejsze będą zmiany między replikami. Badanie obrączkowe również pokazuje, że mogą występować duże zmiany między wynikami uzyskanymi przez rożne laboratoria, lecz zwykle uzyskuje się dobrą zgodność przy zastosowaniu łatwo degradowalnych związków.
I.5.2. Ważność badania
Badanie uznaje się za ważne, jeżeli różnica ekstremów wartości replikowanych zdjętych z plateau badanej substancji pod koniec badania lub pod koniec badania 10-dniowego "okiennego" jest na koniec badania, odpowiednio, mniejsza od 20 %, oraz jeżeli procentowa degradacja substancji odniesienia osiągnęła poziom łatwej biodegradacji przez 14 dni. Jeżeli jeden z tych warunków nie jest spełniony badanie należy powtórzyć. Z powodu ostrości tych metod niskie wartości niekoniecznie oznaczają, że substancja badana nie jest biodegradowalna w warunkach środowiskowych, lecz wskazuje, że konieczne jest więcej wysiłków do ustalenia biodegradowalności.
Jeżeli w badaniu toksyczności, zawierającym zarówno substancję badaną, jak i chemiczną substancję odniesienia, zachodzi mniej niż 35 % degradacji (w oparciu o DOC) lub mniej niż 25 % (w oparciu o ThOD lub ThCO2) w ciągu 14 dni, badaną substancję można ocenić jako inhibitor (zob. także załącznik IV). Należy powtórzyć serie badań, jeżeli możliwe jest użycie niższego stężenia badanej substancji i/lub wyższego stężenia inokulum, lecz nie większego niż 30 mg ciała stałego/litr.
I.6. PROCEDURY OGÓLNE I PRZYGOTOWANIA
Ogólne warunki stosowane w badaniach podsumowano w tabeli 2. Przyrząd oraz inne warunki eksperymentalne specyficznie właściwe dla poszczególnych badań opisano dalej, pod nagłówkami dla danego badania.
Tabela 2
Warunki badania
| Badanie | DOC (metoda "Die-Away" | CO2 wydzielanie | Respirometria manometryczna | Zmodyfikowane OECD badanie przesiewowe | Zamknięta butla | MITT (I) |
| Stężenie badanej substancji jako | |||||
| mg/l | 100 V | 2-10 | 100 | ||
| mg DOC/l | 10-40 | 10-20 | 10-40 | ||
| mg ThOD/1 | 50-100 | 5-10 |
| Stężenie inokulum (komórek/ l, przybliżone) | ≤ 30 mg/1 SS lub ≤ 100 ml wycieku/l (107 - 108) | 0,5 ml wtórny wyciek/1 (105) | < 5 ml wycieku/1 (104 -106) | 30 mg/1 SS (107-108) |
| Stężenie pierwiastków w podłożu mineralnym (w mg/1) | |||
| P | 116 | 11,6 | 29 |
| N | 1,3 | 0,13 | 1,3 |
| Na | 86 | 8,6 | 17,2 |
| K | 122 | 12,2 | 36,5 |
| Mg | 2,2 | 2,2 | 6,6 |
| Ca | 9,9 | 9,9 | 29,7 |
| Fe | 0,05- 0,1 V | 0,05- 0,1 | 0,15 |
| pH | 7,4 ± 0,2 | korzystnie 7,0 |
| Temperatura | 22 ± 2 °C |
| DOC = rozpuszczony węgiel organiczny | ThOD = teoretyczne zapotrzebowanie tlenu | SS =zawieszone ciała stałe |
I.6.1. Woda rozcieńczająca
Stosuje się dejonizowaną lub destylowaną wodę, wolne od inhibujących stężeń substancji toksycznych (np. jonów Cu ++). Musi zawierać nie więcej niż 10 % zawartości węgla organicznego wprowadzanego w badanym materiale. Konieczna jest woda do badań o wysokiej czystości w celu eliminacji wysokich wartości dla śłepej próby. Zanieczyszczenia mogą pochodzić z naturalnych zanieczyszczeń wody ale również z żywic jonowymiennych oraz lizowanych materiałów bakteryjnych i glonów. Dla każdej serii badań stosuje się tylko jedną partię wody sprawdzoną uprzednio analizą DOC. Takie sprawdzenie nie jest konieczne dla badania "zamkniętej butli", lecz zapotrzebowanie wody na tlen musi być niskie.
I.6.2. Roztwory podstawowe składników mineralnych
Do sporządzenia roztworów badanych sporządzane są roztwory podstawowe o odpowiednich stężeniach składników mineralnych. Następujące roztwory podstawowe są używane (o różnych współczynnikach rozcieńczenia) dla metod DOC "Die-Away" zmodyfikowanego badania przesiewowego OECD, wydzielanie CO2, respirometrii manometrycznej i badania "zamkniętej butli".
Współczynniki rozcieńczenia oraz, dla badania MITI, właściwie przygotowane podłoża mineralne podano pod nagłówkami właściwych badań.
Roztwory podstawowe:
Przygotować następujące roztwory podstawowe, stosując odczynniki czystości analitycznej.
a) Diwodoroortofosforan monopotasu, KH2PO48,50 g
Monowodoroortofosforan dipotasu, K2HPO421,75 g
Diwodny monowodoroortofosforan disodium Na2HPO4. 2 H2O33,40 g
Chlorek amonu, NH4CI0,50 g
Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra. Wartość pH roztworu powinna być 7,4.
b) Chlorek wapnia, bezwodny, CaCl227,50 g
lub chlorek wapnia diwodny, CaCl2, 2 H2O36,40 g
Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra.
c) Heptawodny siarczan magnezu, MgSO4. 7 H2O22,50 g
Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra.
d) Heksawodny chlorek żelaza (III), FeCl3. 6 H2O0,25 g
Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra.
Uwaga: aby nie przygotowywać niniejszego roztworu bezpośrednio przed użyciem, dodać kroplę stężonego kwasu solnego lub 0,4 grama soli disodowej kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) na litr.
I.6.3. Roztwory podstawowe substancji chemicznych
Przykładowo rozpuścić 1-10 g odpowiednio badanej substancji chemicznej lub chemicznej substancji odniesienia w wodzie dejonizowanej i dopełnić do 1 litra, gdy rozpuszczalność przekracza 1 g/l. Z drugiej strony, przygotować roztwory podstawowe w podłożu mineralnym lub dodać substancje chemiczną bezpośrednio do podłoża mineralnego. Postępowanie ze słabo rozpuszczalnymi substancjami chemicznymi -zob. załącznik III, ale w badaniu MITI (metoda C.4-F) nie stosuje się ani rozpuszczalników, ani środków emulsyfikujących.
I.6.4. Materiał inokulacyjny
Inokulum może pochodzić z różnych źródeł: aktywowany osad, ścieki kanalizacyjne (niechlorowane), wody powierzchniowe i gleby lub ich mieszaniny. Dla badań DOC "Die-Away", wydzielania CO2 i respirometrii manometrycznej, jeżeli stosowany jest aktywowany osad, powinien być pobrany z oczyszczalni ścieków i urządzeń skali laboratoryjnej przyjmujących głównie ścieki domowe. Materiał inokulacyjny z innych źródeł, okazał się dawać bardziej rozproszone wyniki. Dla zmodyfikowanego badania przesiewowego OECD i badania zamkniętej butli potrzebne jest bardziej rozcieńczone inokulum bez kłaczków osadu i zalecanym źródłem jest ściek drugiego stopnia oczyszczalnia ścieków domowych lub urządzeń skali laboratoryjnej. Dla badania MITI inokulum jest otrzymywane z mieszanych źródeł i opisane jest pod nagłówkiem tego specyficznego badania.
I.6.4.1. Inokulum z aktywowanych osadów
Zebrać świeżo pobraną próbkę aktywowanego osadu z komorą napowietrzania oczyszczalni ścieków lub urządzenia skali laboratoryjnej przerabiającego głównie ścieki domowe. Odrzucić duże cząstki, jeżeli konieczne poprzez filtracje przez siatkę o drobnym oczku i utrzymywać napowietrzanie.
Alternatywnie, zsedymentować lub odwirować (np. 1.100 rpm, 10 min) po usunięciu wszystkich dużych cząstek. Odrzucić nadsącz. Można przemyć osad w podłożu mineralnym. Zawiesić stężony osad w podłożu mineralnym dla uzyskania stężenia 3-5 g zawiesiny ciał stałych/l i napowietrzać do wymaganego momentu.
Osad powinien być pobrany z prawidłowo działającej konwencjonalnej oczyszczalni ścieków. Jeżeli pobrano osad z oczyszczalni o wysokiej szybkości oczyszczania lub podejrzewa się zawartość inhibitorów, należy go przemyć. Zsedymentować lub odwirować ponownie zawieszony osad po energicznym mieszaniu, odrzucić nadsącz i ponownie zawiesić umyty osad w dalszej objętości podłoża mineralnego. Powtarzać tę procedurę do czasu, gdy uzna się, iż jest wolny od nadmiaru substratów lub inhibitorów.
Po zakończeniu ponownego zawieszenia, lub niepoddany obróbce osad, odstawić ich próbkę do momentu jej użycia do ustalenia suchej masy ciał stałych w zawiesinie.
Dalszą alternatywą jest homogenizacja aktywowanego osadu (3-5 g zawiesiny ciał stałych/l). Rozdrobnić osad w mechanicznym rozdrabniaczu przy średniej szybkości przez 2 minuty. Zsedymentować rozdrobniony osad przez 30 minut lub dłużej, gdy trzeba, i zdekantować ciecz do użycia jako inokulum przy szybkości 10 ml/l podłoża mineralnego.
I.6.4.2. Inne źródła inokulum
Można je uzyskać ze ścieków drugiego stopnia oczyszczalni ścieków lub urządzeń skali laboratoryjnej przyjmujących głównie ścieki domowe. Zebrać świeżą próbkę i utrzymywać napowietrzaną w czasie transportu. Pozwolić osadzić się przez 1 godzinę lub przefiltrować przez grubą bibułę filtracyjną i zatrzymać zdekantowany wyciek lub jeśli wymagane przefiltrować z napowietrzaniem. Do 100 ml tego typu inokulum może być użyte na litr podłoża.
Następnym źródłem inokulum są wody powierzchniowe. W tym przypadku zebrać próbkę z odpowiedniej wody powierzchniowej, np. rzeki, jeziora i utrzymywać w napowietrzeniu przez wymagany czas. Jeżeli konieczne, zatężyć inokulum przez filtrację lub odwirowanie.
I.6.5. Wstępne sezonowanie inokulum
Materiał inokulacyjny może być wstępnie sezonowany do warunków eksperymentalnych, lecz niewstępnie adoptowany do badanej substancji. Wstępne sezonowanie składa się z napowietrzania aktywowanego osadu w podłożu mineralnym lub ścieku drugiego stopnia, przez 5-7 dni w temperaturze badania. Wstępne sezonowanie poprawia czasem precyzje metod badania przez zmniejszenie wartości dla ślepej próby. Uważane jest za niekonieczne wstępne sezonowanie inokulum dla metody MITI.
I.6.6. Kontrole abiotyczne
Gdy wymagane, sprawdzić możliwą abiotyczną degradację badanej substancji przez oznaczenie usuniętego DOC, pobieranie tlenu lub wydzielania ditlenku węgla w sterylnych kontrolach niezawierających inokulum. Sterylizować za pomocą filtracji przez membranę (0,2-0,45 mikrona) lub przez dodanie odpowiedniej toksycznej substancji o odpowiednim stężeniu. Jeżeli stosuje się filtracje membranową, pobrać próbki aseptycznie dla utrzymania sterylności. Chociaż absorpcję badanej substancji wykluczono z góry, badania, które mierzą biodegradację jako usuwanie DOC, szczególnie dla inokulum aktywowanego osadu, powinny zawierać kontrole abiotyczne, zaszczepione i intoksykowane.
I.6.7. Liczba kolb
Liczba kolb w typowym badaniu jest opisana pod nagłówkiem każdego badania.
Stosuje się następujące typy kolb:
- zawiesina badana: zawierających substancję badaną i inokulum,
- ślepa próba inokulum: zawierające tylko inokulum,
- kontrola procedury: zawierających substancje odniesienia i inokulum,
- kontrola sterylności abiotycznej: sterylne, zawierających substancję badaną (zob. I.6.6),
- kontrola adsorpcji: zawierających substancję badaną inokulum i środek sterylizujący,
- kontrola toksyczności: zawierających substancję badaną substancje odniesienia i inokulum.
Obowiązkowe jest, by oznaczenia w zawiesinie badanej i w ślepej próbie inokulum były wykonywane równolegle. Wskazane jest wykonywanie oznaczeń w innych kolbach również w oznaczeniach równoległych.
To jednakże nie zawsze jest możliwe. Upewnić się, że pobrano wystarczającą ilość próbek lub odczytów do oceny procentowego usunięcia DOC w 10-dniowym badaniu "okiennym".
I.7. DANE I OCENA
W obliczeniu Dt zastosowano procent degradacji, średnie wartości zdublowanych pomiarów parametrów w obu badanych naczyniach i w ślepej próbie inokulum. Wzory są przedstawione w sekcjach poniżej właściwych badań. Przebieg degradacji jest zobrazowany graficznie i badanie 10-dniowe "okno" jest wskazane. Należy obliczyć i przedstawić w sprawozdaniu usunięcie procentowe uzyskane na koniec 10-dniowego "okna" i wartość w plateau, lub pod koniec badania, w zależności od tego, co jest odpowiednie.
W badaniach respirometrycznych związki zawierające azot mogą wpływać na pobieranie tlenu z powodu nitryfikacji (zob. załączniki II i V).
I.7.1. Degradacja zmierzona za pomocą oznaczenia DOC
Procentową degradację Dt przy każdym czasie pobierania próbki należy obliczyć oddzielnie dla kolb zawierających substancję badaną, stosując średnie wartości zdublowanych pomiarów DOC w celu oszacowania ważności badania (zob. I.5.2). Oblicza się to, stosując następujące równanie:
gdzie:
Dt = % degradacji w czasie t,
C0 = średnie początkowe stężenie DOC w zaszczepionym podłożu kultury zawierającym substancję badaną (mg DOC/l),
Ct = średnie stężenie DOC w zaszczepionym podłożu kultury zawierającym substancję badaną w czasie t (mg DOC/l),
Cbo = średnie początkowe stężenie DOC w zaszczepionym podłoże mineralnym ślepej próby (mg DOC/l),
Cbt = średnie stężenie DOC w zaszczepionym podłożu mineralnym ślepej próby w czasie t (mg DOC/l).
Wszystkie stężenia są mierzone eksperymentalnie.
I.7.2. Degradacja mierzona w pojęciu właściwej analizy
Gdy dostępne są dane z właściwej analizy, można obliczyć pierwotną biodegradację z:
gdzie:
Dt = % degradacji w czasie t, zwykle 28 dni,
Sa = ilość pozostałości substancji badanej w zaszczepionym podłożu na koniec badania (mg),
Sb = ilość pozostałości substancji badanej w badaniu ślepej próby woda/podłoże, do którego dodano tylko substancję badaną (mg).
I.7.3. Abiotyczna degradacja
Gdy stosuje się kontrolę sterylną abiotyczną, obliczyć procentową abiotyczną degradację stosując
100 gdzie:
Cs(o) = DOC stężenie w sterylnej kontroli w dniu 0,
Cs(t) = DOC stężenie w sterylnej kontroli w dniu t.
I.8. SPORZĄDZANE SPRAWOZDANIA
W miarę możliwości sprawozdanie z badań zawiera następujące elementy:
- badana i chemiczne substancje odniesienia, i ich czystość,
- warunki badania,
- inokulum: natura i miejsce próbkowania(-ń), stężenie i wszystkie operacje przygotowania wstępnego,
- proporcja i charakter odpadu przemysłowego obecnego w ścieku, jeśli znany,
- czas trwania badania i temperatura,
- w przypadku słabo rozpuszczalnych badanych substancji, zastosowane operacje,
- zastosowana metoda badania; dla każdej zmiany procedury należy podać przyczyny uzasadnione naukowo i uzasadnienie,
- arkusz danych,
- wszystkie obserwowane zjawiska inhibicji,
- wszystkie obserwowane abiotyczne degradacje,
- dane właściwej analizy chemicznej, jeśli dostępne,
- dane analityczne etapów pośrednich, jeśli dostępne,
- wykres procentowy degradacji w stosunku do czasu dla substancji badanych i odniesienia; fazy opóźnienia, fazy degradacji, 10-dniowe "okno" oraz nachylenie wykresu należy wyraźnie wskazać (załącznik I). Jeżeli badanie odpowiadało kryteriom ważności, można użyć do wykresu średni procent degradacji w kolbach zawierających substancje badaną,
- procentowe usunięcie po 10-dniowym "oknie" i w plateau lub na koniec badania.
CZĘŚĆ II. BADANIE DOC METODĄ "DIE-AWAY" (Metoda C.4-A)
II.1. ZASADA METODY
Zmierzoną objętość zaszczepionego podłoża mineralnego, zawierającego znane stężenie substancji badanej (10-40 mg DOC/l), jako pojedyncze nominalne źródło węgla organicznego napowietrza się w ciemności lub w rozproszonym świetle w 22 ± 2 °C.
Postępującą degradację określa się analizą DOC w częstych przedziałach czasowych przez 28 dni. Stopień biodegradacji jest obliczany przez wyrażenie stężenia usuniętego DOC (skorygowanego do tego ze ślepej próby inokulum w kontroli) jako procent stężenia obecnego początkowo. Stopień pierwotnej biodegradacji może być także obliczony z dodatkowych analiz chemicznych wykonanych na początku i pod koniec inkubacji.
II.2. OPIS METODY
II.2.1. Przyrząd
a) Kolby stożkowe, np. 250 ml do 2 1, w zależności od objętości wymaganej dla analizy DOC.
b) Wytrząsarka do akomodacji kolb stożkowych - albo z automatyczną kontrolą temperatury, albo używaną w stałej temperaturze pokojowej, oraz wystarczająca moc dla utrzymania aerobowych warunków we wszystkich kolbach.
c) Przyrząd filtracyjny z odpowiednimi membranami.
d) Analizator DOC.
e) Przyrząd dla oznaczania rozpuszczonego tlenu.
f) Wirówka.
II.2.2. Przygotowanie podłoża mineralnego
W celu przygotowania roztworów podstawowych, zob. I.6.2.
Zmieszać 10 ml roztworu (a) z 800 ml wody rozcieńczającej, dodać 1 ml roztworu (b) do (d) i dopełnić do 1 l wodą rozcieńczającą.
II.2.3. Przygotowanie wstępne inokulum
Inokulum może być otrzymane z różnych źródeł: aktywowanego osadu, ścieków kanalizacyjnych, wód powierzchniowych, gleb lub z mieszaniny tu wymienionych.
Zob. I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 i I.6.5.
II.2.4. Przygotowanie kolb
Jako przykład wprowadzić porcje 800 ml podłoża mineralnego do 2 1 kolb stożkowych i dodać wystarczające objętości roztworów podstawowych substancji badanej i odniesienia do oddzielnych kolb dla uzyskania stężenia równoważnika chemicznego do 10-40 mg DOC/l. Sprawdzić wartość pH i ustawić, gdy konieczne, do 7,4. Przygotować materiał inokulacyjny w kolbach z aktywowanym osadem lub innym źródłem inokuli (zob. I.6.4) do uzyskania stężenia końcowego większego niż 30 mg zawiesiny ciał stałych/litr. Przygotować także kontrole inokulum w podłożu mineralnym, lecz bez badanej substancji i chemicznej substancji odniesienia.
Jeśli wymagane, użyć jedno naczynie dla sprawdzenia możliwych działań inhibicyjnych substancji badanej przez inokulację roztworu zawierającego w podłożu mineralnym, porównywalne stężenia substancji tak badanej, jak i chemicznej substancji odniesienia.
Także, jeżeli jest to wymagane, ustawić następną sterylną kolbę dla sprawdzenia, czy badana substancja degraduje się abiotycznie, używając niezaszczepiony roztwór substancji chemicznej (zob. I.6.6).
Dodatkowo, jeżeli podejrzewa się, że badana substancja zostanie zaabsorbowana znacząco w szkle, osadzie itp., wykonać wstępną ocenę prawdopodobnego wzrostu absorpcji, a zatem przydatności badania dla substancji chemicznej (zob. tabela 1). Nastawić kolby zawierające substancję badaną, inokulum i środek sterylizujący.
Dopełnić objętość we wszystkich kolbach do 11 podłożem mineralnym i po wymieszaniu pobrać próbkę z każdej kolby do oznaczenia początkowego stężenia DOC (zob. załącznik II.4). Przykryć otwory kolb np. aluminiową folią, w taki sposób by umożliwić swobodną wymianę powietrza między kolbą i otaczającą atmosferą. Następnie włożyć naczynia do wytrząsarki celem rozpoczęcia badania.
II.2.5. Liczba kolb w typowym przebiegu
Kolby 1 i 2: Zawiesina badana
Kolby 3 i 4: Ślepa próba inokulum
Kolba 5: Kontrola procedury
Zalecane oraz gdy konieczne:
Kolba 6: Kontrola sterylności abiotycznej
Kolba 7: Kontrola adsorpcji
Kolba 8: Kontrola toksyczności
Zob. także I.6.7.
II.2.6. Przeprowadzenie badania
Poprzez całe badanie oznaczać stężenia DOC w każdej kolbie duplikatu w znanych odstępach czasu, wystarczająco często, by można było oznaczyć 10-dniowe "okno" i usunięcie procentowe na koniec 10-dniowego "okna". Pobrać tylko minimalną objętość zawiesiny badanej konieczną dla każdego oznaczenia.
Przed pobieraniem próbek zmniejszyć straty parowania z kolb przez dodanie wody rozcieńczającej (I.6.1) w wymaganej ilości, jeśli konieczne. Zamieszać energicznie podłoże kultury przed pobraniem próbki i upewnić się, że materiał przylegający do ścianek naczynia jest rozpuszczony lub zawieszony, przed pobieraniem próbek. Przefiltrować przez filtr membranowy lub odwirować (zob. załącznik II.4) natychmiast po pobraniu próbek. Analizować odfiltrowane lub odwirowane próbki tego samego dnia, w innym razie przechować w 2-4 °C przez maksimum 48 godzin, lub w niższej temperaturze - 18 oC przez czas dłuższy.
II.3. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
II.3.1. Obróbka wyników
Obliczyć procentową degradację w czasie t, jak podano w I.7.1 (oznaczanie DOC), i - do wyboru - według I.7.2 (właściwa analiza).
Zapisać wszystkie wyniki na dołączonych arkuszach danych.
II.3.2. Ważność wyników
Zob. I.5.2.
II.3.3. Sporządzanie sprawozdania
Zob. I.8.
II.4. ARKUSZ DANYCH
Przykład arkusza danych podano poniżej.
BADANIE DOC METODĄ "DIE-AWAY"
1. LABORATORIUM
2. DATA ROZPOCZĘCIA BADANIA
3. SUBSTANCJA BADANA
Nazwa:
Stężenie roztworu podstawowego: ... mg/l jako substancja chemiczna.
Początkowe stężenie w podłożu, t0: ... mg/l jako substancja chemiczna.
4. INOKULUM
Źródło:
Poddano traktowaniu:
Wstępne sezonowanie, jeśli wykonano:
Stężenie zawiesiny ciał stałych w mieszaninie reakcyjnej: ... mg/l
5. OZNACZENIA WĘGLA
Analizator węgla:
| Kolba nr | DOC po n dniach (mg/l) | ||||||
| 0 | n1 | n2 | n3 | nx | |||
| Badana substancja chemiczna plus inokulum | 1 | a1 | |||||
| a2 | |||||||
| a, średnia Ca(t) | |||||||
| 2 | b1 | ||||||
| b2 | |||||||
| b, średnia Cb(t) | |||||||
| Ślepa próba inokulum bez badanej substancji | 3 | C1 | |||||
| C2 | |||||||
| c, średnia Cc(t) | |||||||
| 4 | d1 | ||||||
| d2 | |||||||
| d, średnia Cd(t) | |||||||
 | |||||||
6. OCENA DANYCH PIERWOTNYCH
| Kolba nr | % degradacja po n dniach | |||||
| 0 | n1 | n2 | n3 | nx | ||
| 1 |  | 0 | ||||
| 2 |  | 0 | ||||
| Srednia(*) |  | 0 | ||||
| (*) D1 i D2 nie należy uśredniać jeśli znacznie się różnią. |
Uwaga: podobne arkusze można użyć dla chemicznej substancji odniesienia i kontroli toksyczności.
7. KONTROLA ABIOTYCZNA (do wyboru)
| Czas (dni) |
| 0 | t | |
| DOC cone, (mg/l) kontrola sterylności | Cs(o) | Cs(t) |
8. WŁAŚCIWA ANALIZA CHEMICZNA (do wyboru)
| ilość pozostałości badanej substancji na koniec badania (mg/l) | % pierwotnej degradacji | |
| Kontrola sterylności | Sb | |
| Zaszczepione podłoże badawcze | Sa |  |
CZĘŚĆ III. ZMODYFIKOWANE BADANIE PRZESIEWOWE OECD (Metoda C.4-B)
III. 1. ZASADA METODY
Zmierzoną objętość podłoża mineralnego zawierające znane stężenie substancji badanej (10-40 mg DOC/litr) jako nominalne pojedyncze źródło węgla organicznego, zaszczepiono za pomocą 0,5 ml wycieku na litr podłoża. Mieszaninę napowietrza się w ciemności lub w rozproszonym świetle w 22 ± 2 oC.
Postępującą degradację określa się analizą DOC w częstych przedziałach czasowych przez 28 dni. Stopień biodegradacji jest obliczany przez wyrażenie stężenia usuniętego DOC (skorygowanego do tego ze ślepej próby inokulum w kontroli) jako procent stężenia obecnego początkowo. Stopień pierwotnej biodegradacji może być także obliczony z dodatkowych analiz chemicznych wykonanych na początku i pod koniec inkubacji.
III.2. OPIS METODY
III.2.1. Przyrząd
a) Kolby stożkowe, np. 250 ml do 2 1, w zależności od objętości wymaganej dla analizy DOC.
b) Wytrząsarka do akomodacji kolb stożkowych - albo z automatyczną kontrolą temperatury, albo używaną w stałej temperaturze pokojowej, oraz wystarczająca moc dla utrzymania aerobowych warunków we wszystkich kolbach.
c) Przyrząd filtracyjny z odpowiednimi membranami.
d) Analizator DOC.
e) Przyrząd dla oznaczania rozpuszczonego tlenu.
f) Wirówka.
III.2.2. Przygotowanie podłoża mineralnego
W celu przygotowania roztworów podstawowych, zob. I.6.2.
Zmieszać 10 ml roztworu (a) z 80 ml wody rozcieńczającej, dodać 1 ml roztworu (b) do (d) i dopełnić do 1 litra wodą rozcieńczającą.
Niniejsza metoda wykorzystuje tylko 0,5 ml wycieku/litr jako inokulum i dlatego podłoże może wymagać wzmocnienia śladowymi pierwiastkami i czynnikami wzrostu. Wykonuje się to przez dodanie 1 ml każdego z następujących roztworów, na litr końcowego podłoża:
Roztwór pierwiastków śladowych:
Siarczan manganu tetrawodny MnSO4.4H2O39,9 mg
Kwas borowy, H3BO357,2 mg
Siarczan cynku heptawodny ZnSO4.7H2O42,8 mg
Heptamolibdenian amonu (NH4)6 Mo7O2434,7 mg
Fe-chelata (FeCl3 kwasu etylenodiaminotetraoctowego)100,0 mg
Rozpuścić w i dopełnić do 1.000 ml wodą rozcieńczającą
Roztwór witaminowy:
Ekstrakt drożdży15,0 mg
Rozpuścić ekstrakt drożdży w 100 ml wody. Sterylizować przez przepuszczenie przez membranę 0,2 mikrona, lub przygotować na świeżo.
III.2.3. Przygotowanie wstępne inokulum
Inokulum może być otrzymane ze ścieków drugiego stopnia oczyszczalni ścieków lub urządzeń skali laboratoryjnej przyjmujących głownie ścieki domowe (zob. I.6.4.2 i I.6.5).
Stosuje się 0,5 ml na litr podłoża mineralnego.
III.2.4. Przygotowanie kolb
Jako przykład wprowadzić porcje 800 ml podłoża mineralnego do 2-litrowych kolb stożkowych i dodać wystarczające objętości roztworów podstawowych substancji badanej i odniesienia do oddzielnych kolb dla uzyskania stężenia równoważnika chemicznego do 10-40 mg DOC/l. Sprawdzić wartość pH i ustawić, gdy konieczne, do 7,4. Zaszczepić kolby wyciekiem ściekowym 0,5 ml/litr (zob. I.6.4.2). Przygotować także kontrole inokulum w podłożu mineralnym, lecz bez badanej substancji i chemicznej substancji odniesienia.
Jeśli wymagane, użyć jedno naczynie dla sprawdzenia możliwych działań inhibicyjnych substancji badanej przez inokulację roztworu zawierającego w podłożu mineralnym, porównywalne stężenia substancji tak badanej, jak i chemicznej substancji odniesienia.
Także, jeżeli jest to wymagane, ustawić następną sterylną kolbę dla sprawdzenia, czy badana substancja degraduje się abiotycznie, używając niezaszczepiony roztwór substancji chemicznej (zob. I.6.6).
Dodatkowo, jeżeli podejrzewa się, że badana substancja zostanie zaabsorbowana znacząco w szkle, osadzie itp., wykonać wstępną ocenę prawdopodobnego wzrostu absorpcji, a zatem przydatności badania dla substancji chemicznej (zob. tabela 1). Nastawić kolby zawierające substancję badaną, inokulum i środek sterylizujący.
Dopełnić objętość we wszystkich kolbach do 1 litra podłożem mineralnym i po wymieszaniu pobrać próbkę z każdej kolby do oznaczenia początkowego stężenia DOC (zob. załącznik II.4). Przykryć otwory kolb np. aluminiową folią, w taki sposób by umożliwić swobodną wymianę powietrza między kolbą i otaczającą atmosferą. Następnie włożyć naczynia do wytrząsarki celem rozpoczęcia badania.
III.2.5. Liczba kolb w typowym przebiegu
Kolby 1 i 2: Zawiesina badana
Kolby 3 i 4: Ślepa próba inokulum
Kolba 5: Kontrola procedury
i zalecane oraz gdy konieczne:
Kolba 6: Kontrola sterylności abiotycznej
Kolba 7: Kontrola adsorpcji
Kolba 8: Kontrola toksyczności
Zob. także I.6.7.
III.2.6. Przeprowadzenie badania
Poprzez całe badanie oznaczać stężenia DOC w każdej kolbie duplikatu w znanych odstępach czasu, wystarczająco często, by można było oznaczyć
10-dniowe "okno" i usunięcie procentowe na koniec 10-dniowego "okna". Pobrać tylko minimalną objętość zawiesiny badanej konieczna dla każdego oznaczenia.
Przed pobieraniem próbek zmniejszyć straty parowania z kolb przez dodanie wody rozcieńczającej (I.6.1) w wymaganej ilości, jeśli konieczne. Zamieszać energicznie podłoże kultury przed pobraniem próbki i upewnić się że materiał przylegający do ścianek naczynia jest rozpuszczony lub zawieszony, przed pobieraniem próbek. Przefiltrować przez filtr membranowy lub odwirować (zob. załącznik II.4) natychmiast po pobraniu próbek. Analizować odfiltrowane lub odwirowane próbki tego samego dnia, w innym razie przechować w 2-4 oC przez maksimum 48 godzin, lub w niższej temperaturze - 18 oC przez czas dłuższy.
III.3. DANE AND SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
III.3.1. Obróbka wyników
Obliczyć procentową degradację w czasie t, jak podano w I.7.1 (oznaczanie DOC), i - do wyboru - pod I.7.2. (właściwa analiza).
Zapisać wszystkie wyniki na dołączonych arkuszach danych.
III.3.2. Ważność wyników Zob. I.5.2.
III.3.3. Sporządzanie sprawozdania Zob. I.8.
III.4. ARKUSZ DANYCH
Przykład arkusza danych podano poniżej.
ZMODYFIKOWANE BADANIE PRZESIEWOWE OECD
1. LABORATORIUM
2. DATA ROZPOCZĘCIA BADANIA
3. SUBSTANCJA BADANA
Nazwa:
Stężenie roztworu podstawowego: ... mg/litr jako substancja chemiczna
Początkowe stężenie w podłożu, to: ... mg/litr jako substancja chemiczna
4. INOKULUM
Źródło:
Poddano traktowaniu:
Wstępne sezonowanie, jeśli wykonano:
Stężenie zawiesiny ciał stałych w mieszaninie reakcyjnej: mg/l
5. OZNACZENIA WĘGLA
Analizator wegla:
| Kolba nr | DOC po n dniach (mg/1) | ||||||
| 0 | n1 | n2 | n3 | nx | |||
| Badana substancja chemiczna plus inokulum | 1 | a1 | |||||
| a2 | |||||||
| a, średnia Ca(t) | |||||||
| 2 | b1 | ||||||
| b2 | |||||||
| b, średnia Cb(t) | |||||||
| Ślepa próba inokulum bez badanej substancji | 3 | C1 | |||||
| C2 | |||||||
| c, średnia Cc(t) | |||||||
| 4 | d1 | ||||||
| d2 | |||||||
| d, średnia Cd(t) | |||||||
| |||||||
6. OCENA DANYCH PIERWOTNYCH
| Kolba nr | % degradacja po n dniach | |||||
| 0 | n1 | n2 | n3 | nx | ||
| 1 | 0 | |||||
| 2 | 0 | |||||
| Srednia(*) | 0 | |||||
| (*) D1 i D2 nie mogą być uśrednian, jeżeli znacznie się różnią. |
Uwaga: podobne arkusze można stosować dla chemicznej substancji odniesienia i kontroli toksyczności.
7. KONTROLA ABIOTYCZNA (do wyboru)
| Czas (dni) |
| 0 | t | |
| DOC cone, (mg/l) kontrola sterylności | Cs(o) | Cs(t) |
8. WŁAŚCIWA ANALIZA CHEMICZNA (do wyboru)
| ilość pozostałości badanej substancji na koniec badania (mg/1) | % pierwotnej degradacji | |
| Kontrola sterylności | Sb | |
| Zaszczepione podłoże badawcze | Sa |  |
CZĘŚĆ IV. BADANIE WYDZIELANIA CO2 (Metoda C.4-C)
IV.1. ZASADA METODY
Zmierzona objętość zaszczepionego podłoża mineralnego, zawierającego znane stężenie badanej substancji (10-20 mg DOG lub TOC/l) jako nominalne pojedyncze źródło węgla organicznego, jest napowietrzana przez przepuszczanie powietrza wolnego od ditlenku węgla z kontrolowaną szybkością w ciemności lub rozproszonym świetle. Degradacja jest prowadzona przez 28 dni przez oznaczanie wytwarzanego ditlenku węgla, który jest pochłaniany w wodorotlenku sodowym lub barowym i mierzony za pomocą miareczkowania pozostałego wodorotlenku lub jako nieorganiczny węgiel. Ilość ditlenku węgla wydzielonego z badanej substancji (skorygowana dla tej uzyskanej ze ślepej próby inokulum) jest wyrażana jako procent ThCO2. Stopień biodegradacji można także obliczyć z dodatkowej analizy DOG wykonanej na początku i końcu inkubacji.
IV.2. OPIS METODY
IV.2.1. Przyrząd
a) Kolby, 2-5 litra, każda zaopatrzona w rurkę napowietrzającą sięgającą blisko dna naczynia i w wylot.
b) Mieszadła magnetyczne przy ocenie słabo rozpuszczalnych substancji chemicznych.
c) Butle absorpcji gazu.
d) Urządzenia do kontroli i pomiaru przepływu powietrza.
e) Przyrząd do przemywania ditlenku węgla, dla przygotowania powietrza wolnego od ditlenku węgla; alternatywnie mieszanina tlenu i azotu wolnych od ditlenku węgla z butli gazowych, używane w prawidłowej proporcji (20 % O2: 80 % N2).
f) Przyrząd do oznaczania ditlenku węgla - albo miareczkowaniem, albo jedną z postaci analizatora węgla nieorganicznego.
g) Urządzenie filtracji membranowej (do wyboru). h) Analizator DOG (do wyboru).
IV.2.2. Przygotowanie podłoża mineralnego
W celu przygotowania roztworów podstawowych zob. I.6.2.
Zmieszać 10 ml roztworu (a) z 800 ml wody rozcieńczającej, dodać 1 ml roztworu (b) do (d) i dopełnić do 1 l wodą rozcieńczającą.
IV.2.3. Przygotowanie wstępne inokulum
Inokulum można otrzymać z różnych źródeł: aktywowany osad; ścieki kanalizacyjne; wody powierzchniowe; gleby lub z mieszaniny tu wymienionych.
Zob. I.6.4., I.6.4.1, I.6.4.2 i I.6.5.
IV.2.4. Przygotowanie kolb
Przykładowo wskazano następujące objętości i wagi dla 5-litrowych kolb zawierających 3 litry zawiesiny. Jeżeli używa się mniejszych objętości, należy je odpowiednio zmodyfikować, ale należy zapewnić że utworzony ditlenek węgla zostanie zmierzony dokładnie.
Do każdej 5-litrowej kolby dodać 2.400 ml podłoża mineralnego. Dodać odpowiednią objętość przygotowanego aktywowanego osadu (zob. I.6.4.1 i I.6.5) dla otrzymania stężenia zawiesiny ciał stałych niewiększego niż 30 mg/l w końcowej 3-litrowej zaszczepionej mieszaninie. Alternatywnie, rozcieńczyć wpierw przygotowany osad do uzyskania zawiesiny 500-1.000 mg/l w podłożu mineralnym przed dodaniem podwielokrotności do zawartości 5-litrowej kolby, dla uzyskania stężenia 30 mg/l; zapewnia to większą dokładność. Można użyć innych źródeł inokulum (zob. I.6.4.2).
Napowietrzać te zaszczepione mieszaniny powietrzem wolnym od ditlenku węgla przez noc celem przepłukania systemu z ditlenku węgla.
Dodać badany materiał oraz substancje odniesienia oddzielnie, jako znaną objętość roztworów podstawowych, do replikowanych kolb dla uzyskania stężeń wnoszących udział przez dodane substancje chemiczne, 10 do 20 mg DOC lub TOC/l; pozostawić kilka kolb bez dodawania substancji chemicznych jako kontrole inokulum. Dodać badane słabo rozpuszczalne substancje bezpośrednio do kolb na podstawie masy lub objętości lub postępować jak opisano w załączniku III.
Jeżeli wymagane, użyć jedną kolbę do sprawdzenia możliwego działania inhibicyjnego badanej substancji przez dodanie zarówno badanej jak i substancji odniesienia, w tych samych stężeniach jak obecne w innych kolbach.
Także, jeżeli wymagane, użyć sterylnej kolby do sprawdzenia czy badana substancja jest degradowana abiotycznie przez użycie niezaszczepionego roztworu substancji chemicznej (zob. I.6.6). Sterylizować przez dodanie substancji toksycznej o odpowiednim stężeniu.
Dopełnić objętości zawiesin we wszystkich kolbach do 3l dodając podłoże mineralne uprzednio napowietrzone powietrzem wolnym od CO2. Alternatywnie, można pobrać próbki do analizy DOC (zob. załącznik II.4) i/lub właściwej analizy. Podłączyć butle absorpcyjne do wylotów powietrza kolb.
Jeżeli używany jest wodorotlenek baru, połączyć trzy butle absorpcyjne, każda zawierająca 100 ml 0,0125 M roztworu wodorotlenku baru, w seriach do kazdej 5-litrowej kolby. Roztwór musi być wolny od wytrąconych siarczanów oraz węglanów i jego stężenie musi być oznaczone bezpośrednio przed użyciem. Jeżeli używa się wodorotlenek sodu, podłączyć dwie pułapki, druga działa jako kontrola pokazania, że cały ditlenek węgla został zaabsorbowany w pierwszej. Butle absorpcyjne wyposażone w zamknięcia typu kroplówkowego są odpowiednie. Dodać 200 ml 0,05 M wodorotlenku sodu do każdej butli, która jest odpowiednia do zaabsorbowania całkowitej ilości ditlenku węgla wydzielonego po całkowitej degradacji badanej substancji. Roztwory wodorotlenku sodu, nawet świeżo przygotowane, mogą zawierać ślady węglanów; jest to korygowane przez odjęcie węglanów ze ślepej próby.
IV.2.5. Liczba kolb w typowym przebiegu
Kolby 1 i 2: Zawiesina badana
Kolby 3 i 4: Ślepa próba inokulum
Kolba 5: Kontrola procedury
oraz zalecane i gdy konieczne:
Kolba 6: Kontrola sterylności abiotycznej
Kolba 7: Kontrola toksyczności
Kolba 8: Kontrola toksyczności
Zob. także I.6.7.
IV.2.6. Przeprowadzenie badania
Rozpocząć badanie przez wpuszczenie pęcherzyków powietrza wolnego od ditlenku węgla przez zawiesiny z szybkością 30-100 ml/min. Pobierać próbki absorbenta ditlenku węgla okresowo do analiz na zawartość CO2. W trakcie pierwszych dziesięciu dni zalecane jest, by analizy były wykonywane co drugi lub trzeci dzień, a następnie co piąty, aż do 28 dnia, tak by okres 10-dniowego okna był zidentyfikowany.
W dniu 28 pobrać próbki (do wyboru) do analizy DOC i/lub właściwej analizy, pomierzyć pH zawiesin i dodać 1 ml stężonego kwasu solnego do każdej kolby; napowietrzać przez noc do wypędzenia ditlenku węgla obecnego w badanych zawiesinach. Dnia 29 wykonać analizę wydzielonego ditlenku węgla.
W dniu pomiaru CO2 rozłączyć absorber wodorotlenku baru najbliższy kolby i zmiareczkować roztwór wodorotlenku za pomocą HCl 0,05 M, stosując fenoloftaleinę jako wskaźnik. Przesunąć pozostałe absorbery o jedno miejsce bliżej kolby i umieścić nowy absorber zawierający 100 ml świeżego 0,0125 M wodorotlenku baru na dalszym końcu serii. Wykonać miareczkowania według potrzeby, na przykład gdy podstawowe strącenie jest widoczne w pierwszej pułapce i przed strąceniem w drugim, lub co najmniej co tydzień. Alternatywnie, z NaOH jako absorbentem, pobrać strzykawką małą próbkę (w zależności od charakterystyki stosowanego analizatora węgla) roztworu wodorotlenku sodu z absorbera najbliższego kolbie. Wstrzyknąć próbkę do części IC analizatora węgla do bezpośredniej analizy wydzielonego ditlenku węgla.
Analizować zawartość drugiej pułapki tylko na koniec badania dla skorygowania przenoszenia ditlenku węgla.
IV.3. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
IV.3.1. Obróbka wyników
Ilość CO2 zatrzymana w absorberze przy miareczkowaniu jest dana przez:
mgCO2 = (100 × CB 0,5 × V × Ca) × 44
gdzie:
V = objętość HCl użytego do miareczkowania 100 ml w absorberze (ml),
CB = stężenie roztworu wodorotlenku baru (M),
CA = stężenie roztworu kwasu solnego (M),
jeśli CB wynosi 0,0125 M i CA jest 0,05 M, miareczkowanie 100 ml wodorotlenku baru daje 50 ml, a waga CO2 jest dana przez:
Zatem w tym przypadku dla przeliczenia objętości HCl miareczkującego na wytworzone miligramy CO2, współczynnik wynosi 1,1.
Obliczyć wagi wytworzonego CO2 z samego inokulum oraz z inokulum plus badana substancja używając odnośne wartości miareczkowania, a różnica jest wagą CO2 wytworzonego przez samą badaną substancję.
Przykładowo, jeżeli samo inokulum daje zmiareczkowane 48 ml oraz inokulum plus badana substancja daje 45 ml,
CO2 z inokulum = 1,1 × (50 - 48) = 2,2 mg
CO2 z inokulum plus badana substancja = 1,1 × (50 - 45) = 5,5 mg
Zatem waga CO2 wytworzonego z badanej substancji wynosi 3,3 mg.
Procentowa biodegradacja jest obliczana z:
lub,
3,67 istniejący współczynnik konwersji (44/12) węgla do ditlenku węgla.
Uzyskać procentową degradację po każdym przedziale czasu przez dodanie stosunków procentowych wartości ThCO2 obliczonych dla każdego z dni, do czasu w jakim zmierzono.
Dla absorberów z wodorotlenkiem sodu, obliczyć ilość wytworzonego ditlenku węgla, wyrażając jako IC (mg), przez pomnożenie stężenia IC w absorbencie przez objętość absorbenta.
Obliczyć procentową degradację z:
Obliczyć usunięcie DOC (do wyboru) jak opisano pod I.7. Zapisać te i wszystkie inne wyniki na przygotowanych arkuszach danych.
IV.3.2. Ważność wyników
Zawartość IC zawiesiny badanej substancja w podłożu mineralnym na początku badania musi być mniejsza niż 5 % wartości TC, a całkowite wydzielanie CO2 w ślepej próbie z inokulum na końcu badania nie powinna zwykle przekraczać 40 mg/l podłoża. Jeżeli uzyskuje się wartości wyższe niż 70 mg CO2/litr, dane i technika eksperymentalna muszą być krytycznie przebadane.
Zob. także I.5.2.
IV.3.3. Sporządzanie sprawozdania
Zob. I.8.
IV.4. ARKUSZ DANYCH
Przykład arkusza danych podano poniżej.
BADANIE WYDZIELANIA DITLENKU WĘGLA
1. LABORATORIUM
2. DATA ROZPOCZĘCIA BADANIA
3. SUBSTANCJA BADANA Nazwa:
Stężenie roztworu podstawowego: ... mg/litr jako substancja chemiczna
Wstępne stężenie. w podłożu: ... mg/litr jako substancja chemiczna
Całkowity C dodany do kolby: ... mg C
ThCO2: mg CO2
4. INOKULUM
Źródło:
Poddano traktowaniu:
Przygotowanie wstępne, o ile stosowano:
Stężenie zawiesiny ciał stałych w mieszaninie reakcyjnej: mg/litr
5. WYTWARZANIE DITLENKU WĘGLA I DEGRADOWALNOŚĆ
Metoda: Ba(OH)/NaOH/inne
Uwaga: podobne arkusze mogą być używane dla chemicznej substancji odniesienia i kontroli toksyczności
6. ANALIZA WĘGLA (do wyboru)
Analizator węgla:
| Czas (dzień) | Ślepa próba mg/l | Badana substancja chemiczna mg/l |
| 0 | Cb(o) | C0 |
| 28(*) | Cb(t) | Ct |
| (*) lub w końcu inkubacju |
7. DEGRADACJA ABIOTYCZNA (do wyboru)
CZĘŚĆ V. BADANIE RESPIROMETRII MANOMETRYCZNEJ (Metoda C.4-D)
V.1. ZASADA METODY
Zmierzona objętość zaszczepionego podłoża mineralnego, zawierającego znane stężenie badanej substancji (100 mg/litr substancji badanej, dająca co najmniej 50-100 mg ThOD/litr) jako nominalnego pojedynczego źródła węgla organicznego, jest mieszana w zamkniętej kolbie w stałej temperaturze (± 1o C lub bliżej) do 28 dnia włącznie. Zużycie tlenu jest oznaczane albo przez pomiary ilości tlenu (wytwarzanego elektrolitycznie) wymaganego do utrzymania stałej objętości gazu w kolbie respirometru, lub przez zmianę w objętości lub ciśnieniu (lub w kombinacji dwóch) w aparacie. Wydzielany ditlenek węgla jest absorbowany w roztworze wodorotlenku potasu lub w innym odpowiednim absorbencie. Ilość tlenu pobrana przez badaną substancję (skorygowana o pobór w ślepej próbie z inokulum, biegnącej równolegle) jest wyrażana jako stosunek procentowy ThOD lub COD. Alternatywnie, pierwotna biodegradacja może być także obliczona z dodatkowych właściwych analiz wykonanych na początku i końcu inkubacji, i ostatecznie przez analizę DOC.
V.2. OPIS METODY
V.2.1. Przyrząd
a) odpowiedni respirometr;
b) regulator temperatury, utrzymujący ± 1 oC lub lepszą;
c) urządzenie do filtracji membranowej (do wyboru);
d) analizator węgla (do wyboru).
V.2.2. Przygotowanie podłoża mineralnego
W celu przygotowania roztworów podstawowych, zob. I.6.2.
Zmieszać 10 ml roztworu (a) z 800 ml wody rozcieńczającej, dodać 1 ml roztworu (b) do (d) i dopełnić do 1 litra wodą rozcieńczającą.
V.2.3. Przygotowanie i przygotowanie wstępne inokulum
Inokulum może być uzyskane z różnych źródeł: aktywowany osad; ścieki kanalizacyjne; wody powierzchniowe i gleby lub mieszanina wymienionych.
Zob. I.6.4., I.6.4.1., I.6.4.2. i I.6.5.
V.2.4. Przygotowanie kolb
Przygotować roztwory badane oraz chemicznej substancji odniesienia, w oddzielnych partiach, w podłożu mineralnym równoważnym stężeniu, zwykle 100 mg substancji chemicznej/litr (dający co najmniej 50-100 mg ThOD/litr), stosując roztwory podstawowe.
Obliczyć ThOD na podstawie tworzenia się soli amonowych, poza spodziewaną nitryfikacją, dla której należy oprzeć obliczenia na tworzeniu się azotanów (zob. załącznik II.2.)
Oznaczyć wartości pH i jeśli konieczne, ustawić na 7,4 ± 0,2.
Substancje słabo rozpuszczalne należy dodawać na dalszym etapie (zob. poniżej).
Jeżeli ma być ustalona toksyczność badanej substancji, przygotować dalszy roztwór z podłoża mineralnego zawierającego zarówno substancję badaną jak i chemiczną substancję odniesienia o tych samych stężeniach co w poszczególnych roztworach.
Jeżeli wymagany jest pomiar fizyko-chemicznego poboru tlenu, przygotować roztwór badanej substancji zwykle 100 mg ThOD/litr który został sterylizowany dodatkiem odpowiedniej toksycznej substancji (zob. I.6.6).
Wprowadzić konieczne objętości roztworów badanej substancji i chemicznej substancji odniesienia, odpowiednio, w co najmniej zdublowanych kolbach. Dodać do następnych kolb tylko podłoże mineralne (dla kontroli inokulum) i, jeśli wymagane, zmieszane roztwory substancja badana/substancja odniesienia i roztwór sterylny.
Jeśli badana substancja chemiczna jest słabo rozpuszczalna, dodać ją bezpośrednio na niniejszym etapie na podstawie wagi lub objętości lub postępować jak opisano w dodatku III. Dodać wodorotlenek potasu, tabletki wapna sodowanego lub innego absorbenta do zbiorników absorbera CO2.
V.2.5. Liczba kolb w typowym przebiegu
Kolby 1 i 2: Zawiesina badana
Kolby 3 i 4: Ślepa próba inokulum
Kolba 5: Kontrola procedury
Zalecane i gdy konieczne:
Kolba 6: Kontrola sterylna
Kolba 7: Kontrola toksyczności
Kolba 8: Kontrola toksyczności
Zob. także I.6.7.
V.2.6. Przeprowadzenie badania
Pozwolić na uzyskanie przez naczynia żądanej temperatury i zaszczepić odpowiednie naczynia przygotowanym aktywowanym osadem lub innym źródłem inokulum by otrzymać stężenie zawiesiny ciał stałych niewiększe niż 30 mg/litr. Zestawić wyposażenie, włączyć mieszanie i sprawdzić szczelność, rozpocząć pomiar pobierania tlenu. Zwykle niewymagana jest dalsza uwaga inna niż zbieranie koniecznych danych i wykonywanie codziennych sprawdzeń czy jest utrzymywane są właściwa temperatura i stosowne mieszanie.
Obliczyć pobieranie tlenu z odczytów zbieranych w regularnych i częstych przedziałach czasowych, stosując metody podane przez producenta wyposażenia. Pod koniec inkubacji, zwykle 28-dniowej, zmierzyć pH zawartości kolb, szczególnie jeśli pobieranie tlenu jest niższe lub większe niż ThODNH4 (dla związków zawierających azot).
Jeżeli wymagane, pobrać próbki z kolb respiratora, początkowej i końcowej, do analizy DOC lub właściwej chemicznej (zob. załącznik II.4). Przy początkowym pobieraniu upewnić się, że objętość zawiesiny badanej pozostającej w kolbie jest znana. Gdy tlen zostanie pobrany przez substancję badaną zawierającą azot, oznaczyć wzrost stężenia azotynów oraz azotanów przez okres 28 dni i obliczyć poprawkę dla tlenu zużytego przez nitryfikację (załącznik V).
V.3. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
V.3.1. Obróbka wyników
Podzielić pobór tlenu (mg) przez badaną substancję po danym czasie (skorygować o tę ze ślepej kontroli inokulum po tym samym czasie) przez wagę użytej badanej substancji. Da to BOD wyrażone jako mg tlenu/mg badanej substancji, czyli
= mg O2 na mg badanej substancji.
obliczyć procentową biodegradacje albo z:
Należy zauważyć że te dwie metody niekoniecznie muszą dawać te same wartości; korzystniejsze jest użycie pierwszej metody.
Dla badanych substancji zawierających azot stosuje się odpowiednie ThOD (NH4 lub N03) zgodnie z tym co jest znane lub oczekiwane o zajściu nitryfikacji (załącznik II.2). Jeżeli nitryfikacja zachodzi, lecz nie jest całkowita, obliczyć poprawkę dla tlenu zużytego przez nitryfikację ze zmian w stężeniu azotynów i azotanów (załącznik V).
Gdy wykonano alternatywne oznaczenia węgla organicznego i/lub właściwej substancji chemicznej, obliczyć procentową degradację, jak opisano pod I.7.
Zapisać wszystkie wyniki na dołączonych arkuszach danych.
V.3.2. Ważność wyników
Pobieranie tlenu w ślepej próbie z inokulum jest zwykle 20-30 mg O2/litr i powinno być niewiększe niż 60 mg/litr w ciągu 28 dni. Wartości wyższe od 60 mg/litr wymagają krytycznego sprawdzenia danych i technik eksperymentalnych. Jeżeli wartość pH jest poza zakresem 6-8,5, a zużycie tlenu przez badaną substancję jest mniejsze niż 60 %, należy powtórzyć badanie z niższym stężeniem badanej substancji.
Zob. także 1.5.2.
V.3.3. Sporządzanie sprawozdania
Zob. 1.8.
V.4. ARKUSZ DANYCH
Przykład arkusza danych podano poniżej.
BADANIE RESPIROMETRII MANOMETRYCZNEJ
1. LABORATORIUM
2. DATA ROZPOCZĘCIA BADANIA
3. SUBSTANCJA BADANA
Nazwa:
Stężenie roztworu podstawowego: ... mg/litr
Początkowe stężenie w podłożu, C: ... mg/litr
Objętość w kolbie do badań (V): ml
ThOD lub COD: mg O2/mg substancji badanej (NH4, N03)
4. INOKULUM Źródło:
Poddano traktowaniu:
Wstępne sezonowanie, o ile wykonano:
Stężenie zawiesiny ciał stałych w mieszaninie reakcyjnej: ... mg/l
5. POBÓR TLENU: BIODEGRADOWALNOŚĆ
| Czas (dni) |
| 0 | 7 | 14 | 21 | 28 | |||||||||
| O2 pobór (mg) badana substancja | 1 | ||||||||||||
| 2 | |||||||||||||
| a, średnia | |||||||||||||
| O2 pobór (mg) | 3 | ||||||||||||
| 4 | |||||||||||||
| b, średnia | |||||||||||||
| skorygowane BOD (mg) | (a1- bm) | ||||||||||||
| (a2- bm) | |||||||||||||
| BOD na mg badanej substancji |  | ||||||||||||
 | |||||||||||||
 | D1 (a1) | ||||||||||||
| D2 (a2) | |||||||||||||
| średnia(*) |
| V = objętość podłoża w kolbie do badań |
| (*) D1 i D2 nie należy uśredniać jeśli się znacząco różnią. |
Uwaga: Podobne arkusze używać można do chemicznej substancji odniesienia i kontroli toksyczności
6. POPRAWKA DLA NITRYFIKACJI (zob. załącznik V)
| Dzien | 0 | 28 | Roznica |
| (i) Steżenie azotanów (mg N/litr) | (N) | ||
| (ii) równoważnik tlenu (4,57 × N × V) (mg) | - | - | |
| (iii) Steżenie azotynów (mg N/litr) | (N) | ||
| (iv) równoważnik tlenu (3,43 × N × V) (mg) | - | - | |
| (ii + iv) Całkowity równoważnik tlenu | - | - |
7. ANALIZA WĘGLA (alternatywna) Analizator węgla:
| Czas (dzień) | Ślepa proba mg/litr | Badana substancja chemiczna mg/ litr |
| 0 | (Cblo) | (C0) |
| 28(*) | (Cblt) | (Ct) |
| (*) lub w końcu inkubacji |
8. WŁASCIWA CHEMICZNA (alternatywna)
Sb = stężenie w fizyko-chemicznej (sterylnej) kontroli w 28 dniu
Sa = stężenie w zaszczepionej kolbie w 28 dniu
9. DEGRADACJA ABIOTYCZNA (alternatywna)
a = zużycie tlenu w sterylnej kolbie po 28 dniach, (mg)
(zob. sekcje 1 i 3)
% abiotyczna degradacja = CoV * ThOD
CZĘŚĆ VI. BADANIE "ZAMKNIĘTEJ BUTLI" (Metoda C.4-E)
VI. 1. ZASADA METODY BADANIA
Roztwór badanej substancji w podłożu mineralnym, zwykle 2-5 mg/litr, jest zaszczepiany relatywnie małą liczbą drobnoustrojów ze zmieszanej populacji i trzymany w całkowicie pełnej, zamkniętej butli w ciemności w stałej temperaturze. Degradacja jest oznaczana przez analizę rozpuszczonego tlenu przez okres czasu 28 dni. Ilość tlenu pobrana przez badaną substancję, skorygowany o pobór w równoległej ślepej próbie z inokulum, jest wyrażona jako stosunek procentowy ThOD lub COD.
VI.2. OPIS METODY
VI.2.1. Przyrząd
a) Butle BOD, ze szklanymi korkami, np. 250-300 ml.
b) Łaźnia wodna lub inkubator, dla trzymania butli w stałej temperaturze (± 1 oC lub lepiej) przy wyłączonym świetle.
c) Duże szklane butle (2-5 litrów) dla przygotowania podłoża i napełniania butli BOD.
d) Elektroda tlenowa i miernik, lub wyposażenie oraz odczynniki dla miareczkowania Winklera.
VI.2.2. Przygotowanie podłoża mineralnego
W celu przygotowania roztworów podstawowych zob. 1.6.2.
Zmieszać 1 (jeden) ml roztworu (a) z (d) i dopełnić do 1 litra wodą rozcieńczającą.
VI.2.3. Przygotowanie inokulum
Inokulum jest zwykle uzyskiwane ze ścieku drugiego stopnia oczyszczalni ścieków lub urządzenia skali laboratoryjnej przyjmującego głównie ścieki domowe. Alternatywnym źródłem inokulum są wody powierzchniowe. Zwykle używa się od jednej kropli (0,05 ml) do 5 ml filtratu na litr podłoża; konieczne mogą być próby dla znalezienia optymalnej objętości danego wycieku (zob. I.6.4.2 i I.6.5).
VI.2.4. Przygotowanie kolb
Silnie napowietrzyć podłoże mineralne na co najmniej 20 min. Przeprowadzić każdą serię badań z podłożem mineralnym pochodzącym z tej samej partii. Ogólnie, podłoże jest gotowe do użycia po odstaniu 20 h, w temperaturze badania. Oznaczyć stężenie rozpuszczonego tlenu do celów kontrolnych; wartość powinna wynosić około 9 mg/litr w 20 oC. Prowadzić wszystkie przenoszenia i operacje napełniania nasyconym podłożem wolnym od pęcherzyków, na przykład poprzez użycie syfonów.
Przygotować równoległe grupy butli BOD dla oznaczeń badanej i chemicznej substancji odniesienia w równoczesnych seriach doświadczalnych. Zestawić wystarczającą liczbę butli BOD, włączając ślepe próby inokulum, wykonać co najmniej zdublowane pomiary zużycia tlenu w pożądanych odstępach badawczych, na przykład po 0, 7, 14, 21 i 28 dniach. Dla zapewnienia zdolności identyfikacji 10-dniowego okna wymagana jest większa ilość butli.
Dodać całkowicie napowietrzone podłoże mineralne do dużych butli, tak by były wypełnione w około jednej trzeciej. Następnie dodać wystarczającą ilość roztworu podstawowego badanej substancji i chemicznej substancji odniesienia do oddzielnych dużych butli tak by końcowe stężenie substancji chemicznej zwykle było niewiększe niż 10 mg/litr. Nie dodawać substancji chemicznej do podłoża kontrolnego ślepej próby zawartego w następnej dużej butli.
W celu zapewnienia, że aktywność inokulum nie jest ograniczona, stężenie rozpuszczonego tlenu nie może być poniżej 0,5 mg/litr w butli BOD. To ogranicza stężenie badanej substancji do około 2 mg/litr. Jednakże dla słabo rozpuszczalnych związków i tych o niskim ThOD można użyć 5-10 mg/litr. W kilku przypadkach jest zalecane przeprowadzenie równoległych serii badań badanej substancji o dwu różnych stężeniach na przykład, 2 i 5 mg/litr. Zwykle oblicza się ThOD na podstawie tworzenia się soli amonowych, lecz jeżeli oczekiwana lub znana jest fakt, że może zajść nitryfikacja, oblicza się go na podstawie tworzenia azotanu (ThODNO3: zob. załącznik II.2). Jednakże jeśli nitryfikacja nie jest całkowita, ale zaszła, należy skorygować zmiany w stężeniu azotynu i azotanu, oznaczone analitycznie (zob. załącznik V).
Jeżeli jest do zbadania toksyczność badanej substancji (w przypadku, na przykład, gdy znaleziono wcześniejsze wartości niskiej biodegradowalności), jest konieczna inna seria butli.
Przygotować inna dużą butlę do pomieszczenia napowietrzonego podłoża mineralnego (do około jednej trzeciej jej objętości) plus badana substancja i chemiczna substancja odniesienia o końcowych stężeniach zwykle takich samych jak w tych z innych dużych butli.
Zaszczepić roztwory w dużych butlach ściekiem drugiego stopnia (jedną kroplą (0,05 ml), lub do 5 ml/litr)) lub z innego źródła, na przykład wody rzecznej (zob. I.6.4.2). Na koniec dopełnić roztwory do objętości napowietrzonym podłożem mineralnym stosując wąż wpuszczony na dno butli dla uzyskania odpowiedniego mieszania.
VI.2.5. Liczba kolb w typowym przebiegu
W typowym przebiegu stosuje się następujące butle:
- co najmniej 10 zawierających badaną substancję i inokulum (zawiesina badana),
- co najmniej 10 zawierających tylko inokulum (ślepa próba z inokulum),
- co najmniej 10 zawierających chemiczna substancja odniesienia i inokulum (procedura kontroli),
- i, gdy konieczne, 6 butli zawierających badaną substancję, chemiczną substancję odniesienia i inokulum (kontrola toksyczności). Jednakże dla zapewnienia zdolności identyfikacji 10-dniowego okna konieczna może być około dwukrotnie większa ilość butli.
VI.2.6. Przeprowadzenie badania
Rozdzielić przygotowany roztwór niezwłocznie do odpowiednich grup butli BOD za pomocą węża z dolnej ćwiartki (nie z dna) do odpowiednio dużych butli, tak aby wszystkie butle BOD zostały całkowicie napełnione. Postukać delikatnie, by usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza. Analizować butle o zerowym czasie niezwłocznie na zawartość rozpuszczonego tlenu metodą Winkler lub elektrodowo. Zawartość butli może być zabezpieczona dla późniejszej analizy metodą Winklera przez dodanie siarczanu manganu (II) i wodorotlenku sodu (pierwszy odczynnik Winklera). Przechowywać w starannie zamkniętych, zawierających związany tlen jako brązowy uwodniony tlenek manganu (III), w ciemności w temperaturze 10-20 °C przez nie dłużej niż 24 godziny przed wykonaniem pozostałych kroków metody Winklera. Zakorkować pozostałe replikowane butle, upewniając się, że nie zawierają pęcherzyków powietrza, i inkubować w 20 °C w ciemności. Każdej serii musi towarzyszyć całkowita seria równoległa z zaszczepionymi podłożami ślepej próby. Wyjąć co najmniej zdublowane butle wszystkich serii w celu analizy rozpuszczonego tlenu w odstępach czasu (co najmniej cotygodniowo) przez 28 dni inkubacji.
Cotygodniowe pobieranie próbek powinno umożliwić ocenę stosunku procentowego usunięcia w 14-dniowym oknie, przy czym pobieranie próbek co 3-4 dni powinno umożliwić identyfikację 10-dniowego okna, wymaganego około podwójnie co większość butli.
Dla substancji badanych zawierających azot należy wykonać korekty poboru tlenu przez każdą zachodzącą nitryfikację. By to wykonać, użyć metody O2-elektrody dla oznaczania stężenia rozpuszczonego tlenu i następnie pobrać próbkę z butli BOD do analizy na azotyny i azotany. Ze wzrostu stężenia azotynów i azotanów, obliczyć użyty tlen (zob. załącznik V).
VI.3. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
VI.3.1. Obróbka wyników
Wpierw obliczyć BOD użyte po każdym okresie czasu przez odejmowanie zubożenia tlenu (mg/litr) ślepej próby z inokulum od tej wykazanej przez badaną substancję. Podzielić to poprawione zubożenie przez stężenie(mg/litr) badanej substancji, aby uzyskać właściwe BOD jako mg tlenu na mg badanej substancji. Obliczyć procentową biodegradowalność przez podzielenie właściwego BOD przez właściwe ThOD (obliczonego zgodnie z załącznikiem II.2) lub COD (oznaczonego przez analizę, zob. załącznik II.3), zatem:
= mg O2/mg badana substancja
lub
Należy zauważyć, że te dwie metody niekoniecznie dają te same wartości; korzystne jest użycie pierwszej metody.
Dla badanych substancji zawierających azot użyć odpowiednie ThOD (NH4 lub N03) zgodnie z tym, co jest znane lub oczekiwane o występowaniu nitryfikacji (załącznik II.2). Jeżeli nitryfikacja zachodzi lecz nie jest całkowita, obliczyć poprawkę dla tlenu zużytego przez nitryfikację ze zmiany w stężeniu azotynów i azotanów (załącznik V).
VI.3.2. Ważność wyników
Zubożenie tlenu w ślepej próbie z inokulum nie powinno przekraczać 1,5 mg rozpuszczonego tlenu/litr po 28 dniach. Wyższe wartości wymagają prześledzenia techniki eksperymentalnej. Resztkowe stężenie tlenu w badanych butlach nie powinno nigdy spaść poniżej 0,5 mg/litr. Takie niskie poziomy tlenu są ważne, gdy stosowana metoda oznaczania rozpuszczonego tlenu jest zdolna do dokładnego pomiaru takich poziomów.
Zob. także I.5.2.
VI.3.3. Sporządzanie sprawozdania
Zob. I.8.
VI.4. ARKUSZ DANYCH
Przykład arkusza danych podano poniżej.
BADANIE METODĄ "ZAMKNIĘTEJ BUTLI"
1. LABORATORIUM
2. DATA ROZPOCZĘCIA BADANIA
3. SUBSTANCJA BADANA
Nazwa:
Stężenie roztworu podstawowego: ... mg/litr
Początkowe stężenie w butli: ...mg/litr
ThOD lub COD: ... mg O2/mg substancji badanej
4. INOKULUM
Źródło:
Poddano traktowaniu:
Przygotowanie wstępne, o ile stosowano:
Stężenie w mieszaninie reakcyjnej: ... mg/litr
5. OZNACZANIE DO
Metoda: Winklera/elektrodowa
Analizy kolb
| Czas inkubacji (d) | DO mg/l) |
| 0 | n1 | n2 |
| Ślepa próba -(bez substancji chemicznej | 1 | C1 | ||||
| 2 | C2 |
| Średnia |  |
| Badana substancja chemiczna | 1 | a1 | ||||
| 2 | a2 |
| Średnia |  |
Uwaga: Podobny arkusz może być stosowany dla substancji odniesienia i kontroli toksyczności.
6. POPRAWKA DLA NITRYFIKACJI (zob. załącznik V)
| Czas inkubacji (d) | 0 | n1 | n2 | n3 |
| (i) Stężenie azotanu (mg N/litr) | ||||
| (ii) Zmiana w stężeniu azotanu (mg N/litr) | - | |||
| (iii) Równoważnik tlenu (mg/litr) | - | |||
| (iv) Stężenie azotynu (mg N/litr) | ||||
| (v) Zmiana w stężeniu azotynu (mg N/litr) | - | |||
| (vi) Równoważnik tlenu (mg/litr) | - | |||
| (iii + vi) Całkowity równoważnik tlenu (mg/litr) | - |
7. ZUBOŻENIE DO: % DEGRADACJA
| Zubożenie po n dniach (mg/litr) |
| n1 | n2 | n3 | ||
| KOLBA 1:(mto-mtx)-(mbo- mbx) | ||||
| KOLBA 2: (mto- mtx) - (mbo- mbx) | ||||
| KOLBA 1:
| ||||
| KOLBA 2:
| ||||
 |
| (*) Nie brać średniej jeżeli jest znacząca różnica pomiędzy replikami. |
mto = wartość w badanej kolbie w czasie 0
mtx = wartość w badanej kolbie w czasie x
mbo = średnia wartość ślepej próby w czasie 0
mbx = średnia wartość ślepej próby w czasie x
Zastosować także poprawkę dla nitryfikacji z (iii + vi) w sekcji 6.
8. ZUBOŻENIA DO W ŚLEPYCH PRÓBACH
Zużycie tlenu przez ślepą próbę: (mbo - mb28) mg/litr. Niniejsze zużycie jest istotne dla ważności naukowej badania. Powinno być mniejsze niż 1,5 mg/litr.
CZĘŚĆ VII. BADANIE M.I.T.I. (Metoda C.4-F)
VII.1. ZASADA METODY
Pobieranie tlenu trakcie mieszania roztworu lub zawiesiny badanej substancji w podłożu mineralnym, zaszczepionego specjalnie hodowanymi, nieadoptowanymi drobnoustrojami, jest mierzone automatycznie w ciągu okresu 28 dni w zaciemnionym, zamkniętym respirometrze w 25 ± 1 oC. Wydzielany ditlenek węgla jest absorbowany przez wapno sodowane. Biodegradowalność jest wyrażana jako procent pobieranego tlenu (skorygowany dla poboru w ślepej próbie) poboru teoretycznego (ThOD). Procent pierwotnej biodegradowal-ności jest również obliczany z dodatkowej właściwej analizy chemicznej wykonywanej na początku i pod koniec inkubacji oraz, alternatywnie, przez analizę DOC.
VII.2. OPIS METODY
VII.2.1. Przyrząd
a) Automatyczny elektrolityczny miernik BOD respirometr zwykle wyposażony w 6 butli, każda 300 ml i zaopatrzony w kubki na substancję absorbującą CO2.
b) Stała temperatura pokojowa i/lub łaźnia wodna 25 oC ± 1 oC lub lepszej.
c) Zespół filtracji membranowej (alternatywny).
d) Analizator węgla (alternatywny).
VII.2.2. Przygotowanie podłoża mineralnego
Przygotować następujące roztwory podstawowe, stosując odczynniki czystości analitycznej i wodę (I.6.1.):
a) Diwodoroortofosforan potasu, KH2P048,50 g
monowodoroortofosforan dipotasu, K2HP0421,75 g
monowodoroortofosforan disodu, dodekawodny Na2HP04 12 H2044,60 g
chlorek amonu, NH4Cl1,70 g
Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra.
Wartośc pH roztworu powinna wynosić 7,2.
b) Siarczan magnezu, heptawodny MgSO4 7H2022,50 g
Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra.
c) Chlorek wapnia bezwodny, CaCl227,50 g
Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra.
d) Chlorek żelaza (III), heksawodny FeCl3 6H2027,50 g
Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra.
Pobrać 3 ml każdego roztworu (a), (b), (c) i (d) i dopełnić do 1 litra.
VII.2.3. Przygotowanie inokulum
Zebrać świeże próbki z nie więcej niż dziesięciu miejsc, głównie z obszarów, gdzie stosowana i unieszkodliwiana jest duża rozmaitość substancji chemicznych. Z takich miejsc, jak oczyszczalnie ścieków, oczyszczalnie ścieków wodnych przemysłowych, rzek, jezior, mórz, zebrać 1 litrowe próbki osadu, gleby powierzchniowej, wody itp. i dokładnie wymieszać. Po usunięciu ciał znajdujących się na powierzchni i odstawieniu ustawić pH nadsączu na 7 ± 1 za pomocą wodorotlenku sodu lub kwasu fosforowego.
Użyć odpowiednią objętość odfiltrowanego nadsączu napełnienia zbiornika, służącego do napełniania i wylewania aktywowanego osadu, i napowietrzać roztwór około 23 1/2 godziny. Trzydzieści minut po wstrzymaniu napowietrzania odrzucić około jednej trzeciej całej objętości nadsączu i dodać równą objętość roztworu (pH 7) zawierającego po 0,1 % glukozy, peptonu i ortofosforanu potasu w celu zsedymentowania materiału i rozpocząć ponowne napowietrzanie. Powtarzać niniejszą procedurę raz dziennie. Zbiornik z osadem należy obsługiwać zgodnie z dobrą praktyką: ciecz musi być klarowna, temperaturę należy utrzymywać w 25 ± 2 °C, pH powinno wynosić 7 ± 1, osad należy prawidłowo osadzać, należy utrzymywać wystarczające napowietrzanie mieszaniny aerobowej przez cały czas, powinny być obecne pierwotniaki a aktywność osadu należy badać względem substancji odniesienia co najmniej raz na trzy miesiące. Nie używać osadu jako inokulum, przed upływem co najmniej miesiąca jego utrzymywania i po okresie dłuższym od czterech miesięcy. Następnie pobierać próbki z co najmniej 10 miejsc w regularnych odstępach czasu, raz na trzy miesiące.
W celu utrzymania świeżego i starego osadu w tej samej aktywności zmieszać odfiltrowany nadsącz aktywowanego bieżąco używanego osadu z równą objętością odfiltrowanego nadsączu z mieszaniny zebranej z dziesięciu źródeł i prowadzić kulturę połączonej cieczy, jak powyżej. Pobrać osad do użycia jako inokulum 18-24 godzin po zasileniu zbiornika.
VII.2.4. Przygotowanie kolb
Przygotować następujące sześć kolb:
Nr 1: badana substancja w wodzie rozcieńczającej w 100 mg/l
Nr 2, 3 i 4: badana substancja w podłożu mineralnym w 100 mg/l
Nr 5: chemiczna substancja odniesienia (np. anilina) w podłożu mineralnym w 100 mg/l
Nr 6: tylko podłoże mineralne
Dodać słabo rozpuszczalną badaną substancję bezpośrednio na podstawie wagi lub objętości lub postępować jak opisano w załączniku III, poza przypadkiem, gdy nie należy używać ani rozpuszczalników, ani środków emulsyfikujących. Dodać absorbent CO2 do wszystkich kolb w przygotowanych specjalnych kubkach. Ustawić pH w kolbach nr 2, 3 i 4 na 7,0.
VII.2.5. Przeprowadzenie badania
Zaszczepić kolby nr 2, 3 i 4 (zawiesina badana), nr 5 (kontrola aktywności) i nr 6 (inokulum ślepa próba) małą objętością inokulum, by uzyskać stężenie 30 mg/l zawiesiny ciał stałych. Niedodawane jest inokulum do kolby nr 1, która służy jako kontrola abiotyczna. Zestawić wyposażenie, sprawdzić szczelność, włączyć mieszadła, i rozpocząć pomiar pobierania tlenu w warunkach ciemności. Codziennie sprawdzać temperaturę, mieszadła i rejestrator kulometrycznego pobierania tlenu, notować wszystkie zmiany w kolorze zawartości kolb. Bezpośrednio odczytywać pobieranie tlenu w sześciu kolbach odpowiednią metodą, na przykład z sześciopunktowego rejestratora drukującego krzywe BOD. Na koniec inkubacji, zwykle 28 dni, zmierzyć pH zawartości kolb i oznaczyć stężenie pozostałości badanej substancji i wszystkich pośrednich, a w przypadku substancji rozpuszczalnych w wodzie, stężenie DOC (załącznik II.4). Zwrócić szczególną uwagę w przypadku lotnych substancji chemicznych. Jeżeli przewidywana jest nitryfikacja, oznaczyć jeżeli możliwe, stężenie azotynów i azotanów.
VII.3. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
VII.3.1. Obróbka wyników
Podzielić ilość pobranego tlenu (mg) przez badaną substancję po danym czasie (skorygować o wartość pobraną w ślepej próbie kontroli inokulum po tym samym czasie), przez wagę użytej badanej substancji. Daje to BOD wyrażone jako mg tlenu/mg badana substancja, czyli:
= mg 02/mg badana substancja.
Procentowa biodegradacja jest zatem otrzymywana z:
Dla mieszanin obliczyć ThOD z analizy składników jak dla pojedynczych związków. Użyć odpowiednie ThOD (ThODNH4 lub ThODN03) w zależności, czy nitryfikacja jest obecna czy ukończona (załącznik II.2). Jeżeli jednakże nitryfikacja zachodzi, ale nie jest całkowita, wykonać poprawkę dla tlenu zużytego w nitryfikacji, wyliczonego ze zmian stężeń azotynów i azotanów (załącznik V).
Obliczyć procentową pierwotna biodegradację ze straty właściwej macierzystej substancji chemicznej (zob. 1.7.2).
Jeżeli zaszła strata badanej substancji w kolbie nr 1 mierzącej fizyko-chemiczne usunięcie, zarejestrować to i użyć stężenia badanej substancji (Sb) po 28 dniach w tej kolbie dla obliczenia procentowej biodegradacji.
Jeżeli wykonano oznaczenia DOC (alternatywne), obliczyć ostateczną procentową biodegradację z:
jak opisano w pkt 1.7.1. Jeśli nie wystąpiła strata DOC w kolbie nr 1, mierzącej fizyko-chemiczne usunięcie, użyć stężenia DOC w niniejsze kolbie do obliczenia procentowej biodegradacji.
Zapisać wszystkie wyniki na dołączonych arkuszach danych.
VII.3.2. Ważność wyników
Pobieranie tlenu w ślepej próbie z inokulum jest zwykle 20-30 mg O2/l i powinno być nie większe niż 60 mg/l w ciągu 28 dni. Wartości wyższe od 60 mg/l wymagają krytycznego sprawdzenia danych i technik eksperymentalnych. Jeżeli wartość pH jest poza zakresem 6-8,5, a zużycie tlenu przez badaną substancję jest mniejsze niż 60 %, należy powtórzyć badanie z niższym stężeniem badanej substancji.
Zob. także I.5.2.
Jeżeli procentowa degradacja aniliny obliczona ze zużycia tlenu nie przekracza 40 % po 7 dniach i 65 % po 14 dniach, badanie uważane jest za nieważne.
VII.3.3. Sporządzanie sprawozdania
Zob.: I.8.
VII.4. ARKUSZ DANYCH
Przykład arkusza danych podano poniżej.
BADANIE MITI (I)
1. LABORATORIUM
2. DATA ROZPOCZĘCIA BADANIA
3. SUBSTANCJA BADANA
Nazwa:
Stężenie roztworu podstawowego: ... mg/l jako substancja chemiczna
Początkowe stężenie w podłożu, CO: ... mg/l jako substancja chemiczna
Objętość mieszaniny reakcyjnej, V: ... ml
ThOD: ... mg O2/l
4. INOKULUM
Miejsca pobierania osadu kanalizacyjnego:
1)... 6)...
2)... 7)...
3)... 8)...
4)... 9)...
5)... 10) ...
Stężenie zawiesiny ciał stałych w aktywowanym osadzie po sezonowaniu z syntetycznym ściekiem = ... mg/l
Objętość aktywowanego osad na litr końcowego podłoża = ... ml
Stężenie osad końcowym podłożu = ... mg/l
5. POBÓR TLENU: BIODEGRADOWALNOŚĆ
Typ używanego respirometru:
| Czas (dni) | |||||
| 0 | 7 | 14 | 21 | 28 | |
| O2 pobrany (mg) badana substancja | a1 | |||||
| a2 | ||||||
| a3 | ||||||
| O2 pobrany (mg) ślepa proba | b | |||||
| Poprawka pobranego O2 (mg) | (a1-b) (a2-b) (a3-b) |
| BOD na mg badanej substancji |  | Kolba 1 | |||||
| Kolba 2 | |||||||
| Kolba 3 | |||||||
| 1 | ||||||
| 2 | |||||||
| 3 | |||||||
| srednia(*) |
| (*) Nie uśredniać przy znacznych różnicach pomiędzy replikami. |
Uwaga: podobny arkusz można używać dla substancji odniesienia.
6. ANALIZA WĘGLA (alternatywna) Analizator węgla:
| Kolba | DOC | % DOC usunięte | Średnia | |
| zmierzone | skorygowane | |||
| Woda + substancja badana | a | - | - | |||
| Osad + substancja badana | b1 | b1-c | ||||
| Osad + substancja badana | b2 | b2-c | ||||
| Osad + substancja badana | b3 | b3-c | ||||
| Ślepa próba kontrolna | c | - | - | - |
7. WŁAŚCIWE CHEMICZNE DANE ANALITYCZNE
| Pozostałość badanej substancji na koniec badania | % degradacja | |
| ślepa próba z wodą | Sb | |
| zaszczepione podłoze | Sa1 | |
| Sa2 | ||
| Sa3 |
Obliczyć % degradacji odpowiednio dla kolby al i a3
8. UWAGI
Należy dołączyć, gdy dostępna, krzywą BOD w zależności od czasu.
ZAŁĄCZNIK I
SKRÓTY I DEFINICJE
DO: Rozpuszczony tlen (mg/l) jest stężeniem tlenu rozpuszczonego w wodnej próbce.
BOD: Zapotrzebowanie biochemiczne na tlen (g) jest ilością tlenu zużytego przez drobnoustroje metabolizujące badany związek; także wyrażane jako gramy pobieranego tlenu na gramy badanego związku (zob. metoda C.5).
COD: Zapotrzebowanie chemiczne na tlen (g) jest ilością tlenu zużytego w czasie trwania utleniania badanego związku gorącym zakwaszonym dichromianem; dostarcza pomiaru ilości obecnych utlenialnych ciał; także wyrażane jako gramy tlenu zużytego na gramy badanego związku (zob. metoda C.6).
DOC: Rozpuszczalny węgiel organiczny jest to węgiel organiczny obecny w roztworze, lub ten przechodzący przez filtr 0,45 mikrona lub pozostaje w nadsączu po odwirowaniu przy 40.000 m/s2 (±4.000 g) dla 15 min.
ThOD: Teoretyczne zapotrzebowanie na tlen (mg) jest całkowitą ilością tlenu wymaganą do całkowitego chemicznego utlenienia; jest obliczane ze wzoru cząsteczkowego (zob. załącznik II.2) i jest także wyrażane jako mg wymaganego tlenu na mg badanego związku.
ThCO2: Teoretyczny ditlenek węgla (mg) jest ilością ditlenku węgla obliczoną jako wytworzoną ze znanej lub zmierzonej zawartości węgla związku badanego, przy pełnej mineralizacji; także wyrażany jako ilość mg ditlenku węgla wydzielanego na mg badanego związku.
TOC: Całkowity węgiel organiczny próbki jest sumą węgla organicznego w roztworze i w zawiesinie.
IC: Węgiel nieorganiczny.
TC: Całkowity węgiel, jest sumą węgla organicznego i nieorganicznego obecną w próbce.
Pierwotna biodegradacja:
jest zmianą w chemicznej strukturze substancji, spowodowaną działaniem biologicznym, powodującą utratę specyficznych właściwości tej substancji.
Ostateczna biodegradacja (aerobowa):
jest uzyskanym poziomem degradacji, gdy badany związek zostaje całkowicie rozłożony przez drobnoustroje, objawiający się wytwarzaniem ditlenku węgla, wody, soli mineralnych i nowych mikrobowych składowych komórkowych (biomasy).
Łatwo biodegradowalne:
umowna klasyfikacja substancji chemicznych przechodzących pewne specyficzne badania przesiewowe na ostateczną biodegradowalność; te badania są tak zaostrzone, że można stwierdzić, że takie związki ulegną szybko i całkowicie biodegradacji w środowiskach wodnych w warunkach aerobowych.
Pierwotnie biodegradowalny:
klasyfikacja substancji chemicznych dla których istnieją niedwuznaczne dowody biodegradacji (pierwotnej lub ostatecznej) we wszystkich naukowo uznanych badaniach biodegradowalności.
Podatność na obróbkę:
jest uległością związków do usuwania w czasie trwania biologicznej obróbki ścieków bez zakłócania zwykłego działania procesów przetwarzania. Ogólnie łatwo biodegradowalne związki są podatne na obróbkę, lecz nie wszystkie o pierwotnej biodegradowalności. Abiotyczne procesy mogą także powodować działanie.
Czas opóźnienia:
jest czasem od inokulacji, w badaniu "die-away", do momentu aż procent degradacji wzrośnie co najmniej 10 %. Czas opóźnienia jest często bardzo zmienny i słabo odtwarzalny:
Czas degradacji:
jest czasem od końca czasu opóźnienia do czasu uzyskania 90 % maksymalnego poziomu degradacji.
10- dniowe okno:
jest 10 dniami bezpośrednio następującymi po osiągnięciu 10 % degradacji.
ZAŁĄCZNIK II
OBLICZENIE I OZNACZENIE ODPOWIEDNICH PARAMETRÓW PODSUMOWUJĄCYCH
W zależności od wybranej metody, mogą być wymagane pewne parametry podsumowujące. Następująca sekcja opisuje wyprowadzenie tych wartości. Użycie tych parametrów jest opisane w poszczególnych metodach.
1. Zawartość węgla
Zawartość węgla jest obliczana ze znanego składu pierwiastkowego lub oznaczana poprzez analizę pierwiastkową substancji badanej.
2. Teoretyczne zapotrzebowanie tlenu (ThOD)
Teoretyczne zapotrzebowanie tlenu (ThOD) może być obliczone, jeżeli znany jest skład pierwiastkowy lub jest wyznaczony przez analizę elementarną. Dla związku:
CcHhClclNnNanaOoPpSs
lub z nitryfikacją,
bez nitryfikacji,
3. Zapotrzebowanie chemiczne na tlen (COD)
Zapotrzebowanie chemiczne na tlen (COD) jest oznaczane zgodnie z metodą C.6.
4. Rozpuszczalny węgiel organiczny (DOC)
Rozpuszczalny węgiel organiczny (DOC) jest według definicji węglem organicznym wszystkich substancji chemicznych i mieszanin w wodzie przechodzących przez filtr 0,45 mikrona.
Próbki z naczyń badawczych są pobierane i niezwłocznie filtrowane w aparacie filtracyjnym, stosując odpowiedni filtr membranowy. Pierwsze 20 ml (można zmniejszyć ilość, stosując mniejsze filtry) filtratu jest odrzucane. Objętości 10-20 ml lub mniej, jeżeli wstrzykuje się (objętość zależy od ilości wymaganej dla analizatora węgla), są poddawane analizie na węgiel. Stężenie DOC jest oznaczane za pomocą analizatora węgla organicznego zdolnego do dokładnych pomiarów stężenia węgla równoważnego lub niższego niż 10 % początkowego stężenia DOC użytego w badaniu.
Odfiltrowane próbki, które nie mogą być analizowane tego samego dnia, można zabezpieczyć przez przechowanie w lodówce w 2-4 °C przez 48 godz. lub niższej - 18 oC przez dłuższy czas.
Uwagi;
Filtry membranowe są często impregnowane środkami powierzchniowoczynnymi w celu hydrofilizacji. Zatem filtr może zawierać do kilku mg rozpuszczalnego węgla organicznego, który będzie zakłócał oznaczenia biodegradowalności. Usuwa się związki powierzchniowoczynne i inne rozpuszczalne związki organiczne z filtrów przez gotowanie ich w wodzie dejonizowanej przez trzy okresy czasu po jednej godzinie każdy. Filtry następnie można przechowywać w wodzie przez tydzień. Jeżeli wkłady filtrów jednorazowych są używane, każda partia musi być sprawdzona dla potwierdzenia ze nie zawiera rozpuszczalnego węgla organicznego.
W zależności od rodzaju filtra membranowego badana substancja może być zatrzymywana przez adsorpcję. Jest zatem godne polecenia upewnienie się czy badana substancja nie jest zatrzymywana przez filtr.
Odwirowanie w 40.000 m/sec2 (4.000 g) przez 15 min można stosować do zróżnicowania TOC względem DOC zamiast filtracji. Metoda nie jest pewna przy początkowym stężeniu < 10 mg DOC/l ponieważ, albo nie wszystkie bakterie są usuwane, albo węgiel jako składnik plazmy bakteryjnej jest ponownie rozpuszczany.
BIBLIOGRAFIA
- Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Poll. Control Fed., Oxygen Demand, 1965, P 65.
- Wagner, R., Von Wasser, 1976, vol. 46, 139.
- DIN-Entwurf 38409 Teil 41 - Deutsche Einheitsverfahren zur Wasser-, Abwasser- und Schlammunter-suchung, Summarische Wirkungs- und Stoffkenngröβen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuβ Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut fur Normung e.V.
- Gerike, P., The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol 13 (1), 169.
ZAŁĄCZNIK III
OCENA BIODEGRADOWALNOŚCI SŁABO ROZPUSZCZALNYCH SUBSTANCJI
W badaniach biodegradowalności słabo rozpuszczalnych substancji należy zwrócić szczególną uwagę na następujące aspekty.
Podczas gdy jednorodne ciecze rzadko stwarzają problemy z pobieraniem ich próbek, dla materiałów w postaci ciał stałych, zalecana jest ich homogenizacja odpowiednimi metodami, aby zapobiec błędom z powodu ich niejednorodności. Należy zwrócić szczególną uwagę, gdy wymagane są reprezentatywne próbki kilkumiligramowe z mieszanin substancji chemicznych o dużej zawartości zanieczyszczeń.
W czasie badań można stosować różne formy mieszania. Należy zwrócić uwagę by używać dostatecznego mieszania tylko do utrzymania substancji chemicznej w postaci zawiesiny, w celu zapobieżenia przegrzaniu, nadmiernemu pienieniu i nadmiernym siłom poprzecznym.
Można stosować emulsyfikator dający stabilną zawiesinę substancji chemicznej. Nie może być on toksyczny dla bakterii i ulegać biodegradacji lub powodować pienienie w warunkach badania.
Do rozpuszczalników stosuje się takie same kryteria jak do emulsyfikatorów.
Nie jest zalecane używanie stałych nośników przy badaniu stałych substancji ale mogą być one odpowiednie dla substancji oleistych.
Gdy stosowane są pomocnicze substancje, takie jak emulsyfikatory, rozpuszczalniki oraz nośniki, należy przeprowadzić ślepą próbę z substancją pomocniczą.
Każde z trzech badań respirometrycznych CO2, BOD, MITI można użyć w badaniach biodegradowalności związków słabo rozpuszczalnych.
BIOBLIGRAFIA
- de Morsier, A. et al., Biodegradacja tests for słabo rozpuszczalne compounds. Chemosphere, 1987, vol. 16, 833.
- Gerike, P., The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.
ZAŁĄCZNIK IV
OCENA BIODEGRADOWALNOŚCI SUBSTANCJI CHEMICZNEJ PODEJRZEWANEJ O DZIAŁANIE TOKSYCZNE DLA INOKULUM
Jeżeli substancja chemiczna podlegająca badaniu na łatwość biodegradowalności okazuje sie być niebiodegradowalną, zalecana jest następująca procedura, jeśli pożądana jest różnica pomiędzy inhibicją a obojętnością (Reynolds et al., 1987).
Do badań biodegradacji i toksyczności należy użyć podobnych lub identycznych inokulum.
Do oceny toksyczności substancji chemicznych w badaniach łatwości biodegradacji wydaje się odpowiednie zastosowanie jednego z, lub połączonych badań: inhibicji szybkości respiracji aktywowanego osadu (Dir 88/302/EEC), BOD i/lub inhibicji wzrostu.
Aby zapobiec inhibicji z powodu toksyczności, sugeruje się, aby stężenia substancji badanej, stosowane w badaniach łatwości biodegradowalności, były mniejsze niż 1/10 wartości EC50 (lub mniejsze niż wartości EC20) otrzymywanych w badaniach toksyczności. Związki o wartości EC50 większej niż 300 mg/l nie wywierają prawdopodobnie działania toksycznego w badaniach łatwości biodegradacji.
Wartości EC50 mniejsze niż 20 mg/l prawdopodobnie stwarzają poważne problemy w następnych badaniach. Należy zastosować niskie stężenia badania, powodującego konieczność użycia surowego i czułego badania "zamkniętej butli" lub użycia znacznika 14C. Alternatywnie sezonowane inokulum pozwala użyć wyższego stężenia substancji badanej. W ostatnim przypadku gubi się jednak kryterium właściwe badaniu łatwości biodegradacji.
BIOBLIGRAFIA
Reynolds, L. et al., Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability Chemosphere, 1987, vol. 16, 2259.
ZAŁĄCZNIK V
KOREKCJA POBORU TLENU Z POWODU ZAKŁÓCENIA PRZEZ NITRYFIKACJĘ
Błędy z powodu nieuwzględniania nitryfikacji w ocenie pobieranie tlenu w biodegradowalności substancji badanych niezawierających azotu są marginalne (nie większe niż 5 %), nawet jeżeli utlenianie azotu amonowego w podłożu zachodzi inaczej niż pomiędzy substancją badaną i naczyniami ślepej próby. Jednakże zawarty w badanych substancjach azot powoduje powstanie poważnych błędów.
Jeżeli zaszła nitryfikacja lecz nie jest całkowita, obserwowane pobieranie tlenu przez mieszaninę reakcyjną musi być skorygowane o ilość tlenu zużytego przy utlenieniu amoniaku do azotynów i azotanów; jeżeli zmiany w stężeniu, w czasie trwania inkubacji, azotynów i azotanów są określone następującymi równaniami:
2 NH4Cl + 3 O2 = 2 HNO2 + 2 HCl + 2 H2O(1)
2 HNO2 + O2 = 2 HNO3(2)
ogólnie:
2 NH4Cl + 4 O2 = 2 HNO3 + 2 HC1+ 2 H2O(3)
Według równania (1) pobór tlenu przez 28 g azotu zawartego w chlorku amonu (NH4Cl) utlenianego do azotynu wyniesie 96 g, dając wskaźnik 3,43 (96/28). W ten sam sposób z równania (3) pobór tlenu przez 28 g azotu utlenionego do azotanu wynosi 28 g, dając wskaźnik 4,57 (128/28).
Ponieważ reakcje zachodzą sekwencyjnie, zostały przeprowadzone przez różne szczepy bakterii, jest możliwy wzrost lub spadek stężenia azotynów; w ostatnim przypadku utworzy się równoważne stężenie azotanów, Zatem tlen zużyty w utworzeniu azotanu jest 4,57 mnożony przez wzrost w stężeniu azotanu, podczas gdy tlen połączony z utworzeniem azotynu jest 3,43 pomnożony przez wzrost w stężeniu azotynu lub ze spadkiem w jego stężeniu strata tlenu jest - 3,43 pomnożona przez spadek w stężeniu.
Oznacza to:
O2 zużytego w tworzeniu azotanu = 4,57 x wzrost w stężeniu azotanu(4)
i
O2 zużytego w tworzeniu azotynu = 3,43 x wzrost w stężeniu azotynu(5)
i
Strata O2 w zaniku azotynu = - 3,43 x spadek w stężeniu azotanu(6)
Tak więc
Pobór O2 z powodu nitryfikacji = ± 3,43 x zmiana stężenia azotynu +4,57 x wzrost stężenia azotanu.(7)
I dlatego
Pobór O2 z powodu utleniania C = całkowity obserwowany pobór - pobór z powodu nitryfikacji(8)
Alternatywnie, jeżeli tylko całkowity utleniony azot jest oznaczony, pobieranie tlenu z powodu nitryfikacji, może być wzięte, w pierwszym przybliżeniu, 4,57 x wzrost w utlenionym azocie.
Wartość poprawki zużycia tlenu z powodu utleniania węgla jest następnie porównywana z ThOD NH3, jak wyliczono w załączniku II.
C.5. DEGRADACJA - ZAPOTRZEBOWANIE BIOCHEMICZNE NA TLEN
1. METODA
1.1. WPROWADZENIE
Celem metody jest pomiar zapotrzebowania biochemicznego na tlen (BOD) substancji organicznych w stanie ciekłym lub stałym.
Dane wypracowane w niniejszym badaniu odnoszą się do związków rozpuszczalnych w wodzie, jednakże związki lotne oraz te o niskiej rozpuszczalności w wodzie, mogą być również, przynajmniej z zasady badane.
Metoda jest stosowana tylko do tych badanych materiałów organicznych, które nie są inhibitorami w stosunku do bakterii w stężeniach używanych w badaniu. Jeżeli badany materiał nie jest rozpuszczalny w stężeniu badania, należy użyć specjalnych środków, takich jak użycie ultradźwięków, dla uzyskania dobrej zawiesiny badanego materiału.
Informacje na temat toksyczności substancji chemicznej są użyteczne do interpretacji niskich wyników i do wyboru odpowiednich stężeń badań.
1.2. DEFINICJA I JEDNOSTKI
BOD jest zdefiniowane jako masa rozpuszczonego tlenu pożądana przez właściwą objętość roztworu substancji dla procesu utleniania biochemicznego w opisanych warunkach.
Wyniki są wyrażane jako gramy BOD na gram badanej substancji.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Pożądane jest użycie odpowiednich substancji odniesienia dla sprawdzenia aktywności inokulum.
1.4. ZASADA METODY BADANIA
Wstępnie oznaczona ilość substancji, rozpuszczona lub zawieszona w dobrze napowietrzanym odpowiednim podłożu, jest zaszczepiana drobnoustrojami i inkubowana w stałej zdefiniowanej temperaturze otoczenia w ciemności.
BOD jest oznaczane przez różnicę w zawartości rozpuszczonego tlenu na początku i na końcu badania. Czas trwania badania wynosi co najmniej 5 dni i nie więcej niż 28 dni.
Ślepa próba musi być oznaczona w równoległym badaniu niezawierającym badanej substancji.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCI
Oznaczenie BOD nie może być uważane jako mające ważność naukową oznaczenie biodegradowalności substancji, a jedynie jako badanie przesiewowe (sortujące).
1.6. OPIS METODY BADANIA
Wstępny roztwór lub zawiesina substancji jest przygotowywana aby uzyskac stężenie BOD odpowiednie dla zastosowanej metody. Następnie BOD jest oznaczane stosując jedną z odpowiednich narodowo i międzynarodowo standaryzowanych metod.
2. DANE I OCENA
BOD zawarte w wstępnym roztworze jest obliczane zgodnie z wybraną znormalizowana metodą i przeliczane na gramy BOD na gram badanej substancji.
3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA
Metoda stosowana musi być ustalona.
Zapotrzebowanie biochemiczne na tlen należy uśrednić z co najmniej trzech ważnych pomiarów.
Wszystkie informacje i uwagi odnośnie interpretacji wyników musza być przedstawione w sprawozdaniu, szczególnie w odniesieniu do zanieczyszczeń, postaci fizycznej, działania toksycznego i właściwości związanych z budową substancją które powodują wpływ na wyniki.
Musi być wykazane w sprawozdaniu użycie dodatków hamujących biologiczna nitryfikację.
4. LITERATURA
Wykaz standaryzowanych metod, dla przykładu:
NF T 90-103: Determination biochemical oxygen demand.
NBN 407: Biochemical oxygen demand.
NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik (BZV).
The determination of biochemical oxygen demand, Methods for the examination of water and associated materials, HMSO, London.
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n days.
C.6. DEGRADACJA - ZAPOTRZEBOWANIE CHEMICZNE NA TLEN
1. METODA
1.1. WPROWADZENIE
Celem metody jest pomiar zapotrzebowania chemicznego na tlen (COD) substancji organicznych w stanie ciekłym lub stałym w standardowy arbitralny sposób, w ustalonych warunkach laboratoryjnych.
Informacje na temat wzoru chemicznego są użyteczne dla prowadzenia tego badania oraz interpretacji uzyskanych wyników (np. sole halogenowe, sole żelazowe związków organicznych, związki chloroorganiczne).
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI
Zapotrzebowanie chemiczne na tlen jest zmierzoną utlenialnością substancji, wyrażoną jako równoważna ilość tlenu odczynnika utleniającego zużytego przez substancje w ustalonych warunkach laboratoryjnych.
Wynik jest wyrażany w gramach COD na gram badanej substancji.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Nie ma konieczności stosowania substancji odniesienia za każdym razem, gdy przeprowadzane są badania nowej substancji. Powinny one służyć głównie sprawdzeniu od czasu do czasu wydajności metody i pozwolić na porównanie wyników z innymi metodami.
1.4. ZASADA METODY BADANIA
Wstępnie oznaczona ilość substancji, rozpuszczonej lub zawieszonej w wodzie, jest utleniana przez dichromian potasu w stężonym kwasie siarkowym z siarczanem srebra jako katalizatorem, pod chłodnicą zwrotną przez dwie godziny. Pozostałość dichromiany jest oznaczana miareczkowo mianowanym roztworem siarczanu żelazoamonowego.
W przypadku substancji zawierających chlor, dodaje się siarczanu rtęci(1) celem zmniejszenia zakłócenia przez chlorki.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCI
Z powodu arbitralnego sposobu oznaczenia, COD jest "wskaźnikiem utlenialności" i jako taki używany jest jako praktyczna metoda pomiaru związków organicznych.
Chlorki zakłócają to badanie; redukujące środki nieorganiczne lub utleniające mogą także powodować zakłócenia w oznaczaniu COD.
Niektóre związki cykliczne i wiele substancji lotnych (np. niższe kwasy tłuszczowe) nie są w pełni utleniane w niniejszym badaniu.
1.6. OPIS METODY BADANIA
Wstępny roztwór lub zawiesina substancji jest tak przygotowywana by uzyskać COD pomiędzy 250 i 600 mg na litr.
Uwagi:
W przypadku słabo rozpuszczalnych i niedających się zdyspergować substancji należy ilość drobno sproszkowanej substancji, odpowiadającej około 5 mg COD, odważyć i umieścić w aparacie doświadczalnym wraz z wodą.
Zapotrzebowanie chemiczne na tlen (COD) jest często i szczególnie w przypadku słaborozpuszczalnych substancji oznaczane korzystnie w odmianach metody, to jest w zamkniętym systemie z ciśnieniowym ekwalizerem (H. Kelkenberg, 1975). W niniejszej modyfikacji związki, które tylko z trudnością można oznaczyć metodą konwencjonalną - na przykład kwas octowy - są często z powodzeniem oznaczane. Metoda także zawodzi, jak w przypadku pirydyny. Jeżeli stężenie dichromianu potasu, jak opisano w pozycji bibliograficznej (1), wzrośnie do 0,25 N (0,0416 M), bezpośrednia doważka 5-10 mg substancji ułatwia oznaczenie COD, co jest zasadnicze dla słabo rozpuszczalnych w wodzie substancji (poz. lit. (2)).
Z drugiej strony, COD jest oznaczane, wykorzystując wszystkie odpowiednie krajowe i międzynarodowe standaryzowane metody.
2. DANE I OCENA
COD zawarte w kolbie doświadczalnej jest obliczane, stosując wybrane znormalizowane metody i przeliczane na gramy COD na gram badanej substancji.
3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA Zastosowana metoda odniesienia musi być ustalona.
Zapotrzebowanie chemiczne na tlen musi być średnią co najmniej z trzech pomiarów. Wszystkie informacje i uwagi odnośnie interpretacji wyników musza być przedstawione w sprawozdaniu, szczególnie w odniesieniu do zanieczyszczeń, postaci fizycznej, i właściwości związanych z budową substancji, które powodują wpływ na wyniki.
W sprawozdaniu należy przedstawić również fakt użycia siarczanu rtęci dla zminimalizowania zakłóceń pochodzących od chlorków.
4. LITERATURA
(1) Kelkenberg, H.,Z. von Wasser und Abwasserforschung, 1975, vol. 8, 146.
(2) Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble compounds. Chemosphere, 1984, vol. 13, 169.
Wykaz standaryzowanych metod, dla przykładu:
NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen demand.
ISBN 0 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate value) of polluted and waste waters.
NFT 90-101 Determination of the chemical oxygen demand.
DS 217 = water analysis Determination of the chemical oxygen demand.
DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen demand (COD) within the range above 15 mg per litr.
NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.
ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichromate methods.
______
(1) Po użyciu roztwory zawierające sole rtęci należy unieszkodliwić, by zapobiec przeniesieniu rtęci do środowiska naturalnego.
C.7. ROZKŁAD - ROZKŁAD ABIOTYCZNY: HYDROLIZA JAKO FUNKCJA PH
1. METODA
Niniejsza metoda badania jest równoważna metodzie OECD TG 111 (2004).
1.1. WSTĘP
Związki chemiczne mogą przedostawać się do wód powierzchniowych takimi drogami, jak: bezpośrednie stosowanie, rozpylenie poza teren upraw, odpływ, odprowadzanie wód powierzchniowych, usuwanie odpadów, ścieki przemysłowe, komunalne lub rolnicze oraz opady atmosferyczne. Związki te mogą ulegać przemianom w tych wodach w procesach chemicznych (np. hydroliza, utlenianie), fotochemicznych i/lub mikrobiologicznych. Niniejsze wytyczne opisują metodę badania laboratoryjnego mającą ocenić abiotyczne przemiany hydrolityczne związków chemicznych w układach wodnych, przy wartościach pH normalnie występujących w środowisku naturalnym (pH = 4-9) i oparte są na istniejących wytycznych (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).
Próby wykonuje się dla określenia: (i) szybkości hydrolizy substancji badanej w funkcji pH; oraz (ii) tożsamości lub charakteru oraz szybkości powstawania i zaniku produktów hydrolizy, na działanie których organizmy mogą być narażone. Badania takie mogą być wymagane dla związków chemicznych, które są bezpośrednio stosowane w wodzie albo które prawdopodobnie mogą się przedostawać do środowiska innymi drogami, które opisano powyżej.
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI Zob. załącznik 2.
1.3. ZAKRES STOSOWANIA METODY
Metoda ta dotyczy ogólnie substancji chemicznych (znaczonych lub nieznaczonych), dla których istnieje metoda analityczna mająca wystarczającą dokładność i czułość. Ma ona zastosowanie dla związków o niskiej lotności oraz nielotnych, o wystarczającej rozpuszczalności w wodzie. Badania nie należy przeprowadzać dla związków chemicznych, które wykazują wysoką lotność ze środowiska wodnego (np. fumiganty rozpuszczalniki organiczne) i tym samym nie można ich utrzymać w roztworze w warunkach tego badania. Badanie może być trudne do wykonania dla substancji o minimalnej rozpuszczalności w wodzie (8).
1.4. ZASADA METODY BADANIA
Sterylne wodne roztwory buforowe o różnych wartościach pH (pH = 4, 7 i 9) poddaje się działaniu substancji badanej oraz inkubacji w ciemności w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych (w stałych temperaturach). Po odpowiednich okresach czasu roztwory buforowe analizuje się na obecność substancji badanej i produktów hydrolizy. W przypadku substancji znaczonej (np. 14C) bilans masowy może być łatwiejszy do ustalenia.
Niniejszą metodę badania określa się jako "podejście poziomowe", które pokazano oraz wyjaśniono w załączniku 1. Każdy "poziom" jest uruchamiany przez wyniki poprzedniego "poziomu".
1.5. INFORMACJA O SUBSTANCJI BADANEJ
Do pomiaru szybkości hydrolizy można użyć substancji nieznaczonych albo znaczonych. Materiał znaczony jest zasadniczo preferowany przy badaniu przebiegu hydrolizy oraz przy ustalaniu bilansu masowego; jednak w przypadkach szczególnych znaczenie nie musi być absolutnie konieczne. Zaleca się znaczenie przy pomocy 14C, ale przydatne może być również użycie innych izotopów, takich jak 13C, 15N, 3H. O ile to będzie możliwe, znacznik powinien być umieszczony w najtrwalszej części cząsteczki. Na przykład, jeśli substancja badana zawiera jeden pierścień, wymagane jest znaczenie w pierścieniu; jeśli substancja badana zawiera dwa lub większą liczbę pierścieni, potrzebne mogą być osobne badania dla ustalenia losu każdego zaznaczonego pierścienia i dla uzyskania odpowiednich informacji na temat powstawania produktów hydrolizy. Czystość substancji badanej powinna wynosić co najmniej 95 %.
Przed wykonaniem testu hydrolizy należy zebrać następujące informacje na temat substancji badanej:
a) rozpuszczalność w wodzie (metoda badania A.6);
b) rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych;
c) prężność par (metoda badania A.4) i/lub stała w równaniu Henryego;
d) współczynnik podziału n-oktanol/woda (metoda badania A.8);
e) stała dysocjacji (pKa) (Wytyczna OECD 112) (9);
f) szybkość fototransformacji bezpośredniej i pośredniej w wodzie, w przypadkach, których to dotyczy.
Dostępne powinny być metody analityczne dla oznaczania ilościowego substancji badanej oraz, jeśli jest to ważne, dla identyfikacji i oznaczania ilościowego produktów hydrolizy w roztworach wodnych (zob. także sekcja 1.7.2).
1.6. SUBSTANCJE WZORCOWE
W miarę możliwości przy identyfikacji i ocenie ilościowej produktów hydrolizy metodami spektroskopowymi i chromatograficznymi albo innymi odpowiednio czułymi metodami należy korzystać z substancji wzorcowych.
1.7. KRYTERIA JAKOŚCI
1.7.1. Odzysk
Analiza co najmniej dwóch roztworów buforowych albo ich ekstraktów natychmiast po dodaniu substancji badanej daje pierwszą wskazówkę na temat powtarzalności metody analitycznej oraz jednorodności procedury aplikacyjnej dla substancji badanej. Stopnie odzysku dla kolejnych etapów eksperymentów uzyskuje się z odpowiednich bilansów masowych (jeśli używa się materiału znaczonego). Stopnie te powinny się mieścić w zakresie od 90 % do 110 % dla związków chemicznych znaczonych i nieznaczonych (7). W przypadku gdy uzyskanie tego zakresu jest technicznie trudne, odzysk wynoszący 70 % dla związków nieznaczonych jest do przyjęcia, ale należy podać uzasadnienie.
1.7.2. Powtarzalność i czułość metody analitycznej
Powtarzalność metody analitycznej albo metod analitycznych wykorzystywanych do oceny ilościowej substancji badanej i produktów hydrolizy można sprawdzić za pomocą powielanych analiz tych samych roztworów buforowych (lub ich ekstraktów) w późniejszym okresie, po zebraniu wystarczających ilości produktów hydrolizy dla oceny ilościowej.
Metoda analityczna powinna być wystarczająco czuła, aby można było ocenić ilościowo stężenia substancji badanych na poziomie 10 % lub mniej stężenia pierwotnego. Jeśli ma to zastosowanie, metody analityczne powinny także być wystarczająco czułe, aby można było oznaczyć ilościowo dowolny produkt hydrolizy stanowiący 10 % lub więcej stężenia zastosowanego (w dowolnym momencie podczas badania), do 25 % lub mniej jego najwyższego stężenia.
1.7.3. Przedziały ufności dla danych kinetycznych hydrolizy
Przedziały ufności należy obliczyć i podać dla wszystkich współczynników regresji, stałych szybkości, okresów połowicznego zaniku oraz wszelkich innych parametrów kinetycznych (np. DT50).
1.8. OPIS METODY BADANIA
1.8.1. Aparatura i wyposażenie
Badania należy wykonywać w pojemnikach szklanych (np. w probówkach lub niewielkich kolbkach), w ciemności i w warunkach sterylnych, jeśli jest to konieczne, chyba że informacje wstępne (takie jak współczynnik podziału n-oktanol/woda) wskazują, że substancja badana może przywierać do szkła. W takich przypadkach może zaistnieć potrzeba rozważenia użycia materiałów alternatywnych (takich jak teflon). Być może także uda się zmniejszyć problem przylegania do szkła przy pomocy jednej z poniższych metod:
- określenie masy substancji badanej i produktów hydrolizy zaadsorbowanych do naczynia testowego,
- użycie łaźni ultradźwiękowej,
- zapewnienie mycia rozpuszczalnikiem całego sprzętu szklanego dla każdego odstępu pobierania próbek,
- używanie produktów preparowanych,
- używanie zwiększonej ilości współrozpuszczalnika dla wprowadzania substancji badanej do układu; jeśli używa się współrozpuszczalnika, powinien to być taki materiał, który nie powoduje hydrolizy substancji badanej.
Dla inkubacji różnych roztworów badanych zwykle potrzebne są wstrząsarki z łaźnią wodną o kontrolowanej temperaturze albo inkubatory z termostatyczną kontrolą temperatury.
Potrzebne jest standardowe wyposażenie laboratorium, obejmujące w szczególności:
- pH-metr,
- przyrządy analityczne, takie jak wyposażenie GC, HPLC i TLC, włącznie z odpowiednimi systemami detekcji dla analizy substancji znaczonych radioaktywnie i nieznaczonych, albo odwrócona metoda rozcieńczeń izotopowych,
- przyrządy dla potrzeb identyfikacji (np. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR itp.),
- cieczowy licznik scyntylacyjny,
- rozdzielacze dla ekstrakcji ciecz-ciecz,
- aparatura do zatężania roztworów i ekstraktów (np. wyparka rotacyjna),
- urządzenie do kontroli temperatury (np. łaźnia wodna). Odczynniki chemiczne obejmujące na przykład:
- rozpuszczalniki organiczne, cz.d.a., takie jak heksan, dichlorometan itp.,
- ciecz scyntylacyjna,
- roztwory buforowe (szczegóły - zob. sekcja 1.8.3).
Cały sprzęt szklany, wodę o czystości odczynnikowej oraz roztwory buforowe używane w testach hydrolizy należy poddać sterylizacji.
1.8.2. Wprowadzanie substancji badanej
Substancja badana powinna być wprowadzana jako roztwór wodny do różnych roztworów buforowych (zob. załącznik 3). Jeśli jest to konieczne dla odpowiedniego rozpuszczenia, dopuszcza się użycie niewielkich ilości rozpuszczalników mieszających się z wodą (takich jak acetonitryl, aceton, etanol) dla wprowadzenia i rozprowadzenia substancji badanej, jednak ilość ta normalnie nie powinna przekraczać 1 % obj. W przypadku jeśli rozważa się użycie wyższych stężeń rozpuszczalników (np. w przypadku słabo rozpuszczalnych substancji badanych), jest to dopuszczalne jedynie jeśli można wykazać, że rozpuszczalnik nie wywiera wpływu na hydrolizę substancji badanych.
Nie zaleca się rutynowego stosowania produktu preparowanego, gdyż nie można wykluczyć, że składniki preparatu mogą wpływać na proces hydrolizy. Jednak dla substancji badanych słabo rozpuszczalnych w wodzie albo dla substancji przywierających do szkła (zob. sekcja 1.8.1) użycie materiału preparowanego może być odpowiednią alternatywą.
Należy stosować jedno stężenie substancji badanej i nie powinno ono przekraczać 0,01 M albo połowy stężenia w stanie nasycenia (zob. załącznik 1).
1.8.3. Roztwory buforowe
Badanie hydrolizy należy wykonywać przy wartościach pH wynoszących 4, 7 oraz 9. W tym celu należy przygotować roztwory buforowe, używając chemikaliów cz.d.a. oraz wody. Pewne przydatne układy buforowe przedstawiono w załączniku 3. Należy podkreślić, że stosowany układ buforowy może wpływać na szybkość hydrolizy, i tam gdzie taki wpływ jest obserwowany należy użyć alternatywnego układu buforowego(1).
Wartość pH dla każdego roztworu buforowego należy sprawdzać wykalibrowanym pH-metrem z dokładnością do co najmniej 0,1 jednostki w wymaganej temperaturze.
1.8.4. Warunki badania
1.8.4.1. Temperatura badania
Badania dotyczące hydrolizy należy prowadzić w stałych temperaturach. Dla potrzeb ekstrapolacji ważne jest utrzymywanie temperatury z dokładnością co najmniej do + 0,5 oC.
Test wstępny (poziom 1) należy wykonać w temperaturze 50 oC, jeśli hydrolityczne zachowanie się substancji badanej jest nieznane. Testy kinetyczne na wyższych poziomach należy prowadzić w minimum trzech temperaturach (włącznie z testem w 50 oC), chyba że substancja badana okaże się odporna na hydrolizę w teście początkowym. Sugerowany zakres temperatur to 10-70 oC (korzystnie z przyjęciem co najmniej jednej temperatury poniżej 25 oC), co obejmuje temperaturę podawaną w sprawozdaniu z badań, wynoszącą 25 oC, oraz większość temperatur spotykanych w warunkach polowych.
1.8.4.2. Światło i tlen
Wszystkie badania hydrolizy należy prowadzić przy użyciu odpowiedniej metody, aby uniknąć wpływów fotolitycznych. Należy podjąć wszelkie stosowne środki, aby uniknąć obecności tlenu (np. barbotując przez ciecz hel, azot albo argon, w ciągu 5 minut, przed przygotowaniem roztworu).
1.8.4.3. Czas trwania testu
Test wstępny powinien trwać 5 dni, natomiast testy na wyższych poziomach należy kontynuować, aż hydrolizie ulegnie 90 % substancji badanej albo przez okres 30 dni, zależnie od tego, co nastąpi wcześniej.
1.8.5. Wykonanie badania
1.8.5.1. Test wstępny (poziom 1)
Test wstępny wykonuje się w temperaturze 50 ± 0,5 oC i przy pH = 4,0, 7,0 oraz 9,0. Jeśli po 5 dniach obserwuje się hydrolizę na poziomie mniejszym niż 10 % (t0,5 25 oC > 1 rok), substancję badaną uznaje się za trwałą hydrolitycznie i normalnie nie są wymagane żadne dodatkowe testy. Jeśli o substancji wiadomo, że nie jest ona trwała w temperaturach występujących w środowisku naturalnym(2), test wstępny nie jest wymagany. Metoda analityczna musi być wystarczająco dokładna i czuła, aby wykrywała spadek wynoszący 10 % stężenia początkowego.
1.8.5.2. Hydroliza substancji nietrwałych (poziom 2)
Test na wyższym poziomie (test zaawansowany) należy wykonywać przy wartościach pH, dla których stwierdzono w teście wstępnym, że substancja badana jest nietrwała. Roztwory substancji badanej w buforach należy termostatować w wybranych temperaturach. Przy testach na kinetykę pierwszego rzędu każdy roztwór reakcyjny należy analizować w odstępach czasu, które zapewniają co najmniej sześć równomiernie rozmieszczonych punktów pomiarowych, zwykle pomiędzy 10 % a 90 % hydrolizy substancji badanej. Należy pobierać pojedyncze próbki dla analiz powtórnych (co najmniej po dwie próbki pobierane do osobnych zbiorniczków reakcyjnych) i przeanalizować ich zawartość dla każdego z co najmniej sześciu okresów czasu (dla co najmniej dwunastu punktów zawierających dane). Pobieranie za każdym razem jednej dużej próbki roztworu badanego, z której pobiera się mniejsze ilości dla analiz powtórnych, uznaje się za niewłaściwe, gdyż procedura taka nie pozwala na analizę zmienności danych i może prowadzić do problemów z zanieczyszczaniem roztworu badanego. Na koniec badania na wyższym poziomie (to znaczy przy 90 % hydrolizy albo po 30 dniach) należy wykonywać testy potwierdzające sterylność. Jeśli jednak nie obserwuje się rozkładu (to znaczy transformacji), przeprowadzenie testów na sterylność nie uważa się za konieczne.
1.8.5.3. Identyfikacj a produktów hydrolizy (poziom 3)
Wszelkie główne produkty hydrolizy, a co najmniej te, które reprezentują > 10 % zastosowanej dawki, powinny zostać zidentyfikowane przy pomocy odpowiednich metod analitycznych.
1.8.5.4. Testy opcjonalne
Dla hydrolitycznie nietrwałej substancji badanej wymagane mogą być dodatkowe testy przy wartościach pH innych niż 4, 7 oraz 9. Na przykład dla potrzeb fizjologicznych, potrzebny może być test w warunkach bardziej kwaśnych (np. pH = 1,2) i w jednej temperaturze mającej znaczenie fizjologiczne (37 oC).
2. DANE
Ilości substancji badanej i produktów hydrolizy, jeśli takie istnieją, należy podawać w % zastosowanego stężenia początkowego oraz, tam gdzie ma to zastosowanie, w mg/l, dla każdego punktu (czasu) poboru próbek, dla każdej wartości pH oraz dla każdej temperatury. Dodatkowo, jeśli użyto znaczonej substancji badanej, należy podać bilans masowy w procentach zastosowanego stężenia początkowego.
Należy przygotować prezentację graficzną logarytmicznie przetworzonych danych dla stężeń substancji badanej w funkcji czasu. Wszelkie główne produkty hydrolizy, a przynajmniej te stanowiące > 10 % użytej dawki, powinny zostać zidentyfikowane, a ich przetworzone logarytmicznie stężenia powinny być również wykreślone w ten sam sposób, co substancja macierzysta, aby pokazać szybkości ich powstawania i zaniku.
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW
Dokładniejsze oznaczenie okresów połowicznego zaniku lub wartości DT50 powinno się uzyskać stosując obliczenia na bazie odpowiedniego modelu kinetycznego. Okresy połowicznego zaniku i/lub wartości DT50 (włącznie z granicami przedziału ufności) należy podawać dla każdej wartości pH oraz wartości temperatury, wraz z opisem użytego modelu, rzędu kinetyki oraz współczynnika determinacji (r2). Jeśli jest to właściwe, obliczenia należy także stosować dla produktów hydrolizy.
W przypadku badań szybkości wykonywanych w różnych temperaturach stałe szybkości pseudo pierwszego rządu dla hydrolizy (kobs) należy przedstawić jako funkcję temperatury. Obliczenie powinno być oparte zarówno na rozdzieleniu wartości kobs na stałe szybkości dla hydrolizy katalizowanej kwasem, hydrolizy neutralnej i hydrolizy katalizowanej zasadą (odpowiednio kH, kneutral i k0H), jak i na równaniu Arrheniusa:
gdzie Ai i Bi są stałymi regresji, odpowiednio z punktu przecięcia się osią rzędnych i z nachylenia, dla najlepiej pasujących linii wygenerowanych z przeprowadzenia regresji liniowej ln ki w funkcji odwrotności temperatury absolutnej w Kelvinach (T). Przy pomocy zależności Arrheniusa dla hydrolizy katalizowanej kwasem, hydrolizy neutralnej i hydrolizy katalizowanej zasadą można wyliczyć stałe szybkości pseudo pierwszego rzędu, a tym samym okresy połowicznego zaniku, dla innych temperatur, w których bezpośrednie doświadczalne oznaczenie stałej szybkości nie jest praktycznie możliwe (10).
2.2. OCENA I INTERPRETACJA WYNIKÓW
Większość reakcji hydrolizy przebiega zgodnie z kinetyką reakcji pozornie pierwszego rzędu i dlatego okresy połowicznego zaniku są niezależne od stężenia (zob. równanie 4 w załączniku 2). Pozwala to zwykle na stosowanie wyników laboratoryjnych oznaczonych dla 10-2 do 10-3 M do warunków występujących w środowisku naturalnym (< 10-6 M) (10). Mabey i Mill (11) przedstawili kilka przykładów dobrej zgodności pomiędzy szybkościami hydrolizy zmierzonymi w wodzie czystej i w wodach naturalnych dla różnorodnych związków chemicznych, pod warunkiem że mierzy się zarówno pH, jak i temperaturę.
3. OPRACOWANIE SPRAWOZDANIA
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań musi obejmować co najmniej następujące informacje:
Substancja badana:
- nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna, numer CAS, wzór strukturalny (z pokazaniem miejsca znaczenia, kiedy używa się materiału znaczonego radioaktywnie) oraz stosowne własności fizykochemiczne (zob. sekcja 1.5),
- czystość (zanieczyszczenia) substancji badanej,
- czystość oznaczenia znaczonego związku chemicznego oraz aktywność molowa (jeśli dotyczy),
- roztwory buforowe,
- daty i szczegóły dotyczące przygotowania,
- użyte bufory i rodzaje wody,
- molowość i pH roztworów buforowych. Warunki badania:
- daty wykonania badań,
- ilość zastosowanej substancji badanej,
- metoda i rozpuszczalniki (rodzaj i ilość) użyte dla zastosowania substancji badanej,
- objętość inkubowanych buforowanych roztworów substancji badanej,
- opis układu użytego do inkubacji,
- pH i temperatura w trakcie badania,
- czasy pobierania próbek,
- metoda/metody ekstrakcji,
- metody oceny ilościowej i identyfikacji substancji badanej oraz produktów jej hydrolizy w roztworach buforowych,
- liczba powtórzeń. Wyniki:
- powtarzalność i czułość użytych metod analitycznych,
- stopnie odzysku (wartości procentowe dla ważności badania podano w sekcji 1.7.1),
- dane dla powtórzeń i wartości średnie w formie tabeli,
- bilans masowy w trakcie i na koniec badań (jeśli użyta została znaczona substancja badana),
- wyniki testu wstępnego,
- omówienie i interpretacja wyników,
- wszelkie oryginalne dane i liczby.
Poniższe informacje są wymagane jedynie kiedy oznacza się szybkość hydrolizy:
- wykresy stężeń w funkcji czasu dla substancji badanej i, w stosownych przypadkach, dla produktów hydrolizy przy każdej wartości pH oraz temperatury,
- tabele wyników z równania Arrheniusa dla temperatury 20 oC/25 oC, z podaniem pH, stałej szybkości [h-1 lub dzień-1], okresu połowicznego zaniku albo DT50, temperatur [ oC], włącznie z granicami dla przedziału ufności i współczynnikami korelacji (r2) albo porównywalnymi informacjami,
- proponowany przebieg (cykl przemian w trakcie) hydrolizy.
4. BIBLIOGRAFIA
(1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Guideline for Testing of Chemicals Nr. 111 [OECD (1981).
(2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 796,3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25 oC. Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
(3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate Guidelines for registration of pesticides in Canada.
(4) European Union (EU) (1995). Commission Directive 95/36/EC amending Council Directive 91/414/EEC concerning the placing of plant protection products on the market. Annex V: Fate and Behaviour in the Environment.
(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
(6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prufung des Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (October 1980).
(7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed [SETAC (1995).
(8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures, OECD Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment Nr.23 [OECD (2000).
(9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994 - 2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals [OECD (1993).
(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models. (Text version of oral presentation at the 14th Annual Meeting of the Society of Environmental Toxicology and Chemistry, Dallas TX, November 1993).
(11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis of organic compounds in water under environmental conditions. J. Phys. Chem. Ref Data 7, 383-415.
______
(1) Mabey i Mill zalecają używanie buforów boran owych lub octanowych zamiast fosforanowych (11).
(2) Informacje takie mogą pochodzić z innych źródeł, takich jak dane dotyczące hydrolizy dla strukturalnie podobnych związków - z literatury albo ze wstępnych półilościowych testów hydrolizy dla substancji badanej, wykonanych na wcześniejszym etapie.
ZAŁĄCZNIK 1
Wielopoziomowy schemat badania hydrolizy
ZAŁĄCZNIK 2
Definicje i jednostki
W każdym przypadku należy stosować międzynarodowy układ jednostek miar (SI).
Substancja badana: dowolna substancja, niezależnie od tego, czy jest to związek macierzysty, czy odpowiednie produkty transformacji.
Produkty transformacji: wszystkie substancje powstające w biotycznych lub abiotycznych reakcjach transformacji substancji badanej.
Produkty hydrolizy: wszystkie substancje powstające w reakcjach transformacji hydrolitycznej substancji badanej.
Hydroliza dotyczy reakcji substancji badanej RX z wodą, z wymianą grupy X na grupę OH w centrum reakcyjnym:
RX+HOH→ ROH+HX[1]
Szybkość, z jaką stężenie RX spada w tym uproszczonym procesie, podaje się równaniem
szybkość = k [H2O] [RX]reakcja drugiego rzędu
albo
szybkość=k[RX]reakcja pierwszego rzędu
zależnie od etapu decydującego o szybkości. Ponieważ woda jest obecna w dużym nadmiarze w stosunku do substancji badanej, ten typ reakcji zwykle opisuje się jako reakcję pseudopierwszego rzędu, w której obserwowaną stałą reakcji podaje zależność
kobs =k[H2O][2]
i można ją wyznaczyć z wyrażenia(*)
[3]
gdzie:
t = czas,
a Co, Ct = stężenia RX dla czasu wynoszącego 0 oraz t.
Wymiar dla tej stałej to (jednostka czasu)-1, a okres połowicznego zaniku dla reakcji (czas, po którym przereaguje 50 % RX) podaje równanie
[4]
Okres połowicznego zaniku: (t0,5) to czas potrzebny dla osiągnięcia 50 % hydrolizy substancji badanej, kiedy reakcję można opisać kinetyką pierwszego rzędu; zależy on od stężenia.
DT50 (Disappearance Time 50 = czas zaniku 50): to czas, po którym stężenie substancji badanej zmniejsza się o 50 %; jest on różny od okresu połowicznego zaniku t0,5, kiedy reakcja nie stosuje się do kinetyki pierwszego rzędu.
Ocena k w innej temperaturze
Kiedy znane są stałe szybkości reakcji w dwóch temperaturach, stałe szybkości w innych temperaturach można wyprowadzić z równania Arrheniusa:
Wykres ln k w funkcji l/T jest linią prostą o nachyleniu -E/R
gdzie:
k = stała szybkości, mierzona w różnych temperaturach,
E = energia aktywacji (kJ/mol),
T = temperatura absolutna (K),
R = stała gazowa (8,314 J/mol.K).
Energię aktywacji wyliczono za pomocą analizy regresyjnej albo następującego równania:
______
(*) Jeśli wykres danych w skali logarytmicznej jako funkcji czasu nie jest linią prostą (co równa się szybkości reakcji pierwszego rzędu), wówczas nie można wykorzystywać równania [3] do określania stałej szybkości hydrolizy dla substancji badanej.
ZAŁĄCZNIK 3
Układy buforowe
A. CLARK i LUBS:
Mieszaniny buforowe według CLARKA i LUBSA(*)
| Skład | pH |
| 0,2 N HC1 + 0,2 N KC1 przy 20 oC |
| 47,5 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcieńczyć do 100 ml | 1,0 |
| 32,25 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcieńczyć do 100 ml | 1,2 |
| 20,75 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcieńczyć do 100 ml | 1,4 |
| 13,15 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcieńczyć do 100 ml | 1,6 |
| 8,3 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcieńczyć do 100 ml | 1,8 |
| 5,3 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcieńczyć do 100 ml | 2,0 |
| 3,35 ml HC1 + 25 ml KC1 rozcieńczyć do 100 ml | 2,2 |
| 0,1 M kwasny ftalan potasu + 0,1 N HC1 przy 20 oC |
| 46,70 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 2,2 |
| 39,60 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 2,4 |
| 32,95 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 2,6 |
| 26,42 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 2,8 |
| 20,32 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 3,0 |
| 14,70 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 3,2 |
| 9,90 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 3,4 |
| 5,97 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 3,6 |
| 2,63 ml 0,1 N HC1 + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 3,8 |
| 0,1 M kwaśny ftalan potasu + 0,1 N HCl przy 20 oC |
| 0,40 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 4,0 |
| 3,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 4,2 |
| 7,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 4,4 |
| 12,15 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 4,6 |
| 17,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 4,8 |
| 23,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 5,0 |
| 29,95 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 5,2 |
| 35,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 5,4 |
| 39,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 5,6 |
| 43,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 5,8 |
| 45,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwaśnego ftalanu do 100 ml | 6,0 |
Mieszaniny buforowe według CLARKA i LUBSA (ciąg dalszy)
| 0,1 M fosforan monopotasu + 0,1 N NaOH przy 20 oC |
| 5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 mll | 6,0 |
| 8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml | 6,2 |
| 12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 m | 6,4 |
| 17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml | 6,6 |
| 23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml | 6,8 |
| 29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml | 7,0 |
| 35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml | 7,2 |
| 39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml | 7,4 |
| 42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml | 7,6 |
| 45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml | 7,8 |
| 46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosforanu do 100 ml | 8,0 |
| 0,1 M H3B03 w 0,1 M KC1 + 0,1 N NaOH przy 20 oC |
| 2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml | 7,8 |
| 3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml | 8,0 |
| 5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml | 8,2 |
| 8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml | 8,4 |
| 12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml | 8,6 |
| 16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml | 8,8 |
| 21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml | 9,0 |
| 26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml | 9,2 |
| 32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml | 9,4 |
| 36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml | 9,6 |
| 40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml | 9,8 |
| 43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml kwasu borowego do 100 ml | 10,0 |
______
(*) Wartości pH podane w tych tabelach zostały obliczone na podstawie pomiarów potencjału, przy wykorzystaniu standardowych równań Sórensena (1909). Odpowiadające im wartości pH są o 0,04 jednostki wyższe od wartości podanych w tabeli.
B. KOLTHOFF i VLEESCHHOUWER:
Bufory cytrynianowe według KOLTHOFFA i VLEESCHHOUWERA
| Sklad | pH |
| 0,1 M cytrynian monopotasu i 0,1 N HC1 przy 18 oC(*) |
| 49,7 ml 0,1 N HC1 + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 2,2 |
| 43,4 ml 0,1 N HCl+50 ml cytrynianu do 100 ml | 2,4 |
| 36,8 ml 0,1 N HCl + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 2,6 |
| 30,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 2,8 |
| 23,6 ml 0,1 N HCl+50 ml cytrynianu do 100 ml | 3,0 |
| 17,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 3,2 |
| 10,7 ml 0,1 N HCl + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 3,4 |
| 4,2 ml 0,1 N HCl + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 3,6 |
| 0,1 M cytrynian monopotasu i 0,1 N HCl przy 18oC(*) |
| 2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 3,8 |
| 9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 4,0 |
| 16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 4,2 |
| 23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 4,4 |
| 31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 4,6 |
| 39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 4,8 |
| 46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 5,0 |
| 54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 5,2 |
| 61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 5,4 |
| 68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 5,6 |
| 74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 5,8 |
| 81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml cytrynianu do 100 ml | 6,0 |
______
(*) Dodać niewielkie kryształki tymolu lub podobnej substancji aby zapobiec rozwojowi pleśni.
C. SÖRENSEN:
Mieszaniny boranowe według SÓRENSENA
| Skład | Sörensen 18 °C | Valbum, pH przy | |||
| ml boraksu | ml HCl/NaO H | 10 oC | 40 oC | 70 oC | |
| 0,05 M boraksu + 0,1 N HCl |
| 5,25 | 4,75 | 7,62 | 7,64 | 7,55 | 7,47 |
| 5,50 | 4,50 | 7,94 | 7,98 | 7,86 | 7,76 |
| 5,75 | 4,25 | 8,14 | 8,17 | 8,06 | 7,95 |
| 6,00 | 4,00 | 8,29 | 8,32 | 8,19 | 8,08 |
| 6,50 | 3,50 | 8,51 | 8,54 | 8,40 | 8,28 |
| 7,00 | 3,00 | 8,08 | 8,72 | 8,56 | 8,40 |
| 7,50 | 2,50 | 8,80 | 8,84 | 8,67 | 8,50 |
| 8,00 | 2,00 | 8,91 | 8,96 | 8,77 | 8,59 |
| 8,50 | 1,50 | 9,01 | 9,06 | 8,86 | 8,67 |
| 9,00 | 1,00 | 9,09 | 9,14 | 8,94 | 8,74 |
| 9,50 | 0,50 | 9,17 | 9,22 | 9,01 | 8,80 |
| 10,00 | 0,00 | 9,24 | 9,30 | 9,08 | 8,86 |
| 0,05 M boraksu + 0,1 N NaOH |
| 10,0 | 0,0 | 9,24 | 9,30 | 9,08 | 8,86 |
| 9,0 | 1,0 | 9,36 | 9,42 | 9,18 | 8,94 |
| 8,0 | 2,0 | 9,50 | 9,57 | 9,30 | 9,02 |
| 7,0 | 3,0 | 9,68 | 9,76 | 9,44 | 9,12 |
| 6,0 | 4,0 | 9,97 | 10,06 | 9,67 | 9,28 |
Mieszaniny fosforanowe według SÖRENSENA
| Skład | pH |
| 0,0667 M fosforan monopotasu + 0,0667 M fosforan disodu przy 20 oC |
| 99,2 ml KH2PO4 + 0,8 ml Na2HPO4 | 5,0 |
| 98,4 ml KH2PO4 + 1,6 ml Na2HPO4 | 5,2 |
| 97,3 ml KH2PO4 + 2,7 ml Na2HPO4 | 5,4 |
| 95,5 ml KH2PO4 + 4,5 ml Na2HPO4 | 5,6 |
| 92,8 ml KH2PO4 + 7,2 ml Na2HPO4 | 5,8 |
| 88,9 ml KH2PO4 + 11,1 ml Na2HPO4 | 6,0 |
| 83,0 ml KH2PO4 + 17,0 ml Na2HPO4 | 6,2 |
| 75,4 ml KH2PO4 + 24,6 ml Na2HPO4 | 6,4 |
| 65,3 ml KH2PO4 + 34,7 ml Na2HPO4 | 6,6 |
| 53,4 ml KH2PO4 + 46,6 ml Na2HPO4 | 6,8 |
| 41,3 ml KH2PO4 + 58,7 ml Na2HPO4 | 7,0 |
| 29,6 ml KH2PO4 + 70,4 ml Na2HPO4 | 7,2 |
| 19,7 ml KH2PO4+ 80,3 ml Na2HPO4 | 7,4 |
| 12,8 ml KH2PO4 + 87,2 ml Na2HPO4 | 7,6 |
| 7,4 ml KH2PO4 + 92,6 ml Na2HPO4 | 7,8 |
| 3,7 ml KH2PO4 + 96,3 ml Na2HPO4 | 8,0 |
C.8. TOKSYCZNOŚĆ DŻDŻOWNIC
BADANIE SZTUCZNEJ GLEBY
1. METODA
1.1. WSTĘP
W tym badaniu laboratoryjnym substancja testowa dodawana jest do sztucznej gleby, w której umieszcza się dżdżownice na okres 14 dni. Po zakończeniu tego okresu (i opcjonalnie po siedmiu dniach) badane są skutki śmiertelności dżdżownic wywołane przez substancję testową. Badanie dostarcza metody na względnie krótkoterminowe badanie skutków substancji chemicznej na dżdżownice pobieranej przez skórę i układ pokarmowy.
1.2. DEFINICJA I JEDNOSTKA
LC50: Stężenie substancji testowej ocenione jako powodujące śmierć u 50 % badanych zwierząt w okresie przeprowadzania badania.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Substancja odniesienia używana jest okresowo jako środek pozwalający określić, iż czułość systemu badawczego nie uległa znacznej zmianie.
Analityczny stopień chloroacetamidu zalecany jest jako substancja odniesienia.
1.4. ZASADA BADANIA
Ziemia stanowi zmienną pożywkę, dlatego też do tego badania wykorzystywana jest starannie określona sztuczna gleba. Dorosłe dżdżownice z gatunku Eisenia foetida (zob. uwaga w dodatku) utrzymywane są w ściśle określonej sztucznej glebie poddawanej działaniu różnych stężeń substancji testowej. Zawartość zbiorników rozłożona jest na tacach przez okres 14 dni (i opcjonalnie przez siedmiu dniach) po rozpoczęciu badania oraz zliczane są osobniki pozostałe przy życiu po ekspozycji na działanie każdej wielkości stężenia substancji testowej.
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE
Badanie zaprojektowano w taki sposób, aby było jak najbardziej odtwarzalne w odniesieniu do badanego substrata i organizmu. Śmiertelność w grupach kontrolnych nie może przekraczać 10 % po zakończeniu badania, w przeciwnym razie badanie uważa się za nieważne.
1.6. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.6.1. Materiały
1.6.1.1. Substrat testowy
Zdefiniowana sztuczna gleba używana jest jako podstawowy substrat testowy.
a) Podstawowy substrat (procenty w przeliczeniu na suchą masę)
- 10 % torf sfagnowy (o możliwie jak najbardziej zbliżonym pH 5,5-6,0 bez widocznych pozostałości roślinnych i drobnomielony).
- 20 % gliny laolinitowej, najlepiej z ponad 50 % zawartością kaolinitu.
- Około 69 % przemysłowego piasku kwarcowego (przewaga piasku drobnoziarnistego z ponad 50 % zawartością cząsteczek o wielkości 0,05-0,2 mm). W przypadku gdy substancja nie rozrzedza się w wodzie w sposób wystarczający, 10 g badanego substrata należy zachować z danego zbiornika w celu późniejszego zmieszania z substancja testową.
- Dodaje się około 1 % węglanu wapnia (CaCO3), sproszkowanego, chemicznie czystego w celu uzyskania pH do 6,0 ± 0,5.
b) Substrat testowy
Substrat testowy zawiera substrat podstawowy, substancję testową i dejonizowaną wodę.
Zawartość wody wynosi około 25-42 % suchej masy substrata podstawowego. Zawartość wody w substracie, ustalana jest przez osuszanie próbki do stałej masy przy 105 oC. Kluczowym kryterium jest nawilżanie sztucznej gleby do takiego momentu, aby nie powstały wody stojące. Należy zachować ostrożność podczas mieszania w celu równomiernego rozłożenia substancji testowej i substrata. Sposób wprowadzenia substancji testowej do substrata należy opisać.
c) Substrat kontrolny
Substrat kontrolny zawiera substrat podstawowy i wodę. W przypadku wprowadzenia dodatkowego czynnika, dodatkowy substrat kontrolny powinien zawierać tę samą ilość dodatkowego czynnika.
1.6.1.2. Zbiorniki testowe
Szklane zbiorniki o pojemności około jednego litra (odpowiednio przykryte plastikowymi pokrywkami, naczynia lub folie z tworzywa sztucznego z otworami wentylacyjnymi) wypełnione pewną ilością nawilżonego lub kontrolnego substrata, równowartość 500 g suchej masy substrata.
1.6.2. Warunki badania
Zbiorniki należy przechowywać w klimatyzowanych komorach w temperaturze 20 ± 2 oC w stałym oświetleniu. Natężenie oświetlenia powinno wynosić 400-800 luksów.
Okres badania wynosi 14 dni, ale śmiertelność można fakultatywnie ocenić na siedem dni po rozpoczęciu badania.
1.6.3. Procedura badania
Stężenia substancji testowej
Stężenia substancji testowej wyrażone są jako waga substancji na suchą masę substrata podstawowego (mg/kg).
Test ustalania zakresu stężeń
Wielkość stężeń powodująca śmiertelność 0-100 % można ustalić przez test ustalania zakresu stężeń w celu przekazania informacji o zakresie stężeń wykorzystywanym w ostatecznym badaniu.
Substancję należy zbadać przy następujących wielkościach stężeń: 1.000; 100; 10; 1; 0,1 mg substancji/ kilogram badanego substrata (sucha masa).
W przypadku przeprowadzenia w pełni badania ostatecznego jedna grupa badana na daną wielkość stężenia i jedna grupa kontrolna niepoddana działaniu substancji, każda zawierająca 10 dżdżownic, powinna być wystarczająca w celu wykonania testu ustalania zakresu stężeń.
Badanie ostateczne
Wyniki testu ustalania zakresu stężeń wykorzystywane są w celu wybrania co najmniej pięciu wielkości stężeń uszeregowanych geometrycznie, obejmujących zakres 0-100 % śmiertelności i różniących się stałym czynnikiem nie przekraczającym 1,8.
Badania wykorzystujące te serie stężeń powinny umożliwić ustalenie wartości LC50 oraz jej granic pewności najdokładniej jak to możliwe.
W badaniu ostatecznym należy użyć co najmniej cztery grupy badane przy danej wielkości stężenia i cztery grupy kontrolne niepoddane działaniu substancji, każda zawierająca 10 dżdżownic. Wyniki takich replikujących grup podawane są jako średnia i odchylenie standardowe.
W przypadku gdy dwa równoległe stężenia o wielkości 1,8, powodują 0 % i 100 % śmiertelności, takie dwie wartości są wystarczające do oznaczenia zakresu, w którym obniża się LC50.
Mieszanina podstawowego substrata testowego i substancji testowej.
Badany substrat, jeżeli możliwe, nie powinien zawierać dodatkowych czynników innych niż woda. Bezpośrednio przed rozpoczęciem badania, zawiesina substancji testowej lub substancja testowa rozrzedzona w dejonizowanej wodzie lub innym rozpuszczalniku jest mieszana z podstawowym substratem testowym, lub równomiernie nad nim rozpylana za pomocą drobnego spryskiwacza chromatograficznego lub podobnego.
Jeżeli substancja testowa nie jest rozpuszczalna w wodzie, może być rozpuszczona w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, w możliwie jak najmniejszej ilości (np. heksan, aceton lub chloroform).
Jedynie czynniki łatwo ulatniające się mogą być użyte w celu rozpuszczenia, rozrzedzenia lub zemulgowania substancji testowej. Badany substrat należy wietrzyć przed użyciem. Należy uzupełniać ilość wyparowanej wody. Grupa kontrolna powinna zawierać tę samą ilość każdego dodawanego czynnika.
Jeżeli substancja testowa jest nierozpuszczalna, nierozrzedzalna lub nie emulguje w rozpuszczalnikach organicznych, należy zmieszać 10 g drobnoziarnistego piasku kwarcowego oraz taką ilość substancji testowej, jaka wymagana jest przy 500 g suchej masy sztucznej gleby z 490 g suchej masy badanego substrata.
W odniesieniu do każdej badanej grupy, należy umieścić ilość nawilżonego badanego substrata równą 500 g suchej masy w każdym szklanym zbiorniku wraz z 10 dżdżownicami, które przebywały przez okres 24 godzin w podobnych warunkach tj. w warunkach nawilżonego substrata podstawowego, a następnie zostały szybko umyte, a nadwyżka wody została wchłonięta w bibułę filtracyjną przed użyciem.
Zbiorniki przykrywa się perforowanymi plastikowymi pokrywkami, naczyniami lub folią w celu zapobieżenia wysychaniu substrata i utrzymuje się je w warunkach badania przez okres l4 dni.
Oszacowania należy dokonać 14 dni (opcjonalnie po siedmiu dniach) po rozpoczęciu badania. Substrat rozkładany jest na szklanej płytce lub płytce wykonanej ze stali nierdzewnej. Należy przeprowadzić badanie dżdżownic oraz ustalić liczbę osobników pozostałych przy życiu. Dżdżownice uważa się za martwe, jeżeli nie reagują na delikatne bodźce mechaniczne oddziałujące z przodu organizmu osobnika.
W przypadku gdy badanie przeprowadzane jest po siedmiu dniach, zbiornik ponownie napełniany jest substratem testowym, a osobniki pozostałe przy życiu są przenoszone na powierzchnię z tym samym substratem testowym.
1.6.4. Badane organizmy
Organizmy poddane badaniu powinny być osobnikami dorosłymi Eisenia foetida (zob. uwagi w Dodatku) (w wieku dwóch miesięcy życia z ukształtowanym siodełkiem) o wadze nawilżonego ciała 300-600 mg (metody uprawy, zob. dodatek).
2. DANE
2.1. OBRÓBKA I ANALIZA WYNIKÓW
Stężenia testowej substancji odnotowywane są w odniesieniu do procentowej ilości martwych dżdżownic.
Jeżeli dane są zadowalające, należy ustalić wartość LC50 oraz limity pewności (p = 0,05) wykorzystując standardowe metody (Litchfield i Wilcoxon, 1949, metoda równoważna). LC50 należy podać jako miligram substancji testowej na kilogram badanego substrata (sucha masa).
W przypadkach gdy nachylenie krzywej stężenia jest zbyt strome aby umożliwić obliczenie LC50, wystarczające jest graficzne oszacowanie tej wartości.
W przypadku gdy dwie kolejne wielkości stężenia o wskaźniku w wysokości 1,8 powodują jedynie śmiertelność 0 % i 100 %, te dwie wartości są wystarczające do oznaczenia granicy, przy której obniża się LC50.
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:
- stwierdzenie, że badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wyżej wymienionymi kryteriami jakości,
- przeprowadzone badanie (badanie zakresu wielkości stężeń i/lub badanie ostateczne),
- dokładny opis warunków badania lub stwierdzenie, że badanie zostało przeprowadzone zgodnie z metodą; wszelkie odstępstwa od procedury metody należy odnotować,
- dokładny opis procedury mieszania substancji testowej z podstawowym substratem testowym,
- informacja o badanych organizmach (gatunki, wiek, średnia oraz rozpiętość wagi, warunki hodowli i utrzymywania, dostawca),
- metoda używana w celu ustalenia LC50,
- wyniki badania łącznie ze wszelkimi wykorzystanymi danymi,
- opis obserwowanych objawów i zmian w zachowaniu badanych organizmów,
- śmiertelność w grupach kontrolnych.
- LC50 lub najwyższa wielkość stężenia testowego nie powodująca śmiertelności oraz najniższa wielkość stężenia powodująca 100 %, śmiertelności na 14 dni (oraz fakultatywnie siedem dni) po rozpoczęciu badania,
- wykreślanie krzywej/stężenia w odniesieniu do powodowanej reakcji,
- wyniki otrzymane po zastosowaniu substancji odniesienia, oraz czy zostały połączone z obecnym badaniem, czy na podstawie wcześniejszej kontroli jakości.
4. BIBLIOGRAFIA
(1) OECD, Paryż, 1981, Wytyczne Badania 201, ostateczna decyzja Rady C(81) 30.
(2) Edwards, C. A. i Lofty J. R, 1977, Biologia Dżdżownic, Chapman i Hall, Londyn, str. 331.
(3) Bouche, M. B., 1972, Lombriciens de France, Ecologie et Systétmatique, Institut National de la Recherche Agronomique, str. 671.
(4) Litchfield, J. T. i Wilcoxon, F., Uproszczona metoda oceny badań skutków dawkowania. J. Pharm. Exp. Therap., tom 96, 1949, str. 99.
(5) Komisja Wspólnot Europejskich, Rozwój standardowej metody laboratoryjnej odnośnie oceny wpływu toksyczności substancji chemicznych na dżdżownice, Sprawozdanie 8714 EUR EN, 1983.
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt fur Land- und Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrens-vorschlag "Toxizitatstest am Regenwurm Eisenia foetida in kunstlichem Boden", in: Rudolph/Boje, Okotoxikologie, ecomed, Landsberg, 1986.
Dodatek
Hodowla i utrzymywanie dżdżownic przed rozpoczęciem badania
W celu założenia hodowli zwierząt należy umieścić 30-50 dorosłych dżdżownic w zbiorniku hodowlanym zawierającym świeży substrat i usunąć po okresie 14 dni. Zwierzęta te można wykorzystać do hodowli kolejnych grup. Dżdżownice wylężone z kokonów wykorzystuje się do badania po osiągnięciu dojrzałości (zgodnie z zalecanymi warunkami po okresie dwóch do trzech miesięcy).
Warunki utrzymywania i hodowli
| Komora klimatyczna: | temperatura 20 ± 2 oC najlepiej stałym oświetleniem ze (natężenie 400-800 luksów). |
| Zbiorniki hodowlane: | odpowiednio płytkie zbiorniki o pojemności 10-20 1. |
| Substrat: | Eisenia foetida może być hodowana w różnych ekskrementach zwierzęcych. Zaleca się użycie mieszaniny o składzie 50 % torfu i 50 % krowiego lub końskiego obornika jako pożywki hodowlanej. Pożywka powinna zawierać wartość pH w wysokości około 6-7 (regulowanej węglanem wapnia) oraz niską przewodność elektryczną (mniej niż 6 mmhos lub 0,5 % stężenia soli). |
| Substrat należy odpowiednio nawilżać, ale niezbyt obficie. | |
| Oprócz wyżej wspomnianej metody, można zastosować inne odpowiednie procedury. |
Uwaga: Eisenia foetida występuje w dwóch rasach, które niektórzy systematycy podzielili na dwa gatunki (Bouche, 1972). Gatunki te są podobne pod względem morfologicznym, ale jeden, Eisenia foetida foetida, posiada typowo poprzeczne paskowanie lub przedziały na segmentach, a drugi, Eisenia foetida andrei, takiego paskowania nie posiada, będąc jednocześnie różnobarwnego czerwonawego koloru. Jeżeli jest to możliwe, należy użyć Eisenia foetida andrei. Można użyć inne gatunki, jeżeli dostępna jest metodologia.
C.9. BIODEGRADACJA
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 3.
C.10. SYMULACYJNE BADANIE W WARUNKACH TLENOWYCH W OCZYSZCZALNIACH ŚCIEKÓW: C.10-A: ZESTAWY OSADU CZYNNEGO - C.10-B: BIOFILMY
C.10-A: Zestawy osadu czynnego
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD nr 303 (2001). W latach 50. XX w. zdano sobie sprawę, że nowo wprowadzane środki powierzchniowo czynne powodują nadmierne pienienie w oczyszczalniach ścieków i w rzekach. Nie były w pełni usuwane w drodze rozkładu tlenowego i w niektórych przypadkach ograniczały usuwanie substancji organicznych. To spowodowało podjęcie wielu badań na temat tego, jak środki powierzchniowo czynne mogłyby być usuwane ze ścieków i czy nowe substancje chemiczne wytwarzane w produkcji przemysłowej poddają się oczyszczaniu. W tym celu wykorzystano zestawy modelowe odpowiadające dwóm głównym typom tlenowego oczyszczania biologicznego ścieków (zestaw osadu czynnego i zestaw ze złożem zraszanym). Niepraktycznym i bardzo kosztownym rozwiązaniem byłaby dystrybucja każdej nowej substancji chemicznej i monitorowanie dużych oczyszczalni ścieków, nawet w kontekście lokalnym.
WSTĘPNE ROZWAŻANIA
Zestawy osadu czynnego
2. Opisano modelowe zestawy osadu czynnego w zakresie wielkości od 300 ml do ok. 2 000 ml. Niektóre były bardzo podobne do instalacji normalnej wielkości i zawierały osadniki, z których osad przepompowywany był z powrotem do zbiornika napowietrzającego, podczas gdy inne nie obejmowały osadników, np. Swisher (1). Rozmiar przyrządu jest efektem kompromisu: z jednej strony musi on być wystarczająco duży, by możliwe było przeprowadzenie z powodzeniem działań mechanicznych oraz zapewnienie wystarczającej objętości próbek bez wpływu na całość procedur, z drugiej strony zaś nie może wymagać nadmiernej przestrzeni i ilości materiałów.
3. Dwa przyrządy stosowane powszechnie i z powodzeniem to zestawy Husmanna (2) i zestawy naczyń porowatych (3) (4), używane początkowo przy badaniu środków powierzchniowo czynnych; opisano je w niniejszej metodzie badawczej. Z powodzeniem używano również innych przyrządów, np. Eckenfeldera (5). Z powodu dość wysokiego kosztu i wysiłków związanych ze stosowaniem tego badania symulacyjnego jednocześnie poddano analizie prostsze i tańsze badania przesiewowe, zawarte obecnie w rozdziale C.4 A-F niniejszego załącznika (6). Doświadczenia z wieloma środkami powierzchniowo czynnymi oraz innymi substancjami chemicznymi pokazały, że te, które przeszły z powodzeniem badania przesiewowe (szybko biodegradowalne), ulegały również degradacji w badaniu symulacyjnym. Niektóre substancje, które nie przeszły z powodzeniem badań przesiewowych, przeszły badania naturalnej biodegradowalności (rozdziały C.12 (7) oraz C.19 (8) niniejszego załącznika), jednak tylko niektóre z tej ostatniej grupy uległy degradacji w badaniu symulacyjnym, podczas gdy te substancje, które nie przeszły z powodzeniem badania naturalnej podatności na biodegradację, nie uległy degradacji w badaniach symulacyjnych (9) (10) (11).
4. Badania przeprowadzane przy jednym układzie warunków działania są wystarczające do niektórych celów; wyniki wyraża się jako wartość procentową usunięcia badanej substancji chemicznej lub rozpuszczonego węgla organicznego (DOC). Opis takiego badania podany jest w niniejszej metodzie badawczej. Jednakże w przeciwieństwie do wcześniejszej wersji niniejszego rozdziału, w której opisano tylko jeden typ przyrządu do oczyszczania ścieków syntetycznych w trybie połączonym przy zastosowaniu względnie prostej metody degradacji osadu, w niniejszym tekście przedstawiono szereg możliwości. Opisano alternatywy dla typu przyrządu, trybu działania oraz usuwania ścieków i osadu po degradacji. Niniejszy tekst ściśle odpowiada tekstowi ISO 11733 (12), który został dokładnie przeanalizowany w trakcie przygotowań, choć metody nie poddano badaniu międzylaboratoryjnemu.
5. Dla innych celów konieczna jest dokładniejsza znajomość stężenia badanej substancji chemicznej w odpływie, a do tego potrzebny jest model bardziej ekstensywny. Przykładowo, współczynnik degradacji osadu musi być dokładniej kontrolowany przez cały dzień oraz w ciągu całego czasu badania i konieczne jest przeprowadzenie badań na zestawach przy szeregu różnych współczynników degradacji. W przypadku najbardziej szczegółowej metody badania należy również przeprowadzić w dwóch lub trzech różnych temperaturach: metoda taka została opisana przez Bircha (13) (14) i streszczona w dodatku 6. Jednakże obecna wiedza nie wystarcza do stwierdzenia, który model kinetyczny ma zastosowanie do biodegradacji substancji chemicznych w oczyszczaniu ścieków i ogólnie w środowisku wodnym. Zastosowanie kinetyki Monoda, podane w dodatku 6 jako przykład, jest ograniczone do substancji chemicznych obecnych w ilości co najmniej 1 mg/l, ale w opinii niektórych badaczy nawet to musi zostać uzasadnione. Badania przy stężeniach bardziej dokładnie odzwierciedlających stężenia występujące w ściekach zostały wskazane w dodatku 7, ale takie badania, podobnie jak te zawarte w dodatku 6, przedstawione są w dodatkach, a nie jako osobne metody badawcze.
Filtry
6. Dużo mniej uwagi poświęcono modelom złoży zraszanych, być może dlatego, że są bardziej niewygodne i większe niż instalacje z osadem czynnym. Gerike i in. stworzyli zestawy złoży zraszanych i przeprowadzili na nich działania w trybie połączonym (15). Filtry te były dość duże (wysokość 2 m, pojemność 60 l) i do każdego z nich potrzeba było aż 2 l/h ścieków. Baumann i in. (16) stworzyli symulację złoży zraszanych wkładając paski z "wełny" poliestrowej do 1-metrowych rur (o średnicy wewnętrznej 14 mm) po wcześniejszym zanurzeniu pasków przez 30 min. w stężonym osadzie czynnym. Badana substancja chemiczna jako jedyne źródło C w roztworze soli mineralnych była przepuszczana przez pionową rurę, po czym oceniano biodegradację w oparciu o pomiary DOC w odpływie i CO2 w powstającym gazie.
7. Biofiltry symulowano w inny sposób (15); na wewnętrzne powierzchnie obracających się rur nachylonych pod niewielkim kątem w stosunku do poziomu podawano ścieki (ok. 250 ml/h) zawierające badaną substancję chemiczną i pozbawione jej, a zgromadzony odpływ analizowano pod kątem zawartości DOC lub właściwej badanej substancji chemicznej.
ZASADA BADANIA
8. Celem niniejszej metody jest określenie eliminacji oraz pierwotnej lub ostatecznej biodegradacji rozpuszczalnych w wodzie organicznych substancji chemicznych przez mikroorganizmy tlenowe w stale działającym systemie badawczym symulującym proces osadu czynnego. Ulegająca łatwej biodegradacji pożywka organiczna oraz badana organiczna substancja chemiczna są źródłami węgla i energii dla mikroorganizmów.
9. Dwa stale działające zestawy badawcze (instalacje z osadem czynnym lub naczynia porowate) pracują jednocześnie w identycznych warunkach, które odpowiadają celowi badania. Średni hydrauliczny czas retencji wynosi normalnie 6 h, a średni wiek osadu (czas retencji osadu) od 6 do 10 dni. Osad oczyszczany jest przy wykorzystaniu jednej z dwóch metod, badana substancja chemiczna jest normalnie dodawana w stężeniu pomiędzy 10 mg/l rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) a 20 mg/l DOC do wcieku (pożywki organicznej) tylko w jednym zestawie. Drugi zestaw wykorzystywany jest jako zestaw kontrolny do określenia biodegradacji pożywki organicznej.
10. W często pobieranych próbkach odpływów określa się poziom DOC - co jest lepszym rozwiązaniem - lub poziom chemicznego zapotrzebowania na tlen (ChZT) oraz stężenie badanej substancji chemicznej (o ile jest to konieczne) w odpływie z zestawu pobierającego badaną substancję chemiczną przy wykorzystaniu analizy właściwej. Przyjmuje się, że różnice pomiędzy stężeniami DOC lub ChZT w zestawie badawczym i zestawie kontrolnym wynikają z działania badanej substancji chemicznej lub jej organicznych metabolitów. Różnicę tę porównuje się z powstałym we wcieku wskutek dodania badanej substancji chemicznej stężeniem DOC lub ChZT w celu określenia eliminacji badanej substancji chemicznej.
11. Biodegradację można na ogół odróżnić od bioadsorpcji dzięki dokładnemu zbadaniu krzywej czasu eliminacji, a wynik można zazwyczaj potwierdzić, stosując badanie szybkiej biodegradacji przy wykorzystaniu aklimatyzowanego inokulum z zestawu, do którego dodaje się badaną substancję chemiczną.
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ
12. Właściwości badanej substancji chemicznej związane z czystością, rozpuszczalnością w wodzie, lotnością i adsorpcją powinny być znane, tak aby możliwa była prawidłowa interpretacja wyników. Na ogół nie jest możliwe badanie lotnych ani nierozpuszczalnych substancji chemicznych, chyba że podjęte zostaną specjalne środki (zob. dodatek 5). Należy również znać strukturę chemiczną, a przynajmniej wzór empiryczny, tak aby można było obliczyć wartości teoretyczne lub sprawdzić zmierzone wartości parametrów, np. teoretyczne zapotrzebowanie na tlen (TZT), rozpuszczony węgiel organiczny (DOC) oraz chemiczne zapotrzebowanie na tlen (ChZT).
13. Informacje na temat toksyczności badanej substancji chemicznej dla mikroorganizmów (zob. dodatek 4) mogą być bardzo użyteczne przy wyborze odpowiednich stężeń do badania i mogą być niezbędne dla prawidłowej interpretacji niskich wartości biodegradacji.
POZIOMY PROGOWE
14. W pierwotnym zastosowaniu niniejszego badania symulacyjnego (potwierdzającego) w odniesieniu do pierwotnej biodegradacji środków powierzchniowo czynnych konieczne jest usunięcie ponad 80 % danej substancji chemicznej, aby dany środek mógł zostać wprowadzony do obrotu. Jeśli poziom 80 % nie zostanie osiągnięty, dane badanie symulacyjne (potwierdzające) może zostać zastosowane, a środek powierzchniowo czynny może zostać wprowadzony do obrotu, tylko jeśli ponad 90 % danej substancji chemicznej zostanie usunięte. W przypadku substancji chemicznych zasadniczo nie mówi się o przejściu badania z powodzeniem/bez powodzenia, a uzyskana wartość procentowa usunięcia może zostać wykorzystana w aproksymacji prawdopodobnego stężenia w środowisku, stosowanej przy ocenach zagrożenia chemicznego stwarzanego przez substancje chemiczne. Wyniki układają się zazwyczaj w schemat "wszystko albo nic". W licznych badaniach czystych substancji chemicznych stwierdzono wartość procentową usunięcia DOC na poziomie > 90 % w ponad trzech czwartych, a > 80 % w ponad 90 % substancji, które wykazywały jakikolwiek znaczący poziom biodegradowalności.
15. Stosunkowo niewiele substancji chemicznych (np. środków powierzchniowo czynnych) obecnych jest w ściekach w stężeniach (ok. 10 mg C/l) wykorzystywanych w niniejszym badaniu. Niektóre substancje chemiczne mogą w tych stężeniach mieć działanie hamujące, podczas gdy kinetyka usuwania innych może być utrudniona przy niskich stężeniach. Bardziej dokładnej oceny degradacji można byłoby dokonać przy wykorzystaniu zmodyfikowanych metod i realistycznie niskich stężeń badanej substancji chemicznej, a zgromadzone dane mogłyby zostać wykorzystane do obliczenia stałych kinetycznych. Jednakże niezbędne techniki eksperymentalne nie zostały jeszcze w pełni zwalidowane, a modele kinetyczne opisujące reakcje biodegradacji nie zostały jeszcze ustanowione (zob. dodatek 7).
SUBSTANCJE ODNIESIENIA
16. Dla zapewnienia prawidłowego przeprowadzenia procedury eksperymentu warto od czasu do czasu, wraz z substancjami badanymi, testować substancje chemiczne, których zachowanie jest znane. Substancje takie to na przykład kwas adypinowy, 2-fenylofenol, 1-naftol, kwas 2,2'-bifenylodikarboksylowy, kwas 1-naftalenokarboksylowy itp. (9) (10) (11).
ODTWARZALNOŚĆ WYNIKÓW BADAŃ
17. Istnieje dużo mniej sprawozdań z badań symulacyjnych niż z badań szybkiej biodegradowalności. Odtwarzalność pomiędzy (równoczesnymi) powtórzeniami jest na wysokim poziomie (w zakresie 10-15 %) w przypadku substancji chemicznych zdegradowanych o 80 % lub więcej, ale w przypadku słabiej zdegradowanych substancji chemicznych występuje większe zróżnicowanie. Ponadto w przypadku niektórych substancji chemicznych o wartości granicznej odnotowano bardzo zróżnicowane wyniki (np. 10 % i 90 %) przy różnych okazjach w ciągu 9 tygodni dopuszczonych w badaniu.
18. W przypadku wyników otrzymanych przy wykorzystaniu obydwu rodzajów przyrządów różnice były nieznaczne, ale niektóre substancje chemiczne ulegały degradacji w większym zakresie i bardziej dokładnie w przypadku ścieków domowych niż ścieków syntetycznych OECD.
OPIS METODY BADAWCZEJ
Przyrząd
Układ badawczy
19. Układ badawczy dla jednej substancji chemicznej składa się z zestawu badawczego i zestawu kontrolnego; jednak w przypadku przeprowadzania tylko konkretnych analiz (biodegradacja pierwotna) konieczny jest tylko zestaw badawczy. Jeden zestaw kontrolny może być wykorzystywany przy kilku zestawach badawczych z tymi samymi lub różnymi badanymi substancjami chemicznymi. W przypadku połączenia (dodatek 3) każdy zestaw badawczy musi mieć własny zestaw kontrolny. Układem badawczym może być instalacja z osadem czynnym, zestaw Husmanna (dodatek 1, rysunek 1) lub naczynie porowate (dodatek 1, rysunek 2). W obydwu przypadkach konieczne są odpowiedniej wielkości zbiorniki magazynujące na wcieki i odpływy oraz pompy dozujące wciek i roztwór badanej substancji chemicznej, zmieszane lub osobno.
20. Każdy zestaw osadu czynnego składa się z naczynia napowietrzającego o znanej pojemności ok. 3 l osadu czynnego oraz osadnika (osadnika wtórnego) o pojemności ok. 1,5 l; pojemności te można w pewnym zakresie zmieniać korygując wysokość osadnika. Naczynia różnej wielkości są dopuszczalne, jeśli poddawane są porównywalnym obciążeniom hydraulicznym. Jeśli nie jest możliwe utrzymanie temperatury w pomieszczeniu badawczym w planowanym zakresie, zaleca się zastosowanie naczyń z płaszczem wodnym o kontrolowanej temperaturze wody. Do transportu osadu czynnego z osadnika do naczynia napowietrzającego wykorzystuje się podnośnik powietrzny lub pompę dozującą działającą w systemie stałym lub przerywanym w regularnych odstępach czasu.
21. System naczyń porowatych składa się z wewnętrznego porowatego cylindra o stożkowym dnie umieszczonego w nieco większym naczyniu o tym samym kształcie, ale wykonanym z nieprzepuszczalnego tworzywa sztucznego. Odpowiednim materiałem na naczynie porowate jest porowaty polietylen o maksymalnej średnicy porów 90 μm i grubości 2 mm. Oddzielenie osadu od pożywki organicznej następuje wskutek różnicowego przepływu przez porowate ściany. Odpływy gromadzą się w przestrzeni pierścienia, z której przepływają do naczynia magazynującego. Nie następuje sedymentacja, a więc nie ma zwrotu osadu. Cały układ może być zamontowany w kontrolowanej termostatycznie kąpieli wodnej. Na początkowych etapach naczynia porowate mogą ulegać zablokowaniu i powodować przelewanie. W takiej sytuacji należy wymienić zablokowaną wkładkę na czystą, najpierw zlewając osad z naczynia do czystego kubła i usuwając zablokowaną wkładkę. Po wytarciu nieprzepuszczalnego cylindra zewnętrznego należy umieścić w nim czystą wkładkę i ponownie wprowadzić osad do naczynia. Cały osad, który przylgnął do bocznych części zablokowanej wkładki, również należy ostrożnie zdjąć i przenieść. Zablokowane naczynia należy wyczyścić najpierw za pomocą małej dyszy wodnej w celu usunięcia pozostałego osadu, następnie poprzez zanurzenie kolejno w rozcieńczonym roztworze podchlorynu sodu i w wodzie, a na koniec dokładnie spłukać wodą.
22. Do napowietrzenia osadu w naczyniach napowietrzających obydwu układów konieczne są odpowiednie techniki, na przykład zastosowanie spiekanych kostek (kamieni napowietrzających) i sprężonego powietrza. Powietrze oczyszcza się w razie potrzeby poprzez przepuszczenie przez odpowiedni filtr i płukanie. Przez układ musi przejść wystarczająca ilość powietrza, tak by możliwe było zachowanie warunków tlenowych i utrzymanie kłaczków osadu w zawieszeniu przez cały czas trwania badania.
Przyrząd do filtrowania lub wirówka
23. Urządzenie do filtrowania próbek z filtrami membranowymi o odpowiedniej porowatości (nominalna średnica otworu 0,45 μm), które adsorbują rozpuszczalne organiczne substancje chemiczne i uwalniają węgiel organiczny w minimalnym stopniu. W przypadku stosowania filtrów uwalniających węgiel organiczny należy zmyć filtry dokładnie gorącą wodą w celu usunięcia wymywalnego węgla organicznego. Alternatywnie można zastosować wirówkę mogącą osiągnąć 40 000 m/s2.
Sprzęt do wykonywania analiz
24. Przyrząd konieczny do oznaczenia:
- DOC (rozpuszczonego węgla organicznego) i TOC (całkowitego węgla organicznego) lub ChZT (chemicznego zapotrzebowania na tlen),
- konkretnej substancji chemicznej, o ile jest to konieczne,
- zawiesin, pH, stężenia tlenu w wodzie,
- temperatury, kwasowości i zasadowości,
- amonu, azotynu i azotanu, jeśli badanie przeprowadzane jest w warunkach nitryfikacyjnych.
Woda
25. Woda wodociągowa, zawierająca mniej niż 3 mg/l DOC. Należy określić zasadowość, jeśli nie jest jeszcze znana.
26. Woda dejonizowana, zawierająca mniej niż 2 mg/l DOC.
Pożywka organiczna
27. Jako pożywkę organiczną można stosować ścieki syntetyczne, ścieki domowe lub mieszaninę obydwu tych typów. Wykazano (11) (14), że zastosowanie wyłącznie ścieków domowych często skutkuje zwiększoną wartością procentową usunięcia DOC, a nawet umożliwia usunięcie i biodegradację niektórych substancji chemicznych, które nie ulegają biodegradacji w przypadku zastosowania syntetycznych ścieków OECD. Ponadto stałe lub przerywane dodawanie ścieków domowych często stabilizuje osad czynny, w tym jego kluczowy potencjał - dobre osadzanie. Dlatego też zaleca się stosowanie ścieków domowych. Należy zmierzyć stężenie DOC lub ChZT w każdej nowej partii pożywki organicznej. Kwasowość lub zasadowość pożywki organicznej powinna być znana. Pożywka organiczna może wymagać dodania odpowiedniego bufora (wodorowęglanu sodu lub diwodorofosforanu potasu), jeżeli jej poziom kwasowości lub zasadowości jest niski, w celu utrzymania pH w naczyniu napowietrzającym w trakcie badania na poziomie ok. 7,5 ± 0,5. Ilość dodawanego bufora oraz moment jego dodania należy określić indywidualnie w każdym przypadku. Jeśli mieszaniny dodawane są w sposób stały lub przerywany, poziom DOC (lub ChZT) mieszaniny musi być utrzymywany na mniej więcej tym samym poziomie, np. poprzez rozcieńczanie wodą.
Ścieki syntetyczne
28. Rozpuścić w każdym litrze wody wodociągowej: pepton, 160 mg; ekstrakt mięsa, 110 mg; mocznik, 30 mg; bezwodny wodorofosforan potasu (K2HPO4), 28 mg; chlorek sodu (NaCl), 7 mg; dwuwodny chlorek wapnia (CaCl2.2H2O), 4 mg; siedmiowodny siarczan magnezu (Mg2SO4.7H20), 2 mg. Ten ściek syntetyczny OECD jest mieszaniną przykładową i daje średnie stężenie DOC we wcieku na poziomie ok. 100 mg/l. Alternatywnie można wykorzystać inne składy o zbliżonym stężeniu DOC, które bardziej odpowiadają prawdziwym ściekom. Jeśli wymagany jest mniej stężony wciek, należy przy wykorzystaniu wody wodociągowej rozcieńczyć ściek syntetyczny, na przykład w stosunku 1:1, tak aby uzyskać stężenie ok. 50 mg/l. Taki słabszy wciek umożliwi lepszy wzrost organizmów nitryfikujących i modyfikację tę należy stosować w przypadku badania symulacji oczyszczalni ścieków wykorzystujących nitryfikację. Taki ściek syntetyczny można przygotować w wodzie destylowanej w postaci skoncentrowanej i przechowywać w temperaturze ok. 1 °C przez maksymalnie jeden tydzień. W razie potrzeby należy go rozcieńczyć wodą wodociągową. (Ta pożywka nie jest satysfakcjonująca, np. stężenie azotu jest bardzo wysokie, a zawartość węgla dość niska, ale nie można zaproponować niczego lepszego poza ewentualnym dodaniem większej ilości fosforanu jako bufora i dodatkowego peptonu).
Ścieki domowe
29. Wykorzystać świeżo osadzone ścieki zbierane codziennie z oczyszczalni ścieków przyjmującej głównie ścieki domowe. Ścieki powinny być zbierane przed wstępną sedymentacją z przelewu osadnika wstępnego lub z materiału doprowadzanego do instalacji osadu czynnego i zasadniczo nie powinny zawierać cząstek gruboziarnistych. Ścieki można stosować po przechowywaniu ich przez kilka dni (ale zasadniczo nie dłużej niż siedem dni) w temperaturze ok. 4 °C, po sprawdzeniu, czy DOC (lub ChZT) nie zmniejszył się znacząco (tzn. o mniej niż 20 %) w trakcie przechowywania. Aby zmniejszyć zakłócenia w układzie, przed zastosowaniem należy skorygować DOC (lub ChZT) każdej nowej partii do odpowiedniej stałej wartości, np. poprzez rozcieńczenie wodą wodociągową.
Osad czynny
30. Pobrać osad czynny do inokulacji ze zbiornika napowietrzającego dobrze funkcjonującej oczyszczalni ścieków lub z zestawu osadu czynnego o skali laboratoryjnej służącego do oczyszczania głównie ścieków domowych.
Roztwory podstawowe badanej substancji chemicznej
31. W przypadku substancji chemicznych o odpowiedniej rozpuszczalności przygotować roztwory podstawowe o właściwych stężeniach (np. 1 do 5 g/l) w wodzie dejonizowanej lub w części mineralnej ścieków syntetycznych. (W przypadku nierozpuszczalnych i lotnych substancji chemicznych zob. dodatek 5). Określić DOC i całkowity węgiel organiczny (TOC) roztworu podstawowego i powtórzyć pomiary przy każdej nowej partii. Jeśli różnica pomiędzy DOC a TOC jest większa niż 20 %, sprawdzić rozpuszczalność badanej substancji chemicznej w wodzie. Porównać DOC lub stężenie badanej substancji chemicznej mierzone za pomocą specyficznej analizy roztworu podstawowego o wartości nominalnej w celu stwierdzenia, czy odzyskiwanie jest wystarczające (zazwyczaj można spodziewać się wartości > 90 %). Sprawdzić, w szczególności w przypadku dyspersji, czy można wykorzystać DOC jako parametr analityczny, czy też możliwe jest zastosowanie wyłącznie techniki analitycznej specyficznej dla badanej substancji chemicznej. W przypadku dyspersji konieczne jest odwirowanie próbek. W każdej nowej partii zmierzyć DOC, ChZT lub poziom badanej substancji chemicznej za pomocą specyficznej metody analitycznej.
32. Określić pH roztworu podstawowego. Wartości krańcowe wskazują, że dodanie substancji chemicznej może mieć wpływ na pH osadu czynnego w układzie badawczym. W takim przypadku w celu uzyskania pH o wartości 7 ± 0,5 należy zneutralizować roztwór podstawowy dodając niewielkie ilości nieorganicznego kwasu lub zasady, ale unikając strącania badanej substancji chemicznej.
PROCEDURA
33. Opisano procedurę dla zestawów osadu czynnego; należy ją nieco dostosować na potrzeby układu naczyń porowatych.
Przygotowanie inokulum
34. Inokulować układ badawczy na początku badania albo osadem czynnym, albo inokulum zawierającym małe stężenie mikroorganizmów. Przechowywać napowietrzone inokulum w temperaturze pokojowej do momentu wykorzystania; zużyć w ciągu 24 h. W pierwszym przypadku pobrać próbkę osadu czynnego z naczynia napowietrzającego dobrze działającej biologicznej oczyszczalni ścieków lub z zestawu osadu czynnego o skali laboratoryjnej przyjmującego głównie ścieki domowe. Jeśli konieczna jest symulacja warunków nitryfikacyjnych, pobrać osad z oczyszczalni ścieków wykorzystującej nitryfikację. Określić stężenie zawiesin i - w razie potrzeby - skoncentrować osad poprzez sedymentację w taki sposób, by zminimalizować ilość dodawaną do układu badawczego. Zapewnić początkowe stężenie suchej masy na poziomie ok. 2,5 g/l.
35. W drugim przypadku użyć między 2 ml/l a 10 ml/l odpływu z przydomowej biologicznej oczyszczalni ścieków jako inokulum. Dla uzyskania jak najbardziej zróżnicowanych gatunków bakterii można dodać inokula z różnych innych źródeł, na przykład wody powierzchniowej. W takim przypadku osad czynny w układzie badawczym rozwinie się i urośnie.
Dawkowanie pożywki organicznej
36. Sprawdzić, czy pojemniki na wciek i odpływ oraz rurki z naczyń na wciek i do naczyń na odpływ są całkowicie czyste, aby uniemożliwić wzrost mikroorganizmów na początku i w trakcie trwania badania. Złożyć układy badawcze w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze (zazwyczaj w zakresie 20-25 °C) lub wykorzystać zestawy w płaszczu wodnym. Przygotować odpowiednią ilość koniecznej pożywki organicznej (pkt 27-29). Wstępnie napełnić naczynie napowietrzające i osadnik pożywką organiczną i dodać inokulum (pkt 34, 35). Rozpocząć napowietrzanie w taki sposób, by osad był utrzymywany w zawieszeniu i w stanie tlenowym, rozpocząć dozowanie wcieku i recykling osadzonego osadu. Dawkować pożywkę organiczną ze zbiorników magazynujących do zbiorników napowietrzających (pkt 20, 21) zestawów badawczych i kontrolnych i zebrać odpływy w podobnych zbiornikach magazynujących. W celu uzyskania normalnego 6-godzinnego hydraulicznego czasu retencji pożywkę organiczną pompuje się w tempie 0,5 l/h. W celu potwierdzenia tego tempa mierzyć dzienną ilość dozowanej pożywki organicznej, odnotowując zmniejszenie ilości pożywki w zbiornikach magazynujących. Inne tryby dozowania konieczne są do określenia skutków przerywanego uwalniania i "uderzeniowego" podawania substancji chemicznych.
37. Jeśli pożywka organiczna przygotowywana jest do użytku przez okres dłuższy niż 1 dzień, konieczne jest schładzanie w temperaturze ok. 4 °C lub stosowanie innych odpowiednich metod konserwacji w celu zapobieżenia wzrostowi mikroorganizmów i biodegradacji poza zestawami badawczymi (pkt 29). W przypadku stosowania ścieków syntetycznych można przygotować i przechowywać w temperaturze ok. 4 °C stężony roztwór podstawowy (np. 10-krotność normalnego stężenia, pkt 28). Taki roztwór podstawowy można zmieszać przed użyciem z odpowiednią ilością wody wodociągowej; alternatywnie, można go wpompować bezpośrednio przy jednoczesnym osobnym podawaniu wody wodociągowej.
Dawkowanie badanej substancji chemicznej
38. Dodać odpowiednią ilość roztworu podstawowego badanej substancji chemicznej (pkt 31) do naczynia magazynującego z wciekiem lub dawkować bezpośrednio oddzielną pompą do naczynia napowietrzającego. Normalne średnie stężenie badawcze wcieku powinno wynosić pomiędzy 10 mg/l a 20 mg/l DOC, przy czym górna wartość nie może przekraczać 50 mg/l. Jeśli rozpuszczalność badanej substancji chemicznej w wodzie jest niska lub prawdopodobne jest wystąpienie efektów toksycznych, zmniejszyć stężenie do 5 mg/l DOC lub nawet mniejszej wartości, ale tylko jeśli dostępna i wykorzystywana jest odpowiednia szczególna metoda analityczna (zdyspergowane badane substancje chemiczne, które są słabo rozpuszczalne w wodzie, mogą być dodawane przy użyciu specjalnych technik dawkowania, zob. dodatek 5).
39. Rozpocząć dodawanie badanej substancji chemicznej po okresie, w którym system ustabilizował się i wydajnie usuwa DOC z pożywki organicznej (ok. 80 %). Przed dodaniem badanej substancji chemicznej ważne jest sprawdzanie, czy wszystkie zestawy działają tak samo wydajnie; jeśli nie, skutecznym rozwiązaniem jest zazwyczaj zmieszanie poszczególnych porcji osadu i ponowne podanie równych ilości do poszczególnych zestawów. Jeśli wykorzystywane jest inokulum z (około) 2,5 g/l (suchej masy) osadu czynnego, badana substancja chemiczna może być dodawana od początku badania, ponieważ bezpośrednie dodawanie wzrastających ilości od samego początku przynosi korzyść w postaci lepszego dostosowywania się osadu czynnego do badanej substancji chemicznej. Bez względu na sposób dodawania badanej substancji chemicznej zaleca się, by odpowiednie natężenie przepływu lub ilości w naczyniach magazynujących były mierzone w regularnych odstępach czasu.
Postępowanie z osadem czynnym
40. Stężenie stałego osadu czynnego stabilizuje się zazwyczaj pomiędzy wartościami granicznymi w trakcie badania, niezależnie od zastosowanego inokulum, w zakresie pomiędzy 1 a 3 g/l (suchej masy), w zależności od jakości i stężenia pożywki organicznej, warunków działania, charakteru obecnych mikroorganizmów i wpływu badanej substancji chemicznej.
41. Mierzyć zawiesiny w naczyniach napowietrzających co najmniej raz w tygodniu i usuwać nadwyżkę osadu w celu utrzymania stężenia na poziomie pomiędzy 1 g/l a 3 g/l (suchej masy) lub kontrolować średni wiek osadu utrzymując go na stałym poziomie, zazwyczaj w zakresie pomiędzy 6 a 10 dni. Jeśli wybierze się na przykład 8-dniowy czas retencji osadu, codziennie należy usuwać 1/8 objętości osadu czynnego ze zbiornika napowietrzającego i odrzucać go. Działania te należy przeprowadzać codziennie, lub - w miarę możliwości - przy wykorzystaniu automatycznej pompy działającej w sposób przerywany. Utrzymanie stężenia zawiesiny na stałym poziomie lub pomiędzy bliskimi wartościami granicznymi nie pozwala na zachowanie stałego czasu retencji osadu, który jest zmienną operacyjną określającą wartość stężenia badanej substancji chemicznej w odpływie.
42. W trakcie trwania badania usuwać co najmniej raz dziennie cały osad przylegający do ścian naczynia napowietrzającego i osadnika, tak by osad pozostawał w stanie zawieszonym. Regularnie kontrolować i oczyszczać wszystkie rurki w celu zapobieżenia wzrostowi biofilmu. Przenosić poddany sedymentacji osad z osadnika z powrotem do naczynia napowietrzającego, najlepiej przy wykorzystaniu pompy pracującej w sposób przerywany. W układzie naczyń porowatych nie zachodzi recykling, ale należy zadbać, by włożyć czyste naczynia, zanim poziom w naczyniu znacząco wzrośnie (pkt 21).
43. W zestawach Husmanna może występować słaba sedymentacja i degradacja osadu. Sytuacji tej można zaradzić poprzez zastosowanie co najmniej jednego z poniżej wymienionych działań, jednocześnie w zestawach badawczych i kontrolnych:
- można dodawać w regularnych odstępach, np. co tydzień, świeży osad lub flokulant (np. 50 g/l FeCl3 w ilości 2 ml/naczynie), lecz należy zadbać, by nie nastąpiła żadna reakcja czy też wytrącanie osadu w wyniku reakcji pomiędzy badaną substancją chemiczną a FeCl3,
- podnośnik powietrzny można zastąpić pompą perystaltyczną, co umożliwia przepływ recyrkulacyjny osadu mniej więcej równoważny przepływowi wcieku i pozwala na rozwinięcie strefy beztlenowej w osadzie poddanym sedymentacji (geometria podnośnika powietrznego ogranicza minimalne natężenie przepływu zwróconego osadu do ok. 12-krotności natężenia przepływu wcieku),
- można pompować osad w sposób przerywany z osadnika do naczynia napowietrzającego (np. 5 min. co 2,5 h) w celu zwrotu 1 l/h do 1,5 l/h,
- można wykorzystać nietoksyczną substancję przeciwpianotwórczą w minimalnym stężeniu w celu zapobieżenia stracie wskutek pienienia (np. olej silikonowy),
- można przepuścić powietrze przez osad w osadniku w krótkich uderzeniowych porcjach (np. przez 10 sek., co godzinę),
- można w regularnych odstępach podawać pożywkę organiczną do naczynia napowietrzającego (np. przez 3-10 min co godzinę).
Pobieranie próbek i analiza
44. Mierzyć w regularnych odstępach stężenie rozpuszczonego tlenu, temperaturę i pH osadu czynnego w naczyniach napowietrzających. Zapewnić stałą dostępność wystarczającej ilości tlenu (> 2 mg/l) i temperaturę w odpowiednim zakresie (normalnie od 20 °C do 25 °C). Utrzymać pH na poziomie 7,5 ± 0,5, dawkując niewielkie ilości nieorganicznej zasady lub kwasu do naczynia napowietrzającego lub do wcieku, lub zwiększając pojemność buforową pożywki organicznej (zob. pkt 27). Jeśli zachodzi nitryfikacja, wytwarzany jest kwas, utlenienie 1 mg N powoduje wytworzenie odpowiednika ok. 7 mg CO3-. Częstotliwość pomiarów zależy od mierzonych parametrów oraz stabilności systemu i możliwe jest występowanie różnic pomiędzy pomiarami dziennymi i tygodniowymi.
45. Zmierzyć DOC lub ChZT we wciekach do naczyń kontrolnych i badawczych. Zmierzyć stężenie badanej substancji chemicznej we wcieku w zestawie badawczym przy wykorzystaniu analizy właściwej lub oszacować je ze stężenia w roztworze podstawowym (pkt 31), wykorzystanej pojemności i ilości ścieków dawkowanych do zestawu badawczego. Zaleca się obliczenie stężenia badanej substancji chemicznej w celu zmniejszenia zmienności danych dotyczących stężenia.
46. Pobrać odpowiednie próbki z zebranego odpływu (np. 24-godzinna próbka zbiorcza) i przefiltrować je przez membranę o wielkości porów 0,45 μm lub odwirować je przy ok. 40 000 m/s2 przez ok. 15 min. Jeśli filtrowanie sprawia trudności, należy zastosować wirowanie. Określić DOC lub ChZT co najmniej dwukrotnie w celu zmierzenia ostatecznej biodegradacji i, o ile to konieczne, pierwotnej biodegradacji, w drodze analizy specyficznej dla badanej substancji chemicznej.
47. Zastosowanie ChZT może spowodować powstanie trudności analitycznych przy niskich stężeniach i dlatego zalecane jest wyłącznie, jeśli wykorzystuje się odpowiednio wysokie stężenie badawcze (ok. 30 mg/l). Ponadto w przypadku mocno adsorbujących substancji chemicznych zaleca się, by ilość adsorbowanej substancji chemicznej w osadzie była mierzona przy wykorzystaniu techniki analitycznej specyficznej dla badanej substancji chemicznej.
48. Częstotliwość pobierania próbek zależy od oczekiwanej długości trwania badania. Zalecana jest częstotliwość trzy razy w tygodniu. Jeśli zestawy działają wydajnie, należy przeznaczyć okres od 1 do maksymalnie 6 tygodni po wprowadzeniu badanej substancji chemicznej na osiągnięcie stanu ustalonego. W celu oceny wyniku badania uzyskać co najmniej 15 ważnych wartości w fazie plateau (pkt 59) trwającej normalnie 3 tygodnie. Badanie można zakończyć po osiągnięciu odpowiedniego stopnia eliminacji (np. > 90 %) i uzyskaniu tych 15 wartości odpowiadających analizom przeprowadzonym w każdym dniu roboczym przez 3 tygodnie. Normalnie okres trwania badania nie powinien przekraczać 12 tygodni po dodaniu badanej substancji chemicznej.
49. Jeśli osad ulegnie nitryfikacji oraz jeśli zbadany ma być wpływ badanej substancji chemicznej na nitryfikację, przeanalizować co najmniej raz w tygodniu próbki z odpływu zestawów badawczych i kontrolnych pod kątem soli amonowych lub azotynów i azotanów.
50. Wszystkie analizy, szczególnie określenie poziomu azotu, należy przeprowadzać tak szybko, jak to tylko możliwe. Jeśli analizy muszą być przesunięte w czasie, próbki należy przechowywać w temperaturze ok. 4 °C w ciemności, w pełnych i szczelnie zamkniętych butelkach. Jeśli próbki muszą być przechowywane przez ponad 48 h, zabezpieczyć je poprzez zamrożenie, zakwaszenie (np. stosując 10 ml/l roztworu kwasu siarkowego o stężeniu 400 g/l) lub dodanie odpowiedniej substancji toksycznej (np. 20 ml/l roztworu chlorku rtęci(II) o stężeniu 10 g/l). Zadbać, by technika zabezpieczenia nie miała wpływu na wyniki analizy.
Łączenie zestawów badawczych
51. Jeśli stosowane jest łączenie (dodatek 3), wymieniać codziennie tę samą ilość osadu czynnego (150 ml do 1 500 ml w przypadku naczyń napowietrzających zawierających 3 litry płynu) pomiędzy naczyniami napowietrzającymi zestawu badawczego i jego zestawu kontrolnego. Jeśli badana substancja chemiczna adsorbuje silnie do osadu, wymienić tylko supernatant osadników. W obydwu przypadkach zastosować współczynnik korygujący do obliczenia wyników badania (pkt 55).
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Obróbka wyników
52. Obliczyć wartość procentową eliminacji DOC lub ChZT badanej substancji chemicznej w odniesieniu do każdej oceny w czasie, wykorzystując równanie:
gdzie:
Dt = % eliminacji DOC lub ChZT w czasie t,
Cs = DOC lub ChZT we wcieku w wyniku działania badanej substancji chemicznej, najlepiej oszacowane z roztworu podstawowego (mg/l),
E = mierzona wartość DOC lub ChZT w badanym odpływie w czasie t (mg/l),
Eo = mierzona wartość DOC lub ChZT w kontrolnym odpływie w czasie t (mg/l).
53. Stopień eliminacji DOC lub ChZT w pożywce organicznej w zestawie kontrolnym to informacja przydatna przy ocenianiu aktywności biodegradacyjnej osadu czynnego w trakcie badania. Obliczyć wartość procentową eliminacji z równania:
gdzie:
DB = % eliminacji DOC lub ChZT pożywki organicznej w zestawie kontrolnym w czasie t,
CM = DOC lub ChZT pożywki organicznej we wcieku kontrolnym (mg/l).
Opcjonalnie można obliczyć wartość procentową eliminacji DOC lub ChZT wskutek dodania pożywki organicznej oraz badanej substancji chemicznej w zestawie badawczym z równania:
gdzie:
DT = % eliminacji DOC lub ChZT całości wcieku badawczego,
CT = DOC lub ChZT całości wcieku badawczego lub wartość obliczona z roztworów podstawowych (mg/l).
54. Obliczyć usunięcie badanej substancji chemicznej, jeśli pomiaru dokonywano przy wykorzystaniu swoistej metody analitycznej przy każdym pomiarze w czasie, z równania:
gdzie:
DST = % pierwotnej eliminacji badanej substancji chemicznej w czasie t,
Si = mierzone lub szacowane stężenie badanej substancji chemicznej w badanym wcieku (mg/l),
Se = mierzone stężenie badanej substancji chemicznej w badanym wcieku w czasie t (mg/l).
55. Jeśli wykorzystano tryb połączenia, wyrównać rozcieńczenie badanej substancji chemicznej w naczyniu napowietrzającym przez wymianę osadu z zastosowaniem współczynnika korygującego (zob. dodatek 3). Jeśli zastosowano średni hydrauliczny czas retencji trwający 6 h i wymianę połowy objętości osadu czynnego w naczyniu napowietrzającym, stwierdzone dzienne wartości eliminacji (Dt, pkt 52) muszą zostać skorygowane w celu otrzymania prawdziwego stopnia eliminacji - Dtc - badanej substancji chemicznej z równania:
Prezentacja wyników badania
56. Przedstawić w postaci wykresu wartość procentową eliminacji Dt (lub Dtc) oraz Dst, jeśli jest dostępna, w stosunku do czasu (zob. dodatek 2). Z kształtu krzywej eliminacji badanej substancji chemicznej (per se lub jako DOC) można wyciągnąć pewne wnioski co do procesu usuwania.
Adsorpcja
57. Jeśli od początku badania obserwuje się wysoką eliminację DOC, badana substancja chemiczna jest prawdopodobnie eliminowana w drodze adsorpcji do stałego osadu czynnego. Można to udowodnić poprzez określenie adsorbowanej badanej substancji chemicznej w drodze analizy właściwej. Wysoki poziom eliminacji DOC adsorbowalnych substancji chemicznych podczas całego badania nie jest typowy; zazwyczaj na początku usuwanie zachodzi w dużym stopniu, który następnie spada do równomiernego poziomu. Jednak jeśli adsorbowalna substancja chemiczna spowodowała jakiś rodzaj przystosowania populacji bakterii, poziom eliminacji DOC badanej substancji chemicznej ulegałby stopniowemu wzrostowi i osiągał wysoki poziom plateau.
Faza zastoju
58. Tak samo jak w przypadku statycznych badań przesiewowych, wiele badanych substancji chemicznych wymaga fazy zastoju przed wystąpieniem pełnej biodegradacji. W fazie zastoju następuje przystosowanie lub adaptacja bakterii prowadzących proces degradacji przy jednoczesnym prawie całkowitym braku usuwania badanej substancji chemicznej; następnie zachodzi wstępny wzrost tych bakterii. Zakłada się, że ta faza kończy się, a zaczyna faza degradacji, kiedy następuje usunięcie ok. 10 % wstępnej ilości badanej substancji chemicznej (po adsorpcji, o ile takowa wystąpi). Faza zastoju jest często bardzo zmienna i słabo odtwarzalna.
Faza plateau
59. Faza plateau na krzywej eliminacji w teście ciągłym definiowana jest jako ta faza, w której następuje maksymalna degradacja. Faza plateau powinna trwać co najmniej 3 tygodnie i należy w jej trakcie dokonać około 15 ważnych pomiarów wartości.
Średni stopień eliminacji badanej substancji chemicznej
60. Obliczyć średnią wartość z wartości eliminacji (Dt) badanej substancji chemicznej w fazie plateau. W zaokrągleniu do najbliższej liczby całkowitej (1 %) stanowi ona stopień eliminacji badanej substancji chemicznej. Zaleca się również obliczenie 95 % przedziału ufności średniej wartości.
Eliminacja pożywki organicznej
61. Przedstawić w postaci wykresu wartość procentową eliminacji DOC lub ChZT pożywki organicznej w zestawie kontrolnym (DB) w stosunku do czasu. Wskazać średni stopień eliminacji w taki sam sposób jak w odniesieniu do badanej substancji chemicznej (pkt 60).
Wskazywanie na biodegradację
62. Jeśli substancja chemiczna nie adsorbuje w znaczącym stopniu do osadu czynnego, a krzywa eliminacji ma typowy kształt krzywej biodegradacji z fazami zastoju, degradacji i plateau (pkt 58, 59), zmierzoną eliminację można bezpiecznie przypisać biodegradacji. Jeśli zaszło znaczne wstępne usuwanie, badanie symulacyjne nie może dokonywać rozróżnienia pomiędzy procesami eliminacji biologicznej i abiotycznej. W takich przypadkach, a także w innych sytuacjach, kiedy zachodzi wątpliwość co do biodegradacji (np. jeśli występuje odpędzanie), przeanalizować adsorbowane badane substancje chemiczne lub przeprowadzić dodatkowe statyczne badania biodegradacji w oparciu o parametry wyraźnie wskazujące na procesy biologiczne. Takie badania to metoda pobierania tlenu (rozdz. C.4 D, E i F niniejszego załącznika (6)), badanie z pomiarem wytwarzania dwutlenku węgla (rozdział C.4 C niniejszego załącznika (6)) lub metoda ISO pomiaru dwutlenku węgla w przestrzeni nad roztworem (18) wykorzystująca preinkubowane inokulum z badania symulacyjnego. Jeśli zmierzone zostało zarówno usunięcie DOC, jak i usunięcie właściwej substancji chemicznej, znaczące różnice (pierwsza wartość jest niższa niż druga) pomiędzy wartościami procentowymi wskazują obecność w odpływach pośrednich produktów organicznych, które mogą być trudniejsze w degradacji niż pierwotna substancja chemiczna.
Ważność wyników badania
63. Informacje na temat normalnej biodegradacji inokulum uzyskuje się, jeśli określi się stopień eliminacji pożywki organicznej (pkt 53) w zestawie kontrolnym. Badanie uznaje się za ważne, jeśli stopień eliminacji DOC lub ChZT w zestawie kontrolnym (zestawach kontrolnych) wynosi > 80 % po dwóch tygodniach i nie zaobserwowano żadnych nietypowych zjawisk.
64. Jeśli zastosowano szybko biodegradowalną (referencyjną) substancję chemiczną, stopień biodegradacji (Dt, pkt 52) powinien wynieść > 90 %.
65. Jeśli badanie przeprowadzane jest w warunkach nitryfikujących, średnie stężenie w odpływach powinno wynosić < 1 mg/l azotu w postaci amoniaku i < 2 mg/l azotu w postaci azotynu.
66. Jeśli te kryteria (pkt 63-65) nie są spełnione, powtórzyć badanie, wykorzystując inokulum z innego źródła, zbadać substancję odniesienia i dokonać przeglądu wszystkich procedur eksperymentu.
Sprawozdanie z badania
67. Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
Badana substancja chemiczna
- dane identyfikacyjne,
- charakter fizyczny i w razie potrzeby własności fizykochemiczne.
Warunki badania
- typ układu badawczego; wszelkie modyfikacje w przypadku badania nierozpuszczalnych i lotnych substancji chemicznych,
- typ pożywki organicznej,
- proporcja i charakter ścieków przemysłowych obecnych w ściekach, jeśli są znane,
- inokulum: charakter i miejsce (miejsca) pobierania próbek, stężenie i wszystkie operacje przygotowania wstępnego,
- roztwór podstawowy badanej substancji chemicznej: zawartość DOC i ChZT; sposób przygotowywania, jeśli jest to zawiesina; wykorzystane stężenie badawcze; powody zastosowania wartości DOC poza zakresem 10-20 mg/l; metoda dodawania; data pierwszego dodania; ewentualne zmiany,
- średni wiek osadu i średni hydrauliczny czas retencji; metoda degradacji osadu; metoda likwidowania pęcznienia, utraty osadu itp.,
- zastosowane techniki analityczne,
- temperatura badania,
- cechy pęcznienia osadu, indeks objętościowy osadu (SVI), zawartość zawiesin w komorze osadu czynnego (MLSS),
- wszelkie odchylenia od standardowych procedur i wszelkie okoliczności, które mogły mieć wpływ na wyniki.
Wyniki badania
- wszystkie mierzone dane (DOC, ChZT, analizy właściwe, pH, temperatura, stężenie tlenu, zawiesiny, substancje chemiczne zawierające azot, w stosownych przypadkach,
- wszystkie obliczone wartości Dt (lub Dtc), DB, DSt otrzymane w formie tabelarycznej i krzywe eliminacji,
- informacje na temat faz zastoju i faz plateau, długość trwania badania, stopień eliminacji badanej substancji chemicznej i pożywki organicznej w zestawie kontrolnym wraz z informacjami statystycznymi i potwierdzeniami biodegradowalności i ważności badania,
- omówienie wyników.
BIBLIOGRAFIA:
(1) Swisher RD (1987). "Surfactant Biodegradation", wydanie drugie, Marcel Dekker Inc. Nowy Jork, 1085 s.
(2) Rząd niemiecki (1962). Rozporządzenie w sprawie degradowalności detergentów w środkach myjących i czyszczących. Bundesgesetzblatt, część 1, nr 49: 698-706.
(3) Painter HA i King EF (1978a). WRc porouspot method for assessing biodegradability. Technical Report No.70, Water Research Centre, Medmenham, Zjednoczone Królestwo.
(4) Painter HA i King EF (1978b). The effect of phosphate and temperature on growth of activated sludge and on biodegradation of surfactants. Wat. Res. 12: 909-915.
(5) Eckenfelder, W.W (19) US EPA.
(6) Rozdział C.4 niniejszego załącznika: Oznaczenie szbkiej biodegradowalności.
(7) Rozdział C.12 niniejszego załącznika: Biodegradacja - zmodyfikowane badanie SCAS.
(8) Rozdział C.19 niniejszego załącznika: Oszacowanie współczynnika adsorpcji (KOC) na glebie i w osadzie ściekowym przy zastosowaniu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)
(9) Gerike P i Fischer WK (1979). A correlation study of biodegradability determinations with various chemicals in various tests. Ecotox. Env. Saf. 3: 157-173.
(10) Gerike P i Fischer WK (1981), as (9), II Additional results and conclusions. Ecotox. Env. Saf. 5: 45-55.
(11) Painter HA i Bealing D (1989). Experience and data from the OECD activated sludge simulation test. s. 113-138, [w]: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. [red.] Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
(12) ISO 11733 (1995; zmieniony 2004). Oznaczanie eliminacji i biodegradacji związków organicznych w środowisku wodnym - Test symulacyjny z osadem czynnym.
(13) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg.: 33-48.
(14) Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61 (2): 340-343.
(15) Gerike P, Fischer WK i Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD confirmatory test. Wat.Res. 14: 753-758.
(16) Baumann U, Kuhn G i Benz M. (1998). Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220.
(17) Her Majesty's Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. Methods for the examination of waters and associated materials. s. 91-98 ISBN 011 751661 9.
(18) ISO 14593 (1998). Water Quality - Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis of inorganic carbon in sealed vessels.
Dodatek 1
Rysunek 1
Oprzyrządowanie stosowane do oceny biodegradowalności
Zestaw Husmanna
Rysunek 2
Oprzyrządowanie stosowane do oceny biodegradowalności
Naczynie porowate
Rysunek 3
Szczegóły budowy 3-litrowego naczynia porowatego do napowietrzania
Dodatek 2
Przykład krzywej eliminacji
Dodatek 3
[INFORMACYJNY]
ŁĄCZENIE ZESTAWÓW BADAWCZYCH
W celu zrównoważenia populacji bakteryjnych w osadzie w zestawie badawczym, do którego wprowadza się ścieki i badaną substancję chemiczną, oraz w zestawie kontrolnym, do którego wprowadza się tylko ścieki, wprowadzono codzienną wymianę osadu (1). Procedurę tę nazwano łączeniem, a metoda znana jest jako zestawy łączone. Pierwotnie łączenie stosowano do zestawów osadu czynnego Husmanna, ale używano go również do zestawów z naczyniami porowatymi (2) (3). Nie odnotowano znaczących różnic w wynikach zestawów niełączonych i łączonych, zarówno w przypadku zestawów Husmanna, jak i zestawów naczyń porowatych, tak więc wydatkowanie czasu i energii na łączenie zestawów nie przynosi żadnych korzyści.
Wymiana osadu może pozornie powodować znaczące usuwanie, ponieważ część badanej substancji chemicznej jest przenoszona, a stężenia badanej substancji w odpływie badanym i kontrolnym stają się niemal równe. Dlatego też konieczne jest stosowanie współczynników korygujących, które uzależnione są od wymienianej frakcji i średniego hydraulicznego czasu retencji. Opublikowano szczegółowe informacje na temat wyliczeń (1).
Obliczyć skorygowany stopień eliminacji DOC lub ChZT używając ogólnego wzoru:
Dtc = (Dt - 100 a r/12)/(1 - a r/12) %
gdzie:
Dtc = skorygowany % eliminacji DOC lub ChZT,
Dt = określony % eliminacji DOC lub ChZT,
a = wymieniona frakcja objętości zestawów osadu czynnego,
r = średni hydrauliczny czas retencji (h).
Jeśli na przykład połowa pojemności naczynia napowietrzającego jest wymieniana (a = 0,5), a średni hydrauliczny czas retencji wynosi 6 h, prawidłowy wzór to:
BIBLIOGRAFIA
(1) Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975). Biodegradability Determinations via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled Units of the OECD Confirmatory Test. I The test. Wat. Res. 9: 1131-1135.
(2) Painter HA i Bealing D (1989). Experience and data from the OECD activated sludge simulation test. s. 113-138, [w]: Laboratory tests for simulation of water treatment processes. CEC Water Pollution Report 18. [red.] Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.
(3) Painter HA, King EF (1978). Water Research Centre Porous Pot Method for Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, Zjednoczone Królestwo.
Dodatek 4
OCENA HAMOWANIA OSADU CZYNNEGO
Procedura z udziałem badanych substancji chemicznych
1. Substancja chemiczna (lub ściek) mogą nie ulegać degradacji ani usuwaniu w badaniu symulacyjnym i mogą wręcz mieć wpływ hamujący na mikroorganizmy w osadzie. Inne substancje chemiczne ulegają biodegradacji w niskich stężeniach, ale mają działanie hamujące w stężeniach wyższych (hormeza). Działanie hamujące może ujawnić się na wcześniejszym etapie lub może zostać stwierdzone dzięki zastosowaniu badania toksyczności przy użyciu inokulum podobnego lub identycznego jak to stosowane w badaniu symulacyjnym (1). Metody te to hamowanie pobierania tlenu (rozdział C.11 niniejszego załącznika (2) oraz ISO 8192(3)) lub hamowanie wzrostu organizmów w osadzie (ISO 15522 (4)).
2. W badaniu symulacyjnym wszelkie działanie hamujące wyraża się jako różnica poziomu rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) lub chemicznego zapotrzebowania na tlen (ChZT) pomiędzy odpływem z naczynia badawczego i z kontrolnego przekraczająca ilość DOC w substancji dodanej jako badana substancja chemiczna. Inaczej mówiąc, wartość procentowa usunięcia DOC (i biochemicznego zapotrzebowania na tlen BZT, chemicznego zapotrzebowania na tlen ChZT lub NH+ 4) w poddawanej działaniu pożywce organicznej zmniejszy się w obecności badanej substancji chemicznej. Jeśli to nastąpi, należy powtórzyć badanie, zmniejszając stężenie badanej substancji chemicznej do momentu osiągnięcia poziomu, na którym nie występuje hamowanie, i ewentualnie dalej zmniejszając stężenie do momentu biodegradacji badanej substancji chemicznej. Jednakże jeśli badana substancja chemiczna (lub ściek) ma negatywny wpływ na proces we wszystkich badanych stężeniach, sugeruje to, że substancja jest trudna do oczyszczania biologicznego, lub też że jest ono niemożliwe, jednak warto powtórzyć badanie przy wykorzystaniu osadu czynnego z innego źródła lub poddać osad bardziej stopniowemu przystosowaniu.
3. Z kolei jeśli badana substancja chemiczna ulega bioeliminacji przy pierwszej próbie przeprowadzenia badania symulacyjnego, jej stężenie należy zwiększyć, jeśli konieczne jest ustalenie, czy dana substancja chemiczna może mieć działanie hamujące.
4. Przy próbach określenia stopnia hamowania należy pamiętać, że populacja w osadzie czynnym może ulec zmianie, wskutek czego z biegiem czasu mikroorganizmy mogą rozwinąć tolerancję na substancję chemiczną o działaniu hamującym.
5. Obliczenie stopnia hamowania:
Ogólną procentową wartość usunięcia Ro BZT, DOC, ChZT itp. w zestawach testowych i kontrolnych można wyliczyć z:
Ro = 100 (I - E)/I %
gdzie:
I = stężenie we wcieku BZT, DOC, ChZT itp. w naczyniach badawczych i kontrolnych (mg/l),
E = odpowiednie stężenia w odpływie.
I i E należy skorygować o DOC w odniesieniu do badanej substancji chemicznej w zestawach badawczych, w przeciwnym wypadku obliczenia procentowej wartości hamowania będą niepoprawne.
Stopień hamowania wywołanego obecnością badanej substancji chemicznej można obliczyć z:
% hamowania = 100 (Rc - Rt)/Rc
gdzie:
Rc = procentowa wartość usunięcia w naczyniach kontrolnych,
Rt = procentowa wartość usunięcia w naczyniach badawczych.
BIBLIOGRAFIA
(1) Reynolds L et al. (1987). Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for biodegradability. Chemosphere 16: 2259.
(2) Rozdział C.11 niniejszego załącznika. Biodegradacja - badanie hamowania oddychania osadów czynnych.
(3) ISO 8192 (2007) Jakość wody - Badanie hamowania zużycia tlenu przez osad czynny do utleniania związków zawierających węgiel i amon.
(4) ISO 15522 (1999) Water Quality - Determination of the inhibitory effect of water constituents on activated sludge microorganisms.
Dodatek 5
Badane substancje chemiczne słabo rozpuszczalne w wodzie - lotne substancje chemiczne
Substancje chemiczne słabo rozpuszczalne w wodzie
Opublikowano do tej pory niewiele raportów z poddawania substancji chemicznych słabo rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych w wodzie badaniom symulującym oczyszczanie ścieków (1) (2) (3).
Nie istnieje jedna metoda dyspersji badanej substancji chemicznej, która miałaby zastosowanie do wszystkich nierozpuszczalnych substancji chemicznych. Dwa z czterech typów metod opisywanych w ISO 10634 (4) wydają się odpowiednie do podjęcia prób rozproszenia badanych substancji chemicznych na potrzeby badań symulacyjnych; są to zastosowanie środków emulgujących lub energii ultradźwiękowej. Należy osiągnąć co najmniej 24-godzinne okresy stabilności dyspersji. Odpowiednio ustabilizowane dyspersje znajdujące się w zbiorniku ze stałym mieszaniem (pkt 38) dawkuje się następnie do naczynia napowietrzającego oddzielnie od ścieków domowych (lub syntetycznych).
Jeśli dyspersje są stabilne, zbadać, jak można określić ilość badanej substancji chemicznej w postaci zdyspergowanej. Jest mało prawdopodobne, by odpowiednie było wykorzystanie DOC, zatem należy określić dla badanej substancji chemicznej właściwą metodę analityczną, którą można byłoby stosować do odpływów, części stałych odpływów i osadu czynnego. To, co stanie się z badaną substancją chemiczną w symulacji procesu osadu czynnego, jest wówczas determinowane w fazach ciekłych i stałych. W ten sposób ustalony zostanie "bilans masy" pozwalający określić, czy badana substancja chemiczna uległa biodegradacji. Będzie się to jednak odnosić tylko do biodegradacji pierwotnej. Należy podjąć próbę wykazania ostatecznej biodegradacji poprzez zastosowanie respirometrycznego badania szybkiej biodegradowalności (rozdział C.4 niniejszego załącznika (5) C, F lub D), wykorzystując jako inokulum osad poddany działaniu badanej substancji chemicznej w badaniu symulacyjnym.
Lotne substancje chemiczne
Zastosowanie symulacji oczyszczania ścieków do substancji lotnych jest dyskusyjne i problematyczne. Tak samo jak w przypadku badanych substancji chemicznych słabo rozpuszczalnych w wodzie, również na temat badań symulacyjnych z wykorzystaniem lotnych substancji chemicznych opublikowano niewiele raportów. Konwencjonalnego typu przyrząd do mieszania pełnego jest adaptowany poprzez uszczelnienie zbiorników napowietrzających i osadników, pomiar i kontrolę przepływu powietrza przy wykorzystaniu mierników przepływu powietrza oraz przepuszczanie gazu uchodzącego przez pułapki w celu zebrania lotnych substancji organicznych. W niektórych przypadkach wykorzystuje się pompę próżniową do przepuszczania gazu uchodzącego przez "zimną" pułapkę lub pułapkę oczyszczającą zawierającą Tenax i żel silikonowy do analiz metodą chromatografii gazowej. Obecność badanej substancji chemicznej w pułapce można określić analitycznie.
Badanie przeprowadzane jest w dwóch częściach. Zestawy działają najpierw bez osadu - do zbiornika napowietrzającego wpompowuje się tylko ścieki syntetyczne i badaną substancję chemiczną. Próbki wcieku, odpływu i gazu uchodzącego są gromadzone i analizowane pod kątem obecności badanej substancji chemicznej przez kilka dni. Na podstawie zgromadzonych danych można obliczyć wartość procentową (Rvs) badanej substancji chemicznej usuniętej z układu.
Następnie przeprowadza się normalne badanie biologiczne (z osadem) w warunkach operacyjnych identycznych do warunków badania odpędzania. Wykonuje się również pomiary DOC lub ChZT w celu sprawdzenia, czy zestawy pracują wydajnie. Od czasu do czasu przeprowadza się analizy mające określić ilość badanej substancji chemicznej we wcieku, odpływie i gazie uchodzącym w pierwszej części badania; po przystosowaniu przeprowadza się częstsze analizy. Na podstawie danych w stanie ustalonym można obliczyć wartość procentową usunięcia badanej substancji chemicznej z fazy ciekłej przy wykorzystaniu wszystkich procesów (RT) (fizycznych i biologicznych) oraz odsetek (RV) usunięty z układu.
Obliczenie:
a) W badaniu niebiologicznym udział procentowy (RVP) badanej substancji chemicznej usuniętej z układu można obliczyć ze wzoru:
gdzie:
RVP = sunięcie badanej substancji chemicznej poprzez ulatnianie się (%),
SVP = badana substancja chemiczna zgromadzona w pułapce wyrażona jako ekwiwalent stężenia w fazie płynnej (mg/l),
SIP = stężenie badanej substancji chemicznej we wcieku (mg/l).
b) W badaniu biologicznym udział procentowy (RV) badanej substancji chemicznej usuniętej z układu można obliczyć ze wzoru:
gdzie:
RV = usunięcie badanej substancji chemicznej poprzez ulatnianie się w badaniu biologicznym (%),
SV = badana substancja chemiczna zgromadzona w pułapce w badaniu biologicznym, wyrażona jako ekwiwalent stężenia w płynnym wcieku (mg/l),
SI = stężenie badanej substancji chemicznej we wcieku (mg/l).
c) W badaniu biologicznym udział procentowy (RT) usunięcia badanej substancji chemicznej we wszystkich procesach jest wyliczany ze wzoru:
gdzie:
SE = stężenie badanej substancji chemicznej w (płynnym) odpływie (mg/l).
d) Stąd też udział procentowy (RBA) usunięty poprzez biodegradację z adsorpcją można obliczyć ze wzoru:
RBA = (RT - RV)
Oddzielne badania należy przeprowadzić w celu określenia, czy badana substancja chemiczna podlega adsorpcji; jeśli tak, można dokonać dalszej korekty.
e) Porównanie pomiędzy proporcjami badanej substancji chemicznej usuniętej w układach badania biologicznego (RV) i niebiologicznego (RVP) wskazuje ogólny wpływ oczyszczania biologicznego na emisję badanej substancji chemicznej do atmosfery.
Przykład: benzen
Czas retencji osadu = 4 dni
Ściek syntetyczny; czas retencji = 8 h
SIP = SI= 150 mg/l
SVP = 150 mg/l (SEP = 0)
SV = 22,5 mg/l
SE = 50 μg/l
Stąd:
RVP = 100 %, RV = 15 %
RT = 100 % a RBA = 85 %.
Przyjęto, że benzen nie ulega adsorpcji na osadzie.
BIBLIOGRAFIA
(1) Horn JA, Moyer JE, Hale JH (1970). Biological degradation of tertiary butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854.
(2) Pitter P, Chudoba J (1990). Biodegradability of organic substances in the aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.
(3) Stover EL, Kincannon DF (1983). Biological treatability of specific organic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. Control Fed. 55: 97.
(4) ISO 10634 (1995) Jakość wody - Wytyczne dotyczące przygotowania i obróbki słabo rozpuszczalnych związków organicznych w celu oceny ich biodegradacji w środowisku wodnym.
(5) Rozdział C.4 niniejszego załącznika. Oznaczenie szybkiej biodegradowalności.
Dodatek 6
Wpływ czasu retencji osadu (CRO) na podatność substancji chemicznych na oczyszczanie
WPROWADZENIE
1. Metodę opisaną w głównej części tekstu stworzono w celu potwierdzenia, czy badane substancje chemiczne (zazwyczaj takie, o których wiadomo, że są zasadniczo biodegradowalne, ale nie ulegają szybkiej biodegradacji) mogą ulec biodegradacji w granicach nakładanych przez oczyszczalnie ścieków. Wyniki podawane są w postaci procentowej wartości usunięcia i procentowej wartości biodegradacji. Warunki działania zestawów osadu czynnego i wybór wcieku pozwalają na występowanie dość szerokiego zakresu stężeń badanej substancji chemicznej w odpływie. Badania przeprowadzane są tylko dla jednego stężenia nominalnego osadu stałego lub w odniesieniu do jednego czasu retencji osadu (CRO), a opisane schematy degradacji osadu mogą spowodować, że wartość CRO będzie ulegać znacznym zmianom w trakcie badania, zarówno w odniesieniu do wartości z kolejnych dni, jak i różnych wartości z tego samego dnia.
2. W tym wariancie (1) (2) CRO jest kontrolowany w znacznie węższych ramach przez 24 h (tak jak dzieje się to na dużą skalę), co powoduje bardziej stałe stężenie w odpływach. Zalecane są ścieki domowe, ponieważ dają bardziej spójne i wyższe wartości procentowe usunięcia. Ponadto bada się wpływ szeregu wartości CRO i w bardziej szczegółowym badaniu można określić wpływ różnych temperatur na stężenie odpływu.
3. Nie ma zgody co do tego, jakie modele kinetyczne mają zastosowanie w sytuacji, kiedy substancje chemiczne ulegają biodegradacji w warunkach oczyszczania ścieków. Wybrano zastosowanie modelu Monoda wzrostu bakterii i użycia substratu (1) (2) do zgromadzonych danych, ponieważ metoda ta miała być stosowana tylko do substancji chemicznych produkowanych w dużych ilościach, co skutkuje stężeniami w ściekach powyżej 1 mg/l. Ważność modelu uproszczonego i poczynionych założeń stwierdzono wykorzystując szereg związków oksyetylenowanych o różnych stopniach biodegradowalności pierwotnej (2) (3).
Uwaga: Ten wariant metody jest zgodny z większością tekstu dotyczącego tej metody badawczej C.10-A, zaś poniżej podano wyłącznie te aspekty, które są odmienne.
ZASADA BADANIA
4. Zestawy osadu czynnego z naczyniami porowatymi, które mają za zadanie ułatwienie (niemal) ciągłego wytracania mieszanego płynu, pozwalają na bardzo dokładną kontrolę czasu retencji osadu (CRO lub θs), działają w trybie niepołączonym w odniesieniu do szerokiego zakresu czasów retencji osadu oraz, opcjonalnie, w różnych temperaturach. Czas retencji wynosi zazwyczaj od 2 do 10 dni, a temperatura od 5 do 20 °C. Ścieki, najlepiej ścieki domowe, oraz roztwór badanej substancji chemicznej dawkowane są osobno do zestawów w tempie umożliwiającym otrzymanie wymaganego czasu retencji (3 do 6 godzin) oraz wymaganego stężenia badanej substancji chemicznej we wcieku. Równocześnie, dla celów porównawczych, działają zestawy kontrolne, które nie otrzymują badanej substancji chemicznej.
5. Możliwe jest wykorzystanie innego typu przyrządów, jednak należy zachować szczególną ostrożność, by zapewnić odpowiednią kontrolę CRO. Przykładowo, przy wykorzystywaniu instalacji obejmujących odstojnik konieczne może okazać się uwzględnienie utraty części stałych z odpływu z instalacji. Ponadto należy podjąć specjalne środki ostrożności w celu uniknięcia błędów wynikających ze zmiany ilości osadu w odstojniku.
6. Zestawy pracują w określonych układach warunków i po osiągnięciu równowagi przez około trzy tygodnie uzyskuje się średnie stężenia w stanie ustalonym badanej substancji chemicznej w odpływach i - opcjonalnie - DOC. Oprócz oceniania wartości procentowej usunięcia badanej substancji chemicznej i - opcjonalnie - DOC, przedstawia się w formie graficznej stosunek pomiędzy warunkami działania instalacji a stężeniem w odpływie. Na podstawie tego można obliczyć próbne stałe kinetyczne oraz przewidzieć warunki, w jakich badana substancja chemiczna może być oczyszczana.
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ
7. Zastosowanie ma rozdział C.10 A, pkt 12 i 13.
POZIOMY PROGOWE
8. Zastosowanie ma rozdział C.10 A, pkt 14 i 15.
BADANE SUBSTANCJE ODNIESIENIA
9. Zastosowanie ma rozdział C.10 A, pkt 16.
ODTWARZALNOŚĆ WYNIKÓW BADAŃ
10. Zastosowanie ma rozdział C.10 A, pkt 17 i 18.
OPIS METODY
Przyrząd
11. Odpowiednim zestawem jest zmodyfikowany układ naczyń porowatych (dodatek 6.1). Składa się z naczynia wewnętrznego (wkładki) z porowatego polipropylenu o grubości 3,2 mm i maksymalnej średnicy porów 90 μm, w którym złącze jest zgrzane doczołowo. (Powoduje to, że zestaw jest trwalszy niż ten opisany w pkt 21 niniejszego rozdziału, C.10 A). Wkładka umieszczona jest w nieprzepuszczalnym polietylenowym naczyniu zewnętrznym, które składa się z dwóch części: okrągłej podstawy, w której wywiercono otwory w celu zamocowania dwóch linii powietrznych i jednej linii usuwania osadu oraz górnego cylindra, który przykręcony jest do podstawy i którego wylot umieszczony jest w takim miejscu, by wskazywał znaną ilość (3 l) w naczyniu porowatym. Jedna z linii powietrznych wyposażona jest w kamień napowietrzający, a druga ma otwarte zakończenie i jest usytuowana pod kątem prostym do kamienia w naczyniu. Układ ten powoduje powstanie wystarczających turbulencji, by zapewnić, że zawartość naczynia jest całkowicie wymieszana oraz utrzymać stężenie rozpuszczonego tlenu na poziomie większym niż 2 mg/l.
12. Odpowiednią liczbę zestawów utrzymuje się w kontrolowanych temperaturach w zakresie od 5 do 20 °C (± 1 °C), w kąpieli wodnej lub w pomieszczeniach o stałej temperaturze. Do dawkowania do naczyń napowietrzających roztworu badanej substancji chemicznej oraz osadzonych ścieków w wymaganym tempie (odpowiednio 0-1,0 ml/min i 0-25 ml/min) potrzebne są pompy; trzecia pompa konieczna jest do usuwania osadu odpadowego z naczyń napowietrzających. Niezbędne bardzo wolne tempo przepływu osadu odpadowego osiąga się dzięki zastosowaniu pompy ustawionej na wyższą wartość i uruchamianej z przerwami wyłącznikiem czasowym, np. działającej przez 10 sekund na minutę; szybkość podawania 3 ml/min daje tempo degradacji 0,5 ml/min.
Przyrząd do filtrowania lub wirówka
13. Zastosowanie ma rozdział C.10 A, pkt 23.
Sprzęt do wykonywania analiz
14. Zastosowanie ma rozdział C.10 A, pkt 24.
Woda
15. Zastosowanie ma rozdział C.10 A, pkt 25 i 26.
Pożywka organiczna
16. Zastosowanie ma rozdział C.10 A, pkt 27.
Ścieki syntetyczne
17. Zastosowanie ma rozdział C.10 A, pkt 28.
Ścieki domowe
18. Zastosowanie ma rozdział C.10 A, pkt 29.
Osad czynny
19. Zastosowanie ma rozdział C.10 A, pkt 30.
Roztwory podstawowe badanej substancji chemicznej
20. Zastosowanie ma rozdział C.10 A, pkt 31 i 32.
PROCEDURA Przygotowanie inokulum
21. Zastosowanie ma rozdział C.10 A, pkt 34 - należy zastosować osad czynny (ok. 2,5 g/l).
Liczba zestawów badawczych
22. Do przeprowadzenia prostego testu, tzn. zmierzenia wartości procentowej usunięcia, potrzebna jest tylko jedna wartość CRO, ale do tego, by uzyskać dane potrzebne do wyliczenia próbnych stałych kinetycznych, konieczne jest 4 lub 5 wartości CRO. Wybiera się zazwyczaj wartości pomiędzy 2 a 10 dni. Z praktycznego punktu widzenia wygodne jest przeprowadzenie badania na 4 lub 5 CRO jednocześnie w jednej temperaturze; w rozszerzonych badaniach te same wartości CRO, lub inny zakres wartości, wykorzystuje się w innych temperaturach w zakresie od 5 do 20 °C. W przypadku pierwotnej biodegradacji (główne zastosowanie) konieczny jest zazwyczaj tylko jeden zestaw badawczy na jeden układ warunków. Jednakże do zbadania ostatecznej biodegradowalności potrzebny jest zestaw kontrolny do każdego układu warunków; do zestawu tego dodaje się ścieki, ale bez badanej substancji chemicznej. Jeśli zakłada się obecność badanej substancji chemicznej w używanych ściekach, konieczne jest zastosowanie zestawów kontrolnych przy ocenie pierwotnej biodegradacji i dokonanie właściwych korekt w obliczeniach.
Dawkowanie pożywki organicznej i badanej substancji chemicznej
23. Zastosowanie ma rozdział C10 A, pkt 36-39, jednak należy zauważyć, że roztwór badanej substancji chemicznej jest dawkowany osobno i że stosuje się różne współczynniki degradacji osadu. Należy również często, np. dwa razy dziennie, monitorować i w miarę potrzeby korygować - do ± 10 % - przepływ wcieku, odpływu i degradacji osadu. W przypadku wystąpienia trudności w stosowaniu metod analitycznych przy wykorzystywaniu ścieków domowych badanie należy przeprowadzić z wykorzystaniem ścieków syntetycznych, ale należy dopilnować, by różne media dawały porównywalne dane kinetyczne.
Postępowanie z zestawami osadu czynnego
24. Zastosowanie ma rozdział C10 A, pkt 40-43, ale CRO należy kontrolować tylko poprzez "stałą" degradację osadu.
Pobieranie próbek i analiza
25. Zastosowanie ma rozdział C10 A, pkt 44-50, z tą różnicą, że należy określić stężenie badanej substancji chemicznej, a określenie DOC jest opcjonalne; nie należy stosować ChZT.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Opracowanie wyników
26. Zastosowanie ma rozdział C10 A, pkt 52-54.
Prezentacja wyników badania
27. Zastosowanie ma rozdział C10 A, pkt 56-62.
Obliczenie stałych kinetycznych
28. Podanie średniego stężenia plateau badanej substancji chemicznej w odpływie i opisanie, jak zmienia się ono wraz z warunkami działania instalacji, jest bardziej realistycznym rozwiązaniem niż podawanie procentowej biodegradacji pierwotnej. Można tego dokonać stosując równanie (6) z dodatku 6.2, które daje wartości KS, μ m oraz SC -krytyczną wartość czasu retencji osadu.
(Alternatywnie można otrzymać przybliżone wartości KS i μm, stosując prosty program komputerowy dostosowujący teoretyczną krzywą wyliczoną z równania 2 (dodatek 6.2) do otrzymanych wartości eksperymentalnych. Mimo że żadne rozwiązanie nie będzie unikalne, można uzyskać rozsądne przybliżenie wartości KS i μm).
Zmienność wyników
29. Powszechnie zdarza się uzyskiwanie zmiennych wartości parametrów kinetycznych poszczególnych substancji chemicznych. Uważa się, że warunki, w jakich hodowany był osad, a także warunki występujące w trakcie badania (tak jak w pkt 5 i innych badaniach) mają duży wpływ na ostateczne wyniki. Jeden z aspektów tej zmienności omówili Grady i in. (4), którzy zasugerowali, że terminy "zastany" i "swoisty" powinny być stosowane do dwóch skrajnych warunków odpowiadających wartościom granicznym stanu fizjologicznego, który kultura może osiągnąć w trakcie eksperymentu kinetycznego. Jeśli stan ten nie może zmienić się w trakcie badania, wartości parametru kinetycznego odzwierciedlają warunki w środowisku, z którego pobrano mikroorganizmy; warunki te zwane są "zastanymi" lub obecnie istniejącymi. Z kolei w odwrotnej sytuacji, jeśli warunki badania zezwalają na pełny rozwój systemu syntetyzowania białka dopuszczając maksymalne możliwe tempo wzrostu, otrzymane parametry kinetyczne określa się jako "swoiste" i są one zależne tylko od charakteru substratu i typów bakterii w kulturze. Wartości zastane uzyskuje się poprzez utrzymanie stosunku stężenia substratu do właściwych mikroorganizmów (So/Xo) na poziomie niskim, np. 0,025, zaś wartości swoiste powstają, kiedy stosunek ten jest wysoki i wynosi np. co najmniej 20. W obydwu przypadkach So powinno być równe odpowiedniej wartości Ks - stałej półnasycenia - lub ją przekraczać.
30. Zmienność i inne aspekty kinetyki biodegradacji omawiano podczas ostatniego warsztatu SETAC (5). Dzięki takim badaniom, przeprowadzonym i planowanym, powinno być niedługo możliwe osiągnięcie jaśniejszego obrazu kinetyki w oczyszczalniach ścieków, co umożliwi lepszą interpretację istniejących badań oraz zasugeruje lepsze rozwiązania w przyszłych metodach badawczych.
BIBLIOGRAFIA:
(1) Birch RR (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII Jornado Com. Espanol. Deterg. 33-48.
(2) Birch RR (1984). Biodegradation of noniomic surfactants. J.A.O.C.S. 61(2): 340-343.
(3) Birch RR (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during sewage treatment. J. Chem. Tech. Biotechnol. 50: 411-422.
(4) Grady CPL, Smets BF and Barbeau DS (1996). Variability in kinetic parameter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology. Wat. Res. 30 (3): 742-748.
(5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Warsztat w Port Sunlight, UK. [red.] Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, Verstraete W. 4-6.9.1996. SETAC-Europa, Bruksela.
Dodatek 6.1
Naczynie porowate z kontrolą CRO
Dodatek 6.2
Obliczanie stał ych kinetycznych
1. Zakładając zastosowanie kinetyki Monoda i bilansu masy aktywnych części stałych i substratów w całym układzie z osadem czynnym (1), otrzymać można następujące stany ustalone:
[1]
albo
[2]
gdzie:
S1 = stężenie substratu w odpływie (mg/l),
KS = stała półnasycenia, przy którym stężenie μ = μ m/2 (mg/l),
μ = właściwa szybkość wzrostu (d-1),
μm = maksymalna wartość μ m(d-1),
Kd = właściwa szybkość rozpadu czynnych części stałych (d-1),
s = średni czas retencji osadu, CRO (d).
Zbadanie tego równania prowadzi do następujących wniosków:
(i) Stężenie w odpływie jest niezależne od stężenia we wcieku (S0); dlatego też wartość procentowa biodegradacji zmienia się wraz ze zmianą stężenia we wcieku, S0.
(ii) Jedynym parametrem kontroli instalacji mającym wpływ na S1 jest czas retencji osadu, θS.
(iii) Przy danym stężeniu we wcieku, S0, wystąpi krytyczny czas retencji osadu, taki że:
[3]
gdzie:
SC = krytyczny czas retencji osadu, poniżej którego właściwe mikroorganizmy będą wypłukiwane z instalacji.
(iv) Ponieważ inne parametry równania (2) są powiązane z kinetyką wzrostu, temperatura może mieć wpływ na poziom substratu w odpływie i krytyczny wiek osadu, tzn. czas retencji osadu potrzebny do otrzymania określonego poziomu oczyszczania wzrośnie wraz ze spadkiem temperatury.
2. Przy bilansie masy części stałych w układzie naczyń porowatych i zakładając, że stężenie części stałych w odpływie z instalacji, X2, jest niskie w porównaniu ze stężeniem w naczyniu napowietrzającym, X1, czas retencji osadu wynosi:
[4]
oraz
gdzie:
V = objętość naczynia napowietrzającego (l),
X1 = stężenie części stałych w naczyniu napowietrzającym (mg/l),
X2 = stężenie części stałych w odpływie, (mg/l),
Q0 = natężenie przepływu wcieku (l/d),
Q1 = natężenie przepływu osadu odpadowego (l/d).
Dlatego też możliwe jest kontrolowanie czasu retencji osadu przy dowolnej wstępnie wybranej wartości poprzez kontrolę natężenia przepływu osadu odpadowego, Q1.
Wnioski
3. Głównym celem badania jest przewidywanie stężenia odpływu, a dzięki temu poziomu badanej substancji chemicznej w odbiornikach wodnych.
4. Dzięki wykreśleniu S1 względem θS możliwe jest czasem szybkie oszacowanie krytycznego czasu retencji osadu θSC, np. krzywa 3 na rysunku 1. Jeśli nie jest to możliwe, można obliczyć θSC, wraz z przybliżonym wartościami μ m i KS, dzięki wykreśleniu S1 względem S1θS.
Przekształcenie równania (1) daje
[5]
Jeśli Kd jest małe, wówczas 1 + s Kd ~ 1 i [5] staje się:
[6]
Stąd też wykres powinien być linią prostą (zob. rysunek 2) o nachyleniu 1/μ m i punkcie przecięcia KS/ μ m; tak więc s ~1/μm.
Rysunek 1
Trzy temperatury; pięć CRO
Rysunek 2
Linia regresji CRO S1 vs S1 przy T = 5 °C
Glosariusz:
Stężenie odpływu
Krzywa
Dodatek 7
BADANIE PRZY NISKIM (μg/l) ZAKRESIE STĘŻEŃ
1. Wiele substancji chemicznych obecnych jest normalnie w środowisku wodnym, nawet w ściekach, w bardzo niskich stężeniach (rzędu μg/l). Przy takich stężeniach raczej nie odgrywają one roli podstawowych substratów wzrostowych -bardziej prawdopodobne jest, że ulegną degradacji jako substraty niewzrostowe, drugorzędne, równoległe wobec różnorodnych naturalnie występujących substancji chemicznych zawierających węgiel. Dlatego też degradacja takich substancji chemicznych nie będzie odpowiadała modelowi opisanemu w dodatku 6. Istnieje wiele modeli, które można zastosować, a w warunkach występujących powszechnie w oczyszczalniach ścieków jednocześnie może działać ich kilka. Do wyjaśnienia tego zagadnienia potrzeba znacznie więcej badań.
2. Tymczasem można stosować procedurę podaną w głównym tekście (rozdział C10 A), ale tylko do biodegradowalności pierwotnej, wykorzystując odpowiednio niskie stężenia (< 100 μg/l) oraz zwalidowaną procedurę analityczną. Wartość procentową biodegradacji można obliczyć (zob. pkt 54 metody badawczej) pod warunkiem że uwzględni się procesy abiotyczne (adsorpcję, lotność itp.). Przykładem jest tu badanie przeprowadzone przez Nyholma i jego współpracowników (1) (2), w którym wykorzystano 4-godzinny cykl w systemie sekwencyjnego reaktora biologicznego. Poinformowali oni o uzyskaniu stałych szybkości reakcji pseudopierwszego rzędu w odniesieniu do 5 substancji chemicznych dodanych do ścieków syntetycznych w stężeniu między 5 a 100 μg/l. (W odniesieniu do biodegradowalności ostatecznej można zastosować badane substancje chemiczne znakowane izotopem 14C. Opis tego procesu wychodzi poza zakres niniejszej metody badawczej, ponieważ nie istnieją jeszcze żadne ustalone procedury, choć metoda zaproponowana dla ISO 14592 (3) zawiera wskazówki co do stosowania substancji chemicznych znakowanych izotopem 14C.
Badanie SCAS
3. Później zaproponowano prostsze badanie dwuetapowe (4) (5) (6); po realizacji metody półciągłego osadu czynnego (SCAS) następują krótkie badania kinetyczne próbek pobranych z zestawów SCAS. Układ SCAS działa przy znanych współczynnikach ubytku osadu (w przeciwieństwie do pierwotnej metody badawczej C12) i wykorzystuje zmodyfikowane ścieki syntetyczne OECD lub ścieki domowe. Ścieki syntetyczne zostały zmodyfikowane (z powodu zmiennej wartości pH oraz słabej sedymentacji osadu) poprzez dodanie fosforanu jako bufora, wyciągu z drożdży, chlorku żelaza(III) i soli pierwiastków śladowych, a ich ChZT zwiększono do ok. 750 mg/l dzięki podniesieniu stężenia peptonu i ekstraktu mięsa. Zestawy działały w cyklu 24-godzinnym: napowietrzanie przez 23 h, ubytek osadu, sedymentacja, usuwanie supernatantu (odpływu) i dodanie ścieków syntetycznych z badaną substancją chemiczną, do 100 μg/l (tzn. mniej więcej w tym samym stężeniu co stosowane w badaniu krótkoterminowym). Raz w tygodniu 10 % całości osadu wymieniano na świeży osad w celu utrzymania równowagi populacji bakterii.
4. Dokonuje się pomiarów stężeń badanej substancji chemicznej na początku i końcu napowietrzania, a badanie prowadzi się do momentu, kiedy osiągnięte zostanie stały poziom usuwania badanej substancji chemicznej; zajmuje to od jednego tygodnia do kilku miesięcy.
Badanie krótkoterminowe
5. Badanie krótkoterminowe (trwające ok. 8 godzin) stosuje się w celu określenia stałej szybkości reakcji (pseudo)pierwszego rzędu w odniesieniu do rozpadu badanej substancji chemicznej w osadzie czynnym o znanym, ale różnym pochodzeniu i historii. Próbki osadu pobierane są w szczególności z reaktorów SCAS - na koniec okresu napowietrzania, kiedy stężenie substratu organicznego jest niskie - w trakcie trwania eksperymentu aklimatyzacji (pkt 3, 4). Dla porównania osad może być również pobierany z równoległego zestawu SCAS bez badanej substancji chemicznej. Mieszaniny osadu i badanej substancji chemicznej dodawane w co najmniej dwóch stężeniach w zakresie 1-50 μg/l są napowietrzane, bez dodatku ścieków syntetycznych czy innych substratów organicznych. Badana substancja chemiczna pozostająca w roztworze jest oznaczana w regularnych, np. godzinnych, odstępach w oparciu o degradowalność substancji chemicznej, przez okres nie dłuższy niż 24 h. Przed właściwą analizą próbki są odwirowywane.
Obliczenia
6. Dane z zestawów SCAS są wykorzystywane do obliczenia wartości procentowej usunięcia (pkt 54). Tak więc średnią stałą szybkości reakcji, K1 (normalizowaną w odniesieniu do stężeń zawiesin) można obliczyć z:
gdzie:
t = czas napowietrzania (23 h),
Ce = stężenie pod koniec etapu napowietrzania (μg/l),
Ci = stężenie na początku etapu napowietrzania (μg/l),
SS = stężenie fazy stałej osadu czynnego (g/l).
7. W badaniu krótkoterminowym log % pozostałego stężenia jest wykreślany względem czasu, a nachylenie wstępnej części (10-50 % degradacji) wykresu jest równoważne K1, stałej szybkości reakcji (pseudo)pierwszego rzędu. Stała jest normalizowana w odniesieniu do stężenia fazy stałej osadu poprzez podzielenie nachylenia przez stężenie fazy stałej. Podawany wynik musi również obejmować szczegółowe informacje na temat wstępnego stężenia badanej substancji chemicznej i zawiesin, czasu retencji osadu, podawania i źródła osadu, a także szczegółowe informacje o wstępnym narażeniu na działanie badanej substancji chemicznej (o ile takie narażenie miało miejsce).
Zmienność wyników
8. Zmienność i inne aspekty kinetyki biodegradacji omawiano podczas ostatniego warsztatu SETAC (7). Dzięki takim badaniom, przeprowadzonym i planowanym, niedługo możliwe będzie lepsze zrozumienie kinetyki w oczyszczalniach ścieków, co umożliwi lepszą interpretację istniejących badań oraz zasugeruje lepsze rozwiązania w przyszłych metodach badawczych.
BIBLIOGRAFIA
(1) Nyholm N, Jacobsen BN, Pedersen BM, Poulsen O, Dambourg A i Schultz B (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge reactors. Biodegradability. Wat. Res. 26: 339-353.
(2) Jacobsen BN, Nyholm N, Pedersen BM, Poulsen O, i Ostfeldt P (1993). Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors under various operating conditions: Sorption. Wat. Res. 27: 1505-1510.
(3) ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality - Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations in water.
(4) Nyholm N, Ingerslev F, Berg UT, Pedersen JP i Frimer-Larsen H (1996). Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in activated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations Chemosphere 33 (5): 851-864.
(5) Berg UT i Nyholm N (1996). Biodegradability simulation Studies in semi-continuous activated sludge reactors with low (μg/l range) and standard (ppm range) chemical concentrations. Chemosphere 33 (4): 711-735.
(6) Agencja Ochrony Środowiska Danii. (1996). Activated sludge biodegradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, UT. Ingerslev, F. Ministerstwo Środowiska i Energii, Kopenhaga.
(7) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision making (1997). Warsztat w Port Sunlight, UK. [red.] Hales SG, Feitjel T, King H, Fox K, i Verstraete W. 4-6.9.1996. SETAC-Europa, Bruksela.
C.10-B: Biofilmy
WPROWADZENIE
1. Badania symulacyjne zwykle stosuje się w przypadku chemikaliów, które nie przeszły badania przesiewowego szybkiej biodegradowalności (rozdział C.4 A do F niniejszego załącznika (9)), przeszły natomiast z powodzeniem badanie potencjalnej biodegradowalności. W drodze wyjątku badania symulacyjne stosuje się także do każdej substancji chemicznej, o której trzeba uzyskać więcej informacji, zwłaszcza chemikaliów o dużej wielkości obrotu. Wówczas zwykle stosuje się badanie osadu czynnego (C.10 A). W niektórych okolicznościach niezbędne są jednak konkretne informacje dotyczące zachowania substancji chemicznej w odpowiedzi na zastosowanie metod oczyszczania ścieków wykorzystujących biofilmy czyli złóż zraszanych, obrotowych filtrów biologicznych, złóż fluidalnych. Aby spełnić to zapotrzebowanie, opracowano różne urządzenia.
2. Gerike et al. (1) w ramach projektów pilotażowych zastosowali na dużą skalę złoża zraszane, stosowane w trybie zespolonym. Złoża te zajmowały dużo miejsca i wymagały stosunkowo dużych objętości ścieków lub ścieków syntetycznych. Truesdale et al. (2) opisali mniejsze złoża (ok. 1,8 m × 15 cm średnicy), które zasilano ściekami naturalnymi wolnymi od środków powierzchniowo czynnych, wymagające wciąż raczej dużych objętości ścieków. Aż 14 tygodni zajął rozwój "dojrzałego" biofilmu, a po pierwszym wprowadzeniu poddanego badaniu środka powierzchniowo czynnego potrzeba było kolejnych 4-8 tygodni, by nastąpiło przystosowanie.
3. Baumann et al. (3) zaprojektowali znacznie mniejsze złoże, w którym wykorzystali "wełnę" poliestrową zanurzoną uprzednio w osadzie czynnym jako chemicznie obojętną pożywkę wspomagającą biofilm. Substancja badana została zastosowana jako wyłączne źródło węgla, a biodegradowalność oceniano na podstawie pomiarów rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) we wcieku i odpływie oraz ilości CO2 w gazie uchodzącym.
4. Gloyna et al. (4) zastosowali całkowicie inną metodę w wynalezionym przez nich obrotowym reaktorze rurowym. Na wewnętrznej powierzchni obracającej się rury, nachylonej pod niewielkim kątem w stosunku do poziomu, na znanej części powierzchni wywołano przyrost biofilmu poprzez przepływ wcieku wprowadzanego do rury od strony uniesionego końca. Reaktor stosowano do badania biodegradowalności środków powierzchniowo czynnych (5), a także do badania optymalnej grubości biofilmu i rozproszenia przez biofilm (6). Wyżej wymienieni autorzy udoskonalili projekt reaktora, wprowadzając do niego zmianę, dzięki której można ustalić zawartość CO2 w gazie uchodzącym.
5. Obrotowy reaktor rurowy został przyjęty przez Stały Komitet Analityków (w Zjednoczonym Królestwie) jako standardowa metoda oceny zarówno biodegradowalności chemikaliów (7), jak i możliwości oczyszczenia ścieków oraz ich toksyczności (8). Opisana tu metoda ma liczne zalety, w tym: prostotę, niewielki rozmiar, odtwarzalność oraz zapotrzebowanie na stosunkowo niewielkie ilości pożywki organicznej.
ZASADA BADANIA
6. Na wewnętrzną powierzchnię wolno obracającej się nachylonej rury podaje się ścieki domowe lub syntetyczne oraz badaną substancję chemiczną, zawartą w mieszaninie lub osobno. Na wewnętrznej powierzchni rury tworzy się warstewka drobnoustrojów podobnych do tych występujących w biofiltrach. Warunki działania reaktora dobiera się pod kątem odpowiedniej eliminacji materii organicznej oraz, w miarę potrzeby, utleniania amoniaku.
7. Odpływ z rury jest zbierany i osadzany albo filtrowany przed analizą pod kątem rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) lub badanej substancji chemicznej określoną metodą. Zestawy kontrolne nieotrzymujące badanej substancji chemicznej działają równolegle w tych samych warunkach dla celów porównania. Przyjmuje się, że różnica pomiędzy stężeniami DOC w odpływach z zestawów badawczych i zestawów kontrolnych wynika z działania badanej substancji chemicznej lub jej organicznych metabolitów. Różnicę tę porównuje się ze stężeniem we wcieku wprowadzonej badanej substancji chemicznej (na podstawie DOC) w celu obliczenia poziomu eliminacji badanej substancji chemicznej.
8. Biodegradację można przeważnie odróżnić od bioadsorpcji przez staranne badanie krzywej czasu eliminacji. Potwierdzenie uzyskać można zazwyczaj poprzez zastosowanie badania szybkiej biodegradacji (pobór tlenu lub wytwarzanie dwutlenku węgla) z użyciem aklimatyzowanego inokulum pobranego na końcu badania z reaktorów otrzymujących badaną substancję chemiczną.
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ
9. Właściwości badanej substancji chemicznej związane z czystością, rozpuszczalnością w wodzie, lotnością i adsorpcją powinny być znane, tak aby możliwa była prawidłowa interpretacja wyników.
10. Zwykle nie jest możliwe badanie lotnych ani słaboro zpuszczalnych chemikaliów, chyba że podjęte zostaną szczególne środki ostrożności (zob. dodatek 5 do rozdziału C.10 A). Należy również znać strukturę chemiczną, a przynajmniej wzór empiryczny, tak aby można było obliczyć wartości teoretyczne lub sprawdzić zmierzone wartości parametrów, np. teoretyczne zapotrzebowanie na tlen (TZT) czy zawartość rozpuszczonego węgla organicznego (DOC).
11. Informacje na temat toksyczności badanej substancji chemicznej dla mikroorganizmów (zob. dodatek 4 do rozdziału C.10 A) mogą być bardzo użyteczne przy wyborze odpowiednich stężeń do badania i mogą być niezbędne dla prawidłowej interpretacji niskich wartości biodegradacji.
POZIOMY PROGOWE
12. Początkowo wymagano, by biodegradacja pierwotna środków powierzchniowo czynnych dochodziła do 80 % lub więcej, nim substancja chemiczna mogła zostać wprowadzona do obrotu. Jeśli poziom 80 % nie zostanie osiągnięty, można zastosować badanie symulacyjne (potwierdzające), a środek powierzchniowo czynny można wprowadzić na rynek wyłącznie, jeśli ponad 90 % danej substancji chemicznej zostanie usunięte. Ogólnie w przypadku substancji chemicznych nie mówi się o przejściu z powodzeniem/bez powodzenia badania, a uzyskana wartość procentowa usunięcia może zostać wykorzystana w aproksymacji prawdopodobnego stężenia w środowisku stosowanej przy ocenach zagrożenia stwarzanego przez substancje chemiczne. W wielu badaniach czystych substancji chemicznych w przypadku ponad trzech czwartych substancji stwierdzono wartość procentową usunięcia DOC na poziomie > 90 %, a dla ponad 90 % substancji chemicznych, które wykazywały jakikolwiek znaczący poziom biodegradowalności, wartość ta wynosiła > 80 %.
SUBSTANCJE ODNIESIENIA
13. Dla prawidłowego przeprowadzenia procedury doświadczalnej warto od czasu do czasu, wraz z substancjami badanymi, testować substancje odniesienia, których zachowanie jest znane. Substancje takie to na przykład kwas adypinowy, 2-fenylofenol, 1-naftol, kwas 2,2'-bifenylodikarboksylowy, kwas 1-naftalenokarboksylowy.
ODTWARZALNOŚĆ WYNIKÓW BADAŃ
14. W laboratorium w Wielkiej Brytanii stwierdzono, że względne odchylenie standardowe w badaniach wynosiło 3,5 %, a między badaniami 5 % (7).
OPIS METODY
Przyrząd
Obrotowe reaktory rurowe
15. Przyrząd (zob. rysunki 1 i 2 w dodatku 8) składa się z baterii rur akrylowych o długości 30,5 cm każda i o średnicy wewnętrznej 5 cm, opartych na kołach o gumowanych brzegach, umieszczonych w metalowej oprawie. Każda rura posiada kołnierz zewnętrzny o szerokości ok. 0,5 cm do podtrzymania jej na kołach, jej powierzchnia wewnętrzna jest zarysowana przy użyciu druciaka, od strony uniesionego końca (służącego do podawania materiału doprowadzanego) rura wyposażona jest w głęboki na 0,5 cm kołnierz wewnętrzny, służący do przytrzymania cieczy. Rury nachylone są pod kątem około jednego stopnia w stosunku do poziomu, aby uzyskać czas potrzebny na kontakt ze stosowaną w badaniu pożywką, wprowadzaną do czystej rury. Gumowane koła obracają się napędzane silnikiem o powolnych obrotach zmiennej prędkości. Temperatura rur kontrolowana jest przez ich instalację w pomieszczeniu o stałej temperaturze.
16. Dzięki zamknięciu każdego reaktora rurowego w nieco większej zamkniętej rurze i uszczelnienie połączeń przeciw wyciekom gazu, uchodzący gaz CO2 można było zebrać w roztworze alkalicznym w celu jego dalszego pomiaru (6).
17. Dobowy zapas pożywki organicznej, w stosownych przypadkach z dodatkiem badanej substancji chemicznej, przeznaczonej do podawania do każdej rury, umieszczono w 20-litrowym zbiorniku magazynującym (A) (zob. rysunek 2). W miarę potrzeby roztwór badanej substancji chemicznej może być dawkowany osobno. Przy dnie każdego zbiornika magazynującego znajduje się ujście, które jest podłączone przez odpowiednie złączki, np. wykonane z gumy silikonowej, przez pompę perystaltyczną (B), do szklanej lub akrylowej rury doprowadzającej, która wprowadzona jest na głębokość 2-4 cm do uniesionego końca nachylonej rury (służącego do podawania materiału doprowadzanego) (C). Pozwala się, by odpływ skapywał ze znajdujacego się niżej końca nachylonej rury do innego zbiornika magazynującego (D). Odpływ jest osadzany lub filtrowany przed analizą.
Przyrząd do filtrowania lub wirówka
18. Urządzenie do filtrowania próbek z filtrami membranowymi o odpowiedniej porowatności (nominalna średnica otworu 0,45 μm), które adsorbują organiczne substancje chemiczne i uwalniają węgiel organiczny w minimalnym stopniu. W przypadku stosowania filtrów uwalniających węgiel organiczny należy zmyć filtry dokładnie gorącą wodą w celu usunięcia wymywalnego węgla organicznego. Alternatywnie można zastosować wirówkę mogącą osiągnąć 40 000 m/s2.
19. Sprzęt do wykonywania analiz służący do oznaczenia:
- zawartości rozpuszczonego węgla organicznego (DOC), całkowitego węgla organicznego (TOC) lub chemicznego zapotrzebowania na tlen (ChZT),
- konkretnej substancji chemicznej (metodą HPLC, GC itp.), o ile jest to konieczne,
- pH, temperatury, kwasowości, zasadowości,
- amonu, azotynu i azotanu, jeśli badanie przeprowadzane jest w warunkach nitryfikacyjnych.
Woda
20. Woda wodociągowa, zawierająca mniej niż 3 mg/l DOC.
21. Woda destylowana lub dejonizowana, zawierająca mniej niż 2 mg/l DOC.
Pożywka organiczna
22. Jako pożywkę organiczną można stosować ścieki syntetyczne, ścieki domowe lub mieszaninę obydwu ich rodzajów. Wykazano, że zastosowanie wyłącznie ścieków domowych często skutkuje zwiększonym odsetkiem usuniętego DOC (w zestawach osadu czynnego), a nawet umożliwia biodegradację niektórych substancji chemicznych, które nie ulegają biodegradacji w przypadku zastosowania syntetycznych ścieków OECD. Dlatego też zaleca się stosowanie ścieków domowych. Należy zmierzyć stężenie DOC lub ChZT w każdej nowej partii pożywki organicznej. Kwasowość lub zasadowość pożywki organicznej powinna być znana. Pożywka może wymagać dodania odpowiedniego bufora (wodorowęglanu sodu lub wodorofosforanu potasu), jeżeli jej poziom kwasowości lub zasadowości jest niski, w celu utrzymania pH w reaktorze w trakcie badania na poziomie ok. 7,5 ± 0,5. Ilość dodawanego bufora oraz moment jego dodania należy określić indywidualnie dla każdego przypadku.
Ścieki syntetyczne
23. Rozpuścić w każdym litrze wody wodociągowej: pepton, 160 mg; ekstrakt mięsa, 110 mg; mocznik, 30 mg; fosforan dwupotasowy bezwodny (K2HPO4), 28 mg; chlorek sodu (NaCl), 7 mg; chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2.2H2O), 4 mg; siarczan magnezu siedmiowodny (Mg2SO4.7H2O), 2 mg. Ten ściek syntetyczny OECD stanowi przykład i daje średnie stężenie DOC we wcieku na poziomie ok. 100 mg/l. Alternatywnie można wykorzystać inne składy o zbliżonym stężeniu DOC, które bardziej odpowiadają prawdziwym ściekom. Taki ściek syntetyczny można przygotować w wodzie destylowanej w postaci skoncentrowanej i przechowywać w temperaturze ok. 1 °C przez maksymalnie jeden tydzień. W razie potrzeby należy go rozcieńczyć wodą wodociągową. (Ta pożywka nie jest satysfakcjonująca, np. stężenie azotu jest bardzo wysokie, a zawartość węgla dość niska, ale nie zaproponowano niczego lepszego poza ewentualnym dodaniem większej ilości fosforanu jako bufora i dodatkowego peptonu).
Ścieki domowe
24. Wykorzystać świeżo osadzone ścieki zbierane codziennie z oczyszczalni ścieków przyjmującej głównie ścieki domowe. Ścieki powinny być zbierane przed wstępną sedymentacją z przelewu wstępnego osadnika lub z materiału doprowadzanego do instalacji osadu czynnego i zasadniczo nie powinny zawierać cząsteczek gruboziarnistych. Ścieki można stosować po przechowywaniu ich przez kilka dni w temperaturze ok. 4 °C, po sprawdzeniu, czy poziom DOC (lub ChZT) nie zmniejszył się znacząco (tzn. o mniej niż 20 %) w trakcie przechowywania. Aby zmniejszyć zakłócenia w układzie, przed zastosowaniem należy skorygować DOC (lub ChZT) każdej nowej partii do odpowiedniej stałej wartości, np. poprzez rozcieńczenie wodą wodociągową.
Środek smarny
25. Do smarowania rolek pompy perystaltycznej można stosować glicerynę lub oliwę z oliwek. Obie substancje nadają się do użycia na rurkach z gumy silikonowej.
Roztwory podstawowe badanej substancji chemicznej
26. W przypadku substancji chemicznych o odpowiedniej rozpuszczalności przygotować roztwory podstawowe o właściwych stężeniach (np. 1 do 5 g/l) w wodzie dejonizowanej lub w części mineralnej ścieków syntetycznych. W przypadku nierozpuszczalnych substancji chemicznych, zob. dodatek 5 rozdziału C.10-A. Bez wprowadzenia modyfikacji do reaktorów rurowych (zob. pkt 16) metoda ta nie nadaje się do lotnych substancji chemicznych. Oznaczyć DOC i całkowity węgiel organiczny (TOC) roztworu podstawowego i powtórzyć pomiary przy każdej nowej partii. Jeśli różnica pomiędzy DOC a TOC jest większa niż 20 %, sprawdzić rozpuszczalność badanej substancji chemicznej w wodzie. Porównać DOC lub stężenie badanej substancji chemicznej, mierzone z użyciem swoistej metody analitycznej w roztworze podstawowym z wartością nominalną w celu stwierdzenia, czy odzysk jest wystarczający (zwykle można spodziewać się wartości > 90 %). Sprawdzić, w szczególności w przypadku dyspersji, czy można wykorzystać DOC jako parametr analityczny, czy też możliwe jest wyłącznie zastosowanie techniki analitycznej swoistej dla badanej substancji chemicznej. W przypadku dyspersji konieczne jest odwirowanie próbek. W każdej nowej partii zmierzyć DOC, ChZT lub badaną substancję chemiczną przy użyciu swoistej metody analitycznej.
27. Określić pH roztworu podstawowego. Wartości krańcowe wskazują, że dodanie substancji chemicznej może mieć wpływ na pH osadu czynnego w układzie badawczym. W takim przypadku w celu uzyskania pH o wartości 7 ± 0,5 należy zneutralizować roztwór podstawowy, dodając niewielkie ilości kwasu nieorganicznego lub zasady, ale unikając strącania badanej substancji chemicznej.
PROCEDURA
Przygotowanie pożywki organicznej do dozowania
28. Na początku i w trakcie trwania badania dopilnować, by pojemniki na wciek i odpływ oraz rury prowadzące ze zbiorników na wciek i do zbiorników na odpływ były dokładnie oczyszczone, aby usunąć przyrost mikroorganizmów.
29. Codziennie przygotować świeże ścieki syntetyczne (pkt 23) z substancji stałych lub ze skoncentrowanego roztworu podstawowego przez odpowiednie rozcieńczanie wodą wodociągową. Mierzyć potrzebną ilość w cylindrze i dodawać do czystego zbiornika na wciek. Do ścieków syntetycznych przed rozcieńczeniem należy także, w miarę potrzeb, dodać konieczną ilość roztworu podstawowego badanej substancji chemicznej lub substancji odniesienia. W przypadku gdy jest to wygodniejsze lub niezbędne dla uniknięcia strat badanej substancji chemicznej, przygotować oddzielny rozcieńczony roztwór badanej substancji chemicznej w osobnym zbiorniku i doprowadzać go do nachylonych rur za pośrednictwem innej pompy dozującej.
30. Alternatywnie, w miarę możliwości, należy stosować osadzone ścieki domowe (pkt 24) zbierane, o ile to możliwe, codziennie.
Praca obrotowych reaktorów rurowych
31. Do oceny jednej badanej substancji chemicznej potrzebne są dwa identyczne reaktory rurowe, instalowane w pomieszczeniu o stałej temperaturze zwykle 22 ± 2 °C.
32. Pompy perystaltyczne nastawić na podawanie do nachylonych rur, obracających się z prędkością 18 ± 2 obr./ min, pożywki organicznej w ilości 250 ± 25 ml/h (bez badanej substancji chemicznej). Do rur pompy stosować na początku oraz regularnie w trakcie badania środek smarny (pkt 25), aby zapewnić właściwe działanie i przedłużyć okres użytkowania rur.
33. Dostosować kąt nachylenia rur w stosunku do poziomu tak, by uzyskać czas przebywania materiału doprowadzanego w czystej rurze rzędu 125 ± 12,5 sek. Oszacować czas retencji przez dodanie do materiału doprowadzanego markera niebiologicznego (np. NaCl, chemicznie obojętnego barwnika): przyjmuje się, że czas, jaki zajmuje osiągnięcie najwyższego stężenia w odpływie, to średnia arytmetyczna czasu retencji (gdy występuje najgrubsza warstwa biofilmu, czas retencji może zwiększyć się do ok. 30 min).
34. Stwierdzono, że te współczynniki, prędkości i czasy dają odpowiedni poziom usuwania (> 80 %) DOC (lub ChZT) i wytwarzają nitryfikowany odpływ. Jeśli poziom usuwania jest niewystarczający lub jeśli ma być symulowane działanie konkretnej oczyszczalni ścieków, należy zmienić współczynnik przepływu. W tym drugim przypadku, dostosować współczynnik dozowania pożywki organicznej do poziomu, przy jakim działanie reaktora odpowiada działaniu danej oczyszczalni ścieków.
Inokulacja
35. Gdy stosowane są ścieki syntetyczne, do zapoczątkowania rozwoju mikroorganizmów może być wystarczająca inokulacja drogą powietrzną, w innym przypadku należy do materiału doprowadzanego przez 3 dni dodawać 1 ml/l osadzonych ścieków.
Pomiary
36. Należy w regularnych odstępach czasu sprawdzać, czy dawki i prędkość obrotowa mieszczą się w wymaganych granicach. Należy także mierzyć pH w odpływie, w szczególności gdy spodziewana jest nitryfikacja.
Pobieranie próbek i analiza
37. Metodę, schemat i częstotliwość pobierania próbek dobiera się tak, by były odpowiednie dla celu badania. Przykładowo należy pobrać jednorazową próbkę wcieku i odpływu lub pobierać próbki przez dłuższy okres np. 3-6 godzin. W pierwszym okresie, bez badanej substancji chemicznej, pobierać próbki dwa razy w tygodniu. Próbki należy przefiltrować przez membranę lub odwirować przy ok. 40 000 m/sek2 przez około 15 min (pkt 18). Przed filtrowaniem przez membranę może być konieczne osadzenie lub przefiltrowanie próbek przez filtr dla cząstek grubych. Oznaczyć DOC (lub ChZT) co najmniej w duplikacie oraz w miarę konieczności biologiczne zapotrzebowanie na tlen (BZT), amon, azotyn i azotan.
38. Wszystkie analizy należy przeprowadzać jak najszybciej po zebraniu i przygotowaniu próbek. Jeśli analizy muszą zostać odroczone, próbki należy przechowywać w temperaturze ok. 4 °C w ciemności, w pełnych i szczelnie zamkniętych butelkach. Jeśli próbki muszą być przechowywane przez ponad 48 h, należy zabezpieczyć je przez głębokie mrożenie, zakwaszenie lub dodanie odpowiedniej substancji toksycznej (np. 20 ml/l roztworu chlorku rtęci(II) o stężeniu 10 g/l). Zadbać, by technika zabezpieczenia nie miała wpływu na wyniki analizy.
Okres rozruchu
39. W tym okresie biofilm na powierzchni przyrasta, by osiągnąć optymalną grubość, co zwykle zajmuje około 2 tygodnie i raczej nie przekracza 6 tygodni. Poziom usuniętego DOC (lub ChZT) rośnie (pkt 44) i osiąga wartość plateau. Gdy osiągnięte zostaje plateau o podobnej wartości w obu rurach, jedna wybierana jest jako próbka kontrolna na pozostały czas badania, w którym ich działanie powinno pozostawać zbliżone.
Wprowadzenie badanej substancji chemicznej
40. Na tym etapie dodać badaną substancję chemiczną do drugiego reaktora w pożądanym stężeniu, zwykle 10-20 mg C/l. W próbie kontrolnej podaje się nadal samą pożywkę organiczną.
Okres przystosowania
41. Kontynuować dokonywanie analiz DOC (lub ChZT) dwa razy w tygodniu, a jeśli ma być oceniona biodegradowalność pierwotna, mierzyć także stężenie badanej substancji chemicznej z użyciem swoistej metody analitycznej. Po wprowadzeniu po raz pierwszy badanej substancji chemicznej należy przewidzieć okres od jednego do sześciu tygodni (lub dłużej w szczególnych warunkach) na przystosowanie. W przypadku gdy procent usunięcia badanej substancji (pkt 43-45) osiąga maksymalną wartość, należy uzyskać 12-15 ważnych wartości z fazy plateau przez okres około 3 tygodni w celu oceny średniej procentowej wartości usunięcia. Badanie uznaje się za ukończone, jeśli osiągnięty zostaje odpowiednio wysoki poziom eliminacji. Nie należy zwykle przekraczać 12 tygodni trwania badania po dodaniu badanej substancji chemicznej.
Usuwanie biofilmu
42. Względnie regularnie następuje nagłe usunięcie z rur, czy też złuszczanie się, nadmiaru filmu. W celu dopilnowania, by pozostało to bez wpływu na porównywalność wyników, należy przewidzieć co najmniej dwa pełne cykle przyrastania i złuszczania się.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Opracowanie wyników
43. Obliczyć wartość procentową eliminacji DOC (lub ChZT) badanej substancji chemicznej w odniesieniu do każdej oceny w czasie, stosując równanie:
Dt = 100 [Cs - (E - Eo)]/Cs %
gdzie:
Dt = procentowa eliminacja DOC (lub ChZT) w czasie t,
Cs = stężenie DOC (lub ChZT) we wcieku w wyniku działania badanej substacji chemicznej, najlepiej oszacowane ze stężenia oraz dodanej objętości roztworu podstawowego (mg/l),
E = mierzona wartość DOC (lub ChZT) w badanym odpływie w czasie t (mg/l), Eo = mierzona wartość DOC (lub ChZT) w odpływie kontrolnym w czasie t (mg/l). Obliczenia powtórzyć dla substancji odniesienia, jeśli jest badana.
Działanie reaktora kontrolnego
44. Stopień eliminacji (DB) DOC (lub ChZT) pożywki organicznej w reaktorach kontrolnych stanowi przydatną informację przy ocenie biodegradującego działania biofilmu w trakcie badania. Obliczyć wartość procentową eliminacji z równania:
DB = 100 (1 - Eo/Cm) %
gdzie:
Cm = DOC (lub ChZT) pożywki organicznej we wcieku kontrolnym (mg/l).
45. Obliczyć usunięcie (DST) badanej substancji chemicznej, jeśli je mierzono, przy użyciu właściwej metody analitycznej przy każdej ocenie w czasie, z równania:
DST = 100 (1 - Se/Si) %
gdzie:
Si = mierzone lub, w miarę możliwości, szacowane stężenie badanej substancji chemicznej we wcieku badanym (mg/l),
Se = mierzone stężenie badanej substancji chemicznej we wcieku kontrolnym w czasie t (mg/l).
Jeśli metoda analityczna daje pozytywną wartość w nieskorygowanym równoważniku ścieków do Sc mg/l, obliczyć wartość procentową usunięcia (DSC) z:
DSC = 100 (Si - Se + Sc)/(Si + Sc) %
Prezentacja wyników badania
46. Przedstawić w postaci wykresu wartość procentową eliminacji Dt i DST (lub DSC), jeśli jest dostępna, w stosunku do czasu (zob. dodatek 2 rozdziału C.10-A). Jako procentową wartość usunięcia badanej substancji chemicznej przyjąć średnią arytmetyczną (przedstawioną jako najbliższą liczbę całkowitą) i odchylenie standardowe 12-15 wartości dla DT (oraz dla DST, jeśli jest dostępna) uzyskanych w fazie plateau. Z kształtu krzywej eliminacji można wysnuć wnioski dotyczące procesów usuwania.
Adsorpcja
47. Jeśli na początku badania obserwuje się wysoką eliminację DOC, badana substancja chemiczna jest prawdopodobnie eliminowana przez adsorpcję na biofilm. Możliwe jest udowodnienie tego poprzez oznaczenie adsorbowanej badanej substancji chemicznej w złuszczonych substancjach stałych biofilmu. Wysoki poziom eliminacji DOC adsorbowalnych substancji chemicznych podczas całego badania nie jest typowy; zazwyczaj na początku występuje wysoki poziom usuwania, który następnie spada do równomiernego poziomu. Jeśli jednak adsorbowana badana substancja chemiczna spowodowała przystosowanie populacji mikroorganizmów, eliminacja DOC badanej substancji chemicznej zwiększyłaby się w następstwie i osiągnęła wysoki poziom plateau.
Faza zastoju
48. Tak samo jak w przypadku statycznych badań przesiewowych, wiele badanych substancji chemicznych wymaga fazy zastoju przed wystąpieniem pełnej biodegradacji. W fazie zastoju następuje przystosowanie (lub adaptacja) bakterii odpowiadających za rozkład przy jednoczesnym prawie całkowitym braku usuwania badanej substancji chemicznej; następnie następuje wstępny przyrost tych bakterii. Zakłada się, że ta faza kończy się, a zaczyna faza degradacji, kiedy następuje usunięcie ok. 10 % wstępnej ilości badanej substancji chemicznej (po adsorpcji, o ile takowa wystąpi). Faza zastoju jest często bardzo zmienna i słabo odtwarzalna.
Faza plateau
49. Faza plateau na krzywej eliminacji w teście ciągłym definiowana jest jako ta faza, w której następuje największa degradacja. Faza plateau powinna trwać co najmniej 3 tygodnie i należy w jej trakcie dokonać około 12-15 ważnych pomiarów wartości.
Średni stopień eliminacji badanej substancji chemicznej
50. Obliczyć średnią wartość z wartości eliminacji Dt (oraz Dst, jeśli jest dostępna) badanej substancji chemicznej w fazie plateau. W zaokrągleniu do najbliższej liczby całkowitej (1 %) stanowi ona stopień eliminacji badanej substancji chemicznej. Zaleca się również obliczenie 95 % przedziału ufności średniej wartości. W podobny sposób obliczyć średni stopień eliminacji (DB) pożywki organicznej w naczyniu kontrolnym.
Wskazanie biodegradacji
51. Jeśli badana substancja chemiczna nie adsorbuje w znaczącym stopniu na biofilmie, a krzywa eliminacji ma typowy kształt krzywej biodegradacji z fazami zastoju, degradacji i plateau (ust. 48, 49), zmierzoną eliminację można bezpiecznie przypisać do biodegradacji. Jeśli zaszło znaczne wstępne usuwanie, badanie symulacyjne nie pozwala na dokonanie rozróżnienia między procesami eliminacji biologicznej i abiotycznej. W takich przypadkach oraz w innych przypadkach, gdy występuje wątpliwość dotycząca biodegradacji (np. ma miejsce odpadanie biofilmu) należy zanalizować badaną substancję chemiczną w próbkach filmu lub przeprowadzić dodatkowe statyczne badania (przesiewowe) biodegradowalności w oparciu o parametry jasno wskazujące na procesy biologiczne. Takie badania to testy poboru tlenu (rozdział C.4 niniejszego załącznika D, E i F) (9) lub badanie, które mierzy wytwarzanie CO2 (rozdział C.4-C niniejszego załącznika dotyczący metody pomiaru dwutlenku węgla w przestrzeni nad roztworem) (10); jako inokulum należy zastosować biofilm z odpowiedniego reaktora, uprzednio poddany działaniu badanej substancji chemicznej.
52. Jeśli zmierzono zarówno wartość usuwania DOC, jak i usuwania konkretnej substancji chemicznej, znaczące różnice (ta pierwsza niższa od tej drugiej) między usuniętymi wartościami procentowymi wskazują na obecność w odpływie półproduktów produktów organicznych, które mogą być trudne do rozłożenia i należy je zbadać.
Ważność wyników badania
53. Badanie należy uznać za ważne, jeśli stopień eliminacji DOC (lub ChZT) (DB) w zestawach kontrolnych wynosi > 80 % pod dwóch tygodniach działania i nie poczyniono obserwacji nietypowych.
54. Jeśli badano szybko biodegradowalną substancję chemiczną (odniesienia), stopień biodegradacji powinien wynosić > 90 %, a różnica między wartościami w duplikatach nie powinna wynosić więcej niż 5 %. Jeśli te dwa kryteria nie są spełnione, dokonać przeglądu procedur doświadczalnych i pozyskać ścieki domowe z innego źródła.
55. Podobnie różnice między wartościami biodegradacji z zestawów stanowiących duplikaty (jeśli są stosowane), poddawanych działaniu badanej substancji chemicznej, nie powinny wynosić więcej niż 5 %. Jeśli to kryterium nie jest spełnione, ale poziom usuwania jest wysoki, prowadzić analizę przez kolejne trzy tygodnie. Jeśli poziom usuwania jest niski, zbadać hamujący wpływ badanej substancji chemicznej, jeśli nie jest znany, i powtórzyć badanie przy niższym stężeniu badanej substancji chemicznej, jeśli to możliwe.
Sprawozdanie z badania
56. Sprawozdanie z badania musi zawierać co najmniej następujące informacje:
Badana substancja chemiczna
- dane identyfikacyjne,
- cechy fizyczne oraz w stosownych przypadkach właściwości fizykochemiczne.
Warunki badania
- wszelkie zmiany układu badawczego, zwłaszcza jeśli badane są nierozpuszczalne lub lotne substancje chemiczne,
- rodzaj pożywki organicznej,
- proporcja i charakter odpadów przemysłowych w ściekach, jeśli są wykorzystywane i znane,
- metoda inokulacji,
- zawartość DOC (rozpuszczonego węgla organicznego) i TOC (całkowitego węgla organicznego) w roztworze podstawowym badanej substancji chemicznej; sposób przygotowania, w przypadku zawiesiny; stosowane stężenia badanej substancji chemicznej, podać powody, jeśli wykraczają poza zakres 10-20 mg/l DOC; metoda podania; data pierwszego podania; wszelkie zmiany w stężeniu,
- średni hydrauliczny czas zatrzymania (przy braku przyrostu); prędkość obrotowa rury; w miarę możliwoście przybliżony kąt nachylenia,
- szczegółowe informacje dotyczące złuszczania się; czas i natężenie,
- temperatura badania i zakres,
- stosowane techniki analityczne.
Wyniki badania
- w stosownych przypadkach wszelkie dane z pomiarów DOC, ChZT, specyficzne analizy, pH, temperatura, substancje chemiczne N,
- dane z wyliczeń Dt (lub Dtc), DB, Ds uzyskane w postaci tabeli i krzywe eliminacji,
- informacje o fazach zastoju i plateau, czas trwania badania, stopień eliminacji badanej substancji chemicznej, substancji odniesienia (jeśli jest badana) i pożywki organicznej (w zestawie kontrolnym) wraz z danymi statystycznymi i stwierdzeniami dotyczącymi biodegradowalności i ważności badania,
- omówienie wyników.
BIBLIOGRAFIA:
(1) Gerike P, Fischer W, Holtmann W (1980). Biodegradability determinations in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test. Wat. Res. 14: 753-758.
(2) Truesdale GA, Jones K, Vandyke KG (1959). Removal of synthetic detergents in sewage treatment processes: Trials of a new biologically attackable material.Wat. Waste Tr. J. 7: 441-444.
(3) Baumann U, Kuhn G and Benz M. (1998) Einfache Versuchsanordnung zur Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF - Z. Umweltchem. Ökotox. 10: 214-220.
(4) Gloyna EF, Comstock RF, Renn CE (1952). Rotary tubes as experimental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357.
(5) Kumke GW, Renn CE (1966). LAS removal across an institutional trickling filter. JAOCS 43: 92-94.
(6) Tomlinson TG, Snaddon DHM, (1966). Biological oxidation of sewage by films of micro-organisms. Int. J. Air Wat. Pollut. 10: 865-881.
(7) Her Majesty's Stationery Office (1982). Methods for the examination of waters and associated materials. Asses-sment of biodegradability, 1981, Londyn.
(8) Her Majesty's Stationery Office (1984). Methods for the examination of waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment processes, 1982, Londyn.
(9) Rozdział C.4 niniejszego załącznika: Oznaczanie szybkiej biodegradowalności A-F.
(10) ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of released inorganic carbon in sealed vessels.
Dodatek 8
Rysunek 1
Rury obrotowe
Glosariusz:
Widok z góry:
Widok A/B
Koła napędzane
Koła pośredniczące
Silnik napędowy
Przekładnia redukcyjna
Kołnierz wewnętrzny
Mechanizm przechyłowy
Napęd za pomocą przekładni stożkowej
Rysunek 2
Schemat przepływu
A: Zbiornik materiału doprowadzanego
B: Pompa perystaltyczna
C: Rurka obrotowa
D: Naczynie do zbierania odpływu
DEFINICJE
Badana substancja chemiczna: jakakolwiek substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.
Chemikalia: "Należy zauważyć, że termin 'chemikalia' jest szeroko stosowany w porozumieniach UNCED i dokumentach powiązanych dla uwzględnienia substancji, produktów, mieszanin, preparatów i wszelkich innych terminów, które mogą być stosowane w istniejących systemach, by wskazać cały zakres".
C.11. BADANIE HAMOWANIA ODDYCHANIA OSADÓW CZYNNYCH (UTLENIANIE WĘGLA I AMONU)
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna z dotyczącą badań wytyczną OECD nr 209 (2010). W niniejszej metodzie badawczej opisano sposób określania wpływu danej substancji chemicznej na mikroorganizmy znajdujące się w osadzie czynnym (głównie bakterie) drogą pomiarów ich intensywności oddychania (utleniania węgla lub amonu) w określonych warunkach i w obecności różnych stężeń badanej substancji chemicznej. Przedmiotowa metoda badawcza opiera się na badaniu ETAD (Ecological and Toxicological Association of the Dyestuffs Manufacturing industry) (1) i (2), na poprzedniej wytycznej OECD nr 209 (3) oraz na zmienionej normie PN-EN ISO 8192 (4). Celem badania jest określenie szybkich metod przesiewowych w celu oceny wpływu substancji chemicznych na mikroorganizmy znajdujące się w osadzie czynnym na etapie oczyszczania biologicznego (aerobowego) w oczyszczalniach ścieków. Wyniki badania mogą posłużyć jako wskaźnik odpowiednich niehamujących stężeń badanych substancji chemicznych, które mają zostać wykorzystane w różnych badaniach biodegradowalności (na przykład w rozdziałach C.4 A-F, C.9, C.10, C12 i C.29 niniejszego załącznika, OECD TG302C). W tym przypadku badanie można wykonać w formie badania przesiewowego, podobnego do badania ustalającego zakres stężeń lub badania granicznego stężenia (zob. pkt 39), uwzględniającego wyłącznie oddychanie w ujęciu ogólnym. W przypadku badań szybkiej biodegradowalności (rozdział C.4 lit. A-F i C.29 niniejszego załącznika), w których stężenie inokulum jest znacznie niższe niż wykorzystywane w niniejszej metodzie badawczej, do informacji tych należy jednak podchodzić ostrożnie. Brak zahamowania oddychania w tym badaniu oddychania de facto nie oznacza automatycznego wystąpienia warunków nieprowadzących do zahamowania w badaniu szybkiej biodegradowalności, opisanym w rozdziałach C.4 lit. A-F lub C.29 niniejszego załącznika.
2. Ogólnie rzecz biorąc wydaje się, że od czasu pierwszej publikacji na ten temat badanie hamowania oddychania było wykonywane z powodzeniem, chociaż w niektórych przypadkach odnotowano błędne wyniki, np. w (2) (4) (5). Krzywe obrazujące oddychanie w funkcji stężenia są niekiedy dwufazowe, wykresy zależności dawka-odpowiedź bywają zniekształcone, a wartości EC50 niespodziewanie niskie (5). Badania wykazały, że wyniki takie uzyskuje się, gdy osad czynny użyty w badaniach ulega znacznej nitryfikacji, a badana substancja chemiczna ma większy wpływ na utlenianie amonu niż na ogólne utlenianie w wyniku działalności organizmów heterotroficznych. Wspomniane błędne wyniki można zatem wyeliminować, wykonując dodatkowe badanie z wykorzystaniem specjalnego inhibitora nitryfikacji. Dokonując pomiaru wskaźników poboru tlenu w obecności takiego inhibitora, np. N-allilotiomocznika (ATU), i pod jego nieobecność, można obliczyć oddzielny, łączny pobór tlenu oraz pobór tlenu w procesach heterotroficznych i nitryfikacji (4) (7) (8). Można zatem określić działanie hamujące badanej substancji chemicznej na przedmiotowe dwa procesy, a wartości EC50 w odniesieniu do utleniania węgla organicznego (heterotroficzność) oraz utleniania amonu (nitryfikacja) można obliczyć w zwykły sposób. Należy zauważyć, że w pewnych rzadkich przypadkach działanie hamujące N-allilotiomocznika może być częściowo lub całkowicie zniesione w wyniku kompleksacji z badanymi substancjami chemicznymi lub suplementami występującymi w pożywce, np. jonami Cu++ (6). Jony Cu++ są niezbędne dla bakterii Nitrosomonas, ale w większym stężeniu są toksyczne.
3. Potrzeba nitryfikacji w tlenowym oczyszczaniu ścieków, stanowiąca niezbędny etap w procesie usuwania związków azotu ze ścieków w wyniku denitryfikacji do produktów gazowych, stała się nagląca szczególnie w państwach europejskich; UE ustaliła niższe limity stężenia azotu w oczyszczonych ściekach odprowadzanych do odbiorników wodnych 10 .
4. W większości przypadków wystarczy sama metoda oceny wpływu na procesy utleniania węgla organicznego. W niektórych przypadkach do interpretacji wyników i zrozumienia skutków potrzebne jest jednak badanie wpływu na samą nitryfikację albo oddzielnie na nitryfikację i na utlenianie węgla organicznego.
ZASADA METODY BADANIA
5. Intensywność oddychania próbek osadu czynnego w ściekach syntetycznych mierzy się w zamkniętej komorze, która zawiera elektrodę tlenową, po czasie kontaktu wynoszącym trzy godziny. Uwzględniając realistyczny scenariusz narażenia, odpowiedni może być dłuższy czas kontaktu. Jeżeli badana substancja chemiczna ulega szybkiej degradacji, np. abiotycznie w drodze hydrolizy, lub jest lotna i nie można utrzymać odpowiedniego stężenia, można dodatkowo zastosować krótszy okres narażenia, wynoszący np. 30 minut. Wrażliwość każdej partii osadu czynnego należy sprawdzić w dniu narażenia za pomocą odpowiedniej substancji chemicznej odniesienia. Badanie stosuje się zazwyczaj do określenia ECx (np. EC50) badanej substancji chemicznej lub stężenia, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC).
6. Zahamowanie poboru tlenu przez mikroorganizmy utleniające węgiel organiczny można wyrazić niezależnie od zahamowania poboru tlenu przez mikroorganizmy utleniające amon, mierząc intensywność poboru tlenu pod nieobecność N-allilotiomocznika, który jest specjalnym inhibitorem utleniania amonu do azotynu przez bakterie nitryfikacyjne pierwszego stopnia, i w jego obecności. W tym przypadku procent zahamowania intensywności poboru tlenu oblicza się, porównując intensywność poboru tlenu w obecności badanej substancji chemicznej ze średnią intensywnością poboru tlenu odpowiednich prób kontrolnych niezawierających badanej substancji chemicznej, zarówno w obecności, jak i bez specjalnego inhibitora, tj. N-allilotiomocznika.
7. Pobór tlenu będący skutkiem procesów abiotycznych można wykryć, oznaczając intensywność poboru tlenu w mieszaninach badanej substancji chemicznej, pożywce ze ścieków syntetycznych oraz w wodzie, z pominięciem osadu czynnego.
INFORMACJE O BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ
8. Dla potrzeb prawidłowej interpretacji wyników należy znać cechy badanej substancji chemicznej, takie jak identyfikacja (najlepiej numer CAS), nazwa (IUPAC), czystość, rozpuszczalność w wodzie, prężność pary, lotność i adsorpcja. Lotne substancje chemiczne nie mogą być zazwyczaj badane bez zastosowania specjalnych środków ostrożności (zob. pkt 21).
ZASTOSOWANIE METODY BADAWCZEJ
9. Metodę badawczą można zastosować do substancji chemicznych, które są rozpuszczalne w wodzie, słabo rozpuszczalne w wodzie lub lotne. Nie zawsze możliwe jest jednak otrzymanie wartości EC50 w odniesieniu do substancji chemicznych o ograniczonej rozpuszczalności, a ważne wyniki w odniesieniu do lotnych substancji chemicznych można otrzymać tylko pod warunkiem, że znaczna większość (na przykład > 80 %) badanej substancji chemicznej pozostanie w mieszaninie reakcyjnej pod koniec okresu (okresów) narażenia. W przypadku wystąpienia jakiejkolwiek niepewności co do stabilności badanej substancji chemicznej lub jej lotności, w celu bardziej precyzyjnego określenia stężenia ECx należy przedstawić dodatkowe potwierdzające dane analityczne.
SUBSTANCJE CHEMICZNE ODNIESIENIA
10. Substancje chemiczne odniesienia należy okresowo badać, aby zapewnić wiarygodność metody badawczej i warunków badania oraz w celu sprawdzenia wrażliwości każdej partii osadu czynnego wykorzystywanej w charakterze inokulum mikroorganizmów w dniu narażenia. Zaleca się stosowanie 3,5-dichlorofenolu (3,5-DCP) jako hamującej substancj chemicznej odniesienia, ponieważ jest on znanym inhibitorem oddychania i jest wykorzystywany w wielu typach badań hamowania/toksyczności (4). Jako substancję chemiczną odniesienia do całkowitego zahamowania oddychania można również wykorzystać pięciowodny siarczan miedzi (II) (9). N-metyloanilina może być wykorzystana jako specjalny inhibitor odniesienia nitryfikacji (4).
KRYTERIA WAŻNOŚCI I ODTWARZALNOŚĆ
11. Intensywność poboru tlenu w ślepych próbach kontrolnych (bez badanej substancji chemicznej i bez substancji chemicznej odniesienia) nie powinna być mniejsza niż 20 mg tlenu na jeden gram osadu czynnego (sucha masa zawiesiny) na godzinę. Jeżeli intensywność jest mniejsza, badanie należy powtórzyć, używając wypłukanego osadu czynnego lub osadu pochodzącego z innego źródła. Współczynnik zmienności intensywności poboru tlenu w kontrpróbach kontrolnych nie powinien być wyższy niż 30 % pod koniec ostatecznego badania.
12. W 2004 r. w międzynarodowym badaniu międzylaboratoryjnym zorganizowanym przez ISO (4), w którym wykorzystano osad czynny pochodzący ze ścieków domowych, wykryto, że EC50 dla 3,5-DCP wynosi 2-25 mg/ l w przypadku oddychania ogółem, 5-40 mg/l w przypadku oddychania w procesach heterotroficznych i 0,1- 10 mg/l w procesach nitryfikacji. Jeżeli w przypadku 3,5-DCP EC50 nie mieści się oczekiwanym zakresie, badanie należy powtórzyć, używając osadu czynnego z innego źródła. EC50 dla pięciowodnego siarczanu miedzi (II) powinno wynosić 53-155 mg/l w odniesieniu do oddychania ogółem (9).
OPIS METODY BADAWCZEJ
Naczynia badawcze i aparatura badawcza
13. Należy korzystać ze zwykłego sprzętu laboratoryjnego i następujących przyrządów:
a) naczyń badawczych - na przykład zlewek o pojemności 1 000 ml, w których znajduje się 500 ml mieszaniny reakcyjnej (zob. pkt 5 rys. 1);
b) komór i dodatkowych urządzeń służących do pomiaru stężenia rozpuszczonego tlenu; odpowiedniej elektrody tlenowej; zamkniętej komory, w której znajduje się próbka, bez fazy nadpowierzchniowej, z urządzeniem zapisującym (np. 7, 8 i 9, rys. 1 dodatek 2); ewentualnie można wykorzystać butelkę do oznaczania BZT z odpowiednią przystawką do uszczelniania elektrody tlenowej w szyjce butelki (zob. rys. 2 dodatek 3). Aby uniknąć strat cieczy wypartej przez wprowadzaną elektrodę tlenową, zaleca się uprzednio włożyć do butelki lejek lub szklaną rurkę albo użyć naczyń o wywiniętych krawędziach. W obu przypadkach należy skorzystać z mieszadła magnetycznego lub mieszadła opartego na alternatywnej metodzie, np. samomieszającej sondy;
c) mieszadeł magnetycznych i popychaczy, pokrytych obojętnym materiałem, które wykorzystywane są w komorze pomiarowej lub w naczyniach badawczych;
d) urządzenia napowietrzającego: w razie potrzeby sprężone powietrze należy przepuścić przez odpowiedni filtr w celu usunięcia pyłu i oleju i przez płuczki z wodą w celu nawilżenia go. Zawartość naczyń powinna być napowietrzana za pomocą pipet Pasteura lub innych urządzeń napowietrzających, które nie wchłaniają substancji chemicznych. Aby zaspokoić zapotrzebowania osadu na tlen i rozwiązać problemy z substancjami chemicznymi, które zbytnio się pienią, są lotne, a zatem tracone, lub które są trudne do rozproszenia w trakcie napowietrzenia tlenem, można wykorzystać wytrząsarkę orbitalną działającą przy prędkościach obrotowych w zakresie 150-250 obr./min z kolbami o pojemności np. 2 000 ml. Układ badawczy obejmuje zazwyczaj szereg napowietrzanych w sposób ciągły i kolejno nastawianych (np. w odstępach około 10-15 minut) zlewek, które są następnie kolejno analizowane. Można skorzystać również ze zweryfikowanej aparatury umożliwiającej jednoczesne napowietrzanie i pomiar intensywności zużycia tlenu w mieszaninach;
e) pehametru;
f) wirówki, wirówki stołowej ogólnego przeznaczenia do odwirowywania osadu, osiągającej przyspieszenie 10 000 m/s2.
Odczynniki
14. Przez okres całego badania należy stosować odczynniki do analiz.
Woda
15. O ile nie określono, że można używać wody wodociągowej niezawierającej chloru, należy stosować wodę destylowaną lub dejonizowaną o zawartości rozpuszczonego węgla organicznego (DOC) mniejszej niż 1 mg/l.
Pożywka ze ścieków syntetycznych
16. Pożywkę należy przygotować w taki sposób, aby zawierała następujące składniki w podanych ilościach:
- pepton16 g;
- ekstrakt mięsa (lub porównywalny ekstrakt warzywny)11 g;
- mocznik3 g;
- chlorek sodu (NaCl)0,7 g;
- chlorek wapnia dwuwodny (CaC12, 2H2O)0,4 g;
- siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4, 7H2O)0,2 g;
- wodorofosforan potasu bezwodny (K2HPO4)2,8 g;
- uzupełnić wodą destylowaną lub dejonizowaną do objętości 1 litra.
17. Wartość pH tego roztworu powinna wynosić 7,5 ± 0,5. Jeżeli przygotowana pożywka nie zostanie niezwłocznie wykorzystana, należy ją przechowywać bez dostępu światła w temperaturze 0-4 °C nie dłużej niż przez tydzień lub w warunkach, które nie spowodują żadnej zmiany w jej składzie. Należy zwrócić uwagę, że takie syntetyczne ścieki są 100 razy bardziej stężone niż ścieki opisane w sprawozdaniu technicznym OECD z dnia 11 czerwca 1976 r. "Proponowana metoda oceny biodegradacji substancji powierzchniowo czynnych używanych w detergentach syntetycznych", a ponadto zawierają dodatek w postaci ortofosforanu dipotasu.
18. Innym rozwiązaniem jest sterylizacja poszczególnych składników pożywki przed przechowywaniem albo dodanie peptonu lub ekstraktu mięsa tuż przed wykonaniem badania. Przed zastosowaniem należy dokładnie wymieszać pożywkę i w razie potrzeby wyregulować pH do 7,5 ± 0,5.
Badana substancja chemiczna
19. Roztwór podstawowy powinien być przygotowywany w odniesieniu do substancji badanych łatwo rozpuszczalnych w wodzie wyłącznie do poziomu maksymalnej rozpuszczalności w wodzie (osady są niedopuszczalne). Substancje słabo rozpuszczalne w wodzie, mieszaniny zawierające składniki o różnej rozpuszczalności w wodzie oraz substancje adsorpcyjne należy odmierzać bezpośrednio do naczyń badawczych. W tych przypadkach zastosowanie roztworów podstawowych może stanowić alternatywę, jeżeli rozpuszczone stężenie badanych substancji chemicznych jest określane analitycznie w naczyniach badawczych (przed dodaniem osadu czynnego). Jeżeli przygotowane zostały wodne frakcje, istotne jest również analityczne oznaczenie stężeń rozpuszczonych badanych substancji chemicznych w naczyniach badawczych. Należy unikać stosowania rozpuszczalników organicznych, środków dyspergujących/emulgatorów w celu zwiększenia rozpuszczalności. Można poddawać roztwory podstawowe działaniu ultradźwięków i wstępnie mieszać zawiesiny, np. w nocy, jeżeli dostępna jest wystarczająca ilość informacji na temat stabilności badanej substancji chemicznej w takich warunkach.
20. Badana substancja chemiczna może niekorzystnie wpływać na wskaźnik pH w układzie badawczym. Przed rozpoczęciem badania, podczas badania wstępnego, należy oznaczyć pH mieszanin poddawanych działaniu badanej substancji chemicznej w celu upewnienia się, czy przed badaniem głównym wymagane będzie wyregulowanie pH; czynność tę należy powtórzyć w dniu wykonywania badania głównego. W razie potrzeby przed dodaniem inokulum należy zneutralizować wodne roztwory/zawiesiny badanej substancji chemicznej. Ponieważ jednak neutralizacja może zmienić właściwości chemiczne substancji chemicznej, w zależności od celu badania można wykonać dalsze badania, aby ocenić wpływ badanej substancji chemicznej na osad bez regulowania pH.
21. Toksyczność lotnych substancji chemicznych, w szczególności w badaniach, w których przez układ jest przepuszczane powietrze, mogą spowodować występowanie zmiennych poziomów zmian spowodowanych utratą substancji chemicznej w okresie narażenia. Należy zachować ostrożność podczas pracy z takimi substancjami, przeprowadzając szczegółową analizę substancji w mieszaninach kontrolnych zawierających daną substancję i modyfikując schemat napowietrzania.
Substancja chemiczna odniesienia
22. Jeżeli jako substancja chemiczna odniesienia stosowany jest 3,5-dichlorofenol, należy przygotować roztwór 1,00 g 3,5-dichlorofenolu w 1 000 ml wody (15). W celu przyspieszenia procesu rozpuszczania należy użyć ciepłej wody lub ultradźwięków, a po schłodzeniu do temperatury pokojowej dopełnić do kreski. Należy jednak upewnić się, czy substancja chemiczna odniesienia nie zmieniła swojej struktury chemicznej. W razie potrzeby należy sprawdzić pH roztworu i skorygować je do wartości 7-8 za pomocą NaOH lub H2SO4.
23. Jeżeli w charakterze substancji chemicznej odniesienia stosowany jest pięciowodny siarczan miedzi (II), stosuje się stężenia 58 mg/l, 100 mg/l i 180 mg/l (o współczynniku 1,8). Substancję odmierza się bezpośrednio do naczyń badawczych (29 - 50 - 90 mg przy objętości całkowitej wynoszącej 500 ml). Następnie substancję rozcieńcza się 234 ml wody wodociągowej sterylizowanej w autoklawie. Pięciowodny siarczan miedzi (II) jest łatwo rozpuszczalny. Po rozpoczęciu badania dodaje się 16 ml ścieków syntetycznych i 250 ml osadu czynnego.
Specjalny inhibitor nitryfikacji
24. Należy przygotować roztwór podstawowy N-allilotiomocznika (ATU) o stężeniu 2,32 g/l. Po dodaniu 2,5 ml tego roztworu podstawowego do mieszaniny inkubacyjnej o ostatecznej objętości 500 ml otrzymane stężenie końcowe wynosi 11,6 mg ATU/l (10- 4mol/l), o którym wiadomo, że jest wystarczające (4) do wywołania 100 % zahamowania nitryfikacji w osadzie czynnym o działaniu nitryfikacyjnym, zawierającym 1,5 g/l zawiesiny.
Abiotyczna próba kontrolna
25. W niektórych rzadkich przypadkach badana substancja chemiczna charakteryzująca się silnymi właściwościami redukującymi może spowodować wymierne abiotyczne zużycie tlenu. W takich przypadkach niezbędne są abiotyczne próby kontrolne w celu odróżnienia abiotycznego poboru tlenu przez badaną substancję chemiczną od oddychania mikroorganizmów. Abiotyczne próby kontrolne można przygotować, pomijając dodanie inokulum w mieszaninach stosowanych w badaniu. Podobnie można włączyć do badania abiotyczne próby kontrolne bez inokulum, gdy na etapie narażenia w trakcie badania wykonywane są pomocnicze analityczne pomiary otrzymanego stężenia, np. w przypadku stosowania roztworów podstawowych substancji chemicznych słabo rozpuszczalnych w wodzie, zawierających składniki o różnej rozpuszczalności w wodzie. W szczególnych przypadkach niezbędne może być przygotowanie abiotycznej próby kontrolnej z inokulum poddanym sterylizacji (np. w autoklawie lub za pomocą sterylizujących substancji toksycznych). Niektóre substancje chemiczne mogą wytwarzać tlen lub zużywać go jedynie w przypadku gdy powierzchnia jest wystarczająco duża, aby zaszła reakcja, nawet jeżeli zwykle wymagane są do tego dużo wyższa temperatura lub ciśnienie. W takim przypadku szczególną uwagę należy zwrócić na substancje nadtlenowe. Inokulum poddane sterylizacji zapewnia dużą powierzchnię.
Inokulum
26. Do zastosowania ogólnego osad czynny należy pobrać na wylocie komory napowietrzania lub w pobliżu wylotu komory prawidłowo działającej oczyszczalni ścieków, do której trafiają głównie ścieki domowe. W zależności od celu badania wykorzystać można również inne odpowiednie rodzaje lub źródła osadu czynnego, np. osad wyhodowany w laboratorium, o odpowiednich stężeniach zawiesiny wynoszących 2 g/l- 4 g/l. Osady pochodzące z różnych oczyszczalni ścieków mogą jednak cechować się różnymi właściwościami i różną wrażliwością.
27. Można wykorzystać osad w takiej postaci, w jakiej został pobrany, ale należy usunąć cząsteczki gruboziarniste w drodze krótkotrwałej sedymentacji, np. przez 5-15 minut, oraz zdekantować górną warstwę drobniejszej zawiesiny lub przepuścić przez sito (np. o oczkach 1 mm2). Innym rozwiązaniem jest homogenizacja osadu w wytrząsarce przez około 15 sekund lub dłużej, ale należy zachować ostrożność ze względu na siły tnące i zmianę temperatury, które mogą wystąpić w przypadku długich okresów homogenizacji.
28. Często konieczne jest płukanie osadu, np. w przypadku niskiej intensywności oddychania endogennego. Osad należy najpierw odwirowywać przez pewien okres, np. 10 minut z przyspieszeniem około 10 000 m/s2, w celu wyprodukowania czystego supernatantu i osadu cząstek stałych zawartych w ściekach. Supernatant należy usunąć, a osad dodać do odchlorowanej wody wodociągowej, wstrząsając w celu ponownego uzyskania zawiesiny, a następnie usunąć wodę płuczącą przez ponowne odwirowanie i usunięcie. W razie potrzeby należy powtórzyć proces płukania i odwirowywania. Należy oznaczyć suchą masę znanej objętości osadu ponownie doprowadzonego do stanu zawiesiny oraz osadu zagęszczonego przez usunięcie cieczy lub mocniej rozcieńczyć ten osad w odchlorowanej wodzie wodociągowej w celu uzyskania odpowiedniego stężenia ciał stałych występujących w ściekach, wynoszącego 3 g/l. Osad czynny należy stale napowietrzać (np. 2 l/min) w temperaturze badania i w miarę możliwości wykorzystywać tylko w dniu pobrania. Jeżeli nie jest to możliwe, do osadu należy codziennie doprowadzać pożywkę ze ścieków syntetycznych (50 ml pożywki ścieków syntetycznych/litr osadu czynnego) przez dwa dodatkowe dni. Osad wykorzystuje się następnie w badaniu, a wyniki akceptuje jako ważne, pod warunkiem że nie nastąpiła żadna znaczna zmiana w jego aktywności, oceniona na podstawie intensywności oddychania endogennego osadu, oddychania w procesach heterotroficznych i nitryfikacji.
29. Trudności mogą pojawić się w przypadku pienienia się podczas inkubacji, które będzie tak intensywne, że piana i ciała stałe zawarte w ściekach zostaną wypchnięte z naczyń napowietrzających. W niektórych przypadkach pojawienie się piany może po prostu wynikać z obecności ścieków syntetycznych, ale należy je przewidzieć, jeżeli badana substancja chemiczna jest surfaktantem lub zawiera go w swoim składzie. Utrata części stałych osadu z mieszanin stosowanych w badaniu będzie skutkowała sztucznie obniżoną intensywnością oddychania, która może zostać błędnie zinterpretowana jako skutek zahamowania. Ponadto napowietrzanie roztworu surfaktantu powoduje, że surfaktant gromadzi się w warstwie piany; ubytek piany z układu badawczego spowoduje obniżenie stężeń ekspozycyjnych. Pienienie można eliminować, stosując proste mechaniczne sposoby (np. mieszając od czasu do czasu ręczne za pomocą szklanej pałeczki) lub przez dodanie wolnej od surfaktantu substancji przeciwpianotwórczej w postaci silikonowej emulsji, lub stosując napowietrzanie przez wstrząsanie kolby. Jeżeli problem jest powiązany z obecnością ścieków syntetycznych, skład ścieków należy zmodyfikować, dodając odczynnik przeciwpianotwórczy w ilości np. 50 ml/l. Jeżeli pienienie powoduje badana substancja chemiczna, ilość niezbędną do zredukowania tego efektu należy określić dla maksymalnego badanego stężenia, a następnie identycznie postępować należy w przypadku wszystkich naczyń napowietrzających (w tym np. ślepych prób kontrolnych lub naczyń z substancją odniesienia, w których nie ma piany). Jeżeli zastosowane zostały substancje przeciwpianotwórcze, nie może dochodzić do interakcji z inokulum lub z badaną substancją chemiczną.
PROCEDURA BADANIA
30. Można oznaczyć zahamowanie trzech różnych procesów poboru tlenu: całkowitego, tlenu pobieranego przez mikroorganizmy heterotroficzne i poboru tlenu w wyniku nitryfikacji. Zazwyczaj wystarczający powinien być pomiar zahamowania całkowitego poboru tlenu. Określenie wpływu na pobór tlenu przez mikroorganizmy heterotroficzne w wyniku utleniania węgla organicznego oraz w wyniku utleniania amoniaku jest potrzebne, jeżeli istnieje szczególny wymóg dotyczący takich dwóch oddzielnych punktów końcowych w odniesieniu do danej substancji chemicznej lub (opcjonalnie) w celu wyjaśnienia nietypowych krzywych dawka-odpowiedź wynikających z hamowania całkowitego poboru tlenu.
Warunki badania
31. Badanie należy przeprowadzić w temperaturze mieszczącej się w granicach 20 ± 2 °C.
Mieszaniny stosowane w badaniu
32. W celu uzyskania różnych stężeń nominalnych badanej substancji chemicznej (zob. przykład objętości składników w tabeli 1) należy przygotować stosowane w badaniu mieszaniny (FT jak w tabeli 1) zawierające wodę, pożywkę ze ścieków syntetycznych i badaną substancję chemiczną. W razie potrzeby pH należy skorygować do poziomu 7,5 ± 0,5; mieszaniny należy rozcieńczyć wodą i dodać inokulum w celu uzyskania jednakowych końcowych objętości w naczyniach i rozpoczęcia napowietrzania.
Mieszaniny odniesienia
33. Mieszaniny (FR) należy sporządzić w taki sam sposób jak mieszaniny stosowane w badaniu, zastępując badaną substancję chemiczną substancją chemiczną odniesienia np. 3,5-dichlorofenolem.
Ślepe próby kontrolne
34. Ślepe próby kontrolne (FB) należy przygotować na początku i na końcu okresu narażenia w badaniach, w których zlewki do badania nastawia się kolejno w pewnych odstępach czasu. W badaniach przeprowadzonych z wykorzystaniem urządzeń umożliwiających wykonanie jednoczesnych pomiarów zużycia tlenu, do każdej jednocześnie analizowanej partii należy dołączyć co najmniej dwie ślepe próby kontrolne. Ślepe próby kontrolne zawierają taką samą objętość osadu czynnego i syntetycznej pożywki, ale nie zawierają badanej substancji chemicznej ani substancji chemicznej odniesienia. Należy rozcieńczyć je wodą do takiej samej objętości jak mieszaniny stosowane w badaniu i mieszaniny odniesienia.
Abiotyczna próba kontrolna
35. W razie potrzeby, na przykład jeżeli wiadomo lub istnieje podejrzenie, że badana substancja chemiczna ma silne właściwości redukujące, należy przygotować mieszaninę FA do pomiaru abiotycznego zużycia tlenu. Mieszanina powinna zawierać takie same ilości badanej substancji chemicznej, pożywki ze ścieków syntetycznych oraz mieć taką samą objętość jak mieszaniny stosowane w badaniu, ale nie powinna zawierać osadu czynnego.
Ogólna procedura i pomiary
36. Mieszaniny stosowane w badaniu, mieszaniny odniesienia oraz ślepe i abiotyczne próby kontrolne inkubuje się w temperaturze badania w warunkach wymuszonego napowietrzania (0,5-1 l/min) w celu utrzymania stężenia rozpuszczonego tlenu powyżej 60-70 % nasycenia oraz w celu utrzymania kłaczków osadu w zawieszeniu. Mieszanie kultur jest również konieczne w celu utrzymania kłaczków osadu w zawieszeniu. Inkubację uznaje się za rozpoczętą w momencie początkowego kontaktu inokulum z osadu czynnego z innymi składnikami końcowej mieszaniny. Pod koniec inkubacji, po określonych okresach narażenia, wynoszących zazwyczaj 3 godziny, pobiera się próbki w celu wykonania pomiaru tempa spadku stężenia rozpuszczonego tlenu w przeznaczonej do tego celu komorze (rys. 2 dodatek 3) lub w całkowicie wypełnionej butelce do oznaczania BZT. Sposób, w jaki rozpoczynają się inkubacje zależy także od wydajności urządzeń wykorzystywanych do mierzenia poziomów zużycia tlenu. Jeżeli na przykład jest to jedna sonda tlenowa, pomiary wykonuje się indywidualnie. W tym przypadku należy przygotować różne mieszaniny niezbędne do przeprowadzenia badania w ściekach syntetycznych, ale należy wstrzymać wprowadzanie inokulum i do każdego naczynia w serii dodawać należy wymagane porcje osadu. Każdą inkubację należy rozpoczynać na po kolei w dogodnych odstępach czasu, np. 10-15 minut. Innym rozwiązaniem jest zastosowanie układu pomiarowego składającego się z wielu sond umożliwiających wielokrotne jednoczesne pomiary; w tym przypadku inokulum można dodać w tym samym czasie do odpowiednich grup naczyń.
37. Stężenie osadu czynnego we wszystkich mieszaninach stosowanych w badaniu, mieszaninach odniesienia i w ślepych próbach kontrolnych (ale nie w abiotycznych próbach kontrolnych) wynosi nominalnie 1,5 g/l zawiesiny. Zużycie tlenu należy zmierzyć po 3 godzinach narażenia. W razie potrzeby po 30 minutach narażenia należy wykonać dodatkowe pomiary zgodnie z wcześniejszym opisem w pkt 5.
Nitryfikacyjny potencjał osadu
38. W celu dokonania oceny, czy osad ulegnie nitryfikacji, a jeśli tak, to w jakim stopniu, należy sporządzić mieszaniny (FB), takie jak ślepa próba kontrolna i dodatkowe mieszaniny kontrolne (FN), które jednak zawierają również N-allilotiomocznik w ilości 11,6 mg/l. Mieszaniny należy napowietrzać i inkubować w temperaturze 20° ± 2 °C przez 3 godziny. Następnie zmierzyć należy poziomy poboru tlenu i obliczyć poziom poboru tlenu związany z nitryfikacją.
Projekty badania
Badanie ustalające zakres stężeń
39. W razie potrzeby przeprowadza się badanie wstępne w celu oszacowania zakresu stężeń badanej substancji chemicznej potrzebnych w badaniu ostatecznym, aby oznaczyć zahamowanie zużycia tlenu. Ewentualny brak zahamowania zużycia tlenu przez badaną substancję chemiczną w badaniu wstępnym może wskazywać na brak konieczności wykonania badania ostatecznego, ale należy włączyć do badania trzy próby z najwyższymi badanymi stężeniami ze wstępnego badania (zazwyczaj 1 000 mg/l, ale zależy to od wymaganych danych).
Tabela 1
Przykłady mieszanin stosowanych w badaniu wstępnym
| Odczynnik | Pierwotne stężenie |
| Roztwór podstawowy badanej substancji chemicznej | 10 g/l | ||||
| Roztwór podstawowy syntetycznej pożywki | Zob. pkt 16 | ||||
| Zawiesina podstawowa osadu czynnego | 3 g/l zawiesiny | ||||
| Składniki mieszanin | Dozowanie do naczyń badawczych (a) | ||||
| FT1 | FT2 | FT3-5 | FB1-2 | FA | |
| Roztwór podstawowy badanej substancji chemicznej (ml) (pkt 19-21) | 0,5 | 5 | 50 | 0 | 50 |
| Roztwór podstawowy pożywki ze ścieków syntetycznych (ml) (pkt 16) | 16 | 16 | 16 | 16 | 16 |
| Zawiesina osadu czynnego (ml) (pkt 26-29) | 250 | 250 | 250 | 250 | 0 |
| Woda (pkt 15) | 233,5 | 229 | 184 | 234 | 434 |
| Łączna objętość mieszanin (ml) | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 |
| Stężenia w mieszaninie | |||||
| Badana zawiesina (mg/l) Osad czynny | 10 | 100 | 1 000 | 0 | 1 000 |
| (zawiesina) (mg/l) | 1 500 | 1 500 | 1 500 | 1 500 | 0 |
| (a) Tę samą procedurę należy powtórzyć z chemiczną substancją odniesienia, aby uzyskać kolby FR1-3. |
40. Badanie należy przeprowadzić, stosując co najmniej trzy stężenia badanej substancji chemicznej, na przykład 10 mg/l, 100 mg/l i 1 000 mg/l ze ślepą próbą kontrolną oraz, w razie potrzeby, co najmniej trzy abiotyczne próby kontrolne z najwyższymi stężeniami badanej substancji chemicznej (zob. jako przykład tabelę 1). Najlepiej byłoby, gdyby najniższe stężenie nie miało żadnego wpływu na zużycie tlenu. W stosownych przypadkach należy obliczyć intensywność poboru tlenu i nitryfikacji; następnie należy obliczyć procentową wartość zahamowania. W zależności od celu badania można również w prosty sposób oznaczyć toksyczność stężenia granicznego, np. 1 000 mg/l. Jeżeli przy tym stężeniu nie wystąpi żadne istotne statystycznie toksyczne działanie, dalsze badanie wyższych lub niższych stężeń nie jest konieczne. Należy zauważyć, że substancje słabo rozpuszczalne w wodzie, mieszaniny zawierające składniki o różnej rozpuszczalności w wodzie oraz substancje adsorpcyjne należy odważać bezpośrednio do naczyń badawczych. W tym przypadku objętość zarezerwowaną dla roztworu podstawowego substancji badanej należy zastąpić wodą do rozcieńczania.
Badanie ostateczne
Hamowanie całkowitego poboru tlenu
41. Badanie należy przeprowadzić, stosując szereg stężeń określonych na podstawie wstępnego badania. Aby otrzymać wartości NOEC i ECx (np. EC50), w większości przypadków zaleca się stosowanie sześciu prób kontrolnych i pięciu badanych stężeń uporządkowanych w szereg geometryczny z pięcioma kontrpróbami. Nie ma konieczności powtarzania abiotycznej próby kontrolnej, jeżeli w badaniu wstępnym tlen nie został pobrany, jednak w przypadku znacznego poboru tlenu należy uwzględnić abiotyczne próby kontrolne w odniesieniu do każdego stężenia badanej substancji chemicznej. Wrażliwość osadu należy sprawdzić, wykorzystując do tego celu chemiczną substancję odniesienia, jaką jest 3,5-dichlorofenol. Wrażliwość osadu należy sprawdzać w każdej badanej serii, ponieważ wiadomo, że jest ona zmienna. We wszystkich przypadkach próbki usuwa się z naczyń badawczych po 3 godzinach, i w razie potrzeby po dodatkowych 30 minutach w celu pomiaru intensywności poboru tlenu w komorze z elektrodą tlenową. Na podstawie zebranych danych oblicza się szczegółowe wartości intensywności oddechowej w próbach kontrolnych i mieszaninach użytych w badaniu; następnie oblicza się procentową wartość zahamowania z poniższego równania 7.
Odróżnianie zahamowania oddychania organizmów heterotroficznych od nitryfikacji
42. Wykorzystanie specjalnego inhibitora nitryfikacji ATU umożliwia bezpośrednią ocenę działania hamującego badanej substancji chemicznej na utlenianie heterotroficzne i odejmując intensywność poboru tlenu w obecności ATU od całkowitego poziomu poboru (bez ATU) można obliczyć intensywność nitryfikacji. Zgodnie z projektami badań ECx lub NOEC opisanymi w pkt 41 należy przygotować dwa zestawy mieszanin reakcyjnych, ale dodatkowo do wszystkich mieszanin jednego zestawu należy dodać ATU w końcowym stężeniu 11,6 mg/l, w przypadku którego wykazano działanie całkowicie hamujące nitryfikację w osadzie z zawiesiną o stężeniach do 3 000 mg/l (4). Intensywności poboru tlenu należy mierzyć po okresie narażenia; te bezpośrednie wartości są jedynie wskaźnikami oddychania organizmów heterotroficznych, a różnice między tymi wartościami i odpowiadającymi im całkowitymi wskaźnikami intensywności oddechowej określają nitryfikację. Następnie oblicza się różne stopnie zahamowania.
Pomiary
43. Po okresach narażenia próbkę z pierwszego naczynia do napowietrzania należy przenieść do komory z elektrodą tlenową (rys. 1 dodatek 2) i natychmiast zmierzyć stężenie rozpuszczonego tlenu. Jeżeli dostępny jest układ składający się z wielu elektrod, wówczas pomiary można wykonać jednocześnie. Istotne jest, aby tempo mieszania (za pomocą powlekanego magnesu) było takie samo jak podczas kalibracji elektrody, aby zapewnić minimalne opóźnienie odpowiedzi sondy na zmieniające się stężenia tlenu oraz umożliwić dokonywanie regularnych i odtwarzalnych pomiarów tlenu w naczyniu pomiarowym. Zazwyczaj wystarczający jest system sondy samomieszającej niektórych elektrod tlenowych. Pomiędzy pomiarami komorę należy przepłukiwać wodą. Innym rozwiązaniem jest wykorzystanie próbki do napełnienia butelki do oznaczania BZT (rys. 2 dodatek 3) wyposażonej w mieszadło magnetyczne. Sondę tlenową z przystawką należy następnie umieścić w szyjce butelki i włączyć magnetyczne mieszadło. W obydwu przypadkach stężenie rozpuszczonego tlenu należy mierzyć i rejestrować w sposób ciągły zazwyczaj przez 5-10 minut lub do momentu, gdy stężenie tlenu spadnie poniżej 2 mg/l. Elektrodę należy usunąć, mieszaninę umieścić z powrotem w naczyniu napowietrzającym i kontynuować napowietrzanie i mieszanie, jeżeli konieczne jest wykonanie pomiaru po dłuższych okresach narażenia.
Weryfikacja stężenia badanej substancji chemicznej
44. Do niektórych celów konieczne może być zmierzenie stężenia badanej substancji chemicznej w naczyniach badawczych. Należy zauważyć, że jeżeli zastosowano roztwory podstawowe:
- substancji słabo rozpuszczalnych w wodzie,
- mieszanin składników o różnej rozpuszczalności w wodzie lub
- substancji o dobrej rozpuszczalności w wodzie, ale w przypadku których stężenie roztworu podstawowego jest zbliżone do maksymalnej rozpuszczalności w wodzie,
frakcja, która uległa rozpuszczeniu, jest nieznana, i nie jest znane rzeczywiste stężenie badanej substancji chemicznej przenoszonej do naczyń badawczych. W celu scharakteryzowania narażenia konieczne jest analityczne oszacowanie stężeń badanej substancji chemicznej w naczyniach badawczych. Aby uprościć to zadanie, analityczne oszacowanie należy przeprowadzić przed dodaniem inokulum. Ze względu na fakt, że do naczyń badawczych zostaną przeniesione tylko rozpuszczone frakcje, zmierzone stężenia mogą być bardzo niskie.
45. Aby uniknąć czasochłonnych i kosztownych analiz laboratoryjnych, zaleca się po prostu odważyć badaną substancję chemiczną bezpośrednio do naczyń badawczych i w późniejszych obliczeniach przyjmować stężenie nominalne odważonej pierwotnie substancji. Odróżnienie rozpuszczonych, nierozpuszczonych lub adsorbowanych frakcji badanej substancji chemicznej nie jest konieczne, ponieważ wszystkie te frakcje występują w naturalnych warunkach również w oczyszczalni ścieków i mogą się różnić w zależności od składu ścieków. Celem niniejszej metody badawczej jest realistyczne oszacowanie stężenia, które nie wykazuje działania hamującego; metoda nie nadaje się do szczegółowego badania, które frakcje przyczyniają się do hamowania procesów oddychania organizmów żyjących w osadzie czynnym. Ponadto substancje adsorpcyjne również należy odważyć bezpośrednio do naczyń badawczych, które powinny być wykonane ze szkła silanizowanego, aby ograniczyć do minimum straty powodowane przez adsorpcję.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Obliczenie intensywności poboru tlenu
46. Intensywność poboru tlenu należy obliczyć ze średniej wartości pomiarowych np. z liniowej części wykresów stężenia tlenu w funkcji czasu, ograniczając się do obliczenia stężeń tlenu w zakresie 2,0-7,0 mg/l, ponieważ wyższe i niższe stężenia mogą jako takie wpływać na intensywność zużycia. Od czasu do czasu próba określenia wartości powyżej lub poniżej tego zakresu stężenia jest nieunikniona i konieczna, na przykład gdy oddychanie jest w znacznym stopniu zahamowane i w związku z tym bardzo powolne lub jeżeli w przypadku konkretnego osadu czynnego proces oddychania zachodzi bardzo szybko. Jest to dopuszczalne, pod warunkiem że fragmenty wykresu poboru tlenu poza zakresem są proste, a ich gradienty nie ulegają zmianie, gdy przechodzą przez graniczne wartości 2,0 mg/l lub 7,0 mg/l O2. Wszystkie zakrzywione fragmenty wykresu wskazują na stabilizowanie się systemu pomiarowego lub zmianę intensywności poboru tlenu i nie należy ich wykorzystywać w celu obliczania intensywności oddychania. Intensywność poboru tlenu należy podać w miligramach na litr na godzinę (mg/lh) lub w miligramach na gram suchego osadu na godzinę (mg/gh). Intensywność zużycia tlenu R w mg/lh można obliczyć lub interpolować z liniowego fragmentu wykresu zarejestrowanego spadku zawartości tlenu zgodnie z równaniem 1:
R = (Q1 - Q2)/Δt × 60 (1)
gdzie:
Q1 jest to stężenie tlenu na początku wybranej sekcji fazy liniowej (mg/l);
Q2 jest to stężenie tlenu na końcu wybranej sekcji fazy liniowej (mg/l);
Δt jest to odstęp czasu pomiędzy tymi dwoma pomiarami (min).
47. Właściwą intensywność oddychania (Rs) wyraża się jako ilość tlenu zużytą na g suchej masy osadu na godzinę (mg/gh) zgodnie z równaniem 2:
Rs = R/SS (2)
gdzie SS stanowi stężenie zawiesiny w mieszaninie użytej w badaniu (g/l).
48. Różne indeksy R, które można łączyć, to:
S właściwa intensywność
T całkowita intensywność oddychania
N intensywność wynikająca z nitryfikacji
H intensywność wynikająca z działalności organizmów heterotroficznych
A intensywność wynikająca z procesów abiotycznych
B intensywność oparta na ślepych próbach (średnia)
Obliczenie intensywności poboru tlenu wynikającego z nitryfikacji
49. Związek między całkowitym oddychaniem (RT), oddychaniem związanym z nitryfikacją (RN) i oddychaniem organizmów heterotroficznych (RH) określa równanie 3:
RN = RT - RH (3)
gdzie:
RN to intensywność poboru tlenu wynikającego z nitryfikacji (mg/lh);
RT to zmierzona intensywność poboru tlenu w ślepej próbie kontrolnej (brak ATU; FB) (mg/lh).
RH to zmierzona intensywność poboru tlenu w ślepej próbie kontrolnej po dodaniu ATU (FN) (mg/lh).
50. Ta zależność jest ważna w przypadku wartości ślepych prób (RNB, RTB, RHB), abiotycznych grup kontrolnych (RNA, RTA, RHA) oraz prób z badaną substancją chemiczną (RNS, RTS, RHS) (mg/gh). Właściwą intensywność oddychania oblicza się z:
RNS = RN/SS (4)
RTS = RT/SS (5)
RHS = RH/SS (6)
51. Jeżeli wielkość RN jest nieznaczna (np. < 5 % RT w ślepych próbach kontrolnych) w badaniu wstępnym, można założyć, że pobór tlenu przez organizmy heterotroficzne jest równy całkowitemu poborowi i nie zachodzi nitryfikacja. Gdyby badania miały na celu ocenę wpływu na mikroorganizmy heterotroficzne i nitryfikacyjne, potrzebne byłoby inne źródło osadu czynnego. Badanie ostateczne przeprowadza się, jeżeli nie ma dowodów na hamowanie intensywności poboru tlenu przy innych stężeniach badanych substancji chemicznych.
Obliczenie procentu zahamowania
52. Procent zahamowania całkowitego zużycia tlenu, IT, dla każdego stężenia badanej substancji chemicznej opisany jest równaniem 7:
IT = [1 - (RT - RTA)/RTB] × 100 % (7)
53. Podobnie procent zahamowania poboru tlenu przez organizmy heterotroficzne, IH, dla każdego stężenia badanej substancji chemicznej opisany jest równaniem 8:
IH = [1 - (RH - RHA)/RHB] × 100 % (8)
54. Ponadto zahamowanie poboru tlenu spowodowane nitryfikacją, IN, dla każdego stężenia opisane jest równaniem 9:
IN = [1 - (RT - RH)/(RTB - RHB)] × 100 % (9)
55. Procentowe zahamowanie poboru tlenu należy wykreślić w funkcji logarytmu stężenia badanej substancji chemicznej (krzywa zahamowania, zob. rys 3 dodatek 4). Krzywe zahamowania wyznacza się dla każdego okresu 3 godzin lub dodatkowo po 30 min. Stężenie badanej substancji chemicznej, które powoduje hamowanie poboru tlenu o 50 % (EC50), należy obliczyć lub interpolować z wykresu. Jeżeli dostępne są odpowiednie dane, można obliczyć lub interpolować granice ufności na poziomie 95 % EC50, nachylenie krzywej oraz odpowiednie wartości umożliwiające oznaczenie rozpoczęcia zahamowania (na przykład EC10 lub EC20) i zakończenie zakresu zahamowania (na przykład EC80 lub EC90).
56. Należy zauważyć, że w obliczu zmienności obserwowanej często w wynikach, w wielu przypadkach wystarczające może okazać się dodatkowe wyrażenie wyników w rzędzie wielkości na przykład:
EC50 < 1 mg/l
EC50 1 mg/l - 10 mg/l
EC50 10 mg/l - 100 mg/l
EC50 > 100 mg/l
Interpretacja wyników
ECx
57. Wartości ECx, w tym ich powiązane dolne i górne granice ufności na poziomie 95 % w odniesieniu do parametru, oblicza się za pomocą odpowiednich metod statystycznych (np. analizy probitowej, krzywej logistycznej, funkcji Weibulla, uproszczonej metody Spearmana-Kärbera lub zwykłej interpolacji (11)). ECx otrzymuje się, wstawiając wartość odpowiadającą x % średniej grupy kontrolnej do wybranego równania. Aby obliczyć EC50 lub każdą inną wartość ECx, należy przeprowadzić analizę regresyjną średnich (x) z okresu przed wprowadzeniem substancji chemicznej.
Oszacowanie NOEC
58. Jeżeli analiza statystyczna ma na celu wyznaczenie NOEC, niezbędne są dane statystyczne dotyczące poszczególnych naczyń (poszczególne naczynia uznaje się za kontrpróby). Odpowiednie metody statystyczne należy stosować zgodnie z dokumentem OECD "Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application" (11). Ogólnie rzecz biorąc, niekorzystne skutki podania badanej substancji chemicznej w porównaniu z grupą kontrolną bada się, stosując test jednostronnej (mniejszej) hipotezy na poziomie p ≤ 0,05.
Sprawozdanie z badania
59. Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje: Badana substancja chemiczna
- nazwa zwyczajowa, nazwa systematyczna, numer CAS, czystość;
- właściwości fizykochemiczne badanej substancji chemicznej (np. log Kow, rozpuszczalność w wodzie, prężność pary, stała Henry'ego (H) i ewentualne informacje na temat losów badanej substancji chemicznej, np. adsorpcji przez osad czynny).
Układ badawczy
- źródło, warunki działania oczyszczalni ścieków i odprowadzane do niej ścieki, stężenie, wstępna obróbka i przechowywanie osadu czynnego.
Warunki badania
- temperatura badania, pH w trakcie badania oraz czas trwania faz narażenia. Wyniki
- specyficzne zużycie tlenu w grupach kontrolnych (mg O2/(g osad × h);
- wszystkie zmierzone dane, krzywe zahamowania oraz metoda obliczania EC50;
- EC50 oraz w miarę możliwości granice ufności na poziomie 95 %, ewentualnie EC20, EC80; ewentualnie NOEC i zastosowane metody statystyczne, jeżeli nie można określić EC50;
- wyniki zahamowania całkowitego oraz w stosownych przypadkach zahamowania oddychania organizmów heterotroficznych i nitryfikacyjnych;
- abiotyczny pobór tlenu w fizykochemicznej grupie kontrolnej (jeżeli została użyta);
- nazwa chemicznej substancji odniesienia i wyniki badań z użyciem tej substancji chemicznej;
- wszelkie uwagi i odstępstwa od standardowej procedury, które mogły wpłynąć na wynik.
BIBLIOGRAFIA
(1) Brown, D., Hitz, H.R. i Schäfer, L. (1981). The assessment of the possible inhibitory effect of dyestuffs on aerobic waste-water bacteria, Experience with a screening test. Chemosphere 10 (3): 245-261.
(2) King, E. F. i Painter H. A. (1986). Inhibition of respiration of activated sludge; variability and reproducibility of results. Toxicity Assessment 1(1): 27-39.
(3) OECD (1984), Activated sludge, Respiration inhibition test, Test Guideline No. 209, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paryż.
(4) ISO (2007). ISO 8192 Jakość wody - Badanie hamowania zużycia tlenu przez osad czynny do utleniania związków zawierających węgiel i amon, Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna.
(5) Bealing, D. J. (2003). Dokument ISO/TC147/WGI/N.183, Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna.
(6) Painter, H A, Jones K (1963). The use of the wide-bore dropping-mercury electrode for the determination of the rates of oxygen uptake and oxidation of ammonia by micro-orgranisms. Journal of Applied Bacteriology 26 (3): 471-483.
(7) Painter, H. A. (1986). Testing the toxicity of chemicals by the inhibition of respiration of activated sludge. Toxicity Assessment 1:515-524.
(8) Robra, B. (1976). Wasser/Abwasser 117, 80.
(9) Fiebig S. i Noack, U. (2004). The use of copper(II)sulphate pentahydrate as reference substance in the activated sludge respiration inhibition test - acc. to the OECD guideline 209. Fresenius Environmental Bulletin 13 No. 12b: 1556-1557.
(10) ISO (1995). ISO 10634 Jakość wody - Wytyczne dotyczące przygotowania i obróbki słabo rozpuszczalnych związków organicznych w celu oceny ich biodegradacji w środowisku wodnym, Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna.
(11) OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: a guidance to application, Seria OECD dotycząca badań i oceny, nr 54, ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paryż.
Dodatek 1
Definicje
Do niniejszej metody badawczej mają zastosowanie podane poniżej definicje.
Substancja chemiczna oznacza substancję lub mieszaninę.
ECx (stężenie efektywne x %) jest stężeniem mającym x % wpływu na organizmy użyte do badania w danym okresie narażenia, w porównaniu z próbą kontrolną. Na przykład EC50 jest stężeniem, które w przybliżeniu ma wpływ na punkt końcowy badania w 50 % narażonej populacji w określonym okresie narażenia.
NOEC (stężenie, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian) oznacza stężenie badanej substancji chemicznej, przy którym nie obserwuje się żadnych zmian. W niniejszym badaniu stężenie odpowiadające NOEC nie ma statystycznie istotnego skutku (p < 0,05) w danym okresie narażenia, jeżeli porówna się je z próbą kontrolną.
Badana substancja chemiczna oznacza dowolną substancję lub mieszaninę badaną za pomocą niniejszej metody badawczej.
Dodatek 2
Rys. 1: Przykłady układu pomiarowego
Legenda
1 osad czynny 6 mieszadło magnetyczne
2 pożywka syntetyczna 7 komora do pomiaru zmian stężenia tlenu
3 badana substancja chemiczna 8 elektroda tlenowa
4 powietrze 9 przyrząd do pomiaru stężenia tlenu
5 naczynie do mieszania 10 rejestrator
Dodatek 3
Rys. 2: Przykład układu pomiarowego z zastosowaniem butelki do oznaczania BZT
Legenda
1 naczynie badawcze
2 elektroda tlenowa
3 przyrząd do pomiaru stężenia tlenu
Dodatek 4
Rys. 3: Przykład krzywych zahamowania
Legenda
X stężenie 3,5-dichlorofenolu (mg/l)
Y zahamowanie (%)
■ zahamowanie oddychania organizmów heterotroficznych przy zastosowaniu osadu nitryfikującego
• zahamowanie nitryfikacji przy zastosowaniu osadu nitryfikującego
C.12. BIODEGRADACJA
ZMODYFIKOWANE BADANIE SCAS
1. METODA
1.1. WSTĘP
Celem metody jest ocena wpływu całkowitej biodegradacji rozpuszczalnych w wodzie, nielotnych substancji organicznych, w przypadku ich ekspozycji na stosunkowo wysokie stężenia drobnoustrojów przez długi okres czasu. Żywotność drobnoustrojów utrzymywana jest przez ten okres, codziennie dodając zasiedloną pożywkę szlamową. (Odnośnie do wymogów związanych z przerwą weekendową, ścieki można przechowywać w temperaturze 4 oC. W związku z tym można użyć syntetycznych ścieków (test potwierdzający OECD).
Może mieć miejsce fizyczna i chemiczna adsorpcja zawieszonych substancji stałych, co należy wziąć pod uwagę przy interpretacji wyników (zob. 3.2).
Z powodu długiego okresu zatrzymania fazy płynnej (36 godzin) i nieregularnego dodawania odżywek badanie nie pozoruje faktycznych warunków występujących w oczyszczalni ścieków. Wyniki otrzymane z różnymi substancjami testowymi oznaczają, iż badanie wykazuje wysoki wpływ biodegradacyjny.
Warunki stworzone w badaniu wysoce sprzyjają wyborowi i/lub przystosowaniu drobnoustrojów zdolnych do degradacji badanego związku. (Procedurę można również wykorzystać w celu wytworzenia zaaklimatyzowanego inokulum mogącego być zastosowanym w innych badaniach).
W metodzie tej pomiar stężenia rozwiązanego węgla organicznego lub chemicznego zapotrzebowania tlenu wykorzystywany jest w celu określenia całkowitej biodegradacji substancji testowej. Najlepiej ustalać DOC po zakwaszeniu i oczyszczeniu niż jako różnicę Ccałkowite - Cnieorganiczne.
Równoczesne zastosowanie szczególnej metody analitycznej może umożliwić ocenę podstawowej biodegradacji substancji (zanik pierwotnej budowy chemicznej).
Metodę stosuje się jedynie w odniesieniu do tych organicznych substancji testowych, które przy wielkości stężenia użytego w badaniu:
- są rozpuszczalne w wodzie (przy co najmniej 20 ml rozpuszczonego węgla organicznego/litr),
- posiadają nieznaczne ciśnienie pary,
- nie hamują bakterii,
- nie są znacznie absorbowane w badanym systemie,
- nie są tracone w wyniku wytwarzania piany z badanego roztworu.
Należy ustalić zawartość węgla w organicznym materiale testowym.
Informacje dotyczące względnych części składowych materiału testowego będą użyteczne przy interpretacji otrzymanych wyników, w szczególności w tych przypadkach gdzie wyniki są na niskim poziomie lub marginalne.
Informacje dotyczące wpływu toksyczności substancji na drobnoustroje mogą okazać się użyteczne w celu dokonania interpretacji słabych wyników oraz wyboru właściwych wielkości stężeń.
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI
CT = stężenie testowego związku jako węgla organicznego obecnego w lub dodawanego do osadzonego ścieku na początku czasu napowietrzania (mg/litr),
Ct = stężenie rozwiązanego węgla organicznego w supernatanie substancji testowej na końcu czasu napowietrzania (mg/litr),
Cc = stężenie rozwiązanego węgla organicznego w supernatanie w grupie kontrolnej na końcu czasu napowietrzania (mg/litr).
W metodzie tej biodegradacja określana jest jako zanik węgla organicznego. Biodegradację można wyrazić jako:
1. Procent ubytku Dda ilości substancji dodawanej codziennie:
[1]
gdzie:
Dda = degradacja/dzienna dawka dodana
2. Procent ubytku Dssd ilości substancji obecnej przy rozpoczęciu każdego dnia badania:
[2(a)]
[2(b)]
gdzie:
Dssd = degradacja/substancja przy rozpoczęciu każdego dnia; wskaźniki i oraz (i + 1) odnoszą się do dnia pomiaru.
Zaleca się równanie 2a) w przypadku, gdy ciecz wypływająca ze zbiornika DOC różni się z dnia na dzień, podczas gdy równanie 2b) można zastosować w przypadku, gdy ciecz wypływająca ze zbiornika DOC pozostaje na względnie stałym poziomie w kolejnych dniach.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
W niektórych przypadkach podczas badania nowych substancji użyteczne mogą okazać się substancje odniesienia; jednakże nie można zalecić żadnych poszczególnych substancji odniesienia.
Dane dotyczące kilku związków chemicznych przeanalizowanych za pomocą prób pierścieniowych dostarczane są głównie w celu przeprowadzenia (zob. dodatek 1) kalibracji metody odpowiednio do potrzeb i umożliwienia dokonania porównania wyników w przypadku zastosowania innej metody.
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Aktywowany szlam, pochodzący z oczyszczalni ścieków, umieszczany jest w jednostce działającej na zasadzie szlamu aktywowanego o przepływie półstałym (SCAS). Następnie dodawany jest badany związek oraz wewnętrzne ścieki, po czym następuje napowietrzanie mieszaniny przez 23 godziny. Po 23 godzinach napowietrzanie zostaje przerwane w celu umożliwienia osadzenia się szlamu i ubytku supernatantów
Następnie szlam pozostały w komorze napowietrzania jest mieszany z dalszą podwielokrotnością badanego związku i ścieku, a cykl jest powtarzany.
Biodegradacja ustalana jest przez określenie zawartości rozwiązanego węgla organicznego w supernatancie. Uzyskana wartość porównywana jest z wartością ustaloną dla płynu otrzymanego z probówki kontrolnej dozowanej jedynie osiadłym ściekiem.
W przypadku użycia szczególnej metody analitycznej można dokonać pomiaru zmian w stężeniu pierwotnej molekuły w wyniku biodegradacji (podstawowa biodegradacja).
1.5. KRYTERIA JAKOŚCIOWE
Reprodukcyjność metody, oparta na ubytku rozwiązanego węgla organicznego, nie została jeszcze ustalona. (W przypadku rozważania podstawowej biodegadacji bardzo dokładne dane uzyskiwane są w odniesieniu do materiałów degradowanych ekstensywnie).
Czułość metody jest przeważnie ustalana przez zmienność próbki ślepej i, w mniejszym stopniu, przez precyzję określenia rozwiązanego węgla organicznego i poziomu badanego związku w roztworze po rozpoczęciu każdego cyklu.
1.6. OPIS PROCEDURY BADAWCZEJ
1.6.1. Przygotowania
Dla każdej substancji testowej oraz grup kontrolnych składana jest odpowiednia liczba czystych napowietrzanych jednostek, ewentualnie można zastosować oryginalne, 1,5-litrowe jednostki badawcze SCAS oraz probówki doprowadzające powietrze (rysunek 1). Sprężone powietrze doprowadzane do jednostek testowych, oczyszczone przez bawełniano-wełniany filtr, nie powinno zawierać węgla organicznego oraz powinno zostać nasycone wodą w celu obniżenia jej ubytku wskutek parowania.
Próbka zmieszanego płynu, zawierająca 1-4 g zawieszonej suchej masy na litr, otrzymywana jest z oczyszczalni ścieków, oczyszczającej w głównej mierze ścieki wewnętrzne. Wymagane jest około 150 ml zmieszanego płynu dla każdej napowietrzanej jednostki.
Roztwory podstawowe substancji testowej przygotowywane są w wodzie destylowanej; wymagana wartość stężenia zazwyczaj wynosi 400 mg/litr, tak jak węgiel organiczny, którego stężenie substancji testowej wynosi 20 mg/litr węgla na początku każdego cyklu napowietrzania, jeżeli nie zachodzi biodegradacja.
Dopuszczane są wyższe stężenia, jeżeli pozwala na to wpływ toksyczności na drobnoustroje.
Skład węgla organicznego roztworów podstawowych podlega pomiarowi.
1.6.2. Warunki badania
Badanie należy przeprowadzić w temperaturze 20-25 oC.
Stosowane jest wysokie stężenie drobnoustrojów tlenowych (1-4 g/litr zawieszonej suchej masy), a skuteczny okres zatrzymania wynosi 36 godzin. Materiał zawierający węgiel w pożywce szlamowej jest rozlegle utleniany, zazwyczaj w ciągu ośmiu godzin od rozpoczęcia każdego cyklu napowietrzania. Od tego czasu szlam oddycha endogenicznie przez pozostały czas napowietrzania, w którym jedyny dostępny substrat stanowi związek testowy, jeżeli również nie ulega łatwej metabolizacji. Cechy te, połączone z codziennym szczepieniem substancją testową, w przypadku zastosowania wewnętrznego ścieku jako pożywki, zapewniają wysoce korzystne warunki zarówno dla aklimatyzacji, jak i dla wysokiego stopnia biodegradacji.
1.6.3. Przeprowadzenie badania
Próbka zmieszanego płynu pochodząca z oczyszczalni ścieków, oczyszczającej w głównej mierze ścieki wewnętrzne lub jednostki laboratoryjnej, uzyskiwana jest i utrzymywana w warunkach tlenowych aż do chwili jej użycia w laboratorium. Każda napowietrzana jednostka, a także jednostka kontrolna wypełniana jest 150 ml zmieszanego płynu (w przypadku użycia oryginalnej jednostki testowej SCAS należy pomnożyć dane wielkości przez 10) i rozpoczyna się napowietrzanie. Po 23 godzinach napowietrzanie zostaje przerwane na 45 minut, w celu umożliwienia osadzenia się szlamu. Z kolei należy otworzyć zawór każdego zbiornika i pobrać 100 ml porcję supernatanu. Próbka osiadłego ścieku wewnętrznego powinna zostać pobrana bezpośrednio przed jej użyciem i 100 ml dodawane jest do szlamu pozostającego w każdej napowietrzanej jednostce. Proces napowietrzania rozpoczyna się od nowa. W tej fazie nie są dodawane żadne materiały testowe, a jednostki zasilane są codziennie wyłącznie wewnętrznymi ściekami aż do chwili otrzymania czystego supernatanu po osadzeniu. Powyższa faza zazwyczaj trwa dwa tygodnie, podczas których rozwiązany węgiel organiczny w supernatanie zbliża się do stałej wartości na końcu każdego cyklu napowietrzania.
Po upływie tego okresu poszczególne osadzone szlamy należy zmieszać i dodać 50 ml otrzymanego w ten sposób połączonego szlamu do każdej jednostki.
95 ml osadzonego ścieku i 5 ml wody dodawane jest do jednostek kontrolnych, i 95 ml osadzonego ścieku plus 5 ml właściwego roztworu podstawowego badanego związku (400 mg/litr) dodawane jest do jednostek testowych. Napowietrzanie należy rozpocząć od nowa i kontynuować przez 23 godziny. Następnie należy umożliwić osadzenie się szlamu przez okres 45 minut oraz należy ściągnąć i przeanalizować supernatan w celu ustalenia składu rozwiązanego węgla organicznego.
Powyższą procedurę napełniania i ściągania powtarza się codziennie przez cały okres trwania badania.
Przed osadzeniem konieczne jest oczyszczenie ścian jednostek w celu zapobieżenia nagromadzania się suchej masy ponad poziom płynu. W tym celu należy użyć oddzielnego skrobaka lub szczotki dla każdej z jednostek, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
Najlepiej, aby wartość rozwiązanego węgla organicznego w supernatanie ustalana była codziennie, chociaż dopuszcza się rzadsze przeprowadzanie analiz. Przed przeprowadzeniem analiz płyny filtrowane są przez oczyszczone 0,45 μm filtry membranowe lub odwirowywane. Filtry membranowe są odpowiednie jeżeli zostanie potwierdzone, iż nie uwalniają węgla, ani nie absorbują substancji w fazie filtracji. Temperatura próbki nie może przekraczać 40 oC w chwili umieszczenia jej w wirówce laboratoryjnej.
Długość trwania badania w odniesieniu do związków wykazujących niską lub zerową biodegradację nie jest określona, ale doświadczenie sugeruje, iż taki okres powinien trwać co najmniej 12 tygodni, ale nie dłużej niż 26 tygodni.
2. DANE I OSZACOWANIE
Wartości rozwiązanego węgla organicznego w supernatanach w jednostkach testowych i jednostkach kontrolnych nanoszone są na wykres względem czasu.
W przypadku osiągnięcia biodegradacji jej poziom określony w jednostce badawczej zbliży się do poziomu w jednostce kontrolnej. Po ustaleniu stałej różnicy między dwoma poziomami w trzech kolejnych pomiarach liczba kolejnych pomiarów uzależniona jest od możliwości dokonania statystycznej analizy danych oraz należy obliczyć procentową biodegradację związku testowego (Dda lub Dssd, zob. 1.2).
3. SPRAWOZDANIE
3.1. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań powinno, jeżeli możliwe, zawierać następujące informacje:
- wszelkie informacje dotyczące rodzaju ścieku, typu zastosowanej jednostki oraz wyniki badania dotyczące substancji testowej, substancji odniesienia, jeżeli została użyta, oraz próbki ślepej,
- temperatura,
- krzywa ubytku związku wraz z opisem, sposób obliczania (zob. 1.2),
- data i lokalizacja pobrania próbki aktywowanego szlamu i ścieku, poziom przystosowania, stężenie itd.,
- naukowe powody jakichkolwiek zmian procedury badawczej,
- data i podpis.
3.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW
Ponieważ substancja przeznaczona do badania niniejszą metodą nie będzie ulegać łatwej biodegradacji, jakikolwiek ubytek DOC spowodowany wyłącznie biodegradacją przebiegać będzie stopniowo w okresie dni i tygodni, z wyjątkiem takich przypadków, gdzie aklimatyzacja jest nagła i zasygnalizowana nagłym zniknięciem substancji następującym po okresie kilku tygodni.
Jednakże fizyko-chemiczna adsorpcja może w niektórych przypadkach odegrać istotną rolę; sygnalizowane jest to w chwili gdy następuje całkowity lub częściowy ubytek dodanego DOC na początku badania. To, co następuje później, zależy od czynników, takich jak stopnie adsorpcji i stężenia zawieszonej suchej masy w odrzuconej cieczy wypływającej ze zbiornika. Zwykle różnica między stężeniami DOC w supernatanach w grupie kontrolnej i w grupie badanej stopniowo wzrasta od początkowej niskiej wartości, a następnie utrzymuje się na nowym poziomie wartości w pozostałym okresie badania, jeżeli nie zachodzi aklimatyzacja.
Konieczne jest przeprowadzenie dalszych badań, jeżeli istnieje potrzeba rozróżnienia między biodegradacją (lub częściową biodegradacją) i adsorpcją. Można to osiągnąć na wiele sposobów, ale najbardziej przekonujące jest użycie supernatantu lub szlamu jako inokulum w teście podstawowym (najlepiej teście respirometrycz-nym).
Substancje testowe powodujące wysoki, nieadsorpcyjny ubytek DOC w niniejszym badaniu należy uważać za substancje wpływające biodegradacyjnie. Częściowy, nieadsorpcyjny ubytek oznacza, że substancja chemiczna ulega co najmniej nieznacznej biodegradacji.
Niski, lub zerowy poziom ubytku DOC może być spowodowany zahamowaniem aktywności drobnoustrojów przez substancję testową, co można również wykryć przez rozpad lub utratę szlamu, dającego mętne supernatany. Badanie należy powtórzyć, wykorzystując niskie stężenie substancji testowej.
Użycie specyficznej dla danego związku metody analitycznej lub substancji testowej znakowanej izotopem węgla 14C zwiększa czułość metody. W przypadku związków znakowanych 14C odzyskanie 14CO2 potwierdzi, że zaszła biodegradacja.
W przypadku podawania wyników z uwzględnieniem początkowej biodegradacji, jeżeli możliwe, należy wyjaśnić zmianę w budowie chemicznej, która powoduje utratę reakcji macierzystej substancji testowej.
Zatwierdzenie metody analitycznej musi być dostarczone razem z reakcją, która zaszła w próbce ślepej.
4. ODNIESIENIA
(1) OECD, Paryż, 1981, Wytyczne badania 209, decyzja Rady C (81) 30 wersja ostateczna.
Dodatek 1
Badanie SCAS: przykładowe wyniki
| Substancja | CT (mg/l) | Ct - Cc (mg/l) | Procentowa biodegradacja, Dda | Czas trwania badania (dni) |
| Sulfonian 4-acetyloaminobenzenu | 17,2 | 2,0 | 85 | 40 |
| Sulfonian tetrapropylenobenzenu | 17,3 | 8,4 | 51,4 | 40 |
| 4-nitrofenol | 16,9 | 0,8 | 95,3 | 40 |
| Glikol dietylenowy | 16,5 | 0,2 | 98,8 | 40 |
| Anilina | 16,9 | 1,7 | 95,9 | 40 |
| Cyklopentanotetrakarboksylan | 17,9 | 3,2 | 81,1 | 120 |
Dodatek 2
Przykładowe urządzenia badawcze
C.13. BIOKONCENTRACJA: BADANIE RYB W WARUNKACH PRZEPŁYWU
1. METODA
Ta metoda biokoncentracji jest powtórzeniem OECD WT 305 (1996).
1.1. WPROWADZENIE
Metoda ta opisuje procedurę charakteryzowania biokoncentracyjnego potencjału substancji znajdujących się w rybach w warunkach przepływu. Chociaż preferuje się bardziej wymogi obowiązujące dla badań w warunkach przepływu, dopuszczalne są wymogi obowiązujące dla badań w warunkach częściowo statycznych, pod warunkiem że spełnione są kryteria prawidłowości.
Metoda podaje wystarczające szczegóły dla przeprowadzenia badania, jednocześnie zezwalając na stosowną dowolność w dostosowywaniu procedury doświadczalnej do warunków w poszczególnych laboratoriach oraz na zróżnicowane właściwości substancji badanych. Jest ona najbardziej prawidłowo stosowana w odniesieniu do chemikaliów organicznych o wartościach log Pow między 1,5 i 6,0 (1), ale może być także stosowana do substancji superlipofilowych (o wartości log Pow > 6,0). Wstępne oszacowanie czynnika biokoncentracji (BCF), czasami oznaczanego jako KB, dla takich substancji będzie prawdopodobnie wyższe niż wartość czynnika biokoncentracji w stanie ustalonym (BCFSS), które spodziewa się uzyskać w doświadczeniach laboratoryjnych. Wstępne oszacowania czynnika biokoncentracji dla chemikaliów organicznych o wartościach log Pow wynoszących około 9,0 można uzyskać, stosując równanie Binteina i inne (2). Parametry, które charakteryzują potencjał biokoncentracji, zawierają stałą szybkość absorpcji (k1), stałą szybkość oczyszczania (k2) oraz BCFSS.
Substancje badane oznakowane radiologicznie mogą ułatwić analizę próbek wody i ryb oraz mogą być wykorzystywane do określania, czy konieczne jest wykonanie identyfikacji i kwantyfikacji degradacji. Jeżeli mierzony jest ogół pozostałości radioaktywnych (np. przez spalanie lub rozpuszczanie tkanki), BCF jest oparte na związku macierzystym, wszelkich zatrzymanych metabolitach, a także na asymilowanym węglu. Z tego względu BCFS, oparty na ogóle pozostałości radioaktywnych, nie może być bezpośrednio porównywalny z BCF uzyskiwanym w drodze szczegółowej analizy chemicznej wyłącznie związku macierzystego.
W badaniach substancji oznaczonych radiologicznie można zastosować procedury oczyszczania w celu określenia czynnika BCF w oparciu o związek macierzysty i, jeżeli uzna się to za konieczne, można opisać główne metabolity. Możliwe jest także połączenie badania metabolizmu ryb z badaniem biokoncentracji poprzez analizę i identyfikacje pozostałości w tkankach.
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI
Biokoncentracja/bioakumulacja: jest wzrostem koncentracji substancji badanej w organizmie lub na nim (jego określonych tkankach), w stosunku do koncentracji substancji badanej w otaczającym środowisku.
Czynnik biokoncentracji (BCF lub KB) w każdym momencie w trakcie fazy absorpcji tego badania akumulacji jest stężeniem substancji badanej w/na rybie lub w jej określonych tkankach (Cf jako μg/g (ppm)), podzielone przez koncentrację tej substancji chemicznej w otaczającym środowisku (Cw jako μg/ml (ppm)).
Stały czynnik biokoncentracji (BCFSS lub KB) nie zmienia się znacząco w długim okresie czasu, stężenie substancji badanej w otaczającym środowisku w tym okresie czasu jest stale.
Plateau lub stan ustalony osiągany jest, wykreślając ilość substancji badanej w rybach (Cf) w zależności od momentu, kiedy krzywa staje się równoległa do osi czasu, a trzy następujące po sobie analizy Cf, wykonane na próbkach pobranych w odstępach, co najmniej dwóch dni, różnią się od siebie o ± 20 % i nie ma znacznych różnic między trzema okresami pobierania próbek. Przy wspólnej analizie próbek wymagane są przynajmniej cztery następujące po sobie analizy. W odniesieniu do substancji badanych, które są pobierane powoli, odstępy czasu powinny wynosić odpwiednio siedem dni.
Czynniki biokoncentracji, obliczane bezpośrednio ze stałych wskaźników kinetycznych (k1/k2), określane są jako czynniki koncentracji kinetycznej, BCFK.
Współczynnik podziału oktanol-woda (Pow) jest to stosunek rozpuszczalności substancji chemicznej w n-oktanolu i wodzie w równowadze (metoda A.8), wyrażany także jako Kow. Logarytm Pow wykorzystywany jest jako wskaźnik zdolności substancji chemicznej do biokoncentracji przez organizmy wodne.
Faza narażenia na działanie substancji j absorpcji jest to czas, w trakcie którego ryby narażone są na działanie badanej substancji chemicznej.
Stała szybkość absorpcji (k1) jest wartością liczbową określającą tempo wzrostu koncentracji substancji badanej w rybach i na nich (lub w nich czy ich określonych tkankach) w czasie gdy ryby wystawione są na działanie tej substancji (k1 wyraża się w dniach-1).
Faza po narażeniu na działanie substancji/oczyszczania (ubytku) jest to czas następujący po przeniesieniu ryb ze środowiska zawierającego substancje do środowiska wolnego od tej substancji, w trakcie którego badane jest oczyszczanie (lub ich określonych tkanek) z substancji (ubytek netto).
Stała szybkość oczyszczania (ubytku) (k2) jest wartością liczbową określającą tempo zmniejszania koncentracji substancji badanej w badanych rybach (lub ich określonych tkankach) po przeniesieniu badanych ryb ze środowiska zawierającego substancje badaną do środowiska wolnego od tej substancji (k2 wyrażana jest w dniach-1).
1.3. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Badanie składa się z dwóch faz: faza narażenia na działanie substancji (absorpcja) i faza po narażeniu na działanie substancji (oczyszczania). Podczas fazy absorpcji oddzielne grupy ryb jednego gatunku narażone są na działanie substancji badanej o co najmniej dwóch różnych stężeniach. Następnie ryby przenosi się do środowiska wolnego od substancji badanej w celu przeprowadzenia fazy oczyszczania. Faza oczyszczania jest zawsze konieczna, chyba że absorpcja substancji podczas fazy absorpcji jest nieznaczna (np. czynnik BCF jest mniejszy niż 10). Stężenie substancji badanej w/na rybach (lub w ich określonych tkankach) śledzi się w obu fazach badania. Oprócz dwóch badań stężeń substancji badanej, kontrolowaną grupę ryb przetrzymuje się w identycznych warunkach, z wyjątkiem obecności substancji badanej, w celu odniesienia możliwych negatywnych skutków zaobserwowanych w badaniu biokoncentracji do odpowiedniej grupy kontrolowanej oraz w celu uzyskania bazowych stężeń substancji badanej.
Faza absorpcji trwa 28 dni, jeżeli nie wykaże się, że równowaga została osiągnięta wcześniej. Przewidywany czas trwania fazy absorpcji i czas osiągnięcia stanu ustalonego można obliczyć w oparciu o równanie podane w załączniku 3. Następnie rozpoczyna się okres oczyszczania przez przeniesienie ryb do takiego samego środowiska, ale bez substancji badanej w innym czystym naczyniu. W miarę możliwości czynnik biokoncentracji oblicza się zarówno jako stosunek (BCFSS) stężenia w rybach (Cf) i w wodzie (Cw) w pozornym stanie ustalonym, jak też jako kinetyczny czynnik biokoncentracji (BCFK), będący stosunkiem stałych szybkości absorpcji (k1) i oczyszczania (k2), uznając kinetykę reakcji pierwszego rzędu. Jeżeli kinetyka reakcji pierwszego rzędu jest w oczywisty sposób nieprzestrzegana, należy zastosować bardziej złożone wzory (załącznik 5).
Jeżeli stanu ustalonego nie osiągnie się w ciągu 28 dni, fazę absorpcji należy przedłużyć do czasu osiągnięcia stanu ustalonego lub do 60 dni, w zależności od tego, co nastąpi najpierw; następnie rozpoczyna się fazę oczyszczania.
Stała szybkość absorpcji, stała szybkość reakcji (lub stałe w przypadku gdy zastosowane są bardziej złożone wzory) oczyszczania (ubytku), czynnik biokoncentracji oraz, w miarę możliwości, przedziały ufności dla każdego z tych parametrów oblicza się w oparciu o wzór, który najlepiej opisuje mierzone stężenia substancji badanej w rybach i wodzie.
BCF wyraża się jako funkcje całkowitej mokrej masy ryb. Jednakże do szczególnych celów można wykorzystać określone tkanki lub organy (np. mięsnie, wątroba), jeżeli ryby są wystarczająco duże, lub podzielić ryby na części jadalne (filet) i niejadalne (wnętrzności). Ze względu na to, że w odniesieniu do wielu substancji organicznych istnieje wyraźny związek między zdolnością do biokoncentracji i lipofilowości, istnieje także odpowiadająca mu zależność między zawartością lipidów w rybach i zaobserwowaną biokoncentracją takich substancji. Dlatego w celu zmniejszenia tego źródła zróżnicowania w wynikach badania dla substancji o wysokiej lipofilowosci (tj. o log Pow > 3) biokoncentracja powinna być wyrażona w odniesieniu do zawartości lipidów oprócz całkowitej masy ciała.
Zawartość lipidów powinna być określana na takim samym materiale biologicznym, jaki jest wykorzystywany dla określania substancji badanej, jeżeli jest to możliwe.
1.4. INFORMACJE DOTYCZĄCE SUBSTANCJI BADANEJ
Przed przeprowadzaniem badania na biokoncentrację powinny być znane następujące informacje dotyczące substancji badanej:
- rozpuszczalność w wodzie,
- współczynnik podziału oktanol-woda Pow (oznaczany także jako Kow ustalany za pomocą metody HPLC w A.8),
- hydroliza,
- fotodysocjacja w wodzie, określana w warunkach napromieniowania słonecznego lub symulowanym napromienianiu słonecznym i w warunkach napromieniania badania na biokoncentracji (3),
- napięcie powierzchniowe (np. dla substancji, dla których nie można ustalić log Pow),
- prężność pary,
- biodegradalność inicjalna (jeżeli dotyczy).
Inną wymaganą informacją jest toksyczność dla ryb, które mają być wykorzystywane w trakcie badania, najlepiej asymptotyczna LC50 (tj. niezależna od czasu). Dostępna musi być odpowiednia metoda analizy o potwierdzonej dokładności, precyzji i czułości, dla kwantyfikacji substancji badanej w roztworach badawczych i materiale biologicznym, wraz ze szczegółami dotyczącymi przygotowania i składowania próbki. Powinna być również znana analityczna granica detekcji substancji badanej zarówno w wodzie, jak i w tkankach ryb. Jeśli wykorzystywana jest substancja oznakowana 14C, powinien być znany udział radioaktywności związany z zanieczyszczeniami.
1.5. WAŻNOŚĆ BADANIA
Następujące warunki powinny mieć zastosowanie w odniesieniu do badania, aby było ono ważne:
- zmiana temperatury jest mniejsza niż ± 2 oC,
- stężenie rozpuszczonego tlenu nie spada poniżej 60 % nasycenia,
- stężenie substancji badanej w komorach utrzymuje się na poziomie ± 20 % średniej zmierzonych wartości w trakcie fazy absorpcji,
- śmiertelność lub inne negatywne skutki/choroby, zarówno wśród ryb kontrolnych, jak i badanych, jest mniejsza niż 10 % po zakończeniu badania; w przypadku gdy badanie jest przedłużone o kilka tygodni lub miesięcy, śmiertelność lub inne negatywne skutki w obydwu grupach ryb powinny być niższe niż 5 % w stosunku miesięcznym i całkowicie nie powinny przekraczać 30 %.
1.6. ZWIĄZKI ODNIESIENIA
Wykorzystanie związków odniesienia o znanej zdolności do biokoncentracji może być użyteczne przy sprawdzaniu procedury doświadczalnej, jeżeli jest to wymagane. Jednakże niemożliwe jest na razie polecenie konkretnych substancji.
1.7. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.7.1. Aparatura
Należy zadbać, aby unikać wykorzystywania w odniesieniu do wszystkich części aparatury, materiałów, które mogą rozpuszczać się, sorbować lub ługować i wywoływać szkodliwe skutki dla ryb. Można wykorzystywać standardowe, prostokątne lub cylindryczne zbiorniki, wykonane z materiałów chemicznie obojętnych i o odpowiedniej pojemności, zgodnej ze wskaźnikiem pojemności. Wykorzystanie rur z miękkiego plastiku powinno być minimalne. Zalecane jest wykorzystywanie rur teflonowych, ze stali nierdzewnej i/lub szklanych. Doświadczenie wskazało, że dla substancji o wysokich współczynnikach absorpcji, jak np. syntetyczne pyretroidy, może być wymagane szkło silanizowane. W takich sytuacjach sprzęt będzie musiał po zostać wyrzucony po wykorzystaniu.
1.7.2. Woda
Zwykle do badania wykorzystywana jest woda naturalna, która powinna być uzyskiwana z niezanieczyszczo-nego źródła oraz ze źródła o jednolitej jakości. Woda rozcieńczana powinna być jakości, która pozwoli na przetrwanie wybranych gatunków ryb przez okres trwania aklimatyzacji i okres badań oraz nie będzie powodowała pojawienia się nieprawidłowego ich wyglądu lub zachowania. W idealnym przypadku powinno się wskazać, że badane gatunki mogą przeżyć, rosnąć i rozmnażać się w wodzie rozcieńczonej (np. badanie w warunkach laboratoryjnych lub na toksyczność w cyklu życia). Woda powinna być scharakteryzowana, przynajmniej przez pH, twardość, całkowitą zawartość ciał stałych, całkowitą zawartość węgla organicznego
oraz w miarę możliwości amonu, azotynu oraz alkaliczności i, w odniesieniu do gatunków morskich, zasolenia. Parametry, które są ważne dla optymalnego dobrostanu ryb, są znane w pełni, jednak załącznik 1 podaje zalecane najwyższe stężenia kilku parametrów dla badanych wód słodkich i morskich.
W czasie trwania badania jakość wody powinna być stała. Wartość pH powinna mieścić się w zakresie 6,0-8,5, ale podczas danego badania powinna wynosić ± 0,5 jednostek pH. W celu zapewnienia, że woda rozcieńczana nie wpłynie negatywnie na wyniki badania (np. przez zmianę właściwości substancji badanej) lub na zachowanie ryb, co pewien czas należy pobierać próbki do analizy. Powinny zostać oznaczone zawartości metali ciężkich (np. Cu, Pb, Zn, Cd, Ni), głównych anionów i kationów (np. Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pestycydów (np. całkowitej zawartości pestycydów organofosforowych i organochlorowych), zawartości węgla organicznego i zawiesin, np. co trzy miesiące, w przypadku gdy wiadomo, że woda rozcieńczona ma względnie stałą jakość. Jeżeli wykazano, że woda ma stałą jakość przez okres co najmniej jednego roku, oznaczenia mogą być przeprowadzane rzadziej, a odstępy czasu między oznaczeniami wydłużone (np. co sześć miesięcy).
Naturalna zawartość cząstek, jak również całkowita zawartość węgla organicznego (TOC) wody do rozcieńczania powinna możliwie jak najniższa, w celu uniknięcia absorpcji substancji badanej do materii organicznej, która może zmniejszyć jej biodostępność (4). Najwyższa dopuszczalna wartość wynosi 5 mg/l dla cząstek stałych (masa sucha, która nie jest przepuszczana przez filtr 0,45 μm) oraz 2 mg/l dla całkowitej zawartości węgla organicznego (zob. załącznik 1). W miarę potrzeb woda powinna zostać przefiltrowana przed wykorzystaniem. Udział zawartości węgla organicznego w wodzie, z badania ryb (odchody) oraz z pozostałości pożywienia powinien być możliwie jak najniższy. W trakcie trwania badania stężenie węgla organicznego w naczyniu do badania nie powinno przekraczać stężenia węgla organicznego pochodzącego z substancji badanej i - jeżeli jest wykorzystywany - środka rozpuszczającego o więcej niż 10 mg/l (± 20 %).
1.7.3. Badane roztwory
Podstawowy roztwór substancji badanej przygotowywany jest w odpowiednim stężeniu. Roztwór podstawowy powinien być przygotowywany przez mieszanie lub wstrząsanie substancji badanej w wodzie do rozcieńczania. Nie zaleca się wykorzystywania rozpuszczalników lub dyspergatorów (czynników rozpuszczających); jednakże może to nastąpić w niektórych przypadkach, w celu wytworzenia roztworu podstawowego o odpowiednim stężeniu. Rozpuszczalniki, które mogą zostać wykorzystane, to etanol, metanol, eter monometylowy glikolu etylenowego, eter dwumetylenowy glikolu etylenowego, dwumetylo-formamid i glikol trójetylenowy. Dopuszczalne dyspergatory to kremofor RH40, Tween 80, metyloceluloza 0,01 % i HCO-40. Wykorzystując czynniki łatwo ulegające biodegradacji, należy zachować ostrożność, ponieważ mogą one powodować problemy z porostem bakterii w badaniach przepływowych. Substancja badana może być oznakowana radiologicznie i powinna być o możliwie największej czystości (np. > 98 %).
W odniesieniu do badań przepływowych wymagany jest system, który nieprzerwanie dostarcza i rozcieńcza roztwór podstawowy substancji badanej (np. pompa dozująca, rozcieńczalnik proporcjonalny, sytnik), w celu dostarczenia koncentratów badanych do komór badawczych. Zezwala się na co najmniej pięciokrotną wymianę całej objętości roztworu dziennie w każdej komorze badawczej. Preferowana ma być technika przepływowa, ale w przypadkach gdy nie jest to możliwe (np. gdy zachodzi negatywne działanie na organizmy badane), dopuszczalne jest stosowanie techniki półstatycznej, pod warunkiem że spełnione są kryteria ważności. Szybkość przepływu roztworów podstawowych i wody do rozcieńczania powinny być sprawdzane 48 godzin przed badaniem, a potem co najmniej raz dziennie. W tej kontroli zawarte jest określenie szybkości przepływu przez każdą komorę badawczą i zapewnione jest, że nie różni się ona między komorami i wewnątrz nich o więcej niż 20 %.
1.7.4. Wybór gatunków
Ważnymi kryteriami w wyborze gatunków jest fakt, że są one łatwo dostępne, mogą być uzyskane w odpowiednich rozmiarach i mogą być z powodzeniem przetrzymywane w laboratorium. Inne kryteria w odniesieniu do wybierania gatunków obejmują względy rekreacyjne, handlowe i ekologiczne, jak również porównywalną wrażliwość, pomyślne wykorzystanie w przeszłości itp.
Zalecane gatunki do badania są podane w załączniku 2. Inne gatunki mogą zostać wykorzystane, ale może istnieć konieczność dostosowania procedury badawczej celu zapewnienia odpowiednich warunków dla przeprowadzenia badania. W takim przypadku powinno zostać odnotowane racjonalne uzasadnienie w odniesieniu do wyboru gatunku i metody doświadczalnej.
1.7.5. Przetrzymywanie ryb
Podstawową populacje ryb aklimatyzować przez co najmniej dwa tygodnie w wodzie w temperaturze badania i karmić w oparciu o wystarczającą dietę, tego samego rodzaju, która ma być wykorzystana w trakcie badania.
Po 48-godzinnym okresie adaptacji odnotowuje się współczynnik śmiertelności i stosuje się następujące kryteria:
- śmiertelność wyższa niż 10 % populacji w ciągu siedmiu dni: odrzucić całą partię,
- śmiertelność między 5 i 10 % populacji w ciągu siedmiu dni: aklimatyzować przez dodatkowe siedem dni,
- śmiertelność niższa niż 5 % populacji w ciągu siedmiu dni: zaakceptować partię - jeżeli śmiertelność jest wyższa niż 5 % w ciągu siedmiu dodatkowych dni, odrzucić całą partię.
Zapewnić, że ryby wykorzystywane w badaniu są wolne od dostrzegalnych chorób i nieprawidłowości. Odrzucić wszystkie chore ryby. Ryby nie powinny być leczone na żadną chorobę w okresie dwóch tygodni poprzedzających badanie albo w trakcie badania.
1.8. PRZEPROWADZENIE BADANIA
1.8.1. Badanie wstępne
Może być ono użyteczne w celu przeprowadzenia wstępnego doświadczenia w celu zoptymalizowania warunków dla przeprowadzenia badania ostatecznego, np. wybór stężenia (stężeń) substancji, czasu trwania fazy absorpcji i oczyszczania.
1.8.2. Warunki narażenia na działanie substancji
1.8.2.1. Czas trwaniafazy wchłaniania
Przewidzenie czasu trwania fazy wchłaniania może zostać uzyskane w oparciu o doświadczenie praktyczne (np. z poprzedniego badania lub nagromadzenia powiązanej substancji chemicznej) lub w oparciu o pewne empiryczne związki wykorzystujące wiedzę dotyczącą albo rozpuszczalności w wodzie albo współczynnika podziału oktanol/woda substancji badanej (zob. załącznik 3).
Faza wchłaniania powinna trwać 28 dni, chyba że może zostać udowodnione, iż równowagę osiągnięto wcześniej. Jeśli stan ustalony nie został osiągnięty przed upływem 28 dni, faza absorpcji powinna zostać przedłużona, pobierając dalsze pomiary, do momentu osiągnięcia stanu ustalonego, lub też do 60 dni, w zależności od tego, który z tych dwóch okresów jest krótszy.
1.8.2.2. Czas trwania fazy oczyszczania
Okres połowy czasu trwania fazy absorpcji jest zazwyczaj wystarczający do zmniejszenia pojawiania się (95 %) substancji w masie ciała (zob. załącznik 3 dla wyjaśnienia oszacowania). Jeżeli czas wymagany do osiągnięcia 95 % straty jest zbyt długi, co jest jednocześnie niepraktyczne, przekraczając przykładowo dwukrotnie normalny czas trwania fazy absorpcji (tzn. więcej niż 5-6 dni), może zostać wykorzystany krótszy (np. do czasu, aż stężenie substancji badanej jest niższe niż 10 % stężenia substancji w stanie ustalonym). Jednakże w odniesieniu do substancji posiadającej bardziej złożone wzory absorpcji i oczyszczania niż te, które reprezentuje jednokomorowy model ryby i które oparte są na kinetyce pierwszego rzędu, można zastosować dłuższą fazę oczyszczania, w celu określenia stałych wartości wskaźnika utraty. Okres ten jednak może być regulowany przez okres, w trakcie którego stężenie substancji badanej w rybach pozostaje na poziomie powyżej analitycznego limitu wykrywania.
1.8.2.3. Liczba badanych ryb
Wybrać taką liczba ryb przypadającą na badanie, aby w każdej próbce były co najmniej cztery ryby. Jeśli wymagana jest większa ilość, niezbędna będzie większa liczba ryb przypadających na badanie. Jeśli wykorzystywane są dorosłe ryby, udokumentować przed czy w doświadczeniu wykorzystano samce, samice czy też obie płci.
Jeżeli wykorzystano ryby obu płci, udokumentować różnice występujące w zawartości lipidów, aby nie miały one znaczenia dla doświadczenia przed rozpoczęciem narażenia na działanie substancji; niezbędne może być połączenie wszystkich samic i samców ryb w jednym zbiorniku.
W jakimkolwiek badaniu wybierane są ryby o podobnej masie, tak aby masa najmniejszej z nich nie była mniejsza niż dwie trzecie masy największej z ryb. Wszystkie ryby powinny należeć do tej samej klasy wiekowej i pochodzić z tego samego źródła. Ze względu na to, że masa i wiek ryb mają znaczący wpływ na wartości BCF (1), szczegóły te są odpowiednio udokumentowane. Zaleca się zważenie podpróbki z zasobów ryb przed rozpoczęciem badania, w celu ustalenia średniej masy.
1.8.2.4. Dostarczanie ryb
Wykorzystuje się wysoką proporcję między ilością ryb i wody w celu zminimalizowania zmniejszenia w Cw spowodowanego przez dodanie ryb na początku badania, a także w celu uniknięcia spadku stężenia rozpuszczonego tlenu. Proporcje te są stosowane również w tym celu, aby uniknąć spadków stężenia rozpuszczonego tlenu. Ważne jest, aby wskaźnik dostarczenia ryb był odpowiedni dla poszczególnych badanych gatunków. W każdym przypadku zaleca się, aby wskaźnik dostarczenia ryb wynosił 0,1-1,0 g ryb
(masa mokra) na litr wody dziennie. Wysokie wskaźniki dostarczania ryb mogą być wykorzystane, jeśli wykaże się, że wymagane stężenie substancji badanej może być zachowane w ramach ograniczeń ± 20 % oraz że stężenie rozpuszczonego tlenu nie spada poniżej 60 % nasycenia.
Wybierając systemy dostarczania ryb, bierze się pod uwagę naturalne środowisko, w którym występują dane gatunki ryb. Na przykład ryby żyjące na dnie zbiorników mogą wymagać większej przestrzeni dna akwarium w odniesieniu do tej samej objętości wody niż ryby pelagiczne.
1.8.2.5. Karmienie
W czasie aklimatyzacji i badania, ryby są karmione według odpowiedniej diety, o znanej całkowitej zawartości lipidów i białek, w ilości wystarczającej do utrzymania ich w stanie zdrowym i do zachowania ich masy ciała. Ryby są karmione w czasie aklimatyzacji i badania ilością pokarmu, na poziomie w przybliżeniu 1-2 % masy ich ciała dziennie; utrzymuje to stężenie lipidów u większości gatunków na w miarę stałym poziomie w czasie badania. Ilość pokarmu powinna być ponownie obliczana, na przykład raz na tydzień, w celu utrzymania stałej masy ciała i zawartości lipidów. W odniesieniu do tego obliczenia masa ciała ryb w każdej komorze badawczej może być oszacowana na postawie masy ciała ryb pobranych jako próbkę w tej komorze ostatnio. Nie ważyć ryb pozostających w komorze.
Pokarm, który nie został spożyty, oraz ekskrementy są wypłukiwane z komór badawczych wkrótce po karmieniu (od 30 minut do 1 godziny). Komory są utrzymane w miarę możliwości w czystości przez okres trwania badania tak, aby stężenie substancji organicznej utrzymane było na możliwie jak najniższym poziomie, ze względu na to, że obecność węgla organicznego może ograniczyć biodostepność substancji badanej (1).
Ze względu na to, że wiele pokarmów jest uzyskiwanych z mączki rybnej, pokarm powinien być analizowany na obecność substancji badanej. Pożądane jest także analizowanie pokarmu na obecność pestycydów i metali ciężkich.
1.8.2.6. Światło i temperatura
Fotookres trwa zwykle 12-16 godzin, a temperatura (± 2 oC) powinna być odpowiednia dla gatunków badanych (zob. załącznik 2). Powinien być znany rodzaj oraz właściwości oświetlenia. Należy również zwrócić uwagę na możliwe fototransformacje substancji badanej w warunkach napromieniowania. Unikając narażenia ryb na działanie nienaturalnych fotoproduktów, należy wykorzystywać odpowiednie oświetlenie. W niektórych przypadkach odpowiednie może być wykorzystanie filtru w celu odfiltrowania promieniowania UV poniżej 290 nm.
1.8.2.7. Stężenia badania
Ryby są narażone na działanie przynajmniej dwóch stężeń substancji badanej w wodzie w warunkach przepływu. Zazwyczaj wybiera się wyższe (lub najwyższe) stężenie substancji badanej, aby wynosiło około 1 % jego ostrej, asymptotycznej LC50, oraz aby było przynajmniej dziesięciokrotnie wyższe od jej limitu wykrywalności w wodzie przez wykorzystywaną metodę analityczną.
Najwyższe stężenie badania można również oznaczyć przez podzielenie ostrej 96h LC50 przez odpowiedni ostry/chroniczny wskaźnik (odpowiednie wskaźniki dla niektórych substancji chemicznych wynoszą 3-100). Jeśli jest to możliwe, wybrać inne stężenie (stężenia), tak aby różniło się ono od podanego wyżej współczynnika o 10. Jeśli nie jest to możliwe ze względu na kryterium 1 % z LC50 oraz na limit analityczny, można użyć czynnika niższego od 10 albo też wziąć pod uwagę zastosowanie oznakowanej substancji badanej 14C. Żadne wykorzystane stężenie nie powinno przekraczać poziomu rozpuszczalności substancji badanej.
W przypadku gdy wykorzystuje się czynnik rozpuszczający, jego stężenie nie powinno być wyższe niż 0,1 ml/l i powinno być takie samo we wszystkich naczyniach badawczych. Wpływ stężenia, wraz z substancją badaną, na całkowitą zawartość węgla organicznego w wodzie badanej powinien być znany. Jednakże powinny zostać podjęte wszelkie wysiłki, w celu uniknięcia wykorzystania takich materiałów.
1.8.2.8. Kontrole
Powinna zostać przeprowadzona jedna kontrola wody do rozcieńczania lub, jeżeli jest to stosowne, jedna kontrola obejmującą czynnik rozpuszczający powinna zostać przeprowadzona oprócz badania, pod warunkiem że ustalono, iż czynnik nie wywiera wpływu na ryby. Jeśli nie ustalono tego, powinny zostać zorganizowane obie kontrole.
1.8.3. Częstotliwość pomiarów jakości wody
W trakcie badania powinny zostać przeprowadzone pomiary rozpuszczonego tlenu, TOC, pH oraz temperatury we wszystkich zbiornikach. Całkowita twardość i zasolenie, jeśli jest to odpowiednie, powinno zostać zmierzone w czasie kontroli, natomiast jeden ze zbiorników powinien zostać zbadany przy wyższym (lub najwyższym) stężeniu. Jako minimum poziom rozpuszczonego tlenu oraz zasolenie, jeśli jest to
odpowiednie powinno zostać zmierzone trzykrotnie: na początku, w połowie i pod koniec fazy absorpcji oraz raz w tygodniu w czasie fazy oczyszczania. TOC powinno zostać zmierzone na początku badania (24 godziny i 48 godzin przed rozpoczęciem fazy absorpcji), przed wpuszczeniem ryb oraz przynajmniej raz w tygodniu w czasie fazy absorpcji i oczyszczania. Temperatura powinna być mierzona codziennie, pH na początku i na końcu każdego okresu, a twardość - raz w ciągu trwania badania. Zaleca się ciągłe monitorowanie temperatury, przynajmniej jednym pojemniku.
1.8.4. Pobieranie próbek oraz analiza ryb i wody
1.8.4.1. Plan pobierania próbek ryb i wody
Próbka wody z komór badawczych do oznaczania stężenia substancji badanej, pobierana jest przed wpuszczeniem ryb, oraz w trakcie zarówno fazy absorpcji, jak i oczyszczania. Próbki wody pobierane są przed karmieniem i w tym samym czasie, co próbki ryb. W trakcie fazy absorpcji oznaczane są stężenia substancji badanych, w celu sprawdzenia ich zgodności z kryteriami ważności.
Próbki ryb są pobierane przynajmniej pięć razy podczas fazy absorpcji oraz przynajmniej cztery razy podczas fazy oczyszczania. Ze względu na to, że czasami trudno będzie obliczyć dokładne oszacowanie wartości BCF w oparciu o tą ilość próbek, zwłaszcza jeśli wskazane są inne typy kinetyki niż prosta kinetyka pierwszego rzędu, wskazane może być pobieranie próbek podczas obu faz z większą częstotliwością (zob. załącznik 4). Dodatkowe próbki są składowane i analizowane jedynie wówczas gdy wyniki badań próbek pochodzących z pierwszej serii nie są wystarczające do obliczenia wartości czynnika BCF z pożądaną dokładnością.
Przykład dopuszczalnego planu pobierania próbek podany jest w załączniku 4. Inne harmonogramy można łatwo obliczyć, wykorzystując inne przyjęte wartości Pow dla określenia czasu narażenia na działanie czynników dla 9 5 % absorpcji.
Pobieranie próbek kontynuuje się podczas fazy absorpcji do momentu, kiedy osiągnięty zostanie stan ustalony lub przez 28 dni, w zależności od tego, który z tych dwóch okresów jest krótszy. Jeśli nie osiągnięto stanu ustalonego przed w okresie 28 dni, pobieranie próbek jest kontynuowane do czasu aż osiągnięty zostanie stan ustalony lub przez 60 dni, w zależności od tego, który z tych dwóch okresów jest krótszy. Przed rozpoczęciem fazy oczyszczania ryby przenoszone są do czystych zbiorników.
1.8.4.2. Pobieranie i przygotowywanie próbek
Próbki wody do analizy uzyskiwane na przykład przez ich wypłukiwanie z centralnego punktu komory badawczej. Ze względu na to, że zarówno filtracja, jak i odwirowywanie nie zawsze powoduje oddzielenie się czynnika bioniedostępnego z pierwszej substancji od czynnika biodostępnego (zwłaszcza w substancjach superlipofilowych, tzn. w tych substancjach, które mają log Pow > 5) (1)(5), próbki mogą nie być poddawane takim obróbkom.
Zamiast tego pomiary powinny być pobierane w celu utrzymania zbiorników w czystości oraz zawartość całkowita węgla organicznego powinna być monitorowana zarówno podczas fazy absorpcji, jak i oczyszczania.
Odpowiednia ilość ryb (zwykle co najmniej cztery) jest usuwana z komór badawczych podczas każdorazowego pobierania próbek. Ryby pobrane w próbkach są szybko opłukiwane wodą, plamione "na sucho", zabijane, wykorzystując odpowiedni i humanitarny sposób, a następnie ważone.
Preferowane jest analizowanie ryby i wody natychmiast po pobraniu próbek, w celu zapobieżenia degradacji lub innym stratom oraz w celu obliczenia średnich wskaźników absorpcji i oczyszczania w trakcie postępowania badania. Natychmiastowa analiza unika również opóźnień w określaniu, kiedy plateau zostało osiągnięte.
W przypadku niepowodzenia przeprowadzenia natychmiastowej analizy, próbki są składowane, wykorzystując odpowiednią metodę. Przed rozpoczęciem badania uzyskiwane są informacje dotyczące właściwej metody składowania w odniesieniu do poszczególnych substancji badanych - np. głębokiego zamrażania, przetrzymywania w temperaturze 4 °C, czasu trwania składowania, ekstrakcji itp.
1.8.4.3. Jakość metody analitycznej
Ze względu na to, że cała procedura uzależniona jest zasadniczo od dokładności, precyzji i czułości metody analitycznej wykorzystywanej w odniesieniu do substancji badanej, sprawdzić doświadczalnie, iż precyzja oraz powtarzalność analizy chemicznej, jak również odzyskiwanie substancji badanej zarówno z wody, jak i są wystarczające dla danej metody. Sprawdzić również, że substancja badana nie jest wykrywalna wykorzystanej wodzie do rozcieńczania.
W miarę potrzeb wartości Cw i Cf, uzyskane z badania, są korygowane w odniesieniu do wartości tłowych uzyskanych w czasie kontroli. Z próbkami ryb i wody postępuje się w międzyczasie w taki sposób, aby zminimalizować zanieczyszczenie lub straty (np. wynikające z adsorpcji przez urządzenia do pobierania próbek).
1.8.4.4. Analiza próbek ryb
Jeśli w badaniu wykorzystywane są substancje oznakowane radiologicznie, możliwe jest przeprowadzenie analizy w odniesieniu do całkowitego oznaczenia radiologicznego (np. macierzyste i metabolity) lub można oczyścić próbki, tak aby związek macierzysty mógł zostać poddany analizie oddzielnie. Główne metabolity mogą zostać również określone w stanie ustalonym lub pod koniec fazy pobierania, w zależności od tego, która z tych faz nastąpi szybciej. Jeśli czynnik BCF jest > 1.000 % w kategoriach całkowitych pozostałości substancji oznakowanej radiologicznie, wskazane może być, a w odniesieniu do niektórych kategorii chemikaliów, takich jak pestycydy, stanowczo zalecane zidentyfikowanie i obliczenie ilości degradatów stanowiących > 10 % całkowitej ilości pozostałości substancji w tkankach ryb w stanie ustalonym. Jeśli degradaty stanowiące > 10 % całkowitych pozostałości substancji o oznaczeniu radiologicznym w tkankach ryb są zidentyfikowane i obliczone, zaleca się również identyfikację i podanie ilości degradatów w wodzie badanej.
Stężenie substancji badanej powinno zazwyczaj być oznaczane dla każdej indywidualnie ważonej ryby. Jeśli nie jest to możliwe, można zebrać wszystkie próbki w jednym zbiorniku podczas każdego pobierania próbek, ale nie ogranicza to procedur statystycznych, które mogą mieć zastosowanie do danych. Jeżeli szczególne procedury statystyczne oraz moc statystyczna są ważnymi względami, odpowiednia liczba ryb w celu przystosowania odpowiedniej procedury zgromadzenia próbek w jednym zbiorniku powinna zostać objęta badaniem (6)(7).
BCF powinno być wyrażone zarówno jako funkcja całkowitej masy mokrej, jak i, w odniesieniu do substancji wysokolipofilowych, jako funkcja zawartości lipidów. Zawartość lipidów ryb określa się podczas każdorazowego pobierania próbek, jeśli jest to możliwe. Odpowiednie metody powinny zostać wykorzystane w celu oznaczenia zawartości lipidów (odniesienia 8 i 2 w załączniku 3). Metoda ekstrakcji chloroform/ metanol może być zalecana jako metoda standardowa (9). Różne metody nie dają identycznych wartości (10), zatem ważne jest podanie szczegółów dotyczących wykorzystanej metody. Jeśli jest to możliwe, analiza dla lipidów często powinna być przeprowadzona na tym samym ekstrakcie, który wytworzony został dla potrzeb analizy na obecność substancji badanej, ze względu na to, że lipidy często muszą zostać usunięte z ekstraktu zanim zostanie on poddany analizie chromatograficznie. Zawartość lipidów w rybie (podana w mg/kg mokrej masy) pod koniec doświadczenia nie powinna różnić się od tej z początku doświadczenia o więcej niż ± 25 %. Procent zawartości ciał stałych w tkance powinien zostać także odnotowany, w celu umożliwienia przekształcenia stężenia lipidów z bazy mokrej w bazę stałą.
2. DANE
2.1. PRZETWARZANIE WYNIKÓW
Krzywa absorpcji badanej substancji uzyskiwana jest przez wykreślenie jej stężenia w/na rybie (lub w określonych tkankach) w fazie absorpcji, w danym czasie, w skali arytmetycznej. Jeśli krzywa osiągnęła plateau, to znaczy, że stała się w przybliżeniu asymptotyczna do osi czasu, stan ustalony BCFSS obliczany jest w następujący sposób:
W przypadku gdy nie został osiągnięty stan ustalony, może istnieć możliwość obliczenia BCFSS o wystarczającej precyzji dla oceny zagrożenia na podstawie "stanu ustalonego" przy 80 % (1,6/k2) lub 95 % (3,0/k2) równowagi.
Również czynnik stężenia (BCFK) jest oznaczany jako stosunek k1/k2, dwóch stałych kinetycznych pierwszego rzędu. Stała szybkość oczyszczania (k2) jest zwykle określana na podstawie krzywej oczyszczania (tzn. na podstawie wykresu spadku stężenia badanej substancji w rybie wraz z upływem czasu). Stała szybkość absorpcji (k1) wyliczana jest wówczas na podstawie k2 oraz wartości Cf, którą uzyskuje się z krzywej absorpcji (zob. także załącznik 5). Preferowaną metodą uzyskiwania BCFK oraz stałych wskaźników, k1 i k2, jest wykorzystanie metod oceny parametrów nieliniowych na komputerze (11). W przeciwnym razie dla obliczenia k1 i k2 można korzystać z metod graficznych. Jeśli krzywa oczyszczenia w wyraźny sposób nie może być uznana za krzywą procesu pierwszego rzędu, wówczas powinny zostać zastosowane modele bardziej złożone (zob. odniesienia w załączniku 3) i powinno się zasięgnąć rady u biostatystyka.
2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW
Wyniki powinny być interpretowane uważnie w przypadku, gdy mierzone stężenia badanych roztworów występują na poziomach zbliżonych do granicy wykrywalności metody analitycznej.
Jasno określone krzywe absorpcji i ubytku wskazują dobrej jakości dane o biostężeniu. Rozbieżność w stałych absorpcji/oczyszczenia między dwoma badanymi stężeniami powinna być niższa niż 20 %. Powinny zostać odnotowane zaobserwowane różnice dotyczące szybkości absorpcji/oczyszczenia między dwoma zastosowanymi badanymi stężeniami, podając możliwe wyjaśnienia. Ogólnie granica ufności BCFs, na podstawie dobrze zaprojektowanego podejścia badawczego, wynosi ± 20 %.
3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDAŃ
Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
3.1. BADANA SUBSTANCJA:
- własności fizyczne oraz, gdy jest to istotne, właściwości fizyczno-chemiczne,
- dane dotyczące identyfikacji chemicznej (łącznie z zawartością węgla organicznego, w odpowiednich przypadkach),
- w przypadku oznakowania radiologicznego, dokładne położenie znaczonego atomu (znaczonych atomów) oraz zawartość procentową radioaktywności, związanej z nieczystościami.
3.2. BADANE GATUNKI
- nazwa naukowa, gatunek, źródło, jakakolwiek obróbka wstępna, aklimatyzacja, wiek, zakres rozmiarów itp.
3.3. WARUNKI PRZEPROWADZANIA BADANIA:
- wykorzystana procedura badawcza (np. przepływowa lub półstatyczna),
- rodzaj i właściwości zastosowanego oświetlenia i fotookresów,
- projekt badania (np. numer i rozmiar komór badawczych, szybkość wymiany objętości wody, liczba powtórzeń, liczba ryb przypadających na powtórzenie, liczba stężeń badania, długość faz absorpcji i oczyszczenia, częstotliwość pobierania próbek ryb i wody),
- metoda przygotowania roztworów podstawowych i częstotliwość ich odnawiania, (jeśli został użyty, należy podać czynnik rozpuszczający, jego stężenie oraz jego udział w zawartości węgla organicznego wody używanej do przeprowadzenia badań),
- nominalne stężenia badania, średnia mierzonych wartości oraz ich standardowe odchylenia, odnoszące się do naczyń używanych w badaniach, oraz metoda, za pomocą której zostały one uzyskane,
- źródło wody do rozcieńczania, opis jakiejkolwiek obróbki wstępnej, wyniki przeprowadzenia dowodu na zdolność ryb do życia w wodzie oraz właściwości wody: pH, twardość, temperatura, stężenie rozpuszczonego tlenu, poziomy pozostałościowego chloru (jeśli dokonano pomiaru), węgiel organiczny ogółem, zawiesina, stopień zasolenia środowiska zastosowanego w badaniach (jeśli występuje taka potrzeba) oraz inne wykonane pomiary,
- jakość wody w naczyniach wykorzystane w badaniach, pH, twardość, węgiel organiczny ogółem (TOC), temperatura oraz stężenie rozpuszczonego tlenu,
- szczegółowe informacje w sprawie karmienia (np. rodzaj karmy, jej źródło, skład - przynajmniej, jeśli to możliwe, zawartość lipidów i białka, ilość podanej karmy i częstotliwość karmienia),
- informacje w sprawie postępowania z próbkami ryb i wody, łącznie ze szczegółami dotyczącymi przygotowania, składowania, ekstrakcji i procedur analitycznych (oraz dokładność) w odniesieniu do badanej substancji i zawartości lipidów (jeśli zmierzono).
3.4. WYNIKI:
- wyniki z wszelkich przeprowadzonych badań wstępnych,
- śmiertelność ryb kontrolowanych oraz ryb w każdej z komór narażonych na działanie substancji oraz wszelkie inne zaobserwowane nieprawidłowe zachowania,
- zawartość lipidów ryb (jeśli oznaczono w momencie przeprowadzania badania),
- krzywe (łącznie z wszystkimi zmierzonymi danymi) przedstawiające absorpcję i oczyszczenie badanej substancji chemicznej w rybie, czas poprzedzający stan ustalony,
- Cf i Cw (razem z odchyleniami standardowymi i zakresem, jeśli jest to stosowne) dla wszystkich czasów pbierania próbek (Cf wyrażone w ug/g mokrej masy (ppm)) całego organizmu lub określonych tkanek, np. lipidy, i Cw w ug/ml (ppm). Wartości Cw dla serii kontrolnych (należy również zgłosić tło),
- czynnik biostężenia w stanie ustalonym (BCFSS) i/lub czynnik stężenia kinetycznego (BCFK) oraz, w stosownych przypadkach, 95 % granicy ufności dla stałej szybkości absorpcji i oczyszczenia (ubytku), wyrażone w odniesieniu do całego organizmu i całkowitej zawartości lipidów jeśli dokonano pomiaru, zwierzęcia lub jego poszczególnych tkanek, granice ufności i odchylenie standardowe, jeśli są dostępne, oraz metody analizy obliczeń/danych dla każdego stężenia wykorzystanej substancji badanej,
- w przypadku gdy wykorzystano substancje oznakowane radiologicznie oraz, jeśli jest wymagane, nagromadzenie jakichkolwiek wykrytych metabolitów może zostać przedstawione,
- wszystko, co odbiega od normy, jeśli chodzi o badanie, wszelkie odchylenia od tych procedur oraz wszelkie inne ważne informacje;
zminimalizować ilość wyników jako "niewykrytych w granicy wykrywalności" w drodze opracowywania metod stosowanych przed badaniem i za pomocą projektu doświadczalnego, ponieważ wyniki takie nie mogą być użyte do obliczenia stałej szybkości reakcji.
4. BIBLOGRAFIA
(1) Connell D.W. (1988). Bio accumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156.
(2) Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on noctanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390.
(3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.
(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derivedfrom OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bio availability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.
(5) US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.
(6) US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852. July 1975.
(7) US EPA (1974). Section 5, A(l). Analysis of Human or animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Emronmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.
(8) Compaan H. (1980) in "The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation", Rozdział 2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands.
(9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105.
(10) Randall R. C, Lee H, Ozretich R.J, Lake J. L. and Pruell R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bio accumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp. 1431-1436.
(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method-Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report Marzecl 987. Autorzy: P. Kristensen i N. Nyholm.
(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.
ZAŁĄCZNIK 1
Właściwości chemiczne dopuszczalnej wody do rozcieńczania
| Substancja | Ograniczenie stężenia | |
| 1 | Cząstki stałe | 5 mg/l |
| 2 | Węgiel organiczny ogółem | 2 mg/l |
| 3 | Amoniak niejonizowany | 1 μg/l |
| 4 | Chlor pozostały | 10 μg/l |
| 5 | Pestycydy fosforoorganiczne | 50 μg/l |
| 6 | Pestycydy z grupy węglowodorów chlorowanych oraz bifenyle polichlorowane | 50 μg/1 |
| 7 | Chlor organiczny ogółem | 25 μg/1 |
| 8 | Glin | 1 μg/l |
| 9 | Arsen | 1 μg/l |
| 10 | Chrom | 1 μg/l |
| 11 | Kobalt | 1 μg/l |
| 12 | Miedź | 1 μg/l |
| 13 | Żelazo | 1 μg/l |
| 14 | Ołów | 1 μg/l |
| 15 | Nikiel | 1 μg/l |
| 16 | Cynk | 1 μg/l |
| 17 | Kadm | 100 μg/1 |
| 18 | Rtęć | 100 μg/1 |
| 19 | Srebro | 100 μg/1 |
ZAŁĄCZNIK 2
Gatunki ryb zalecane do przeprowadzenia badania
| Zalecane gatunki | Zalecany zakres temperatur badania (oC) | Zalecana całkowita długość badanego zwierzęcia (cm) | |
| 1 | Danio rerio(1) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) Danio pręgowany | 20-25 | 3,0 ± 0,5 |
| 2 | Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) Strzebla | 20-25 | 5,0 ± 2,0 |
| 3 | Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) Karp | 20-25 | 5,0 ± 3,0 |
| 4 | Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck and Schlegel) Ryżówka | 20-25 | 4,0 ± 1,0 |
| 5 | Poccilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) Gupik | 20-25 | 3,0 ± 1,0 |
| 6 | Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque) Okoń błękitnoskrzeli (Bluegill) | 20-25 | 5,0 ± 2,0 |
| 7 | Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) Pstrąg tęczowy | 13-17 | 8,0 ± 4,0 |
| 8 | Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus) Ciernik | 18-20 | 3,0 ± 1,0 |
| (1) Meyer A, Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B, Vol. 252, p. 231. |
W różnych krajach wykorzystano różne gatunki występujące w wodach przybrzeżnych i gatunki morskie, na przykład:
Spot Leiostomus xanthurus
Owczarz karpiowaty Cyprinodon variegatus
Kiżucz Mienidia beryl
Szumień mały Cymatogaster aggregata
Złocica europejska Parophys vertulus
Kur rogacz Leptocottus armatus
Ciernik trzypromienny Gasteroseteus aculeatus
Labraks Dicentratracus labrax
Ukleja Alburnus alburnus
Gromadzenie
Ryby słodkowodne, wymienione w tabeli, są łatwe w hodowli i/lub są szeroko dostępne w ciągu roku, podczas gdy dostępność gatunków morskich i zamieszkujących wody przybrzeżne jest częściowo ograniczona do odpowiednich krajów. Nadają się one do hodowli i rozmnażania albo w gospodarstwach rybnych, albo w laboratoriach, w warunkach chroniących je od chorób i pasożytów. Ryby te dostępne są w wielu częściach świata.
ZAŁĄCZNIK 3
Przewidywanie czasu trwania faz wchłaniania i oczyszczenia
1. Przewidywanie czasu trwania fazy wchłaniania
Przed przeprowadzeniem badania, oszacować k2 i wskutek tego pewien udział procentowy czasu potrzebnego do osiągnięcia stanu ustalonego może zostać uzyskany na podstawie zależności empirycznych między k2 a n-oktanolo/ wodnym współczynnikiem podziału (Pow) oraz k2 i wodną rozpuszczalnością (s).
Oszacowanie k2 (dzień-1) może zostać uzyskane na przykład z następujących zależności empirycznych (1):
log10 k2 = 0,414 log10(Pow) + 1,47(r2 = 0,95) (równanie 1)
W odniesieniu do innych zależności - zob. poz. bibliograficzna (2).
Jeśli nie jest znany współczynnik podziału (Pow), można dokonać oszacowania (3) na podstawie wiedzy o rozpuszczalności wodnej substancji, wykorzystując wzór:
log10 (Pow) = 0,862 log10(s) + 0,710 (r2 = 0,994) (równanie 2)
gdzie:
s = rozpuszczalność (mol/l): (n = 36).
Zależności te stosują się jedynie do substancji chemicznych o wartościach log Pow pomiędzy 2 a 6,5 (4).
Czas potrzebny do osiągnięcia pewnego udziału procentowego stanu ustalonego może zostać uzyskany przez stosowanie oszacowania k2, na podstawie ogólnego równania kinetycznego, opisującego absorpcje i oczyszczanie (kinetyka pierwszego rzędu):
lub jeśli Cw jest stałe, w następujący sposób:
(równanie 3)
W momencie zbliżania się do stanu stacjonarnego (t→ ∞ ) równanie 3 można zredukować (5)(6) do:
Cf= k 1.Cwlub Cf/Cw = k1/k2= BCF
Wówczas k1/k2 Cw zbliża się do stężenia w rybie w "stanie ustalonym" (Cf, s). Równanie 3 może zostać rozpisane do:
(równanie 4)
Stosując równanie 4, czas potrzebny do osiągnięcia udziału procentowego stanu ustalonego może zostać przewidziany, jeśli k2 jest uprzednio oszacowane, wykorzystując równania 1 lub 2.
Jako wytyczna statystycznie optymalny czas trwania fazy absorpcji dla wytworzenia, statystycznie możliwy do przyjęcia danych (BCFK), jest okresem, który jest wymagany do tego, aby krzywa logarytmu stężenia substancji badanej w rybie, wykreślona w zestawieniu z czasem podanym liniowo, osiągnęła swój punkt środkowy 1 1,6/k2, lub też 80 % stanu ustalonego, ale nie więcej niż 3,0/k2 lub 95 % stanu ustalonego (7).
Czas potrzebny do osiągnięcia 80 % stanu ustalonego (równanie 4):
(równanie 5)
Podobnie 95 % stanu ustalonego wynosi:
(równanie 6)
Na przykład czas trwania fazy wchłaniania (up) dla substancji badanej o log Pow = 4 wynosiłby (wykorzystując równania 1, 5 i 6):
log10k2 =-0,414.(4)+1,47 k2 = 0,652 dni-1
up (80 %) = 1,6/0,652, i.e. 2,45 days (59 godzin)
lub up (95 %) = 3,0/0,652, i.e. 4,60 days (110 godzin)
Podobnie, w odniesieniu do substancji badanej s = 10-5 mol/l (log(s) = - 5,0) czas trwania wynosiłby (wykorzystując równania 1, 2, 5 i 6):
log10 (Pow) = 0,862 (- 5,0) + 0,710 = 5,02
log10 K2 = 0,414 (5,02) + 1,47
k2 = 0,246 dni-1
up (80 %) = 1,6/0,246, tj. 6,5 dni (156 godzin)
lub up (95 %) = 3,0/0,246, tj. 12,2 dni (293 godzin)
Alternatywnie, wyrażenie:
teq = 6,54 x 103 Pow + 55,31 (godzin)
może być wykorzystane do obliczenia czasu potrzebnego do skutecznego osiągnięcia stanu ustalonego (4).
2. Przewidywanie czasu trwania fazy oczyszczenia
Przewidywanie ilości czasu potrzebnego do wyeliminowania zanieczyszczenia z organizmu do pewnej ilości udziału procentowego stężenia początkowego może zostać uzyskane na podstawie ogólnego równania, opisującego absorpcje i oczyszczanie (kinetyka pierwszego rzędu) (1)(8).
Dla fazy oczyszczania przyjmuje się Cw równe zeru. Równanie można zredukować do:
Gdzie Cf, o jest stężeniem z początku stanu oczyszczania 50 %. Oczyszczanie osiągnięte zostanie wówczas w czasie (t50):
Podobnie 95 % oczyszczania zostanie osiągnięte w następującym czasie:
Jeśli 80 % absorpcji wykorzystywane jest w odniesieniu do pierwszego okresie (1,6/k2), a 95 % ubytku w fazie oczyszczania (3,0/k2), wówczas faza oczyszczania jest w przybliżeniu dwa razy dłuższa niż długość fazy wchłaniania.
Jednakże ważne jest, aby odnotować, że oszacowania oparte są na założeniu, że wzory absorpcji i oczyszczania będą zgodne z kinetyką pierwszego rzędu. Jeśli w wyraźny sposób kinetyka pierwszego rzędu nie jest przestrzegana, powinny zostać wykorzystane bardziej złożone modele (np. poz. bibliograficzna (1)).
Literatura (załącznika 3)
(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982) Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish.Toxicol. and Chem. 1, pp. 309-320.
(2) Kristensen P. (1991) Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OecD and ASTM testing methods; influence of p articulate matter to the bio availability of chemicals. Danish Water Quality Institute.
(3) Chiou C.T. and Schmedding (3) (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16, pp. 1.4-10.
(4) Hawker D. W. and Connell D.W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701-707.
(5) Branson D. R., Blau G.E., Alexander H. C. i Neely W. B. (19 7 5). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785-792.
(6) Ernst W. (19 8 5). Accumulation in Aquatic organisms. W: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4.4, str. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N.Y.
(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G. E., Branson D. R. i Sauerhoff M.W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kenetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614-622.
(8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3-19.
ZAŁĄCZNIK 4
Teoretyczny przykład harmonogramu pobierania próbek w odniesieniu do badań biokoncentracji substancji o log Pow = 4
| Pobieranie próbek ryb | Harmonogram badania próbek | Liczba ryb przypadających na jedną próbkę | Liczba próbek wody | |
| Minimalna wymagana częstotliwość (dni) | Dodatkowe pobieranie próbek | |||
| Faza wchłaniania | -1 0 | 2(*) 2 | Dodać 45-80 ryb | |
| pierwsza | 0,3 | 0,4 | 2 (2) | 4 (4) |
| druga | 0,6 | 0,9 | 2 (2) | 4 (4) |
| trzecia | 1,2 | 1,7 | 2 (2) | 4 (4) |
| czwarta | 2,4 | 3,3 | 2 (2) | 4 (4) |
| piąta | 4,7 | 2 | 6 | |
| Faza oczyszczania | Przenieść ryby do wody wolnej od badanej substancji chemicznej | |||
| szósta | 5,0 | 5,3 | 4 (4) | |
| siódma | 5,9 | 7,0 | 4 (4) | |
| ósma | 9,3 | 11,2 | 4 (4) | |
| dziewiąta | 14,0 | 17,5 | 6 (4) | |
| (*) Woda próbki po dostarczeniu co najmniej trzech objętości komór. |
| Wartości w nawiasach są liczbami próbek (woda, ryby), które mają zostać pobrane, jeśli przeprowadzane jest dodatkowe pobieranie próbek. |
| Uwagi: Oznaczenie k2 dla log Pow z 4,0 przed badaniem wynosi 0,652 dnia-1. Całkowita długość trwania eksperymentu ustalona jest na 3 × faza absorpcji = 3 × 4,6 dnia, np. 14 dni. W odniesieniu do oszacowania absorpcji - odnieść się do załącznika 3. |
ZAŁĄCZNIK 5
Rozróżnianie modeli
Większość danych dotyczących biokoncentracji uznano za dość dobrze opisane za pomocą prostego modelu dwukomorowego o dwóch parametrach, jak wskazano za pomocą krzywej prostoliniowej, która zbliża się do punktów stężenia w rybach, w czasie fazy oczyszczania, gdy są one wykreślone na papierze półlogarytmicznym. (W przypadku gdy punktów tych nie można opisać za pomocą krzywej prostoliniowej, wówczas należy zastosować modele złożone, zob. na przykład Spacie i Hamelink, poz. bibliograficzna (1) w załączniku 3).
Graficzne metody oznaczania stałej szybkości oczyszczania (ubytku) k2
Wykreślić stężenie substancji badanej zawartej w każdej z próbek ryb w czasie pobierania próbek na papierze półlogarytmicznym. Nachyleniem tej linii jest k2.
Należy zauważyć, że odchylenia od linii prostej mogą wskazywać na bardziej złożony schemat oczyszczania niż ten oparty na kinetyce pierwszego rzędu. Metoda graficzna może być zastosowana do analizowania typów oczyszczania, które są odchyleniem od kinetyki procesu pierwszego rzędu.
Graficzne metody oznaczania stałej szybkości absorpcji k1
Mając podane k2, obliczyć k1 w następujący sposób:
(równanie 1)
Wartość Cf odczytywana jest ze środkowego punktu części gładkiej krzywej absorpcji, powstałej w oparciu o dane, gdy stężenie logarytmiczne jest wykreślone w zależności od czasu (w skali arytmetycznej).
Metoda komputerowego obliczania stałych szybkości absorpcji i oczyszczania (ubytku)
Preferowaną metodą uzyskiwania czynnika biokoncentracji oraz stałych szybkości reakcji, k1 i k2, jest wykorzystanie metod oceny parametrów nieliniowych na komputerze. Programy te przypisują wartości dla k1 i k2 w oparciu o zestaw danych dotyczących czasu sekwencyjnego stężenia i modelu:
(równanie2)
(równanie 3)
gdzie: tc = czas przy końcu fazy absorpcji
Podejście to przewiduje standardowe oszacowania odchyleń k1 i k2.
Ponieważ k2 w większości przypadków może zostać oszacowane na podstawie krzywej oczyszczenia z dość wysoką dokładnością oraz ze względu na istnienie silnego związku między dwoma parametrami k1i k2, gdy obliczane są równocześnie, wskazane może być obliczanie najpierw k2, jedynie na podstawie danych dotyczących oczyszczania, a w następnej kolejności obliczanie k1, na podstawie danych dotyczących wchłaniania, używając regresji nieliniowej.
C.14. BADANIE ROZWOJU MŁODYCH RYB
1. METODA
Niniejsza metoda wpływu toksyczności na rozwój jest kopią OECD TG 215 (2000).
1.1. WPROWADZENIE
Niniejszy badanie jest przeznaczone do oceny skutków przedłużonej ekspozycji na działanie substancji chemicznych na rozwój młodocianych ryb. Jest on oparty na metodzie, rozwiniętej i powszechnie stosowanej (1)(2) w ramach Unii Europejskiej, dla oceny działania substancji chemicznych na rozwój młodego pstrąga tęczowego (Oncorynchus mykiss) w warunkach przepływowych. Inne dobrze udokumentowane gatunki można również zastosować. Na przykład uzyskano doświadczenie z badań rozwoju danio pręgowanego (Danio rerio)(1) (3)(4) i Oryzias latipes (5)(6)(7).
Zob. także Ogólne wprowadzenie część C.
1.2. DEFINICJE
Najniższy obserwowany skutek stężenia (LOEC): jest to najmniejsze badane stężenie substancji badanej, przy którym obserwuje się znaczący skutek (przy p < 0,05) w porównaniu z doświadczeniem kontrolnym. Jednakże wszystkie badane stężenia powyżej LOEC muszą wykazywać szkodliwy skutek, równy lub większy niż ten obserwowany przy LOEC.
Nieobserwowany skutek stężenia (NOEC): jest stężeniem badanym bezpośrednio poniżej LOEC.
ECx: w niniejszej metodzie jest stężeniem badanej substancji, która powoduje x % zmienności we wskaźniku rozwoju ryb w porównaniu z doświadczeniem kontrolnym.
Wskaźnik obciążenia: jest wilgotną masą ryb na objętość wody.
Gęstość wyjściowa: jest liczbą ryb do objętości wody.
Wskaźnik szczególnego rozwoju określonej ryby: wyrażenie wskaźnika rozwoju określonej jednostki w oparciu o jej początkową wagę.
Średni zbiornikowy wskaźnik szczególnego rozwoju: wyrażenie średniego wskaźnika wzrostu populacji w zbiorniku przy jednym stężeniu.
Wskaźnik pseudoszczególnego rozwoju: wyrażenie wskaźnika określonego rozwoju w proporcji do średniej wagi początkowej populacji zbiornika.
1.3. ZASADA METODY BADANIA
Młode ryby w fazie wykładniczej rozwoju są umieszczane po zważeniu w komorach do badań i eksponowane w zakresie stężenia subletalnego substancji badanej rozpuszczonej w najlepiej strumieniem wody lub jeśli to niemożliwe, we właściwych, półstatycznych (statycznie odnawialnych) warunkach. Czas trwania badania wynosi 28 dni. Ryby są karmione codziennie. Racje żywności są oparte na początkowej wadze ryb i przeliczane po 14 dniach. Na koniec badania ryby są ważone ponownie. Skutki w odniesieniu do wskaźników rozwoju są analizowane, stosując model regresyjny w celu prognozowania stężenia, które spowoduje x % zmienności w wskaźniku rozwoju, tj. ECx (np. EC10, EC20 lub EC30). Alternatywnie, dane są porównywane z objętością w doświadczeniu kontrolnym w celu ustalenia najniższego obserwowanego skutku stężenia (LOEC), a stąd też nieobserwowanego skutku stężenia (NOEC).
1.4. INFORMACJE DOTYCZĄCE SUBSTANCJI BADANEJ
Wyniki badania ostrej toksyczności (zob. metoda badania C.1), najlepiej przeprowadzone z gatunkami wybranymi do niniejszego badania, powinny być dostępne. Oznacza to, że rozpuszczalność w wodzie i ciśnienie pary badanej substancji są znane, a wiarygodna analityczna metoda jest dostępna w odniesieniu do ujęcia ilościowego substancji w roztworach badanych, ze znaną i udokumentowaną dokładnością oraz granicą wykrywalności.
Użyteczne informacje obejmują wzór strukturalny, czystość substancji, stabilność w wodzie i na świetle, pKa, Pow oraz wyniki badania całkowitej biodegradacji (zob. metoda C.4).
1.5. WAŻNOŚĆ BADANIA
Aby badanie był ważne, stosuje się następujące warunki:
- śmiertelność w doświadczeniach kontrolnych nie może przekraczać 10 % na koniec badania,
- średnia waga ryb w doświadczeniach kontrolnych musi wzrosnąć wystarczająco, aby pozwolić na wykrycie minimalnych zmian wskaźnika rozwoju uznanego za znaczący. Próba pierścieniowa (2) wykazała, że w odniesieniu do pstrąga tęczowego średnia waga ryb w doświadczeniach kontrolnych wzrosła co najmniej o połowę (tj. 50 %) ich średniej wagi początkowej przez ponad 28 dni; tj. waga początkowa: 1 g/ryba (= 100 %), waga końcowa po 28 dniach: ≥ 1,5 g/ryba (≥ 150 %),
- stężenie tlenu rozpuszczonego musi wynosić co najmniej 60 % wartości nasycenia powietrzem (ASV) w trakcie badania,
- różnica temperatury wody nie może być większa niż ± 1 oC między komorami do badań przez cały czas trwania badania i musi być utrzymywana w obrębie 2 oC zakresu temperatur określonego w odniesieniu do gatunków badanych (dodatek 1).
1.6. OPIS METODY BADANIA
1.6.1. Aparatura
Zwykły sprzęt laboratoryjny, w szczególności następujący:
- mierniki tlenu i pH metry,
- sprzęt do oznaczania alkaliczności i twardości wody,
- odpowiednia aparatura do pomiaru temperatury, zalecane jest stałe monitorowanie,
- zbiorniki wykonane z chemicznie obojętnego materiału o odpowiedniej objętości w zależności do zalecanej gęstości wyjściowej i obciążenia (zob. pkt 1.8.5 i dodatek 1),
- waga o odpowiedniej dokładności (tj. dokładności do ± 0,5 %).
1.6.2. Woda
Każda woda, w której badane gatunki wykazują odpowiednie długoterminowe przeżycie i wzrost, może być stosowana jako woda do badań. Musi być stałej jakości w okresie trwania badania. Wartość pH wody powinna być w zakresie 6,5-8,5, lecz w trakcie danego badania musi być w zakresie ± 0,5 pH. Twardość powyżej 140 mg/l (jako CaCO3) jest zalecana. W celu zapewnienia, aby rozcieńczająca woda nie miała falowego wpływu na wyniki badania (np. przez kompleksowanie substancji badanej), należy okresowo pobierać próbki wody do analizy. Co trzy miesiące na przykład powinny być wykonane pomiary metali ciężkich (takich jak Cu, Pb, Zn, Hg, Cd i Ni), głównych anionów i kationów (np. Ca, Mg, Na, K, Cl i SO4), pestycydów (np. całkowita ilość fosforo- i chloroorganicznych), całkowity węgiel organiczny i zawiesina ciał stałych, w przypadku gdy rozcieńczająca woda jest znana jako stosunkowo stała w jakości. Jeśli można przedstawić dane, że jakość wody była stała przynajmniej przez rok, oznaczenia mogą być mniej częste i przedziały poszerza się (np. co sześć miesięcy). Kilka cech chemicznych akceptowalnej wody rozcieńczającej wymieniono w dodatku 2.
1.6.3. Roztwory użyte w badaniu
Roztwory w badaniu o wybranym stężeniu są przygotowywane poprzez rozcieńczanie roztworu podstawowego.
Zalecane jest przygotowanie roztworu podstawowego przez proste wymieszanie badanej substancji w wodzie rozcieńczającej w sposób mechaniczny (np. mieszadło lub ultradźwięki). Kolumny nasyceniowe (rozpuszczające) mogą być użyte do uzyskania odpowiednio stężonego roztworu podstawowego.
W kilku przypadkach może być wymagane użycie rozpuszczalników lub dyspergatorów (środków rozpuszczających) w celu wykonania odpowiednio stężonego roztworu podstawowego. Przykładami odpowiednich rozpuszczalników są aceton, etanol, metanol, dimetylosulfotlenek, dimetyloformamid i glikol trójetylenowy. Przykładami odpowiednich dyspergatorów są Cremophor RH40, Tween 80, Metyloceluloza 0,01 % i HCO-40. Należy zachować ostrożność przy użyciu łatwo biodegradowalnych środków (np. aceton) i/ lub wysokolotnych związków, gdyż mogą być przyczyną problemów z rozwojem bakterii w przepływach badań. Gdy stosuje się środki rozpuszczające, nie mogą one mieć znaczącego wpływu na wzrost ryb i widocznych negatywnych działań na młode ryby, jak odkryto w doświadczeniu kontrolnym z rozpuszczalnikiem.
Dla badań przepływowych wymagany jest system ciągłego dozowania i rozcieńczania roztworu podstawowego substancji badanej (np. pompa dozująca, rozcieńczalnik proporcjonalny, system nasycania) do przesyłania serii stężeń do komór do badań. Szybkości przepływów roztworu podstawowego i rozcieńczającej wody muszą być sprawdzane okresowo, najlepiej codziennie w trakcie trwania badania, oraz nie mogą zmieniać się więcej niż 10% w trakcie badania. Badanie pierścieniowe (2) wykazało, że w odniesieniu do pstrąga tęczowego częstotliwość wymiany wody w trakcie trwania badania jest akceptowalna przy 6 litrów/g ryby/dzień (zob. pkt 1.8.2.2).
Dla badań półstatycznych (odnawialnych) częstotliwość odnawiania ośrodka zależy od stabilności substancji badanej, lecz zalecane jest codzienne odnawianie wody. Jeśli ze wstępnych badań stabilności (zob. pkt 1.4) wynika, że stężenie substancji badanej nie jest stabilne (tj. poza zakresem nominalnego 80-120 % lub spada poniżej 80 % zmierzonego stężenia początkowego) przez okres odnowienia, należy rozważyć celowość użycia badania przepływowego.
1.6.4. Wybór gatunków
Pstrąg tęczowy (Oncorhynchus mykiss) jest zalecanym gatunkiem do niniejszego badania, ponieważ uzyskano najwięcej doświadczeń z prób pierścieniowych z tym gatunkiem (1)(2). Można jednakże zastosować inne, dobrze udokumentowane gatunki, lecz może być niezbędne przyjęcie procedury badania w celu zapewnienia odpowiednich warunków badania. Dostępne są doświadczenia, na przykład z danio pręgowanym (Danio rerio) (3)(4) i Oryzias latipes (5)(6)(7). W takim przypadku powinno być podane racjonalne uzasadnienie wyboru i metody eksperymentalnej.
1.6.5. Przetrzymanie ryb
Badane ryby muszą być wybrane z populacji wyjściowej pojedynczo, najlepiej z tego samego tarła, przetrzymywanego co najmniej dwa tygodnie przed badaniem w warunkach jakości wody i oświetlenia zbliżonych do stosowanych w badaniu. Powinny one być karmione racją minimum 2 % wagi ciała dziennie, a najlepiej 4 % wagi ciała na dzień przez okres przetrzymania i w trakcie trwania badania.
Przez następujący od rozpoczęcia okres 48 godzin notowana jest śmiertelność i stosuje się następujące kryteria:
- śmiertelność większa niż 10 % populacji przez siedem dni: odrzucić całą partię,
- śmiertelność między 5 % i 10 % populacji: aklimatyzacja przez siedem dodatkowych dni, jeśli więcej niż 5 % śmiertelności w ciągu tych siedmiu dni, odrzucić całą partię,
- śmiertelność mniejsza od 5 % populacji w ciągu siedmiu dni: dopuścić partię.
Ryby nie mogą być taktowane leczniczo przez dwa tygodnie poprzedzające badanie ani w ciągu jego trwania.
1.7. PROJEKT BADANIA
"Projekt badania" odnosi się do wyboru ilości i odstępów stężeń badanych, liczbą zbiorników dla każdego poziomu i liczbą ryb na zbiornik. W idealnym przypadku taki projekt badania powinien być wybierany z uwzględnieniem:
- celu badania,
- metody statystycznej analizy, która będzie wykorzystana,
- dostępność i źródła finansowania eksperymentu.
Oświadczenie o celu badania powinno, jeśli jest to możliwe, określać statystyczną zdolność, przy której różnica danego wymiaru (np. we wskaźniku rozwoju) wymaganego jest możliwa do obserwacji lub, alternatywnie, precyzją, z jaką ECx (na przykład x = 10, 20 lub 30, a najlepiej nie mniej niż 10) ma być oszacowane. Bez tego zwięzłego określenie zakresu badania nie może być podane.
Istotne jest, aby uznać, że projekt, który jest optymalny (najlepszy z użyciem źródeł) przy użyciu jednej metody analizy statystycznej, nie jest koniecznie optymalny dla innej. Zalecany projekt dla oszacowania LOEC/NOEC dlatego nie byłby taki sam jak zalecany dla analizy metodą regresji.
W większości przypadków, analiza regresyjna jest zalecana dla analizy wariancji, z przyczyn omówionych przez Stephan i Rogers (8). Jednakże jeżeli nie znaleziono odpowiedniego modelu regresji (r2 < 0,9) powinna być zastosowana metoda NOEC/LOEC.
1.7.1. Projekt analizy regresyjnej
Ważnymi rozważaniami w projekcie badania, które mają być zanalizowane metodą regresyjną, są:
- skutek stężenia (np. EC10 20 30) i zakres stężeń powyżej, którego wpływ substancji badanej jest poza zainteresowaniem, powinien być koniecznie osiągnięty przez stężenie włączone do badań. Dokładność, z którą ocena wpływu stężenia jest wykonywana, jest najlepsza, gdy wpływ stężenia jest pośrodku zakresu badanych stężeń. Wstępne badanie szukania zakresu może być pomocne w wybraniu właściwych stężeń badanych,
- w celu zapewnienia zadawalającego modelu statystycznego badanie powinno obejmować co najmniej jeden zbiornik kontrolny i pięć dodatkowych zbiorników o różnych stężeniach. Tam gdzie to jest stosowne, gdy stosowany jest środek ułatwiający rozpuszczanie, należy przeprowadzić obok serii badanej jedno doświadczenie kontrolne z tym środkiem przy najwyższym badanym stężeniu (zob. pkt 1.8.3 i 1.8.4),
- właściwe serie geometryczne lub serie logarytmiczne (9) (zob. dodatek 3) mogą być wykorzystane. Zaleca się odstępy logarytmiczne w stężeniach badanych,
- o ile jest dostępne więcej niż sześć zbiorników, dodatkowe zbiorniki muszą być użyte albo do zapewnienia powtórzenia lub rozdziału w poprzek zakresu stężeń, w celu zapewnienia bliższego odstępu poziomów. Oba z tych środków są w równym stopniu pożądane.
1.7.2. Projekt dotyczący oszacowania NOEC/LOEC przy użyciu analizy wariancji (ANOVA)
Zalecane jest posiadanie skopiowanych zbiorników dla każdego stężenia i analizy statystycznej na poziomie zbiornika (10). Bez skopiowanych zbiorników nie można zastosować poprawek dla zmienności między zbiornikami, poza spodziewanymi dla poszczególnych ryb. Jednakże doświadczenie pokazało (11), że zmienność między zbiornikami jest bardzo mała w porównaniu ze zmiennością w obrębie zbiorników (tj. między rybami) w badanym przypadku. Dlatego względnie dopuszczalną alternatywą jest przeprowadzenie analizy statystycznej na poziomie poszczególnych ryb.
Zwyczajowo stosuje się co najmniej pięć stężeń badanych w serii geometrycznej ze współczynnikiem zalecanym nieprzekraczającym 3,2.
Ogólnie, gdy badania są prowadzone ze skopiowanymi zbiornikami, liczba skopiowanych zbiorników kontrolnych, a zatem i liczba ryb musi być podwojona przy każdym badaniu stężenia, które powinny być równoważnych rozmiarów (12)(13)(14). Z drugiej strony, przy nieobecności skopiowanych zbiorników, liczba ryb w grupie kontrolnej powinna być taka sama jak liczba przy każdym badaniu stężenia.
Jeśli ANOVA ma opierać się na zbiornikach, a nie na poszczególnych rybach (pociąga to albo oznaczanie poszczególnych ryb albo użycie "pseudoszczególnych" wskaźników rozwoju (zob. pkt 2.1.2), zachodzi potrzeba wystarczającego skopiowania zbiorników w celu zapewnienia oznaczenia standardowego odchylenia "stężeń w obrębie zbiorników". To oznacza, że stopień swobody błędu w analizie wariancji musi wynosić co najmniej 5 (11). Jeśli tylko doświadczenia kontrolne są powielane zachodzi niebezpieczeństwo, że zmienność
błędu będzie obciążona, ponieważ może to zwiększyć rozważaną wartość średnią wskaźnika rozwoju. Ponieważ wskaźnik rozwoju prawdopodobnie zmniejszy się ze wzrostem stężenia, będzie to powodowało przeszacowanie zmienności.
1.8. PROCEDURA
1.8.1. Wybór i ważenie ryb badanych
Istotne jest, aby zminimalizować zmienność wagi ryb na początku badania. Odpowiedni zakres wymiarowy dla różnych gatunków zalecanych do wykorzystania w tym badaniu podano w dodatku 1. W odniesieniu do całej partii ryb wykorzystanych w badaniu zakres poszczególnych wag na początku badania powinien być idealnie utrzymany w obrębie ± 10 % średniej arytmetycznej wagi, a w żadnym przypadku nie może przekraczać 25 %. Zalecane jest zważenie podpróbki ryb przed badaniem, w celu oszacowania średniej wagi.
Należy wstrzymać żywienie populacji na 24 godziny przed rozpoczęciem badania. Ryby powinny być wybrane losowo. Stosując ogólne znieczulenie (np. roztwór wodny 100 mg/l tricainy metanosulfonianu (MS 222) zneutralizowanej przez dodanie dwóch części dwuwęglanu sodu na jedną część MS 222), ryby powinny być zważone pojedynczo w stanie wilgotnym (osuszone) z dokładnością podaną w dodatku 1. Ryby, których waga jest w zamierzonym zakresie powinny być zatrzymane i następnie losowo rozdzielone do zbiorników do badań. Całkowita waga ryb w każdym zbiorniku powinna być odnotowana. Użycie znieczulenia ułatwia manipulację rybami (włączając suszenie i ważenie) może jednak powodować stres i zranienia dla młodocianych ryb, w szczególności dla gatunków o małych wymiarach. Dlatego manipulowanie młodocianymi rybami musi być wykonane z najwyższą troską, aby zapobiec stresom i zranieniom badanych zwierząt.
Ryby są ważone ponownie w 28 dniu badania (zob. pkt 1.8.6). Jednakże jeśli jest to uważane za niezbędne przeliczenie racji żywieniowej, ryby są ważone ponownie 14 dnia badania (zob. pkt 1.8.2.3). Inne metody, takie jak metoda fotograficzna, mogą być stosowane do ustalania zmiany rozmiarów ryb, na podstawie których można dostosować racje żywieniowe.
1.8.2. Warunki ekspozycji
1.8.2.1. Czas trwania
Czas trwania badania wynosi ≥ 28 dni.
1.8.2.2. Wskaźnik obciążenia i gęstości wyjściowe
Istotne jest, aby wskaźnik obciążenia i gęstość wyjściowa były właściwe dla wykorzystanych gatunków badanych (zob. dodatek 1). Jeśli gęstość wyjściowa jest za wysoka, wtedy stres z powodu zatłoczenia może prowadzić do zmniejszenia wskaźnika rozwoju i prawdopodobnie do choroby. Jeśli jest za mała, może wytwarzać zachowywanie terytorialne, które również wpływa na rozwój. W każdym przypadku wskaźnik obciążenia powinien być wystarczająco niski, aby stężenie tlenu rozpuszczonego wynosiło przynajmniej 60 % ASV i było utrzymywana bez napowietrzania. Próba pierścieniowa (2) pokazała, że w odniesieniu do pstrąga tęczowego wskaźnik obciążenia dla 16 pstrągów po 3-5 gram w 40-litrowej objętości jest dopuszczalny. Zalecana częstotliwość usuwania wody w czasie trwania badania wynosi 6 litrów/gram ryby/ dzień.
1.8.2.3. Karmienie
Ryby muszą być karmione właściwym pokarmem (dodatek 1) w wystarczającej ilości dla wytworzenia akceptowalnego wskaźnika rozwoju. Należy zwrócić uwagę, aby zapobiec rozwojowi mikrobów i mętności wody. Dla pstrąga tęczowego wskaźnik 4 % ich wagi ciała dziennie prawdopodobnie spełnia te warunki (2)(15) (16)(17). Dzienna racja może być podzielona na dwie równe porcje i podawana rybom w dwóch posiłkach dziennie, w odstępie co najmniej pięciu godzin. Racje są oparte na początkowej całkowitej wadze ryb w każdym zbiorniku do badań. Jeśli ryby są ważone ponownie 14 dnia racje są wtedy przeliczane. Karmienie powinno być wstrzymane na 24 godziny przed ważeniem.
Niezjedzony pokarm i odchody ryb muszą być usuwane ze zbiorników do badań codziennie, poprzez staranne czyszczenie dna zbiorników stosując ssanie.
1.8.2.4. Światło i temperatura
Czas naświetlania i temperatura wody muszą być odpowiednie dla badanego gatunku (dodatek 1).
1.8.3. Stężenia użyte w badaniu
Zwykle wymagane jest pięć stężeń badanych, poza projektem badania (zob. pkt 1.7.2). Wcześniejsza znajomość toksyczności substancji badanej (np. z badania ostrej toksyczności i/lub ustalonego w badaniach zakresu) pomaga w doborze właściwych stężeń badanych. Najwyższe stężenie badane nie może przekraczać granicy rozpuszczalności substancji w wodzie.
W przypadku gdy środek ułatwiający rozpuszczenie towarzyszy w przygotowaniu roztworu wyjściowego jego końcowe stężenie nie może być większe niż 0,1 ml/l i zalecane jest takie same we wszystkich zbiornikach do badań (zob. pkt 1.6.3). Jednakże należy dołożyć wszelkich starań, aby uniknąć użycia takich materiałów.
1.8.4. Doświadczenia kontrolne
Liczba doświadczeń kontrolnych wody rozcieńczającej zależy od projektu badania (zob. pkt 1.7-1.7.2). Jeśli stosowany jest środek ułatwiający rozpuszczanie, powinna być przeprowadzona taka sama liczba doświadczeń kontrolnych co liczba doświadczeń kontrolnych z wodą rozcieńczającą.
1.8.5. Częstotliwość oznaczeń analitycznych i pomiarów
W czasie trwania badania stężenia substancji badanej są oznaczane w regularnych odstępach czasu (zob. poniżej).
W badaniach przepływowych wskaźniki przepływu rozcieńczalnika i roztworu wyjściowego toksykanta muszą być sprawdzane w odstępach czasu, najlepiej codziennie, i nie mogą się zmieniać więcej niż 10 % w trakcie badania. W przypadku gdy oczekuje się, że stężenie badanej substancji będzie w zakresie ± 20 % wartości nominalnej (tj. w zakresie 80-120 %; zob. pkt 1.6.2 i 1.6.3), jest zalecane, aby jako minimum wykonać analizę najmniejszego i największego stężenia substancji badanej na początku badania i w tygodniowych odstępach czasu, w okresie późniejszym. W przypadku gdy oczekuje się, że stężenie substancji badanej pozostanie w zakresie ± 20 % nominalnej wartości (na podstawie danych stabilności substancji badanej), niezbędne jest analizowanie wszystkich stężeń badanych, ale przy zastosowaniu tego samego systemu.
W półstatycznych (odnawialnych) badaniach, w przypadku gdy oczekuje się, że stężenie badanej substancji pozostanie w zakresie ± 20 % nominalnej wartości, jest zalecane, aby jako minimum analizować najniższe i najwyższe stężenia badane świeżo po przygotowaniu i zaraz przed odnowieniem, na początku badań i cotygodniowo w okresie późniejszym. Dla badań gdzie nie oczekuje się, że stężenie substancji badanej pozostanie w zakresie ± 20 % nominału, wszystkie badane stężenia muszą być analizowane, przy zastosowaniu tego samego systemu co dla substancji bardziej stabilnych.
Zalecane jest, aby wyniki oparte były na pomierzonych stężeniach. Jeżeli jednakże dostępne dowody wykazują, że stężenie badanej substancji w roztworze można z powodzeniem utrzymywać w obszarze ± 20 % nominalnego lub wstępnie zmierzonego stężenia poprzez okres badania, wtedy wyniki mogą być oparte na wartościach nominalnych lub zmierzonych.
Próbki mogą wymagać przefiltrowania (np. stosując 0,45 μm wymiar poru) lub odwirowania. Odwirowanie jest zalecaną procedurą. Jednakże jeśli badany materiał nie adsorbuje się na filtrze, dopuszczalna jest też filtracja.
W czasie trwania badania powinny być mierzone tlen rozpuszczony, pH i temperatura we wszystkich zbiornikach. Całkowita twardość, alkaliczność i zasolenie (jeśli dotyczy) muszą być mierzone w doświadczeń kontrolnych i w zbiorniku o najwyższym stężeniu. Jako minimum należy pomierzyć rozpuszczony tlen i zasolenie (jeśli dotyczy) trzy razy (na początku, w środku i pod koniec badania). W badaniach półstatycznych jest zalecane, aby rozpuszczony tlen był mierzony częściej, najlepiej przed i po każdej wymianie wody lub co najmniej raz na tydzień. Wartość pH na początku i na końcu każdej wymiany wody w badaniach statycznych odnawialnych i co najmniej cotygodniowo w badaniach przepływowych. Twardość i alkaliczność powinny być mierzone jednorazowo w każdym badaniu. Zalecane jest stałe monitorowanie temperatury w przynajmniej jednym zbiorniku do badań.
1.8.6. Obserwacje
Ważenie: pod koniec badania wszystkie ryby, które przeżyły, muszą być zważone jako masa wilgotna (osuszone) albo grupowo z badanego zbiornika albo pojedynczo. Zalecane jest ważenie ryb z badanego zbiornika, zamiast poszczególnych ryb, gdyż wymaga to indywidualnego oznaczenia ryby. W przypadku pomiarów wagi poszczególnych ryb, w celu oznaczenia wskaźnika szczególnego rozwoju określonej ryby, wybrana technika oznaczania powinna zapobiegać stresowaniu zwierząt (alternatywne do oznaczania w stanie zamrożonym jest stosowne oznaczenie ryby np. kolorową cienką linią).
Ryby powinny być sprawdzane codziennie w czasie trwania okresu badania na jakiekolwiek zewnętrzne odstępstwa od normalności (takie jak krwotoki, odbarwienia) oraz nienormalne zachowanie. Każdy przypadek śmiertelny musi być odnotowany a martwa ryba usunięta tak szybko jak to możliwe. Martwe ryby nie są zastępowane, wskaźnik obciążenia i gęstość wyjściowa są wystarczające, aby zapobiec wpływowi na rozwój poprzez zmiany w ilości ryb na zbiornik. Jednakże zachodzi potrzeba dostosowania wskaźnika żywieniowego.
2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW
Jest zalecane, aby statystyka obejmowała zarówno projekt, jak i analizę badania, ponieważ niniejsza metoda badania pozwala na uwzględnienie znacznej zmiany w projekcie doświadczenia, taką jak na przykład ilość komór do badań, liczbę stężeń badanych, liczbę ryb itd. Uwzględniając dostępne opcje w projekcie badania, nie podano tutaj informacji dotyczących procedur statystycznych.
Wskaźniki rozwoju nie powinny być obliczane w odniesieniu do zbiorników do badań, gdy śmiertelność przekracza 10 %. Jednakże wskaźnik śmiertelności powinien być wskazany w odniesieniu do wszystkich stężeń badanych.
Którakolwiek metoda jest stosowana do analizy danych, głównym pojęciem jest wskaźnik szczególnego rozwoju r między czasem t1 i czasem t2. Może to być określone na kilka sposobów zależnych od tego, czy ryby były indywidualnie oznaczane czy nie albo czy wymagana jest średnia zbiornika.
gdzie:
r1 = wskaźnik szczególnego rozwoju określonej ryby,
r2 = średniego zbiornikowy wskaźnik szczególnego rozwoju,
r3 = wskaźnik pseudoszczególnego rozwoju,
w1, w2 = wagi poszczególnych ryb w czasach odpowiednio t1 i t2,
loge w1 = logarytm wagi określonej ryby na początku okresu badania,
loge w2 = logarytm wagi określonej ryby pod koniec okresu badania,
logeW1 = średnia logarytmów wartości w1 w odniesieniu do ryb w zbiorniku na początku okresu badania,
logeW2 = średnia logarytmów wartości w2 w odniesieniu do ryb w zbiorniku pod koniec okresu badania,
t1, t2 = czas (dni) od startu do końca okresu badania
r1, r2, r3 może być obliczony w odniesieniu do okresu 0-28 dni i, tam gdzie to jest stosowne (np. gdy pomiar wykonano w 14 dniu) w odniesieniu do okresów czasu 0-14 i 14-28 dni.
2.1.1. Regresyjna analiza wyników (modelowanie stężenie-reakcja)
Niniejsza metoda analizy dostosowuje odpowiednią matematyczną zależność między wskaźnikiem szczególnego rozwoju a stężeniem i stąd umożliwia obliczenie "ECX", tj. każdej wymaganej wartości WE. Stosując niniejszą metodę obliczenia r dla określonej ryby (r1), nie jest konieczne i zamiast tego analiza może być oparta na średniej zbiornikowej wartości r (r2). Ta ostatnia metoda jest zalecana. Jest także bardziej właściwa w przypadku użycia najmniejszych gatunków.
Średnie zbiornikowe wskaźniki szczególnego rozwoju (r2) muszą być wykreślone graficznie w zależności od stężenia w celu sprawdzenia zależności reakcji stężenia.
Dla wyrażenia zależności między r2 a stężeniem powinien być wybrany właściwy model, a wybór musi być poparty odpowiednim uzasadnieniem.
Jeśli ilości ryb, które przeżyły w każdym zbiorniku są nierówne, wtedy proces dostosowania modelu albo prostego albo nieliniowego powinien być rozważony, aby uwzględnić nierówność rozmiarów grup.
Metoda dostosowania modelu musi umożliwiać oszacowanie czy na przykład EC20 i jego rozrzut (czy błąd standardowy czy przedział ufności) może być wyprowadzony. Wykres dopasowanego modelu powinien być przedstawiony w zależności od danych tak, aby odpowiedniość dopasowania modelu była widoczna (8)(18) (29)(20).
2.1.2. Analiza wyników dla oszacowania LOEC
Jeżeli badanie obejmuje skopiowane zbiorniki przy wszystkich poziomach stężeń, oszacowanie LOEC może być oparte na analizie wariancji (ANOVA) średniego zbiornikowego wskaźnika szczególnego rozwoju (zob. pkt 2.1), według odpowiednich metod (np. badania Dunnetta lub Williamsa (12)(13)(14)(21)) porównywania średniego r w odniesieniu do każdego stężenia ze średnią r w odniesieniu do doświadczeń kontrolnych dla określenia najniższego stężenia, dla którego ta różnica jest znacząca przy poziomie prawdopodobieństwa 0,05. Jeśli wymagane przyjęcie dla metod parametrycznych nie odpowiada nienormalnemu rozkładowi (np. badanie Shapiro-Wilka) lub heterogenicznej wariancji (badanie Bartletta), należy podjąć rozważania w celu przekształcenia danych do jednolitych wariancji przed zastosowaniem ANOVA albo przeprowadzeniem ważonego ANOVA.
Jeśli badanie nie obejmuje duplikatów zbiorników dla każdego stężenia, ANOVA oparta o zbiorniki będzie niesensytywna albo niemożliwa. W tej sytuacji dopuszczalnym kompromisem jest ANOVA na pseudoszcze-gólnym wskaźniku rozwoju r3 dla poszczególnych ryb.
Średnia r3 dla każdego stężenia badanego może wtedy być porównywana ze średnią r3 dla doświadczeń kontrolnych. LOEC może być wtedy określona jak poprzednio. Trzeba jednak uznać, że niniejsza metoda nie umożliwia wprowadzania poprawek, ani nie zabezpiecza przed zmiennościami między zbiornikami, poza tymi, które są liczone dla zmienności między poszczególnymi rybami. Jednakże doświadczenie pokazało (8), że zmienność między zbiornikami jest bardzo mała w porównaniu z zmiennością wewnątrz zbiorników (tj. między rybami). Jeśli poszczególne ryby nie są włączone do analizy, poboczna metoda identyfikacji i uzasadnienie jej użycia życia muszą być przedstawione.
2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW
Wyniki muszą być interpretowane z ostrożnością w przypadku, gdy mierzone stężenie toksykanta w roztworach badanych wypada na poziomie granicy wykrywalności metody analitycznej lub w badaniach półstatycznych, gdy stężenie substancji badanej obniża się między świeżo przygotowanymi roztworami i przed wymianą.
2.3. SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
2.3.1. Substancja użyta w badaniu:
- natura fizyczna i odpowiednie właściwości fizykochemiczne,
- dane identyfikacji chemicznej włączając czystość i metodę analityczną kwantyfikacji substancji badanej, tam gdzie jest to stosowne.
2.3.2. Gatunki użyte w badaniu:
- możliwie nazwa naukowa,
- szczep, wymiar, dostawca, wszystkie przedtraktowania itp.
2.3.3. Warunki badania:
- zastosowana procedura badania (np. półstatyczna/odnawialna, przepływowa, obciążenie, gęstość wyjściowa itp.),
- projekt badania (np. liczba zbiorników do badań, stężenia badane i duplikatów, liczba ryb na zbiornik),
- metoda przygotowania roztworów wyjściowych i częstotliwość odnawiania (środek ułatwiający rozpuszczanie i jego stężenie musi być podane, jeśli jest stosowany),
- nominalne stężenia użyte w badaniu, średnie wielkości mierzonych i ich standardowe odchylenia w zbiornikach do badań metody, którymi je uzyskano, oraz dowody, że pomiary odnoszą się do stężeń substancji badanej w prawdziwym roztworze,
- charakterystyka wody rozcieńczającej: pH, twardość, alkaliczność, temperatura, stężenie rozpuszczonego tlenu, poziom pozostałości chloru (jeśli jest zmierzony), całkowity węgiel organiczny, zawieszone cząstki stałe, zasolenie ośrodka badanego (jeśli jest zmierzony) oraz każde inne wykonane pomiary,
- jakość wody w obrębie zbiorników do badań: pH, twardość, temperatura i stężenie rozpuszczonego tlenu,
- szczegółowe informacje dotyczące karmienia (np. rodzaj pożywienia, źródło, ilość podawana i częstotliwość).
2.3.4. Wyniki:
- dowody, że doświadczenia kontrolne odpowiadają kryteriom ważności dla przeżycia oraz dane śmiertelności zdarzającej się w każdym stężeniu badanym,
- zastosowane techniki statystyczno-analityczne, statystyka oparta na duplikatach lub rybach, opracowanie danych i uzasadnienie użytych technik,
- stabelaryzowane dane wagi średniej i indywidualnej ryb w dniach 0, 14 (jeśli są zmierzone) i 28 wartości średniej zbiornikowej lub pseudoszczególnych wskaźników rozwoju (jeśli to stosowne) w okresie 0-28 dni lub możliwie 0-14 i 14-28,
- wyniki analizy statystycznej (tj. analizy regresyjnej lub ANOVA) zalecane w tabelarycznej i graficznej formie oraz LOEC (p = 0,05) i NOEC lub ECx z, o ile możliwe, błędami standardowymi, jeśli właściwe,
- wypadki wszystkich niezwykłych reakcji ryb i wszystkie wizualne efekty, wytworzone przez substancję badaną.
3. BIBLIOGRAFIA
(1) Solbe J. F. de LG (1987). Environmental Effects of Chemicals (CFM 9350 SLD). Report on a UK Ring Test of a Method for Studying the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. WRc Report No PRD 1388-M/2.
(2) Ashley S., Mallett M. J. and Grandy N. J. (1990). EEC Ring Test of a Method for Determining the Effects of Chemicals on the Growth Rate of Fish. Final Report to the Commission of the European Communities. WRc Report No EEC 2600-M.
(3) Crossland N. O. (1985). A method to evaluate effects of toxic chemicals on fish growth. Chemosphere, 14, pp. 1855-1870.
(4) Nagel R., Bresh H., Caspers N., Hansen P. D., Market M., Munk R., Scholz N. and Hofte B. B. (1991). Effect of 3,4-dichloroaniline on the early life stages of the Zebrafish (Brachydanio rerio): results of a comparative laboratory study. Ecotox. Environ. Safety, 21, pp. 157-164.
(5) Yamamoto, Tokio. (1975). Series of stock cultures in biological field. Medaka (killifish) biology and strains. Keigaku Publish. Tokio, Japan.
(6) Holcombe, G. W., Benoit D. A., Hammermeister, D. E., Leonard, E. N. and Johnson, R. D. (1995). Acute and long-term effects of nine chemicals on the Japanese medaka (Oryzias latipes). Arch. Environ. Conta. Toxicol. 28, pp. 287-297.
(7) Benoit, D. A., Holcombe, G. W. and Spehar, R. L. (1991). Guidelines for conducting early life toxicity tests with Japanese medaka (Oryzias latipes). Ecological Research Series EPA-600/3-91-063. US Environ-mental Protection Agency, Duluth, Minnesota.
(8) Stephan C. E. and Rogers J. W. (1985). Advantages of using regression analysis to calculate results of chronic toxicity tests. Aquatic Toxicology and Hazard Assessment: Eighth Symposium, ASTM STP 891, R. C. Bahner and D. J. Hansen, eds., American Society for Testing and Materials, Philadelphia, pp. 328- 338.
(9) Environment Canada (1992). Biological test method: toxicity tests using early life stages of salmonid fish (rainbow trout, coho salmon, or atlantic salmon). Conservation and Protection, Ontario, Report EPS 1/ RM/28, 81 p.
(10) Cox D. R. (1958). Planning of experiments. Wiley Edt.
(11) Pack S. (1991). Statistical issues concerning the design of tests for determining the effects of chemicals on the growth rate of fish. Room Document 4, OECD Ad Hoc Meeting of Experts on Aquatic Toxicology, WRc Medmenham, UK, 10-12 December 1991.
(12) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing Several Treatments with a Control, J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096-1121.
(13) Dunnett C. W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.
(14) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, pp. 103-117.
(15) Johnston, W. L., Atkinson, J. L., Glanville N. T. (1994). A technique using sequential feedings of different coloured food to determine food intake by individual rainbow trout, Oncorhynchus mykiss: effect of feeding level. Aquaculture 120, pp. 123-133.
(16) Quinton, J. C. and Blake, R. W. (1990). The effect of feed cycling and ration level on the compensatory growth response in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of Fish Biology, 37, pp. 33-41.
(17) Post, G. (1987). Nutrition and Nutritional Diseases of Fish. Chapter IX in Testbook of Fish Health. T.F.H. Publications, Inc. Neptune City, New Jersey, USA. 288 pp.
(18) Bruce, R. D. and Versteeg D. J. (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environ. Toxicol. Chem. 11, pp. 1485-1494.
(19) DeGraeve, G. M., Cooney, J. M., Pollock, T. L., Reichenbach, J. H., Dean, Marcus, M. D. and McIntyre, D. O. (1989). Precision of EPA seven-day fathead minnow larval survival and growth test; intra and interlaboratory study. Report EA-6189 (American Petroleum Institute Publication, No 4468). Electric Power Research Institute, Palo Alto, CA.
(20) Norbert-King T. J. (1988). An interpolation estimate for chronic toxicity: the ICp approach. US Environmental Protection Agency. Environmental Research Lab., Duluth, Minnesota. Tech. Rep. No 05- 88 of National Effluent Toxicity Assesment Center. Sept. 1988. 12 pp.
(21) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, pp. 510-531.
______
(1) Meyer, A., Bierman, C.H. and Orti, G. (1993). The phylogenetic position of the zebrafish (Danio rerio), a model system in developmental biology: an invitation to the comparative method. Proc. R. Soc. Lond. B. 252, 231-236.
DODATEK 1
GATUNKI RYB ZALECANE DO BADANIA I ODPOWIEDNIE WARUNKI BADANIA
| Gatunki | Zalecana temperatura badania zakres temperatur (oC) | Okres naświetlania (godziny) | Zalecany zakres początkowej wagi ryby (g) | Wymagana dokładność pomiarowa | Wskaźnik obciążenia (g/l) | Gęstość wyjściowa (na litr) | Pokarm | Czas trwania badania (dni) |
| Zalecane gatunki: | ||||||||
| Oncorhynchus mykiss Pstrąg tęczowy | 12,5-16,0 | 12 - 16 | 1-5 | 100 mg | 1,2 - 2,0 | 4 | Sucha pasza dla narybka | ≥ 28 |
| Inne dobrze udokumentowane | ||||||||
| Danio rerio Zebrafish | 21 - 25 | 12 - 16 | 0,050 - 0,100 | 1 mg | 0,2 - 1,0 | 5 - 10 | Żywa żywność (Brachionus Artemia) | ≥ 28 |
| Oryzias latipes Ricefish (Medaka) | 21 - 25 | 12 - 16 | 0,050 - 0,100 | 1 mg | 0,2-1,0 | 5 - 20 | Żywa żywność (Brachionus Artemia) | ≥ 28 |
DODATEK 2
NIEKTÓRE CECHY CHEMICZNE DOPUSZCZONEJ WODY ROZCIEŃCZAJĄCEJ
| Substancja | Stężenie |
| Cząstki stałe | < 20 mg/l |
| Całkowity węgiel organiczny | < 2 mg/l |
| Niezjonizowany amoniak | < 1 μg/l |
| Pozostałość chloru | < 10 μg/l |
| Całkowite pestycydy fosforoorganiczne | < 50 ng/l |
| Całkowite pestycydy chloroorganiczne plus polichlorowane bifenyle | < 50 ng/1 |
| Calkowity chlor organiczny | < 25 ng/1 |
DODATEK 3
Logarytmiczne serie stężeń odpowiednich dla badania toksyczności (9)
| Kolumna (liczba stężeń między 100 i 10 lub między 10 i 1)(*) |
| 1 | 2 | 3 | i | 5 | 6 | 7 |
| 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 32 | 46 | 56 | 65 | 68 | 72 | 75 |
| 10 | 22 | 32 | 40 | 46 | 52 | 56 |
| 3,2 | 10 | 18 | 25 | 32 | 37 | 42 |
| 1,0 | 4,6 | 10 | 16 | 22 | 27 | 32 |
| 2,2 | 5,6 | 10 | 15 | 19 | 24 | |
| 1,0 | 3,2 | 6,3 | 10 | 14 | 18 | |
| 1,8 | 4,0 | 6,8 | 10 | 13 | ||
| 1,0 | 2,5 | 4,6 | 7,2 | 10 | ||
| 1,6 | 3,2 | 5,2 | 7,5 | |||
| 1,0 | 2,2 | 3,7 | 5,6 | |||
| 1,5 | 2,7 | 4,2 | ||||
| 1,0 | 1,9 | 3,2 | ||||
| 1,4 | 2,4 | |||||
| 1,0 | 1,8 | |||||
| 1,3 | ||||||
| 1,0 |
| (*) Serie pięciu (lub więcej) kolejnych stężeń mogą być wybrane z kolumny. Punkt środkowy między stężeniami w kolumnie (x) są znajdowane w kolumnie (2x + 1). Zamieszczone wartości przedstawiają stężenia wyrażone w procentach objętościowo lub wagowo (mg/l lub μg/l). Wartości mogą być zwielokrotniane lub dzielone przez każdą potęgę 10, jeśli to konieczne. Kolumna 1 może być używana, jeśli była znaczna niepewność w poziomie toksyczności. |
C.15. RYBY, KRÓTKOTERMINOWE BADANIE TOKSYCZNOŚCI NA EMBRIONIE I NARYBKU
Skreślono tę metodę badania, ponieważ nie jest już uznawana za odpowiednią do generowania informacji na temat właściwości ekotoksykologicznych substancji chemicznych do celów rozporządzenia (WE) nr 1907/2006. Metody badań mające zastosowanie do danego punktu końcowego przedstawiono w części 0 tabela 3.
C.16. PSZCZOŁY MIODNE - BADANIE TOKSYCZNOŚCI OSTREJ DROGĄ POKARMOWĄ
1. METODA
Niniejsza metoda badania toksyczności ostrej jest kopią OECD TG 213 (1998).
1.1. WPROWADZENIE
Niniejszy badanie toksyczności jest laboratoryjną metodą, zaprojektowaną do oceny ostrej toksyczności środków ochrony roślin i innych substancji chemicznych do dorosłych robotnic pszczół miodnych.
Przy oszacowaniu i ocenie cech toksyczności substancji chemicznej oznaczenie ostrej toksyczności drogą pokarmową dla pszczół miodnych jest wymagane np. gdy jest prawdopodobna ekspozycja pszczół na działanie danej substancji chemicznej. Badanie toksyczności ostrej drogą pokarmową jest przeprowadzane dla ustalenia właściwej toksyczności dla pszczół, pestycydów i innych substancji chemicznych. Wyniki niniejszego badania powinny być wykorzystane do określenia potrzeby dalszej oceny. W szczególności niniejsza metoda może być zastosowana w programach odcinkowych oceny niebezpieczeństwa pestycydów dla pszczół, w oparciu o kolejne postępy badań toksyczności laboratoryjnych do półpolowych i polowych eksperymentów (1). Pestycydy mogą być badane jako substancje aktywne (a.s.) lub jako wytworzone produkty.
Standard toksyczności powinien być zastosowany do sprawdzenia wrażliwości pszczół i precyzji procedury badania.
1.2. DEFINICJE
Ostra toksyczność drogą pokarmową: jest negatywnymi skutkami powstającymi w granicach maksymalnego okresu 96 godzin po podaniu doustnym pojedynczej dawki badanej substancji.
Dawka: jest ilością substancji badanej spożytej. Dawka jest wyrażana jako masa (μg) substancji badanej na badane zwierzę (μg/pszczoła). Rzeczywista dawka dla każdej pszczoły nie może być obliczona, ponieważ są karmione wspólnie, ale średnia dawka może być oszacowana (całkowita ilość spożytej substancji badanej/ilość badanych pszczół w jednej klatce).
LD50 (średnia dawka śmiertelna) drogą pokarmową: jest statystycznie wyprowadzoną pojedynczą dawką substancji, która powoduje zgonu 50 % zwierząt przy podaniu drogą pokarmową. Wartość LD50 jest wyrażona w (μg) substancji badanej na pszczołę. W odniesieniu do pestycydów substancją badaną może być substancja aktywna (a.s.) albo wytworzony produkt zawierający jedną lub więcej niż jedną substancję aktywną.
Śmiertelność: zwierzę jest rejestrowane jako martwe, gdy jest zupełnie nieruchome.
1.3. ZASADA METODY BADANIA
Dorosłe robotnice pszczół miodnych (Apis mellifera) są eksponowane w zakresie dawek substancji badanej rozproszonej w roztworze sacharozy. Następnie pszczoły są karmione tą samą dietą, wolną od substancji badanej. Śmiertelność jest rejestrowana codziennie podczas co najmniej 48 godzin i porównywana z wartościami kontrolnymi. Jeśli wskaźnik śmiertelności zwiększa się między 24 i 48 godziną, podczas gdy śmiertelność w doświadczeniu kontrolnym pozostaje na akceptowalnym poziomie, tj. < 10 %, właściwe jest rozciągnięcie czasu trwania badania do maksimum 96 godzin. Wyniki są analizowane w celu obliczenia LD50 w 24 i 48 godzinie i, w przypadku gdy badanie jest przedłużone, w 72 i 96 godzinie.
1.4. WAŻNOŚĆ BADANIA
Aby badanie było ważne, mają zastosowanie następujące warunki:
- średnia śmiertelność dla wszystkich doświadczeń kontrolnych nie może przekraczać 10 % na końcu badania,
- LD50 normy toksyczności spełnia określony zakres.
1.5. OPIS METODY BADANIA
1.5.1. Zbieranie pszczół
Młode dojrzałe robotnice pszczół z tej samej rasy muszą być użyte, tj. pszczoły w tym samym wieku, statusie żywieniowym itd. Pszczoły powinny być uzyskane z kolonii, właściwie odżywianej, zdrowej, tak dalece jak to możliwe wolnej od chorób, o właściwej królowej, o znanej historii i fizjologicznym statusie. Mogą być zebrane rano przed użyciem lub wieczorem przed badaniem i przechowane w warunkach badania do następnego dnia. Odpowiednie są pszczoły zebrane z ram, bez potomstwa. Należy uniknąć zbierania pszczół wczesną wiosną lub późną jesienią, gdyż podczas tego okresu mają zmienioną fizjologię. Jeżeli badania muszą być prowadzone wczesną wiosną lub późną jesienią, pszczoły umieszcza się w inkubatorze i hoduje przez tydzień na "pszczelim chlebie" (pyłek zebrany z grzebienia) i roztworze sacharozy. Pszczoły traktowane substancjami chemicznymi, takimi jak antybiotyki, produkty przeznaczone do zwalczania warrozy itd., nie powinny być używane do badań toksyczności przez cztery tygodnie od czasu końca ostatniego traktowania.
1.5.2. Pomieszczenie i warunki żywienia
Stosuje się łatwe do czyszczenia i dobrze wentylowane klatki. Należy stosować właściwe materiały, na przykład stal nierdzewną, siatkę drucianą, plastikowe lub jednorazowe drewniane klatki. Zalecane są grupy po dziesięć pszczół na klatkę. Wymiary klatek do badań muszą być właściwe do ilości pszczół, tj. zapewniać wystarczającą przestrzeń.
Pszczoły powinny być trzymane w ciemności, w pokoju doświadczalnym w temperaturze 25 ± 2 °C Wilgotność względna, zwykle około 50-70%, powinna być rejestrowana w czasie badania. Procedury postępowania, włączając traktowanie i obserwacje, prowadzi się w dziennym świetle. Roztwory sacharozy w wodzie o stężeniu końcowym 500 g/l (50 % wag./obj.) powinny być stosowane jako pokarm. Po podaniu próbnych dawek pokarm powinien być zapewniany ad libitum. System podawania pokarmu powinien umożliwiać rejestrowanie poboru pokarmu powinien odniesieniu do każdej klatki (zob. pkt 1.6.3.1). Może to być szklana rura (około 50 mm długości i 10 mm szerokości z otwartym zwężającym się końcem do około 2 mm średnicy).
1.5.3. Przygotowanie pszczół
Zebrane pszczoły mogą być przypadkowo rozmieszczane w klatkach do badań rozmieszczonych losowo w pokoju doświadczalnym.
Pszczoły mogą być zagłodzone przez 2 h przed rozpoczęciem badania. Zalecane jest, aby pszczoły pozbawiono pokarmu przed traktowaniem, tak aby wszystkie pszczoły miały równe warunki odnośnie do zawartości jelit na początku badania. Konające pszczoły powinny być usunięte i zastąpione zdrowymi przed rozpoczęciem badania.
1.5.4. Przygotowanie dawek
W przypadku gdy substancja badana jest związkiem mieszającym się z wodą, roztwarza się ją bezpośrednio w 50% roztworze sacharozy. W odniesieniu do produktów technicznych i substancji o niskiej rozpuszczalności w wodzie stosuje się nośniki takie, jak organiczne rozpuszczalniki, emulgatory lub dyspergatory o niskiej toksyczności dla pszczół (np. aceton, dimetyloformamid, dimetylosulotlenek). Stężenie nośnika zależy od rozpuszczalności badanej substancji i powinno być takie same dla wszystkich badanych stężeń. Jednakże 1 % stężenie nośnika jest ogólnie właściwe i nie może być przekraczane.
Powinny być przygotowane roztwory kontrolne, tj. w przypadku gdy stosuje się rozpuszczalnik lub dyspergator do rozpuszczenia substancji badanej, należy użyć dwóch oddzielnych roztworów kontrolnych: roztwór w wodzie i roztwór sacharozy z układem rozpuszczalnik/dyspergator o stężeniu stosowanym w roztworach dozujących.
1.6. PROCEDURA
1.6.1. Grupy badane i kontrolne
Liczba dawek i testowanych kopii musi spełniać wymagania statystyczne dla oznaczenia LD50 z 95 % granicą ufności. Zwykle pięć dawek w serii geometrycznej, ze wskaźnikiem nieprzekraczającym 2,2 i obejmującym zakres dla LD50, jest wymaganych dla badania. Jednakże wskaźnik rozcieńczenia i liczba stężeń w odniesieniu do dozowania muszą być ustalone w zależności od zbocza krzywej toksyczności (dawka w zależności od śmiertelności) i uwzględnione w ramach wybranej metody statystycznej do analizy wyników. Badanie znalezienia zakresu umożliwia wybór właściwych stężeń do dozowania.
Należy użyć minimum trzech kopii grup badanych, po 10 pszczół każda, dozowanych każdym stężeniem badanym. Minimum trzy kontrolne partie, każda po 10 pszczół, powinny być dodatkowo włączone w przebieg serii badań. Partie kontrolne powinny być także włączone, gdy stosowany jest układ rozpuszczalnik/nośnik (zob. pkt 1.5.4).
1.6.2. Norma toksyczności
W badane serie należy włączyć normę toksyczności. Co najmniej trzy dawki muszą być wybrane do pokrycia wartości oczekiwanej LD50. Co najmniej trzy skopiowane klatki, każda zawierająca 10 pszczół, należy użyć dla każdej badanej dawki. Zalecaną normą toksyczności jest dimetoat, dla którego doniesienie o LD50-24 h, drogą pokarmową jest w zakresie 0,10-0,35 μg a.s./pszczoła (2). Jednakże inne normy toksyczności byłyby również dopuszczalne w przypadku, gdy można dostarczyć wystarczających danych do sprawdzenia oczekiwanej reakcji na dawkę (np. paration).
1.6.3. Ekspozycja
1.6.3.1. Podawanie dawek
Każdej badanej grupie pszczół należy dostarczyć 100-200 μl 50 % roztworu sacharozy w wodzie, zawierającego badaną substancję o właściwym stężeniu. Większa objętość jest wymagana w odniesieniu do produktów o niskiej rozpuszczalności, niskiej toksyczności lub stężeniu w składzie, ponieważ muszą być zastosowane wyższe proporcje w roztworze sacharozy. Ilość traktowanej, spożytej diety przez grupę musi być monitorowana. Zużyty podajnik (zwykle 3-4 godz.) powinien być usunięty z klatki i zastąpiony podajnikiem wypełnionym tylko roztworem sacharozy. Roztwory sacharozy są wtedy dostarczane ad libitum. W odniesieniu do niektórych związków odrzucenie wyższego stężenia dawki badanej objawia się w małej konsumpcji pokarmu lub jej braku. Po maksimum 6 godz. niespożyta traktowana dieta powinna być zastąpiona samym roztworem sacharozy. Ilość spożytej traktowanej diety musi być oszacowana (np. pomiar objętość/waga pozostałej traktowanej diety).
1.6.3.2. Czas trwania
Zalecany czas trwania badania wynosi 48 godz. po zastąpieniu roztworu badanego, roztworem samej sacharozy. Jeśli śmiertelność nadal wzrasta do więcej niż 10 % po pierwszych 24 godz., czas trwania badania powinien być przedłużony do maksimum 96 godz., zapewniając, że śmiertelność w doświadczeniu kontrolnym nie przewyższa 10 %.
1.6.4. Obserwacje
Śmiertelność jest rejestrowana w 4 godziny po rozpoczęciu badania, a w okresie późniejszym w 24 i 48 godzinie (tj. po podaniu dawki). Jeśli wymagany jest przedłużony okres obserwacji, następne oceny powinny być dokonane w 24 godzin przedziałach czasowych, do maksimum 96 godzin, pod warunkiem że śmiertelność w doświadczeniu kontrolnym nie przekroczy 10 %.
Ilości pokarmu spożytego na grupę powinna być oszacowana. Porównanie wskaźników spożycia traktowanej i nietraktowanej diety w danych 6 godzinach dostarcza informacji o strawności diety traktowanej.
Wszystkie anormalne efekty zachowania zaobserwowane w trakcie okresu badania powinny być zarejestrowane.
1.6.5. Badanie graniczne
W pewnych przypadkach (np. gdy oczekuje się, że substancja badana posiada niską toksyczność) należy przeprowadzić badanie graniczne, stosując 100 μg a.s./pszczołę w celu ukazania, że LD50 jest większa niż niniejsza wartość. Ta sama procedura powinna być zastosowana do, włączając trzy skopiowane grupy badane dla dawki badanej, odpowiednich doświadczeń kontrolnych, oceny ilości traktowanej diety spożytej oraz użycia normy toksyczności. Jeśli występuje śmiertelność, powinny być przeprowadzone pełne badania. Jeśli obserwuje się podśmiertelne skutki (zob. pkt 1.6.4), powinny być one zarejestrowane.
2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
2.1. DANE
Dane powinny być zestawione w formie tabelarycznej, pokazując w odniesieniu do każdej traktowanej grupy, jak również w odniesieniu do grup kontrolnych i grup norm toksyczności, ilość użytych pszczół, śmiertelność w dowolnym momencie obserwacji i liczbę pszczół o negatywnym zachowaniu. Analiza danych śmiertelności właściwymi metodami statystycznymi (np. analiza probitowa, średnia krocząca, prawdopodobieństwo dwumianu) (3)(4). Wykreślone krzywe dawka-reakcja w każdym zalecanym momencie obserwacji i obliczenia zboczy krzywych oraz średnie dawki śmiertelne (LD50) z 95 % granicami ufności. Poprawki dotyczące śmiertelności w doświadzeniach kontrolnych mogą być dokonane przy użyciu poprawki Abbotta (4)(5). W przypadku gdy traktowana dieta nie jest całkowicie spożyta, powinna być ustalona dawka substancji badanej spożytej przez grupę. LD50 powinna być wyrażona w μg substancji badanej na pszczołę.
2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
2.2.1. Substancja użyta w badaniu:
- charakter fizyczny i stosowne właściwości fizyko-chemiczne (np. stabilność w wodzie, ciśnienie pary),
- dane dotyczące identyfikacji chemicznej włączając wzór strukturalny, czystość (tj. w odniesieniu do pestycydów identyfikację i stężenie aktywnej(-ych) substancji).
2.2.2. Gatunki użyte w badaniu:
- nazwa naukowa, rasa, przybliżony wiek (w tygodniach), metoda zbierania, dane dotyczące zbierania,
- informacje dotyczące kolonii używanych do zbierania pszczół badanych, włączając stan zdrowotny, choroby wieku dorosłego, wszystkie wcześniejsze traktowania itd.
2.2.3. Warunki badania:
- temperatura i wilgotność względna pokoju doświadczalnego,
- warunki pomieszczenia włączając typ, wymiary i materiał klatki,
- metody przygotowania roztworu wyjściowego i roztworów badanych (rozpuszczalnik i jego stężenia muszą być podane, gdy zostały zastosowane),
- metoda przygotowania roztworu wyjściowego i częstotliwość odnawiania (środek ułatwiający rozpuszczanie i jego stężenia muszą być podane, gdy zostały zastosowane),
- projekt badania, np. liczba i stężenia badane użyte, ilość doświadczeń kontrolnych w odniesieniu do każdego stężenia badanego i doświadczenia kontrolnego, liczba kopii klatek i liczba pszczół na klatkę,
- data badania.
2.2.4. Wyniki:
- wyniki badań wstępnego szukania zakresu, jeśli wykonano,
- pierwotne dane: śmiertelność przy każdej dawce badanej w dowolnym momencie obserwacji,
- wykresy krzywych dawka-reakcja na koniec badania,
- wartość LD50 z granicami ufności 95 % w zalecanym momencie obserwacji, w odniesieniu do substancji badanej i normy toksyczności,
- zastosowane procedury statystyczne do określenia LD50,
- śmiertelność w doświadczeniach kontrolnych,
- inne skutki biologiczne zaobserwowane lub pomierzone, np. anormalne zachowanie pszczół (włączając odrzucenie dawki badanej), wskaźnik spożycia diety w traktowanych i nietraktowanych grupach,
- wszelkie odchylenia od opisanych tutaj procedur badania oraz wszelkie inne istotne informacje.
3. BIBLIOGRAFIA
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products-Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151-165. March 1993.
(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C, Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981-1992. Journal of Apicultural Research 22, pp. 119-125.
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99-113.
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265-267.
C.17. PSZCZOŁY MIODNE - BADANIE KONTAKTOWEJ TOKSYCZNOŚCI OSTREJ
1. METODA
Niniejsza metoda badania kontaktowej toksyczności ostrej jest kopią OECD TG 214 (1998 r.).
1.1. WPROWADZENIE
Niniejsze badanie toksyczności jest laboratoryjną metodą, zaprojektowaną do oceny kontaktowej ostrej toksyczności środków ochrony roślin i innych substancji chemicznych do dorosłych robotnic pszczół miodnych.
Przy oszacowaniu i ocenie cech toksyczności substancji chemicznej oznaczenie ostrej toksyczności kontaktowej dla pszczół miodnych jest wymagane np. gdy jest prawdopodobna ekspozycja pszczół na działanie danej substancji chemicznej. Badanie kontaktowej toksyczności ostrej jest przeprowadzane dla ustalenia właściwej toksyczności w odniesieniu do pszczół, pestycydów i innych substancji chemicznych. Wyniki niniejszego badania powinny być wykorzystane do określenia potrzeby dalszej oceny. W szczególności niniejsza metoda może być stosowana w programach odcinkowych oceny niebezpieczeństwa pestycydów dla pszczół, w oparciu o kolejne postępy badań toksyczności laboratoryjnych do półpolowych i polowych eksperymentów (1). Pestycydy mogą być badane jako substancje aktywne (a.s.) lub jako wytworzone produkty.
Norma toksyczności powinna być zastosowana do sprawdzenia wrażliwości pszczół i precyzji procedury badania.
1.2. DEFINICJE
Ostra toksyczność drogi pokarmowej: są to negatywne skutki powstające w granicach maksymalnego okresu 96 godzin po miejscowym podaniu pojedynczej dawki substancji.
Dawka: jest ilością substancji badanej zastosowanej. Dawka jest wyrażana jako masa (μg) substancji badanej na badane zwierzę (μg/pszczołę).
LD50 (średnia dawka śmiertelna) kontaktowa: jest statystycznie wyprowadzoną pojedyńczą dawką substancji, która powoduje zgon u 50 % zwierząt poprzez kontakt. Wartość LD50 jest wyrażona w μg substancji badanej na pszczołę. W odniesieniu do pestycydów substancją badaną może być substancja aktywna (a.s.) albo wytworzony produkt zawierający jedną lub więcej niż jedną substancję aktywną.
Śmiertelność: zwierzę jest rejestrowane jako martwe, gdy jest zupełnie nieruchome.
1.3. ZASADA METODY BADANIA
Dorosłe robotnice pszczół miodnych (Apis mellifera) są eksponowane w zakresie dawek substancji badanej rozproszonej we właściwym nośniku, przez bezpośrednie nałożenie na tułów (kropelki). Czas trwania badania wynosi 48 godz. Jeśli wskaźnik śmiertelności zwiększa się między 24 a 48 godz., podczas gdy śmiertelność w doświadzeniach kontrolnych pozostaje na akceptowalnym poziomie, tj. < 10 %, właściwe jest przedłużenie czasu trwania badania do maksimum 96 godz. Śmiertelność jest rejestrowana codziennie i porównywana z wartościami kontrolnymi .Wyniki są analizowane w celu obliczenia LD50 w 24 i 48 godz. oraz, w przypadku gdy badanie jest przedłużone, w 72 i 96 godz..
1.4. WAŻNOŚĆ BADANIA
Aby badanie było ważne, mają zastosowanie następujące warunki:
- średnia śmiertelność w odniesieniu do wszystkich doświadczeń kontrolnych nie może przekraczać 10 % na końcu badania,
- LD50 normy toksyczności odpowiada określonemu zakresowi.
1.5. OPIS METODY BADANIA
1.5.1. Zbieranie pszczół
Młode dojrzałe robotnice pszczół z tej samej rasy powinny być użyte, tj. pszczoły w tym samym wieku, statusie żywieniowym itd. Pszczoły powinny być uzyskane z kolonii, właściwie odżywianej, zdrowej, tak dalece jak to możliwe wolnej od chorób, o właściwej królowej, o znanej historii i fizjologicznym statusie. Muszą być zebrane rano przed użyciem lub wieczorem przed badaniem i przechowane w warunkach badania do następnego dnia. Odpowiednie są pszczoły zebrane z ram, bez potomstwa. Należy uniknąć zbierania pszczół wczesną wiosną lub późną jesienią, gdyż podczas tego okresu mają zmienioną fizjologię. Jeżeli badania muszą być prowadzone wczesną wiosną lub późną jesienią, pszczoły umieszcza się w inkubatorze i hoduje przez tydzień na "pszczelim chlebie" (pyłek zebrany z grzebienia) i roztworze sacharozy. Pszczoły traktowane substancjami chemicznymi, takimi jak antybiotyki, produkty przeznaczone do zwalczania warrozy itd., nie mogą być używane do badań toksyczności przez cztery tygodnie od chwili zakończenia ostatniego traktowania.
1.5.2. Pomieszczenie i warunki żywienia
Stosuje się łatwe do czyszczenia i dobrze wentylowane klatki. Należy stosować właściwe materiały, na przykład stal nierdzewną, siatkę drucianą, plastikowe lub jednorazowe drewniane klatki. Zalecane są grupy po dziesięć pszczół na klatkę. Wymiary klatek do badań muszą być odpowiednie do ilości pszczół, tj. zapewniać wystarczającą przestrzeń.
Pszczoły powinny być trzymane w ciemności, w pokoju doświadczalnym w temperaturze 25 ± 2 °C. Wilgotność względna, zwykle około 50-70 %, powinna być rejestrowana w czasie badania. Procedury postępowania włączając traktowanie i obserwacje prowadzi się w dziennym świetle. Roztwory sacharozy w wodzie o stężeniu końcowym 500 g/l (50 % wag./obj.) stosowane są jako pokarm podawany ad libitum w czasie trwania badania, używając podajnik pszczół. Może to być szklana rura (około 50 mm długości i 10 mm szerokości z otwartym zwężającym się końcem do około 2 mm średnicy).
1.5.3. Przygotowanie pszczół
Zebrane pszczoły są znieczulane dwutlenkiem węgla lub azotem w celu zastosowania substancji badanej. Ilość środka znieczulającego i czas ekspozycji powinien być zminimalizowany. Konające pszczoły powinny być usunięte i zastąpione zdrowymi pszczołami przed rozpoczęciem badania.
1.5.4. Przygotowanie dawek
Substancja badana ma być zastosowana jako roztwór w nośniku, tj. organicznym rozpuszczalniku lub wodnego roztworu ze środkiem zwilżającym. Z organicznych rozpuszczalników zalecany jest aceton, lecz mogą być użyte inne organiczne rozpuszczalniki o niskiej toksyczności dla pszczół (np. dwumetyloformamid, dwumetylosulfotlenek). Dla rozproszonych w wodzie określonych produktów i wysokopolarnych substancji organicznych nierozpuszczalnych w rozpuszczalnikowych organicznych nośnikach, roztwory łatwiej podawać, gdy przygotuje się słaby roztwór handlowego środka zwilżającego (np. Agral, Cittowett, Lubrol, Triton, Tween).
Powinny być przygotowane właściwe roztwory kontrolne, tj. w przypadku gdy użyto rozpuszczalnika albo dyspergator dla rozpuszczenia substancji badanej, powinny być zastosowane dwie kontrolne grupy, jedna traktowana wodą i jedna traktowana układem rozpuszczalnik/dyspergator.
1.6. PROCEDURA
1.6.1. Grupy badane i kontrolne
Liczba dawek i badanych kopii powinna odpowiadać wymaganiom statystycznym dotyczącym określenia LD50 z granicami ufności 95 %. Zwykle pięć dawek w serii geometrycznej, ze wskaźnikiem nieprzekraczającym 2,2 i obejmującym zakres dla LD50, jest wymaganych w odniesieniu do badań. Jednakże liczba dawek musi być ustalona w zależności od zbocza krzywej toksyczności (dawka w zależności od śmiertelności) i z uwzględnieniem wybranej metody statystycznej do analizy wyników. Badanie szukania zakresu umożliwia wybór właściwych stężeń do dozowania.
Należy użyć minimum trzech kopii grup badanych, po 10 pszczół każda, dozowanych każdym stężeniem badanym.
Minimum trzy kontrolne partie, każda
po 10 pszczół, powinny być dodatkowo włączone w przebieg serii badań. Jeśli rozpuszczalnik organiczny lub środek zwilżający jest stosowany, trzy partie kontrolne, każda po 10 pszczół dla rozpuszczalnika i środka zwilżającego, muszą być włączone.
1.6.2. Norma toksyczności
W badane serie należy włączyć normę toksyczności. Co najmniej trzy dawki powinny być wybrane do pokrycia oczekiwanej wartości LD50. Co najmniej trzy skopiowane klatki, każda zawierająca 10 pszczół, należy użyć przy każdej badanej dawce. Zalecaną normą toksyczności jest dimetoat, dla którego oświadczone ustnie LD50-24 h, drogą pokarmową jest w zakresie 0,10-0,35 μg a.s./pszczołę (2). Jednakże inne normy toksyczności byłyby również dopuszczalne w przypadku, gdy można dostarczyć wystarczających danych do sprawdzenia oczekiwanej reakcji na dawkę (np. paration).
1.6.3. Ekspozycja
1.6.3.1. Podawanie dawek
Znieczulone pszczoły są pojedynczo poddawane zabiegowi miejscowemu podaniu dawki. Pszczoły są losowo poddawane różnym próbnym i kontrolnym dawkom. Objętość 1 μl roztworu zawierającego substancję badaną o odpowiednim stężeniu powinna być podana mikroaplikatorem do grzbietowej strony tułowia każdej pszczoły. Można użyć inne objętości, jeśli jest to uzasadnione. Po podaniu dawki pszczoły są umieszczane w klatkach do badań i żywione roztworami sacharozy.
1.6.3.2. Czas trwania
Zalecany czas trwania badania wynosi 48 godz. Jeśli śmiertelność wzrasta o więcej niż 10 % między 24 a 48 godz., czas trwania badania powinien być przedłużony do maksimum 96 godz., pod warunkiem że śmiertelność przy doświadczeniu kontrolnym nie przewyższa 10 %.
1.6.4. Obserwacje
Śmiertelność jest rejestrowana w 4 godzinie po dozowaniu, a w okresie późniejszym w 24 i 48 godzinie. Jeśli wymagany jest przedłużony okres obserwacji, dalsze oceny powinny być dokonywane w 24-godzinnych przedziałach czasowych, do maksimum 96 godzin, pod warunkiem że śmiertelność przy doświadczeniu kontrolnym nie przekracza 10 %.
Wszystkie anormalne skutki zachowywania się w czasie trwania badania powinny być zarejestrowane.
1.6.5. Badanie graniczne
W niektórych przypadkach (np. gdy oczekuje się, że substancja badana posiada niską toksyczność) można przeprowadzić badanie graniczne, stosując 100 μg a.s./pszczoła w celu ukazania, że LD50 jest większa niż niniejsza wartość. Ta sama procedura powinna być zastosowana, włączając trzy skopiowane grupy badane, w odniesieniu do dawki badanej, odpowiednich dawek kontrolnych oraz użycia normy toksyczności. Jeśli występuje śmiertelność, powinny być przeprowadzone pełne badania. Jeśli obserwuje się podśmiertelne skutki (zob. pkt 1.6.4), powinny one być zarejestrowane.
2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
2.1. DANE
Dane powinny być zestawione w formie tabelarycznej, pokazując w odniesieniu do każdej traktowanej grupy, jak również w odniesieniu do grup kontrolnych i grup normy toksyczności, ilość użytych pszczół, śmiertelność w każdym momencie obserwacji i liczbę pszczół o negatywnym zachowaniu. Analiza danych dotyczących śmiertelności właściwymi metodami statystycznymi (np. analiza probitowa, średnia krocząca, prawdopodobieństwo dwumianu) (3)(4). Wykreślone krzywe dawka-reakcja w każdym zalecanym momencie obserwacji (tj. 24, 48 godz. i, jeśli to stosowne, 72 i 96 godz.) i obliczenia zboczy krzywych oraz średnie dawki śmiertelne (LD50) z granicami ufności 95 %. Poprawki w odniesieniu do śmiertelności przy doświadczeniu kontrolnym powinny być wykonane przy użyciu poprawki Abbotta (4)(5). LD50 powinna być wyrażona w μg substancji badanej na pszczołę.
2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
2.2.1. Substancja użyta w badaniu:
- charakter fizyczny i stosowne właściwości fizyko-chemiczne (np. stabilność w wodzie, ciśnienie pary),
- dane identyfikacji chemicznej, włączając wzór strukturalny, czystość (tj. w odniesieniu do pestycydów identyfikację i stężenie aktywnej substancji).
2.2.2. Gatunki użyte w badaniu:
- nazwa naukowa, rasa, przybliżony wiek (w tygodniach), metoda zbierania, dane dotyczące zbierania,
- informacje dotyczące kolonii używanych do zbierania pszczół badanych, włączając stan zdrowotny, choroby wieku dorosłego, wszystkie wcześniejsze traktowania itd.
2.2.3. Warunki badania:
- temperatura i wilgotność względna pokoju doświadczalnego,
- warunki pomieszczenia, włączając typ, wymiary i materiał klatki,
- metody podawania substancji badanej, np. użyty nośnik, rozpuszczalnik, objętość zastosowanego roztworu badanego, użyte znieczulenie,
- projekt badania, np. ilość i użyte dawki badane, liczba doświadczeń kontrolnych dla próbnej dawki i pomiaru, liczba kopii klatek i liczba pszczół na klatkę,
- data badania.
2.2.4. Wyniki:
- wyniki badań wstępnego szukania zakresu, jeśli wykonano,
- pierwotne dane: śmiertelność przy każdym stężeniu badanym w każdej chwili obserwacji,
- wykresy krzywych dawka-reakcja na koniec badania,
- wartość LD50 z 95 % limitem zaufania w każdym zalecanym momencie obserwacji, w odniesieniu do substancji badanej i normy toksyczności,
- zastosowane procedury statystyczne do określenia LD50,
- śmiertelność w doświadczeniach kontrolnych,
- inne skutki biologiczne zaobserwowane lub pomierzone i wszystkie anormalne reakcje pszczół,
- wszelkie odchylenia od opisanej tutaj metody badania i wszystkie inne istotne informacje.
3. BIBLIOGRAFIA
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision -Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Products-Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, pp. 151-165. March 1993.
(2) Gough, H. J., Mclndoe, E. C, Lewis, G. B. (1994). The use of dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxicity tests on honeybees (Apis mellifera L.), 1981-1992. Journal of Apicultural Research 22, pp. 119-125.
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, pp. 99-113.
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New York.
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effectiveness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, pp. 265-267.
C.18. ADSORPCJA/DESORPCJA PRZY UŻYCIU METODY RÓWNOWAGI OKRESOWEJ
1. METODA
Niniejsza metoda jest kopią OECD TG 106, w odniesieniu do określenia adsorpcji/desorpcji gleby przy użyciu metody równowagi okresowej (2000 r.).
1.1. WPROWADZENIE
Metoda uwzględnia próbę obrączkową i warsztat dotyczący wyboru gleby dla rozwoju badania adsorpcji (1)(2) (3)(4), a także istniejące wytyczne na poziomie krajowym (5)(6)(7)(8)(9)(10)(11).
Badania adsorpcji/desorpcji są użyteczne dla uzyskania podstawowych informacji dotyczących mobilności substancji chemicznych i ich rozłożeniu w ziemnych, wodnych i powietrznych częściach biosfery (12)(13)(14) (15)(16)(17)(18)(19)(20)(21). Informacje mogą być wykorzystywane w przewidywaniu lub szacowaniu na przykład zdolności substancji chemicznych do degradacji (22)(23), przekształcania i poboru przez organizmy (24); wymywania przez profil gleby (16)(18)(19)(21)(25)(26)(27)(28); lotności z gleby (21)(29)(30); ucieczki z powierzchni ziemi do wód naturalnych (18)(31)(32). Dane dotyczące adsorpcji są wykorzystywane do celów porównawczych i modelowania (19)(33)(34)(35).
Rozłożenie substancji chemicznej między glebę a fazę wodną jest złożonym procesem zależnym od wielu różnych czynników: charakteru chemicznego substancji (12)(36)(37)(38)(39)(40), cech gleby (4)(12)(13)(14) (41)(42)(43)(44)(45)(46)(47)(48)(49), czynników klimatycznych takich, jak opady deszczu, temperatury, światła słonecznego i wiatru. W ten sposób liczne zjawiska i mechanizmy włączają się w proces adsorpcji substancji chemicznej przez glebę i nie mogą być określone całościowo przez uproszczony model laboratoryjny, jak w niniejszej metodzie. Jednakże jeśli nawet ta próba nie może objąć środowiskowo możliwych przypadków, to dostarcza cennych informacji odnoszących się do adsorpcji substancji chemicznych w środowisku.
Zob. także Ogólne wprowadzenie.
1.2. ZAKRES
Metoda ma na celu oszacowanie zachowywania adsorpcji/desorpcji substancji w glebie. Celem jest uzyskanie wartości sorpcji, która jest użyteczna do przewidywania podziału w różnorodności warunków środowiskowych; do tego celu współczynniki adsorpcji równowagowej są ustalane w odniesieniu do substancji chemicznych w różnych glebach, jako funkcja cech gleby (np. zawartość węgla organicznego, zawartość gliny i tekstura gleby oraz pH). Należy użyć różnych typów gleby w celu objęcia jak najszerzej zdarzenia współdziałań danej substancji z glebami naturalnymi.
W niniejszej metodzie adsorpcja przedstawia proces wiązania się substancji chemicznej do powierzchni gleby; nie odróżnia między różnymi procesami adsorpcji (fizyczna i chemiczna adsorpcja) i takimi procesami, jak rozkład katalizowany powierzchniowo, masową adsorpcją i chemiczną reakcją. Adsorpcji zdarzającej się na cząstkach koloidów (średnica < 0,2 μm) wytwarzanych przez gleby nie uwzględniono.
Parametrami gleby, przypuszczalnie najistotniejszymi, w odniesieniu do gleby są: zawartość węgla organicznego (3)(4)(12)(13)(14)(41)(43)(44)(45)(46)(47)(48); zawartość gliny i tekstura gleby (3)(4)(41)(42) (43)(44)(45)(46)(47)(48) i pH w odniesieniu do zjonizowanych związków (3)(4)(42). Inne parametry gleby, które mają wpływ na absorpcję/desorpcję określonej substancji, to efektywna zdolność wymiany kationu (ECEC), zawartość amorficznego żelaza i tlenków glinu, szczególnie w odniesieniu do gleb wulkanicznych i tropikalnych (4), jak również powierzchnia właściwa (49).
Badanie jest zaprojektowane do oceny adsorpcji substancji chemicznej na różnego typu glebach o zróżnicowanym zakresie zawartości węgla organicznego, zawartości gliny i tekstury gleby oraz pH. Obejmuje to trzy warstwy:
Warstwa 1: Badania wstępne w celu ustalenia:
- proporcji gleba/roztwór,
- czasu równowagi dla adsorpcji i ilości substancji badanej zaadsorbowanej w równowadze,
- adsorpcji substancji badanej na powierzchni zbiornika badanego i stabilność badanej substancji w czasie trwania okresu badania.
Warstwa 2: Badanie klasyfikacji: adsorpcja jest badana na pięciu różnych typach gleby za pomocą kinetyki adsorpcji w pojedynczym stężeniu oraz określenie współczynnika podziału Kd i Koc.
Warstwa 3: Określenie izoterm adsorpcji Freundlicha dla ustalenia wpływu stężenia na zasięg adsorpcji na glebach.
Badania desorpcji za pomocą kinetyki desorpcji/Freundlicha desorpcji izotermy (dodatek 1).
1.3. DEFINICJE I JEDNOSTKI
| Symbol | Definicja | Jednostki |
 | procent adsorpcji w czasie ti | % |
| Aeq | procent adsorpcji w równowadze adsorpcji | % |
 | masa substancji badanej zaadsorbowanej na glebie w czasie ti | µg |
 | masa substancji badanej zaadsorbowanej na glebie podczas trwania przedziału czasowego Δti | µg |
 | masa substancji badanej zaadsorbowanej na glebie w równowadze adsorpcji | µg |
| m0 | masa substancji badanej w probówce na początku badania adsorpcji | µg |
 | masa substancji badanej, zmierzona w podwielokrotności (vAa) w punkcie czasu ti | µg |
 | masa substancji w roztworze przy równowadze adsorpcji | µg |
| msoil | wielkość fazy gleby, wyrażona jako sucha masa gleby | g |
| Cst | stężenie masowe roztworu podstawowego substancji | μg cm-3 |
| C0 | początkowe stężenie masowe roztworu badanego w kontakcie z glebą | μg cm-3 |
 | stężenie masowe substancji w fazie wodnej w czasie ti, w którym dokonywana jest analiza | μg cm-3 |
 | zawartość substancji zaadsorbowanej na glebie przy równowadze adsorpcji | μg cm-1 |
 | stężenie masowe substancji w fazie wodnej przy równowadze adsorpcji | μg cm-3 |
| V0 | początkowa objętość fazy wodnej w kontakcie z glebą, w czasie trwania badania adsorpcji | cm3 |
 | objętość podwielokrotności, w której substancja badana została zmierzona | cm3 |
| Kd | współczynnik podziału dla adsorpcji | cm3 g-1 |
| Koc | znormalizowany współczynnik adsorpcji węgla | cm3 g-1 |
| Kom | znormalizowany współczynnik ciał organicznych | cm3 g-1 |
 | współczynnik adsorpcji Freundlicha | μg1-l/n (cm3) 1/n g-1 |
| 1/n | wykładnik Freundlicha | |
 | procent desorpcji w punkcie czasu ti | % |
 | procent desorpcji odpowiadający przedzialowi czasu Δti | % |
| Kdes | pozorny wspolczynnik desorpcji | μgcm-1 |
 | wspolczynnik desorpcji Freundlicha | μg1-1n (cm3)1/n g-1 |
 | masa badanej substancji zdesorbowana z gleby w czasie tj | µg |
 | masa badanej substancji zdesorbowana z gleby w czasie Δti | µg |
 | masa substancji ustalona analitycznie w wodnej fazie przy równowadze desorpcyjnej | µg |
 | całkowita masa badanej substancji zdesorbowanej przy równowadze desorpcyjnej | µg |
 | masa substancji pozostająca zaadsorbowana na glebie po przedziale czasowym Δti | µg |
 | masa substancji pozostała z równowagi adsorpcji z powodu niecałkowitego podstawienia objętości | µg |
 | zawartość badanej substancji pozostająca zaadsorbowana na glebie przy równowadze desorpcyjnej | μg g-1 |
 | stężenie masowe badanej substancji w fazie wodnej przy równowadze desorpcyjnej | μg cm-3 |
| VT | całkowita objętość fazy wodnej w kontakcie z glebą w czasie trwania doświadczenia kinetyki desorpcji wykonanego metodą seryjną | cm3 |
| VR | objętość nadsączu usuniętego z probówki po osiągnięciu równowagi adsorpcji, zastąpionego tą samą objętością roztworu 0,01 M CaCl | cm3 |
 | Objętość podwielokrotności pobrana do celu analitycznego w czasie (i), w czasie trwania doświadczenia kinetyki adesorpcji wykonanego metodą seryjną | cm3 |
 | objętość roztworu pobrana z probówki (i) dla pomiaru substancji badanej, w doświadczeniu kinetyki adesorpcji (metoda równoległa) | cm3 |
 | objętość roztworu pobrana z probówki dla pomiaru substancji badanej w rownowadze desorpcji | cm3 |
| MB | bilans masy | % |
| mE | całkowita masa substancji badanej ekstrahowanej z gleby i ścianek zbiornika badanego w dwóch kolejnych czynnościach | µg |
| Vrec | objętość nadsączu odzyskana po równowadze adsorpcji | cm3 |
| Pow | współczynnik podziału oktanol/woda | |
| pKa | stała dysocjacji | |
| Sw | rozpuszczalność w wodzie | g1-1 |
1.4. ZASADA METODY BADANIA
Znane objętości roztworów badanej substancji, nieetykietowanej czy też etykietowanej izotopami o znanym stężeniu w 0,01 M CaCl2 są dodane do próbek gleby o znanej suchej masie, wcześniej zrównoważone w 0,01 M CaCl2. Mieszanina jest mieszana przez właściwy czas. Zawiesiny gleby rozdziela się następnie przez odwirowanie i, jeśli pożądane, filtrowane, a faza wodna analizowana. Ilość substancji badanej zaadsorbowana na próbce gleby jest obliczona jako różnica między ilością substancji badanej początkowo obecnej w roztworze a ilością pozostałą na koniec doświadczenia (metoda pośrednia).
Jako opcja, ilość badanej substancji zaadsorbowanej jest także bezpośrednio ustalana analizą gleby (metoda bezpośrednia). Niniejsza procedura obejmująca stopniową ekstrakcję gleby właściwym rozpuszczalnikiem, jest zalecana w przypadku, gdy różnica w stężeniu roztworu substancji nie może być dokładnie ustalona. Przykładami takich przypadków są: adsorpcja substancji badanej na ściankach zbiornika, niestabilność substancji badanej w skali czasu doświadczenia, słabej adsorpcji dającej tylko małe zmiany stężenia w roztworze i silna adsorpcja powodująca niskie stężenie, którego nie można dokładnie określić. Jeśli stosuje się substancję etykietowaną izotopowo, ekstrakcji z gleby można zapobiec za pomocą analizy fazy gleby przez spalanie i obliczenie scyntylacji na cieczowym liczniku. Jednakże cieczowy licznik scyntylacyjny jest techniką nieokreśloną, która nie może rozróżnić między macierzystymi a przekształconymi produktami; dlatego musi być używana tylko wtedy jeżeli badana substancja chemiczna jest stabilna w czasie trwania badań.
1.5. INFORMACJE DOTYCZĄCE SUB STANCJI BADANEJ
Odczynniki chemiczne powinny być czystości analitycznej. Zalecane jest użycie nieetykietowanych substancji badanych o znanym składzie i czystości co najmniej 95 % lub etykietowanych izotopami substancji badanych o znanym składzie oraz radioczystości. W przypadku wskaźników o krótkim czasie półtrwania należy zastosować poprawki na rozkład.
Przed przeprowadzeniem badania adsorpcji-desorpcji powinny być dostępne następujące informacje o badanej substancji:
a) rozpuszczalność w wodzie (A.6);
b) ciśnienie pary (A.4) i/lub stała Henry'ego;
c) rozkład abiotyczny: hydroliza jako funkcja pH (C.7);
d) współczynnik podziału (A.8);
e) szybka biodegradacja (C.4) lub aerobowe i anaerobowe przekształcenia w glebie;
f) pKa niezjonizowanych substancji;
g) bezpośrednia fotoliza w wodzie (tj. UV-Vis widmo absorpcji w wodzie, wydajność kwantowa) i fotodegradacja na glebie.
1.6. MOŻLIWOŚĆ ZASTOSOWANIA BADANIA
Badanie ma zastosowanie do substancji chemicznych, dla których jest dostępna analityczna metoda z dostateczną dokładnością. Ważnym parametrem wpływającym na wiarygodność wyników, w szczególności kiedy stosowana jest metoda pośrednia, jest stabilność substancji badanej w zakresie czasu badania. Dlatego wstępnym warunkiem jest sprawdzenie stabilności we wstępnych badaniach, jeśli obserwuje się przekształcenie w skali czasu badania, zalecane jest, aby prowadzono główne badania poprzez analizę zarówno gleby jak i fazy wodnej.
Trudności w prowadzeniu niniejszego badania powstają w odniesieniu do substancji badanych, o niskiej rozpuszczalności w wodzie (Sw < 10-4 g 1-1), jak również w odniesieniu do wysoce naładowanych substancji, spowodowanych przez fakt, że stężenie w fazie wodnej nie może być zmierzone analitycznie z wystarczającą dokładnością. W tych przypadkach należy podjąć dodatkowe czynności. Wytyczne dotyczące sposobu postępowania z takimi problemami podano we właściwych punktach niniejszej metody.
Przy badaniu lotnych substancji należy zachować ostrożność by zapobiec stratom w czasie trwania badania.
1.7. OPIS METODY
1.7.1. Aparatura i odczynniki chemiczne
Zwykły sprzęt laboratoryjny, w szczególności następujące urządzenia:
a) probówki lub zbiorniki do prowadzenia doświadczeń. Istotne jest, aby te probówki i zbiorniki:
- pasowały bezpośrednio do aparatury wirówki w celu zminimalizowania manipulacji i przenoszenia błędów,
- były wykonane z obojętnego materiału o minimalnej adsorpcji badanej substancji na jego powierzchni;
b) urządzenie do mieszania: podwieszany wibrator lub równoważny osprzęt, utrzymujący glebę w postaci zawiesiny;
c) wirówka: zalecana wysokoobrotowa, na przykład siła odwirowania > 3.000 g, kontrolowana odnośnie do temperatury, zdolna do usuwania cząstek o średnicy większej niż 0,2 μm z roztworu wodnego. Pojemniki powinny być zamykane w czasie wirowania i mieszania w celu uniknięcia zmian i strat wody; w celu zminimalizowania adsorpcji na nich należy użyć nieaktywne zamknięcia na przykład pokrywki śrubowe z teflonu;
d) fakultatywnie: urządzenie filtracyjne; filtry o porowatości 0,2 μm, sterylne, jednorazowego użytku. Należy zwrócić szczególną uwagę przy wyborze materiału filtra aby uniknąć jakichkolwiek strat na nim; w odniesieniu do słabo rozpuszczalnych substancji badanych nie zaleca się filtra z materiału organicznego;
e) analityczne oprzyrządowanie, odpowiednie do pomiarów stężenia badanej substancji chemicznej;
f) suszarka laboratoryjna, zdolna utrzymać temperaturę od 103 oC do 110 oC.
1.7.2. Scharakteryzowanie i wybór gleb
Gleby powinny być scharakteryzowane przez trzy parametry uważane za w dużej mierze odpowiedzialne za zdolności adsorpcyjne: węgiel organiczny, zawartość gliny i tekstura gleby oraz pH. Jak już wspomniano (zob. zakres) inne fizykochemiczne właściwości gleby wpływają na adsorpcję/desorpcję określonych substancji i powinny być rozważone w takich przypadkach.
Metody używane do scharakteryzowania gleby są bardzo istotne oraz posiadają znaczący wpływ na wyniki. Dlatego jest zalecane, aby pH gleby było mierzone w roztworze 0,01 M CaCl2 (jest to roztwór używany w badaniach adsorpcja/desorpcja) zgodnie z odpowiednią metodą ISO (ISO-10390-1). Jest także zalecane, aby inne stosowne właściwości gleby były ustalane zgodnie ze standardowymi metodami (na przykład "Handbook of Soil Analysis" ISO); pozwala to na oparcie analizowanych danych sorpcji, na globalnie znormalizowanych parametrach gleby. Niektóre wytyczne dotyczące istniejących standardowych metod analiz gleby i jej charakterystykę podano w bibliografii (50-52). W odniesieniu do kalibracji metod badania gleby zalecane jest stosowanie gleb odniesienia.
Wytyczne dotyczące wyboru gleb do doświadczeń adsorpcja/desorpcja podano w tabeli 1. Siedem wybranych gleb pokrywa typy gleb spotykane w różnych strefach geograficznych. Dla podatnych na jonizację substancji badanych wybrane gleby powinny pokrywać szeroki zakres pH, w celu umożliwienia oceny adsorpcji substancji w jej zjonizowanych i niezjonizowanych formach. Wytyczne dotyczące tego jak wiele różnych gleb należy użyć na różnych stadiach badania podano pod 1.9 "Wykonanie badania".
Jeśli inne typy gleb są preferowane powinny one charakteryzować się tymi samymi parametrami i powinny mieć zbliżone zmiany we właściwościach do tych opisanych w tabeli 1, nawet jeśli nie zestawiają one dokładnie kryteriów.
Tabela 1
Wytyczne dotyczące wyboru próbek gleby dla adsorpcji/desorpcji
| Typ gleby | Zakres pH (w 0,01 M CaCl2) | Zawartość węgla organicznego (%) | Zawartość gliny (%) | Tekstura gleby(1) |
| 1 | 4,5-5,5 | 1,0-2,0 | 65-80 | glina |
| 2 | > 7,5 | 3,5-5,0 | 20-40 | glina formierska |
| 3 | 5,5-7,0 | 1,5-3,0 | 15-25 | mul formierski |
| 4 | 4,0-5,5 | 3,0-4,0 | 15-30 | ił |
| 5 | < 4,0-6,0(2) | < 0,5-1,5(2)(3) | < 10-15(2) | piasek formierski |
| 6 | > 7,0 | < 0,5-1,0(2)(3) | 40-65 | glina ił/glina |
| 7 | < 4,5 | > 10 | < 10 | piasek/piasek formierski |
| (1) Zgodnie z FAO I systemem US (85). |
| (2) Odpowiednie zmienne powinny wykazywać wartości w ramach podanego zakresu. Jednakże jeśli występują trudności ze znalezieniem właściwego materiału gleby, wartości poniżej wskazują akceptowalne minimum. |
| (3) Gleby z mniej niż 0,3 % węgla organicznego mogą zakłócać korelację między organiczną zawartością a adsorpcją. Jest zalecane użycie gleb o minimalnej zawartości węgla organicznego 0,3 %. |
1.7.3. Zbieranie i przechowywanie próbek gleby
1.7.3.1. Zbieranie
Nie ma specjalnych technik ani narzędzi zalecanych do pobierania próbek; technika pobierania próbek zależy od celu badania (53)(54)(55)(56)(57)(58).
Należy rozważyć:
a) szczegółowe informacje dotyczące historii pola jest konieczne, obejmuje to umiejscowienie, rodzaje wegetacji, traktowanie pestycydami i/lub nawozami, dodatki biologiczne lub przypadkowe zanieczyszczenia. Zalecenia normy ISO dotyczące pobierania próbek (ISO 10381-6) powinny zostać spełnione w odniesienia do opisu miejsca pobierania próbek;
b) miejsce pobierania próbek musi być określone przez UTM (uniwersalne poprzeczne odwzorowanie Mercatora - europejski poziom geodezyjny) lub współrzedne geograficzne; może to umożliwić ponowne zebranie określonej gleby w przyszłości lub może pomóc w określeniu gleby w różnych systemach klasyfikacyjnych używanych w różnych krajach Zbierana powinna być gleba z poziomu A do maksymalnej głębokości do 20 cm. W szczególności w odniesieniu do gleb typu n. 7, jeśli poziom Oh jest obecny jako część gleby, która powinna być włączona przy zbieraniu próbek.
Próbki gleby powinny być przetransportowane z użyciem pojemników i w warunkach temperatury, które zapewniają, aby początkowe właściwości gleby nie zostały zmienione w znaczący sposób.
1.7.3.2. Przechowywanie
Zalecane jest użycie tylko świeżo pobranych gleb z pola. Tylko w przypadkach, gdy jest to niemożliwe, gleba jest przechowywana w temperaturze otoczenia oraz powinna być wysuszona powietrzem. Nie ma zalecanej granicy czasu przechowywania, lecz gleby przechowywane dłużej niż trzy lata powinny być ponownie przeanalizowane przed użyciem w odniesieniu do ich zawartości węgla organicznego, pH i CEC.
1.7.3.3. Postępowanie i przygotowanie próbek gleby do badań
Gleby są suszone powietrzem w temperaturze otoczenia (zalecane 20-25 oC). Rozdrobnienie powinno być prowadzone z minimalną siłą, tak aby pierwotna tekstura gleby zmieniła się tak niewiele, jak to możliwe. Gleby przesiewa się do wielkości cząstki < 2 mm; zalecenia normy ISO dotyczące pobierania próbek gleby (ISO 10381-6) powinny być spełnione w odniesieniu do procesu przesiewania. Zalecana jest staranna homogenizacja, gdyż poprawia to odtwarzalność wyników. Zawartość wilgoci w każdej glebie jest określana z trzech podwielokrotnośći ogrzewanych w temperaturze 105 oC do zaniku występowania znaczących różnic wagi (około 12 godzin). W odniesieniu do wszystkich obliczeń masa gleby oznacza wysuszoną w suszarce suchą masę, tj. wagę gleby skorygowaną o zawartość wilgoci.
1.7.4. Przygotowanie substancji użytej w badaniu do zastosowania na glebę
Substancja badana jest rozpuszczona w roztworze 0,01 M CaCl2 w destylowanej lub dejonizowanej wodzie; roztwór CaCl2 stosuje się jako rozpuszczalnik fazy wodnej do poprawy odwirowania i zminimalizowania wymiany kationowej. Zalecane stężenie roztworu podstawowego powinno być trzy rzędy wyższe niż granica wykrywalności stosowanej metody analitycznej. Niniejszy próg gwarantuje dokładne pomiary w odniesieniu do metodologii stosowanej w niniejszej metodzie; ponadto stężenie roztworu podstawowego powinno być poniżej rozpuszczalności w wodzie badanej substancji.
Roztwór podstawowy powinien być przygotowany tuż przed zastosowaniem do próbek gleby oraz powinien być on trzymany zamknięty w ciemności w 4 oC. Czas przechowywania zależy od stabilności substancji badanej i jej stęzenia w roztworze.
Tylko w odniesieniu do słabo rozpuszczalnych substancji (Sw < 10-4 g 1-1), gdy trudno rozpuścić substancję badaną, potrzebny może być środek ułatwiający rozpuszczenie. Środek ułatwiający rozpuszczenie: a) powinien być mieszalny z wodą, jak też z metanolem lub acetonitrylem; b) jego stężenie nie powinno przekraczać 1 % całkowitej objętości roztworu podstawowego i powinno stanowić mniej niż to w roztworze substancji badanej, która wchodzi w kontakt z glebą (zalecany mniej niż 0,1 %); oraz c) nie powinien być środkiem powierzchniowo czynnym lub ulegać solwolitycznym reakcjom z badaną substancją. Użycie środka ułatwiającego rozpuszczanie powinno być przewidziane i usprawiedliwione przy przedstawianiu danych.
Inną alternatywą dla słabo rozpuszczalnych substancji jest dodanie substancji badanej do systemu badanego przez wybijanie: substancja badana jest rozpuszczona w organicznym rozpuszczalniku, jej podwielokrotność do systemu gleby a 0,01 M roztworu CaCl2 w destylowanej lub dejonizowanej wodzie. Zawartość rozpuszczalnika w fazie wodnej powinna być tak niska jak to możliwe, zwykle nie przekracza 0,1 %. Wybijanie z roztworu organicznego może ulec objętościowej nieodtwarzalności. Dlatego wprowadza się dodatkowy błąd, tak że stężenie substancji badanej i korozpuszczalnika nie jest takie samo we wszystkich badaniach.
1.8. WARUNKI WSTĘPNE PRZEPROWADZANIA BADANIA ADSORPCJI/DESORPCJI
1.8.1. Metoda analityczna
Kluczowe parametry wpływające na dokładność pomiarów sorpcji obejmują: dokładność metody analitycznej w analizie obu roztworów i faz adsorbowanych, stabilność i czystość substancji badanej, osiągnięcie równowagi sorpcji, rozpiętość zmian stężenia roztworu, stosunek gleba/roztwór i zmiany w strukturze gleby w czasie trwania procesu równowagi (35)(59-62). Niektóre przykłady dotyczące danych dokładności podano w dodatku 2.
Wiarygodność używanej metody analitycznej musi być sprawdzona w zakresie stężeń, które prawdopodobnie wynikną w trakcie badania. Eksperymentator powinien czuć się swobodnie, aby rozwijać odpowiednie metody z właściwą dokładnością, precyzją, odtwarzalnością, granicami wykrywalności i je poprawiać. Wytyczne dotyczące tego w jaki sposób należy prowadzić takie badania podano w doświadczeniu poniżej.
Właściwa objętość 0,01 M CaCl2, np. 100 cm3, jest mieszana w ciągu 4 godz. z odważką gleby, np. 20 g, o wysokiej adsorbowalności, tj. z wysoką zawartością węgla organicznego oraz gliny; te odważki i wielkości zmieniają się w zależności od potrzeb analitycznych, lecz stosunek gleba/roztwór wynoszący 1:5 jest dogodnym punktem początkowym. Mieszaninę odwirowuje się, a fazę wodną filtruje. Pewną objętość roztworu podstawowego substancji badanej dodaje się do drugiej dla uzyskania nominalnego stężenia, w zakresie stężenia, które prawdopodobnie wystąpi w czasie trwania badania. Objętość ta nie powinna przekraczać 10% końcowej objętości fazy wodnej, w celu zmiany w najmniejszym możliwym zakresie charakteru roztworu przedrównowagowego. Roztwór poddaje się analizie.
Ślepa próba, składająca się z systemu gleba + roztwór CaCl2 (bez substancji badanej), musi być włączona w celu sprawdzenia artefaktów w metodzie analitycznej oraz dla macierzystych efektów powodowanych przez glebę.
Analityczne metody, które mogą być stosowane do pomiarów sorpcji zawierają chromatografię gazowo-cieczową (GLC), wysokiej rozdzielczości chromatografię cieczową (HPLC), spektrometrię (np. spektrometria GC/masa, spektrometria HPLC/masa) i cieczową scyntylacyjną (w odniesieniu do substancji etykietowanych izotopami). Niezależnie od używanych metod analitycznych, jest uznane za odpowiednie, jeśli wykrywalność wynosi między 90 a 110% wartości nominalnej. W celu umożliwienia wykrycia oraz oceny po zajściu podziału granice wykrywalności metody analitycznej powinny być co najmniej dwa rzędy wielkości, poniżej stężenia nominalnego.
Cechy i granice wykrywalności metody analitycznej dostępnej do przeprowadzenia badań adsorpcji mają istotną rolę w określaniu warunków badania i całego doświadczalnego przeprowadzenia badania. Niniejsza metoda wskazuje ogólną doświadczalną drogę, dostarcza zaleceń i wytycznych dotyczących rozwiązań alternatywnych, w przypadku gdy metoda analityczna i laboratoryjne środki mogą nakładać ograniczenia.
1.8.2. Wybór optymalnych proporcji gleba/roztwór
Wybór właściwych proporcji gleby do roztworu w badaniach sorpcji zależy od współczynnika podziału Kd oraz względnego stopnia pożądanej adsorpcji. Zmiana stężenia substancji w roztworze określa statystyczną dokładność pomiaru opartego na kształcie równania adsorpcji i granicy analitycznej metodologii w wykrywaniu stężenia substancji chemicznej w roztworze. Dlatego w praktyce ogólnej jest użyteczne ustalenie kilku proporcji, w odniesieniu do których procent adsorpcji wynosi powyżej 20 %, a zalecany > 50 % (62), ponieważ należy dążyć do utrzymania stężenia substancji badanej w wodnej fazie wystarczająco wysoko, aby mogło być ono zmierzone dokładnie. Jest to szczególnie istotne w przypadku wysokiego procentu adsorpcji.
Dogodne podejście do wyboru właściwej proporcji gleba/woda jest oparte na szacowaniu wartości Kd przez badania wstępne albo przez ustalone techniki szacowania (dodatek 3). Wybór właściwej proporcji dokonywany jest w oparciu o wykres proporcji gleba/roztwór w zależności od Kd w odniesieniu do ustalonego procenta adsorpcji (rys. 1). W tym wykresie przyjęto, że równanie adsorpcji jest liniowe (1). Stosowana zależność jest uzyskiwana przez przekształcenie równania (4) dla Kd do postaci równania (1):
(1)
lub w jego postaci logarytmicznej, przyjmując ze 
:(2)
Rys. 1. Zależność między stosunkami gleba do roztworu i Kd przy różnych procentach zaadsorbowanej substancji badanej
Rysunek 1 przedstawia proporcje gleba/roztwór jako funkcje Kd dla różnych poziomów adsorpcji. Na przykład przy proporcji gleba/roztwór 1:5 i Kd 20 zachodzi w przybliżeniu 80% adsorpcji. Dla uzyskania 50% adsorpcji dla tego samego Kd należy zastosować proporcję 1:25. Takie podejście do wyboru właściwych proporcji gleba/roztwór daje badaczowi elastyczność w spełnieniu doświadczalnych wymagań.
Dziedziny, które są trudniejsze do rozwiązania, są tymi, w których substancja chemiczna jest wysoce adsorbowana lub bardzo nieznacznie. W przypadku występowania niskiej adsorpcji stosunek 1:1 gleba/ roztwór jest zalecany, chociaż w odniesieniu do niektórych bardzo organicznych typów gleb, konieczne są mniejsze proporcje do uzyskania zawiesiny. Analityczna metodologia do pomiaru małych zmian stężeń w roztworach musi być stosowana z ostrożnością; inaczej pomiar adsorpcji będzie niedokładny. Z drugiej strony, bardzo wysokie współczynniki podziału Kd, dochodzące do 1:100 stosunek gleba/roztwór w celu pozostawienia znaczącej ilości substancji w roztworze. Jednakże należy zwrócić uwagę na zapewnienie dobrego mieszania oraz odpowiedniego czasu na dojście systemu do równowagi. Alternatywnym podejściem do rozwiązania takich ekstremalnych przypadków, gdy brakuje stosownej metodologii analitycznej, jest przewidywanie wartości Kd w zastosowaniu technik oceny, opartych na przykład, o wartości Pow (dodatek 3). Może to być przydatne w szczególności w odniesieniu do nisko adsorbowalnych polarnych substancji chemicznych o Pow < 20 oraz dla lipofilowych, wysoce sorpcyjnych substancji o Pow > 104.
1.9. WYKONANIE BADANIA
1.9.1. Warunki badania
Wszystkie doświadczenia są wykonywane w temperaturze otoczenia oraz, jeśli to możliwe, w stałej temperaturze między 20 a 25 °C
Warunki odwirowania powinny umożliwić usunięcie z roztworu cząstek większych niż 0,2 um. Ta wartość oddziela cząstki najmniejszych rozmiarów, uważanych za cząstkę stałą i jest granicą między stałą i koloidalną cząstką. Wytyczne dotyczące sposobu określania warunków odwirowania podano w dodatku 4.
Jeśli udogodnienia w zakresie odwirowania nie mogą zapewnić usunięcia cząstek większych od 0,2 um, stosowana może być kombinacja odwirowania oraz filtracji przez filtr 0,2 um. Filtry te powinny być wykonane z odpowiedniego obojętnego materiału, zapobiegającego stratom na nim. W każdym przypadku należy udowodnić, że nie powstają na nim jakiekolwiek straty substancji badanej podczas trwania filtracji.
1.9.2. Warstwa 1 - Badania wstępne
Cel prowadzenia badań wstępnych podano już w punkcie dotyczącym zakresu. Wytyczne dotyczące określania takiego badania wraz z doświadczeniem sugerowanym podano poniżej.
1.9.2.1. Wybór optymalnych proporcji gleba/roztwór
Używa się dwa typy gleby i trzy proporcje gleba/roztwór (sześć doświadczeń). Jeden rodzaj gleby ma wysoką zawartość węgla organicznego i gliny, druga niską zawartość węgla organicznego i gliny. Sugerowane są następujące proporcje gleby do roztworu:
- 50 g gleby i 50 cm3 roztworu wodnego substancji badanej (proporcja 1/1),
- 10 g gleby i 50 cm3 roztworu wodnego substancji badanej (proporcja 1/5),
- 2 g gleby i 50 cm3 roztworu wodnego substancji badanej (proporcja 1/25).
Minimalna ilość gleby, przy której przeprowadza się doświadczenie, zależy od możliwości laboratorium i wykonania zastosowanych metod analitycznych. Jednakże jest zalecane użycie co najmniej 1 g, a najlepiej 2 g, w celu uzyskania wiarygodnych wyników badania.
Jedna próbka kontrolna jedynie z substancją badaną w roztworze 0,01 M CaCl2 (bez gleby) podlega dokładnie tym samym kolejnym czynnościom jak badane systemy, w celu sprawdzenia stabilności badanej substancji w roztworze CaCl2 i możliwej adsorpcji na powierzchni badanego zbiornika.
Ślepa próba gleby z taką samą ilością gleby i całkowitej objętości 50 cm3 roztworu 0,01 M CaCl2 (bez substancji badanej) podlega takiej samej procedurze badania. Służy to jako dodatkowa kontrola w czasie trwania analizy mającej na celu wykrycie zakłócających substancji lub zanieczyszczonych gleb.
Wszystkie doświadczenia, łącznie z próbami ślepymi i kontrolnymi, powinny być wykonane przynajmniej z duplikatem. Całkowita ilość próbek które powinny być przygotowane dla badań mogą być obliczone w odniesieniu do metodologii, która zastanie zastosowana.
Metody w zakresie badań wstępnych i badania główne są ogólnie takie same, wyjątki są wspomniane tam, gdzie to jest odpowiednie.
Wysuszone powietrzem próbki gleby są równoważone przez wytrząsanie minimalną objętością 45 cm3 0,01 M CaCl2 w ciągu nocy (12 godz.) przed dniem doświadczenia. Następnie dodaje się pewną ilość roztworu podstawowego substancji badanej w celu dostosowania końcowej objętości do 50 cm3. Objętość dodanego roztworu podstawowego: a) nie powinna przekroczyć 10 % końcowej objętości 50 cm3 fazy wodnej w celu zmiany, w możliwie najmniejszym zakresie charakteru roztworu przed równowagą; oraz b) powinna zdecydowanie wpływać na wyniki początkowego stężenia substancji badanej będącej w kontakcie z glebą (C0) co najmniej dwa rzędy wielkości więcej niż granica wykrywalności metody analitycznej; niniejszy próg zabezpiecza możliwość prowadzenia dokładnych pomiarów nawet gdy zachodzi silne adsorpcja (> 90 %) i określenia późniejszych izoterm adsorpcji. Zaleca się również, jeśli to możliwe, aby początkowe stężenie substancji (C0) nie przekraczało połowy jej granicy rozpuszczalności.
Przykład sposobu obliczenia stężenia roztworu podstawowego (Cst) podano poniżej. Przyjęto granicę wykrywalności 0,01 μg cm-3 i 90 % adsorpcji; zatem zalecane wstępne stężenie substancji badanej w kontakcie z glebą powinno wynosić l μg cm-3 (dwa rzędy wielkości wyższe niż granica wykrywalności). O ile dodano zalecaną maksymalną objętość roztworu podstawowego, tj 5-45 cm3 0,01 M CaCl2 roztworowa równowaga (= 10 % roztworu podstawowego do 50 cm3 całkowitej objętości fazy wodnej), stężenie roztworu podstawowego powinno wynosić 10 μg cm-3; to jest trzy rzędy wielkości wyższej niż granica wykrywalności metody analitycznej.
Wartość pH fazy wodnej powinna być mierzona przed i po kontakcie z glebą, ponieważ ma to istotne znaczenie w całkowitym procesie adsorpcji, w szczególności w odniesieniu do jonizowalnych substancji.
Mieszanina jest wytrząsana do osiągnięcia równowagi adsorpcji. Czas równowagi w glebach jest wysoce zmienny w zależności od substancji chemicznej i gleby; okres 24 godzin jest ogólnie wystarczający (77). W badaniach wstępnych próbki mogą być zbierane sekwencyjnie przez 48 godzin okresu mieszania (np. w 4, 8, 24, 48 godzin). Jednakże czas analizy powinien być określony elastycznie w odniesieniu do rozkładu pracy laboratorium.
Istnieją dwie możliwości w odniesieniu do analizy substancji badanej w roztworze wodnym: a) metoda równoległa; i b) metoda seryjna. Należy pokreślić, że chociaż metoda równoległa jest doświadczalnie bardziej uciążliwa, to matematyczne opracowanie wyników jest prostsze (dodatek 5). Jednakże wybór metodologii która ma być zastosowana pozostawiona jest eksperymentatorowi, który musi rozważyć dostępne urządzania i zasoby laboratorium.
a) Metoda równoległa: przygotowuje się próbki w tej samej proporcji gleba/roztwór, w liczbie zależnej od tego w ilu przedziałach czasowych chce się zbadać kinetykę adsorpcji. Po odwirowaniu i jeśli jest to pożądane, po filtracji faza wodna z pierwszej probówki jest usuwana możliwie całkowicie i mierzona po, na przykład 4 godzinach, druga probówka po 8 godzinach, trzecia po 24 godzinach itd.
b) Metoda seryjna: przygotowuje się tylko kopie próbek odniesieniu do każdej proporcji gleba/roztwór. W określonych przedziałach czasu mieszanina jest wirowana w celu rozdzielenia faz. Mała podwielokrotność fazy wodnej jest niezwłocznie analizowana w odniesieniu do substancji badanej; następnie doświadczenie prowadzi się nadal z oryginalną mieszaniną. Jeśli zastosowano filtrację po odwirowaniu, laboratorium powinno posiadać urządzenia umożliwiające przeprowadzenie filtracji małych wodnych podwielokrotności. Zalecane jest, aby całkowite podwielokrotności pobrane nie przekraczały 1 % całkowitej objętości roztworu, w celu nie powodowania znaczących zmian proporcji gleba/roztwór i zmniejszenia masy rozpuszczonej zdolnej do adsorpcji w czasie trwania badania.
Procentowa adsorpcja Ati jest obliczana w każdym punkcie czasu (ti) na podstawie nominalnego początkowego stężenia i zmierzonego stężenia w chwili pobierania próbek (ti), skorygowana w odniesieniu do wartości ślepej próby. Wykresy Ati w zależności od czasu (rys. 1 dodatek 5) są generowane w celu oszacowania osiągnięcia plateau równowagowego (1). Wartość Kd w równowadze jest również obliczana. W oparciu o tę wartość Kd, właściwe proporcje gleba/roztwór są wybierane z rys. l, tak aby procent adsorpcji osiągał powyżej 20 %, a zalecane > 50 % (61). Wszystkie mające zastosowanie równania i zasady wykreślania podano w punkcie "Dane i sprawozdawczość" oraz w dodatku 5.
1.9.2.2. Określenie czasu równowagi adsorpcji i ilości badanej substancji zaadsorbowanej w równowadze
Jak już wspomniano, wykresy Ati lub Caadqs w zależności od czasu pozwalają oszacować osiągnięcie równowagi adsorpcji i ilości badanej substancji zaadsorbowanej w równowadze. Rysunki 1 i 2 w dodatku 5 wskazują przykłady takich wykresów. Czas równowagi jest czasem potrzebnym systemowi do osiągnięcia plateau.
Jeśli przy określonej glebie nie występuje plateau, tylko stały wzrost, może być to spowodowane czynnikami zakłócającymi, takimi jak biodegradacja lub powolne rozproszenie. Biodegradacja może być wykazana przez powtórzenie doświadczenia ze sterylizowaną próbką gleby. Jeśli nie uzyskano plateau nawet w tym przypadku, eksperymentator powinien poszukiwać innych zjawisk, które mogły wpłynąć na to szczególne badanie; może to być dokonane z właściwymi zmianami warunków doświadczenia (temperatura, czas wytrząsania, proporcje gleba/roztwór). Pozostawia się do uznania ekperymentatora, czy stosować nadal procedurę badania pomimo możliwosci nieuzyskania równowagi.
1.9.2.3. Adsorpcja na powierzchni zbiornika badanego i stabilność substancji użytej w badaniu
Niektóre informacje dotyczące adsorpcji substancji badanej na powierzchni badanego zbiornika, jak również dotyczące jej stabilności są wyprowadzane poprzez analizowanie próbek kontrolnych. Jeżeli obserwuje się uszczuplenie większe niż standardowy błąd metody analitycznej, może to świadczyć o abiotycznej degradacji i/lub adsorpcji na powierzchni badanego zbiornika. Rozróżnienie między tymi dwoma zjawiskami może być uzyskane przez gruntowne mycie ścian zbiornika znaną ilością właściwego rozpuszczalnika oraz przez poddanie roztworu z mycia analizie w odniesieniu do substancji badanej. Jeśli nie obserwuje się adsorpcji na powierzchni zbiornika badanego, uszczuplenie oznacza abiotyczną niestabilność substancji badanej. Jeśli wykryto adsorpcję, konieczna jest zmiana materiału zbiornika badanego. Jednakże danych dotyczących adsorpcji na powierzchni badanego zbiornika, uzyskanych w wyniku tego doświadczenia nie można bezpośrednio ekstrapolować do doświadczenia gleba/roztwór. Obecność gleby oddziaływuje na tę adsorpcję.
(1) Krzywa stężenia substancji badanej fazie wodnej (Caadqs) w zależności od czasu może być również wykorzystana do oszacowania osiągnięcia plateau równowagowego (zob. rys. 2 w dodatku 5).
Dodatkowe informacje dotyczące stabilności substancji badanej mogą być uzyskane przez określenie macierzystego bilansu masy w czasie. Oznacza to, że faza wodna, ekstrakt z gleby i ścianki zbiornika badanego są analizowane w odniesieniu do substancji badanej. Różnica między masą badanych substancji chemicznych dodanych a sumą mas badanych substancji chemicznych w fazie wodnej, ekstraktów z gleby i ścianek zbiornika badanego jest równa masie zdegradowanej i/lub ulotnionej i/lub nieekstrahowanej. W celu dokonania określenia bilansu masy równowaga adsorpcyjna powinna być osiągnięta w czasie doświadczenia.
Bilans masy wykonuje się na obu glebach i w odniesieniu do jednej proporcji gleba/roztwór na glebę, co daje uszczuplenie ponad 20 % i zalecane > 50 % w równowadze. Po zakończeniu doświadczenia znalezienia proporcji z analizą ostatniej próbki wodnej fazy po 48 godzinach, fazy są rozdzielane przez odwirowanie i, jeśli jest to pożądane, filtrowane. Faza wodna jest w najszerszym możliwym zakresie odzyskiwana oraz dodany jest odpowiedni rozpuszczalnik ekstrakcyjny (współczynnik ekstrakcji co najmniej 95 %) do gleby, aby wyekstrahować substancję badaną. Zaleca się co najmniej dwie kolejne ekstrakcje. Ilość substancji badanej w ekstrakcie z gleby i zbiornika badanego jest określana, a bilans masy oblicza się (równanie 10, Dane i sprawozdawczość). Jeżeli jest mniejszy niż 90 %, substancję badaną uznaje się za niestabilną w skali czasu badania. Jednakże badania mogą nadal być prowadzone, uwzględniając niestabilność substancji badanej, w tym przypadku zalecane jest analizowanie obu faz w badaniu głównym.
1.9.2.4. Warstwa 2 - Kinetyka adsorpcji przy jednym stężeniu substancji badanej
Stosuje się pięć typów gleb, wybranych z tabeli 1. Zaletą jest, że można włączyć niektóre lub wszystkie gleby użyte w badaniach wstępnych, jeśli to stosowne, spośród tych pięciu gleb. W tym przypadku warstwa 2 nie zostaje powtórzona w odniesieniu do gleb użytych w badaniach wstępnych.
Czas równowagi, stosunek gleba/roztwór, waga próbki gleby, objętość fazy wodnej w kontakcie z glebą oraz stężenie substancji badanej w roztworze są wybierane w oparciu o wyniki badań wstępnych. Zalecane jest, aby analiza została wykonana po około 2, 4, 6, 8 (możliwie także 10) i 24 godz. czasu kontaktu; czas mieszania może być przedłużony do maksimum 48 godz. w przypadku substancji chemicznej wymagającej dłuższego czasu równowagi w odniesieniu do wyników poszukiwania proporcji. Jednakże czas analizy należy rozważyć elastycznie.
Każde doświadczenie (jedna gleba i jeden roztwór) jest co najmniej raz kopiowane, aby umożliwić oszacowanie odchylenia wyników. W każde doświadczenie włączona jest ślepa próba. Obejmuje to glebę i roztwór 0,01 M CaCl2, bez substancji badanej, odpowiednio wagę oraz objętość identyczne do tych z doświadczenia. Kontrolna próbka tylko z substancją badaną w roztworze 0,01 M CaCl2 (bez gleby) podlega tej samej procedurze badania, służąc jako zabezpieczenie przed nieoczekiwanym.
Procent adsorpcji jest obliczany w każdym punkcie czasu Ati i/lub przedziale czasowym A∆ ti (wedle potrzeby) i jest wykreślany w zależności od czasu. Współczynnik podziału Kd w równowadze, jak również znormalizowany współczynnik adsorpcji węgla organicznego Koc (w odniesieniu do niepolarnych substancji chemicznych organicznych) są również obliczane.
Wyniki badania adsorpcji kinetycznej
Liniowa wartość Kd jest zasadniczo dokładna aby opisać zachowanie sorpcyjne w glebie (35)(78) i przedstawia wyrażenie mobilności właściwej substancji chemicznych w glebie. Na przykład ogólnie w substancjach chemicznych o Kd < 1 cm3 g-1 są uznawane za jakościowo mobilne. Podobnie, schemat klasyfikacji mobilności oparty o wartości Koc został rozwinięty przez MacCall et al. (16). Dodatkowo, schematy klasyfikacji wypłukiwania istnieją w oparciu o zależność między Koc a DT-50 (1) (32)(79).
Również, zgodnie z badaniami analizy błędów (61), wartości Kd poniżej 0,3 cm3 g-1 nie można oszacować dokładnie z obniżenia stężenia w fazie wodnej, nawet jeżeli zastosowano najbardziej korzystny (z punktu widzenia dokładności) stosunek gleba/roztwór, tj. 1:1. Zaleca się w tym przypadku analizę obu faz, gleby i roztworu.
W odniesieniu do powyższych uwag jest zalecane, aby badania zachowania adsorpcyjnego substancji chemicznych w glebie i ich potencjalna mobilność były nadal prowadzone przez oznaczanie izoterm adsorpcji Freundlicha dla tych systemów, dla których możliwe jest oznaczenie Kd, wraz z protokołem doświadczalnym zastosowanym w niniejszej metodzie badania. Dokładne oznaczenie jest możliwe jeżeli wartość, która wynika z pomnożenia Kd i proporcji gleba/roztwór jest > 0,3, gdy pomiary są oparte na spadku stężenia w wodnej fazie (metoda pośrednia), lub > 0,1, gdy analizowane są obie fazy (metoda bezpośrednia) (61).
(1) DT-50: czas degradacji dla 50 % badanej substancji.
1.9.2.5. Warstwa 3 - Izotermy adsorpcji i kinetyka desorpcji/izotermy desorpcji
1.9.2.5.1. Izotermy adsor pcji
Używa się pięć stężeń substancji badanej, obejmujące najlepiej dwa rzędy wielkości; przy wyborze tych stężeń powinny być uwzględnione rozpuszczalność w wodzie i wynikła stężeniowa równowaga wodną. W trakcie badań musi być zachowany ten sam stosunek gleba/roztwór. Badanie adsorpcji jest prowadzone, jak opisano powyżej, z tą tylko różnicą, że faza wodna jest analizowana tylko raz w czasie niezbędnym do osiągnięcia równowagi, jak ustalono wcześniej w warstwie 2. Stężenia równowagowe w roztworze są określone, a ilość zaadsorbowana jest obliczona z uszczuplenia substancji badanej w roztworze lub metodą bezpośrednią. Zaadsorbowana masa na jednostkę masy gleby jest wykreślana jako funkcja stężenia równowagi badanej substancji (zob. Dane i sprawozdawczość).
Wyniki z doświadczenia izoterm adsorpcji
Z matematycznych modeli adsorpcji dotąd proponowanych, izoterma Freundlicha jest jedną z najczęściej stosowanych do opisu procesów adsorpcji. Bardziej szczegółowe informacje dotyczące interpretacji i ważności modelu adsorpcji są określone w bibliografii (41)(45)(80)(81)(82).
Uwaga: Należy wspomnieć, że porównanie wartości KF (współczynnik adsorpcji Freundlicha) w odniesieniu do różnych substancji jest tylko możliwe, gdy te wartości KF są wyrażone w tych samych jednostkach (83).
1.9.2.5.2. Kinetyka desor pcji
Celem tego doświadczenia jest zbadanie, czy substancja chemiczna jest odwracalnie czy nieodwracalnie adsorbowana w glebie. Niniejsza informacja jest istotna ponieważ proces desorpcji również ma istotne znaczenie w zachowaniu się substancji chemicznych w glebie pól. Ponadto dane w zakresie desorpcji są użyteczne jako dane wejściowe w komputerowym modelowaniu symulacji przebiegu rozpuszczania i płukania. Jeśli badania desorpcji są pożądane, jest zalecane, aby badania opisane poniżej były prowadzone na każdym systemie, dla którego dokładne oznaczenie Kd w poprzedzającym doświadczenie kinetyki adsorpcji było możliwe.
Podobnie jak w badaniach kinetyki adsorpcji, istnieją dwie możliwości wykonania doświadczenia kinetyki desorpcji: a) metoda równoległa; i b) metoda seryjna. Wybór zastosowanej metodologii pozostawia się uznaniu eksperymentatora, który musi uwzględnić dostępne urządzenia i zasoby laboratorium.
a) Metoda równoległa: w odniesieniu do każdej gleby wybranej do przeprowadzenia badań desorpcji, przygotowuje się próbki o tym samym proporcji gleba/roztwór, w liczbie zależnej od tego w ilu przedziałach czasowych chce się zbadać kinetyki desorpcji. Powinno się użyć tych samych przedziałów czasowych jak w doświadczeniu kinetyki adsorpcji; jednakże całkowity czas może być przedłużony, jeśli to właściwe, w celu osiągnięcia przez system równowagi desorpcji. W każdym doświadczeniu (jedna gleba, jeden roztwór) włącza się ślepą próbę. Obejmuje to glebę i roztwór 0,01 M CaCl2, bez substancji badanej, odpowiednio naważkę oraz objętość identyczne do tych z doświadczenia. Kontrolna próbka tylko z substancją badaną w roztworze 0,01 M CaCl2 (bez gleby) podlega tej samej procedurze badania. Wszystkie mieszaniny gleby z roztworem są mieszane do osiągnięcia równowagi adsorpcji (jak wcześniej określono w warstwie 2). Następnie fazy są rozdzielane przez odwirowanie, a fazy wodne są usuwane w najszerszym możliwym zakresie. Objętość oddzielonego roztworu jest zastępowana przez równą objętość 0,01 M CaCl2 bez substancji badanej, a nowe mieszaniny są ponownie mieszane. Faza wodna z pierwszej probówki jest usuwana całkowicie, jak to możliwe i mierzona po, na przykład 2 godz., druga probówka po 4 godzinach, trzecia po 6 godzinach itd. do osiągnięcia równowagi desorpcji.
b) Metoda seryjna: po doświadczeniu kinetyki adsorpcji, mieszanina jest odwirowana i faza wodna jest usuwana w najszerszym możliwym zakresie. Objętość roztworu usuniętego jest zastępowana przez równą objętość 0,01 M CaCl2 bez substancji badanej. Nowa mieszanina jest mieszana do osiągnięcia równowagi desorpcji. W trakcie tego okresu czasu, w określonych przedziałach czasowych, mieszanina jest odwirowywana w celu rozdzielenia faz.. Mała podwielokrotność fazy wodnej jest niezwłocznie analizowana w odniesieniu do substancji badanej; następnie doświadczenie prowadzi się nadal z pierwotną mieszaniną. Objętość każdej poszczególnej podwielokrotności powinna być mniejsza niż 1 % całkowitej objetości. Taka sama ilość świeżego roztworu 0,01 M CaCl2 jest dodawana do mieszaniny w celu utrzymania proporcji gleby do roztworu a mieszanie jest kontynuowane do następnego przedziału czasowego.
Procent desorpcji jest obliczany w każdym punkcie czasu (ðDti Þ) i/lub przedziale czasowym (ðD∆ ti Þ) (wedle potrzeb badania) i jest wykreślana w zależności od czasu. Współczynnik desorpcji Kdes w równowadze jest także obliczany. Wszystkie mające zastosowanie równania podano w dodatku 5 i "Dane i sprawozdawczość".
Wyniki z doświadczenia kinetyki desorpcji
Wspólne wykreślenie procentu desorpcji Dti i adsorpcji Ati w zależności od czasu umożliwia oszacowanie odwracalności procesu adsorpcji. Jeśli równowaga desorpcji jest osiągana nawet w obrębie podwojonego czasu równowagi adsorpcji, a całkowita desorpcja jest większa niż 75 % ilości adsorbowanej, adsorpcja jest uważana za odwracalną.
1.9.2.5.3. Izotermy desorpcji
Izotermy desorpcji Freundlicha są określone na glebach używanych w doświadczeniu izoterm adsorpcji. Badanie desorpcji jest prowadzone jak opisano w punkcie "Kinetyka desorpcji", z tą tylko różnicą, że faza wodna analizowana jest tylko raz, w równowadze desorpcji. Ilość substancji badanej zdesorbowanej jest obliczana. Zawartość substancji badanej pozostającej zaadsorbowaną na glebie w równowadze desorpcji jest wykreślana jako funkcja stężenia równowagi substancji badanej w roztworze.(zob. Dane i sprawozdawczość oraz dodatek 5).
2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Dane analityczne są przedstawione w formie tabelarycznej (zob. dodatek 6). Podano poszczególne pomiary i obliczone średnie. Pokazano graficzne przedstawienie izoterm adsorpcji. Dokonanie obliczeń opisano poniżej.
Do celów badania uznaje się, że waga 1 cm3 roztworu wodnego wynosi 1 g. Stosunek gleba/roztwór wyrażony w jednostkach wag./wag. lub wag./obj. jest tą samą liczbą.
2.1. ADSORPCJA
Adsorpcja (Ati) jest określona jako procent substancji zaadsorbowanej na glebie w proporcji do ilości na początku badania w warunkach badania. Jeśli substancja badana jest stabilna i nie adsorbuje się w znacznym stopniu na ściankach zbiornika, Ati oblicza się w każdym punkcie czasu ti, zgodnie z równaniem:
(3)
gdzie:
= procent adsorpcji w punkcie czasu ti (%),
= masa substancji badanej zaadsorbowanej na glebie w czasie ti (μg),
m0 = masa substancji badanej w probówce badanej, na początku badania (μg).
Szczegółowe informacje dotyczące sposobu obliczenia procenta adsorpcji Ati dla metody równoległej i seryjnej podano w dodatku 5.
Współczynnik podziału Kd jest proporcją między zawartością substancji w fazie gleby i masowym stężeniem substancji w roztworze wodnym, w warunkach badania, gdy osiągnięta jest równowaga adsorpcji.
(4)
gdzie:
= zawartość substancji zaadsorbowana na glebie w równowadze adsorpcji (μg g-1),
= stężenie masowe substancji w fazie wodnej w równowadze adsorpcji (μg cm-3). To stężenie jest oznaczone analitycznie, uwzględniając wartości dane w ślepej próbie,
= masa substancji zaadsorbowana na glebie w równowadze adsorpcji (ug),
= masa substancji w roztworze w równowadze adsorpcji (ug),
msoil = ilość fazy gleby, wyrażona w suchej masie gleby (g),
V0 = początkowa objętość fazy wodnej w kontakcie z glebą (cm3).
Zależność między Aeq i Kd jest określona przez:
(5)
gdzie:
Aeq = procent adsorpcji w równowadze adsorpcji, %.
Znormalizowany współczynnik adsorpcji węgla organicznego Koc wiąże współczynnik podziału Kd z zawartością węgla organicznego próbki gleby:
(6)
gdzie:
% OC = procent węgla organicznego w próbce gleby (g g-1).
Współczynnik Koc przedstawia pojedynczą wartość, która charakteryzuje podzielenie głównie niepolarnych substancji organicznych między węglem organicznym w glebie lub osadzie i wodzie. Adsorpcja tych substancji chemicznych jest skorelowana z zawartością związków organicznych sorbującego ciała stałego (7); zatem wartości Koc zależą od właściwych cech próchnicowych frakcji, które różnią się znacznie zdolnością sorpcji z powodu różnic w pochodzeniu, genezie itd.
2.1.1. Izotermy adsorpcji
Równanie izoterm Freundlicha wiąże ilość substancji badanej zaadsorbowanej ze stężeniem substancji badanej w roztworze w równowadze (równanie 8).
Dane są opracowywane jak w "Adsorpcja" i, w odniesieniu do każdej probówki badanej, jest obliczana zawartość substancji badanej zaadsorbowanej na glebie po badaniu adsorpcji (Casds(eq), gdzie indziej oznaczane jako as x/m). Przyjmując, że równowaga została osiągnięta i że Casds (eq) przedstawia wartość równowagi:
(7)
Równanie adsorpcji Freundlicha jest wskazane w (8):
(8)
lub w postaci liniowej:
(9)
gdzie:
= współczynnik adsorpcji Freundlicha; jego wymiarem jest cm3 g-1 tylko gdy l/n = 1; we wszystkich innych przypadkach nachylenie l/n jest wprowadzone w wymiar KaFds (ug1-1/n (cm3)1/n g-1)
n = stała regresji; l/n ogólnego zakresu między 0,7-1,0, wskazując, że dane sorpcji są często lekko nieliniowe.
Równania (8) i (9) są wykreślane i wartości Kds i l/n są wyliczane analizą regresyjną, używając równanie 9. Współczynnik korelacji r2 równania logarytmicznego jest również wyliczany. Przykład takich wykresów podano na rys. 2.
Rys. 2. Wykres adsorpcji Freundlicha, normalny i linearyzowany
2.1.2. Bilans masy
Bilans masy (MB) określa się jako procent substancji, który może być analitycznie odzyskany po badaniu adsorpcji w zależności od nominalnej ilości substancji na początku badania.
Opracowywanie danych rozróżni, czy rozpuszczalnik jest całkowicie mieszalny z wodą. W przypadku rozpuszczalników mieszalnych z wodą opracowanie danych opisanych pod "Desorpcja" może być stosowane do określenia ilości substancji odzyskanej przez ekstrakcję rozpuszczalnikiem. Jeśli rozpuszczalnik jest słabo mieszalny z wodą, określenie odzyskanej ilości musi być dokonane.
Bilans masy MB w odniesieniu do adsorpcji jest obliczany następująco; przyjmuje się, że pojęcie (mE) odpowiada sumie badanych mas substancji chemicznych wyekstrahowanych z gleby i powierzchni zbiornika badanego, rozpuszczalnikiem organicznym:
(10)
gdzie:
MB = bilans masy (%),
mE = całkowita masa substancji badanej wyekstrahowanej z gleby i ścian zbiornika badanego w dwóch krokach (ug),
C0 = początkowe stężenie masowe roztworu badanego w kontakcie z glebą (ug cm-3),
Vrec = objętość nadsączu odzyskanego po równowadze adsorpcyjnej (cm3).
2.2. DESORPCJA
Desorpcję (D) określa się jako procent substancji badanej zdesorbowanej w zależności od ilości substancji uprzednio zaadsorbowanej, w warunkach badania:
Dti = procent desorpcji w punkcie czasu ti (%),
= masa substancji badanej zdesorbowanej z gleby w punkcie czasu ti (ug),
= masa substancji badanej zaadsorbowanej na glebie w równowadze adsorpcji (ug).
Szczegółowe informacje dotyczące sposobu obliczenia procentu desorpcji Dti dla metody równoległej i seryjnej podano w dodatku 5.
Pozorny współczynnik desorpcji (Kdes) jest, w warunkach badania, proporcją między zawartością substancji pozostającą w fazie gleby a stężeniem masowym substancji desorbowanej w roztworze wodnym, gdy osiągnięta jest równowaga desorpcji:
(12)
gdzie:
Kdes = współczynnik desorpcji (cm3 g-1),
= całkowita masa substancji badanej zdesorbowanej z gleby w równowadze desorpcji (µg),
VT = całkowita objętość fazy wodnej w kontakcie z glebą w czasie trwania badania kinetyki desorpcji (cm3).
Wytyczne dotyczące obliczania podano w dodatku 5 pod pozycją "Desorpcja". Uwaga:
Jeśli badanie adsorpcji, które było poprzedzające było wykonane metodą równoległą objętość VT w równaniu 12 uznaje się za równe V0.
2.2.1. Izotermy desorpcji
Równanie izoterm desorpcji Freundlicha wiąże zawartość substancji badanej pozostającej zaadsorbowanej na glebie, ze stężeniem substancji badanej w roztworze w równowadze desorpcji (równanie 16).
W odniesieniu do każdej probówki badanej, zawartość substancji pozostającej zaadsorbowaną na glebie, w równowadze desorpcji, jest obliczana następująco:
(13)
jest określone jako:
(14)
gdzie:
= zawartość substancji badanej pozostającej zaadsorbowaną na glebie w równowadze desorpcji (µg g-1)
= masa substancji określona analitycznie w fazie wodnej w równowadze desorpcji (µg),
= masa substancji badanej pozostałej z równowagi adsorpcji z powodu niepełnego podstawienia objętości (µg),
= masa substancji w roztworze w równowadze adsorpcji (µg);
(15)
= objętość roztworu pobrana z probówki do pomiaru substancji badanej, w równowadze desorpcji (cm3), Vr r = objętość nadsączu usuniętego z probówki po uzyskaniu równowagi adsorpcji i zastąpieniu przez tę samą objętość roztworu 0,01 M CaCl2 (cm3).
Równanie desorpcji Freundlicha znajduje się w (16):
(16)
lub w postaci liniowej:
(17)
gdzie:
= współczynnik desorpcji Freundlicha,
n = stała regresji,
= stężenie masowe substancji w fazie wodnej w równowadze desorpcji (ug cm-3).
Równania 16 i 17 mogą być wykreślone, a wartości i l/n są obliczane za pomocą analizy regresyjnej, stosując równanie 17.
Uwaga:
Jeśli wykładnik l/n adsorpcji lub desorpcji Freundlicha jest równy 1, stałe wiążące adsorpcję lub desorpcję Freundlicha ( i ), będą równe odpowiednio stałym równowagi adsorpcji lub desorpcji (Kd i Kdes), a wykresy Cs vs Caq będą liniowe. Jeśli wykładniki nie są równe 1, krzywe Cs vs Caq będą nieliniowe, a stałe adsorpcji i desorpcji będą się zmieniać wzdłuż izoterm.
2.2.2. Sprawozdanie z badania
Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
- Pełna identyfikacja użytych próbek gleby, włączając:
- geograficzne odniesienie miejsca (szerokość geograficzna, długość geograficzna),
- data pobierania próbek,
- użyty rodzaj (np. gleba rolnicza, leśna itd.),
- głębokość pobierania próbek,
- zawartość piasek/mul/glina,
- wartości pH (w 0,01 M CaCl2),
- zawartość węgla organicznego,
- zawartość substancji organicznych,
- zawartość azotu,
- stosunek C/N,
- zdolność wymiany kationu (mmol/kg),
- wszystkie informacje odnoszące się do zbierania i przechowywania próbek,
- tam gdzie to jest stosowne, wszystkie istotne informacje dotyczące interpretacji adsorpcja/desorpcja substancji badanej,
- bibliografia dla metod zastosowanych dla oznaczenia każdego parametru,
- informacje dotyczące substancji badanej, jeśli to stosowne,
- temperatura doświadczeń,
- warunki odwirowania,
- procedura analityczna zastosowana do analizy substancji badanej,
- uzasadnienie w odniesieniu do każdego użycia środka ułatwiającego rozpuszczanie do przygotowania roztworu właściwego substancji badanej,
- wyjaśnienie korekt wykonanych w obliczeniach, jeśli to odpowiednie,
- dane zgodnie z formularzem (dodatek 6) wraz z prezentacją graficzną,
- wszystkie informacje i obserwacje pomocne dla interpretacji wyników badania.
3. BIBLIOGRAFIA
(1) Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. UBA Report 106 02.045, Part II.
(2) Franzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of Representative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02.045, Part I.
(3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.
(4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy 18-20 January 1995 (June 1995).
(5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate, Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.
(6) US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 835-Fate, Transport and Transformation Test Guidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.
(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for Determining a Sorption Constant (Koc) for an Organic Chemical in Soil and Sediments.
(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada, 15 July 1987.
(9) Netherlands Commission Registration Pesticides (1995): Application for registration of a pesticide. Section G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
(10) Danish National Agency of Environmental Protection (October 1988): Criteria for registration of pesticides as especially dangerous to health or especially harmful to the environment.
(11) BBA (1990), Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, Biological Research Centre for Agriculture and Forestry Braunschweig, Germany.
(12) Calvet R, (1989), "Evaluation of adsorption coefficients and the prediction of the mobilities of pesticides in soils", in Methodological Aspects of the Study of Pesticide Behaviour in Soil (ed. P. Jamet), INRA, Paris, (Review).
(13) Calvet R, (1980), "Adsorption-Desorption Phenomena" in Interactions between herbicides and the soil. (R. J. Hance ed.), Academic Press, London, pp. 83-122.
(14) Hasset J. J., and Banwart W.L., (1989), "The sorption of nonpolar organics by soils and sediments" in Reactions and Movement of Organic Chemicals in Soils. Soil Science Society of America (S.S.S.A), Special Publication no. 22, pp. 31-44.
(15) van Genuchten M. Th., Davidson J. M., and Wierenga P. J., (1974), "An evaluation of kinetic and equilibrium equations for the prediction of pesticide movement through porous media". Soil Sci. Soc. Am. Proc, Vol. 38(1), pp. 29-35.
(16) McCall P. J., Laskowski D. A., Swann R. L., and Dishburger H. J., (1981), "Measurement of sorption coefficients of organic chemicals and their use, in environmental fate analysis", in Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Proceedings of AOAC Symposium, AOAC, Washington DC.
(17) Lambert S. M., Porter P. E., and Schieferrstein R H., (1965), "Movement and sorption of chemicals applied to the soil". Weeds, 13, pp. 185-190.
(18) Rhodes R. C, Belasco I. J., and Pease H. L, (1970) "Determination of mobility and adsorption of agrochemicals in soils". J.Agric.Food Chem., 18, pp. 524-528.
(19) Russell M. H., (1995), "Recommended approaches to assess pesticide mobility in soil" in Environmental Behavior of Agrochemicals (ed. T R. Roberts and P. C. Kearney). John Wiley & Sons Ltd.
(20) Esser H. O., Hemingway R.J., Klein W., Sharp D. B., Vonk J. W. and Holland P. T, (1988), "Recommended approach to the evaluation of the environmental behavior of pesticides", IUPAC Reports on Pesticides (24). Pure Appl. Chem., 60, pp. 901-932.
(21) Guth J. A., Burkhard N., and D. O. Eberle, (1976), "Experimental models for studying the persistence of pesticides in soils". Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, pp. 137-157, BCPC, Surrey, UK.
(22) Furminge C. G. L., and Osgerby J. M., (1967), "Persistence of herbicides in soil". J. Sci. Fd Agric, 18, pp. 269-273.
(23) Burkhard N., and Guth J. A., (1981), "Chemical hydrolysis of 2-Chloro-4,6-bis(alkylamino)-l,3,5-triazine herbicides and their breakdown in soil under the influence of adsorption". Pestic. Sci. 12, pp. 45-52.
(24) Guth J. A., Gerber H. R, and Schlaepfer T, (1977), "Effect of adsorption, movement and persistence on the biological availability of soil-applied pesticides". Proc. Br. Crop Prot. Conf, 3, pp. 961-971.
(25) Osgerby J. M., (1973), "Process affecting herbicide action in soil". Pestic. Sci., 4, pp. 247-258.
(26) Guth J. A., (1972), "Adsorptions- und Einwascheverhalten von Pflanzenschutzmitteln in Boden". Schr. Reihe Ver. Wass. -Boden-Lufthyg. Berlin-Dahlem, Heft 37, pp. 143-154.
(27) Hamaker J. W., (1975), "The interpretation of soil leaching experiments", in Environmental Dynamics of Pesticides (eds R Haque and V.H. freed), pp. 135-172, Plenum Press, NY.
(28) Helling C. S., (1971), "Pesticide mobility in soils". Soil Sci. Soc. Amer. Proc, 35, pp. 732-210.
(29) Hamaker J. W., (1972), "Diffusion and volatilization" in Organic chemicals in the soil environment (CA.I. Goring and J. W. Hamaker eds), Vol. I, pp. 49-143.
(30) Burkhard N. and Guth J. A., (1981), "Rate of volatilisation of pesticides from soil surfaces; Comparison of calculated results with those determined in a laboratory model system". Pestic. Sci. 12, pp. 37-44.
(31) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R.F., and Enfield CG., (1984), "Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses", in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp. 297-325, Acs Symp. Ser. 259, American Chemical Society, Washington, DC.
(32) Gustafson D. I., (1989), "Groundwater ubiquity score: a simple method for assessing pesticide teachability". J. Environ. Toxic. Chem., 8(4), pp. 339-357.
(33) Leistra M., and Dekkers W. A., (1976). "Computed effects of adsorption kinetics on pesticide movement in soils". J.of Soil Sci., 28, pp. 340-350.
(34) Bromilov R. H., and Leistra M., (1980), "Measured and simulated behavior of aldicarb and its oxydation products in fallow soils". Pest. Sci., 11, pp. 389-395.
(35) Green R. E., and Karickoff S. W., (1990), "Sorption estimates for modeling", in Pesticides in the Soil Environment: Process, Impacts and Modeling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am., Book Series no. 2, pp. 80-101,
(36) Lambert S. M., (1967), "Functional relationship between sorption in soil and chemical structure". J. Agri. FoodChem., 15, pp. 572-576.
(37) Hance R. J., (1969), "An empirical relationship between chemical structure and the sorption of some herbicides by soils". J. Agri. Food Chem., 17, pp. 667-668.
(38) Briggs G. G. (1969), "Molecular structure of herbicides and their sorption by soils". Nature, 223, 1288.
(39) Briggs G. G. (1981). "Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor". J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.
(40) Sabljic A., (1984), "Predictions of the nature and strength of soil sorption of organic polutance by molecular topology". J. Agric. Food Chem., 32, pp. 243-246.
(41) Bailey G. W., and White J. L, (1970), "Factors influencing the adsorption, desorption, and movement of pesticides in soil". Residue Rev., 32, pp. 29-92.
(42) Bailey G. W., J. L. White and Y. Rothberg., (1968), "Adsorption of organic herbicides by montomorillonite: Role of pH and chemical character of adsorbate". Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 32: pp. 222-234.
(43) Karickhoff S. W., (1981), "Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils". Chemosphere 10, pp. 833-846.
(44) Paya-Perez A., Riaz M. and Larsen B., (1989), "Soil Sorption of 6 Chlorobenzenes and 20 PCB Congeners". Environ. Toxicol. Safety 21, pp. 1-17.
(45) Hamaker J. W., and Thompson J. M., (1972), "Adsorption in organic chemicals" in Organic Chemicals in the Soil Environment (Goring CA.I. and Hamaker J.W., eds), Vol I and II, Marcel Dekker, Inc., New York, NY, 1972, pp. 49-143.
(46) Deli J., and Warren G. F., 1971, "Adsorption, desorption and leaching of diphenamid in soils". Weed Sci. 19: pp. 67-69.
(47) Chu-Huang Wu, Buehring N., Davinson J. M. and Santelmann, (1975), "Napropamide Adsorption, desorption and Movement in soils". Weed Science, Vol. 23, pp. 454-457.
(48) Haues M. H. B., Stacey M., and Thompson J. M., (1968), "Adsorption of s-triazine herbicides by soil organic preparations" in Isotopes and Radiation in Soil Organic Studies, p.75, International. Atomic Energy Agency Vienna.
(49) Pionke H. B., and Deangelis R.J., (1980), "Methods for distributing pesticide loss in field run-off between the solution and adsorbed phase", CREAMS, in A Field Scale Model for Chemicals, Run-off and Erosion from Agricultural Management Systems, Chapter 19, Vol. III: Supporting Documentation, USDA Conservation Research report.
(50) ISO Standard Compendium Environment: Soil Quality-General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition (1994).
(51) Scheffer F., and Schachtschabel, Lehrbuch der Bodenkunde, F. Enke Verlag, Stuttgart (1982), 11th edition.
(52) Black, Evans D. D., White J. L., Ensminger L. E., and Clark F. E., eds. "Methods of Soil Analysis", Vol 1 and 2, American Society of Agronomy Madison, WI, 1982.
(53) ISO/DIS 10381-1 Soil Quality-Sampling-Part 1: Guidance on the design of sampling programmes.
(54) ISO/DIS 10381-2 Soil Quality-Sampling-Part 2: Guidance on sampling techniques.
(55) ISO/DIS 10381-3 Soil Quality-Sampling-Part 3: Guidance on safety of sampling.
(56) ISO/DIS 10381-4 Soil Quality-Sampling-Part 4: Guidance on the investigation of natural and cultivated soils.
(57) ISO/DIS 10381-5 Soil Quality-Sampling-Part 5: Guidance on the investigation of soil contamination of urban and industrial sites.
(58) ISO 10381-6, 1993: Soil Quality-Sampling-Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
(59) Green R. E., and Yamane V. K., (1970), "Precision in pesticide adsorption measurements". Soil Sci. Am. Proc, 34, pp. 353-354.
(60) Grover R., and Hance R. J. (1970), "Effect of ratio of soil to water on adsorption of linuron and atrazine". Soil Sci., pp. 109-138.
(61) Boesten, J. J. T. I, "Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in pesticide/soil system". Pest. Sci. 1990, 30, pp. 31-41.
(62) Boesten, J. J. T. I. "Influence of soil/liquid ratio on the experimental error of sorption coefficients in relation to OECD guideline 106". Proceedings of 5th international workshop on environmental behaviour of pesticides and regulatory aspects, Brussels, 26-29 April 1994.
(63) Bastide J., Cantier J. M., et Coste C, (1980), "Comportement de substances herbicides dans le sol en fonction de leur structure chimique". Weed Res. 21, pp. 227-231.
(64) Brown D. S., and Flagg E. W., (1981), "Empirical prediction of organic pollutants sorption in natural sediments". J. Environ.Qual., 10(3), pp. 382-386.
(65) Chiou C. T., Porter P. E., and Schmedding D. W., (1983), "Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water". Environ. Sci. Technol., 17(4), pp. 227-231.
(66) Gerstl Z., and Mingelgrin U., (1984), "Sorption of organic substances by soils and sediments". J. Environm. Sci. Health, B19 (3), pp. 297-312.
(67) Vowles P. D., and Mantoura R F. C, (1987), "Sediment-water partition coefficient and HPLC retention factors of aromatic hydrocarbons". Chemosphere, 16(1), pp. 109-116.
(68) Lyman W. J., Reehl W. F.and Rosenblatt D. H. (1990). Handbook of Chemical Property Estimation Methods. Environmental Behaviour of Organic Compounds. American Chemical Society, Washington DC.
(69) Keniga E. E., and Goring, C. A. I. (1980). "Relationship between water solubility soil sorption, octanol-water partitioning and concentration of chemicals in the biota" in Aquatic Toxicology (eds J.G. Eaton, et al.), pp.78-115, ASTM STP 707, Philadelphia.
(70) Chiou C. T., Peters L.J., and Freed V. H, (1979), "A physical concept of soil-water equilibria for non-ionic organic compounds". Science, Vol. 206, pp. 831-832.
(71) Hassett J. J., Banwart W. I., Wood S. G., and Means J. C, (1981), "Sorption of/-Naphtol: implications concerning the limits of hydrophobic sorption". Soil Sci. Soc. Am. J. 45, pp. 38-42.
(72) Karickhoff S. W., (1981), "Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils". Chemosphere, Vol. 10(8), pp. 833-846.
(73) Moreale A., van Bladel R., (1981), "Adsorption de 13 herbicides et insecticides par le sol. Relation solubilite-reactivite". Revue de l'Agric, 34 (4), pp. 319-322.
(74) Muller M., Kórdel W. (1996), "Comparison of screening methods for the determination/estimation of adsorption coefficients on soil". Chemosphere, 32(12), pp. 2493-2504.
(75) Kórdel W., Kotthoff G., Müller M. (1995), "HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test". Chemosphere 30 (7), pp. 1373-1384.
(76) Kórdel W., StutteJ., Kotthoff G. (1993), "HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-comparison of different stationary phases". Chemosphere 27 (12), pp. 2341-2352.
(77) Hance, R. J., (1967), "The Speed of Attainment of Sorption Equilibria in Some Systems Involving Herbicides". Weed Research, Vol. 7, pp. 29-36.
(78) Koskinen W. C, and Harper S. S., (1990), "The retention processes: mechanisms" in Pesticides in the Soil Environment: Processes, Impacts and Modelling (ed. H.H. Cheng). Soil Sci. Soc. Am. Book Series, No. 2, Madison, Wisconsin.
(79) Cohen S. Z., Creeger S. M., Carsel R. F., and Enfield C. G. (1984), "Potential pesticide contamination of groundwater from agricultural uses", in Treatment and Disposal of Pesticide Wastes, pp.297-325, ACS Symp. Ser. 259, American Chemical Society Washington, DC.
(80) Giles C. H., (1970), "Interpretation and use of sorption isotherms" in Sorption and Transport Processes in Soils. S.C.I. Monograph No. 37, pp. 14-32.
(81) Giles, C. H.; McEwan J. H.; Nakhwa, S.N. and Smith, D, (1960), "Studies in adsorption: XL A system of classification of solution adsorption isotherms and its use in the diagnosis of adsorption mechanisms and in measurements of pesticides surface areas of soils". J. Chem. Soc, pp. 3973-93.
(82) Calvet R, Terce M., and Arvien J. C, (1980), "Adsorption des pesticides par les sols et leurs constituants: 3. Caracteristiques generates de ladsorption". Ann. Agron. 31: pp. 239-251.
(83) Bedbur E., (1996), "Anomalies in the Freundlich equation", Proc. COST 66 Workshop, Pesticides in soil and the environment, 13-15 May 1996, Stratford-upon-Avon, UK.
(84) Guth, J. A., (1985), "Adsorption/desorption", in Joint International Symposium, Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment, July 1-3, Canterbury UK.
(85) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305(1962).
DODATEK 1
Plan Badania
DODATEK 2
WPŁYW DOKŁADNOŚCI METODY ANALITYCZNEJ I ZMIAN STĘŻENIA NA DOKŁADNOŚĆ WYNIKÓW ADSORPCJI
DODATEK 3
TECHNIKI OSZACOWANIA DLA Kd
1. Techniki oszacowania pozwalają na przewidzenie Kd opartego na korelacjach z, na przykład wartością Pow (12)(39) (63-68), danymi dotyczącymi wodnej rozpuszczalności (12)(19)(21)(39)(68-73) lub danych polarności wyprowa dzonych z zastosowania HPLC w fazie odwróconej (74-76). Jak wskazano w tabelach 1 i 2, istnieją Koc lub Kom obliczone tymi równaniami i następnie, pośrednio, Kd z równań:
2. Pojecie tych korelacji jest oparte na dwóch założeniach: 1) jest to substancja organiczna gleby, która głównie wpływa na adsorpcje substancji; i 2) współdziałania wywołane są głównie substancjami niepolarnymi. Jako wynik te korelacje: 1) nie są, lub są tylko w pewnym zakresie, stosowane do substancji polarnych, i 2) nie są stosowane w przypadkach, gdy zawartość substancji organicznych w glebie jest bardzo mała (12). Dodatkowo, chociaż odkryto zadawalające korelacje między Pow i adsorpcją (19), tego samego nie można powiedzieć o zależności między rozpuszczalnością w wodzie i zakresem adsorpcji (19)(21); tak więc badania są w istotnym stopniu sprzeczne.
3. Niektóre przykłady korelacji między współczynnikiem adsorpcji a współczynnikiem podziału oktanol-woda, jak również rozpuszczalność w wodzie, podano odpowiednio w tabelach 1 i 2.
Tabela 1
Przykłady korelacji między współczynnikiem podziału adsorpcji a współczynnikiem podziału oktanol-woda; dalsze przykłady w (12)(68)
| Substancja | Korelacje | Autorzy |
| Podstawione moczniki Aromatyczne chlorowane Różne pestycydy Aromatyczne węglowodory | log Kom = 0,69 + 0,52 log Pow log Koc = - 0,779 + 0,904 log Pow log Kom = 4,4 + 0,72 log Pow log Koc = - 2,53 + 1,15 log Pow | Briggs (1981) (39) Chiou et al. (1983) (65) Gerstl i Mingelgrin (1984) (66) Vowles i Mantoura (1987) (67) |
Tabela 2
Przykłady korelacji między współczynnikiem podziału adsorpcji i rozpuszczalnością w wodzie; dalsze przykłady zob. (68)(69)
| Związki | Korelacje | Autorzy |
| Różne pestycydy Alifatyczne, aromatyczne substancje chlorowane α-naftol Cykliczne, alifatyczne aromatyczne Różne związki | Log Kom = 3,8 - 0,561 log Sw log Kom = (4,040 +/- 0,038) - (0,557 +/- 0,012) log Sw log Koc = 4,273 - 0,686 log Sw log Koc = - 1,405 - 0,921 log Sw -0,00953 (mp-25) log Kom = 2,75 - 0,45 log Sw | Gerstl i Mingelgrin (1984) (66) Chiou et al. (1979) (70) Hasset et al. (1981) (71) Karickhoff (1981)(72) Moreale van Blade (1982) (73) |
DODATEK 4
OBLICZENIA W ODNIESIENIU DO OKREŚLNIA WARUNKÓW WIROWANIA
1. Czas odwirowania jest podany za pomocą następującego wzoru, włączając sferyczne cząstki:
(1)
Do celów uproszczenia, wszystkie parametry są opisane w jednostkach nie-SI (g, cm).
gdzie:
ω = szybkość obrotowa (=2 n rpm/60), rad s-1,
rpm = broty na minutę,
ŋ = lepkość roztworu, gs-1cm-1,
rp = promień cząstki, cm,
ρs = gęstość gleby, gcm-3,
ρaq = gęstość roztworu, gcm-3,
Rt = odległość od środka wirnika wirówki do górnego poziomu roztworu w probówce wirówki, cm,
Rb = odległość od środka wirnika wirówki do dna probówki, cm
Rb-Rt = długość mieszaniny gleba/roztwór w probówce wirówki, cm.
W ogólnej praktyce stosuje się podwojony obliczony czas w celu zapewnienia całkowitego oddzielenia.
2. Równanie (1) może być uproszczone dalej, jeśli założymy, że lepkość (ŋ) i gęstość (ρaq) roztworu jest równa lepkości i gęstości wody w 25 °C; zatem, ŋ, = 8,95 x 10-3 g s-1 cm-1 i ρaq = 1,0 g, cm-3.
Zatem, czas wirowania jest podany za pomocą równania (2)
(2)
3. Z równania 2 jasno wynika, że dwa parametry są ważne dla określania warunków wirowania, tj. czas (t) szybkość (rpm), w celu uzyskania rozdzielenia cząstek o szczególnym wymiarze (w tym przypadku promień 0,1 um): 1) gęstość gleby oraz 2) długość mieszaniny w probówce wirówki (Rb-Rt), tj. odległość, którą przebywa cząstka z góry roztworu do dna probówki, oczywiście dla ustalonej objętości długość mieszaniny w probówce zależy od kwadratu promienia probówki.
4. Rysunek 1 przedstawia zmiany w czasie wirowania (t) w zależności od szybkości wirowania (rpm) dla różnych gęstości gleby (ρs) (rys. la) i różnych długości mieszaniny w probówkach wirówki (rys. 2a). Z rys. la wpływ gęstości gleby wynika w sposób oczywisty, na przykład dla klasycznego wirowania przy 3000 rpm czas wirowania wynosi w przybliżeniu 240 min dla gęstości gleby 1,2 g cm3, podczas gdy jest to tylko 50 min. dla 2,0 g cm3. Podobnie, z rys. lb, dla klasycznego wirowania 3000 rpm czas wirowania wynosi w przybliżeniu 50 min dla długości mieszaniny 10 cm i tylko 7 min. dla długości 1 cm. Jednakże istotne jest odkrycie optymalnej zależności między wirowaniem które wymaga możliwie mniejszej długości i ułatwionego postępowania eksperymentatora w rozdzielaniu faz po odwirowaniu.
5. Ponadto przy określaniu doświadczalnych warunków rozdzielania faz gleba/roztwór, istotne jest rozważenie możliwości istnienia trzeciej "pseudofazy", koloidów. Cząstki te, o wielkości mniejszej niż 0,2 (um, mają ważny wpływ na cały mechanizm adsorpcji substancji w zawiesinie gleby. Gdy wirowanie jest wykonywane jak opisano powyżej, koloidy pozostają w fazie wodnej i podlegają analizie wraz z wodną fazą. W ten sposób informacja o ich wpływie jest tracona.
Jeśli laboratorium prowadzące badanie posiada urządzenia ultrawirujące lub ultrafiltrujące, adsorpcja/desorpcja substancji w glebie może być badana dogłębiej, włączając informacje o adsorpcji substancji na koloidach. W tym przypadku należy zastosować ultrawirowanie przy 60.000 rpm/min lub ultrafiltrację z filtrem o porowatości 100.000 daltonów w celu rozdzielenia trzech faz gleby, koloidów i roztworu. Protokół badania powinien być również odpowiednio zmodyfikowany w celu objęcia wszystkich trzech faz analizą substancji.
DODATEK 5
OBLICZANIE ADSORPCJI A (%) I DESORPCJI D (%)
DODATEK 6
ADSORPCJA-DESORPCJA W GLEBACH: ARKUSZ PRZEDSTAWIANIA DANYCH
C.19. OSZACOWANIE WSPÓŁCZYNNIKA ADSORPCJI (KOC) NA GLEBIE I W OSADZIE ŚCIEKOWYM PRZY ZASTOSOWANIU WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC)
1. METODA
Niniejsza metoda jest kopią OECD TG121 (2000).
1.1. WPROWADZENIE
Zachowanie się sorpcji substancji w glebach lub osadach ściekowych może być opisane za pomocą parametrów określonych doświadczalnie w rozumieniu metody badania C18. Ważnym parametrem jest współczynnik adsorpcji, który określa się jako stosunek między stężeniem substancji w gleba/osad ściekowy a stężeniem substancji w fazie wodnej w równowadze adsorpcji. Współczynnik adsorpcji znormalizowany do zawartości węgla organicznego gleby Koc jest użytecznym wskaźnikiem zdolności wiązania substancji chemicznych na ciałach organicznych gleby i osadu ściekowego oraz pozwalającym na dokonanie porównań między różnymi substancjami chemicznymi. Niniejszy parametr może być oszacowany poprzez korelacje rozpuszczalności wodnej i współczynnikiem podziału n-oktanol/woda (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).
Metoda doświadczalna opisana w niniejszym badaniu, używa HPLC dla oszacowania współczynnika adsorpcji Koc w glebie i w osadzie ściekowym (8). Oceny są wyższej wiarygodności niż te z obliczeń QSAR (9). Jako metoda oszacowania nie może w pełni zastąpić doświadczeń okresowej równowagi, zastosowanej w metodzie badanej C18. Jednakże oszacowany Koc jest użyteczny dla wyboru właściwych parametrów badania dla badań adsorpcja/desorpcja zgodnie z metodą badania C18, poprzez wyliczenie Kd (współczynnik podziału) lub Kf (współczynnik adsorpcji Freundlicha) zgodnie z równaniem 3 (zob. pkt 1.2).
1.2. DEFINICJE
Kd: Współczynnik podziału jest zdefiniowany jako stosunek stężenia równowagi C roztworu substancji badanej w systemie dwufazowym składającym się z sorbentu (gleba lub osad ściekowy) i fazy wodnej; jest to wartość bezwymiarowa, natomiast stężenia w obu fazach są wyrażone na podstawie waga/waga. W przypadku stężenia w fazie wodnej podano je na bazie waga/objętość, zatem jednostką jest ml- g-1. Kd zmienia się z właściwościami sorbentu i może być zależny od stężenia.
(1)
gdzie:
Csoil = stężenie substancji badanej w glebie w równowadze (µg· g-1),
Csludge = stężenie substancji badanej w osadzie w równowadze (µg· g-1),
Caq = stężenie substancji badanej w fazie wodnej w równowadze (µg· g-1, µg ml-1).
Kf: Współczynnik adsorpcji Freundlicha definiuje się jako stężenie substancji badanej w glebie lub osadzie ściekowym (x/m), gdy stężenie równowagi Caqw fazie wodnej jest równe jeden; jednostką jest ug- g-1 sorbenta. Wartość zmienia się z właściwościami sorbenta.
(2)
gdzie:
x/m = ilość substancji badanej x (ug) zaadsorbowanej na ilości sorbenta m (g) w równowadze
1/n = nachylenie izotermy adsorpcji Freundlicha
Caq = stężenie substancji badanej w fazie wodnej w równowadze (ug. ml-1)
Koc: Współczynnik podziału (Kd) lub współczynnik adsorpcji Freundlicha (Kf) znormalizowany do zawartości węgla organicznego (foc) sorbenta; w szczególności dla niezjonizowanych substancji chemicznych, jest to przybliżony wskaźnik dla zasięgu adsorpcji między substancją a sorbentem, pozwalający na dokonanie porównań między różnymi substancjami chemicznymi. W zależności od wymiarów Kd i Kf, Koc są bezwymiarowe lub mają jednostki ml. g-1 lub ug. g-1 ciała organicznego.
(3)
Zależność między Koc i Kd nie zawsze jest liniowa i w ten sposób wartości Koc mogą różnić się od gleby do gleby ale ich różnorodność jest znacznie zmniejszona porównując do wartości Kd lub Kf.
Współczynnik adsorpcji (Koc) jest wyprowadzony ze współczynnika zdolności (k") przy użyciu krzywej kalibracji, wykreślając log k' w zależności od log Koc wybranych związków odniesienia.
(4)
gdzie:
tR = HPLC czas retencji substancji badanej i substancji odniesienia (minuty)
t0 = HPLC czas martwy (minuty) (zob. pkt 1.8.2).
Pow: współczynnik podziału oktanol-woda jest określony jako stosunek stężenia roztworu substancji w n-oktanolu i wody; jest bezwymiarową wartością.
(5)
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Wzór strukturalny czystość, stała dysocjacji (jeśli to właściwe) powinny być znane przed zastosowaniem metody. Informacje dotyczące rozpuszczalności w wodzie i rozpuszczalnikach organicznych, współczynniku podziału oktanol-woda oraz cechy hydrolizy są przydatne.
Aby skorelować zmierzone przez HPLC dane retencji substancji badanej i jej współczynnik adsorpcji Koc, ustalana jest krzywa kalibracji log Koc w zależności od log k'. Powinno być zastosowane minimum sześć punktów odniesienia, co najmniej jeden powyżej i jeden poniżej wartości oczekiwanej substancji badanej. Dokładność metody będzie znacząco poprawiona, jeśli substancje wzorcowe są strukturalnie związane z zastosowaną substancją badaną. Jeśli takie dane nie są dostępne, jest zadaniem użytkownika wybranie właściwych substancji wzorcowych. W tym przypadku powinien zostać wybrany bardziej ogólny zestaw strukturalnie heterogenicznych substancji. Substancje stosowane i wartości Koc są wymienione w dodatku w tabeli 1 dotyczącej osadów ściekowych i w tabeli 3 dotyczącej gleb. Wybór innych substancji kalibracyjnych powinien być uzasadniony.
1.4. ZASADA METODY BADANIA
HPLC wykonuje się na analitycznych kolumnach napełnionych handlowo dostępnym cyjanopropylem w fazie stałej zawierającej lipofilowe i polarne grupy cząsteczkowe. Umiarkowanie stacjonarna faza polarna jest oparta na stosowanej matrycy krzemionkowej:
Zasada metody badania jest podobna do metody badania A.8 (współczynnik podziału, HPLC metoda). Podczas przejścia przez kolumnę wraz z ruchomą fazą, substancja badana oddziałuje z fazą stacjonarną. W wyniku rozdzielenia między fazami ruchomą i stacjonarną badana substancja jest opóźniona. Podwójny skład fazy stacjonarnej posiadającej polarne i niepolarne powierzchnie pozwala na współdziałanie polarnych i niepolarnych grup cząsteczki w podobny sposób jak dla matryc ciał organicznych w glebie lub osadu ściekowego. Umożliwia to zależności między czasem retencji na kolumnie i współczynnikiem adsorpcji na powstających substancjach organicznych.
Wartość pH ma znaczący wpływ na zachowania sorpcyjne, w szczególności w odniesieniu do substancji polarnych. W odniesieniu do gleb rolniczych lub zbiorników oczyszczalni ścieków pH zwykle zmienia się między 5,5 a 7,5. Dla podatnych na jonizację substancji należy wykonać dwa badania zarówno z formą jonową, jak i niejonową we właściwych roztworach buforowych, ale tylko w przypadkach, gdy co najmniej 10 % związku badanego jest zdysocjowana w zakresie pH 5,5-7,5.
Ponieważ tylko zależność między retencją na kolumnie HPLC a współczynnikiem adsorpcji jest wykorzystywana do oceny, nie jest wymagana analityczna metoda ilościowa i konieczne jest określenie tylko czasu retencji. Jeśli dostępny jest odpowiedni zestaw substancji odniesienia i stosowane mogą być standardowe warunki doświadczalne, metoda stanowi szybki i skuteczny sposób oszacowania współczynnika adsorpcji Κoc.
1.5. MOŻLIWOŚĆ ZASTOSOWANIA BADANIA
Metoda HPLC ma zastosowanie do substancji chemicznych (nieetykietowanych lub etykietowanych) w odniesieniu do których jest dostępny właściwy system detakcji (np. spektrofotometer, detektor radioaktywności) i które są wystarczająco stabilne podczas czasu trwania doświadczenia. Może to być szczególnie użyteczne w odniesieniu do substancji chemicznych które są trudne do badań w innych systemach doświadczalnych (tj. substancje lotne, substancje nierozpuszczalne w wodzie w stężeniu które może być analitycznie zmierzone, substancje z wysokim powinowactwem do powierzchni systemów inkubacyjnych). Metoda jest użyteczna w odniesieniu do mieszanin dających pasma nierozuszczalnej elucji. W takim przypadku górne i dolne granice wartości log Κoc związków mieszaniny badanej powinny być określone.
Zanieczyszczenia mogą czasem powodować problemy dotyczące interpretacji wyników z HPLC, lecz mają małe znaczenie w zakresie w jakim substancja badana może analitycznie być wyraźnie określona oraz oddzielana od zanieczyszczeń.
Metoda jest uzasadniona w odniesieniu do substancji wymienionych w tabeli 1 w dodatku oraz była również stosowana do różnych innych substancji chemicznych należących do następujących chemicznych klas:
- aminy aromatyczne (np. trifluralin, 4-chloroanilina, 3,5-dinitroanilina, 4-metyloanilina, N-metyloanilina, 1-naftyloamina),
- estry aromatycznych kwasów karboksylowych (np. metyloester kwasu benzoesowego, ester etylowy kwasu 3,5-dinitrobenzoesowego),
- węglowodory aromatyczne (np. toluen, ksylen, etylobenzen, nitrobenzen),
- estry kwasu aryloksyfenoksypropioniowego (np.diclofop-metylowy, fenoxaprop-etylowy, fenoxaprop-P-etylowy),
- środki grzybobójcze benzimidazolu i imidazolu (np. carbendazim, fuberidazol, triazoxid),
- amidy kwasu karboksylowego (np. 2-chlorobenzamid, N,N-dimetylobenzamid, 3,5-dinitrobenzamid, N-metylobenzamid, 2-nitrobenzamid, 3-nitrobenzamid),
- chlorowane węglowodory (np. endosulfan, DDT, heksachlorobenzen, quintozen, 1,2,3-trichlorobenzen),
- fosforoorganiczne środki owadobójcze (np. azinphos-metylowy, disulfoton, fenamiphos, isofenphos, pyrazophos, sulprofos, triazophos),
- fenole (np. fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentachlorofenol, 2,4,6-trichlorofenol, 1-naftol),
- pochodne fenylomocznika (np. isoproturon, monolinuron, pencycuron),
- pigmentowe barwniki (np. Acid Yellow 219, Basic Blue 41, Direct Red 81),
- węglowodory poliaromatyczne (np. acetonaften, naftalen),
- środki chwastobójcze 1,3,5-triazyny (np. prometryn, propazine, simazine, terbutryn),
- pochodne triazolu (np. tebuconazole, triadimefon, tradimenol, triapenthenol).
Metody nie stosuje się do substancji, które reagują z eluentem albo z fazą stacjonarną. Nie jest także stosowana do substancji, które oddziaływają w szczególny sposób ze składnikami nieorganicznymi (np. tworzenie grup kompleksów z minerałami gliny). Metoda nie działa z substancjami powierzchniowo czynnymi, związkami nieorganicznymi i umiarkowanymi lub mocnymi organicznymi kwasami i zasadami. Wartości log Κoc
w zakresie 1,5-5,0 mogą być określone. Podatne na jonizację substancje muszą być mierzone, stosując buforowaną fazę ruchomą, należy jednak zachować ostrożność, aby zapobiec strącaniu się składników buforu lub substancji badanej.
1.6. KRYTERIA JAKOŚCIOWE
1.6.1. Dokładność
Zwykle współczynnik adsorpcji substancji badanej może być szacowany w zakresie ± 0,5 log jednostki wartości określonej przez okresową metodę równowagi (zob. tabela 1 w dodatku). Wyższa dokładność może być uzyskana, jeśli substancje odniesienia zastosowane są strukturalnie związane z substancją badaną.
1.6.2. Powtarzalność
Oznaczenia powinny być prowadzone przynajmniej w dwóch kopiach. Wartości log Κoc wyprowadzone z poszczególnych pomiarów powinny mieścić się w zakresie 0,25 log jednostki.
1.6.3. Odtwarzalność
Doświadczenie uzyskane dotychczas przy zastosowaniu metody podtrzymuje jej zasadność. Badania metodą HPLC, z użyciem 48 substancji (głównie pestycydów), w odniesieniu do których były dostępne wiarygodne dane Κoc na glebach, dało współczynnik korelacji równy R = 0,95 (10)(11).
Między laboratoryjne badanie porównawcze z 11 uczestniczącymi laboratoriami przeprowadzono, aby poprawić i uwiarygodnić metodę (12). Wyniki podano w tabeli 2 dodatku.
1.7. OPISANIE METODY BADANIA
1.7.1. Wstępne oszacowanie współczynnika adsorpcji
Współczynnik podziału oktanol-woda Pow (= Κow) oraz, w pewnym zakresie, wodna rozpuszczalność może być używana jako wskaźnik dla zasięgu adsorpcji w szczególności dla niejonowych substancji, a w ten sposób może być używana do wstępnego znalezienia zakresu. Rozmaitość przydatnych korelacji opublikowano w odniesieniu do kilku grup substancji chemicznych (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7).
1.7.2. Aparatura
Wymagane są: cieczowy chromatograf połączony z bezpulsacyjną pompą i odpowiednim urządzeniem wykrywającym. Zalecane jest użycie zaworu wtryskowego z pętlą wtryskową. Należy użyć handlowego cyjanopropylu chemicznie związanego żywicą na bazie krzemionki (np. Hypersil i Zorbax CN). Kolumna ochronna z tego samego materiału może być ustawiona między systemem wtrysku i kolumną analityczną. Kolumny od różnych dostawców mogą różnić się znacznie w wydajności rozdzielania. Jako wytyczne, powinny być osiągnięte następujące masowe proporcje podziału k': log k' > 0,0 dla log Κoc = 3,0 i log k' > 0,4 dla log Κoc = 2,0 przy użyciu metanol/woda 55/45 % jako faza ruchoma.
1.7.3. Fazy ruchome
Zbadano kilka ruchomych faz i następujące dwie są zalecane:
- metanol/woda (55/45 % obj./obj.),
- metanol/0,01M bufor cytrynianowy pH 6,0 (55/45 % obj./obj.).
Metanol czystości HPLC oraz destylowana woda lub bufor cytrynianowy są używane do przygotowania elucyjnego rozpuszczalnika. Mieszanina jest odgazowywana przed użyciem. Powinna być używana elucja izokratyczna. Jeśli mieszaniny metanol/woda nie są właściwe, należy wypróbować inne mieszaniny rozpuszczalnik organiczny/woda, np. etanol/woda lub acetonitryl/woda. W odniesieniu do związków jonowych zaleca się użycie buforów w celu stabilizacji pH. Należy zachować ostrożność, aby zapobiec wytrącaniu się soli i uszkodzeniu kolumny, co zdarza się przy niektórych mieszaninach faza organiczna/bufor.
Nie można używać żadnych dodatków, takich jak odczynniki z wolną parą elektronową, ponieważ wpływają na właściwości sorpcji fazy stacjonarnej. Takie zmiany w fazie stacjonarnej są nieodwracalne. Z tej przyczyny obowiązkowe jest, aby doświadczenia z użyciem dodatków prowadzić w oddzielnych kolumnach.
1.7.4. Substancje rozpuszczone
Substancje badane i substancje odniesienia powinny być rozpuszczone w fazie ruchomej.
1.8. WYKONANIE BADANIA
1.8.1. Warunki badania
Temperatura w czasie trwania pomiarów powinna być rejestrowana. Użycie segmentu kolumny z kontrolowaną temperaturą jest silnie zalecane w celu zapewnienia stałych warunków w czasie trwania procesu kalibracji, oszacowania i pomiaru substancji badanej.
1.8.2. Oznaczenie czasu martwego to
Stosuje się w odniesieniu do określenia czasu martwego dla dwóch różnych metod (zob. także pkt 1.2).
1.8.2.1. Określenie czasu martwego to za pomocą serii homologicznych
Niniejsza procedura daje wiarygodne i standaryzowane wartości to. W zakresie szczegółowych informacji zob. metoda badania A.8: współczynnik podziału (n-oktanol/woda), metoda HPLC.
1.8.2.2. Określenie czasu martwego to substancjami obojętnymi, niezatrzymywanymi przez kolumnę
Niniejsza technika jest oparta na wtrysku roztworów formamidu, mocznika lub azotanu sodowego. Pomiary powinny być wykonane co najmniej dwa razy.
1.8.3. Oznaczanie czasów retencji tR
Należy wybrać substancje odniesienia, jak opisano w pkt 1.3. Są one wstrzykiwane jako mieszaniny wzorcowe dla ustalenia ich czasów retencji, upewniając się, że czas retencji każdego wzorca nie jest zakłócony przez obecność innego wzorca. Kalibracja powinna być wykonywana w regularnych odstępach czasu, co najmniej dwa razy dziennie, w celu wyjaśnienia niespodziewanych zmian w działaniu kolumny. Dla najlepszego sposobu wstrzyknięcia kalibracyjne powinny być prowadzone przed i po wstrzyknięciu badanej substancji w celu zapewnienia, aby czas retencji nie zmieniał się. Substancje badane są wstrzykiwane oddzielnie, w ilościach tak małych, jak to możliwe (aby zapobiec przeciążeniu kolumny), a ich czasy retencji są określone.
W celu podniesienia zaufania do pomiarów, należy wykonać podwójne określenia. Wartości log Koc uzyskane z poszczególnych pomiarów powinny wchodzić w zakres 0,25 log jednostki.
1.8.4. Ocena
Masowe proporcje podziału k' są obliczane od martwego czasu do czasów retencji tR wybranych substancji odniesienia, według równania 4 (zob. pkt 1.2). Dane log k' dotyczące substancji odniesienia są wykreślane względem ich wartości log Κoc z doświadczeń równowagi wsadowej podanych w tabeli 1 i 3 dodatku. Stosując niniejszy wykres, wartość log k' badanej substancji jest zatem używana do określania wartości log Κoc. Jeśli rzeczywiste wyniki wskazują, że log Κoc substancji badanej jest poza zakresem kalibracji, badanie należy powtórzyć stosując inne, bardziej właściwe substancje odniesienia.
2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Sprawozdanie musi zawierać następujące informacje:
- identyczność substancji badanej i substancji odniesienia ich czystość i wartości pKa, jeśli to stosowne,
- opis wyposażenia i warunki działania, np. typ i wymiary kolumn analitycznych (z ochroną), sposoby wykrywania, faza ruchoma (proporcje składników i pH), zakres temperatur w czasie trwania pomiarów,
- czas martwy i zastosowana metoda jego określenia,
- ilość substancji badanej i substancji odniesienia wprowadzonej do kolumny,
- czas retencji różnych związków odniesienia użytych do kalibracji,
- szczegółowe informacje dotyczące spasowania linii regresji (log k' vs log Κoc) i wykres linii regresji,
- dane średniej retencji i oszacowane wartości d log Koc w odniesieniu do testowanego związku,
- chromatogramy.
3. BIBLIOGRAFIA
(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, McGraw-Hill, New York.
(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the adsorption coefficient (Κoc) for soils by HPLC. Chemosphere, 17, 1 67.
(3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J. Agric. Food Chem., 29, pp. 1050-1059.
(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, pp. 227-231.
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substances by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, pp. 297-312.
(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical concept of soil water equilibria for nonionic organic compounds, Science, 106, pp. 831-832.
(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Chemosphere, 10, pp. 833-846.
(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), pp. 121-128.
(9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening methods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Chemosphere, 32(12), pp. 2493-2504.
(10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient in soil-comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27(12), pp. 2341-2352.
(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of nonpolar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD Guideline 106, Chemosphere, 22, pp. 285-304.
(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373-1384.
DODATEK
Tabela 1
Porównanie wartości Koc w odniesieniu do gleb i osadu ściekowego oraz obliczone wartości metodą rozdzielania HPLC(1),(2)
| Substancja | CAS No | log Κoc osad kanalizacyjny | log Κoc HPLC | Δ | log Κoc gleb | log Κoc HPLC | Δ |
| Atrazyna | 1912-24-9 | 1,66 | 2,14 | 0,48 | 1,81 | 2,20 | 0,39 |
| Linuron | 330-55-2 | 2,43 | 2,96 | 0,53 | 2,59 | 2,89 | 0,30 |
| Fention | 55-38-9 | 3,75 | 3,58 | 0,17 | 3,31 | 3,40 | 0,09 |
| Monuron | 150-68-5 | 1,46 | 2,21 | 0,75 | 1,99 | 2,26 | 0,27 |
| Fenantren | 85-01-8 | 4,35 | 3,72 | 0,63 | 4,09 | 3,52 | 0,57 |
| Fenyloester kwasu benzoesowego | 93-99-2 | 3,26 | 3,03 | 0,23 | 2,87 | 2,94 | 0,07 |
| Benzamid | 55-21-0 | 1,60 | 1,00 | 0,60 | 1,26 | 1,25 | 0,01 |
| 4-nitrobenzamid | 619-80-7 | 1,52 | 1,49 | 0,03 | 1,93 | 1,66 | 0,27 |
| Acetanilid | 103-84-4 | 1,52 | 1,53 | 0,01 | 1,26 | 1,69 | 0,08 |
| Anilina | 62-53-3 | 1,74 | 1,47 | 0,27 | 2,07 | 1,64 | 0,43 |
| 2,5-dichloroanilina | 95-82-9 | 2,45 | 2,59 | 0,14 | 2,55 | 2,58 | 0,03 |
| (1) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), pp. 121–128. (2) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage sludges. Chemosphere, 35 (1/2), pp. 107–119. |
Tabela 2
Wyniki interlaboratoryjnego badania porównawczego (11 uczestniczących laboratoriów) przeprowadzonego w celu poprawy i uwiarygodnienia metody HPLC(1)
| Substancja | Nr CAS | log Κoc | Κoc | log Κoc |
| (OECD 106) | (metoda HPLC) | |||
| Atrazine | 1912-24-9 | 1,81 | 78 ±16 | 1,89 |
| Monuron | 150-68-5 | 1,99 | 100 ±8 | 2,00 |
| Triapenthenol | 77608-88-3 | 2,37 | 292 ± 58 | 2,47 |
| Linuron | 330-55-2 | 2,59 | 465 ± 62 | 2,67 |
| Fenthion | 55-38-9 | 3,31 | 2062 ± 648 | 3,31 |
| (1) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), pp. 1373-1384. |
Tabela 3
Zalecane substancje odniesienia dla metody przeglądowej HPLC opartej o dane adsorpcji gleby
| Substancja wzorcowa | Nr CAS | Log Κoc średnie wartości od równowagi wsadowej | Liczba danych Koc | Log S.D. | Źródło |
| Acetanilid | 103-84-4 | 1,25 | 4 | 0,48 | (a) |
| Fenol | 108-95-2 | 1,32 | 4 | 0,70 | (a) |
| 2-nitrobenzamid | 610-15-1 | 1,45 | 3 | 0,90 | (b) |
| N.N-dimetylobenzamid | 611-74-5 | 1,52 | 2 | 0,45 | (a) |
| 4-metylobenzamid | 619-55-6 | 1,78 | 3 | 1,76 | (a) |
| Benzoesan metylu | 93-58-3 | 1,80 | 4 | 1,08 | (a) |
| Atrazyna | 1912-24-9 | 1,81 | 3 | 1,08 | (c) |
| Isoproturon | 34123-59-6 | 1,86 | 5 | 1,53 | (c) |
| 3-Nitrobenzamid | 645-09-0 | 1,95 | 3 | 1,31 | (b) |
| Anilina | 62-53-3 | 2,07 | 4 | 1,73 | (a) |
| 3,5-Dinitrobenzamid | 121-81-3 | 2,31 | 3 | 1,27 | (b) |
| Carbendazim | 10605-21-7 | 2,35 | 3 | 1,37 | (c) |
| Triadimenol | 55219-65-3 | 2,40 | 3 | 1,85 | (c) |
| Triazoxide | 72459-58-6 | 2,44 | 3 | 1,66 | (c) |
| Triazophos | 24017-47-8 | 2,55 | 3 | 1,78 | (c) |
| Linuron | 330-55-2 | 2,59 | 3 | 1,97 | (c) |
| Naftalen | 91-20-3 | 2,75 | 4 | 2,20 | (a) |
| Endosulfan-diol | 2157-19-9 | 3,02 | 5 | 2,29 | (c) |
| Metiocarb | 2032-65-7 | 3,10 | 4 | 2,39 | (c) |
| Barwnik Acid Yellow 219 | 63405-85-6 | 3,16 | 4 | 2,83 | (a) |
| 1,2,3-Trichlorobenzen | 87-61-6 | 3,16 | 4 | 1,40 | (a) |
| Y-HCH | 58-89-9 | 3,23 | 5 | 2,94 | (a) |
| Fention | 55-38-9 | 3,31 | 3 | 2,49 | (c) |
| Barwnik Direct Red 81 | 2610-11-9 | 3,43 | 4 | 2,68 | (a) |
| Pyrazophos | 13457-18-6 | 3,65 | 3 | 2,70 | (c) |
| a-Endosulfan | 959-98-8 | 4,09 | 5 | 3,74 | (c) |
| Diclofop metylowy | 51338-27-3 | 4,20 | 3 | 3,77 | (c) |
| Fenantren | 85-01-8 | 4,09 | 4 | 3,83 | (a) |
| Barwnik Basic Blue 41 (mieszany) | 26850-47-5 12270-13-2 | 4,89 | 4 | 4,46 | (a) |
| ODT | 50-29-3 | 5,63 | 1 | - | (b) |
| (a) W. Kördel. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoefftiienten organischern Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D Report No 106 01044 (1994). (b) B.V. Oepen. W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, pp. 285–304. (c) Dane dostarczone przez przemysł. |
C.20. BADANIE ROZRODCZOŚCI DAPHNIA MAGNA
1. METODA
Niniejsza metoda badania toksyczności dla rozrodczości jest kopią OECD TG 211 (1998).
1.1. WPROWADZENIE
Głównym celem badania jest ocena skutków działania substancji chemicznych na zdolność rozrodczości Daphnia magna.
1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI
Zwierzęta rodzicielskie: są tymi samicami Daphnia obecnymi na początku badania i których zdolność rozrodczości jest przedmiotem badań.
Potomstwo: są to młode Daphnia produkowane przez zwierzęta rodzicielskie w trakcie badania.
Najniższy obserwowany skutek stężenia (LOEC): jest to najmniejsze badane stężenie substancji badanej, przy którym obserwuje się statystycznie istotny skutek dotyczący rozrodczości i śmiertelności zwierząt macierzystych (przy p < 0,05) przy porównaniu z doświadczeniem kontrolnym, w ramach określonego czasu trwania ekspozycji na badania. Jednakże wszystkie badane stężenia powyżej LOEC muszą wykazywać szkodliwy skutek, równy lub większy niż ten obserwowany przy LOEC. Gdy te dwa warunki nie mogą być spełnione, muszą być podane wszystkie wyjaśnienia w odniesieniu do sposobu w jaki LOEC (i stąd NOEC) zostało wybrane.
Nieobserwowany skutek stężenia (NOEC): jest stężeniem badanym bezpośrednio poniżej LOEC, które, gdy jest porównane z doświadczeniem kontrolnym, nie ma statystyczni istotnego skutku (p < 0,05), w ramach określonego czasu trwania ekspozycji na badanie.
ECx: jest stężeniem substancji badanej rozpuszczonej w wodzie powodującym w x % redukcję w rozrodczości Daphnia magna w ramach okresu ekspozycji na badanie.
Wewnętrzny wskaźnik wzrostu: jest miarą wzrostu populacji, która łączy zdolność rozrodczą i określoną wiekowo śmiertelność (20)(21)(22). W populacji w stanie zrównoważonym jest równy zero. Dla rozwijających populacji będzie dodatni, a dla kurczących się populacji będzie ujemny. Jest oczywiste, że ten drugi jest niepodtrzymujący i ostatecznie prowadzi do zaniku.
Granica wykrywania: najniższe stężenie, które może być wykryte, ale nie można go ilościowo oznaczyć.
Granica oznaczania: najniższe stężenie, które można zmierzyć ilościowo.
Śmiertelność: zwierzę jest rejestrowane jako martwe, gdy jest nieruchome, tj. gdy nie jest w stanie pływać lub nie jest obserwowany ruch przydatków lub odwłoka, w ciągu 15 sekund po łagodnym poruszeniu zbiornika badanego. (Jeśli jest stosowana inna definicja, musi być to zrelacjonowane wraz z odniesieniem).
1.3. ZASADA METODY BADANIA
Młode samice Daphnia (zwierzęta rodzicielskie), w wieku poniżej 24 godzin na początku badania, są wystawiane na działanie substancji badanej dodanej do wody w zakresie stężeń. Czas trwania badania wynosi 21 dni. Na końcu badania szacowana jest całkowita ilość żyjącego potomstwa wyprodukowanego na zwierzę rodzicielskie, które przeżyło do końca badania. To oznacza, że młode wyprodukowane przez dorosłe zmarłe w czasie trwania badania są wykluczone z obliczeń. Zdolność rozrodcza zwierząt rodzicielskich może być wyrażona w inny sposób (np. liczba żyjącego potomstwa wyprodukowanego na zwierzę na dzień od pierwszego dnia zaobserwowania potomstwa), lecz powinno to być przedstawione jako dodatek do całkowitej liczby młodocianych wyprodukowanych na żywych rodziców na końcu badania. Zdolność rozrodcza zwierząt wystawianych na działanie substancji badanej jest porównywana do tej z doświadczenia kontrolnego w celu ustalenia najniższego obserwowanego skutku stężenia (LOEC), a stąd nieobserwowanego skutku stężenia (NOEC). Ponadto, w najszerszym możliwym zakresie, dane analizuje się, stosując model regresji w celu prognozowania stężenia powodującego x % zmniejszenia zdolności rozrodczej (tj. EC50, EC20 lub EC10).
Przeżycie zwierząt rodzicielskich i czas do produkcji potomstwa musi być również przedstawiony. Inne skutki związane z substancją dotyczące parametrów takich jak rozwój (np. długość) i możliwy wewnętrzny wskaźnik wzrostu może być również zbadany.
1.4. INFORMACJE DOTYCZĄCE SUBSTANCJI UŻYTEJ W BADANIU
Powinny być dostępne wyniki badania toksyczności ostrej (zob. metoda C.2, część I) wykonanej na Daphnia magna. Wyniki mogą być użyteczne przy wyborze właściwego zakresu stężeń badanych w badaniach rozrodczości. Rozpuszczalność w wodzie i ciśnienie pary substancji badanej powinny być znane, jak również powinna być dostępna niezawodna metoda określania ilościowego substancji w roztworach badanych o udokumentowanej wydajności i granicy określenia.
Informacje dotyczące substancji badanej, które mogą być użyteczne w ustalaniu warunków badania, obejmują: wzór strukturalny, czystość substancji, stabilność w świetle, stabilność w warunkach badania, pKa, Pow i wyniki badania szybkiej biodegradacji (zob. metoda C.4).
1.5. WAŻNOŚĆ BADANIA
Aby badanie było ważne, powinny być spełnione następujące kryteria wykonania doświadczeń kontrolnych:
- śmiertelność zwierząt rodzicielskich (samice Daphnia) nie przewyższa 20 % na koniec badania,
- średnia liczba żyjącego potomstwa wyprodukowanego na zwierzę rodzicielskie przeżywające na koniec badania wynosi ≥ 60.
1.6. OPIS METODY BADANIA
1.6.1. Aparatura
Zbiorniki do badań i inna aparatura, która wchodzi w kontakt z roztworami badanymi, powinny być wykonane całkowicie ze szkła lub innego chemicznie obojętnego materiału. Zbiornikami do badań będą zwykłe szklane zlewki.
Ponadto wymagane są wszystkie lub kilka z następujących sprzętów:
- miernik tlenu (z mikroelektrodą lub innym odpowiednim wyposażeniem do pomiaru rozpuszczonego tlenu w próbkach o małej objętości),
- odpowiedni aparat do kontroli temperatury,
- pH metr,
- wyposażenie do określenia twardości wody,
- sprzęt do określenia całkowitego węgla organicznego (TOC) w wodzie lub wyposażenie do określenia zapotrzebowania na chemiczny tlen (COD),
- odpowiednia aparatura do kontroli parametrów światła i pomiaru intensywności oświetlenia.
1.6.2. Organizmy użyte w badaniu
Gatunkiem wykorzystywanym w badaniu jest Daphnia magna Straus. Inne gatunki Daphnia wykorzystuje się, zapewniając, że odpowiadają właściwym kryteriom ważności (kryterium ważności dotyczące zdolności rozrodczej przy doświadczeniach kontrolnych powinny być właściwe w odniesieniu do gatunku Daphnia). Jeśli wykorzystane są inne gatunki Daphnia, muszą być one wyraźnie określone i ich wykorzystanie musi być uzasadnione.
Najlepiej, aby klon był określony za pomocą genotypowania. Badania (1) wykazały, że zdolności reprodukcyjne klonu A (pochodzącego z IRCHA we Francji) (3) konsekwentnie odpowiada kryterium ważności średniej ≥ 60 potomstwa na rodzicielskie zwierzę przeżywające, gdy jest hodowane zgodnie z warunkami opisanymi w niniejszej metodzie. Jednakże inne klony są akceptowalne, pod warunkiem że wykazano że kultura Daphnia spełnia kryteria ważności dotyczące badania.
Na początku badania zwierzęta powinny być młodsze niż 24 godziny i nie muszą być pierwszym potomstwem. Powinny one pochodzić ze zdrowej hodowli (tj. niewykazujące takich oznak stresu, jak wysoka śmiertelność, obecności samców i ephippia, opóźnień w produkcji pierwszego potomstwa, zwierząt odbarwionych itd.). Podstawowe zwierzęta muszą być utrzymywane w warunkach właściwych dla ich hodowli (światło, temperatura, ośrodek, karmienie i ilość zwierząt na jednostkę objętości), zbliżonych do tych stosowanych w badaniu. Jeśli ośrodek hodowli Daphnia używany w badaniu różni się od rutynowego dla hodowli Daphnia, jest dobrą praktyką włączyć okres aklimatyzacji przed badaniem, zwykle około trzech tygodni (tj. jedno pokolenie), aby zapobiec stresowi zwierząt rodzicielskich.
1.6.3. Ośrodek badania
Jest zalecane, aby w badaniu użyć w pełni określony ośrodek. Umożliwia to zapobieżenie użyciu dodatków (np. wodorostów, ekstraktu ziemi itd.), które trudno scharakteryzować, a w ten sposób poprawić możliwości standaryzacji między laboratoriami. Ośrodki Elendt M4 (4) i M7 (zob. dodatek 1) uznano za właściwe do tego celu. Są też akceptowane inne ośrodki odpowiednie w tym celu (np. (5)(6)) które dostarczają zdolności dla hodowli Daphnia spełnienia kryteriów ważności dotyczących badania.
Jeśli stosowane ośrodki zawierają niezdefiniowane dodatki, powinny być one wyraźnie określone, a informacja o nich powinna być zawarta w sprawozdaniu z badań dotyczącym ich składu, w szczególności w odniesieniu do zawartości węgla organicznego, mogącą wpływać na dostarczaną dietę. Jest zalecane, aby całkowity węgiel organiczny (TOC) i/lub zapotrzebowanie na tlen chemiczny (COD) w przygotowanych dodatkach ośrodka podstawowego był ustalony i dokonany szacunek wynikowego udziału TOC/COD w ośrodku badanym. Zalecane jest aby poziomy TOC w ośrodku (tj. przed dodaniem alg) były poniżej 2 mg/l (7).
W przypadku substancji badanych, zawierających metale, istotne jest aby uwzględniać, że właściwości ośrodka (np. twardość, zdolność chelatującą) mogą wpływać na toksyczność badanej substancji. Z tej przyczyny jest pożądany w pełni zdefiniowany ośrodek. Jednakże obecnie jedynymi w pełni zdefiniowanymi ośrodkami uznanymi za odpowiednie dla hodowli długoterminowej Daphnia magna są Elendt M4 i M7. Oba ośrodki zawierają związek chelatujący EDTA. Prace wykazały (2), że "oczywista toksyczność" kadmu jest ogólnie niższa, gdy badanie rozrodczości jest prowadzone w ośrodkach M4 i M7 niż w ośrodkach niezawierających EDTA. M4 i M7 dlatego nie są zalecane do badań substancji zawierających metale, a inne ośrodki zawierające znane środki chelatujące powinny być również unikane. W odniesieniu do substancji zawierających metale może być wskazane użycie alternatywnego ośrodka, takiego jak na przykład odtworzona świeża twarda woda ASTM (7), która nie zawiera EDTA, z dodatkiem ekstraktu wodorostów (8). Ta kombinacja odtworzonej świeżej twardej wody ASTM i ekstraktu wodorostów jest także odpowiednia dla długoterminowej hodowli oraz badania Daphnia magna (2), chociaż obserwuje się łagodne działanie chelatujące z powodu składnika organicznego w dodanym ekstrakcie wodorostu.
Na początku i w trakcie trwania badania stężenie rozpuszczonego tlenu powinno być powyżej 3 mg/l. Wartość pH powinna być w zakresie 6-9 i zwykle nie powinna różnić się o więcej niż 1,5 jednostki w każdym pojedynczym badaniu. Twardość powyżej 140 mg/l (jako CaCO3) jest zalecana. Badania na tym poziomie i powyżej wykazały zdolność rozrodczą w zgodności z kryteriami ważności (9)(10).
1.6.4. Roztwory użyte w badaniu
Roztwory użyte o wybranych stężeniach są zwykle przygotowywane przez rozcieńczenie roztworu podstawowego. Zalecane jest przygotowanie roztworów podstawowych przez rozpuszczenie substancji badanej w ośrodku badanym.
W niektórych przypadkach stosowanie rozpuszczalników organicznych lub dyspergatorów może być wymagane w celu uzyskania odpowiednio stężonego roztworu podstawowego, ale należy dołożyć wszelkich starań, aby zapobiec użyciu takich materiałów. Przykładami odpowiednich rozpuszczalników są aceton, etanol, metanol, dwumetyloformamid i glikol trójetylenowy. Przykładami odpowiednich dyspergatorów są Cremophor RH40, metyloceluloza 0,01 % i HCO-40. W każdym przypadku substancja badana w roztworach badanych nie powinna przekraczać granicy rozpuszczalności w ośrodku badanym.
Rozpuszczalniki są stosowane do wykonania roztworu podstawowego, który może być dozowany ściśle do wody. W zalecanym stężeniu rozpuszczalnika w końcowym ośrodku badanym (tj. < 0,1 ml/l) rozpuszczalniki wymienione powyżej nie będą toksyczne i nie mogą podnosić rozpuszczalności substancji w wodzie.
Dyspergatory mogą pomagać w dokładnej dawce i rozproszeniu. Przy zalecanym stężeniu w końcowym ośrodku badanym (< 0,1 ml/l) dyspergatory wymienione powyżej nie będą toksyczne i nie będą podnosić rozpuszczalności substancji w wodzie.
1.7. PROJEKT BADANIA
Traktowanie powinno być rozdzielone do zbiorników do badań, a wszystkie następujące czynności ze zbiornikami do badań powinny być prowadzone metodą losową. Niezastosowanie się do tego może powodować powstanie błędów systematycznych, które mogą być zinterpretowane jako wpływ stężenia. W szczególności jeśli jednostki doświadczalne są obsługiwane według traktowania lub stężenia, wtedy niektóre związane z czasem skutki, takie jak zmęczenie operatora lub inny błąd mogą prowadzić do poważniejszych skutków przy wyższych stężeniach. Ponadto, jeśli na wyniki badania prawdopodobnie wpłyną początkowe lub środowiskowe warunki, takie jak położenie w laboratorium, należy rozważyć wykonanie badania blokowego.
1.8. PROCEDURA
1.8.1. Warunki ekspozycji
1.8.1.1. Czas trwania
Czas trwania badania wynosi 21 dni.
1.8.1.2. Załadunek
Zwierzęta rodzicielskie są utrzymywane pojedynczo, jedno na zbiornik do badań, z 50-100 ml ośrodka w każdym zbiorniku.
Większe objętości czasem są niezbędne do spełnienia wymagań procedury analitycznej stosowanej do określania stężenia substancji badanej, chociaż zakładanie kopii w odniesieniu do analizy chemicznej jest też dopuszczalne. Jeśli stosuje się objętości większe niż 100 ml, racje podawane Daphnia mogą wymagać zwiększenia w celu zapewnienia odpowiedniej dostępności pożywienia i zgodności z kryteriami ważności. W odniesieniu do badań przepływowych alternatywne projekty mogą być rozważane, z przyczyn technicznych (np. cztery grupy po 10 zwierząt w większej objętości badanej) lecz wszystkie zmiany projektu badania powinny być przedstawione.
1.8.1.3. Liczba zwierząt
W odniesieniu do półstatycznych badań co najmniej 10 zwierząt jest trzymanych pojedynczo przy każdym stężeniu badanym i co najmniej 10 zwierząt trzymanych pojedynczo w seriach kontrolnych.
W odniesieniu do badań przepływowych 40 zwierząt, podzielonych na grupy po 10 zwierząt w każdym stężeniu badanym, okazało się być odpowiednie (1). Mniejsza liczba organizmów badanych może być wykorzystana, a minimum 20 zwierząt na stężenie, podzielonych w dwie lub więcej kopii z równą ilością zwierząt (np. cztery kopie każda z pięcioma daphnid. Należy zauważyć, że w odniesieniu do badań, w których zwierzęta są trzymane w grupach, nie jest możliwe wyrażenie zdolności rozrodczej jako całkowitej liczby żyjącego potomstwa wyprodukowanego na rodzicielskie zwierzę, które żyje na końcu badania, jeśli zwierzęta rodzicielskie zmarły. W tych przypadkach zdolność rozrodcza powinna być wyrażona jako "całkowita liczba żyjącego potomstwa wyprodukowanego na rodzica obecnego na początku badania".
1.8.1.4. Karmienie
W odniesieniu do badań półstatycznych karmienie powinno być wykonywane najlepiej codziennie, lecz przynajmniej trzy razy na tydzień (tj. zgodnie z wymianami ośrodka). Odchylenia od tego (np. w odniesieniu do badań przepływowych) powinno być przedstawione.
W czasie trwania badania dieta zwierząt rodzicielskich powinno składać się z żyjących komórek glonowych jednego lub więcej z następujących typów: Chlorella sp., Selenastrum capricornutum (obecnie Pseudokirchneriella subcapitata (11)) i Scenedesmus subspicatus. Dostarczana dieta powinna być oparta na ilości węgla organicznego dostarczanego każdemu zwierzęciu rodzicielskiemu. Badania (12) wykazały, że dla Daphnia magna poziomy racji między 0,1 i 0,2 mg C/Daphnia/dzień są wystarczające do uzyskania odpowiedniej liczby potomstwa spełniającego kryteria ważności. Racje dostarczane są jako stały wskaźnik poprzez czas badania albo, jeśli to jest pożądane, stosując niski wskaźnik na początku i zwiększany w czasie trwania badania, uwzględniając rozwój zwierząt rodzicielskich. W tym przypadku racje powinny nadal pozostawać w granicach zalecanego zakresu 0,1-0,2 mg C/Daphnia/dzień przez cały czas.
Jeśli mają być stosowane środki zastępcze, takie jak ilość komórek glonowych lub absorpcja światła, do karmienia na wymaganym poziomie racji (tj. dla wygody ponieważ pomiar zawartości węgla zabiera czas), każde laboratorium musi wykonać swój własny nomogram odnoszący się do zależności środka zastępczego oraz zawartości węgla hodowli glonów (zob. dodatek 2 dotyczący zaleceń odnoszących się do wykonania nomogramu). Nomogramy powinny być sprawdzane co najmniej corocznie i częściej, gdy warunki hodowli glonów uległy zmianie. Odkryto, że absorpcja światła jest lepszą namiastką dla zawartości węgla niż ilość komórek (13).
W celu zminimalizowania objętości kultur glonów dostarczanych do ośrodka zbiorników do badań Daphnia powinny być karmione koncentratem glonów w nośniku. Stężenie glonów może być uzyskane przez odwirowanie zawiesiny w destylowanej albo dejonizowanej wodzie, z pierwotnej zawiesiny lub z ośrodka kultur Daphnia.
1.8.1.5. Światło
16 godzin światła przy intensywności nieprzekraczającej 15-20 uE · m-2 · s-1.
1.8.1.6. Temperatura
Temperatura ośrodka badanego powinna być w zakresu 18-22 oC. Jednakże w odniesieniu do jednego badania nie może, jeśli to możliwie, różnić się o więcej niż 2 oC w ramach tych granic (np. 18-20, 19-21 lub 20- 22 oC). Właściwe może być użycie dodatkowego zbiornika badanego do celów monitorowania temperatury.
1.8.1.7. Napowietrzanie
W czasie trwania badania zbiorniki do badań nie mogą być napowietrzane.
1.8.2. Stężenie użyte w badaniu
Zwykle powinno być co najmniej pięć stężeń ułożonych w serii geometrycznej ze wskaźnikiem odstępu najlepiej nieprzekraczającym 3,2 oraz właściwej liczbie kopii dla każdego stężenia badanego (zob. pkt 1.8.1.3). Powinno być przedstawione uzasadnienie w przypadku zastosowania mniej niż pięciu stężeń. Nie powinny być badane substancje powyżej ich granicy rozpuszczalności w ośrodku badanym.
W określaniu zakresu stężeń należy uwzględnić do następuje:
(i) jeśli celem jest uzyskanie LOEC/NOEC, najniższe stężenie badane musi być wystarczająco niskie, aby płodność przy tym stężeniu nie była znacząco niższa niż w przy doświadczeniu kontrolnym. W innym przypadku badanie będzie musiało być powtórzone ze zmniejszonym najniższym stężeniem;
(ii) jeśli celem jest uzyskanie LOEC/NOEC, najwyższe stężenie badane musi być wystarczająco wysokie, aby płodność przy tym stężeniu była znacząco niższa niż w doświadczeniu kontrolnym. W innym przypadku badanie będzie musiało być powtórzone ze zwiększonym najwyższym stężeniem;
(iii) jeśli szacowane jest ECX odnoszące się do skutków dotyczących rozrodczości wskazane jest użycie wystarczającego stężenia w celu określenia ECX z właściwym poziomem wiarygodności. Jeśli szacowany jest EC50 odnoszące się do skutków dotyczących rozrodczości, wskazane jest, aby najwyższe stężenie badane było wyższe niż ten EC50. Inaczej, choć będzie jeszcze możliwe oszacowanie EC50, przedział ufności dla EC50 będzie bardzo szeroki i nie będzie możliwe zadawalające ocenienie odpowiedniości dopasowanego modelu;
(iv) zakres stężeń badanych nie powinien obejmować żadnych stężeń, które mają statystycznie znaczący wpływ na przeżycie dorosłych, ponieważ powoduje to zmianę charakteru badania z badania prostej rozrodczości na badanie złożonej rozrodczości i śmiertelności, wymagający bardziej złożonej analizy statystycznej.
Uprzednia wiedza dotycząca toksyczności substancji badanej (np. z badania ostrego i/lub badań szukania zakresu) powinna być pomocna w wyborze właściwych stężeń badanych.
W przypadku gdy rozpuszczalnik lub dyspergator stosowano do pomocy w przygotowaniu roztworów badanych (zob. pkt 1.6.4), ich końcowe stężenie w zbiornikach do badań nie powinno przekraczać 0,1 ml/l oraz powinno być takie samo we wszystkich zbiornikach do badań.
1.8.3. Doświadczenia kontrolne
Do serii badanej dodatkowo musi być włączona jedna seria kontrolna badanego ośrodka oraz, jeżeli to właściwe, jedna seria kontrolna zwierająca rozpuszczalnik lub dyspergator. Gdy stosowany jest rozpuszczalnik lub dyspergator ich stężenie powinno być takie samo jak używane w zbiornikach zawierających substancję badaną. Należy użyć właściwą ilość kopii (zob. pkt 1.8.1.3).
Ogólnie, w dobrze przebiegającym badaniu współczynnik zmian wokół średniej ilości żyjącego potomstwa produkowanego urodzonego na jedno rodzicielskie zwierzę w doświadczeniu(-ach) kontrolnym(-ch) powinna wynosić < 25 % oraz powinno to być przedstawione w odniesieniu do projektów badania stosującego pojedynczo trzymane zwierzęta.
1.8.4. Odnawianie ośrodka użytego w badaniu
Częstotliwość odnawiania ośrodka zależy od stabilności substancji badanej, lecz powinna następować co najmniej trzy razy na tydzień. Jeśli z wstępnego badania stabilności (zob. pkt 1.4) wynika, że stężenie substancji badanej nie jest stabilne (tj. poza zakresem 80-120 % nominalnego lub spada poniżej 80 % mierzonego stężenia początkowego) poza maksymalnym okresem odnawiania (tj. trzy dni), należy rozważyć częstszą wymianę ośrodka lub zastosowania badania przepływowego.
Gdy ośrodek jest wymieniany w badaniach półstatycznych, przygotowuje się drugą serię zbiorników do badań, a zwierzęta rodzicielskie są do nich przenoszone, na przykład szklaną pipetą o odpowiedniej średnicy. Objętość ośrodka przenoszonego z Daphnia powinna być zminimalizowana.
1.8.5. Obserwacje
Wyniki obserwacji dokonanych w trakcie trwania badania powinny być odnotowane w arkuszach danych (zob. przykłady w dodatkach 3 i 4). Jeśli inne pomiary są wymagane (zob. 1.3 i 1.8.8) dodatkowe obserwacje mogą być wymagane.
1.8.6. Potomstwo
Potomstwo wyprodukowane prze każde zwierzę rodzicielskie powinno być usunięte i policzone codziennie od pojawienia się pierwszego potomstwa, w celu powstrzymania ich przed zjedzeniem pokarmu przeznaczonego dla dorosłych. Do celów niniejszej metody potrzebne jest tylko liczenie ilości żyjącego potomstwa, lecz obecność przerwanych jaj lub martwego potomstwa powinna być także odnotowana.
1.8.7. Śmiertelność
Śmiertelność zwierząt rodzicielskich powinna być rejestrowana najlepiej codziennie, co najmniej w tych samych porach, gdy liczone jest potomstwo.
1.8.8. Inne parametry
Chociaż niniejsza metoda jest przeznaczona zasadniczo do oceny skutków dotyczących rozrodczości, możliwe jest, że inne efekty zostaną wystarczająco określone, aby umożliwić ich statystyczną analizę. Wysoce pożądane są pomiary rozwoju, ponieważ dostarczają one informacji dotyczących możliwych skutków podśmiertelnych, które mogą być bardziej użyteczne niż tylko sam pomiar rozrodczości; pomiar długości zwierząt rodzicielskich (tj. długość ciała, wyłączając kolec odbytowy) jest zalecany na końcu badania. Inne parametry do zmierzenia lub obliczenia obejmują: czas do produkcji pierwszego potomstwa (i dalszego potomstwa), liczbę i rozmiary potomstwa na zwierzę, liczbę poronień, obecność samic lub ephippię oraz wewnętrzny wskaźnik przyrostu populacji.
1.8.9. Częstotliwość analitycznych określeń i pomiarów
Stężenie tlenu, temperatura, wartości twardości i pH powinny być mierzone co najmniej raz tygodniowo, w świeżych i starych roztworach, w kontrolnych i w najwyższych stężeniach badanej substancji.
W czasie trwania badania stężenia substancji użytej w badaniu są określane w regularnych odstępach czasu.
W półstatycznych badaniach, w przypadku gdy oczekuje się, że stężenie substancji pozostanie w zakresie ± 20 % nominału (tj. w zakresie 80-120 % - zob. pkt 1.4 i 1.8.4), jest zalecane, aby jako minimum analizować najniższe i najwyższe stężenia użyte w badaniu świeżo po przygotowaniu i zaraz przed odnowieniem, po jednym w czasie trwania pierwszego tygodnia badania (tj. analizy powinny być dokonane na próbce z tego samego roztworu - gdy świeżo przygotowany i przy odnowieniu). Te określenia powinny być powtarzane przynajmniej w odstępach tygodniowych, w późniejszym czasie.
W odniesieniu do badań, w których nie oczekuje się, że stężenie substancji użytej w badaniu pozostanie w zakresie ± 20 % nominału, konieczne jest analizowanie wszystkich stężeń po świeżym przygotowaniu i przy odnowieniu. Jednakże w odniesieniu do tych badań, w których zmierzone początkowe stężenie nie jest w zakresie ± 20 % nominału, lecz gdy mogą być dostarczone wystarczające dowody wskazujące, że wstępne stężenia są powtarzalne i stabilne (tj. w zakresie 80-120 % stężenia początkowego), oznaczenia chemiczne mogą być zmniejszone w tygodniu 2 i 3 badania do najwyższego i najniższego stężenia badanego. We wszystkich przypadkach oznaczenie stężenia substancji użytej w badaniu przed odnowieniem wymaga jedynie prowadzenia na jednym kopiowanym zbiorniku dla każdego stężenia badanego.
W odniesieniu do badań przepływowych właściwe jest użycie podobnego do opisanego dla badań półstatycznych, sposobu pobierania próbek (lecz pomiar "starych" roztworów nie jest stosowany w tym przypadku). Jednakże wskazane jest zwiększenie ilości pobieranych próbek podczas pierwszego tygodnia (np. trzy zestawy pomiarów) w celu zapewnienia, aby stężenia badane pozostały stałe. W tego typu badaniach jednostka przepływu rozcieńczalnika i substancji badanej powinny być sprawdzane codziennie.
Jeśli istnieją dowody że stężenie substancji badanej jest zadawalająco utrzymywane w granicach ± 20% nominalnego lub zmierzonego początkowego stężenia poprzez badanie, wtedy wyniki oparte są o nominalne lub zmierzone początkowe wartości. Jeśli odchylenie od nominalnego lub zmierzonego stężenia jest większe niż ± 20 %, wyniki muszą być wyrażone w średniej ważonej czasu (zob. dodatek 5).
2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW
Celem niniejszego badania jest ustalenie działania substancji użytej w badaniu na całkowitą liczbę żywego potomstwa wyprodukowanego na zwierzę rodzicielskie, żyjące na koniec badania. Całkowita liczba potomstwa na zwierzę rodzicielskie powinna być obliczona w odniesieniu do każdego badanego zbiornika (tj. kopii). Jeśli w jakimś skopiowanym zbiorniku zwierze rodzicielskie zmarło w czasie trwania badania lub okazało się samcem, to ta kopia jest wyłączona z analizy. Analiza jest wtedy oparta na zmniejszonej ilości kopii.
W odniesieniu do oszacowania LOEC, a stąd NOEC, w odniesieniu do skutków substancji chemicznych dotyczących zdolności rozrodczej, konieczne jest obliczenie średniej zdolności rozrodczej poprzez kopie dla każdego stężenia i złożonego pozostałego standardowego odchylenia poprzez użycie analizy wariancji (ANOVA). Średnia w odniesieniu do każdego stężenia musi być porównana ze średnią doświadczenia kontrolnego, stosując właściwą metodę wielokrotnego porównania. Użyteczne są badania Dunnetta lub Williamsa (14)(15)(16)(17). Koniecznie należy sprawdzić, czy założenie metody ANOVA homogeniczności odchylenia jest utrzymane. Jest zalecane, aby zostało to wykonane w sposób graficzny niż poprzez formalnie znaczące badanie (18); odpowiednią alternatywą jest przeprowadzenie badania Bartletta. Jeśli to założenie nie jest utrzymane, należy rozważyć przekształcenie danych do shomogenizowania wariancji, przed przeprowadzeniem ANOVA albo przeprowadzić ważoną ANOVA. Zakres skutków wykrywalnych przy zastosowaniu ANOVA (tj. najmniej znaczącej różnicy) powinien być obliczony i odnotowany.
Dla oszacowania stężenia, które spowoduje 50% zmniejszenia zdolności rozrodczej (tj. EC50), odpowiednia krzywa, taka jak krzywa logistyczna powinna być dopasowana do danych, używając metodę statystyczną, taką jak najmniejszych kwadratów. Krzywa musi być sparametryzowana, tak aby EC50 i jej błąd standardowy można było obliczyć bezpośrednio. Ułatwiałoby to obliczenie granic ufności w zakresie EC50. O ile istnieją słuszne przyczyny, aby preferować różne poziomy ufności, dwustronne 95 % granice ufności powinny być podawane. Procedura spasowania powinna zasadniczo dostarczać środki oceny znaczenia braku spasowania. Może to być wykonane graficznie lub przez podzielenie pozostałej sumy kwadratów na "brak pasowania" i "czyste składniki błędu", a przeprowadzenie badania istotności w odniesieniu do braku spasowania. Ponieważ obróbka dająca wysoką płodność prawdopodobnie zapewni większe odchylenie w ilości młodych osobników wyprodukowanych niż obróbka dająca niską płodność, muszą być podjęte rozważania do zważenia obserwowanych wartości dla odzwierciedlenia różnych wariancji w różnych opracowywanych grupach (zob. podstawowe informacje w bibliografii (18)).
W analizie danych z końcowego badania obrączkowego (2) spasowano krzywą logistyczną, posługując się następującym modelem, chociaż inny odpowiedni model może być użyty:
gdzie:
Y = całkowita liczba młodych osobników na zwierzę rodzicielskie żyjące na koniec badania (obliczone w odniesieniu każdego zbiornika),
x = stężenie substancji,
c = oczekiwana ilość młodych osobników, gdy x = 0,
x0 = EC50 w populacji,
b = parametr nachylenia.
Niniejszy model jest prawdopodobnie odpowiedni w dużej ilości sytuacji, ale są badania, dla których nie jest właściwy. Ważność powyższego sugerowanego modelu powinna zostać sprawdzona. W niektórych przypadkach model hormesis, w którym niskie stężenia powodują lepsze wyniki może być właściwy (19).
Inne skutki stężeń, takie jak EC10 lub EC20, mogą również być oszacowane, chociaż bardziej pożądane jest użycie różnej parametryzacji modelu, z którego oszacowano EC50.
2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące dane:
2.2.1. Substancja użyta w badaniu:
- charakter fizyczny i stosowne właściwości fizykochemiczne,
- dane identyfikacji chemicznej, włączając czystość.
2.2.2. Gatunki użyte w badaniu:
- klon (czy był typowany genetycznie), dostawca lub źródło (jeśli jest znane) i warunki stosowanej hodowli. Jeśli użyto innego gatunku niż Daphnia powinno to być przedstawione i uzasadnione.
2.2.3. Warunki badania:
- stosowana procedura badania (np. półstatyczna lub przepływowa, objętość, obciążenie w ilości Daphnia na litr),
- czas trwania naświetlania i intensywność światła,
- projekt badania (np. ilość kopii, ilość rodziców na kopię),
- szczegółowe informacje dotyczące kultur stosowanego ośrodka,
- jeśli stosowano, dodatki materiałów organicznych, włączając ich skład, źródło, metodę przygotowania, TOC/COD preparatów podstawowych, oszacowanie wynikłego TOC/COD w ośrodku badanym,
- szczegółowe informacje o karmieniu, włączając ilość (w mg C/Daphnia/dzień) i plan (np. typ karmy, włączając dla glonów właściwą nazwę, gatunek i - jeśli znany szczep - warunki kultur),
- metoda przygotowania roztworów podstawowych i częstotliwość odnawiania (muszą być podane stężenia rozpuszczalników i dyspergantów, jeśli je użyto).
2.2.4. Wyniki:
- wyniki ze wszystkich wstępnych badań dotyczące stabilności substancji badanej,
- nominalne stężenia badane i wyniki wszystkich analiz ustalających stężenia substancji badanej w zbiornikach do badań (zob. przykładowy arkusz danych w dodatku 4); zdolność wyjściową metody i granice oznaczania powinny być również przedstawione,
- jakość wody w zbiornikach do badań (tj. pH, temperatura, stężenie rozpuszczonego tlenu, TOC i/lub COD oraz twardość, tam gdzie to ma zastosowanie) (zob. przykładowy arkusz danych w dodatku 3),
- pełny zapis żyjącego potomstwa każdego zwierzęcia rodzicielskiego (zob. przykładowy arkusz danych w dodatku 3),
- ilość zgonów między zwierzętami rodzicielskimi i data kiedy nastąpiły (zob. przykładowy arkusz danych w dodatku 3),
- współczynnik rozrzutu dla kontroli płodności (oparty na całkowitej ilości żyjącego potomstwa na ilość żywych pod koniec badania zwierząt rodzicielskich),
- wykres całkowitej liczby żyjącego potomstwa na zwierzę rodzicielskie (w odniesieniu do każdej kopi) żyjące na koniec badania w zależności od stężenia substancji badanej,
- najniższy obserwowany skutek stężenia (LOEC) dla rozrodczości, włączając opis zastosowanych procedur statystycznych i wskazanie zakresu skutków jaki jest wykrywany oraz nie obserwowany skutek stężenia (NOEC) dla rozrodczości; gdzie stosowne, należy także przedstawić LOEC/NOEC w odniesieniu do śmiertelności zwierząt rodzicielskich,
- tam gdzie to jest stosowne, ECX w odniesieniu do rozrodczości i przedziałów zaufania oraz wykres dopasowanego modelu użytego do obliczeń, nachylenie krzywej dawka - reakcja i jej błąd standardowy,
- inne obserwowane skutki biologiczne lub pomiary: przedstawienie wszystkich innych biologicznych skutków zaobserwowanych lub pomierzonych (np. rozwój zwierząt rodzicielskich) włączając właściwe uzasadnienie,
- wytłumaczenie wszystkich odchyleń od metody badania.
3. BIBLIOGRAFIA
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 20-21 March 1993.
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring Test of the Daphnia magna Reproduction Test Paris. 1997.
(3) Baird D. J., Barber J., Bradley M. C, Soares A. M. V M. and Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of Daphnia magna Strauss. Ecotoxicology and Environmental Safety, 21, pp. 257-265.
(4) Elendt B. P., (1990). Selenium deficiency in Crustacea; An ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, pp. 25-33.
(5) EPA (1993). Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), USEPA, Cincinnati, Ohio.
(6) Vigano L., (1991) Suitability of commercially available spring waters as standard medium for culturing Daphnia magna. Bull. Environ. Contain. Toxicol., 47, pp. 775-782.
(7) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia P. A. 20 pp.
(8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley M. C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of Daphnia magna Straus for use in ecotoxicological tests; problems and prospects. In: Proceedings of the 1st European Conference on Ecotoxicology. Copenhagen 1988 (H. Lokke, H. Tyle & F. Bro-Rasmussen. Eds.), pp. 144-148.
(9) Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Reproducibility of a life-cycle toxicity test with Daphnia magna. Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, pp. 1-8.
(10) Cowgill U. M. and Milazzo D. P. (1990) The sensitivity of two cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), pp. 185-196.
(11) Korshikov (1990). Pseudokirchneriella subcapitata Hindak, F-1990. Biologice Prace, 36, 209.
(12) Sims I. R., Watson S. and Holmes D. (1993). Toward a standard Daphnia juvenile production test. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, pp. 2053-2058.
(13) Sims I. (1993). Measuring the growth of phytoplankton: the relationship between total organic carbon with three commonly used parameters of algal growth. Arch. Hydrobiol., 128, pp. 459-466.
(14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc, 50, pp. 1096-1121.
(15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, pp. 482-491.
(16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, pp. 103-117.
(17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28, pp. 510-531.
(18) Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression Analysis, second edition, Wiley, N.Y.
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, pp. 93-96.
(20) Wilson E. O. and Bossert, W. H. (1971). A Primer of Population Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.
(21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, pp. 532.
(22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L. and Boyce M. S. (1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, pp. 1156-1166.
DODATEK 1
PRZYGOTOWANIE W PEŁNI ZDEFINIOWANYCH OŚRODKÓW ELENDT M7 I M4
Aklimatyzacja do ośrodków Elendt M7 i M4
Niektóre laboratoria doświadczyły trudności w bezpośrednim przeniesieniu Daphnia do ośrodków M4 (1) i M7. Jednakże pewien sukces został osiągnięty ze stopniową aklimatyzacją, tj. zastępując własny ośrodek najpierw 30 % Elendt, następnie do 60 % Elendt, a następnie do 100 % Elendt. Okresy czasu potrzebne do aklimatyzacji mogą trwać do jednego miesiąca.
PRZYGOTOWANIE
Mikroelementy
Odrębne roztwory podstawowe (I) poszczególnych mikroelementów są uprzednio przygotowywane w wodzie o odpowiedniej czystości, np. dejonizowanej, destylowanej lub odwróconej osmozie. Z tych różnych roztworów podstawowych (I) jest przygotowywany drugi pojedynczy roztwór podstawowy (II), który zawiera wszystkie mikroelementy (połączony roztwór), np.:
| Roztwór podstawowy I (pojedyncze substancje) | Ilość dodana do wody (mg/l) | Stężenie (w stosunku do ośrodka M4) (krotność) | Do przygotowania połączonego roztworu podstawowego II dodać następującą ilość roztworu podstawowego I do wody (ml/l) |
| M4 | M7 | |||
| H3BO3 | 57.190 | 20.000 | 1,0 | 0,25 |
| MnCl2 * 4 H2O | 7.210 | 20.000 | 1,0 | 0,25 |
| LiCl | 6.120 | 20.000 | 1,0 | 0,25 |
| RbCl | 1.420 | 20.000 | 1,0 | 0,25 |
| SrCl2 * 6 H2O | 3.040 | 20.000 | 1,0 | 0,25 |
| NaBr | 320 | 20.000 | 1,0 | 0,25 |
| Na2MoO4 * 2 H2O | 1.260 | 20.000 | 1,0 | 0,25 |
| CuCl2 * 2 H2O | 335 | 20.000 | 1,0 | 0,25 |
| ZnCl2 | 260 | 20.000 | 1,0 | 1,0 |
| CoCl2 * 6 H2O | 200 | 20.000 | 1,0 | 1,0 |
| KI | 65 | 20.000 | 1,0 | 1,0 |
| Na2SeO3 | 43,8 | 20.000 | 1,0 | 1,0 |
| NH4VO3 | 11,5 | 20.000 | 1,0 | 1,0 |
| Na2EDTA * 2 H2O | 5.000 | 2.000 | - | - |
| FeSO4 * 7 H2O | 1.991 | 2.000 | - | - |
| Oba roztwory Na2EDTA i FeSO2 przygotowano oddzielnie, zlane razem i niezwłocznie autoklawowane. To daje: |
| 21 Fe-EDTA roztwór | 1.000 | 20,0 | 5,0 |
Ośrodki M4 i M7
Ośrodki M4 i M7 są przygotowane przy użyciu roztworu podstawowego II, makrosubstancje odżywcze i witaminy, jak następuje:
| Ilość dodana do wody (mg/l) | Stężenie (w stosunku do ośrodka M4) (krotność) | Ilość roztworu podstawowego do przygotowania ośrodka (ml/1) M4 M7 |
| Roztwór podstawowy II połączone mikroelementy | 20 | 50 | 50 |
| Makro-odżywcze roztwory podstawowe (pojedyńcze substancje) |
| CaCl2 * 2 H2O | 293.800 | 1.000 | 1,0 | 1,0 |
| MgSO4 * 7 H2O | 246.600 | 2.000 | 0,5 | 0,5 |
| KCl | 58.000 | 10.000 | 0,1 | 0,1 |
| NaHCO3 | 64.800 | 1.000 | 1,0 | 1,0 |
| Na2SiO3 * 9 H2O | 50.000 | 5.000 | 0,2 | 0,2 |
| NaNO3 | 2.740 | 10.000 | 0,1 | 0,1 |
| KH2PO4 | 1.430 | 10.000 | 0,1 | 0,1 |
| K2HPO4 | 1.840 | 10.000 | 0,1 | 0,1 |
| Roztwór związany witamin | - | 10.000 | 0,1 | 0,1 |
| Podstawowy roztwór związany witamin przygotowano poprzez dodanie 3 witamin do 1 litra wody jak wskazano poniżej: |
| Hydrochlorek tiaminy | 750 | 10.000 | - | - |
| Cyjanocobalamina (B12) | 10 | 10.000 | - | - |
| Biotyna | 7,5 | 10.000 | - | - |
| Wsad połączonych witamin jest przechowywany w zamrożeniu w małych podwielokrotnościach.. Witaminy są dodawane do ośrodka krótko przed użyciem. |
| Uwagi Aby zapobiec wytrącaniu się soli przy przygotowaniu kompletnego ośrodka, dodać podwielokrotności roztworów podstawowych do około 500-800 ml dejonizowanej wody a następnie dopełnić do 1 litra. Pierwszą publikację o ośrodku M4 można znaleźć w, B.P. (1990). Selenium deficiency in Crustacea; an ultrastructural approach to antennal damage in Daphnia magna Straus. Protoplasma, 154, pp. 25-33. |
DODATEK 2
ANALIZA CAŁKOWITEGO WĘGLA ORGANICZNEGO (TOC) I WYKONANIE NOMOGRAMU ZAWARTOŚCI TOC W POKARMIE GLONOWYM
Należy uwzględnić, że zawartość węgla w pokarmie glonowym nie będzie mierzona bezpośrednio, ale z korelacji (tj. nomogramów) z pomiarami zastępczymi, takimi jak ilość komórek glonowych lub absorbancja światła.
TOC powinien być zmierzony raczej wysokotemperaturowym utlenieniem niż ultrafioletem lub metodą nadsiarczanową. (Zob. The Instrumental Determination of Total Organic Carbon, Total Oxygen Demand and Related Determinands 1979, HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).
Dla wykonania nomogramu glony powinny być oddzielone od ośrodka rozwoju poprzez odwirowanie następujące po ponownym utworzeniu zawiesiny w wodzie destylowanej. Pomiar zastępczego parametru i stężenia TOC w każdej potrojonej próbce. Destylowana woda jako ślepa próba powinna być zanalizowana, a stężenie TOC wydedukowane ze stężenia próbki glonów o danym TOC.
Nomogram musi być liniowy ponad wymagany zakres stężenia węgla. Przykłady pokazano poniżej.
Uwaga: Nie powinno to być zastosowane do konwersji; istotne jest, aby laboratorium przygotowało swoje własne nomogramy.
DODATEK 3
PRZYKŁADOWY ARKUSZ DANYCH ZAPISU WYMIANY OŚRODKA, DANYCH FIZYKO-CHEMICZNYCH MONITOROWANIA, KARMIENIA, ROZRODCZOŚCI DAPHNIA I ŚMIERTELNOŚCI DOROSŁYCH
| Doświadczenie nr: | Data rozpoczęcia: | Klon: | Ośrodek: | Typ pokarmu | Substancja badana: | Stężenie nominalne |
| Dzień | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | ||
| Odnawianie ośrodka (takt) | ||||||||||||||||||||||||
| PH(1) | nowy | |||||||||||||||||||||||
| stary | ||||||||||||||||||||||||
| O2 mg/l(1) | nowy | |||||||||||||||||||||||
| stary | ||||||||||||||||||||||||
| Temperatura (oC)(1) | nowy | |||||||||||||||||||||||
| stary | ||||||||||||||||||||||||
| Żywność dostarczona (takt) | ||||||||||||||||||||||||
| Nie żywe potomstwo(2) | Całkowity | |||||||||||||||||||||||
| zbiornik 1 | ||||||||||||||||||||||||
| 2 | ||||||||||||||||||||||||
| 3 | ||||||||||||||||||||||||
| 4 | ||||||||||||||||||||||||
| 5 | ||||||||||||||||||||||||
| 6 | ||||||||||||||||||||||||
| 7 | ||||||||||||||||||||||||
| 8 | ||||||||||||||||||||||||
| 9 | ||||||||||||||||||||||||
| 10 | ||||||||||||||||||||||||
| Całkowity |
| Skumulowana śmiertelność dorosłych(3) |
| (1) Wskazuje, który zbiornik był użyty w doświadczeniu. |
| (2) Zapis śmiertelności wszystkich dorosłych zwierząt jako "M" w stosownym okienku. |
| (3) Zapis przerw wylęgu jako "AB" w stosownym okienku. |
DODATEK 4
PRZYKŁADOWY ARKUSZ DANYCH DOTYCZĄCYCH ZAPISU WYNIKÓW ANALIZY CHEMICZNEJ
a) Pomierzone stężenia
| Stężenie | Próbka tydzień 1 | Próbka tydzień 2 | Próbka tydzień 3 | |||
| Świeża | Stara | Świeża | Stara | Świeża | Stara | |
b) Pomierzone stężenia jako procent nominału
| Stężenie nominalne | Próbka tydzień 1 | Próbka tydzień 2 | Próbka tydzień 3 | |||
| Świeża | Stara | Świeża | Stara | Świeża | Stara | |
DODATEK 5
OBLICZANIE ŚREDNIEJ WAŻONEJ CZASU
Średnia ważona czasu
Podane stężenie substancji badanej może wypaść w okresie czasu między odnawianiami ośrodka, dlatego konieczne jest, aby uważać, które stężenie powinno być wybrane jako reprezentatywne w zakresie stężeń doświadczanych przez dorosłe Daphnia. Wybór powinien być oparty na zarówno rozważaniach biologicznych, jak i statystycznych. Na przykład, jeśli sądzi się, że rozrodczość podlega doświadczalnie głównie maksymalnemu stężeniu, wtedy należy użyć maksymalnego stężenia. Jednakże jeśli skumulowane lub długoterminowe działanie substancji toksycznej jest uznawane za najważniejsze, wtedy bardziej właściwe jest średnie stężenie. W takim przypadku, stosowną średnią do zastosowania jest czasowo ważona średnia stężenia, ponieważ uwzględnia zmiany w chwilowym stężeniu czasowym.
Rysunek 1:
Przykład średniej ważonej czasu
Rysunek 1 wskazuje przykład (uproszczony) badania trwającego siedem dni z odnowieniem ośrodka w dniach 0, 2 i 4.
Cienka zygzakowata linia przedstawia stężenie w każdym punkcie czasu. Spadek stężenia ocenia się jako proces wykładniczy zanikający.
Sześć wykreślonych punktów przedstawia pomierzone stężenia na początku i na końcu czasu każdego odnowienia.
Gruba linia pokazuje położenie czasowo ważonej średniej.
Średnia ważona czasu jest obliczana tak, aby powierzchnia pod średnią ważoną była równa powierzchni pod krzywą stężenia. Obliczenia w odniesieniu do powyższego przykładu zilustrowano w tabeli 1.
Tabela 1
Obliczanie średniej ważonej czasu
| Odnowienie nr | Dni | Conc0 | Conc1 | Ln(Conc0) | Ln(Conc1) | Powierzchnia |
| 1 | 2 | 10,000 | 4,493 | 2,303 | 1,503 | 13,767 |
| 2 | 2 | 11,000 | 6,037 | 2,398 | 1,798 | 16,544 |
| 3 | 3 | 10,000 | 4,066 | 2,303 | 1,403 | 19,781 |
| Suma dni: 7 | Suma powierzchni | 50,091 |
| Średnia TW | 7,156 |
Dni jest ilością dni w okresie odnowienia.
Conc0 jest zmierzonym stężeniem na początku każdego okresu odnowienia.
Conc1 jest zmierzonym stężeniem na końcu każdego okresu odnowienia.
Ln(Conc0) jest naturalnym logarytmem stężenia 0.
Ln(Conc1) jest naturalnym logarytmem stężenia 1.
Powierzchnia jest powierzchnią pod krzywą wykładniczą dla każdego okresu odnowienia. Jest obliczona za pomocą:
Średnia ważona czasu (średnia TW) jest całkowitą powierzchnią podzieloną przez sumę dni.
Oczywiście odniesieniu do badania rozrodczości Daphnia tabela musi być rozszerzona, aby objąć 21 dni.
Jest wiadome, że gdy podejmuje się obserwację tylko na początku i na końcu każdego okresu odnawiania, nie jest możliwe stwierdzenie, że proces spadku jest rzeczywiście gwałtowny. Różne krzywe powstają przy różnych obliczeniach dla "powierzchni". Jednakże wykładniczy proces zanikający nie jest nieprawdopodobny oraz jest prawdopodobnie najlepszą krzywą do zastosowania wobec braku innych informacji.
Wymagana jest jednak uważna praca, jeśli analiza chemiczna nie odkryje jakiejś substancji na końcu okresu odnowienia. O ile możliwe jest oszacowanie jak szybko substancja zniknęła z roztworu, niemożliwe jest uzyskanie rzeczywistej powierzchni pod krzywą, a stąd niemożliwe jest uzyskanie wiarygodnej średniej ważonej czasu.
C.21. MIKROORGANIZMY GLEBOWE: BADANIA PRZEMIAN AZOTU
1. METODA
Ta metoda jest równoważna OECD TG 216 (2000).
1.1 WPROWADZENIE
Ta metoda badawcza opisuje laboratoryjną metodę opracowaną do badania długookresowych skutków jednorazowego wystawienia na działanie środków chemicznych dla aktywności mikroorganizmów glebowych związanej z przemianami azotu. To badanie jest oparte głównie na zaleceniach Europejskiej i Śródziemnomorskiej Organizacji Ochrony Roślin (1). Jednakże inne wytyczne, w tym wytyczne German Biologische Bundesanstalt (2), Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska (3) SETAC (4) i Międzynarodowej Organizacji Normalizacyjnej (5), także zostały wzięte pod uwagę. W czasie warsztatów OECD na temat Selekcji Gleb/ Osadów, mających miejsce w Belgirate we Włoszech w 1995 (6), ustalono ilość i rodzaj gleb stosowanych w tym badaniu. Zalecenia w sprawie pobierania, przenoszenia i przechowywania próbek gleby są oparte na wytycznych metodycznych według ISO (7) i zaleceniach z warsztatów w Belgirate. W ocenie i interpretacji toksycznych właściwości badanej substancji może być wymagane określenie skutków działania dla aktywności mikrobiologicznej, np. jeżeli są wymagane dane na temat potencjalnych efektów ubocznych działania środków ochrony upraw na mikroflorę glebową lub jeżeli spodziewane jest wystawienie mikroorganizmów na działanie związków chemicznych innych niż środki ochrony upraw. Badanie przemiany azotu jest prowadzone w celu określenia wpływu działania takich związków chemicznych na mikroflorę. Jeżeli badane są substancje agrochemiczne (np. środki ochrony upraw, nawozy, związki chemiczne stosowane w leśnictwie), to są prowadzone zarówno badania przemiany azotu, jak i węgla. Jeżeli badane są substancje nieagrochemiczne, wystarczające jest badanie przemian azotu. Jednakże, jeżeli wartości EC50 w badaniach przemiany azotu znajdą się w zakresie, w którym taki związek chemiczny uznaje się za dostępny w handlu inhibitor nitryfikacji (np. nitropiryna), można przeprowadzić badania przemian azotu w celu uzyskania dodatkowych informacji.
Gleby składają się ze składników ożywionych i nieożywionych, które występują w złożonych i heterogenicznych mieszaninach. Mikroorganizmy odgrywają istotną rolę w rozkładzie i przemianie materii organicznej w żyznych glebach, gdzie wiele gatunków przyczynia się do różnych aspektów żyzności gleby. Jakikolwiek długookresowy wpływ na procesy biochemiczne może potencjalnie zakłócić obieg substancji biogennych, a to może zmienić żyzność gleb. Przemiany węgla i azotu występują we wszystkich żyznych glebach. Pomimo że biocenozy bakteryjne różnią się w poszczególnych rodzajach gleb, szlaki przemian są w zasadzie takie same.
Ta opisana metoda badawcza jest przeznaczona do wykrywania długookresowych niepomyślnych skutków działania substancji na procesy przemiany azotu w natlenionych powierzchniowych warstwach gleb. Metoda badawcza pozwala także na określenie skutków działania substancji na przemiany węgla przez mikroflorę glebową. Tworzenie azotanów ma miejsce po degradacji wiązań węgiel-azot. Z tego powodu, jeżeli zostaną stwierdzone jednakowe tempa produkcji azotu w glebie badanej i kontrolnej, istnieje wysokie prawdopodobieństwo, że główne szlaki degradacji węgla są nienaruszone i funkcjonalne. Substrat wybrany do badań (sproszkowana mączka z lucerny) ma korzystny stosunek węgla do azotu (na ogół pomiędzy 12/1 a 16/1). Z tego powodu ograniczony zostaje deficyt węgla podczas badania, a jeżeli w wyniku działania związku chemicznego zostaną uszkodzone biocenozy bakteryjne, mogą się odtworzyć w ciągu 100 dni.
Badania, na podstawie których zastała opracowana ta metoda badawcza, były na początku przeznaczone dla substancji, dla których można było przewidzieć ich ilość będącą w kontakcie z glebą. Tak się dzieje, na przykład, w przypadku środków ochrony upraw, gdzie znana jest ich ilość podawana w terenie. Dla substancji agrochemicznych wystarczające jest badanie dwóch dawek odpowiadających ilości podanej lub przewidywanej. Substancje agrochemiczne mogą być badane jako aktywne dodatki (a.i.) lub jako gotowe produkty. Jednakże badanie nie jest ograniczone do substancji agrochemicznych. Zmieniając zarówno ilości substancji badanej podanej do gleby, jak i sposób interpretacji wyników, badania mogą być stosowane do substancji chemicznych, których przewidywana ilość przechodząca do gleby jest nieznana. Wobec tego dla substancji chemicznych innych niż agrochemiczne określa się wpływ różnych stężeń na przemiany azotu. Wyniki tych badań są wykorzystywane do przygotowania krzywej zależności dawka-odpowiedź i obliczenia wartości ECx, gdzie x zdefiniowano jako % oddziaływania.
1.2. DEFINICJE
Przemiany azotu: to ostateczna degradacja materii organicznej zawierającej azot, w wyniku działania mikroorganizmów, poprzez procesy amonifikacji i nitryfikacji, do odpowiednich nieorganicznych produktów końcowych azotanowych.
ECx (stężenie efektywne): to stężenie substancji badanej w glebie, które powoduje x procentową inhibicję przemian azotu do azotanu.
EC50 (mediana stężenia efektywnego): stężenie substancji w glebie, które powoduje 50-procentową (50 %) inhibicję przemian azotu do azotanu.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.
1.4. ZASADA METODY BADANIA
Przesiana gleba jest wzbogacona sproszkowaną mączką roślinną i albo poddawana działaniu badanej substancji, albo pozostawiona nienaruszona (próbka kontrolna). Jeżeli badane są substancje agrochemiczne, zaleca się stosowanie przynajmniej dwóch stężeń i powinny one być wybrane w odniesieniu do najwyższego stężenia, jakie może występować w terenie. Po 0, 7, 14 dniach i po 28 dniach inkubacji próbki gleby badanej i kontrolnej są ekstrahowane odpowiednim rozpuszczalnikiem i oznaczane są ilości azotanów w ekstraktach. Tempo wytwarzania azotanów w próbce badanej jest porównywane z tempem w próbce kontrolnej i obliczane jest odchylenie procentowe między próbką badaną a kontrolną. Wszystkie badania są prowadzone przynajmniej przez 28 dni. Jeżeli 28 dnia różnice pomiędzy glebami badanymi a kontrolnymi będą równe lub większe niż 25 %, badania są kontynuowane przez maksymalnie 100 dni. Jeżeli badane są substancje nieagrochemiczne, do próbek gleby dodawana jest seria stężeń badanej substancji i mierzone są ilości wytworzonych azotanów w próbce badanej i kontrolnej po 28 dniach inkubacji. Wyniki badań z wieloma stężeniami są analizowane przy użyciu modelu regresyjnego i obliczane są wartości ECx (to jest EC50, EC25 i/lub EC10). Zob. definicje.
1.5. WAŻNOŚĆ BADANIA
Oceny wyników badań substancji agrochemicznych są oparte na stosunkowo niewielkich różnicach (średnia wartość ± 25 %) pomiędzy stężeniem azotanów w kontrolnych i badanych próbkach gleby, więc duże różnice próbek kontrolnych mogą prowadzić do fałszywych wyników. Z tego powodu odchylenia pomiędzy powtórzeniami próbek kontrolnych powinny być mniejsze niż ± 15 %.
1.6. OPIS METODY BADANIA
1.6.1. Aparatura
Stosowane są pojemniki z materiałów chemicznie obojętnych. Powinny one mieć odpowiednią pojemność zgodnie z procedurą stosowaną do inkubacji gleb, to jest inkubacji w masie lub jako serii pojedynczych próbek gleby (zob. sekcja 1.7.1.2). Powinno się zwrócić uwagę na minimalizację utraty wody i umożliwienie wymiany gazów podczas badania (np. pojemniki do badań mogą być przykryte perforowaną folią polietylenową). Jeżeli badane są substancje lotne, powinno się stosować pojemniki umożliwiające uszczelnienie i gazoszczelne. Powinny być takiej wielkości, aby około jednej czwartej ich objętości było wypełnione próbką gleby.
Stosowane jest następujące standardowe wyposażenie laboratoryjne:
- mieszadło: mechaniczna wytrząsarka lub urządzenie podobne,
- wirówka (pojemność 3.000g) lub filtr (stosując papier bezazotanowy),
- instrument o odpowiedniej czułości i powtarzalności do analizy azotanów.
1.6.2. Wybór i ilość rodzajów gleb
Stosowany jest jeden rodzaj gleb. Zalecanymi własnościami gleby są:
- zawartość piasku: nie mniej niż 50 % i nie więcej niż 75 %,
- pH: 5,5-7,5,
- zawartość węgla organicznego: 0,5-1,5 %,
- powinna zostać zmierzona mikrobiologiczna biomasa (8)(9) i jej zawartość węgla powinna wynosić przynajmniej 1 % całkowitej masy węgla organicznego w glebie.
Przeważnie, gleby o takich własnościach stanowią najgorszy przypadek, ponieważ adsorpcja badanej substancji chemicznej jest minimalna, a jej dostępność dla mikroflory maksymalna. Wynika z tego, że badania innych gleb są na ogół niepotrzebne. Jednakże w pewnych okolicznościach, to jest gdy przewiduje się, że substancja badana będzie stosowana głównie w określonych glebach, takich jak kwaśne gleby leśne lub dla substancji chemicznych z ładunkiem elektrostatycznym, może być konieczne zastosowanie dodatkowych rodzajów gleb.
1.6.3. Pobieranie i przechowywanie próbek gleby
1.6.3.1. Pobieranie
Powinny być dostępne szczegółowe informacje na temat historii obszaru, z jakiego została pobrana badana próbka gleby. Szczegółowe informacje powinny obejmować dokładną lokalizację, szatę roślinną, daty poddania działaniu środków ochrony upraw, podanie nawozów organicznych lub nieorganicznych, dodanie materiałów biologicznych lub przypadkowe zanieczyszczenia. Obszar wybrany do pobrania gleby powinien umożliwiać długookresowe użytkowanie. Odpowiednie do tego są stałe pastwiska, pola okresowo zasiewane zbożami (z wyjątkiem kukurydzy) lub gęsto nawożone zielonką. Wybrany obszar do pobierania próbek nie powinien być poddawany działaniu produktów ochrony upraw przez co najmniej jeden rok przed pobraniem próbek. Nie powinno się również podawać żadnych nawozów organicznych przez co najmniej sześć miesięcy. Stosowanie nawozów mineralnych jest dozwolone tylko wtedy, gdy jest zgodne z wymogami upraw i próbki gleby nie powinny być pobierane przez co najmniej trzy miesiące po podaniu nawozu. Należy unikać stosowania gleb poddanych działaniu nawozów o znanym działaniu biologicznym (np. cyjanamid wapnia).
Pobierania próbek należy unikać podczas lub bezpośrednio po dłuższych okresach (przekraczających 30 dni) suszy lub zalania wodą. Dla gleb zaoranych, próbki powinny być pobierane z głębokości od 0 do 20 cm. Dla łąk (pastwisk) lub innych gleb, które nie są orane przez dłuższy czas (przynajmniej jeden sezon wegetacyjny), maksymalna głębokość pobierania próbek może być nieco większa niż 20 cm (np. do 25 cm).
Próbki gleb powinny być transportowane przy użyciu odpowiednich pojemników i w warunkach temperaturowych gwarantujących, że początkowe własności gleby nie zostaną znacząco zmienione.
1.6.3.2. Przechowywanie
Preferuje się stosowanie gleb świeżo zebranych. Jeżeli nie można uniknąć przechowywania w laboratorium, gleba może być przechowywana w ciemności w temperaturze 4 ± 2 oC przez maksymalnie trzy miesiące. Należy zapewnić warunki do napowietrzania gleby podczas jej przechowywania. Jeżeli gleby są pobierane z obszarów, które zamarzają przez przynajmniej trzy miesiące w roku, można wziąć pod uwagę przechowywanie przez sześć miesięcy w temperaturze od minus 18 oC do minus 22 oC. Mikrobiologiczna biomasa przechowywanych gleb jest mierzona przed każdym eksperymentem i zawartość węgla w biomasie powinna wynosić co najmniej 1 % całkowitej zawartości węgla organicznego w glebie (zob. sekcja 1.6.2).
1.6.4. Postępowanie i przygotowanie gleby do badań
1.6.4.1. Inkubacja wstępna
Jeżeli gleba była przechowywana (zob. sekcja 1.6.4.2), zalecana jest wstępna inkubacja przez okres 2-28 dni. Temperatura i zawartość wilgoci w glebie podczas wstępnej inkubacji powinny być podobne do tych, jakie będą w czasie badania (zob. sekcje 1.6.4.2 i 1.7.1.3).
1.6.4.2 Właściwości fizyczno-chemiczne
Z gleby usuwane są ręcznie większe obiekty (to jest kamienie, części roślin itp.) i jest przesiewana na wilgotno, bez nadmiernego wysuszenia do ziarnistości mniejszej lub równej 2 mm. Zawartość wilgoci w próbce gleby powinna zostać zwiększona przy użyciu wody destylowanej lub dejonizowanej do wartości pomiędzy 40 a 60 % maksymalnej pojemności wodnej.
1.6.4.3. Wzbogacanie substratem organicznym
Gleba powinna zostać wzbogacona odpowiednim substratem organicznym, np. mączką części zielonych lucerny (główny komponent to Medicago sativa) ze stosunkiem C/N od 12/1 do 16/1. Zalecany jest dodatek lucerny do gleby w ilości 5 g lucerny na kilogram gleby (sucha masa).
1.6.5. Przygotowanie substancji badanej do podania do gleby
Substancja badana jest zazwyczaj podawana przy użyciu nośnika. Nośnikiem może być woda (dla substancji rozpuszczalnych w wodzie) lub obojętne ciało stałe, takie jak drobnoziarnisty piasek kwarcowy (rozmiar ziaren 0,1-0,5 mm). Należy unikać nośników ciekłych innych niż woda (np. organiczne rozpuszczalniki, takie jak aceton, chloroform), ponieważ mogą niszczyć mikroflorę. Jeżeli stosowanym nośnikiem jest piasek, może on być powleczony badaną substancją rozpuszczoną lub zawieszoną w odpowiednim rozpuszczalniku. W takich przypadkach przed wymieszaniem z glebą należy usunąć rozpuszczalnik przez odparowanie. Dla zachowania optymalnego rozkładu substancji badanej w glebie zaleca się stosowanie 10 g piasku na kilogram gleby (w suchej masie). Próbki kontrolne są poddawane działaniu równoważnej ilości tylko wody i/lub piasku kwarcowego.
Jeżeli badane są lotne substancje chemiczne, powinno się unikać strat podczas poddawania działaniu i należy podjąć próbę zapewnienia jednorodnego rozkładu w glebie (np. badana substancja powinna być nastrzyknięta do gleby w kilku miejscach).
1.6.6. Stężenia stosowane w badaniach
Jeżeli badane są substancje agrochemiczne, powinno się stosować przynajmniej dwa stężenia. Niższe stężenie powinno odzwierciedlać przynajmniej maksymalną, oczekiwaną ilość dochodzącą do gleby w praktycznym zastosowaniu, natomiast wyższe stężenie powinno być wielokrotnością niższego. Stężenia substancji badanej dodanej do gleby są obliczane przy założeniu równomiernego wprowadzenia na głębokość 5 cm i gęstości nasypowej gleby 1,5. Dla substancji agrochemicznych dodawanych bezpośrednio do gleby lub dla substancji chemicznych o przewidywalnej ilości dochodzącej do gleby zalecanymi stężeniami do badań są maksymalne przewidywalne stężenia środowiskowe (Predicted Environmental Concentration - PEC) i ich pięciokrotność. Substancje, dla których przewiduje się kilkakrotne stosowanie w jednym sezonie, powinny być badane przy stężeniach wyliczonych poprzez przemnożenie PEC przez oczekiwaną maksymalną liczbę zastosowań. Wyższe badane stężenie nie powinno jednak przekraczać dziesięciokrotności pojedynczej stosowanej maksymalnej ilości. Jeżeli badane są substancje nieagrochemiczne, stosowane są ciągi geometryczne przynajmniej pięciu stężeń. Badane stężenia powinny pokryć zakres potrzebny do określenia wartości ECx.
1.7. PROWADZENIE BADANIA
1.7.1. Warunki ekspozycji
1.7.1.1. Próbki badane i kontrolne
Jeżeli badane są substancje agrochemiczne, gleba dzielona jest na trzy równe wagowo części. Dwie części są mieszane z nośnikiem zawierającym badany produkt, a trzecia jest mieszana z samym nośnikiem (próbka kontrolna). Zalecane są przynajmniej trzy powtórzenia, zarówno dla gleb poddanych działaniu badanej substancji, jak i niepoddanych. Jeżeli badane są środki niebędące substancjami agrochemicznymi, gleba dzielona jest na sześć równych wagowo części. Pięć próbek jest mieszanych z nośnikiem zawierającym substancję badaną, a szósty mieszany jest z samym nośnikiem. Zaleca się trzy powtórzenia, zarówno dla próbek badanych, jak i próbek kontrolnych. Należy zadbać o zapewnienie homogenicznego rozprowadzenia substancji badanej w poddanych jej działaniu próbkach gleby. Podczas mieszania powinno się uniknąć sklejania lub zbrylania gleby.
1.7.1.2. Inkubacja próbek gleby
Inkubacja może być prowadzona na dwa sposoby: jako zbiorcze próbki każdej gleby poddanej i niepoddanej działaniu badanej substancji albo jako seria pojedynczych podpróbek równej wielkości, poddanych i niepoddanych działaniu badanej substancji. Jednakże jeżeli badane są substancje lotne, badania powinny być prowadzone jedynie na serii pojedynczych podpróbek. Jeżeli gleby są inkubowane w masie, przygotowywane są duże ilości gleby poddanej i niepoddanej działaniu badanej substancji i podpróbki do analizy są pobierane w miarę potrzeby podczas badania. Ilość przygotowana wstępnie do każdego poddania działaniu i do kontroli zależy od wielkości podpróbek, ilości powtórzeń stosowanych do analizy oraz przewidywanej maksymalnej liczby pobieranych próbek. Gleby inkubowane w jednej objętości powinny zostać dokładnie wymieszane przed podziałem na mniejsze próbki. Jeżeli gleby są inkubowane jako seria pojedynczych próbek, każda poddana działaniu substancji badanej i kontrolna masa gleby jest dzielona na wymaganą liczbę podpróbek, które są wykorzystywane w miarę potrzeb. W eksperymentach, gdzie przewiduje się więcej niż dwa próbkowania, powinna być przygotowywana wystarczająca liczba podpróbek do wszystkich powtórzeń i próbkowań. Przynajmniej trzy powtórzone próbki badanej gleby powinny być inkubowane w warunkach napowietrzania (zob. sekcja 1.7.1.1). Podczas wszystkich badań powinny być stosowane odpowiednie pojemniki, z wystarczającą przestrzenią nad powierzchnią próbki, w celu uniknięcia rozwoju warunków beztlenowych. Jeżeli badane są substancje lotne, badanie powinno być prowadzone wyłącznie na serii pojedynczych podpróbek.
1.7.1.3. Warunki badań i czas ich trwania
Badanie jest prowadzone w ciemności w temperaturze pokojowej 20 ± 2 oC. Zawartość wilgoci w próbkach gleb podczas badania powinna wynosić 40-60 % maksymalnej pojemności wodnej (zob. sekcja 1.6.4.2) w przedziale ± 5 %. Można dodawać wodę destylowaną i dejonizowaną, stosownie do potrzeb.
Minimalny czas trwania badań wynosi 28 dni. Jeżeli badane są substancje agrochemiczne, porównywane są szybkości tworzenia azotanów próbki badanej i kontrolnej. Jeżeli 28 dnia wyniki różnią się od siebie o więcej niż 25 %, badanie jest kontynuowane aż do osiągnięcia wartości równej lub mniejszej od 25 % lub przez maksymalnie 100 dni, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Dla substancji niebędących agrochemicznymi badanie przerywa się po 28 dniach. 28 dnia oznaczane są ilości azotanów w próbce badanej i kontrolnej i obliczane są wartości ECx.
1.7.2. Próbkowanie i analiza gleb
1.7.2.1. Harmonogram próbkowania gleb
Jeżeli badane są substancje agrochemiczne, próbki gleby są analizowane pod kątem azotanów w dniach 0, 7, 14 i 28. Jeżeli wymagane jest przedłużenie badania, dalsze pomiary powinny być wykonywane co 14 dni po dniu 28.
Jeżeli badane są substancje nieagrochemiczne, stosuje się przynajmniej pięć stężeń i próbki gleby są analizowane na azotany na początku (dzień 0) i na końcu okresu ekspozycji (28 dzień). Można dodać pomiary pośrednie, np. 7 dnia, jeżeli zostanie to uznane za konieczne. Dane uzyskane 28 dnia są stosowane do wyznaczenia wartości ECx dla substancji chemicznej. Jeżeli jest to pożądane, można wykorzystać wyniki z dnia 0 dla próbek kontrolnych do podania początkowej ilości azotanów w glebie.
1.7.2.2. Analizy próbek gleby
Ilość wytworzonych azotanów w każdej próbce poddanej działaniu badanej substancji i w próbce kontrolnej jest określana przy każdym próbkowaniu. Azotany są ekstrahowane z gleby przez wytrząsanie próbek z odpowiednim rozpuszczalnikiem, to jest 0,1 M roztwór chlorku potasu. Zaleca się 5 ml roztworu KCl na gram suchej masy równoważnej ilości gleby. W celu optymalizacji ekstrakcji pojemnik zawierający glebę i roztwór ekstrakcyjny nie powinien być napełniony bardziej niż do połowy. Mieszanina jest wytrząsana z szybkością 150 rpm przez 60 minut. Mieszanina jest odwirowywana lub filtrowana, a faza ciekła analizowana na azotany. Roztwory wolne od cząstek stałych mogą być przechowywane przed analizą w temperaturze minus 20 ± 5 oC przez okres do sześciu miesięcy.
2. DANE
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW
Jeżeli badane są substancje agrochemiczne, powinna zostać zarejestrowana ilość wytworzonych azotanów w każdej próbce gleby i wartość średnia wszystkich powtórzeń powinna zostać przedstawiona w formie tabeli. Tempa przemian azotu należy zinterpretować przy użyciu odpowiednich i powszechnie akceptowanych metod statystycznych (np. test F, 5 % poziom istotności). Ilości wytworzonych azotanów wyrażane są w mg azotanów/kg suchej masy gleby/dzień. Tempo tworzenia azotanów w każdej próbce poddanej działaniu badanej substancji jest porównywane z próbką kontrolną i obliczane jest odchylenie procentowe od próbki kontrolnej.
Jeżeli badane są substancje niebędące agrochemicznymi, oznaczana jest ilość utworzonych azotanów w każdym powtórzeniu i do oceny wartości ECx przygotowywana jest krzywa zależności dawka-odpowiedź. Ilości azotanów (to jest mg azotanów/kg suchej masy gleby) oznaczone w badanych próbkach po 28 dniach są porównywane z wartościami określonymi dla próbki kontrolnej. Na podstawie tych danych obliczane są wielkości % inhibicji dla każdego badanego stężenia. Te wartości procentowe są wykreślane w zależności od stężenia, a następnie wykorzystuje się procedury statystyczne do obliczenia wartości ECx. Granice przedziału ufności (p = 0,95) dla obliczanej wartości ECx są również określane przy użyciu standardowych procedur (10) (11)(12).
Badane substancje zawierające wysokie ilości azotu mogą przyczyniać się do ilości azotanów wytworzonych w czasie badań. Jeżeli te substancje są badane w dużych stężeniach (np. związki chemiczne przewidziane do wielokrotnego stosowania), w badaniach trzeba uwzględnić odpowiednie próbki kontrolne (tj. gleba i substancja badana, ale bez mączki roślinnej). Dane z tych próbek kontrolnych muszą zostać uwzględnione w obliczeniach ECx.
2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW
Jeżeli są oceniane wyniki badań substancji agrochemicznych i różnica tempa tworzenia azotanów pomiędzy niższym stężeniem (to jest maksymalne przewidywane stężenie) a próbką kontrolną jest mniejsza lub równa 25 %, w którymkolwiek momencie pomiarów po upływie 28 dni, produkt może zostać oceniony, jako niemający długookresowego wpływu na przemiany azotu w glebie. Jeżeli oceniane są wyniki uzyskane dla substancji chemicznych innych niż agrochemiczne, stosowane są wartości EC50, EC25 i/lub EC10.
3. SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Raport z badań musi zawierać następujące informacje:
Pełną identyfikację używanej gleby, w tym:
- położenie geograficzne miejsca (długość, szerokość),
- informacje o historii miejsca (to jest szata roślinna, podawanie środków ochrony upraw, nawożenie, przypadkowe zanieczyszczenia itp.),
- przykłady wykorzystania (gleby uprawne, lasy itp.),
- głębokość pobierania próbek (cm),
- zawartości piasku/iłów/gliny (% suchej masy),
- pH (w wodzie),
- zawartość węgla organicznego (% suchej masy),
- zawartość azotu (% suchej masy),
- początkowe stężenie azotanów (mg azotanów/kg suchej masy),
- zdolność wymiany kationów (mmol/kg),
- mikrobiologiczna biomasa wyrażona jako procent węgla organicznego,
- odniesienia do metod stosowanych do oznaczania wszystkich parametrów,
- wszystkie informacje odnoszące się do pobierania i przechowywania próbek gleby,
- szczegóły wstępnej inkubacji gleby, jeżeli była stosowana. Substancja badana:
- charakter fizyczny i w razie potrzeby własności fizyczno-chemiczne,
- dane identyfikacji chemicznej, w razie potrzeby, w tym wzór strukturalny, czystość (tj. dla środków ochrony upraw procent składnika aktywnego), zawartość azotu.
Substrat:
- źródło substratu,
- skład (to jest mączka z lucerny, mączka z części zielonych lucerny),
- stężenie węgla i azotu (% suchej masy),
- ziarnistość (mm).
Warunki badania:
- informacje szczegółowe dotyczące wzbogacenia gleby substratem organicznym,
- liczba użytych stężeń badanej substancji chemicznej i w razie potrzeby uzasadnienie wybranych stężeń,
- szczegółowe informacje dotyczące podania substancji badanej do gleby,
- temperatura inkubacji,
- zawartość wilgoci na początku i w trakcie badania,
- zastosowana metoda inkubacji gleby (to jest w całej objętości lub w serii pojedynczych próbek),
- liczba powtórzeń,
- liczba poborów próbek,
- metoda zastosowana do ekstrakcji azotanów z gleby. Wyniki:
- procedura analityczna i wyposażenie stosowane do analizy azotanów,
- dane tabelaryczne zawierające pojedyncze i średnie wartości pomiarów azotanów,
- odchylenie pomiędzy powtórzeniami dla próbki badanej i kontrolnej,
- wyjaśnienie poprawek wprowadzonych w obliczeniach, jeżeli dotyczy,
- odchylenie procentowe dla stopnia tworzenia azotanów dla każdego próbkowania lub, w razie potrzeby, EC50 z 95 % granicą poziomu ufności, inne ECx (to jest EC25 lub EC10) z podaniem przedziałów ufności oraz wykres reakcji na dawkę,
- statystyczne opracowanie wyników,
- wszystkie informacje i obserwacje pomocne w interpretacji wyników.
4. BIBLIOGRAFIA
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Bruxelles.
(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality - Determination of Nitrogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the Influence of Chemicals on these Processes. Technical Committee ISO/TC 190/SC 4: Soil Quality - Biological Methods.
(6) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italie, 18-20janvier1995.
(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality - Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory
(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate induced respiration method.
(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation extraction method.
(10) Litchfield, J.T. and Wilcoxon F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
(11) Finney D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.
(12) Finney, D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay Griffin, Weycombe, UK.
C.22. MIKROORGANIZMY GLEBOWE: BADANIE PRZEMIAN WĘGLA
1. METODA
Ta metoda jest równoważna OECD TG 217 (2000).
1.1. WPROWADZENIE
Ta metoda badawcza opisuje metodę laboratoryjną opracowaną do badania potencjalnych długoterminowych skutków jednorazowego poddania działaniu środków ochrony upraw i innych substancji chemicznych dla przemian węgla spowodowanych przez mikroorganizmy glebowe. To badanie jest oparte głównie na zaleceniach Europejskiej i Śródziemnomorskiej Organizacji Ochrony Roślin (1). Jednakże inne wytyczne, w tym wytyczne German Biologische Bundesanstalt (2), Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska (3) i SETAC (4) także zostały wzięte pod uwagę. W czasie warsztatów OECD na temat Selekcji Gleb/Osadów, mających miejsce w Belgirate we Włoszech w 1995 (6), ustalono ilość i rodzaj gleb stosowanych w tym badaniu. Zalecenia w sprawie pobierania, przenoszenia i przechowywania próbek gleby są oparte na wytycznych metodycznych według ISO (6) i zaleceniach z warsztatów w Belgirate.
W ocenie i interpretacji toksycznych właściwości badanej substancji może być wymagane określenie skutków działania dla aktywności mikrobiologicznej np. jeżeli są wymagane dane na temat potencjalnych efektów ubocznych działania środków ochrony upraw dla mikroflory glebowej lub jeżeli spodziewane jest wystawienie mikroorganizmów na działanie związków chemicznych innych niż środki ochrony upraw. Badanie przemian węgla jest prowadzone w celu określenia wpływu działania takich substancji chemicznych na mikroflorę. Jeżeli badane są substancje agrochemiczne (np. środki ochrony upraw, nawozy, związki chemiczne stosowane w leśnictwie), to są prowadzone zarówno badania przemian węgla, jak i azotu. Jeżeli badane są substancje nieagrochemiczne, wystarczające jest badanie przemian azotu. Jednakże jeżeli wartości EC50 w badaniach przemian azotu znajdą się w zakresie, w którym taki związek chemiczny uznaje się za dostępny w handlu inhibitor nitryfikacji (np. nitropiryna), można przeprowadzić badania przemian azotu w celu uzyskania dodatkowych informacji.
Gleby składają się ze składników ożywionych i nieożywionych, które występują w złożonych i heterogenicznych mieszaninach. Mikroorganizmy odgrywają istotną rolę w rozkładzie i przemianie materii organicznej w żyznych glebach, gdzie wiele gatunków przyczynia się do różnych aspektów żyzności gleby. Jakikolwiek długookresowy wpływ na procesy biochemiczne może potencjalnie zakłócić obieg substancji biogennych, a to może zmienić żyzność gleb. Przemiany węgla i azotu występują we wszystkich żyznych glebach. Pomimo że biocenozy bakteryjne różnią się w poszczególnych rodzajach gleb, szlaki przemian są w zasadzie takie same.
Ta metoda badawcza jest przeznaczona do wykrywania długookresowych, niepomyślnych skutków działania substancji dla procesów przemian węgla w napowietrzonych, powierzchniowych warstwach gleb. Badanie jest czułe na zmiany wielkości i aktywności biocenoz bakteryjnych odpowiedzialnych za przemiany węgla, ponieważ poddaje te biocenozy zarówno oddziaływaniu chemicznemu, jak i deficytowi węgla. Stosowana jest piaszczysta gleba o niskiej zawartości materii organicznej. Ta gleba jest poddawana działaniu badanej substancji, a następnie jest inkubowana w warunkach pozwalających na szybki metabolizm mikrobiologiczny. W tych warunkach źródła łatwo dostępnego węgla w glebie są gwałtownie wyczerpywane. Powoduje to deficyt węgla, który zarówno zabija komórki mikrobiologiczne, jak i powoduje przejście w stan uśpienia i/lub zarodnikowania. Jeżeli badanie trwa dłużej niż 28 dni, suma wszystkich tych reakcji może zostać zmierzona w próbkach kontrolnych (niepoddanych działaniu badanej substancji) jako stopniowy spadek aktywnej metabolicznie biomasy mikrobiologicznej (7). Jeżeli biomasa w glebie ubogiej w węgiel, w warunkach badania, jest poddawana działaniu substancji chemicznej, to może ona nie wrócić do takiego samego poziomu, jak próbka kontrolna. Stąd zaburzenia spowodowane przez badaną substancję w dowolnym momencie podczas badania często trwają aż do zakończenia badania.
Badania, na podstawie których zastała opracowana ta metoda badawcza, były na początku przeznaczone dla substancji, dla których można było przewidzieć ich ilość będącą w kontakcie z glebą. Tak się dzieje, na przykład, w przypadku środków ochrony upraw, gdzie znana jest ich ilość podawana w polu. Dla produktów agrochemicznych wystarczające jest badanie dwóch dawek odpowiadających ilości podanej lub przewidywanej. Substancje agrochemiczne mogą być badane jako aktywne dodatki (a.i.) lub jako gotowe produkty. Jednakże badanie nie jest ograniczone do substancji chemicznych o przewidywalnych stężeniach środowiskowych. Zmieniając zarówno ilości substancji badanej podanej do gleby, jak i sposób interpretacji wyników, badania mogą być stosowane do substancji chemicznych, których przewidywana ilość będąca w kontakcie z glebą jest nieznana. Wobec tego dla substancji chemicznych innych niż agrochemiczne określa się wpływ różnych stężeń na przemianę węgla. Wyniki tych badań są wykorzystywane do przygotowania wykresu reakcji na dawkę i obliczenia wartości ECx, gdzie x zdefiniowano jako % oddziaływania.
1.2. DEFINICJE
Przemiany węgla: to degradacja materii organicznej w wyniku działania mikroorganizmów do końcowych, nieorganicznych produktów przemiany, jakim jest ditlenek węgla.
ECx (stężenie efektywne): to stężenie substancji badanej w glebie, które powoduje x-procentową inhibicję przemian węgla do ditlenku węgla.
EC50 (mediana stężenia efektywnego): stężenie substancji w glebie, które powoduje 50-procentową inhibicję przemian węgla do ditlenku węgla.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Brak.
1.4. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Przesiana gleba jest albo poddawana działaniu substancji badanej, albo pozostawiona nienaruszona (próbka kontrolna). Jeżeli badane są substancje agrochemiczne, zaleca się stosowanie przynajmniej dwóch stężeń i powinny one być wybrane w odniesieniu do najwyższego stężenia, jakie może występować w terenie. Po 0, 7, 14 i 28 dniach inkubacji próbki gleb poddanych działaniu badanej substancji i próbki kontrolne są mieszane z glukozą i przez kolejne 12 godzin jest mierzone tempo respiracji indukownej glukozy. Tempo respiracji wyraża się ilością uwolnionego ditlenku węgla (mg dwutlenku węgla/kg suchej gleby/h) lub ilością pochłoniętego tlenu (mg tlenu/kg suchej gleby/h). Średnie tempo respiracji w próbce gleby poddanej działaniu badanej substancji jest porównywane z tempem respiracji dla próbki kontrolnej, a następnie oblicza się odchylenie procentowe próbki badanej od próbki kontrolnej. Wszystkie badania są prowadzone przynajmniej przez 28 dni. Jeżeli 28 dnia różnice pomiędzy glebami badanymi a kontrolnymi będą równe lub większe niż 25 %, badania kontynuuje się w odstępach 14-dniowych przez maksymalnie 100 dni. Jeżeli badane są substancje nieagrochemiczne, do próbek gleby dodawana jest seria stężeń badanej substancji i po 28 dniach mierzone są tempa respiracji indukowanej glukozą (to jest średnia ilość wytworzonego ditlenku węgla lub zużytego tlenu). Wyniki badań z serii stężeń są analizowane przy użyciu modelu regresyjnego i obliczane są wartości ECx (to jest EC50, EC25 i/lub EC10). Zob. definicje.
1.5. WAŻNOŚĆ BADANIA
Oceny wyników badań substancji agrochemicznych są oparte na stosunkowo niewielkich różnicach (średnia wartość ± 25 %) pomiędzy uwolnionym ditlenkiem węgla lub zużytym tlenem w (lub przez) kontrolnych i badanych próbkach gleby, więc duże różnice próbek kontrolnych mogą prowadzić do fałszywych wyników. Z tego powodu odchylenia pomiędzy powtórzeniami próbek kontrolnych powinny być mniejsze niż ± 15 %.
1.6. OPIS METODY BADANIA
1.6.1. Aparatura
Stosowane są pojemniki z materiałów chemicznie obojętnych. Powinny one mieć odpowiednią pojemność zgodnie z procedurą stosowaną do inkubacji gleb, to jest inkubacji w masie lub jako serii pojedynczych próbek gleby (zob. sekcja 1.7.1.2). Powinno się zwrócić uwagę na minimalizację utraty wody i umożliwienie wymiany gazów podczas badania (np. pojemniki do badań mogą być przykryte perforowaną folią polietylenową). Jeżeli badane są substancje lotne, powinno się stosować pojemniki umożliwiające uszczelnienie i gazoszczelne. Powinny być takiej wielkości, aby około jednej czwartej ich objętości było wypełnione próbką gleby.
Dla oznaczenia respiracji indukowanej glukozą, wymagany jest system inkubacyjny oraz przyrządy do pomiaru produkcji ditlenku węgla lub zużycia tlenu. Przykłady takich systemów i urządzeń można znaleźć w literaturze (8)(9)(10)(11).
1.6.2. Wybór i ilość próbek gleb
Stosowany jest jeden rodzaj gleb. Zalecanymi własnościami gleby są:
- zawartość piasku: nie mniej niż 50 % i nie więcej niż 75 %,
- pH: 5,5-7,5,
- zawartość węgla organicznego: 0,5-1,5 %,
- powinna zostać zmierzona mikrobiologiczna biomasa (12)(13) i jej zawartość węgla powinna wynosić przynajmniej 1 % całkowitej masy węgla organicznego w glebie.
Przeważnie gleby o takich własnościach stanowią najgorszy przypadek, ponieważ adsorpcja badanej substancji chemicznej jest minimalna, a jej dostępność dla mikroflory maksymalna. Wynika z tego, że badania innych gleb są na ogół niepotrzebne. Jednakże w pewnych okolicznościach, to jest gdy przewiduje się, że substancja badana będzie stosowana głównie w określonych glebach, takich jak kwaśne gleby leśne lub dla substancji chemicznych z ładunkiem elektrostatycznym, może być konieczne zastosowanie dodatkowych rodzajów gleb.
1.6.3. Pobieranie i przechowywanie próbek gleby
1.6.3.1. Pobieranie
Powinny być dostępne szczegółowe informacje na temat historii obszaru, z jakiego została pobrana badana próbka gleby. Szczegółowe informacje powinny obejmować dokładną lokalizację, szatę roślinną, daty poddania działaniu środków ochrony upraw, podanie nawozów organicznych lub nieorganicznych, dodanie materiałów biologicznych lub przypadkowe zanieczyszczenia. Obszar wybrany do pobrania gleby powinien umożliwiać długookresowe użytkowanie. Odpowiednie do tego są stałe pastwiska, pola okresowo zasiewane zbożami (z wyjątkiem kukurydzy) lub gęsto nawożone zielonką. Wybrany obszar do pobierania próbek nie powinien być poddawany działaniu produktów ochrony upraw przez co najmniej jeden rok przed pobraniem próbek. Nie powinno się również podawać żadnych nawozów organicznych przez co najmniej sześć miesięcy. Stosowanie nawozów mineralnych jest dozwolone tylko wtedy, gdy jest zgodne z wymogami upraw i próbki gleby nie powinny być pobierane przez co najmniej trzy miesiące po podaniu nawozu. Należy unikać stosowania gleb poddanych działaniu nawozów o znanym działaniu biologicznym (np. cyjanamid wapnia).
Pobierania próbek należy unikać podczas lub bezpośrednio po dłuższych okresach (przekraczających 30 dni) suszy lub zalania wodą. Dla gleb zaoranych próbki powinny być pobierane z głębokości od 0 do 20 cm. Dla łąk (pastwisk) lub innych gleb, które nie są orane przez dłuższy czas (przynajmniej jeden sezon wegetacyjny), maksymalna głębokość pobierania próbek może być nieco większa niż 20 cm (np. do 25 cm). Próbki gleb powinny być transportowane przy użyciu odpowiednich pojemników i w warunkach temperaturowych gwarantujących, że początkowe własności gleby nie zostaną znacząco zmienione.
1.6.3.2. Przechowywanie
Preferuje się stosowanie gleb świeżo zebranych. Jeżeli nie można uniknąć przechowywania w laboratorium, gleba może być przechowywana w ciemności w temperaturze 4 ± 2 oC przez maksymalnie trzy miesiące. Należy zapewnić warunki do napowietrzania gleby podczas jej przechowywania. Jeżeli gleby są pobierane z obszarów, które zamarzają przez przynajmniej trzy miesiące w roku, można wziąć pod uwagę przechowywanie przez sześć miesięcy w temperaturze minus 18 oC. Mikrobiologiczna biomasa przechowywanych gleb jest mierzona przed każdym eksperymentem i zawartość węgla w biomasie powinna wynosić co najmniej 1 % całkowitej zawartości węgla organicznego w glebie (zob. sekcja 1.6.2).
1.6.4. Postępowanie i przygotowanie gleby do badań
1.6.4.1. Inkubacja wstępna
Jeżeli gleba była przechowywana (zob. sekcje 1.6.4.2 i 1.7.1.3), zalecana jest wstępna inkubacja przez okres 2- 28 dni. Temperatura i zawartość wilgoci w glebie podczas wstępnej inkubacji powinny być podobne do tych, jakie będą stosowane w czasie badania (zob. sekcje 1.6.4.2 i 1.7.1.3).
1.6.4.2. Właściwości fizyczno-chemiczne
Z gleby usuwane są ręcznie większe obiekty (to jest kamienie, części roślin itp.) i jest ona przesiewana na wilgotno, bez nadmiernego wysuszenia do ziarnistości mniejszej lub równej 2 mm. Zawartość wilgoci w próbce gleby powinna zostać zwiększona przy użyciu wody destylowanej lub dejonizowanej do wartości pomiędzy 40 a 60 % maksymalnej zdolności utrzymywania wody.
1.6.5. Przygotowanie substancji badanej do podania do gleby
Substancja badana jest zazwyczaj podawana przy użyciu nośnika. Nośnikiem może być woda (dla substancji rozpuszczalnych w wodzie) lub obojętne ciało stałe, takie jak drobnoziarnisty piasek kwarcowy (rozmiar ziaren 0,1-0,5 mm). Należy unikać nośników ciekłych innych niż woda (np. organiczne rozpuszczalniki, takie jak aceton, chloroform), ponieważ mogą niszczyć mikroflorę. Jeżeli stosowanym nośnikiem jest piasek, może on być powleczony badaną substancją rozpuszczoną lub zawieszoną w odpowiednim rozpuszczalniku. W takich przypadkach przed wymieszaniem z glebą należy usunąć rozpuszczalnik przez odparowanie. Dla zachowania optymalnego rozkładu substancji badanej w glebie, zaleca się stosowanie 10 g piasku na kilogram gleby (w suchej masie). Próbki kontrolne są poddawane działaniu równoważnej ilości tylko wody i/lub piasku kwarcowego.
Jeżeli badane są lotne substancje chemiczne, powinno się unikać strat podczas poddawania działaniu i należy podjąć próbę zapewnienia jednorodnego rozkładu w glebie (np. badana substancja powinna być nastrzyknięta do gleby w kilku miejscach).
1.6.6. Stężenia stosowane w badaniach
Jeżeli badane są środki ochrony upraw lub inne substancje chemiczne o przewidywalnym stężeniu środowiskowym, powinno się stosować przynajmniej dwa stężenia. Niższe stężenie powinno odzwierciedlać przynajmniej maksymalną, oczekiwaną ilość dochodzącą do gleby w praktycznym zastosowaniu, natomiast wyższe stężenie powinno być wielokrotnością niższego. Stężenia substancji badanej dodanej do gleby są obliczane przy założeniu równomiernego wprowadzenia na głębokość 5 cm i gęstości nasypowej gleby 1,5. Dla substancji agrochemicznych dodawanych bezpośrednio do gleby lub dla substancji chemicznych, o przewidywalnej ilości dochodzącej do gleby, zalecanymi stężeniami do badań są maksymalne przewidywalne stężenia środowiskowe (Predicted Environmental Concentration - PEC) i ich pięciokrotność. Substancje, dla których przewiduje się kilkakrotne stosowanie w jednym sezonie, powinny być badane przy stężeniach wyliczonych poprzez przemnożenie PEC przez oczekiwaną maksymalną liczbę zastosowań. Wyższe badane stężenie nie powinno jednak przekraczać dziesięciokrotności pojedynczej stosowanej maksymalnej ilości.
Jeżeli badane są substancje nieagrochemiczne, stosowane są ciągi geometryczne przynajmniej pięciu stężeń. Badane stężenia powinny pokryć zakres potrzebny do określenia wartości ECx.
1.7. PROWADZENIE BADANIA
1.7.1. Warunki ekspozycji
1.7.1.1. Próbki badane i kontrolne
Jeżeli badane są substancje agrochemiczne, gleba dzielona jest na trzy równe wagowo części. Dwie części są mieszane z nośnikiem zawierającym badany produkt, a trzecia jest mieszana z samym nośnikiem (próbka kontrolna). Zalecane są przynajmniej trzy powtórzenia, zarówno dla gleb poddanych działaniu badanej substancji, jak i niepoddanych. Jeżeli badane są środki niebędące substancjami agrochemicznymi, gleba dzielona jest na sześć równych wagowo części. Pięć próbek jest mieszanych z nośnikiem zawierającym substancję badaną, a szósty mieszany jest z samym nośnikiem. Zaleca się trzy powtórzenia, zarówno dla próbek badanych, jak i próbek kontrolnych. Należy zadbać o zapewnienie homogenicznego rozprowadzenia substancji badanej w poddanych jej działaniu próbkach gleby. Podczas mieszania powinno się uniknąć sklejania lub zbrylania gleby.
1.7.1.2. Inkubacja próbek gleby
Inkubacja może być prowadzona na dwa sposoby: jako zbiorcze próbki każdej gleby poddanej i niepoddanej działaniu badanej substancji, albo jako seria pojedynczych podpróbek równej wielkości, poddanych i niepoddanych działaniu badanej substancji. Jednakże jeżeli badane są substancje lotne, badania powinny być prowadzone jedynie na serii pojedynczych podpróbek. Jeżeli gleby są inkubowane w masie, przygotowywane są duże ilości gleby poddanej i niepoddanej działaniu badanej substancji i podpróbki do analizy są pobierane w miarę potrzeby podczas badania. Ilość przygotowana wstępnie do każdego poddania działaniu i do kontroli zależy od wielkości podpróbek, ilości powtórzeń stosowanych do analizy oraz przewidywanej maksymalnej liczby pobieranych próbek. Gleby inkubowane w jednej objętości powinny zostać dokładnie wymieszane przed podziałem na mniejsze próbki. Jeżeli gleby są inkubowane jako seria pojedynczych próbek, każda poddana działaniu substancji badanej i kontrolna masa gleby jest dzielona na wymaganą liczbę podpróbek, które są wykorzystywane w miarę potrzeb. W eksperymentach, gdzie przewiduje się więcej niż dwa próbkowania, powinna być przygotowywana wystarczająca liczba podpróbek do wszystkich powtórzeń i próbkowań. Przynajmniej trzy powtórzone próbki badanej gleby powinny być inkubowane w warunkach napowietrzania (zob. sekcja 1.7.1.1). Podczas wszystkich badań powinny być stosowane odpowiednie pojemniki, z wystarczającą przestrzenią nad powierzchnią próbki, w celu uniknięcia rozwoju warunków beztlenowych. Jeżeli badane są substancje lotne, badanie powinno być prowadzone wyłącznie na serii pojedynczych podpróbek.
1.7.1.3. Warunki badań i czas ich trwania
Badanie jest prowadzone w ciemności w temperaturze pokojowej 20 ± 2 oC. Zawartość wilgoci w próbkach gleb podczas badania powinna wynosić 40-60 % maksymalnej pojemności wodnej (zob. sekcja 1.6.4.2) w przedziale ± 5 %. Można dodawać wodę destylowaną i dejonizowaną, stosownie do potrzeb.
Minimalny czas trwania badań wynosi 28 dni. Jeżeli badane są substancje agrochemiczne, porównywane są ilości wydzielonego ditlenku węgla lub zużytego tlenu dla próbki badanej i kontrolnej. Jeżeli 28 dnia wyniki różnią się od siebie o więcej niż 25 %, badanie jest kontynuowane aż do osiągnięcia wartości równej lub mniejszej od 25 % lub przez maksymalnie 100 dni, w zależności od tego, co nastąpi wcześniej. Jeżeli badane są substancje niebędące środkami agrochemicznymi, badanie przerywa się po 28 dniach. 28 dnia oznaczane są ilości wydzielonego ditlenku węgla lub zużytego tlenu w próbce badanej i kontrolnej i obliczane są wartości ECx.
1.7.2. Próbkowanie i analiza gleb
1.7.2.1. Harmonogram próbkowania gleb
Jeżeli badane są substancje agrochemiczne, próbki gleby są analizowane pod kątem oddychania pod wpływem glukozy w dniach 0, 7, 14 i 28. Jeżeli wymagane jest przedłużenie badania, dalsze pomiary powinny być wykonywane co 14 dni po dniu 28.
Jeżeli badane są substancje nieagrochemiczne, stosuje się przynajmniej pięć stężeń i próbki gleby są analizowane na respirację wywołaną glukozą na początku (dzień 0) i na końcu okresu ekspozycji (28 dzień). Można dodać pomiary pośrednie, np. 7 dnia, jeżeli zostanie to uznane za konieczne. Dane uzyskane 28 dnia są stosowane do wyznaczenia wartości ECx dla substancji chemicznej. Jeżeli jest to pożądane, można wykorzystać wyniki z dnia 0 próbek kontrolnych do oszacowania początkowych ilości aktywnej metabolicznie biomasy mikrobiologicznej w glebie (12).
1.7.2.2. Pomiary tempa respiracji indukowanej glukozą
Tempo respiracji indukowanej glukozą w każdej próbce badanej i kontrolnej jest określane przy każdorazowym próbkowaniu. Próbki gleby są mieszane z odpowiednią ilością glukozy w celu wywołania warunków do natychmiastowej reakcji respiracyjnej. Ilość glukozy potrzebnej do wywołania maksymalnej reakcji respiracyjnej dla danej gleby może zostać wyznaczona we wstępnym badaniu z wykorzystaniem serii stężeń glukozy (14). Jednakże dla piaszczystych gleb zawierających 0,5-1,5 % węgla organicznego na ogół wystarczające jest zastosowanie 2.000 mg do 2.000 mg glukozy na kg suchej masy gleby. Glukoza może zostać roztarta z czystym piaskiem kwarcowym (10 g piasku na kg suchej masy gleby) i homogenicznie wymieszana z glebą.
Próbki gleby wzbogaconej glukozą są inkubowane w aparaturze odpowiedniej do mierzenia tempa respiracji albo w sposób ciągły, albo co godzinę bądź co dwie godziny (zob. sekcja 1.6.1) w temperaturze 20 ± 2 oC. Uwalniany ditlenek węgla lub zużyty tlen są mierzone przez kolejnych 12 godzin, a pomiary powinny rozpocząć się tak szybko, jak to możliwe, to jest w ciągu 1-2 godzin od dodania glukozy. Określa się całkowite ilości wydzielonego ditlenku węgla lub pochłoniętego tlenu w ciągu 12 godzin i wyznacza się średnią wartość tempa respiracji.
2. DANE
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW
Jeżeli badane są substancje agrochemiczne, powinien zostać zapisany uwolniony ditlenek węgla lub pochłonięty tlen z każdej próbki gleby i wartość średnia wszystkich powtórzeń powinna zostać przedstawiona w formie tabeli. Wyniki powinny należy zinterpretować przy użyciu odpowiednich i powszechnie akceptowanych metod statystycznych (np. test F, 5 % poziom istotności). Tempo respiracji indukowanej glukozą jest wyrażane w mg ditlenku węgla/kg suchej masy gleby/h lub mg tlenu/kg suchej masy gleby/ h. Średnie tempo tworzenia się ditlenku węgla lub średnie tempo pochłaniania tlenu dla każdej badanej próbki jest porównywane z próbką kontrolną i obliczane jest odchylenie procentowe od próbki kontrolnej.
Jeżeli badane są substancje nieagrochemiczne, oznacza się ilość wydzielonego ditlenku węgla lub pochłoniętego tlenu przez każdą próbkę i do oceny wartości ECx przygotowywana jest krzywa zależności dawka-reakcja. Tempo respiracji indukowanej glukozą (to jest mg ditlenku węgla/kg suchej masy gleby/h lub mg tlenu/kg suchej masy gleby/h) określone w badanych próbkach jest porównywane z wartością określoną dla próbki kontrolnej. Na podstawie tych danych obliczane są wielkości % inhibicji dla każdego badanego stężenia. Te wartości procentowe są wykreślane w zależności od stężenia, a następnie wykorzystuje się procedury statystyczne do obliczenia wartości ECx. Granice przedziału ufności (p = 0,95) dla obliczanej wartości ECx są również określane przy użyciu standardowych procedur (15)(16)(17).
2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW
Jeżeli są oceniane wyniki badań substancji agrochemicznych i różnica między tempem respiracji przy niższym stężeniu (to jest maksymalne przewidywane stężenie) a tempem respiracji próbki kontrolnej jest mniejsza lub równa 25 %, w którymkolwiek momencie pomiarów po upływie 28 dni, produkt może zostać oceniony, jako niemający długookresowego wpływu na przemiany węgla w glebie. Jeżeli oceniane są wyniki uzyskane dla substancji chemicznych innych niż agrochemiczne, stosowane są wartości EC50, EC25 i/lub EC10.
3. SPRAWOZDAWCZOŚĆ
RAPORT Z BADAŃ Raport z badań musi zawierać następujące informacje:
Pełną identyfikację używanej gleby, w tym:
- położenie geograficzne miejsca (długość, szerokość),
- informacje o historii miejsca (to jest szata roślinna, podawanie środków ochrony upraw, nawożenie, przypadkowe zanieczyszczenia itp.),
- przykłady wykorzystania (gleby uprawne, lasy itp.),
- głębokość pobierania próbek (cm),
- zawartości piasku/iłów/gliny (% suchej masy),
- pH (w wodzie),
- zawartość węgla organicznego (% suchej masy),
- zawartość azotu (% suchej masy),
- zdolność wymiany kationów (mmol/kg),
- początkowa mikrobiologiczna biomasa wyrażona jako procent węgla organicznego,
- odniesienia do metod stosowanych do oznaczania wszystkich parametrów,
- wszystkie informacje odnoszące się do pobierania i przechowywania próbek gleby,
- szczegóły wstępnej inkubacji gleby jeżeli była stosowana. Substancja badana:
- charakter fizyczny i w razie potrzeby własności fizyczno-chemiczne,
- dane identyfikacji chemicznej, w razie potrzeby, w tym wzór strukturalny, czystość (t.j. dla środków ochrony upraw procent składnika aktywnego), zawartość azotu.
Warunki badania:
- informacje szczegółowe dotyczące wzbogacenia gleby substratem organicznym,
- liczba użytych stężeń badanej substancji chemicznej i w razie potrzeby uzasadnienie wybranych stężeń,
- szczegółowe informacje dotyczące podania substancji badanej do gleby,
- temperatura inkubacji,
- zawartość wilgoci na początku i w trakcie badania,
- zastosowana metoda inkubacji gleby (to jest w całej objętości lub w serii pojedynczych próbek),
- liczba powtórzeń,
- czas poborów próbek, Wyniki:
- metoda i wyposażenie stosowane do pomiaru szybkości oddychania,
- dane tabelaryczne zawierające pojedyncze i średnie wartości ilości ditlenku węgla lub tlenu,
- odchylenie pomiędzy powtórzeniami dla próbki badanej i kontrolnej,
- wyjaśnienie poprawek wprowadzonych w obliczeniach, jeżeli dotyczy,
- odchylenie procentowe dla stopnia oddychania pod wpływem glukozy dla każdego próbkowania lub, w razie potrzeby, EC50 z 95 % granicą przedziału ufności, inne ECx (to jest EC25 lub EC10) z podaniem przedziałów ufności oraz wykres reakcji na dawkę,
- statystyczne opracowanie wyników, w razie potrzeby,
- wszystkie informacje i obserwacje pomocne w interpretacji wyników.
4. BIBLIOGRAFIA
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2nd eds., 1990).
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Guidelines; Proposed rule. September 28, 1987.
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M.R. Lynch, Pub. SETAC-Europe, Brussels.
(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality - Sampling. Guidance on the collection, handling and storage of soil for the grade of aerobic microbial processes in the laboratory.
(7) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and Storage of Soils for Pesticide Experiments, in "Pesticide Effects on Soil Microflora.. Eds. L. Somerville and M.P. Greaves, Chap. 3: 45-60.
(8) Anderson, J.P.E. (1982). Soil respiration, in "Methods of Soil Analysis - Part 2: Chemical and Microbiological Properties. Agronomy Monograph No 9. Eds. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Keeney. 41: 831-871.
(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality - Guidance on Laboratory Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.
(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality - Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
(11) Heinemeye, r O., Insam, H., Kaiser, E.A, and Walenzik, G. (1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.
(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrateinduced oddychania method.
(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigationextraction method.
(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einfluß von Glukosemenge auf die Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegemiber Pflanzenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (Influence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbicide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., Braunschweig, 38: 113-120.
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, 99-113.
(16) Finney, D.J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, London and New-York.
(17) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in biological Assay. Griffin, Weycombe, UK.
C.23. PRZEMIANY W GLEBIE W WARUNKACH NATLENIENIA I BEZTLENOWYCH
1. METODA
Ta metoda badawcza jest równoważna OECD TG 307 (2002).
1.1. WPROWADZENIE
Ta metoda badawcza jest oparta na istniejących wytycznych (1)(2)(3)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Metoda opisana w tej metodzie badawczej jest przeznaczona do oceny przemian substancji chemicznych w glebie, w warunkach natlenienia i beztlenowych. Eksperymenty są prowadzone w celu wyznaczenia: (i) szybkości przemian substancji badanej; oraz (ii) charakteru i szybkości tworzenia oraz zanikania produktów przemian, których działaniu mogą zostać poddane organizmy w glebie. Takie badania są wymagane dla substancji chemicznych, które są bezpośrednio podawane do gleby lub mogą przeniknąć do środowiska glebowego. Wyniki takich badań laboratoryjnych mogą być także wykorzystane do opracowania protokołów pobierania próbek i analizy dla związanych badań w terenie.
Badania w warunkach tlenowych i beztlenowych jednego rodzaju gleby na ogół wystarczają do oceny szlaków przemian (8)(10)(11). Tempa przemian powinny być określone przy użyciu co najmniej trzech dodatkowych rodzajów gleb (8)(10).
W czasie warsztatów OECD w sprawie wyboru gleb i osadów, które odbyły się w Belgirate we Włoszech w 1995 roku (10), uzgodniono, w szczególności, rodzaje gleb do stosowania w tym badaniu i ich liczbę. Rodzaje badanych gleb powinny być reprezentacyjne dla warunków środowiskowych, w których substancja będzie stosowana lub uwalniania. Na przykład związki chemiczne, które mogą być uwalniane w klimacie subtropikalnym lub tropikalnym, powinny być badane przy pomocy ferrazoli lub nitrozoli (system FAO). Uczestnicy warsztatów podali również zalecenia dotyczące pobierania, przenoszenia i przechowywania próbek gleby na podstawie wytycznych ISO (15). W tej metodzie uwzględniono także gleby pod mokre uprawy ryżu.
1.2. DEFINICJE
Substancja badana: jakakolwiek substancja, czy to związek macierzysty czy też odnośne produkty przemian.
Produkty przemian: wszystkie substancje powstałe w wyniku biotycznych lub abiotycznych reakcji przemian substancji badanej, w tym CO2, i produkty w pozostałościach związanych.
Pozostałości związane: "Pozostałości związane" stanowią związki w glebie, roślinach lub zwierzętach, które pozostają po ekstrakcji w materiale macierzystym w postaci substancji macierzystej lub jej metabolitu(-ów)/ produktów przemiany. Metoda ekstrakcji nie może zmieniać w sposób znaczący samych związków lub struktury materiału macierzystego. Charakter wiązania można częściowo wyjaśnić przez metody ekstrakcji zmieniające materiał macierzysty i wyspecjalizowane techniki analityczne. Do dziś, na przykład, zostały w ten sposób zidentyfikowane wiązania kowalencyjne zjonizowane i sorpcyjne, a także pułapkowanie. Na ogół tworzenie się pozostałości związanych znacząco redukuje biodostępność i bioprzyswajalność (12) (zmodyfikowane w stosunku do IUPAC 1984 (13)).
Przemiany tlenowe: reakcje zachodzące w obecności tlenu cząsteczkowego (14).
Przemiany beztlenowe: reakcje zachodzące z wykluczeniem tlenu cząsteczkowego (14).
Gleba: jest mieszaniną składników chemicznych mineralnych i organicznych, te drugie zawierają związki o wysokiej zawartości węgla i azotu, i o wysokiej masie atomowej, ożywioną przez drobne (najczęściej mikro-) organizmy. Gleba może występować w dwóch stanach:
a) niezakłóconym, tak jak się rozwijała z upływem czasu, z charakterystycznymi warstwami różnych rodzajów gleb;
b) zakłóconym, jak to ma na ogół miejsce na polach uprawnych lub kiedy próbki są pobierane przez kopanie i stosowane w tej metodzie badawczej (14).
Mineralizacja: to całkowita degradacja związku organicznego do CO2 i H2O w warunkach tlenowych lub CH4, CO2 i H2O w warunkach beztlenowych. W kontekście tej metody badawczej, w której stosowane są związki znakowane 14C, mineralizacja oznacza ekstensywną degradację, podczas której znaczone atomy węgla są utleniane z wydzieleniem odpowiedniej ilości 14CO2 (14).
Okres półtrwania: t0,5 to czas potrzebny do przemiany 50 % substancji badanej, jeżeli przemiana może zostać opisana kinetyką pierwszego rzędu; nie zależy od stężenia.
DT50 (czas zaniku 50): czas, w którym stężenie substancji badanej zmniejsza się o 50 %; ta wielkość różni się od okresu półtrwania t0,5, jeżeli przemiana nie może zostać opisana kinetyką pierwszego rzędu.
DT75 (czas zaniku 75): czas, w jakim stężenie substancji badanej zmniejsza się o 75 %.
DT90 (czas zaniku 90): czas, w jakim stężenie substancji badanej zmniejsza się o 90 %.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Substancje odniesienia powinny być stosowane do charakteryzacji i/lub identyfikacji produktów przemian przy pomocy metod spektroskopowych i chromatograficznych.
1.4. ZASTOSOWANIE BADANIA
Metoda może być stosowana do wszystkich substancji chemicznych (nieznakowanych lub znakowanych izotopowo), dla których jest dostępna metoda analityczna o wystarczającej czułości i dokładności. Może być stosowana do związków słabo lotnych, nielotnych, rozpuszczalnych lub nierozpuszczalnych w wodzie. Badanie nie powinno być stosowane do substancji chemicznych o wysokiej lotności z gleby (np. fumigantów, rozpuszczalników organicznych), które nie mogą utrzymać się w glebie w warunkach eksperymentalnych badania.
1.5. INFORMACJE O SUBSTANCJI BADANEJ
Nieznakowane i znakowane izotopowo substancje badane mogą być stosowane do pomiaru tempa przemian. Materiał znakowany jest wymagany do badania szlaków przemian i do określenia bilansu masowego. Zaleca się znakowanie izotopem 14C, ale inne izotopy, takie jak 13C, 15N, 3H, 32P, także mogą być użyteczne. Na tyle, na ile jest to możliwe, znacznik powinien być umiejscowiony w najbardziej stabilnej części (częściach) cząsteczki(1). Czystość substancji badanej powinna wynosić przynajmniej 95 %.
Przed przystąpieniem do badań przemian tlenowych i beztlenowych w glebie, powinny być dostępne następujące informacje na temat substancji badanej:
a) rozpuszczalność w wodzie (metoda A.6),
b) rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych,
c) prężność pary (metoda A.4) i stała proporcjonalności w prawie Henry'ego,
d) współczynnik podziału n-oktanol/woda (metoda A.8),
e) stabilność chemiczna w ciemności (hydroliza) (metoda C.7),
f) pKa, jeżeli molekuła jest podatna na protonowanie lub deprotonowanie (wytyczne OECD 112) (16).
Inne przydatne informacje mogą obejmować dane na temat toksyczności substancji badanej dla mikroorganizmów w glebie (metody badawcze C.21 i C.22) (16).
Powinny być dostępne metody analityczne (w tym metody ekstrakcji i czyszczenia) do oznaczania ilościowego i identyfikacji substancji badanej i jej produktów przemian.
1.6. ZASADA METODY BADAWCZEJ
Próbki gleby są poddawane działaniu substancji badanej i inkubowane w ciemności w kolbie biometrycznej lub w układzie przepływowym, w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych (w stałej temperaturze i wilgotności gleby). W odpowiednich odstępach czasu próbki gleby są ekstrahowane i analizowane pod kątem obecności substancji macierzystej i produktów przemian. Produkty lotne są także pobierane do analizy przy użyciu odpowiednich urządzeń do ich absorpcji. Stosując materiał znakowany izotopem 14C, można mierzyć różne stopnie mineralizacji substancji badanej poprzez pułapkowanie wydzielonego 14CO2 i można określić bilans masowy, obejmujący tworzenie pozostałości związanych w glebie.
1.7. KRYTERIA JAKOŚCIOWE
1.7.1. Odzysk
Ekstrakcja i analiza przynajmniej podwójnych próbek gleby natychmiast po dodaniu substancji badanej daje, pierwsze wskazanie co do powtarzalności metody analitycznej i jednorodności procedury podawania substancji badanej. Odzysk dla następnych etapów eksperymentu jest podawany przez odnoszący się do nich bilans masowy. Odzysk powinien mieścić się w zakresie 90-110 % dla znakowanych substancji chemicznych (8) i 70-110 % dla nieznakowanych substancji chemicznych (3).
1.7.2. Powtarzalność i czułość metody analitycznej
Powtarzalność metody analitycznej (wyłączając sprawność początkowej ekstrakcji) dla oznaczenia ilościowego substancji badanej i produktów przemian może zostać sprawdzona przez powtórną analizę tego samego ekstraktu z gleby inkubowanej wystarczająco długo, aby doszło do wytworzenia produktów przemian.
Granica wykrywalności (LOD) metody analitycznej dla badanej substancji i produktów przemian powinna wynosić co najmniej 0,01 mg × kg-1 gleby (dla substancji badanej) lub 1 % podanej dawki, w zależności od tego, co jest niższe. Granica kwantyfikacji (LOQ) także powinna zostać określona.
1.7.3. Dokładność danych przemian
Analiza regresji stężeń substancji badanej w funkcji czasu daje odpowiednie informacje o rzetelności krzywej przemian i pozwala na obliczenie granic przedziału ufności dla okresu półtrwania (w przypadku kinetyki pseudo pierwszorzędowej) lub wartości DT50 oraz w razie potrzeby wartości DT75 i DT90.
1.8. OPIS METODY
1.8.1. Wyposażenie i odczynniki
Układ inkubacyjny składa się ze statycznych systemów zamkniętych lub odpowiednich systemów przepływowych (7)(17). Przykłady odpowiedniej aparatury do przepływowej i kolby biometrycznej do inkubacji gleby są przedstawione odpowiednio na rys. 1 i 2. Obydwa systemy inkubacyjne mają swoje zalety i ograniczenia (7)(17).
Wymagane jest standardowe wyposażenie laboratoryjne, zwłaszcza następujące:
- instrumenty analityczne, takie jak aparaty do GLC, HPLC, TLC, włączając w to odpowiednie układy detekcji do analizy substancji znakowanych i nieznakowanych izotopowo lub metodę inwersji rozrzedzonych izotopów,
- instrumenty do celów identyfikacji (np. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR itp.),
- cieczowy licznik scyntylacyjny,
- aparat do przeprowadzania utleniania do spalania materiałów radioaktywnych,
- wirówka,
- aparatura do ekstrakcji (na przykład wirówka rurowa do zimnej ekstrakcji i aparat ekstrakcyjny Soxhleta do ciągłej ekstrakcji pod chłodnicą zwrotną),
- instrumenty do zatężania roztworów i ekstraktów (np. wirówka próżniowa),
- łaźnia wodna,
- mieszadła mechaniczne (np. zgniatarka, mikser obrotowy). Do stosowanych odczynników zalicza się na przykład:
- NaOH, czysty do analizy, 2 mol dm-3, lub inne odpowiednie zasady (np. KOH, etanoloamina),
- H2SO4, czysty do analizy, 0,05 mol dm-3,
- glikol etylenowy, czysty do analizy,
- stałe materiały absorpcyjne, takie jak wapno sodowe i poliuretanowe wkłady,
- rozpuszczalniki organiczne, czyste do analizy, takie jak aceton, metanol itp.,
- ciecz scyntylacyjna.
1.8.2. Podawanie substancji badanej
W celu dodania i rozprowadzenia w glebie substancja badana może być rozpuszczona w wodzie (dejonizowanej lub destylowanej) lub w razie potrzeby w minimalnej ilości acetonu lub innego rozpuszczalnika organicznego (6), w jakiej substancja badana jest wystarczająco rozpuszczalna i stabilna. Jednakże ilość wybranego rozpuszczalnika nie powinna mieć znaczącego wpływu na aktywność mikrobiologiczną gleby (zob. sekcje 1.5 i 1.9.2-1.9.3). Należy unikać stosowania rozpuszczalników, które inhibitują aktywność mikrobiologiczną, takich jak: chloroform, dichlorometan i inne rozpuszczalniki fluorowcowane.
Substancja badana może być również dodana w stanie stałym, np. wymieszana z piaskiem kwarcowym (6) lub w małej podpróbce badanej gleby, która została wysuszona na powietrzu i wysterylizowana. Jeżeli substancja badana jest dodawana przy użyciu rozpuszczalnika, rozpuszczalnik powinien zostać odparowany przed dodaniem szczytowej podpróbki do właściwej, niesterylnej próbki gleby.
Dla większości substancji chemicznych, których główną drogą dostępu do gleby jest osad ściekowy/ zastosowania rolnicze, substancja badana powinna zostać najpierw dodana do szlamu, który następnie jest wprowadzany do próbki gleby (zob. sekcje 1.9.2 i 1.9.3).
Stosowanie gotowych produktów nie jest rutynowo zalecane. Jednakże np. dla słabo rozpuszczalnych substancji badanych zastosowanie gotowych materiałów może być odpowiednim rozwiązaniem.
1.8.3. Gleby
1.8.3.1. Wybór gleb
Do określenia szlaków przemian, może być stosowana gleba reprezentatywna, glina piaszczysta, glina iłowa, glina, lub piasek gliniasty (zgodnie z klasyfikacją FAO i USDA (18)), o pH 5,5-8,0, zawartości węgla organicznego 0,5-2,5 % i mikrobiologicznej biomasie stanowiącej co najmniej 1 % całkowitej zawartości węgla organicznego (10).
Do badania tempa przemian powinny zostać użyte przynajmniej trzy dodatkowe gleby reprezentujące szereg istotnych gleb. Te gleby powinny mieć różną zawartość węgla organicznego, pH, zawartość gliny i mikrobiologicznej biomasy (10).
Wszystkie gleby powinny zostać scharakteryzowane, przynajmniej pod względem tekstury (% piasku, % iłów, % gliny) (zgodnie z klasyfikacją FAO i USDA (18)), pH, pojemności wymiany kationowej, węgla organicznego, gęstości nasypowej, własności retencji wody(2) i mikrobiologicznej biomasy (tylko do badań w warunkach natlenienia). Dodatkowe informacje na temat właściwości gleby mogą być przydatne przy interpretacji wyników. Dla określenia własności gleby mogą być stosowane zalecane metody przedstawione w literaturze (19)(20)(21)(22)(23). Mikrobiologiczna biomasa powinna być oznaczona z wykorzystaniem metody respiracji wywołanej przez substrat (SIR) (25)(26) lub metodami alternatywnymi (20).
1.8.3.2. Pobieranie, przenoszenie i przechowywanie gleb
Powinny być dostępne szczegółowe informacje na temat historii obszaru, z jakiego została pobrana badana próbka gleby. Szczegółowe informacje powinny obejmować dokładną lokalizację, szatę roślinną, poddawanie działaniu substancji chemicznych, poddawanie działaniu nawozów organicznych i nieorganicznych, dodatki materiałów biologicznych lub inne zanieczyszczenia. Gleby, które były poddawane działaniu substancji badanej lub jej strukturalnych analogów w ciągu ostatnich czterech lat, nie powinny być używane do badania przemian (10)(15).
Gleba powinna być świeżo zebrana z pola (z poziomu A lub z wierzchniej warstwy o grubości 20 cm), z taką zawartością wody, jaka ułatwia przesiewanie. Dla gleb innych niż gleby z pól ryżowych, powinno się unikać pobierania próbek podczas lub bezpośrednio po długich okresach (> 30 dni) suszy, mrozu, zalewania (14). Próbki powinny być transportowane w sposób, który minimalizuje zmiany zawartości wody w glebie oraz powinny być przechowywane w ciemnym miejscu, z możliwie swobodnym dostępem powietrza. Na ogół do tego celu wystarczająca jest luźno związana torba polietylenowa.
Gleba powinna zostać przetworzona możliwie szybko po pobraniu próbki. Roślinność, większe okazy fauny glebowej oraz kamienie powinny zostać usunięte przed przesianiem gleby przez 2 mm sito, które usuwa drobne kamienie, okazy fauny i szczątki roślin. Należy unikać intensywnego suszenia i kruszenia gleby przed przesiewaniem (15).
Jeżeli zimą pobieranie próbek z pola jest trudne (gleba zamarznięta lub pokryta warstwą śniegu), można pobrać próbkę z partii gleby przechowywanej w szklarni pod pokryciem roślinnym (np. trawa lub mieszanina trawy i koniczyny). Zdecydowanie preferuje się badanie gleb świeżo pobranych z terenu, ale jeżeli zebrana i przetworzona gleba musi być przechowywana przed rozpoczęciem badań, przechowywanie musi być w odpowiednich warunkach i tylko przez ograniczony czas (4 ± 2 oC przez maksymalnie trzy miesiące), aby utrzymać aktywność mikrobiologiczną(3). Szczegółowe instrukcje pobierania, obchodzenia się i przechowywania gleby, przeznaczonej do eksperymentów z bioprzemianami, można znaleźć w (8)(10)(15)(26)(27).
Przed użyciem przetworzonej gleby w tym badaniu, powinna ona być wstępnie inkubowana, aby umożliwić kiełkowanie i usunięcie nasion, i aby przywrócić równowagę metabolizmu mikrobiologicznego następującą po przeniesieniu próbki z pola lub z warunków przechowywania do warunków inkubowania. Na ogół wystarczający jest okres wstępnej inkubacji 2-28 dni, w temperaturze i wilgotności zbliżonych do tych, jakie panują w czasie właściwego badania (15). Czas przechowywania i wstępnej inkubacji łącznie nie powinien przekraczać trzech miesięcy.
1.9. PROWADZENIE BADAŃ
1.9.1. Warunki badania
1.9.1.1. Temperatura badania
Podczas całego okresu badania gleby powinny być inkubowane w ciemności w stałej temperaturze reprezentatywnej dla warunków klimatycznych, w których wystąpi wykorzystanie lub uwolnienie substancji badanej. Zaleca się temperaturę około 20 ± 2 oC dla wszystkich substancji badanych, jakie mogą przeniknąć do gleby w klimacie umiarkowanym. Temperatura powinna być monitorowana.
Dla substancji chemicznych podawanych lub uwalnianych do gleby w chłodniejszych strefach klimatycznych (np. w krajach północnych, podczas okresów jesieni/zimy) powinno się inkubować dodatkowe próbki gleby, ale w niższej temperaturze (np. 10 ± 2 oC).
1.9.1.2. Zawartość wilgoci
Do badań przemian w warunkach natlenienia powinna zostać skorygowana zawartość wilgoci(4) i powinna być utrzymywana na poziomie pF od 2,0 do 2,5 (3). Zawartość wilgoci jest wyrażana jako masa wody na masę suchej gleby i powinna być regularnie kontrolowana (np. w odstępach dwutygodniowych) przez ważenie kolby inkubacyjnej, a straty wody powinny być kompensowane przez dodawanie wody (najlepiej sterylnie filtrowana woda z kranu). Należy uważać, by uniemożliwić lub zminimalizować straty substancji badanej i/lub produktów transformacji w wyniku ulatniania się i/lub fotodegradacji (jeśli zachodzi) podczas uzupełniania wilgoci.
Do badania przemian w warunkach beztlenowych i dla warunków pól ryżowych, gleba jest nasycana wodą przez zalewanie.
1.9.1.3. Inkubacja w warunkach tlenowych
W systemach przepływowych warunki natlenienia będą utrzymane w wyniku przerywanego przepływu cieczy lub ciągłej wentylacji nawilżonym powietrzem. W kolbach biometrycznych wymiana powietrza jest uzyskiwana przez dyfuzję.
1.9.1.4. Sterylne warunki tlenowe
Aby uzyskać informacje na temat znaczenia abiotycznej przemiany substancji badanej, próbki gleby mogą zostać wysterylizowane (metody sterylizacji zob. poz. bibliograficzne (16) i (29)), poddawane działaniu sterylnych substancji badanych (np. dodawanie roztworu przez filtr sterylny) i natleniane nawilżonym sterylnym powietrzem zgodnie z opisem w sekcji 1.9.1.3. Dla gleb pod mokre uprawy ryżu gleba i woda powinny być sterylizowane i inkubacja powinna być prowadzona jak opisano w sekcji 1.9.1.6.
1.9.1.5. Beztlenowe warunki inkubacji
Aby stworzyć i utrzymać warunki beztlenowe, gleba jest poddawana działaniu substancji badanej i inkubowana w warunkach natlenienia przez 30 dni lub jeden okres półtrwania lub DT50 (w zależności od tego, który jest krótszy), następnie jest zalewana wodą (warstwa 1-3 cm wody nad powierzchnią) i system inkubowania jest przepłukiwany strumieniem gazu obojętnego (np. azot lub argon)(5). Układ badawczy musi pozwalać na pomiary takie, jak pH, stężenie tlenu i potencjał redoks oraz zawierać urządzenie do wychwytywania produktów lotnych. Układ biometryczny musi być zamknięty i uniemożliwiać dostawanie się powietrza poprzez dyfuzję.
1.9.1.6. Warunki inkubacji mokrej uprawy ryżu
Do badania przemian w warunkach mokrej uprawy ryżu, gleba jest zalewana warstwą wody o grubości warstwy około l-5cm, a substancja badana jest dodawana do fazy wodnej (9). Zaleca się głębokość gleby przynajmniej 5 cm. System jest wentylowany powietrzem, tak jak w warunkach natlenienia. Należy monitorować i podawać pH, stężenie tlenu i potencjał redoks warstwy wody. Niezbędny jest przynajmniej dwutygodniowy okres wstępnej inkubacji przed rozpoczęciem badań przemian (zob. sekcja 1.8.3.2).
1.9.1.7. Czas trwania badań
Czas badania stopnia przemian i ich szlaków nie powinien przekraczać 120 dni(6) (3)(6)(8), ponieważ można oczekiwać, że po tym czasie spadnie aktywność mikrobiologiczna w sztucznych warunkach laboratoryjnych izolowanych od naturalnej wymiany składników. Jeżeli jest to konieczne do scharakteryzowania zaniku substancji badanej, a także tworzenia i zaniku głównych produktów przemian, badania mogą być prowadzone w dłuższym okresie czasu (np. 6 lub 12 miesięcy) (8). Powody dłuższej inkubacji powinny zostać przedstawione w sprawozdaniu z badań i powinny być dołączone pomiary biomasy sporządzone podczas i na końcu tego okresu.
1.9.2. Prowadzenie badań
Około 50-200 g gleby (w suchej masie) jest umieszczane w każdej kolbie inkubacyjnej (zob. rysunki 1 i 2 w załączniku 3), a następnie gleba jest poddawana działaniu substancji badanej jedną z metod przedstawionych w sekcji 1.8.2. Jeżeli stosowane są rozpuszczalniki organiczne do podania substancji badanej, należy je usunąć z gleby poprzez odparowanie. Następnie gleba jest dokładnie mieszana przy pomocy szpatułki i/lub poprzez wstrząsanie kolby. Jeżeli badanie jest prowadzone w warunkach mokrej uprawy ryżu, gleba z wodą powinny zostać dokładnie wymieszane po dodaniu substancji badanej. Małe podwielokrotności (np. 1 g) gleby poddanej działaniu powinny być analizowane pod kątem substancji badanej w celu sprawdzenia równomiernego rozkładu. Dla metody alternatywnej, zob. poniżej.
Stopień poddania działaniu substancji badanej powinien odpowiadać największemu stopniowi podania środka ochrony upraw zalecanemu w instrukcji stosowania i jednorodnemu wprowadzeniu na odpowiednią głębokość na polu (np. górna warstwa 10 cm(7) gleby (7)). Na przykład dla substancji chemicznych stosowanych na liście lub na glebę bez wprowadzania do niej, odpowiednia głębokość do obliczenia, ile substancji chemicznej należy dodać do kolby wynosi 2,5 cm. Dla substancji chemicznych wprowadzanych do gleby, odpowiednia głębokość jest głębokością wprowadzania określoną w instrukcji stosowania. Dla większości substancji chemicznych podawaną ilość należy oszacować na podstawie najbardziej istotnego szlaku wnikania; na przykład jeżeli główny szlak wnikania w glebę prowadzi przez osad ściekowy, substancja chemiczna powinna być dozowana do osadu w stężeniu, które odzwierciedla oczekiwane stężenie w osadzie, a ilość osadu dodawanego do gleby powinna odzwierciedlać zwykłe wprowadzanie osadu do gleby uprawnej. Jeżeli to stężenie nie jest wystarczająco wysokie do zidentyfikowania głównych produktów przemian, pomocna powinna być inkubacja oddzielnej próbki gleby zawierającej wyższe stężenie, należy jednak unikać stężeń, które po przekroczeniu pewnego poziomu wpływają na mikrobiologiczne funkcje w glebie (zob. sekcje 1.5 i 1.8.2).
Alternatywnie, można poddać działaniu substancji badanej większą partię gleby (to jest 1-2 kg), dokładnie mieszając w odpowiednim urządzeniu do mieszania, i następnie przenieść w małych porcjach 50-200 g do kolby inkubacyjnej (na przykład stosując rozdzielacz do próbek). Małe podwielokrotności (np. 1 g) partii gleby poddanej działaniu substancji badanej powinny być analizowane na jej obecność w celu sprawdzenia równomierności rozprowadzenia. Procedura ta jest preferowana, ponieważ umożliwia bardziej równomierne rozprowadzenie substancji badanej w glebie.
Także próbki gleby niepoddane działaniu substancji badanej inkubuje się w tych samych warunkach (natlenienia), jak próbki poddane jej działaniu. Próbki te stosowane są do pomiarów biomasy podczas badań i na ich koniec.
Jeżeli substancja badana podawana jest w postaci rozpuszczonej w rozpuszczalniku (rozpuszczalnikach) organicznym, próbki gleby traktowane taką samą ilością rozpuszczalnika (rozpuszczalników) są inkubowane w tych samych warunkach (natlenienia), jak próbki gleby poddanej działaniu substancji badanej. Te próbki używane do pomiarów biomasy na początku, w trakcie i na końcu badań, w celu określenia wpływu rozpuszczalnika (rozpuszczalników) na biomasę mikrobiologiczną.
Kolby zawierające glebę poddaną działaniu badanej substancji są albo podłączone do systemu przepływowego opisanego na rys. 1, albo zamykane kolumną absorpcyjną przedstawioną na rys. 2 (zob. załącznik 3).
1.9.3 Pobieranie próbek i pomiar
Dwie kolby inkubacyjne są usuwane w odpowiednich odstępach czasu i próbki gleby są ekstrahowane odpowiednimi rozpuszczalnikami o różnej polarności, a następnie analizuje się ich zawartość pod kątem substancji badanej i/lub produktów przemian. W dobrze zaprojektowanych badaniach jest wystarczająca liczba kolb, tak aby można było poświęcić dwie kolby dla każdego poboru próbek. Także, roztwory absorpcyjne i absorbenty stałe są usuwane w różnych odstępach czasu (co 7 dni przez pierwszy miesiąc, a potem w odstępach 17 dniowych) podczas i na zakończenie inkubacji każdej gleby i analizowane pod kątem produktów lotnych. Poza tym, dla próbki gleby pobranej zaraz po podaniu (próbka z dnia 0) powinno się przygotować przynajmniej 5 dodatkowych punktów pomiarowych. Odstępy czasu powinny być tak dobrane, aby można było określić profil zaniku substancji badanej i profil tworzenia i zaniku produktów przemian (np. 0, 1, 3, 7 dni; 2, 3 tygodnie; 1, 2, 3 miesiące itd.).
Jeżeli stosowane są substancje badane znakowane izotopem 14C, niewyekstrahowane izotopy promieniotwórcze będą kwantyfikowane przy pomocy spalania, a dla każdego odstępu próbkowania będzie obliczany bilans masy.
W przypadkach inkubacji w warunkach beztlenowych i w warunkach mokrej uprawy ryżu faza glebowa i faza wodna są analizowane razem na obecność substancji badanej i produktów przemian lub rozdzielane przy pomocy filtracji lub odwirowania przed ekstrakcją i analizą.
1.9.4 Badania opcjonalne
Badania w warunkach natlenienia i braku sterylności w dodatkowym zakresie temperatur i wilgotności gleby mogą być przydatne do oszacowania wpływu temperatury i wilgotności gleby na tempo przemian substancji badanej i/lub produktów przemian w glebie.
Można podjąć próbę dalszej charakteryzacji izotopów promieniotwórczych, które nie uległy ekstrakcji, stosując na przykład ekstrakcję płynem nadkrytycznym.
2. DANE
2.1. OPRACOWANIE WYNIKÓW
Ilości substancji badanej, produktów przemian, substancji lotnych (tylko w %) i nieulegających ekstrakcji powinny zostać podane jako % zastosowanego stężenia początkowego i tam, gdzie to dotyczy, jako mg kg-1 gleby (na podstawie suchej masy gleby) dla każdego odstępu pobierania próbek. Bilans masy należy podać w procencie zastosowanego stężenia początkowego dla każdego odstępu pobierania próbek. Graficzna prezentacja stężenia substancji badanej w zależności od czasu pozwoli na oszacowanie okresu półtrwania lub
DT50. Główne produkty przemian powinny zostać zidentyfikowane, a ich stężenia także powinny zostać wykreślone w zależności od czasu, w celu przedstawienia ich tempa powstawania i zaniku. Głównym produktem przemian jest każdy produkt stanowiący >10 % podanej dawki zmierzony w którymkolwiek momencie podczas badań.
Pułapkowane produkty lotne dają pewien wskaźnik odnośnie do potencjału lotności substancji badanej i jej produktów przemian pochodzących z gleby.
Przez zastosowanie obliczeń z odpowiednim modelem kinetycznym powinno się otrzymać dokładniejsze określenie okresu półtrwania lub wartości DT50 i, w miarę potrzeby, wartości DT75 i DT90. Okres półtrwania i wartości DT50 powinny być podane razem z opisem stosowanej metody, rzędowości kinetyki i współczynnikiem determinacji (r2). Preferowana jest kinetyka pierwszego rzędu, chyba że r2 < 0,7. Jeśli jest to odpowiednie, obliczenia powinny zostać także wykonane dla głównych produktów przemian. Przykłady odpowiednich modeli są opisane w pozycjach bibliograficznych 31 i 35.
W przypadku badań tempa prowadzonych w różnych temperaturach, tempo przemian powinno zostać opisane w funkcji temperatury dla zakresu temperatur eksperymentu, przy użyciu zależności Arrheniusa w postaci:
gdzie ln A i B są stałymi regresji wyznaczonymi odpowiednio z przecięcia i nachylenia najlepszej krzywej dopasowania otrzymanej z regresji liniowej ln k od l/T, k jest stałą tempa reakcji w temperaturze T, gdzie T jest wyrażone w kelwinach. Należy uważać na ograniczony zakres temperatur, w którym spełnione jest równanie Arreheniusa w przypadku przemian zależnych od aktywności mikrobiologicznej.
2.2. OCENA I INTERPRETACJA WYNIKÓW
Choć badania są prowadzone w sztucznych warunkach laboratoryjnych, wyniki pozwolą na ocenę tempa przemian substancji badanej, a także tempa powstawania i zaniku produktów przemian w warunkach panujących w terenie (36)(37).
Badanie szlaków przemian substancji badanej dostarcza informacji o sposobie, w jaki podana substancja zostaje zmieniona pod względem strukturalnym w glebie w wyniku reakcji chemicznych i mikrobiologicznych.
3. SPRAWOZDANIE
RAPORT Z BADAŃ
Sprawozdanie z badań musi zawierać:
Substancja badana:
- nazwę zwyczajową, nazwę systematyczną, numer CAS, wzór strukturalny (ze wskazaniem pozycji znacznika(-ów), jeżeli jest zastosowany materiał znakowany izotopowo) oraz odnośne właściwości fizyczno-chemiczne (zob. sekcja 1.5),
- stopień czystości substancji badanej (zanieczyszczenia),
- stopień czystości radiochemicznej znakowanych substancji chemicznych i rodzaj aktywności (w razie potrzeby).
Substancje odniesienia:
- nazwa systematyczna i struktura substancji odniesienia stosowanej do charakteryzacji i/lub identyfikacji produktów przemian.
Badane gleby:
- szczegółowe informacje dotyczące miejsca pobrania,
- data i procedura pobierania próbek gleby,
- właściwości gleb, takie jak: pH, zawartość węgla organicznego, tekstura (% piasku, % iłu, % gliny), pojemność wymiany kationowej, gęstość nasypowa, własności retencji wody i biomasa mikrobiologiczna,
- długość przechowywania gleby i warunki przechowywania (jeżeli była przechowywana). Warunki badań:
- daty wykonywania badań,
- ilość podanej substancji badanej,
- stosowane rozpuszczalniki i metoda podawania substancji badanej,
- początkowa masa gleby poddanej działaniu substancji badanej i ilość pobierana do analizy przy każdym odstępie pobierania próbek,
- opis stosowanego systemu inkubacyjnego,
- stopień przepływu powietrza (tylko dla systemu przepływowego),
- temperatura prowadzenia eksperymentu;
- nawilżenie gleby w czasie inkubacji,
- biomasa mikrobiologiczna na początku, w trakcie i na zakończenie badań w warunkach natlenienia,
- pH, stężenie tlenu i potencjał redoks początkowy, w trakcie i na zakończenie badań w warunkach beztlenowych i w warunkach mokrej uprawy ryżu,
- metoda(y) ekstrakcji,
- metody kwantyfikacji i identyfikacji substancji badanej oraz główne produkty przemian w glebie i absorbentach,
- ilość powtórzeń i liczba próbek kontrolnych; Wyniki:
- wynik oznaczenia aktywności mikrobiologicznej,
- powtarzalność i czułość stosowanych metod analitycznych,
- stopień odzysku (% wartości dla ważnych badań podano w sekcji 1.7.1),
- stabelaryzowane wyniki wyrażone jako % podanej początkowo dawki i w miarę potrzeby, jako mg kg-1 gleby (w suchej masie),
- bilans masowy podczas i na zakończenie badań,
- charakterystyka niepodlegających ekstrakcji (związanych) izotopów lub pozostałości w glebie,
- kwantyfikacja uwolnionego CO2 i innych lotnych związków,
- wykresy stężeń substancji badanej w glebie w zależności od czasu, w miarę potrzeby, dla głównych produktów przemian,
- okres półtrwania lub DT50, DT75 i DT90 dla substancji badanej i w miarę potrzeby, dla głównych produktów przemian, włączając w to granice przedziałów ufności,
- oszacowanie tempa degradacji abiotycznej w warunkach sterylnych,
- ocena kinetyki przemian substancji badanej w miarę potrzeby głównych produktów przemian,
- proponowane szlaki przemian, w miarę potrzeby,
- dyskusja i interpretacja wyników,
- surowe dane (to jest, przykładowe chromatogramy, przykładowe obliczenia tempa przemian i średnie stosowane do identyfikacji produktów przemian).
4. BIBLIOGRAFIA
(1) US- Environmental Protection Agency (1982). Pesticide Grade Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. Guidelines for registration of pesticides in Canada.
(3) Unia Europejska (EU) (1995). Dyrektywa Komisji 95/36/EC z dnia 14 lipca 1995 zmieniająca dyrektywę Rady 91/414/EEC dotyczącą wprowadzania do obrotu środków ochrony roślin. Załącznik II, część A i załącznik III, część A: Losy i zachowanie się w środowisku.
(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
(5) BBA (1986). Richtlinie fur die amtliche Priifung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-1. Verbleib von Pflanzenschutzmitteln im Boden - Abbau, Umwandlung und Metabolismus.
(6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality -Guidance on laboratory tests for biodegradation of organic chemicals in soil - Part 1: Aerobic conditions.
(7) ISO 14239 (1997). Soil Quality. Laboratory incubation systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.
(9) MAFF - Japan 2000 - Draft Guidelines for transformation studies of pesticides in soil - Aerobic metabolism study in soil under paddy field conditions (flooded).
(10) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Italy, 18- 20 January 1995.
(11) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, Ed.), Academic Press, 123-157.
(12) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley. VCH (1998).
(13) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residue in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).
(14) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).
(15) ISO 10381-6 (1993). Soil Quality - Sampling - Part 6: Guidance on the collection, handling and storage of soil for the grade of aerobic microbial processes in the laboratory.
(16) Załącznik V do dyrektywy 67/548/EEC.
(17) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114.
(18) Soil Texture Classification (US and FAO systems): Weed Science, 33, Suppl. 1 (1985) and Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mineralogical Methods. A. Klute, Ed.) Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
(20) Metodas of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties. A.L. Strona, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2nd Edition.
(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality - General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. First Edition.
(22) Muckenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogi-schen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.
(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.
(24) Anderson, J.P.E., Domsch, K.H. (1978) A physiological method for the quantitative measurement of microbial biomass in soils. Soil Biol. Biochem. 10, 215-221.
(25) ISO 14240-1 and 2 (1997). Soil Quality - Determination of soil microbial biomass - Part 1: Substrate-induced respiration method. Part 2: fumigation-extraction method.
(26) Anderson, J.P.E. (1987). Handling and storage of soils for pesticide experiments. In Pesticide Effects on Soil Microflora. L. Somerville, M.P. Greaves, Eds. Taylor & Francis, 45-60.
(27) Kato, Yasuhiro. (1998). Mechanism of pesticide transformation in the environment: Aerobic and biotransformation of pesticides in water solution environment. Proceedings of the 16th Symposium on Environmental Science of Pesticide, 105-120.
(28) Keuken O., Anderson J.P.E. (1996). Influence of storage on biochemical processes in soil. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 59-63 (SETAC-Europe).
(29) Stenberg B., Johansson M., Pell M., Sjodahl-Svensson K, Stenstrom J., Torstensson L. (1996). Effect of freeze and cold storage of soil on microbial activities and biomass. In Pesticides, Soil Microbiology and Soil Quality, 68-69 (SETAC-Europe).
(30) Gennari, M., Negre, M., Ambrosoli, R. (1987). Effects of ethylene oxide on soil microbial content and some chemical characteristics. Plant and Soil 102, 197-200.
(31) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
(32) Hamaker, J.W. (1976). The application of mathematical modelling to the soil persistence and accumulation of pesticides. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides, 181-199.
(33) Goring, CA.I., Laskowski, DA, Hamaker, J.W., Meikle, R.W. (1975). Principles of pesticide degradation in soil. In "Environmental Dynamics of Pesticides". R. Haque and V.H. Freed, Eds., 135-172.
(34) Timme, G., Frehse, H., Laska, V. (1986). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. II. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer 39, 188-204.
(35) Timme, G., Frehse, H. (1980). Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues. I. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer 33, 47-60.
(36) Gustafson D.I., Holden L.R. (1990). Non-linear pesticide dissipation in soil; a new model based on spatial variability. Environm. Sci. Technol. 24, 1032-1041.
(37) Hurle K, Walker A. (1980). Persistence and its prediction. In Interactions between Herbicides and the Soil (RJ. Hance, Ed.), Academic Press, 83-122
______
(1) Na przykład jeżeli substancja badana zawiera jeden pierścień, wymagane jest znakowanie na tym pierścieniu; jeżeli substancja badana zawiera dwa lub więcej pierścieni, mogą być potrzebne oddzielne badania w celu oceny losu każdego znakowanego pierścienia i w celu otrzymania odpowiednich informacji na temat powstawania produktów przemian.
(2) Własności retencji wody gleby można zmierzyć jako pojemność połowa, jako pojemność wodna lub jako siła ssąca gleby (pF). Wyjaśnienia zamieszczono w załączniku 1. W sprawozdaniu z badań należy podać, czy własności retencji wody i gęstość nasypową gleb określono w próbkach z terenu niezaburzonego, czy w próbkach zaburzonych (przetworzonych).
(3) Ostatnie wyniki badań pokazują, że gleby ze stref umiarkowanych również mogą być przechowywane w temp. -20 oC przez okres dłuższy niż trzy miesiące (28)(29) bez znaczących strat aktywności mikrobiologicznej.
(4) Gleba nie powinna być ani za mokra, ani za sucha, aby utrzymać odpowiednie napowietrzenie i odżywienie mikroflory glebowej. Zawartość wilgoci zalecana dla optymalnego wzrostu mikrobiologicznego mieści się z zakresie od 40-60 % zdolności utrzymywania wody (WHC) i 0,1-0,33 bara (6). Ten drugi zakres jest równoważny zakresowi pF 2,0-2,5. Typowe zawartości wilgoci różnych rodzajów gleb są podane w załączniku 2.
(5) Warunki tlenowe dominują w glebach powierzchniowych i nawet w glebach podpowierzchniowych, jak pokazano w pracy badawczej sponsorowanej przez UE [K. Takagi et al. (1992). Microbial dirersity and activity in subsoils: Methods, field site, seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Internat. Symp. Environment. Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17-21 sierpnia 1992 r., Sigtuna, Szwecja]. Warunki beztlenowe mogą występować jedynie okazjonalnie podczas zalewania gleb po silnych opadach deszczu lub kiedy na polach ryżowych są tworzone warunki ryżowe.
(6) Badania tlenowe mogą być zakończone przed upływem 120 dni, pod warunkiem że w tym czasie jednoznacznie zostanie osiągnięta ostateczna ścieżka przemiany i ostateczna mineralizacja. Zakończenie badania jest możliwe po 120 dniach lub kiedy zostanie przemienione przynajmniej 90 % substancji badanej, ale tylko wtedy gdy utworzy się przynajmniej 5 % C02.
(7) Obliczenie stężenia początkowego na powierzchni z wykorzystaniem następującego równania:
Csoil = Stężenie początkowe stężenie w glebie (mg- kg1).
A = Podana ilość [kg · ha-1]; 1 = grubość warstwy gleby z pola (m); d = gęstość nasypowa sucha gleby (kg · m-3).
Z reguły podana ilość 1 kg · ha-i powoduje stężenie w glebie około 1 mg · kg-1 nasypowej 1 g- cm-3).
ZAŁĄCZNIK 1
NAPIĘCIE WODY, POJEMNOŚĆ POLOWA GLEBY (FC) I POJEMNOŚĆ WODNA (WHC)(1)
| Wysokość słupa wody (cm) | pF(a) | bar(b) | Uwagi |
| 107 | 7 | 104 | Sucha gleba |
| 1,6*104 | 4,2 | 16 | Początek więdnięcia |
| 104 | 4 | 10 | |
| 103 | 3 | 1 | |
| 6*102 | 2,8 | 0,6 | |
| 3,3*102 | 2,5 | 0,33(c) | |
| 102 | 2 | 0,1 | Zakres pojemności |
| 60 | 1,8 | 0,06 | polowej gleby (d) |
| 33 | 1,5 | 0,033 | |
| 10 | 1 | 0,01 | WHC (w przybliżeniu) |
| 1 | 0 | 0,001 | Gleba nasycona wodą |
| (a) pF = log z cm słupa wody. |
| (b) l bar = 105 Pa. |
| (c) Odpowiada przybliżonej zawartości wody 10 % w piasku, 35 % w piasku gliniastym, 45 % w glinie. |
| (d) Pojemność polowa nie jest stała, ale zmienia się w zakresie pF od 1,5 do 2,5. |
Napięcie wody jest mierzone w cm wysokości słupa wody lub w barach. Z powodu dużego zakresu napięcia kapilarnego jest wyrażane po prostu, jako wartość pF, która jest równoważna logarytmowi cm słupa wody.
Pojemność polowa jest definiowana jako ilość wody, jaka może być przechowywana pomimo grawitacji przez naturalną ziemię przez 2 dni po dłuższym okresie opadów lub po odpowiedniej irygacji. Jest określana w nienaruszonej glebie in situ w terenie. Ten pomiar nie może więc być stosowany do naruszonych, laboratoryjnych próbek gleb. Wartości FC oznaczone w naruszonych glebach mogą wykazywać większe odchylenia systematyczne.
Pojemność wodna (WHC) jest wyznaczana w laboratorium przy użyciu nienaruszonej i naruszonej gleby przez nasycanie słupa gleby wodą w wyniku ruchów kapilarnych. Jest to szczególnie użyteczne dla gleb naruszanych i może osiągać wartość do 30 % wyższą niż największa pojemność polowa8. Jest też łatwiejsza do wyznaczenia eksperymentalnie, niż rzetelne wyznaczenie wartości FC.
Uwagi
(1) Muckenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt, Main.
ZAŁĄCZNIK 2
ZAWARTOŚĆ WILGOCI W GLEBIE (g wody na 100 g suchej gleby) DLA RÓŻNYCH RODZAJÓW GLEB Z RÓŻNYCH KRAJÓW
| Wilgotność gleby | Kraj | Rodzaj w danym kraju |
| WHC(1) | pF = 1,8 | pF = 2,5 | ||
| Piasek | Niemcy | 28,7 | 8,8 | 3,9 |
| Piasek gliniasty | Niemcy | 50,4 | 17,9 | 12,1 |
| Piasek gliniasty | Szwajcaria | 44,0 | 35,3 | 9,2 |
| Glina ilasta | Szwajcaria | 72,8 | 56,6 | 28,4 |
| Ił gliniasty | Brazylia | 69,7 | 38,4 | 27,3 |
| Ił gliniasty | Japonia | 74,4 | 57,8 | 31,4 |
| Glina piaszczysta | Japonia | 82,4 | 59,2 | 36,0 |
| Glina ilasta | USA | 47,2 | 33,2 | 18,8 |
| Glina piaszczysta | USA | 40,4 | 25,2 | 13,3 |
| (1) pojemność wodna (WHC). |
ZAŁĄCZNIK 3
C.24. PRZEMIANY TLENOWE I BEZTLENOWE W UKŁADACH OSADÓW WODNYCH
1. METODA
Ta metoda badawcza jest równoważna z OECD TG 308 (2002).
1.1. WPROWADZENIE
Substancje chemiczne mogą dostawać się do płytkich lub głębokich wód powierzchniowych takimi szlakami, jak bezpośrednie wprowadzenie, znoszenie wód rozpylonych, spływ, odwadnianie, usuwanie odpadów, ścieki przemysłowe, gospodarcze lub rolnicze i opady atmosferyczne. Ta metoda badawcza opisuje metodę laboratoryjną do oceny tlenowej i beztlenowej przemiany organicznych substancji chemicznych w układach osadów wodnych. Jest oparta na istniejących wytycznych (1)(2)(3)(4)(5)(6). Podczas Warsztatów OECD na temat Selekcji Gleb/Osadów, które odbyły się w Belgirate, we Włoszech w 1995 (7), uzgodniono w szczególności liczbę i rodzaj osadów do stosowania w tym badaniu. Podano również zalecenia odnoszące się do pobierania, przenoszenia i przechowywania próbek osadów, oparte na wytycznych ISO (8). Takie badania są wymagane dla substancji chemicznych, które są bezpośrednio wprowadzane do wody lub, co do których istnieje możliwość dostania się do środowiska wodnego poprzez szlaki opisane powyżej.
Warunki w naturalnych układach osadów wodnych są często tlenowe w górnej fazie wodnej. Warstwa powierzchniowa osadu może być zarówno natleniona, jak i niedotleniona, podczas gdy głębsze osady są zazwyczaj beztlenowe. Aby uwzględnić wszystkie te możliwości, w tym dokumencie opisano zarówno badania w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych. Badanie w warunkach tlenowych symuluje natlenioną kolumnę wodną nad warstwą osadów natlenionych ze stopniowo niedotlenionym podkładem. Badanie w warunkach beztlenowych symuluje całkowicie beztlenowy układ woda-osad. Jeśli okoliczności wskazują, że jest konieczne znaczne odejście od tych zaleceń, na przykład poprzez użycie nienaruszonych rdzeni osadowych lub osadów, które mogły zostać poddane działaniu substancji badanych, dla tych celów są dostępne inne metody (9).
1.2. DEFINICJE
W każdym przypadku należy używać standardowych międzynarodowych jednostek (SI).
Substancja badana: jakakolwiek substancja, czy to związek macierzysty czy też odnośne produkty przemian.
Produkty przemian: wszystkie substancje powstałe w wyniku biotycznych lub abiotycznych reakcji przemian substancji badanej, w tym CO2 i produkty w pozostałościach związanych.
Pozostałości związane: "Pozostałości związane" stanowią związki w glebie, roślinach lub zwierzętach, które pozostają po ekstrakcji w materiale macierzystym w postaci substancji macierzystej lub jej metabolitu(-ów)/ produktów przemiany. Metoda ekstrakcji nie może zmieniać w sposób znaczący samych związków lub struktury materiału macierzystego. Charakter wiązania można częściowo wyjaśnić przez metody ekstrakcji zmieniające materiał macierzysty i wyspecjalizowane techniki analityczne. Do dziś, na przykład, zostały w ten sposób zidentyfikowane wiązania kowalencyjne zjonizowane i sorpcyjne, a także pułapkowanie. Na ogół tworzenie się pozostałości związanych znacząco redukuje biodostępność i bioprzyswajalność (10) [zmodyfikowane w stosunku do IUPAC 1984 (11)].
Przemiany tlenowe: (utlenianie): reakcje zachodzące w obecności tlenu cząsteczkowego (12).
Przemiany beztlenowe: (redukcja): reakcje zachodzące z wykluczeniem tlenu cząsteczkowego (12).
Wody naturalne: są wodami powierzchniowymi otrzymanymi ze stawów, rzek, strumieni itp.
Osad: jest mieszaniną mineralnych i organicznych składników chemicznych, te drugie zawierające związki o wysokiej zawartości węgla i azotu i o dużych masach cząsteczkowych. Jest osadzony przez wodę naturalną i tworzy z tą wodą granicę rozdziału.
Mineralizacja: to całkowita degradacja związku organicznego do CO2 i H2O w warunkach tlenowych lub CH4, CO2 i H2O w warunkach beztlenowych. W kontekście tej metody badawczej, w której stosowane są związki znakowane 14C, mineralizacja oznacza ekstensywną degradację, podczas której znaczone atomy węgla są utleniane z wydzieleniem odpowiedniej ilości 14CO2
Czas półtrwania: t0,5 to czas potrzebny do przemiany 50 % substancji badanej, jeżeli przemiana może zostać opisana kinetyką pierwszego rzędu; nie zależy od stężenia.
DT50 (Czas zaniku 50): to czas, w którym początkowe stężenie substancji badanej zmniejsza się o 50 %.
DT75 (Czas zaniku 75): to czas, w którym początkowe stężenie substancji badanej zmniejsza się o 75 %.
DT90 (Czas zaniku 90): to czas, w którym początkowe stężenie substancji badanej zmniejsza się o 90 %.
1.3. SUBSTANCJE ODNIESIENIA
Substancje odniesienia powinny być stosowane do identyfikacji i oznaczenia ilościowego produktów przemian metodami spektroskopowymi i chromatograficznymi.
1.4. INFORMACJE O SUBSTANCJI BADANEJ
Nieznakowane i znakowane izotopowo substancje badane mogą być użyte do pomiaru tempa przemian, chociaż preferowany jest materiał znakowany. Materiał znakowany jest wymagany do badania szlaków przemian i do określenia bilansu masowego. Zaleca się znakowanie izotopem 14C, ale inne izotopy, takie jak 13C, 15N, 3H, 32P, także mogą być użyteczne. Tak, jak to tylko możliwe, znacznik powinien być umiejscowiony w najbardziej stabilnej części(ach) cząsteczki(1). Chemiczna lub/i radiochemiczna czystość substancji testowej powinna wynosić co najmniej 95 %.
Przed rozpoczęciem badania powinny być dostępne następujące informacje o substancji badanej:
a) rozpuszczalność w wodzie (metoda A.6),
b) rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych,
c) prężność pary (metoda A.4) i stała proporcjonalności w prawie Henry'ego,
d) współczynnik podziału n-oktanol/woda (metoda A.8),
e) współczynnik adsorpcji (odpowiednio Kd, Kf, Koc) (metoda C.18),
f) hydroliza (metoda C.7),
g) stała dysocjacji (pKa) [OECD Wytyczna 112] (13),
h) struktura chemiczna substancji badanej i pozycja znacznika(ów) izotopowych jeśli dotyczy.
Uwaga: Należy podać temperaturę, w której wykonano te pomiary.
Inne przydatne informacje mogą obejmować dane na temat toksyczności substancji badanej dla mikroorganizmów, dane na temat biodegradalności gotowej i/lub nieodłącznej, oraz dane o tlenowych i beztlenowych przemianach w glebie.
Powinny być dostępne metody analityczne (w tym metody ekstrakcji i czyszczenia) do identyfikacji i oznaczania ilościowego substancji badanej i jej produktów przemian w wodzie i w osadzie (patrz sekcja 1.7.2).
1.5 ZASADA METODY BADAWCZEJ
W opisanej metodzie dla tego badania stosuje się tlenowy i beztlenowy układ osadu wodnego (zobacz załącznik 1), który umożliwia:
(i) pomiar tempa przemiany substancji badanej w układzie woda-osad;
(ii) pomiar tempa przemiany substancji badanej w osadzie;
(iii) pomiar tempa mineralizacji substancji badanej i/lub jej produktów przemiany (gdy stosowana jest substancja badana znakowana izotopem 14C);
(iv) identyfikacja i oznaczenie ilościowe produktów przemiany w fazach wodnej i w osadu, w tym bilans masowy (gdy stosowana jest znakowana substancja badana);
(v) pomiar rozdziału substancji badanej i jej produktów przemiany między dwie fazy podczas okresu inkubacji w ciemności (by uniknąć, na przykład, zakwitu glonów) w stałej temperaturze. Czasy półtrwania, wartości DT50, DT75 i DT90 są określone, tam gdzie potwierdzają to dane, ale nie powinny być ekstrapolowane daleko poza okres eksperymentalny (zob. sekcja 1.2).
Do badań odpowiednio w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych wymagane są conajmniej dwa osady wraz z towarzyszącymi im wodami (7). Jednakże mogą wystąpić przypadki, gdzie powinny być użyte więcej niż dwa osady wodne, na przykład, dla substancji chemicznych, które mogą być obecne w środowiskach słodkowodnych i/lub morskich.
1.6. ZASTOSOWANIE BADANIA
Metoda ogólnie może być stosowana dla substancji chemicznych (znakowanych i nieznakowanych izotopowo), dla których jest dostępna metoda analityczna o wystarczającej czułości i dokładności. Może być stosowana do związków słabo lotnych, nielotnych, rozpuszczalnych lub nierozpuszczalnych w wodzie. Badanie nie powinno być stosowane do substancji chemicznych, o wysokiej lotności z wody (np.: fumiganty, rozpuszczalniki organiczne), które nie mogą być zatrzymane w wodzie i/lub osadzie w warunkach eksperymentalnych badania.
Metoda ta została, jak dotąd, zastosowana do badania przemian substancji chemicznych w wodzie słodkiej i osadach, ale w zasadzie może być także zastosowana do układów estuaryjno-morskich. Nie nadaje się do symulacji warunków wód płynących (np. rzek) lub otwartego morza.
1.7. KRYTERIA JAKOŚCIOWE
1.7.1. Odzysk
Ekstrakcja i analiza, co najmniej podwójnych próbek wód i osadów natychmiast po dodaniu substancji badanej daje pierwsze wskazanie co do powtarzalności metody analitycznej i jednorodności procedury podawania substancji badanej. Odzysk dla następnych etapów eksperymentu jest podawany przez odnoszący się do nich bilans masowy (gdy stosowane są materiały znakowane). Odzysk powinien mieścić się w zakresie od 90 % do 110 % dla znakowanych substancji chemicznych (6) i od 70-110 % dla nieznakowanych substancji chemicznych.
1.7.2. Powtarzalność i czułość metody analitycznej
Powtarzalność metody analitycznej (z wyłączeniem początkowej wydajności ekstrakcji) dla określenia ilości substancji badanej i produktów przemian może być sprawdzona przez powtórzenie analizy tego samego ekstraktu próbek wody lub osadu, które były inkubowane wystarczająco długo, aby wytworzyły się produkty przemian.
Granica wykrywalności (LOD) metody analitycznej dla substancji badanej i dla produktów przemian powinna być na poziomie przynajmniej 0,01 mg kg-1 wody lub osadu (jako substancji badanej) lub 1 % początkowej ilości podanej do układu badanego, w zależności od tego, co jest niższe. Granica kwantyfikacji (LOQ) również powinna zostać określona.
1.7.3. Dokładność danych przemiany
Analiza regresji stężeń substancji badanej w funkcji czasu daje właściwe informacje o dokładności krzywej przemian i pozwala na obliczenie granic przedziału ufności dla okresu półtrwania (przy założeniu kinetyki pseudo pierwszego rzędu) lub wartości DT50, oraz w razie potrzeby, wartości DT75 i DT90.
1.8. OPIS METODY
1.8.1. Badany układ i aparatura
Badanie powinno być przeprowadzone w pojemnikach szklanych (np. butlach, probówkach wirówkowych), chyba że wstępne informacje (jak współczynnik podziału n-oktanol-woda, dane sorpcyjne itp.) pokazują, że badana substancja może przylegać do szkła, w takim przypadku można rozważyć materiał alternatywny (taki jak teflon). Tam gdzie wiadomo, że substancja badana przywiera do szkła, można złagodzić ten problem przez użycie jednej lub więcej następujących metod:
- określenie masy substancji badanej i produktów przemian sorbowanych do szkła,
- zapewnić mycie rozpuszczalnikiem całego sprzętu szklanego na końcu badania,
- używać produktów gotowych (zobacz też sekcja 1.9.2),
- używać zwiększonej ilości współrozpuszczalnika do dodawania substancji badanej do układu; jeśli jest użyty współrozpuszczalnik, powinien to być współrozpuszczalnik, który nie solwatuje substancji badanej.
Przykłady typowej aparatury badawczej, np.: układy przepływowe i biometryczne są pokazane odpowiednio w załącznikach 2 i 3 (14). Inne użyteczne układy inkubacyjne są opisane w pozycji bibliograficznej 15. Konstrukcja aparatury badawczej powinna umożliwiać wymianę powietrza lub azotu i zatrzymywanie produktów lotnych. Wymiary aparatury muszą być takie, aby spełniały wymagania badania (patrz sekcja 1.9.1). Wentylację można zapewnić albo przez łagodne barbotowanie, albo przez przedmuchiwanie powietrzem lub azotem powierzchni wody. W tym drugim przypadku, wskazane łagodne mieszanie wody od góry może być wskazane dla lepszego rozprowadzenia tlenu lub azotu w wodzie. Nie powinno się używać powietrza pozbawionego CO2, ponieważ może to powodować wzrost pH wody. W każdym razie zaburzenie osadu jest niepożądane i powinno się go w miarę możliwości unikać. Lekko lotne substancje chemiczne powinny być badane w układzie biometrycznym, z łagodnym mieszaniem powierzchni wody. Można również użyć zamkniętych naczyń z fazą gazową powietrza atmosferycznego lub azotu nad roztworem, z wewnętrznym pojemniczkiem do wyłapywania produktów lotnych (16). Regularna wymiana gazów znad powierzchni roztworu jest wymagana w badaniach tlenowych, żeby skompensować zużycie tlenu przez biomasę.
Odpowiednie pułapki do wyłapywania lotnych produktów przemian obejmują, między innymi, 1 mol dm-3 roztworu wodorotlenku potasu lub wodorotlenku sodu dla ditlenku węgla(2) i glikol etylenowy, etanolaminę lub 2 % roztwór parafiny w ksylenie dla związków organicznych. Części lotne powstające w warunkach beztlenowych, takie jak metan, mogą być wyłapywane przez, na przykład, sita molekularne. Takie części lotne mogą być spalone, na przykład do CO2 poprzez przepuszczanie gazu przez rurę kwarcową wypełnioną CuO w temperaturze 900 oC i wychwytywanie powstałego CO2 w aparacie absorpcyjnym z alkaliami (17).
Wymagane jest oprzyrządowanie laboratoryjne do analizy chemicznej substancji badanej i produktów przemian (np.: chromatografia gazowo-cieczowa (GLC), wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa (HPLC), chromatografia cienkowarstwowa (TLC), spektroskopia masowa (MS), chromatografia gazowa sprzężona ze spektrometrią masową (GC-MS), chromatografia cieczowa sprzężona ze spektrometrią masową (LC-MS), magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) itp.), włączając w to układy do wykrywania substancji chemicznych znakowanych i nieznakowanych radioizotopami. Jeśli jest stosowany materiał znakowany radioizotopem, będzie również potrzebny cieczowy licznik scyntylacyjny i aparat do utleniania przez spalanie (do spalania próbek osadów przed analizy promieniotwórczości).
W miarę potrzeby wymagane jest inne standardowe wyposażenie laboratoryjne do oznaczeń fizykochemicznych i biologicznych (zob. sekcja tabela 1, sekcja 1.8.2.2), szkło laboratoryjne, substancje chemiczne i odczynniki.
1.8.2. Wybór i liczba osadów wodnych.
Miejsca pobierania próbek powinny być wybierane stosownie do celu badania w dowolnej sytuacji. Przy wyborze miejsc pobierania próbek należy uwzględnić historię ewentualnych rolniczych, przemysłowych i gospodarczych wpływów na zlewnię i wody w górze rzeki. Osady nie powinny być użyte, jeśli zostały zanieczyszczone substancją badaną lub jej analogami strukturalnymi w ciągu ostatnich czterech lat.
1.8.2.1. Wybór osadów
Zazwyczaj używa się dwóch osadów do badań w warunkach tlenowych (7). Dwa wybrane osady powinny się różnić pod względem zawartości węgla organicznego i budowy. Jeden osad powinien mieć wysoką zawartość węgla organicznego (2,5-7,5 %) i budowę drobnoziarnistą, drugi osad powinien mieć niską zawartość węgla organicznego (0,5-2,5 %) i budowę gruboziarnistą. Różnica zawartości węgla organicznego powinna zazwyczaj wynosić co najmniej 2 %. "Budowa drobnoziarnista" jest zdefiniowana jako suma [glina +ił](3) o zawartości > 50 % a "budowa gruboziarnista" jest zdefiniowana jako suma [glina + ił] o zawartości < 50 %. Różnica zawartości [glina + ił] dla tych dwóch osadów powinna zwykle wynosić co najmniej 20 %. W przypadku gdy substancja chemiczna może także dostać się do wody morskiej, przynajmniej jeden z układów woda-osad powinien być pochodzenia morskiego.
Dla badań w warunkach ściśle beztlenowych, dwa osady (wraz z towarzyszącymi wodami) powinny być pobrane ze stref beztlenowych powierzchniowych części wód (7). Obie fazy osadowa i wodna powinny być przenoszone i transportowane ostrożnie bez dostępu tlenu.
Przy wyborze osadów mogą być ważne inne parametry i powinny być rozpatrywane dla każdego przypadku indywidualnie. Na przykład zakres pH osadów byłby ważny dla badania substancji chemicznych, których przemiana i/lub sorpcja mogą być zależne od pH. Zależność sorpcji od pH może być odzwierciedlone w wartości pKa substancji badanej.
1.8.2.2. Charakterystyka próbek woda-osad
Kluczowe parametry, które muszą być zmierzone i podane w sprawozdaniu (w odniesieniu do użytej metody) zarówno dla wód, jak i osadów, oraz etap badania, na którym te parametry powinny zostać określone, są podsumowane w tabeli poniżej. Dla informacji, metody określania tych parametrów są podane w bibliografii (18)(19)(20)(21).
Dodatkowo może zachodzić potrzeba pomiaru i sprawozdania innych parametrów stosownie do indywidualnego przypadku (np.: dla wody słodkiej: cząstki zawieszone, zasadowość, twardość, przewodnictwo, NO3/PO4 (stosunek i wartości bezwzględne); dla osadów: zdolność wymiany kationowej, pojemność wodna, węglany, całkowity azot i fosfor; a dla układów morskich: zasolenie). Analiza osadów i wody na azotany, siarczany, żelazo bioprzyswajalne i ewentualnie inne akceptory elektronowe, również może być przydatna do oceny warunków redoks, szczególnie w odniesieniu do przemian beztlenowych.
Pomiar parametrów do charakteryzacji próbek woda-osad (7)(22)(23)
| Parametr | Etap procedury | |||||
| pobieranie próbek w terenie | późniejsze przenoszenie | początek przygotowania | początek badania | podczas badania | koniec badania | |
| Woda |
| Pochodzenie/źródło | x | |||||
| Temperatura | x | |||||
| pH | x | x | x | x | x | |
| TOC | x | x | x | |||
| Stężenie O2 (*) | x | x | x | x | x | |
| Potencjał redoks (*) | x | x | x | x |
| Osad |
| Pochodzenie/źródło | x | |||||
| Głębokość warstwy | x | |||||
| pH | x | x | x | x | x | |
| Rozkład wielkości cząstek | x | |||||
| TOC | x | x | x | x | ||
| Biomasa mikrobiologiczn(**) | x | x | x | |||
| Potencjał redoks(*) | Obserwacja (kolor/ zapach) | x | x | x | x |
| (*) Ostatnie badania pokazują, że pomiary stężeń tlenu w wodzie i potencjałów redoks nie mają ani mechanistycznej, ani predykcyjnej wartości, tak długo, jak zaburzony jest wzrost i rozwój populacji mikrobiologicznej w wodach powierzchniowych (24)(25). Oznaczenie zapotrzebowania na tlen biochemiczny (BOD, przy pobieraniu próbek w terenie, na początku i na końcu badania) i stężeń mikro/makro składników biogennych Ca, Mg i Mn (na początku i na końcu badania) w wodzie i pomiar całkowitego N i całkowitego P (przy pobieraniu próbek w terenie i na końcu badania) może być lepszym narzędziem do interpretacji i oceny tempa bioprzemian tlenowych i ich szlaków. |
| (**) Metoda tempa respiracji mikrobiologicznej (26), metoda zadymiania (27) lub zliczanie na podkładzie rozmnożeniowym (np. bakterie, promieniowce, grzyby i całe kolonie) dla badań w warunkach tlenowych; tempo metanogenezy dla badań beztlenowych. |
1.8.3. Pobieranie, przenoszenie i przechowywanie
1.8.3.1. Pobieranie
Przy pobieraniu próbek osadu należy korzystać z projektu wytycznych ISO o pobieraniu próbek osadu dennego (8). Próbki osadu powinny być pobierane z całej górnej warstwy osadu, o grubości od 5 do 10 cm. Towarzysząca mu woda powinna być pobrana z tego samego miejsca lub lokalizacji i w tym samym czasie, co osad. Dla badań w warunkach beztlenowych osad i towarzysząca woda powinny być pobrane i transportowane bez dostępu tlenu (28) (zob. sekcja 1.8.2.1). Niektóre urządzenia do pobierania próbek są opisane w literaturze (8)(23).
1.8.3.2. Przenoszenie
Osad jest oddzielany od wody przez filtrację i przesiewany na mokro przez 2 mm sito przy użyciu nadmiaru miejscowej wody, która jest potem wylewana. Następnie, znane ilości osadów i wody są mieszane z pożądaną prędkością (zob. sekcja 1.9.1) w kolbach inkubacyjnych przez okres przystosowawczy (zob. sekcja 1.8.4). Dla badań w warunkach beztlenowych wszystkie kroki na etapie przenoszenia muszą być wykonane bez dostępu tlenu (29)(30)(31)(32)(33).
1.8.3.3. Przechowywanie
Bardzo zaleca się użycie świeżo pobranego osadu, jeśli jednak konieczne jest jego przechowywanie, osad i woda powinny być przesiane, jak opisano powyżej i przechowywane razem, zalane wodą (6-10 cm warstwy wody), w ciemności, w temperaturze 4 ± 2 oC4 przez maksymalnie 4 tygodnie (7)(8)(23). Próbki przeznaczone do badań w warunkach tlenowych powinny być przechowywane przy swobodnym dostępie powietrza (np.: w otwartych pojemnikach), natomiast próbki do badań beztlenowych, bez dostępu tlenu. Podczas transportu i magazynowania nie może zajść zamrożenie osadu i wody i wysuszenie osadu.
1.8.4. Przygotowanie próbek osad/woda do badania
Okres przystosowawczy powinien nastąpić przed dodaniem substancji badanej, gdzie każda próbka osad/woda jest umieszczana w naczyniu inkubacyjnym, do użycia w badaniu głównym, i przystosowanie powinno być prowadzone dokładnie w tych samych warunkach, co inkubacja (zob. sekcja 1.9.1). Okres przystosowawczy jest to czas potrzebny do osiągnięcia przez układ umiarkowanej stabilności, co odzwierciedla pH, stężenie tlenu w wodzie, potencjał redoks osadu i wody, oraz makroskopowa separacja faz. Okres przystosowawczy powinien zazwyczaj trwać od jednego do dwóch tygodni i nie powinien przekroczyć czterech tygodni. Wyniki oznaczeń wykonanych w tym okresie powinny zostać podane w sprawozdaniu.
1.9. PROWADZENIE BADAŃ
1.9.1. Warunki badania
Badanie powinno być wykonane w aparaturze inkubacyjnej (patrz sekcja 1.8.1) przy stosunku wody do osadu na poziomie między 3:1 a 4:1, oraz grubością warstwy osadu 2,5 cm (± 0,5 cm)(4). Zaleca się minimalną ilość 50 g osadu (w suchej masie) na naczynie inkubacyjne.
Badanie powinno być wykonane w ciemności, w stałej temperaturze z przedziału 10-30 oC. Właściwa jest temperatura (20 ± 2) oC. W razie potrzeby, można rozważyć, stosownie do indywidualnego przypadku, dodatkową niższą temperaturę (np. 10 oC), zależnie od informacji wymaganych od badania. Temperatura inkubacji powinna być monitorowana i podana w sprawozdaniu.
1.9.2. Obróbka i podanie substancji badanej
Używane jest jedno badane stężenie substancji chemicznej(5). Dla środków ochrony upraw wprowadzanych bezpośrednio do części wód, należy przyjąć maksymalną dawkę na etykiecie, jako maksymalny stopień podania obliczony na podstawie pola powierzchni wody w naczyniu do badania. W innych przypadkach, użyte stężenie powinno być oparte na przewidywaniach emisji środowiskowych. Należy uważać, aby zapewnić, że zastosowane będzie odpowiednie stężenie substancji badanej, żeby scharakteryzować szlak przemian oraz powstawanie i zanik produktów przemian. Może być konieczne zastosowanie większych dawek (np.: 10 razy) w sytuacjach, w których stężenia substancji badanej są bliskie granicy wykrywalności na początku badania i/lub w których główne produkty przemian nie mogą być łatwo wykryte, jeżeli są obecne w ilości 10 % stopnia podania substancji badanej. Jednakże jeśli używa się wyższych stężeń testowych, nie powinny one mieć znaczącego niekorzystnego wpływu na aktywność mikrobiologiczną układu woda-osad. Żeby osiągnąć stałe stężenie substancji badanej w naczyniach o różnych wymiarach, można uznać za stosowne korektę ilości podanego materiału, na podstawie wysokości słupa wody w naczyniu w stosunku do głębokości wody w terenie (którą przyjmuje się jako 100 cm, ale mogą być użyte inne głębokości). Zob. załącznik 4 w celu uzyskania przykładowych obliczeń.
W idealnym przypadku substancja badana powinna być podana jako roztwór wodny do fazy wodnej układu badanego. Jeśli nie da się tego uniknąć, użycie małych ilości mieszających się z wodą rozpuszczalników (takich jak aceton, etanol) jest dopuszczalne dla podania i rozprowadzenia substancji badanej, ale nie powinno przekroczyć 1 % v/v i nie powinno mieć niekorzystnego wpływu na aktywność mikrobiologiczną układu badanego. Należy zachować ostrożność przy wytwarzaniu roztworu wodnego substancji badanej - może być właściwe użycie kolumn do wytwarzania i wstępnego mieszania, aby zapewnić kompletną homogeniczność. Po dodaniu roztworu wodnego do układu badanego zaleca się delikatne mieszanie fazy wodnej, aby możliwie najmniej zaburzyć osad.
Nie zaleca się rutynowego używania gotowych produktów, jako że składniki preparatu mogą wywierać wpływ na rozdział substancji badanej i/lub produktów przemian pomiędzy fazę wodną a osad. Jednakże dla substancji badanych o niskiej rozpuszczalności w wodzie zastosowanie produktów gotowych może być właściwym rozwiązaniem.
Liczba naczyń inkubacyjnych zależy od tego, ile razy są pobierane próbki (zob. sekcja 1.9.3). Należy uwzględnić wystarczającą liczbę układów badanych, tak żeby przy każdorazowym pobraniu próbek można było poświęcić dwa układy. Jeżeli stosuje się układy kontrolne wodnego układu osadowego, nie powinny być ona poddawane działaniu substancji badanej. Układy kontrolne mogą być użyte do oznaczenia biomasy mikrobiologicznej osadu i całkowitego węgla organicznego w wodzie i osadzie na końcu badania. Dwa z układów kontrolnych (np. jeden układ kontrolny każdego osadu wodnego) mogą być stosowane do
monitorowania wymaganych parametrów w osadzie i w wodzie podczas okresu przystosowawczego (zob. tabela w sekcji 1.8.2.2). Dwa dodatkowe układy kontrolne muszą być uwzględnione w przypadku, gdy substancja badana jest podana przy pomocy rozpuszczalnika, aby zmierzyæ niekorzystne skutki dla aktywności mikrobiologicznej układu badanego.
1.9.3. Czas badania i pobieranie próbek
Eksperyment badawczy nie powinien zazwyczaj trwać dłużej niż 100 dni (6) i powinien być kontynuowany tak długo, aż zostanie określony szlak degradacji i model rozkładu woda/osad lub kiedy 90 % substancji badanej zaniknie poprzez przemiany i/lub parowanie. Liczba pobrań próbek powinna wynosić co najmniej sześć (włączając czas zerowy), z opcjonalnym wstępnym badaniem (zob. sekcja 1.9.4) stosowanym do ustalenia właściwego reżimu pobierania próbek i czasu trwania badania, chyba że dostępne są wystarczające dane o substancji badanej z poprzednich badań. Dla hydrofobowych substancji badanych mogą być konieczne dodatkowe punkty pobierania próbek podczas początkowego okresu badania, w celu określenia stopnia rozdziału między fazę wodną a osadową.
We właściwych momentach pobierania próbek całe naczynia inkubacyjne (w powtórzeniach) usuwa się do analizy. Osad i woda znad niego są analizowane osobno(6). Należy ostrożnie usunąć wodę powierzchniową, żeby jak najmniej zaburzyć osad. Ekstrakcja i scharakteryzowanie substancji badanej i produktów przemian powinno nastąpić po właściwych procedurach analitycznych. Należy uważać przy usuwaniu materiału, który mógł zostać zaadsorbowany do naczynia inkubacyjnego, albo do łączących rur stosowanych do wyłapania części lotnych.
1.9.4. Opcjonalne wstępne badanie
Jeśli czas trwania i reżim pobierania próbek nie mogą być oszacowane na podstawie innych odnośnych badań substancji badanej, można uznać za stosowne opcjonalne wstępne badanie, które powinno być przeprowadzone przy użyciu tych samych warunków badania, jakie zostały zaproponowane do badania ostatecznego. Odnośne warunki doświadczalne i wyniki z badania wstępnego, jeśli je przeprowadzono, powinny być pokrótce przedstawione w sprawozdaniu.
1.9.5. Pomiary i analizy
Przy każdym pobieraniu próbek stężenie substancji badanej i produktów przemiany w wodzie i osadzie powinno być zmierzone i podane w sprawozdaniu (jako stężenie i jako procent całości dostarczonej). Generalnie, produkty przemian wykryte przy ≥ 10 % zastosowanej radioaktywności w całym układzie woda-osad przy każdorazowym pobieraniu próbek powinny zostać zidentyfikowane, chyba że można przedstawić rozsądne uzasadnienie braku potrzeby identyfikacji. Produkty przemian, których stężenie ciągle wzrasta podczas badania, również powinny być uwzględnione do identyfikacji nawet, jeśli ich stężenia nie przekraczają granic podanych wyżej, jako że może to wskazywać na trwałość. To drugie powinno być rozpatrywane indywidualnie, stosownie do przypadku, z uzasadnieniem przedstawionym w sprawozdaniu.
Wyniki z układu wychwytującego gazy/części lotne (CO2 i inne, np.: lotne związki organiczne) powinny być podawane przy każdym pobieraniu próbek. Należy podać w sprawozdaniu tempo mineralizacji. Pozostałości w osadzie nieulegające ekstrakcji (związane) powinny być podawane przy każdym pobieraniu próbek.
2. DANE
2.1. OBRÓBKA WYNIKÓW
Całkowity bilans masy lub odzysk (zob. sekcja 1.7.1) dodanych radioizotopów ma być obliczany przy każdorazowym pobieraniu próbek. Wyniki powinny być podawane jako procent dodanych radioizotopów. Rozdział izotopów między wodę a osad należy podać jako stężenia i procenty, przy każdym pobieraniu próbek.
Czas półtrwania, DT50, i w razie potrzeby, DT75 i DT90 substancji badanej powinny być obliczone wraz z ich granicami przedziału ufności (zob. sekcja 1.7.3). Informacje o szybkości rozpraszania substancji badanej w wodzie i osadzie można otrzymać poprzez użycie odpowiednich narzędzi oceny. Mogą to być zastosowania kinetyki pseudo pierwszego rzędu, empiryczne techniki dopasowania krzywych, które stosują rozwiązania graficzne lub numeryczne i wiele bardziej złożonych ocen z wykorzystaniem, na przykład, modeli jedno- lub wieloprzedziałowych. Dalsze szczegółowe informacje można otrzymać z odnośnych publikacji (35)(36)(37).
Wszystkie podejścia mają swoje słabe i mocne strony i znacznie się różnią w swojej złożoności. Założenie kinetyki pierwszego rzędu może być zbytnim uproszczeniem procesów degradacji i rozdziału, ale tam, gdzie jest to możliwe daje termin (stała tempa lub czas półtrwania), który jest łatwo zrozumiały i o wartości w modelowaniu symulacyjnym i obliczeniach przewidywanych stężeń środowiskowych. Podejścia empiryczne lub przemiany liniowe mogą dawać lepsze dopasowanie krzywych do danych i dlatego pozwalają na lepsze
oszacowanie czasów półtrwania, DT50 i, w razie potrzeby, wartości DT75 i DT90. Użycie wyprowadzonych stałych jest jednak ograniczone. Modele przedziałowe mogą wytwarzać wiele użytecznych stałych o wartości w ocenie ryzyka, które opisują tempo degradacji w różnych przedziałach i rozdział substancji chemicznej. Powinny być one również użyte do oszacowania stałych tempa dla powstawania i degradacji głównych produktów przemian. We wszystkich przypadkach wybrana metoda musi być uzasadniona i osoba badająca powinna przedstawić graficznie i/lub statystycznie zgodność wyników doświadczenia z przewidywaniami.
3. SPRAWOZDANIE
3.1 SPRAWOZDANIE Z BADANIA
Sprawozdanie musi zawierać następujące informacje:
Substancja badana:
- nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna, numer CAS, wzór strukturalny (wskazujący pozycję znacznika (znaczników), jeśli użyty jest materiał znakowany izotopowo) i odnośne właściwości fizyczno- chemiczne,
- czystość (zanieczyszczenia) substancji badanej,
- radiochemiczna czystość znakowanej substancji chemicznej i aktywność molowa (w razie potrzeby).
Substancje odniesienia:
- nazwa chemiczna i struktura substancji odniesienia użytej do scharakteryzowania i/lub identyfikacji produktów przemian
Badany osad i wody:
- lokalizacja i opis miejsca (miejsc) pobierania próbek wodnego osadu, z uwzględnieniem, jeśli to możliwe, historii zanieczyszczenia,
- wszystkie informacje odnoszące się do pobierania, przechowywania (jeśli było) i przystosowania układów woda-osad,
- charakterystyka próbek woda-osad wymieniona w tabeli w sekcji 1.8.2.2. Warunki badania:
- zastosowany układ badawczy (np. przepływ, biometr, sposób wentylacji, metoda mieszania, poziom wody, masa osadu, grubość zarówno warstwy wody, jak i osadu, wymiary naczyń do badań itp.)
- podanie substancji badanej do układu badanego: użyte stężenie badane, liczba powtórzeń i sposób kontroli podawania substancji badanej (np.: ewentualne użycie rozpuszczalnika), itp.,
- temperatura inkubacji,
- ilość razy pobierania próbek,
- metody ekstrakcji i wydajności, tak jak i metody analityczne i granice wykrywalności,
- metody charakterystyki/identyfikacji produktów przemiany,
- odchylenia od protokołu badawczego lub warunków badania podczas badania.
Wyniki:
- nieobrobione dane liczbowe analiz reprezentatywnych (wszystkie nieobrobione dane muszą być przechowywane w archiwum GLP),
- powtarzalność i czułość zastosowanych metod analitycznych,
- stopień odzysku (wartości procentowe dla ważnego badania są podane w sekcji 1.7.1),
- tabele wyników wyrażone, jako % dostarczonej dawki i w mg kg-1 w wodzie, osadzie i całkowitym układzie (tylko w %) dla substancji badanej i w razie potrzeby dla produktów przemian i izotopów nieulegających wyekstrahowaniu,
- bilans masowy podczas i na koniec badań,
- graficzne przedstawienie przemian we frakcjach wody i osadu oraz w całym układzie (wraz z mineralizacją),
- tempo mineralizacji,
- czas półtrwania, DT50 i w razie potrzeby wartości DT75 i DT90 dla substancji badanej i, jeżeli jest to właściwe, dla głównych produktów przemian w wodzie, w osadzie i w całym układzie, wraz z granicami przedziałów ufności,
- ocena kinetyki przemiany substancji badanej i w razie potrzeby głównych produktów przemian,
- proponowany szlak przemian, w razie potrzeby,
- dyskusja wyników.
4. BIBLIOGRAFIA
(1) BBA-Guidelines for the examination of plant protectors in the registration process. (1990). Part IV, Section 5-1: Degradability and fate of plant protectors in the water/sediment system. Germany.
(2) Commission for registration of pesticides: Application for registration of a pesticide. (1991). Part G. Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air, Section G.2.1 (a). The Netherlands.
(3) MAFF Pesticides Safety Directorate. (1992). Preliminary guideline for the conduct of biodegradability tests on pesticides in natural sediment/water systems. Ref No SC 9046. United-Kingdom.
(4) Agriculture Canada: Environmental chemistry and fate. (1987). Guidelines for registration of pesticides in Canada. Aquatic (Laboratory) - Anaerobic and aerobic. Canada. pp 35-37.
(5) US-EPA: Pesticide assessment guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental fate (1982). Section 162-3, Anaerobic aquatic metabolism.
(6) SETAC-Europe publication. (1995). Procedures for assessing the environmental fate and ecotoxicity of pesticides. Ed. Dr Mark R. Lynch. SETAC-Europe, Brussels.
(7) OECD Test Guidelines Programme. (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/ sediments, Belgirate, Italy, 18-20 January 1995.
(8) ISO/DIS 5667-12. (1994). Water quality - Sampling - Part 12: Guidance on sampling of bottom sediments.
(9) US-EPA (1998a). Sediment/water microcosm biodegradation test. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3180). EPA 712-C-98-080.
(10) DFG: Pesticide Bound Residues in Soil. Wiley-VCH (1998).
(11) T.R. Roberts: Non-extractable pesticide residues in soils and plants. Pure Appl. Chem. 56, 945-956 (IUPAC 1984).
(12) OECD Test Guideline 304A: Inherent Biodegradability in Soil (adopted 12 May 1981).
(13) OECD (1993): Guidelines for Testing of Chemicals. Paris. OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Testing of Chemicals.
(14) Scholz, K., Fritz R, Anderson C. and Spiteller M. (1988) Degradation of pesticides in an aquatic model ecosystem. BCPC - Pests and Diseases, 3B-4, 149-158.
(15) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide Biochemistry (D.H. Hutson, T.R Roberts, Eds.), Vol. 1, 85-114. J. Wiley & Sons.
(16) Madsen, T, Kristensen, P. (1997). Effects of bacterial inoculation and non-ionic surfactants on degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in soil. Environ. Toxicol. Chem. 16, 631-637.
(17) Steber, J., Wierich, P. (1987). The anaerobic degradation of detergent range fatty alcohol ethoxylates. Studies with 14C-labelled model surfactants. Water Research 21, 661-667.
(18) Black, CA. (1965). Metodas of Soil Analysis. Agronomy Monograph No. 9. American Society of Agronomy Madison.
(19) APHA (1989). Standard Metodas for Examination of Water and Wastewater (17th edition). American Public Health Association, American Water Works Association and Water Pollution Control Federation, Washington D.C.
(20) Rowell, D.L. (1994). Soil Science Metodas and Applications. Longman.
(21) Light, T.S. (1972). Standard solution for redox potential measurements. Anal. Chemistry 44, 1038-1039.
(22) SETAC-Europe publication (1991). Guidance document on testing procedures for pesticides in freshwater mesocosms. From the Workshop "A Meeting of Experts on Guidelines for Static Field Mesocosms Tests", 3-4 July 1991.
(23) SETAC-Europe publication. (1993). Guidance document on sediment toxicity tests and bioassays for freshwater and marine environments. From the Workshop On Sediment Toxicity Assessment (WOSTA), 8-10 November 1993. Eds.: I.R. Hill, P. Matthiessen and F. Heimbach.
(24) Vink, J.P.M., van der Zee, S.E.A.TM. (1997). Pesticide biotransformation in surface waters: multivariate analyses of environmental factors at field sites. Water Research 31, 2858-2868.
(25) Vink, J.P.M., Schraa, G., van der Zee, S.E.A.T.M. (1999). Nutrient effects on microbial transformation of pesticides in nitrifying waters. Environ. Toxicol, 329-338.
(26) Anderson, TH., Domsch, K.H. (1985). Maintenance carbon requirements of actively-metabolising microbial populations under in-situ conditions. Soil Biol. Biochem. 17, 197-203.
(27) ISO-14240-2. (1997). Soil quality - Determination of soil microbial biomass - Part 2: Fumigation-extraction method.
(28) Beelen, P. Van and F. Van Keulen. (1990), The Kinetics of the Degradation of Chloroform and Benzene in Anaerobic Sediment from the River Rhine. Hydrobiol. Bull. 24 (1), 13-21.
(29) Shelton, D.R. and Tiedje, J.M. (1984). General metoda for determining anaerobic biodegradation potential. App. Environ. Microbiol. 47, 850-857.
(30) Birch, R.R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, U., Steber, J., Reust, H. and Bontinck, W.J. (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1527-1550.
(31) Pagga, U. and Beimborn, D.B. (1993). Anaerobic biodegradation tests for organic compounds. Chemoshpere 27, 1499-1509.
(32) Nuck, B.A. and Federle, T.W. (1986). A partia test for assessing the mineralisation of 14C-radiolabelled compounds under realistic anaerobic conditions. Environ. Sci. Technol. 30, 3597-3603.
(33) US-EPA (1998b). Anaerobic biodegradability of organic chemicals. Harmonised Test Guidelines (OPPTS 835.3400). EPA 712-C-98-090.
(34) Sijm, Haller and Schrap (1997). Influence of storage on sediment characteristics and drying sediment on sorption coefficients of organic contaminants. Bulletin Environ. Contam. Toxicol. 58, 961-968.
(35) Timme, G., Frehse H. and Laska V. (1986) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues II. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer, 39, 187-203.
(36) Timme, G., Frehse, H. (1980) Statistical interpretation and graphic representation of the degradational behaviour of pesticide residues I. Pflanzenschutz - Nachrichten Bayer, 33, 47-60.
(37) Carlton, R.R. and Allen, R. (1994). The use of a compartment model for evaluating the fate of pesticides in sediment/water systems. Brighton Crop Protection Conference - Pest and Diseases, pp. 1349-1354.
______
(1) Na przykład, jeżeli substancja badana zawiera jeden pierścień, wymagane jest znakowanie na tym pierścieniu; jeżeli substancja badana zawiera dwa lub więcej pierścieni, mogą być potrzebne oddzielne badania w celu oceny losu każdego znakowanego pierścienia i w celu otrzymania odpowiednich informacji na temat powstawania produktów przemian.
(2) Ponieważ te zasadowe roztwory absorpcyjne pochłaniają również ditlenek węgla z wentylacji powietrzem i utworzony przez respirację w doświadczeniach tlenowych, muszą być regularnie wymieniane, aby uniknąć ich nasycenia, a tym samym utraty zdolności absorpcyjnej.
(3) [Glina i ił] jest frakcją mineralną osadu o ziarnistości < 50 μm
(4) Ostatnie badania pokazały, że przechowywanie w temp. 4 oC może prowadzić do spadku zawartości węgla organicznego w osadzie, co może ewentualnie skutkować spadkiem aktywności mikrobiologicznej. (34)
(5) Badanie z drugim stężeniem może być przydatne dla substancji chemicznych, które przechodzą do wód powierzchniowych innymi szlakami wejścia, powodujących znacznie inne stężenia, pod warunkiem, że niższe stężenie może być analizowane z wystarczającą dokładnością.
(6) W przypadkach gdy może łatwo wystąpić gwałtowne ponowne utlenianie produktów przemian beztlenowych, podczas pobierania próbek i analizy należy utrzymywać warunki beztlenowe.
ZAŁĄCZNIK 1
WYTYCZNE DLA UKLADÓW BADAWCZYCH W WARUNKACH TLENOWYCH I BEZTLENOWYCH
Układ badań w warunkach tlenowych
Układ badań w warunkach tlenowych opisany w tej metodzie badawczej składa się z natlenionej warstwy wody (typowe stężenie tlenu w zakresie 7 do 10 mg l-1) i z warstwy osadu, natlenionej na powierzchni i beztlenowej poniżej powierzchni (typowy średni potencjał redoks (Eh) w strefie beztlenowej osadu w zakresie od - 80 do - 190 mV). Nawilżone powietrze przechodzi nad powierzchnią wody w każdym urządzeniu do inkubacji, aby utrzymać wystarczającą ilość tlenu w przestrzeni nad roztworem.
Układ badań w warunkach beztlenowych
Dla układu badań w warunkach beztlenowych procedura badawcza jest zasadniczo taka sama, jak przedstawiono dla układów tlenowych z tym, że nawilżony azot przepływa nad powierzchnią wody w każdym urządzeniu inkubacyjnym, aby utrzymać atmosferę azotową w przestrzeni nad roztworem. Osad i woda są uważane za beztlenowe, jeśli potencjał redoks (Eh) jest niższy niż - 100 mV.
W badaniu w warunkach beztlenowych ocena mineralizacji obejmuje pomiar wydzielonego ditlenku węgla i metanu.
ZAŁĄCZNIK 2
PRZYKŁAD APARATURY PRZEPŁYWOWO-GAZOWEJ
ZAŁĄCZNIK 3
PRZYKŁADY APARATURY BIOMETRYCZNEJ
ZAŁĄCZNIK 4
PRZYKŁADOWE OBLICZENIA DLA DAWKI DOSTARCZANEJ DO NACZYŃ BADAWCZYCH
| Wewnętrzna średnica cylindra: | = 8 cm |
| Wysokość słupa wody bez osadu: | =12 cm |
| Pole powierzchni: 3,142 × 42 | = 50,3 cm2 |
| Stopień dostarczania: 500 g substancji badanej/ha odpowiada 5 μg/cm2 | |
| Dawka całkowita μg: 5 × 50,3 | = 251,5 μg |
| Korekta ilości w odniesieniu do głębokości 100 cm: | |
| 12 × 251,5 ÷ 100 | = 30,18 μg |
| Pojemność słupa wody: 50,3 × 12 | = 603 ml |
| Stężenie w wodzie: 30,18 ÷ 603 | = 0,050 μg/ml lub 50 μg/l |
C.25. MINERALIZACJA TLENOWA W WODZIE POWIERZCHNIOWEJ - SYMULACYJNE BADANIE BIODEGRADACJI
1. METODA
Niniejsza metoda odpowiada OECD TG 309 (2004)(1).
1.1. WSTĘP
Celem niniejszego badania jest zmierzenie czasowego przebiegu biodegradacji badanej substancji w małym stężeniu w napowietrzonej naturalnej wodzie oraz ilościowe wyrażenie wyników obserwacji w postaci wyrażeń szybkości w ujęciu kinetycznym. Niniejsze badanie symulacyjne jest laboratoryjną próbą prowadzoną w systemie okresowym, opartą na metodzie wstrząsanej kolby, mającą na celu wyznaczenie szybkości tlenowej biodegradacji substancji organicznych w próbkach naturalnej wody powierzchniowej (słodkiej, słonawej lub morskiej). Jest ono oparte na ISO/DIS 14592-1 (2) i zawiera również elementy zaczerpnięte w metod badawczych C.23 i C.24 (3)(4). Ewentualnie, przy długich czasach badania, prowadzenie badania w systemie okresowym zastępuje się prowadzeniem go w systemie półciągłym, aby nie dopuścić do pogorszenia się stanu mikrokosmosu. Zasadniczym celem symulacji jest określenie mineralizacji badanej substancji w wodzie powierzchniowej, przy czym mineralizacja stanowi podstawę do wyrażenia kinetyki degradacji. Jednakże dodatkowym drugorzędnym celem badania jest uzyskanie informacji o pierwotnej degradacji oraz informacji o głównych produktach przemiany. Identyfikacja produktów przemiany oraz, jeśli to możliwe, ilościowe określenie ich stężeń, są szczególnie ważne w przypadku substancji, które bardzo wolno ulegają mineralizacji (np. przy półokresach zaniku dla całkowitego szczątkowego 14C przekraczających 60 dni). Z powodu ograniczeń analitycznych do identyfikacji i ilościowego oznaczania głównych produktów przemiany zwykle należy używać wyższych stężeń badanej substancji (np. > 100 μg/l).
Niskie stężenie w niniejszym badaniu oznacza stężenie (np. mniejsze niż 1 μg/l - 100 μg/l), które jest na tyle niskie, iż zapewnia, że kinetyka biodegradacji uzyskana w badaniu odzwierciedla kinetyki spodziewane w środowisku. W stosunku do całkowitej masy ulegających biodegradacji substratów węglowych dostępnych w naturalnej wodzie użytej do badania badana substancja obecna w niskim stężeniu posłuży jako drugorzędny substrat. Oznacza to, że spodziewana kinetyka biodegradacji jest kinetyką pierwszego rzędu ("nierosnącą") i że badana substancja może ulegać degradacji poprzez "kometabolizm". Kinetyka pierwszego rzędu oznacza, iż szybkość degradacji (mg/l/dzień) jest proporcjonalna do stężenia substratu, które maleje w czasie. W przypadku rzeczywistej kinetyki pierwszego rzędu właściwa stała szybkości degradacji, k, jest niezależna od czasu i stężenia. Oznacza to, że k nie zmienia się znacząco w trakcie przebiegu doświadczenia i nie zmienia się wraz ze zwiększeniem stężenia pomiędzy doświadczeniami. Z definicji stała właściwej szybkości degradacji jest równa względnej zmianie stężenia przez czas k = (1/C) ∙ (dC/dt). Choć w zaleconych warunkach zwykle spodziewane są kinetyki pierwszego rzędu, to mogą istnieć pewne sytuacje, w których bardziej odpowiednie są inne kinetyki. Odchylenia od kinetyki pierwszego rzędu można obserwować np. wówczas, jeżeli szybkość biotransformacji jest ograniczana przez zjawiska związane z transportem masy, takie jak szybkość dyfuzji, a nie przez szybkość reakcji biologicznej. Jednakże dane można niemal zawsze opisać przy pomocy kinetyki pseudo pierwszego rzędu, przyjmując stałą szybkości zależną od stężenia.
Przed badaniem należy dysponować danymi o podatności na biodegradację badanej substancji w wyższych stężeniach (np. uzyskanymi ze standardowych prób przesiewowych), jak również danymi o podatności na degradację abiotyczną, produktach przemian oraz istotnych własnościach fizykochemicznych, w celu umożliwienia przeprowadzenia planowania doświadczeń oraz interpretacji wyników. Wyznaczenie podatności na ostateczną biodegradację umożliwia zastosowanie badanych substancji znakowanych za pomocą 14C i określenie rozkładu fazy 14C na końcu badania. Gdy użyta jest nieznakowana badana substancja, to ostateczną biodegradację można oszacować jedynie wówczas, jeśli badane jest wyższe stężenie i znane są wszystkie główne produkty przemiany.
1.2. DEFINICJE
Pierwotna biodegradacja: strukturalna zmiana (przemiana) substancji chemicznej przez mikroorganizmy, powodująca utratę chemicznej tożsamości.
Biodegradacja funkcjonalna: strukturalna zmiana (przemiana) substancji chemicznej przez mikroorganizmy, powodująca utratę określonej własności.
Ostateczna biodegradacja tlenowa: rozkład substancji chemicznej przez mikroorganizmy w obecności tlenu do dwutlenku węgla, wody i soli mineralnych wszelkich innych obecnych pierwiastków (mineralizacja) oraz wytworzenie nowej biomasy i produktów organicznych biosyntezy drobnoustrojowej.
Mineralizacja: rozkład substancji chemicznej lub materii organicznej przez mikroorganizmy w obecności tlenu do dwutlenku węgla, wody i soli mineralnych wszelkich innych obecnych pierwiastków.
Faza zastoju: czas od rozpoczęcia badania do osiągnięcia przystosowania się przez mikroorganizmy powodujące degradację oraz wzrostu stopnia biodegradacji substancji chemicznej lub materii organicznej do wykrywalnego poziomu (np. 10 % maksymalnej teoretycznej biodegradacji, bądź niższego, w zależności od dokładności techniki pomiarowej).
Maksymalny poziom biodegradacji: zapisany w procentach stopień biodegradacji substancji chemicznej lub materii organicznej podczas badania, powyżej którego nie następuje dalsza biodegradacja w trakcie badania.
Podstawowy substrat: zbiór naturalnych źródeł węgla i energii, które zapewniają wzrost i utrzymanie biomasy drobnoustrojowej.
Drugorzędny substrat: składnik substratowy obecny w tak niskim stężeniu, iż wskutek jego degradacji właściwym mikroorganizmom dostarczane są jedynie nieznaczne ilości węgla i energii w porównaniu do ilości węgla i energii dostarczanych w wyniku degradacji głównych składników substratowych (podstawowych substratów).
Stała szybkości degradacji: kinetyczna stała szybkości pierwszego rzędu lub pseudo pierwszego rzędu, k (d-1), która wskazuje szybkość procesów biodegradacji. Dla doświadczenia prowadzonego okresowo k oszacowuje się na podstawie początkowej części krzywej biodegradacji uzyskanej po końcu fazy opóźniania.
Czas półtrwania, t1/2 (d): termin używany do charakteryzowania szybkości reakcji pierwszego rzędu. Jest to przedział czasu, który odpowiada zmniejszeniu się stężenia o czynnik 2. Czas półtrwania i stała szybkości biodegradacji związane są równaniem t1/2 = ln2/k.
Półokres degradacji, DT50 (d): termin używany do ilościowego wyrażenia wyniku badań biodegradacji. Jest to przedział czasu, wraz z fazą opóźniania, potrzebny do osiągnięcia wartości biodegradacji wynoszącej 50 %.
Granica wykrywalności (LOD) i granica kwantyfikacji (LOQ): granica wykrywalności (LOD) jest to stężenie substancji, poniżej którego tożsamości substancji nie można odróżnić od ubocznych efektów analitycznych. Granica kwantyfikacji (LOQ) jest to stężenie substancji, poniżej którego stężenia nie można oznaczyć z zadowalającą dokładnością.
Rozpuszczony węgiel organiczny (RWO): ta część węgla organicznego w próbce wody, której nie można usunąć za pomocą określonej metody rozdzielania faz, na przykład poprzez odwirowanie przy 40.000 ms-2 przez 15 min lub przez filtrację przeponową z użyciem przepon o średnicy porów 0,2 μm-0,45 μm.
Aktywność całkowitego organicznego 14C (TOA): całkowita aktywność 14C związana z węglem organicznym.
Aktywność rozpuszczonego organicznego 14C (DOA): całkowita aktywność 14C związana z rozpuszczonym węglem organicznym.
Aktywność organicznego 14C w postaci cząstek stałych (POA): całkowita aktywność 14C związana z węglem organicznym w postaci cząstek stałych.
1.3. STOSOWALNOŚĆ BADANIA
Niniejsze badanie symulacyjne stosuje się do nielotnych lub nieznacznie lotnych substancji organicznych badanych w niskich stężeniach. Gdy używa się kolb otwartych do atmosfery (np. zamkniętych watą), to substancje o stałych prawa Henry'ego mniejszych niż około 1 Pa∙ m3/mol (ok. 10-5 atm∙ m3/mol) można w praktyce uważać za nielotne. Gdy używa się zamkniętych kolb z przestrzenią nad roztworem, to możliwe jest badanie nieznacznie lotnych substancji (o stałych prawa Henry'ego < 100 Pa∙ m3/mol lub < 10-3 atm∙ m3/mol) bez strat z układu próbnego. Strata substancji znakowanych przy pomocy 14C może wystąpić, jeśli nie zachowuje się prawidłowych środków ostrożności podczas usuwania CO2. W takich sytuacjach może być konieczne wychwycenie CO2 w wewnętrznym absorberze z alkaliami lub użycie zewnętrznego układu absorbera CO2 (bezpośrednie oznaczanie 14CO2; zob. dodatek 3). Do wyznaczania kinetyki biodegradacji, stężenia badanej substancji muszą być niższe od jej rozpuszczalności w wodzie. Należy zwrócić uwagę jednak, że literaturowe wartości rozpuszczalności w wodzie mogą być znacznie wyższe niż rozpuszczalność badanej substancji w naturalnych wodach. Ewentualnie rozpuszczalność badanych substancji szczególnie trudno rozpuszczalnych w wodzie można ustalić przy użyciu naturalnych wód.
Metoda może być stosowana do symulowania biodegradacji w wodzie powierzchniowej wolnej od dużych cząstek ("próba pelagiczna") lub w mętnej wodzie powierzchniowej, która może istnieć np. w pobliżu granicy faz woda/osad ("próba z zawieszonym osadem").
1.4. ZASADA BADANIA
Badanie przeprowadza się w systemie okresowym przez inkubowanie badanej substancji samą wodą powierzchniową ("próba pelagiczna") lub wodą powierzchniową doprawioną zawieszonymi cząstkami stałymi/osadem w ilości 0,01-1 g/l suchej masy ("próba z zawieszonym osadem"), symulując zbiornik wodny z zawieszonymi cząstkami stałymi lub ponownie zawieszonym osadem. Stężenie zawieszonych cząstek stałych/osadu w dolnym zakresie tego przedziału jest typowe dla większości wód powierzchniowych. Kolby próbne inkubuje się w ciemności w temperaturze środowiska w warunkach aerobowych, stosując mieszanie. W celu określenia kinetyki degradacji należy użyć co najmniej dwóch różnych stężeń badanej substancji. Stężenia powinny różnić się od siebie o czynnik 5-10 i powinny reprezentować spodziewany zakres stężeń w środowisku. Maksymalne stężenie badanej substancji nie powinno przekraczać 100 µg/l, lecz aby zapewnić, że biodegradacja będzie przebiegać zgodnie z kinetyką pierwszego rzędu preferowane jest stężenie wynoszące 10 µg/l lub mniej. Najniższe stężenie nie powinno przekraczać 10 µg/l, lecz preferowane są niższe stężenia próbne, wynoszące 1-2 μg/l lub poniżej 1 μg/l. Zwykle zadowalającą analizę tak niskich stężeń można wykonać, używając dostępnych w handlu substancji znakowanych za pomocą 14C. Z uwagi na ograniczenia analityczne często niemożliwe jest zmierzenie stężenia badanej substancji z wymaganą dokładnością, jeżeli badana substancja jest zastosowana w stężeniu ≤ 100 µg/l (zob. akapit drugi w sekcji 1.7.2). Do identyfikacji i ilościowego oznaczenia głównych produktów przemiany lub wówczas, gdy nie jest dostępna konkretna metoda analityczna o niskiej granicy wykrywania, mogą być stosowane wyższe stężenia badanej substancji (> 100 µg/l, a niekiedy > 1 mg/l). Jeżeli badane są wysokie stężenia badanej substancji, to może być niemożliwe wykorzystanie wyników do oszacowania stałej i czasu półtrwania degradacji pierwszego rzędu, gdyż degradacja prawdopodobnie nie będzie przebiegać zgodnie z kinetyką pierwszego rzędu.
Degradację śledzi się w odpowiednich odstępach czasu, mierząc resztkowy 14C lub stężenie resztkowe badanej substancji, gdy stosowana jest specyficzna analiza chemiczna. Oznakowanie za pomocą 14C najbardziej trwałej części cząsteczki zapewnia wyznaczenie całkowitej mineralizacji, podczas gdy oznakowanie przy pomocy 14C mniej trwałej części cząsteczki, jak również zastosowanie specyficznej analizy, umożliwia ocenę jedynie biodegradacji pierwotnej. Jednakże najbardziej trwała część cząsteczki niekoniecznie obejmuje właściwą funkcjonalną część cząsteczki (którą można powiązać z określoną własnością, taką jak toksyczność, bioakumulacja, itp.). W tej sytuacji, aby śledzić eliminację określonej własności, stosowne może być wykorzystanie badanej substancji, która jest oznakowana za pomocą 14C w części funkcjonalnej.
1.5. INFORMACJE O BADANEJ SUBSTANCJI
Do niniejszego badania mogą być używane substancje próbne zarówno znakowane, jak i nieznakowane izotopem promieniotwórczym. Zalecana jest technika znakowania za pomocą 14C i znakowanie zwykle powinno być wykonane w najbardziej trwałej części(-ach) cząsteczki (zob. również - sekcja 1.4). W przypadku substancji zawierających więcej niż jeden pierścień aromatyczny, najlepiej jeden lub więcej atomów węgla w każdym pierścieniu powinno być oznakowanych za pomocą 14C. Ponadto, najkorzystniej jest, jeśli za pomocą 14C oznakowany jest jeden lub więcej atomów węgla po obydwu stronach wiązań łatwo ulegających degradacji. Chemiczna i/lub radiochemiczna czystość badanej substancji powinna wynosić > 95 %. Dla substancji znakowanych izotopem promieniotwórczym, preferowana jest aktywność właściwa wynosząca ok. 50 μCi/mg (1,85 MBq) lub więcej, aby ułatwić pomiary 14C w badaniach prowadzonych przy niskich początkowych stężeniach. Powinny być dostępne następujące dane o badanej substancji:
- rozpuszczalność w wodzie [metoda A.6],
- rozpuszczalność w organicznym rozpuszczalniku(-ach) (substancje stosowane z rozpuszczalnikiem lub substancje o niskiej rozpuszczalności w wodzie),
- stała dysocjacji (pKa), jeżeli substancja jest podatna na protonację lub deprotonację [OECD TG 112] (5),
- ciśnienie pary [metoda A.4] oraz stała prawa Henry'ego,
- chemiczna trwałość w wodzie i w ciemności (hydroliza) [metoda C.7].
Gdy słabo rozpuszczalne w wodzie substancje są badane w wodzie morskiej, to może być przydatna znajomość stałej wysalania (lub stałej "Setczenowa") Ks, którą określa wyrażenie: log (S/S') = Ks Cm, w którym S i S' jest rozpuszczalnością, odpowiednio, w wodzie słodkiej i w wodzie morskiej, a Cm stężeniem molowym soli.
Jeżeli badanie przeprowadza się jako "próbę zawieszonego osadu", to powinny być również dostępne następujące dane:
- współczynnik podziału n-oktanol/woda [metoda A.8],
- współczynnik adsorpcji [metoda C.18].
Do innych przydatnych danych mogą należeć:
- stężenie w środowisku, jeśli jest znane lub oszacowane,
- toksyczność badanej substancji w stosunku do mikroorganizmów [metoda C.11],
- gotowa i/lub naturalna podatność na biodegradację [metody C.4 A-F, C.12, C.9, OECD TG 302 (5)],
- podatność na aerobową lub anaerobową biodegradację w badaniach przemiany w glebie i osadzie/wodzie [metody C.23, C.24].
1.6. SUBSTANCJA ODNIESIENIA
Jako substancję odniesienia należy zastosować substancję, która normalnie łatwo ulega degradacji w warunkach aerobowych (tj. anilinę lub benzoesan sodu). Spodziewany okres dla degradacji aniliny i benzoesanu sodu wynosi zwykle mniej niż 2 tygodnie. Zadaniem substancji odniesienia jest zapewnienie, że aktywność drobnoustrojowa wody zawiera się w pewnych granicach, tzn. że woda zawiera aktywną populację drobnoustrojów.
1.7. KRYTERIA JAKOŚCI
1.7.1. Odzysk
Natychmiast po dodaniu badanej substancji każde początkowe stężenie należy sprawdzić poprzez pomiary aktywności 14C lub, w przypadku nieznakowanych substancji, za pomocą analiz chemicznych, w co najmniej podwójnych próbkach. Dostarcza to informacji o stosowalności i powtarzalności metody analitycznej oraz o jednorodności rozkładu badanej substancji. Zwykle w późniejszych analizach danych używa się zmierzonej początkowej aktywności 14C lub stężenia badanej substancji zamiast nominalnego stężenia, gdyż w ten sposób kompensuje się straty spowodowane sorpcją i błędami dozowania. Dla substancji znakowanej za pomocą 14C poziom odzysku na końcu doświadczenia dany jest przez bilans masy (zob. ostatni akapit w sekcji 1.8.9.4). Najlepiej jest, jeśli bilans masy znakowanej izotopem promieniotwórczym zawiera się w granicach 90-110 %, natomiast dla nie-znakowanych badanych substancji dokładność analityczna powinna prowadzić do początkowego odzysku wynoszącego 70-110 %. Zakresy te należy interpretować jako docelowe i nie należy używać ich jako kryteriów dla przyjęcia badania. Ewentualnie dokładność analityczną można wyznaczyć dla badanej substancji w niższym stężeniu niż początkowe stężenie oraz dla głównych produktów przemiany.
1.7.2. Powtarzalność i czułość metody analitycznej
Powtarzalność metody analitycznej (w tym wydajność początkowej ekstrakcji) w ilościowym oznaczaniu badanej substancji oraz produktów przemiany, jeśli stosowne, należy sprawdzić za pomocą pięciu powtórzonych analiz indywidualnych ekstraktów wody powierzchniowej.
Granica wykrywalności (LOD) metody analitycznej dla badanej substancji i dla produktów przemiany powinna wynosić co najmniej 1 % początkowej ilości wprowadzonej do badanego układu, jeśli to możliwe. Granica kwantyfikacji (LOQ) powinna być mniejsza lub równa 10 % zastosowanego stężenia. Analizy chemiczne wielu substancji organicznych i produktów ich przemiany często wymagają, aby badana substancja była wprowadzona w stosunkowo dużym stężeniu, tj. > 100 μg/l.
1.8. OPIS METODY BADAWCZEJ
1.8.1. Sprzęt
Badanie można prowadzić w kolbach stożkowych lub cylindrycznych o odpowiedniej pojemności (np. 0,5 lub 1,0 litra) zamkniętych korkiem silikonowym lub gumowym bądź w kolbach na surowicę z wieczkami szczelnymi dla CO2 (np. przykrywkami z gumy butylowej). Inną możliwością jest prowadzenie badania przy użyciu wielu kolb i zbieranie całych kolb, co najmniej podwójnie, o każdym czasie przewidzianym na pobranie próbki (zob. ostatni akapit w sekcji 1.8.9.1). Dla nielotnych badanych substancji, które nie są oznakowane izotopem promieniotwórczym, nie są wymagane gazoszczelne korki lub przykrywki; odpowiednie są luźne tampony z waty, które zapobiegają zanieczyszczeniu z powietrza (zob. akapit drugi w sekcji 1.8.9.1). Nieznacznie lotne substancje należy badać w układzie typu biometr z łagodnym mieszaniem powierzchni wody. Aby być pewnym, że nie występuje zanieczyszczenie bakteryjne, przed użyciem naczynia można dodatkowo wysterylizować przez ogrzanie lub autoklawizowanie. Ponadto używany jest następujący standardowy sprzęt laboratoryjny:
- stół wibracyjny lub mieszadła magnetyczne do ciągłego mieszania kolb próbnych,
- wirówka,
- pehametr,
- turbidymetr do nefelometrycznych pomiarów zmętnienia,
- piec lub kuchenka mikrofalowa do oznaczeń masy suchej,
- aparat do filtracji przeponowej,
- autoklaw lub piec do sterylizacji szkła laboratoryjnego,
- urządzenia do manipulacji substancjami oznakowanymi przy pomocy 14C,
- sprzęt do ilościowego określania aktywności 14C w próbkach pobranych z roztworów wychwytujących CO2 oraz, jeśli to wymagane, w próbkach osadu,
- sprzęt analityczny do oznaczania badanej substancji (i substancji odniesienia), jeżeli stosowana jest specyficzna analiza chemiczna (np. chromatograf gazowy, wysokociśnieniowy chromatograf cieczowy).
1.8.2. Roztwory wzorcowe badanej substancji
Do sporządzenia roztworów podstawowych badanej substancji i substancji odniesienia używa się wody dejonizowanej (zob. akapit pierwszy w sekcji 1.8.7). Woda dejonizowana powinna być wolna od substancji, które mogą być toksyczne dla mikroorganizmów, zaś stężenie rozpuszczonego węgla organicznego (RWO) nie powinno być większe niż 1 mg/l (6).
1.8.3. Pobranie i transport wody powierzchniowej
Miejsce do pobrania próbki wody powierzchniowej należy wybrać stosownie do celu badania w danej sytuacji. Przy wyborze miejsc do pobrania próbki należy wziąć pod uwagę historię możliwych wprowadzanych zanieczyszczeń rolniczych, przemysłowych lub domowych. Jeżeli wiadomo, że środowisko wodne było zanieczyszczane badaną substancją lub jej strukturalnymi analogami w ciągu poprzednich czterech lat, to nie należy go wykorzystywać do pobrania wody do badania, chyba że wyraźnym celem badacza jest zbadanie szybkości degradacji w poprzednio eksponowanych miejscach. W miejscu pobrania należy zmierzyć pH i temperaturę wody. Ponadto należy odnotować głębokość pobierania próbki oraz wygląd próbki wody (np. barwę i mętność) (zob. sekcja 3). Należy zmierzyć stężenie tlenu i/lub potencjał redoks w wodzie i w powierzchniowej warstwie osadu, aby wykazać istnienie warunków aerobowe, chyba że jest to oczywiste na podstawie oceny wyglądu i historycznych doświadczeń dotyczących miejsca. Wodę powierzchniową należy transportować w dokładnie wyczyszczonym pojemniku. Podczas transportu, temperatura próbki nie powinna znacząco przekraczać temperatury stosowanej w badaniu. Zalecane jest ochłodzenie do temperatury 4 oC, jeśli czas trwania transportu przekracza 2-3 godziny. Próbki wody nie wolno zamrażać.
1.8.4. Przechowywanie i przygotowywanie wody powierzchniowej
Badanie najlepiej jest rozpocząć w ciągu jednego dnia od pobrania próbki. Przechowywanie wody, jeśli konieczne, powinno być ograniczone do minimum i w żadnym wypadku nie może przekroczyć maksymalnego okresu wynoszącego 4 tygodnie. Do czasu użycia próbkę wody należy utrzymywać w temperaturze 4 °C z napowietrzaniem. Przed użyciem należy usunąć duże cząstki, np. za pomocą filtracji przez filtr nylonowy o rozmiarze otworów 100 μm lub przez zgrubny filtr papierowy bądź poprzez sedymentację.
1.8.5. Sporządzenie wody doprawionej osadem (do wyboru)
Do próby zawieszonego osadu do kolb zawierających naturalną wodę (przefiltrowaną w celu usunięcia dużych cząstek, jak opisano w sekcji 1.8.4) dodaje się osad powierzchniowy, aby uzyskać zawiesinę; stężenie zawieszonych cząstek stałych powinno zawierać się w granicach 0,01-1 g/l. Osad powierzchniowy powinien pochodzić z tego samego miejsca, z którego pobrano próbkę wody. W zależności od konkretnego środowiska wodnego osad powierzchniowy może charakteryzować się wysoką zawartością węgla organicznego (2,5-7,5 %) i drobnoziarnistą strukturą lub niską zawartością węgla organicznego (0,5-2,5 %) i gruboziarnistą strukturą (3). Osad powierzchniowy można przygotować następująco: pobrać kilka rdzeni osadu, używając rurki z przezroczystego tworzywa sztucznego, natychmiast po pobraniu próbek odciąć górne warstwy aerobowe (od powierzchni do głębokości maks. 5 mm) i połączyć je z sobą. Otrzymaną w wyniku próbkę osadu należy przetransportować w pojemniku z dużą objętością powietrza nad osadem, aby utrzymać osad w warunkach aerobowych (ochłodzić do temperatury 4 oC, jeśli czas transportu przekracza 2-3 godziny). Z próbki osadu należy sporządzić zawiesinę w badanej wodzie w stosunku 1:10 i do czasu użycia utrzymywać w temperaturze 4 oC z napowietrzaniem. Przechowywanie osadu, jeśli jest wymagane, powinno być ograniczone do minimum i w żadnym wypadku nie może przekroczyć maksymalnego okresu wynoszącego 4 tygodnie.
1.8.6. Procedura półciągła (do wyboru)
Jeśli występuje długa zwłoka czasowa, to może być wymagana dłuższa inkubacja (trwająca kilka miesięcy), zanim można będzie zmierzyć znaczącą degradację badanej substancji. Jeśli wiadomo o tym z poprzedniego badania substancji, to badanie można rozpocząć, stosując procedurę półciągłą, która pozwala na okresową wymianę części badanej wody lub zawiesiny (zob. dodatek 2). Alternatywnie normalne badanie prowadzone w systemie okresowym można zamienić na badanie półciągłe, jeśli nie została osiągnięta degradacja badanej substancji w ciągu około 60 dni badania z użyciem procedury okresowej (zob. akapit drugi w sekcji 1.8.8.3).
1.8.7. Dodanie substancji badanej (lub odniesienia)
W przypadku substancji o wysokiej rozpuszczalności w wodzie (> 1 mg/L) i małej lotności (stałe prawa Henry'ego < 1 Pa∙ m3/mol lub < 10-5 atm∙ m3/mol) roztwór podstawowy można sporządzić w wodzie dejonizowanej (zob. sekcja 1.8.2); odpowiednią objętość roztworu podstawowego dodaje się do naczyń próbnych, aby uzyskać żądane stężenie. Objętość każdego dodawanego roztworu podstawowego należy ograniczyć do praktycznie możliwego minimum (< 10 % końcowej objętości cieczy, jeśli to możliwe). Inna procedura polega na rozpuszczeniu badanej substancji w dużej objętości badanej wody, co można uważać za procedurę alternatywną dla użycia rozpuszczalników organicznych.
Jeśli to nieuniknione, roztwory podstawowe nielotnych substancji o słabej rozpuszczalności w wodzie należy sporządzić przy użyciu lotnego rozpuszczalnika organicznego, lecz ilość rozpuszczalnika dodanego do układu nie powinna przekraczać 1 % obj. i nie powinna mieć negatywnych wpływów na aktywność drobnoustrojów. Rozpuszczalnik nie powinien wpływać na stabilność badanej substancji w wodzie. Rozpuszczalnik należy ograniczyć do bardzo małej ilości, tak aby nie zwiększył znacząco stężenia RWO w badanej wodzie lub zawiesinie. Należy to sprawdzić za pomocą analizy specyficznej dla substancji lub, jeśli to możliwe, za pomocą analizy RWO (6). Należy starać się ograniczyć ilość przenoszonego rozpuszczalnika do absolutnie niezbędnej wielkości oraz upewnić się, że ilość badanej substancji może rozpuścić się w końcowej objętości badanej wody. Do wprowadzenia badanej substancji do naczyń próbnych można użyć innych technik, takich jak opisane w (7) i (8). Gdy do wprowadzenia badanej substancji użyty jest rozpuszczalnik organiczny, to próby z rozpuszczalnikiem zawierające badaną wodę (bez dodatków) i badaną wodę z dodatkiem substancji odniesienia należy potraktować podobnie, jak aktywne naczynia próbne zaprawione badaną substancją w nośniku rozpuszczalnikowym. Celem użycia prób kontrolnych z rozpuszczalnikiem jest zbadanie możliwych ujemnych skutków powodowanych przez rozpuszczalnik w populacji mikroorganizmów, uwidocznionych przez degradację substancji odniesienia.
1.8.8. Warunki badania
1.8.8.1. Temperatura badania
Inkubacja powinna odbywać się w ciemności (preferowane) lub w rozproszonym świetle w regulowanej temperaturze (± 2 oC), którą może być temperatura polowa lub standardowa temperatura 20-25 oC. Temperaturą polową może być rzeczywista temperatura próbki w czasie jej pobierania lub średnia temperatura otoczenia w miejscu pobierania próbki.
1.8.8.2. Mieszanie
Należy zapewnić mieszanie poprzez ciągłe wstrząsanie lub mieszanie, aby utrzymać cząstki i mikroorganizmy w zawiesinie. Mieszanie ułatwia również przenoszenie tlenu z przestrzeni nad cieczą do cieczy, tak aby mogły być należycie utrzymane warunki aerobowe. Ustawić kolby na stole wibracyjnym (z prędkością mieszania ok. 100 obr./min) lub użyć mieszadła magnetycznego. Mieszanie musi być ciągłe. Jednakże wstrząsanie lub mieszanie powinno być możliwie jak najbardziej łagodne, przy jednoczesnym utrzymywaniu jednorodnej zawiesiny.
1.8.8.3. Czas trwania badania
Czas trwania badania zwykle nie powinien przekraczać 60 dni, chyba że zastosowana jest procedura półciągła z okresową wymianą badanej zawiesiny (zob. sekcja 1.8.6 i dodatek 2). Jednakże okres badania w przypadku próby okresowej może być przedłużony do 90 dni, jeżeli degradacja badanej substancji rozpoczęła się w ciągu pierwszych 60 dni. Degradację monitoruje się w odpowiednich odstępach czasu poprzez wyznaczanie aktywności resztkowego 14C lub wydzielonego 14CO2 (zob. sekcja 1.8.9.4) i/lub za pomocą analizy chemicznej (sekcja 1.8.9.5). Czas inkubacji musi być wystarczająco długi, aby ocenić proces degradacji. Stopień degradacji najlepiej powinien przekraczać 50 %; w przypadku substancji powoli ulegających degradacji, stopień degradacji musi być dostateczny (zwykle większy niż 20 % degradacji), aby zapewnić oszacowanie kinetycznej stałej szybkości degradacji.
Należy prowadzić okresowe pomiary pH i stężenia tlenu w układzie, chyba że poprzednie doświadczenia uzyskane z podobnych badań z udziałem próbek wody i osadu pobranych z tego samego miejsca wskazują, że pomiary takie są niepotrzebne. W pewnych warunkach może zdarzyć się, że metabolizm podstawowych substratów przy znacznie wyższych stężeniach w wodzie lub osadzie spowoduje na tyle duże wydzielenie się CO2 i wyczerpanie się tlenu, że znacząco zmieni warunki doświadczalne podczas badania.
1.8.9. Procedura
1.8.9.1. Przygotowanie kolb do próby pelagicznej
Przenieść odpowiednią objętość badanej wody do kolb próbnych do około jednej trzeciej objętości kolby, ale nie mniej niż około 100 ml. Jeżeli użytych jest wiele kolb (w celu umożliwienia zebrania całych kolb o każdym czasie pobierania próbek), to odpowiednia objętość badanej wody również wynosi około 100 ml, gdyż małe objętości próbek mogą wpływać na długość fazy zastoju. Badaną substancję dodaje się z roztworu podstawowego, jak opisano w sekcjach 1.8.2 i 1.8.7. Należy użyć co najmniej dwóch różnych stężeń badanej substancji, różniących się o czynnik 5-10, aby określić kinetykę degradacji i obliczyć kinetyczną stałą szybkości degradacji. Obydwa wybrane stężenia powinny być mniejsze niż 100 µg/l, a najlepiej powinny zawierać się w przedziale < 1-10 µg/l.
Zamknąć kolby korkami lub przykrywkami nieprzepuszczalnymi dla powietrza i CO2. Dla nieznakowanych za pomocą 14C nielotnych badanych substancji chemicznych odpowiednie są luźne tampony z waty, które zapobiegają przedostawaniu się zanieczyszczeń z powietrza (zob. sekcja 1.8.1), pod warunkiem iż wiadomo, że wszelkie główne produkty degradacji są nielotne i jeżeli stosowane jest bezpośrednie oznaczanie CO2 (zob. dodatek 3).
Inkubować kolby w wybranej temperaturze (zob. sekcja 1.8.8.1). Pobrać próbki do analizy chemicznej lub pomiarów 14C na początku badania (tj. przed rozpoczęciem się biodegradacji; zob. sekcja 1.7.1), a następnie w odpowiednich odstępach czasu w trakcie przebiegu badania. Próbkowanie można przeprowadzić przez pobranie podpróbek (np. porcji po 5 ml) z każdego replikatu lub przez zebranie całych kolb o każdym czasie próbkowania. Mineralizację badanej substancji można określić pośrednio lub bezpośrednio (zob. dodatek 3). Zwykle podczas fazy degradacji (tj. po zakończeniu fazy zastoju) wymaganych jest minimum pięć punktów próbkowania w celu oszacowania wiarygodnej stałej szybkości, chyba że można uzasadnić, iż dla substancji szybko ulegających degradacji wystarczą trzy punkty próbkowania. W przypadku substancji, które nie ulegają szybko degradacji, można z łatwością wykonać większą ilość pomiarów podczas fazy degradacji i dlatego do oszacowania k należy użyć więcej punktów danych. Nie można podać ustalonego harmonogramu pobierania próbek, gdyż szybkość biodegradacji jest zmienna; jednakże zaleca się, aby pobrać próbkę raz na tydzień, jeśli degradacja jest powolna. Jeżeli badana substancja szybko ulega degradacji, to pobranie próbki powinno odbywać się raz na dzień w ciągu pierwszych trzech dni, a następnie co dwa lub trzy dni. W niektórych sytuacjach, jak na przykład w przypadku substancji szybko hydrolizujących, może być konieczne pobieranie próbek w odstępach godzinnych. Zaleca się, aby przed badaniem przeprowadzić badanie wstępne w celu określenia odpowiednich odstępów próbkowania. Jeżeli próbki muszą być dostępne do dalszej specjalnej analizy, to wskazane jest, aby pobrać większą ilość próbek, a następnie wybrać te, które będą analizowane na końcu doświadczenia, postępując według strategii "wstecz", zgodnie z którą ostatnie próbki są analizowane jako pierwsze (zob. akapit drugi w sekcji 1.8.9.5, gdzie podano wskazówki dotyczące trwałości próbek w czasie przechowywania).
1.8.9.2. Liczba kolb i próbek
Przygotować dostateczną ilość kolb próbnych, tak aby mieć:
- kolby próbne; co najmniej po dwie kolby do każdego stężenia badanej substancji (najlepiej minimum 3) lub wiele kolb próbnych do każdego stężenia, jeżeli o każdym czasie próbkowania zbierane są całe kolby (symbol FT),
- kolby próbne do obliczenia bilansu masy; co najmniej pod dwie kolby do każdego badanego stężenia (symbol FM),
- ślepą próbę kontrolną, bez badanej substancji; co najmniej jedną kolbę próbną zawierającą tylko badaną wodę (symbol FB),
- porównawczą próbę kontrolną; po dwie kolby z substancją odniesienia (np. aniliną lub benzoesanem sodu, o stężeniu 10 µg/l) (symbol FC). Celem porównawczej próby kontrolnej jest potwierdzenie minimalnej aktywności drobnoustrojów. Jeśli jest to dogodne, można użyć substancji odniesienia znakowanej izotopem promieniotwórczym, także wówczas, gdy degradacja badanej substancji jest monitorowana za pomocą analiz chemicznych,
- sterylną próbę kontrolną; jedną lub dwie kolby zawierające wysterylizowaną badaną wodę do zbadania możliwej abiotycznej degradacji lub innego niebiologicznego usuwania badanej substancji (symbol FS). Biologiczną aktywność można zatrzymać przez autoklawizowanie badanej wody (121 °C; 20 min) lub przez dodanie środka toksycznego (np. azydku sodowego (NaN3) o stężeniu 10-20 g/l, chlorku rtęciowego (HgCl2) o stężeniu 100 mg/l lub formaliny o stężeniu 100 mg/l) bądź przez napromieniowanie promieniami gamma. Jeżeli wykorzystuje się HgCl2, to należy go zutylizować, tak jak odpad toksyczny. W przypadku wody z osadem dodanym w dużej ilości nie jest łatwo uzyskać sterylne warunki; w takim przypadku zaleca się kilkukrotne (np. trzykrotne) autoklawizowanie. Należy wziąć pod uwagę, że wskutek autoklawizowania może zmienić się charakterystyka sorpcyjna osadu,
- próby kontrolne z rozpuszczalnikiem, zawierające badaną wodę oraz badaną wodę z substancją odniesienia; po dwie kolby potraktowane taką samą ilością rozpuszczalnika i przy zastosowaniu takiej samej procedury, jak użyta do wprowadzania badanej substancji. Celem jest zbadanie możliwych negatywnych wpływów rozpuszczalnika przez określenie degradacji badanej substancji.
W planie badania badacz powinien wziąć pod uwagę względne znaczenie zwiększonej ilości powtórzeń doświadczalnych w zależności od zwiększonej krotności próbkowania. Dokładna liczba potrzebnych kolb zależeć będzie od metody użytej do mierzenia degradacji (zob. akapit trzeci w sekcji 1.8.9.1; sekcja 1.8.9.4 i dodatek 3).
O każdym czasie próbkowania, z każdej kolby próbnej należy pobrać dwie podpróbki (np. porcje po 5 ml). Jeżeli używa się wielu kolb dla umożliwienia zbierania całych kolb, to każdorazowo podczas próbkowania należy poświęcić minimum dwie kolby (zob. akapit pierwszy w sekcji 1.8.9.1).
1.8.9.3. Przygotowanie kolb do próby z zawieszonym osadem [do wyboru]
Dodać do naczyń próbnych niezbędne objętości badanej wody i osadu, jeśli jest wymagany (zob. sekcja 1.8.5). Przygotowanie kolb do próby z zawieszonym osadem jest takie samo, jak dla próby pelagicznej (zob. sekcje 1.8.9.1 i 1.8.9.2). Najlepiej jest użyć butelek na osocze lub kolb o podobnym kształcie. Umieścić zamknięte kolby poziomo na wstrząsarce. Oczywiście otwarte kolby w przypadku nielotnych substancji nieznakowanych za pomocą 14C należy ustawić w pozycji pionowej; w tym przypadku zaleca się mieszanie magnetyczne i użycie mieszadełek magnetycznych pokrytych szkłem. Jeśli to konieczne, napowietrzać butelki, aby utrzymać odpowiednie warunki aerobowe.
1.8.9.4. Oznaczenia radiochemiczne
Wydzielający się 14CO2 mierzy się pośrednio i bezpośrednio (zob. dodatek 3). 14CO2 oznacza się pośrednio na podstawie różnicy pomiędzy początkową aktywnością 14C w badanej wodzie lub zawiesinie a całkowitą aktywnością resztkową podczas pobierania próbek, zmierzoną po zakwaszeniu próbki do pH 2-3 i usunięciu CO2. Węgiel nieorganiczny zostaje w ten sposób usunięty, a zmierzona aktywność resztkowa pochodzi od materiału organicznego. Pośredniego oznaczania 14CO2 nie należy stosować, jeżeli podczas przemiany badanej substancji tworzą się główne produkty przemiany, które są lotne (zob. dodatek 3). Jeśli to możliwe, wydzielenie 14CO2 należy zmierzyć bezpośrednio (zob. dodatek 3) podczas pobierania próbek w co najmniej jednej kolbie próbnej; procedura ta umożliwia sprawdzenie zarówno bilansu masy, jak i procesu biodegradacji, lecz ogranicza się do prób prowadzonych z zamkniętymi kolbami.
Jeżeli wydzielony 14CO2 mierzy się bezpośrednio podczas badania, to w tym celu na początku badania należy przygotować większą ilość kolb. Bezpośrednie oznaczanie 14CO2 jest zalecane, jeżeli podczas przemiany badanej substancji tworzą się lotne główne produkty przemiany. W każdym momencie pomiaru dodatkowe kolby próbne zakwasza się do pH 2-3, a 14CO2 zbiera się w wewnętrznym lub zewnętrznym absorberze (zob. dodatek 3).
Ewentualnie, badaną substancję znakowaną za pomocą 14C oraz główne produkty przemiany można oznaczać przy zastosowaniu radiochromatografii (np. chromatografii cienkowarstwowej, RAD-TLC) lub HPLC z detekcją radiochemiczną.
Ewentualnie można wyznaczyć rozkład fazowy pozostającej radioaktywności (zob. dodatek 1) oraz resztkowej badanej substancji i produktów przemiany.
Na końcu badania należy wyznaczyć bilans masy przez bezpośredni pomiar 14CO2, używając oddzielnych kolb próbnych, z których próbki nie są pobierane w trakcie badania (zob. dodatek 3).
1.8.9.5. Specyficzna analiza chemiczna
Jeśli dysponuje się czułą specyficzną metodą analityczną, to pierwotną biodegradację można ocenić, mierząc całkowite resztkowe stężenie badanej substancji, zamiast używania technik znakowania izotopem promieniotwórczym. Jeżeli użyta jest substancja znakowana izotopem promieniotwórczym (w celu zmierzenia całkowitej mineralizacji), to równolegle można wykonać specyficzną analizę chemiczną, aby uzyskać przydatne dodatkowe informacje i sprawdzić procedurę. Specyficznych analiz chemicznych można również użyć do zmierzenia produktów przemiany powstałych podczas degradacji badanej substancji i jest to zalecane dla substancji, które są mineralizowane z czasem półtrwania przekraczającym 60 dni. Za każdym razem podczas próbkowania należy zmierzyć stężenie badanej substancji i produktów przemiany i podać je w sprawozdaniu (jako stężenie i jako procentowość zastosowanego stężenia). Na ogół powinno się identyfikować produkty przemiany wykryte w ilości ≥ 10 % zastosowanego stężenia podczas każdego próbkowania, o ile nie jest uzasadnione inaczej istotnymi względami. Produkty przemiany, dla których stężenia wzrastają w sposób ciągły podczas badania, należy również uwzględnić przy identyfikacji, nawet jeśli ich stężenia nie przekraczają podanej wyżej granicy, gdyż może to oznaczać utrzymywanie się tendencji. Analizy produktów przemiany w próbach sterylizowanych powinny być wzięte pod uwagę, jeżeli uważa się za możliwą szybką abiotyczną przemianę badanej substancji (np. hydrolizę). Potrzebę kwantyfikacji i identyfikacji produktów przemiany należy rozważyć dla każdego przypadku oddzielnie, z podaniem uzasadnień w sprawozdaniu. Techniki ekstrakcji za pomocą rozpuszczalnika organicznego należy zastosować zgodnie ze wskazówkami podanymi w odnośnej procedurze analitycznej.
Wszystkie próbki należy przechowywać w temperaturze 2-4 oC i w warunkach hermetycznych, jeśli analizę przeprowadza się w ciągu 24 godzin (preferowane). Do dłuższego przechowywania, próbki należy zamrozić do temperatury poniżej - 18 oC lub chemicznie zakonserwować. Zakwaszanie nie jest zalecanym sposobem konserwacji próbek, ponieważ zakwaszone próbki mogą być nietrwałe. Jeżeli próbki nie są zanalizowane w ciągu 24 i są poddane dłuższemu przechowywaniu, to należy przeprowadzić badanie trwałości podczas przechowywania w celu wykazania trwałości substancji chemicznych będących przedmiotem zainteresowania w temperaturze poniżej - 18 oC lub w warunkach konserwacji. Jeżeli metoda analityczna wiąże się z ekstrakcją rozpuszczalnikową lub ekstrakcją fazy stałej (SPE), to ekstrakcję należy wykonać natychmiast po pobraniu próbki lub po przechowaniu schłodzonej próbki maksymalnie przez 24 godziny.
W zależności od czułości metody analitycznej, mogą być konieczne większe objętości próbek niż te, które podano w sekcji 1.8.1. Badanie można łatwo przeprowadzić z objętościami próbnymi wynoszącymi jeden litr w kolbach o pojemności 2-3 litrów, co pozwala na pobranie próbek o objętości ok. 100 ml.
2. DANE ORAZ SPORZĄDZENIE SPRAWOZDANIA
2.1. OBRÓBKA WYNIKÓW
2.1.1. Wykreślne przedstawienie danych
Zaokrąglić czasy pobierania próbek do całkowitej liczby godzin (chyba że substancja ulega istotnej degradacji w czasie trwającym w minutach lub godzinach), lecz nie do całkowitej liczby dni. Wykreślić oszacowane wartości aktywności resztkowej badanej substancji (dla substancji znakowanych za pomocą 14C) lub stężenie resztkowe (dla nieznakowanych substancji) w zależności od czasu na wykresie liniowym lub półlogarytmicznym (zob. rysunki 1a, 1b). Jeśli miała miejsce degradacja, to porównać wyniki z kolb FT z wynikami z kolb FS. Jeżeli średnie wyników uzyskanych z kolb z badaną substancją (FT) i kolb sterylizowanych (FS) różnią się o mniej niż 10 %, to można założyć, że zaobserwowana degradacja jest w przeważającej mierze abiotyczna. Jeżeli degradacja w kolbach FS jest mniejsza, to wielkości tych można użyć do skorygowania wielkości uzyskanych z kolb FT (przez odjęcie), aby oszacować stopień biodegradacji. Gdy wykonywane są dodatkowe analizy dla głównych produktów przemiany, to należy również przedstawić wykres ich powstawania i spadku zawartości, oprócz wykresu spadku zawartości badanej substancji.
Oszacować czas trwania fazy zastoju tL na podstawie krzywej degradacji (wykresu półlogarytmicznego) przez ekstrapolację jej liniowej części do zerowej degradacji lub, alternatywnie, przez wyznaczenie czasu dla przybliżonej 10 % degradacji (zob. rysunki 1a i 1b). Na podstawie wykresu półlogarytmicznego oszacować stałą szybkości pierwszego rzędu, k, oraz jej błąd standardowy za pomocą regresji liniowej ln (aktywności resztkowej 14C lub stężenia badanej substancji) w zależności od czasu. W szczególności w przypadku pomiarów 14C użyć tylko danych należących do początkowej liniowej części krzywej po zakończonej fazie zastoju i wybrać raczej niewielką liczbę reprezentatywnych danych niż większą liczbę bardziej niepewnych danych. Niepewność obejmuje tu błędy związane z zaleconym bezpośrednim użyciem zmierzonych aktywności resztkowego 14C (zob. poniżej). Niekiedy może być właściwe obliczenie dwu różnych stałych szybkości, jeżeli degradacja przebiega dwufazowo. W tym celu określono dwie różne fazy krzywej degradacji. Obliczenia stałej szybkości, k, oraz czasu półtrwania t½ = ln2/k należy przeprowadzić dla każdej spośród indywidualnych replikatowych kolb, gdy podpróbki są pobrane z tej samej kolby, lub używając średnich wartości, gdy podczas każdego próbkowania zbierane są pełne kolby (zob. ostatni akapit w sekcji 1.8.9.2). Gdy użyta jest pierwsza z wymienionych procedur, to stałą szybkości i czas półtrwania należy podać w sprawozdaniu dla każdej z indywidualnych replikatowych kolb oraz jako wartość średnią z błędem standardowym. Jeśli użyto wysokich stężeń badanej substancji, to krzywa degradacji może znacznie odbiegać od linii prostej (wykresu półlogarytmicznego) i kinetyka pierwszego rzędu może nie być ważna. Określenie półokresu nie posiada więc znaczenia. Jednakże dla ograniczonego zakresu danych można zastosować kinetykę pseudo pierwszego rzędu i oszacować półokres degradacji DT50 (czas do osiągnięcia 50 % degradacji). Należy pamiętać jednak, że przebiegu czasowego degradacji poza wybranym zakresem danych nie da się przewidzieć przy użyciu DT50, który jest jedynie deskryptorem danego zbioru danych. Analityczne narzędzia służące do ułatwienia obliczeń statystycznych i dopasowywania krzywych są łatwo dostępne i zaleca się użycie tego rodzaju oprogramowania.
Jeżeli wykonywane są specyficzne analizy chemiczne, należy oszacować stałe szybkości i czas półtrwania dla pierwotnej degradacji, jak powyżej dla całkowitej mineralizacji. Jeżeli pierwotna degradacja jest procesem ograniczającym, to można niekiedy użyć punktów danych z całego przebiegu degradacji. Wynika to stąd, iż pomiary te są bezpośrednie, w przeciwieństwie do pomiarów aktywności 14C.
Jeżeli są używane substancje znakowane za pomocą 14C, to bilans masy należy wyrazić w procentach zastosowanego stężenia, przynajmniej na końcu badania.
2.1.2. Aktywność resztkowa
Gdy znakowana za pomocą 14C część substancji organicznej ulega biodegradacji, to znaczna część 14C zamienia się w 14CO2, podczas gdy reszta zostaje zużyta do wzrostu biomasy i/lub syntezy pozakomórkowych metabolitów. Dlatego pełna "ostateczna" biodegradacja substancji nie powoduje 100 % zamiany jej węgla w 14CO2. 14C wbudowany w produkty utworzone w wyniku biosyntezy jest następnie powoli uwalniany jako 14CO2 na skutek "wtórnej mineralizacji". Z tych powodów wykresy zależności aktywności resztkowego organicznego 14C (zmierzonej po usunięciu CO2) lub wytworzonego 14CO2 od czasu wykazywać będą tworzenie się "ogona" po zakończeniu degradacji. Komplikuje to kinetyczną interpretację danych i w tym celu do oszacowania stałej szybkości degradacji zwykle należy wykorzystać tylko początkową część krzywej (po zakończeniu się fazy zastoju a przed osiągnięciem ok. 50 % degradacji). Jeżeli badana substancja ulega degradacji, to całkowita aktywność resztkowego organicznego 14C jest zawsze wyższa od aktywności 14C związanego z pozostałą nienaruszoną badaną substancją. Jeżeli badana substancja ulega degradacji wskutek reakcji pierwszego rzędu i stały ułamek α zostaje zmineralizowany do CO2, to początkowe nachylenie krzywej zaniku 14C (całkowity organiczny 14C w zależności od czasu) będzie równe α razy nachylenie odpowiedniej krzywej dla stężenia badanej substancji (lub, ściślej biorąc, części badanej substancji oznakowanej za pomocą 14C). Gdy używa się pomiarów aktywności całkowitego organicznego 14C bez korekty, to obliczona stała szybkości degradacji będzie stanowić ostrożne oszacowanie. Procedury szacowania stężeń badanych substancji na podstawie aktywności radiochemicznych, oparte o różne upraszczające założenia, zostały opisane w literaturze (2)(9)(10)(11). Procedury takie najłatwiej jest stosować do substancji szybko ulegających degradacji.
2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW
Jeżeli stwierdza się, że k jest niezależna od dodanego stężenia (tj. jeżeli obliczona k jest w przybliżeniu taka sama przy różnych stężeniach badanej substancji), to można założyć, że stała szybkości pierwszego rzędu jest reprezentatywna dla zastosowanych warunków badania, tj. badanej substancji, próbki wody i temperatury badania. To, w jakim stopniu wyniki można uogólnić lub ekstrapolować do innych układów, musi zostać określone na podstawie specjalistycznej opinii. Jeżeli użyte jest wysokie stężenie badanej substancji i w związku z tym degradacja nie przebiega zgodnie z kinetyką pierwszego rzędu, to danych nie można wykorzystać do bezpośredniego oszacowania stałej szybkości pierwszego rzędu lub odpowiadającego jej czasu półtrwania. Jednakże dane pochodzące z badania, w którym użyto wysokiego stężenia badanej substancji, mogą nadal być przydatne do oszacowania stopnia całkowitej mineralizacji i/lub wykrycia i kwantyfikacji produktów przemiany.
Jeżeli znane są szybkości procesów powodujących stratę, innych niż biodegradacja (np. hydrolizy lub ulatniania się), to można odjąć je od szybkości straty netto zaobserwowanej podczas badania, uzyskując przybliżone oszacowanie szybkości biodegradacji. Dane dla hydrolizy, na przykład, można uzyskać ze sterylnej próby kontrolnej lub z równoległego badania z użyciem wyższego stężenia badanej substancji.
Pośrednie i bezpośrednie oznaczanie 14CO2 (sekcja 1.8.9.4 i dodatek 3) można zastosować jedynie do pomiaru stopnia mineralizacji badanej substancji do CO2. Do analizy stężeń badanej substancji znakowanej za pomocą 14C oraz powstawania głównych produktów przemiany można zastosować radiochromatografię (RAD-TLC) lub HPLC (akapit trzeci w sekcji 1.8.9.4). Aby umożliwić bezpośrednie oszacowanie czasu półtrwania główne produkty przemiany (określone jako ≥ 10 % zastosowanej ilości badanej substancji) muszą być nieobecne. Jeżeli występują główne produkty przemiany, zgodnie z powyższym określeniem, wymagana jest szczegółowa ocena danych. Może ona obejmować wielokrotne badania i/lub identyfikację produktów przemiany (zob. akapit pierwszy w sekcji 1.8.9.5), chyba że los produktów przemiany można w sposób rozsądny ocenić na podstawie doświadczenia (np. informacji o drodze degradacji). Ponieważ część badanej substancji ulegająca przemianie w CO2 jest zmienna (zależąc w dużej mierze od stężenia badanej substancji oraz innych dostępnych substratów, warunków badania oraz zespołu drobnoustrojów), badanie to nie pozwala na proste oszacowanie ostatecznej biodegradacji, jak w próbie zanikania RWO; lecz wynik jest podobny do uzyskanego przy pomocy badaniu respirometrycznym. Stopień mineralizacji będzie więc mniejszy lub równy minimalnemu poziomowi ostatecznej biodegradacji. Aby uzyskać pełniejszy obraz ostatecznej biodegradacji (mineralizacji i włączenia do biomasy), na końcu badania należy przeprowadzić analizę rozkładu fazowego 14C (zob. dodatek 1). 14C w określonej puli składać się będzie z 14C włączonego do bakteryjnej biomasy oraz 14C zesorbowanego do cząstek organicznych.
2.3. WAŻNOŚĆ BADANIA
Jeżeli substancja odniesienia nie ulega degradacji w spodziewanym przedziale czasu (dla aniliny i benzoesanu sody zwykle krótszym niż dwa tygodnie), to ważność badania jest niepewna i musi zostać poddana dalszej weryfikacji lub, alternatywnie, badanie należy powtórzyć z nową próbką wody. W zgodnym z ISO pierścieniowym teście metody, w którym uczestniczyło siedem laboratoriów z całej Europy, dostosowane stałe szybkości degradacji dla aniliny wynosiły w granicach od 0,3 do 1,7 dzień-1 ze średnią 0,8 d-1 w 20 oC i z błędem standardowym ± 0,4 d-1 (t½ = 0,9 dnia). Typowe czasy zastoju wynosiły 1-7 dni. Podano, że badane wody miały bakteryjną biomasę odpowiadającą 103-104 jednostek tworzących kolonię (CFU) na ml. Szybkości degradacji w bogatych w składniki odżywcze wodach środkowoeuropejskich były większe niż w skandynawskich wodach oligotroficznych, co może być spowodowane innym troficznym statusem lub uprzednią ekspozycją na substancje chemiczne.
Całkowity odzysk (bilans masy) na końcu doświadczenia powinien zawierać się w granicach 90-110 % dla substancji znakowanych izotopem promieniotwórczym, podczas gdy dla substancji nieznakowanych początkowy odzysk na początku doświadczenia powinien wynosić 70-110 %. Jednakże podane zakresy należy interpretować jedynie jako cele i nie należy używać ich jako kryteriów dla przyjęcia badania.
3. SPRAWOZDANIE Z BADANIA
W sprawozdaniu z badania należy wyraźnie podać typ badania, tj. czy jest to próba pelagiczna czy próba zawieszonego osadu, przy czym powinno ono również zawierać co najmniej następujące informacje:
Badana substancja i substancja(-e) odniesienia:
- nazwy pospolite, nazwy chemiczne (zalecane nazwy IUPAC i/lub CAS), numery CAS, wzory strukturalne (wskazujące położenie 14C, jeśli użyta jest substancja znakowana izotopem promieniotwórczym) oraz stosowne własności fizykochemiczne badanej substancji i substancji odniesienia (zob. sekcje 1.5 i 1.6),
- nazwy chemiczne, numery CAS, wzory strukturalne (wskazujące położenie 14C, jeśli użyta jest substancja znakowana izotopem promieniotwórczym) oraz stosowne własności fizykochemiczne substancji użytych jako wzorce do identyfikacji i kwantyfikacji produktów przemiany,
- czystość (zanieczyszczenia) badanej substancji i substancji odniesienia,
- radiochemiczna czystość znakowanej substancji chemicznej oraz aktywność właściwa (tam gdzie stosowne).
Woda powierzchniowa:
Należy podać, jako minimum, następujące informacje dotyczące próbki wody:
- lokalizacja i opis miejsca pobrania próbki, w tym, jeśli to możliwe, historia zanieczyszczenia,
- data i godzina pobrania próbki,
- składniki odżywcze (całkowity N, amon, azotyn, azotan, całkowity P, rozpuszczony ortofosforan),
- głębokość pobrania,
- wygląd próbki (np. barwa i mętność),
- RWO i TOC,
- BOD,
- temperatura i pH w miejscu oraz czas pobrania,
- potencjał tlenowy i redoks (obowiązkowy tylko wówczas, jeśli warunki aerobowe nie są oczywiste),
- zasolenie lub konduktywność (w przypadku wody morskiej lub słonawej),
- zawieszone cząstki stałe (w przypadku mętnej próbki),
- ewentualnie inne istotne informacje o miejscu próbkowania w czasie pobierania próbki (np. faktyczne lub historyczne dane dotyczące natężenia przepływu rzek lub prądów morskich, pobliskie ważniejsze odprowadzenia ścieków i ich typ, warunki atmosferyczne poprzedzające czas pobrania próbki),
oraz nieobowiązkowo:
- biomasę drobnoustrojów (np. bezpośrednią liczbę uzyskaną za pomocą oranżu akrydynowego lub jednostki tworzące kolonię),
- węgiel nieorganiczny,
- stężenie chlorofilu a jako swoiste oszacowanie biomasy alg.
Ponadto należy podać następujące informacje o osadzie, jeśli przeprowadzona jest próba zawieszonego osadu:
- głębokość pobrania osadu,
- wygląd osadu (np. zabarwiony, szlamowaty, mulisty lub piaszczysty),
- struktura (np. % grubego piasku, drobnego piasku, mułu i gliny),
- ciężar suchej masy w g/l zawieszonych cząstek, stężenie TOC lub utrata ciężaru po zapłonie, jako miara zawartości materii organicznej,
- pH,
- potencjał tlenowy i redoks (obowiązkowy tylko wówczas, jeśli warunki aerobowe nie są oczywiste).
Warunki badania:
- upływ czasu od pobrania do użycia w badaniu laboratoryjnym, przechowywanie próbki i wstępna obróbka próbki, daty przeprowadzenia badań,
- ilość zastosowanej substancji badanej, stężenie próbne oraz substancja odniesienia,
- metoda wprowadzenia badanej substancji, w tym ewentualne użycie rozpuszczalników,
- objętość użytej wody powierzchniowej i osadu (jeśli jest użyty) oraz objętość pobrana każdorazowo do analizy,
- opis zastosowanego układu badawczego.
Jeśli nie mają być utrzymane warunki ciemności - informacje o warunkach "rozproszonego światła",
- informacje o metodzie(-ach) zastosowanej do przygotowania sterylizowanych prób kontrolnych (np. temperatura, czas i ilość obróbek w autoklawie),
- temperatura inkubacji,
- informacje o analitycznych technikach i metodzie(-ach) zastosowanej/ych do pomiarów radiochemicznych oraz do sprawdzania bilansu masy i pomiarów rozkładu fazowego (jeśli jest przeprowadzony),
- liczba replikatów.
Wyniki:
- procenty odzysku (zob. sekcja 1.7.1),
- powtarzalność i czułość zastosowanych metod analitycznych, w tym granica wykrywalności (LOD) oraz granica kwantyfikacji (LOQ) (zob. sekcja 1.7.2),
- wszystkie zmierzone dane (w tym punkty czasowe próbkowania) oraz obliczone wartości w postaci tabelarycznej i krzywych degradacji; dla każdego stężenia próbnego i dla każdej replikatowej kolby należy podać współczynnik korelacji liniowej dla nachylenia wykresu logarytmicznego, oszacowaną fazę zastoju oraz stałą szybkości pierwszego rzędu lub pseudo pierwszego rzędu (jeśli to możliwe) oraz odpowiadający jej czas półtrwania degradacji (lub okres półtrwania, t50),
- podać stosowne wartości jako średnie z wyników zaobserwowanych w indywidualnych replikatach, np. długość fazy zastoju, stałą szybkości degradacji i czas półtrwania degradacji (lub t50),
- określić kategorię układu, jako niezaadaptowany lub zaadaptowany, na podstawie wyglądu krzywej degradacji oraz na podstawie ewentualnego wpływu stężenia próbnego,
- wyniki końcowego sprawdzenia bilansu masy oraz wyniki pomiarów rozkładu fazowego (jeśli są wykonane),
- frakcja zmineralizowanego 14C oraz, jeżeli zastosowane są specyficzne analizy, końcowy poziom pierwotnej degradacji,
- identyfikacja, molowe stężenie i procentowość zastosowanej badanej substancji oraz głównych produktów przemiany (zob. akapit pierwszy w sekcji 1.8.9.5), tam gdzie stosowne,
- proponowana droga przemiany, tam gdzie stosowne,
- omówienie wyników.
4. LITERATURA
(1) OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water - Simulation Biodegradation Test.
(2) ISO/DIS 14592-1 (1999) Water quality - Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations - Part 1: Shake flask batch test with surface water or surface water/sediment suspensions.
(3) Testing Method C.23. Aerobic and anaerobic transformation in soil.
(4) Testing Method C.24. Aerobic and anaerobic transformation in aquatic sediments.
(5) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. OECD, Paris.
(6) ISO 8245 (1999). Water quality - Guidelines on the determination of total organic carbon (TOC) and dissolved organic carbon (DOC).
(7) ISO 10634 (1995). Water quality - Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
(8) OECD draft (2000). Guidance Document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment. No 22 (to be published summer 2000).
(9) Simkins, S. and Alexander, M. (1984). Models for mineralization kinetics with the variables of substrate concentration and population density. Appl. Environ. Microbiol. 47, 394-401.
(10) Ingerslev, F. and N. Nyholm. (2000). Shake-flask test for determination of biodegradation rates of 14C-labeled chemicals at low concentrations in surface water systems. Ecotoxicol. Environ. Saf. 45, 274-283.
(11) ISO/CD 14592-1 (1999). Ring test report: Water Quality - Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations part 1 - report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface water or surface water/sediment suspensions.
Dodatek 1
Rozkład fazowy 14C
Aby sprawdzić procedurę, rutynowe pomiary aktywności pozostałego całkowitego organicznego 14C (TOA) należy uzupełnić pomiarami bilansu masy polegającymi na bezpośrednim wyznaczaniu wydzielonego 14CO2 po wychwyceniu go w absorberze (zob. dodatek 3). Dodatnie wytworzenie się 14CO2 samo w sobie jest bezpośrednim dowodem biodegradacji, w odróżnieniu od degradacji abiotycznej lub innych mechanizmów straty, takich jak ulatnianie się lub sorpcja. Dodatkowe użyteczne informacje charakteryzujące przebieg biodegradacji można uzyskać z pomiarów rozkładu TOA pomiędzy stan rozpuszczony (aktywność rozpuszczonego organicznego 14C, DOA) a stan cząstkowy (aktywność cząstkowego organicznego 14C, POA) po separacji cząstek stałych poprzez filtrację przeponową lub odwirowanie. Na POA składa się badana substancja zesorbowana na biomasie drobnoustrojów oraz na innych cząstkach, oraz węgiel badanej substancji, który został zużyty na syntezę nowego materiału komórkowego, a przez to włączony do frakcji biomasy cząstkowej. Utworzenie się rozpuszczonego materiału organicznego 14C można oszacować jako DOA na końcu biodegradacji (plateau na krzywej zależności degradacji od czasu).
Oszacować rozkład fazowy resztkowego 14C w wybranych próbkach przez przefiltrowanie próbek na filtrze przeponowym 0,22 μm lub 0,45 μm wykonanym z materiału, który nie adsorbuje znaczących ilości badanej substancji (odpowiednie mogą być filtry poliwęglanowe). Jeżeli sorpcja badanej substancji na filtrze jest zbyt duża, aby można było ją pominąć (należy to sprawdzić przed doświadczeniem), to zamiast filtracji można zastosować odwirowanie z wysoką prędkością (2.000 g; 10 min).
Postąpić z filtratem lub odwirowanym materiałem tak, jak opisano w dodatek 3 dla niefiltrowanych próbek. Rozpuścić filtry przeponowe w odpowiednim płynie scyntylacyjnym i wykonać zliczenie, jak zwykle, normalnie stosując tylko metodę stosunku zewnętrznego wzorca, aby dokonać poprawki wygaszania, bądź użyć utleniacza próbki. Jeżeli zastosowane zostało odwirowanie, to z grudki utworzonej z frakcji cząstkowej ponownie utworzyć zawiesinę w 1-2 ml wody destylowanej i przenieść do fiolki scyntylacyjnej. Następnie przemyć dwukrotnie 1 ml wody destylowanej i przenieść wodę płuczącą do fiolki. Jeśli to konieczne, zawiesinę można osadzić w żelu w celu wykonania cieczowego zliczenia scyntylacyjnego.
Dodatek 2
Procedura półciągła
Może być konieczna przedłużona inkubacja trwająca do kilku miesięcy po to, aby osiągnąć degradację opornych substancji. Czas trwania badania normalnie nie powinien przekraczać 60 dni, chyba że cechy pierwotnej próbki wody są utrzymywane przez wymianę zawiesiny próbnej. Jednakże okres badania może być wydłużony do maksimum 90 dni bez wymiany zawiesiny próbnej, jeżeli degradacja badanej substancji rozpoczęła się w ciągu pierwszych 60 dni.
Podczas inkubacji przez długie okresy, różnorodność zespołu drobnoustrojów może ulec zmniejszeniu na skutek różnych mechanizmów straty oraz wskutek możliwego zmniejszania się w próbce wody ilości istotnych składników odżywczych i podstawowych substratów węglowych. Dlatego zaleca się, aby zastosować badanie półciągłe w celu zadowalającego wyznaczenia szybkości degradacji substancji wolno ulegających degradacji. Badanie należy rozpocząć przez zastosowanie procedury półciągłej, jeżeli - na podstawie wcześniejszego doświadczenia - spodziewane jest, że do osiągnięcia 20 % degradacji badanej substancji niezbędny jest okres inkubacji wynoszący trzy miesiące. Alternatywnie, normalne badanie prowadzone w systemie okresowym można zamienić na badanie półciągłe, jeżeli w ciągu około 60 dni badania z użyciem procedury okresowej nie osiągnięto degradacji badanej substancji. Procedurę półciągłą nożna zatrzymać i kontynuować badanie jako doświadczenie okresowe, gdy odnotuje się istotną degradację (np. > 20 %).
W badaniu półciągłym, co dwa tygodnie wymienia się około jedną trzecią objętości zawiesiny próbnej na świeżo pobraną wodę z badaną substancją, dodaną do początkowego stężenia. Podobnie, do wymiennej wody dodaje się osad do początkowego stężenia (0,01-1 g/l), jeżeli przeprowadza się dodatkowo próbę zawieszonego osadu. Przeprowadzając badanie z zawieszonymi cząstkami stałymi osadu, ważne jest, aby również podczas wymiany wody utrzymywać układ w stanie pełnego zawieszenia i aby czas przebywania był identyczny dla cząstek stałych i wody, gdyż w przeciwnym razie utracone zostanie zamierzone podobieństwo do jednorodnego układu wodnego bez ustalonych faz. Z tych względów, gdy stosowana jest procedura półciągła, preferowane jest początkowe stężenie zawieszonych osadów w dolnym przedziale wyznaczonego zakresu.
Zalecone dodanie badanej substancji oznacza, że początkowe stężenie badanej substancji nie zostaje przekroczone wskutek częściowej wymiany zawiesiny próbnej, a przez to unika się adaptacji, którą często obserwuje się przy wysokich stężeniach badanej substancji. Ponieważ procedura obejmuje zarówno ponowną inokulację, jak i kompensację wyczerpanych składników odżywczych i głównych substratów, zostaje przywrócona początkowa różnorodność zespołu drobnoustrojów, a czas trwania badania można w zasadzie wydłużać do nieskończoności. Gdy stosuje się procedurę półciągłą, należy pamiętać, że resztkowe stężenie badanej substancji musi być skorygowane pod względem dodanych lub usuniętych ilości badanej substancji podczas każdej procedury wymiany. Stężenie całkowitej i rozpuszczonej badanej substancji może być używane zamiennie w przypadku związków mało sorbujących. Sorpcja jest nieznacząca (< 5 %) w określonych warunkach (0,1-1 g cząstek stałych/l) dla substancji o log Kow < 3 (ważne dla związków obojętnych, lipofilowych). Ilustruje to następujący przykład obliczeniowy. 0,1 g/l cząstek stałych w przybliżeniu odpowiada 10 mg węgla na litr (ułamek węgla, fC = 0,01). Zakładając, że:
Log Kow (badanej substancji) = 3
Koc = 0,42 × Kow
Współczynnik podziału, Kd = fC × Koc
zatem, rozpuszczony ułamek całkowitego stężenia (C-woda (Cw)/C-całkowity (Ct)) wynosi:
Cw/Ct = 1/(1 + Kd × SS) = 1(1 + Koc × fC × SS) = 1/(1 + 0,42 × 103 × 0,01 × 0,1 × 10-3) = 0,999
Dodatek 3
Oznaczanie 14CO2
Pośrednie oznaczanie 14CO2
Dla rutynowych pomiarów metoda pośrednia jest zwykle najmniej czasochłonną i najbardziej dokładną metodą, jeżeli badana substancja jest nielotna i nie zamienia się w lotne produkty przemiany. Należy jedynie przenieść niefiltrowane próbki, o objętości np. 5 ml, do fiolek scyntylacyjnych. Odpowiednia aktywność w próbkach wynosi początkowo 5.000-10.000 dpm (80-170 Bq), a minimalna początkowa aktywność wynosi około 1.000 dpm. CO2 należy usunąć po zakwaszeniu do pH 2-3 przy pomocy 1-2 kropli stężonego H3PO4 lub HCl. Usunięcia CO2 można dokonać poprzez barbotowanie powietrzem przez około ½-1 godziny. Alternatywnie fiolki można energicznie wstrząsać przez 1-2 godziny (na przykład na wstrząsarce mikropłytowej) lub, stosując łagodniejsze wstrząsanie, pozostawić na noc. Należy sprawdzić efektywność procedury usuwania CO2 (przez przedłużenie okresu napowietrzania lub wstrząsania). Następnie należy dodać ciecz scyntylacyjną odpowiednią do zliczania próbek wodnych, ujednorodnić próbkę na mieszadle wirowym i wyznaczyć radioaktywność za pomocą cieczowego zliczania scyntylacyjnego, odejmując aktywność tła stwierdzoną w ślepych próbach (FB). O ile badana woda nie jest silnie zabarwiona lub nie zawiera wysokiego stężenia cząstek stałych, próbki zwykle będą wykazywać równomierne wygaszanie i wystarczające będzie wykonanie poprawek wygaszania przy użyciu zewnętrznego wzorca. Jeżeli badana woda jest silnie zabarwiona, to konieczna może być poprawka wygaszania poprzez dodanie wewnętrznego wzorca. Jeśli stężenie cząstek stałych jest wysokie, to może nie być możliwe uzyskanie jednorodnego roztworu lub żelu bądź też może występować duża zmienność wygaszania pomiędzy próbkami. W takim przypadku można użyć metody zliczania opisanej poniżej dla szlamów próbnych. Jeżeli badanie przeprowadza się jako próbę zawieszonego osadu, to pomiar 14CO2 można wykonać pośrednio, pobierając jednorodną próbkę 10 ml badanej wody/zawiesiny i rozdzielając fazy przez odwirowanie z odpowiednią prędkością (np. 40.000 m/s2 przez 15 min). Fazę wodną należy następnie potraktować, jak opisano powyżej. Aktywność 14C w fazie cząstkowej (POA) należy wyznaczyć przez ponowne sporządzenie zawiesiny osadu w niewielkiej objętości wody destylowanej, przeniesienie jej do fiolek scyntylacyjnych i dodanie cieczy scyntylacyjnej w celu utworzenia żelu (do tego celu dostępne są specjalne ciecze scyntylacyjne). W zależności od charakteru cząstek (np. zawartości w nich materiału organicznego), może być możliwe roztworzenie próbki przez noc za pomocą solubilizatora tkankowego, a następnie ujednorodnienie na mieszadle wirowym przed dodaniem cieczy scyntylacyjnej. Alternatywnie POA można wyznaczyć przez spalenie w nadmiarze tlenu, używając utleniacza próbek. Podczas zliczania należy zawsze włączyć wewnętrzne wzorce, a także może być niezbędne dokonanie korekt wygaszania przy użyciu dodatku wewnętrznego wzorca dla każdej indywidualnej próbki.
Bezpośrednie oznaczanie 14CO2
Jeżeli wydzielony 14CO2 mierzy się bezpośrednio, to należy to wykonać, przygotowując na początku badania większą ilość kolb, zbierając kolby próbne w każdym punkcie pomiaru przez zakwaszenie kolb próbnych do pH 2-3 i wychwycenie 14CO2 w wewnętrznym (umieszczonym w każdej kolbie próbnej na początku badania) lub zewnętrznym absorberze. Jako czynnika absorbującego można użyć absorbera alkalicznego (np. 1 N roztwór NaOH lub tabletki NaOH), atanolaminy lub absorbera na jej bazie lub absorbery dostępne w handlu. Do bezpośrednich pomiarów 14CO2, kolby powinny być zamknięte np. za pomocą przykrywki z gumy butylowej.
Rysunek 1a
Przykład arytmetycznego wykresu danych (aktywność resztkowa w zależności od czasu)
Rysunek 1b
Przykład półlogarytmicznego wykresu plot danych (ln z aktywności resztkowej w zależności od czasu)
C.26. BADANIE ZAHAMOWANIA WZROSTU U GATUNKÓW LEMNA
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna z dotyczącą badań wytyczną OECD nr 221 (2006). Służy ona do oceny toksyczności substancji chemicznych w stosunku do roślin słodkowodnych rodzaju Lemna (rzęsy wodnej). Jej podstawę stanowią istniejące metody (1)(2)(3)(4)(5)(6), lecz obejmuje modyfikacje tych metod, uwzględniające najnowsze badania i konsultacje w sprawie szeregu zasadniczych kwestii. Niniejsza metoda badawcza została potwierdzona za pomocą międzynarodowego badania międzylabolatoryjnego (7).
2. Niniejsza metoda badawcza opisuje gatunki Lemna gibba i Lemna minor, z których obydwa zostały dogłębnie zbadane i są przedmiotem przywołanych wyżej norm. Taksonomia gatunków Lemna jest trudna, gdyż komplikuje ją istnienie wielu różnych fenotypów. Choć w przypadku Lemna może występować genetyczna zmienność pod względem reakcji na czynniki toksyczne, to obecnie istnieje zbyt mało danych na temat tego źródła zmienności, aby można było zalecić określony klon do użycia wykorzystania w ramach niniejszej metody badawczej. Należy zwrócić uwagę, że badanie nie jest przeprowadzane na kulturach aksenicznych, ale na poszczególnych etapach procedury badawczej podejmowane są kroki w celu ograniczenia zanieczyszczenia innymi organizmami do minimum.
3. Opisano szczegóły badania z wymianą (badanie półstatyczne i przepływowe) i bez wymiany (badanie statyczne) roztworu do badań. W zależności od celów badania oraz od wymogów regulacyjnych zaleca się rozważyć zastosowanie metody półstatycznej i przepływowej, np. w przypadku substancji chemicznych, które są szybko tracone z roztworu na skutek ulatniania się, fotodegradacji, strącania lub biodegradacji. Dalsze wskazówki przedstawiono w (8).
4. Zastosowane definicje są podane w dodatku 1.
ZASADA BADANIA
5. Rozrastającym się wykładniczo kulturom roślinnym rodzaju Lemna umożliwia się wzrost w postaci monokultur z udziałem różnych stężeń badanej substancji chemicznej przez okres siedmiu dni. Celem badania jest ilościowe określenie oddziaływań substancji chemicznej na wegetatywny wzrost w tym okresie na podstawie ocen wybranych zmiennych pomiarowych. Główną zmienną pomiarową jest liczba liści. Mierzy się również co najmniej jedną inną zmienną pomiarową (całkowitą powierzchnię liści, suchą masę lub mokrą masę), gdyż niektóre substancje chemiczne mogą wpływać w o wiele większym stopniu na inne zmienne pomiarowe niż na liczbę liści. Aby określić ilościowo skutki związane z substancją chemiczną, wzrost w roztworach do badań porównuje się ze wzrostem w grupach kontrolnych i wyznacza się stężenie powodujące zahamowanie wzrostu o określone x % (np. 50 %) i wyraża się je jako ECx (np. EC50).
6. Punktem końcowym badania jest zahamowanie wzrostu wyrażone jako logarytmiczny przyrost zmiennej pomiarowej (średnia właściwa szybkość wzrostu) w okresie narażenia. Na podstawie średniej właściwej szybkości wzrostu zarejestrowanej w serii roztworów do badań wyznacza się stężenie powodujące zahamowanie szybkości wzrostu o określoną wartość procentową (np. 50 %) i wyraża się je jako ErCx (np. ErC50).
7. Dodatkową zmienną zależną użytą w niniejszej metodzie badawczej jest przyrost, który może być potrzebny do spełnienia określonych wymogów regulacyjnych w niektórych krajach. Jest on zdefiniowany jako zmienne pomiarowe na końcu okresu narażenia minus zmienne pomiarowe na początku okresu narażenia. Na podstawie uzysku zarejestrowanego w serii roztworów do badań oblicza się stężenie powodujące zahamowanie przyrostu o określone x % (np. 50 %) i wyraża się je jako EyCx (np. EyC50).
8. Ponadto można statystycznie określić najniższe stężenie, przy którym obserwuje się zmiany (LOEC), oraz stężenie, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC).
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ
9. Należy dysponować metodą analityczną zapewniającą należytą czułość pozwalającą na ilościowe oznaczenie substancji chemicznej w pożywce.
10. Informacje na temat badanej substancji chemicznej, które mogą być przydatne przy ustalaniu warunków badania, obejmują wzór strukturalny, czystość, rozpuszczalność w wodzie, stabilność w wodzie i świetle, stałą dysocjacji, Kow prężność pary oraz biodegradowalność. Rozpuszczalność w wodzie i prężność pary mogą posłużyć do obliczenia stałej Henry'ego, która wskaże, czy istnieje prawdopodobieństwo znaczących strat badanej substancji chemicznej w okresie badania. Pomoże to stwierdzić, czy należy podjąć szczególne działania w celu ograniczenia takich strat. W przypadku gdy dane dotyczące rozpuszczalności i stabilności badanej substancji chemicznej są niepewne, zaleca się oceniać je w warunkach badania, tj. uwzględniając pożywkę, temperaturę i warunki oświetlenia, które mają być zastosowane w badaniu.
11. Jeżeli szczególnie ważna jest kontrola pH pożywki, np. gdy bada się metale lub substancje chemiczne, które są hydrolitycznie nietrwałe, zaleca się dodać do pożywki roztwór buforowy (zob. pkt 21). Dalsze wskazówki dotyczące badania substancji chemicznych o własnościach fizykochemicznych, które utrudniają ich badanie, podano w (8).
WAŻNOŚĆ BADANIA
12. Aby badanie było ważne, czas podwojenia liczby liści w próbie kontrolnej musi być krótszy niż 2,5 dnia (60 godz.), co odpowiada w przybliżeniu siedmiokrotnemu wzrostowi w ciągu siedmiu dni oraz średniej właściwej szybkości wzrostu wynoszącej 0,275 d- 1. W przypadku zastosowania pożywki i warunków badania opisanych w niniejszej metodzie badawczej, kryterium to można spełnić, stosując warunki badania statycznego (5). Przewiduje się również, że kryterium to będzie możliwe do spełnienia w warunkach badania półstatycznego i przepływowego. Obliczenie czasu podwojenia przedstawiono w pkt 49.
SUBSTANCJA CHEMICZNA ODNIESIENIA
13. Sposobem sprawdzenia procedury badania może być zbadanie substancji chemicznych odniesienia, takich jak 3,5-dichlorofenol stosowany w międzynarodowym badaniu międzylaboratoryjnym (7). Wskazane jest badanie chemicznej substancji odniesienia co najmniej dwa razy do roku lub równolegle z określaniem toksyczności badanej substancji chemicznej, gdy badanie jest wykonywane z mniejszą częstotliwością.
OPIS METODY
Aparatura
14. Cały sprzęt mający kontakt z pożywkami musi być wykonany ze szkła lub innego chemicznie obojętnego materiału. Szklane naczynia używane do hodowli kultur i badania powinny być pozbawione zanieczyszczeń chemicznych, które mogłyby zostać wypłukane do pożywki, oraz powinny być sterylne. Naczynia badawcze powinny mieć dostateczną szerokość, aby liście różnych kolonii w naczyniach kontrolnych urosły bez zachodzenia na siebie na końcu badania. Nie ma znaczenia, czy korzenie dotykają dna naczyń badawczych, lecz zaleca się minimalną głębokość 20 mm i minimalną objętość 100 ml w każdym naczyniu badawczym. Wybór naczyń badawczych nie ma szczególnie dużego znaczenia, o ile spełnione są te wymagania. Odpowiednie okazały się szklane zlewki, krystalizatory lub szalki Petriego o odpowiednich wymiarach. Naczynia badawcze muszą być przykryte, aby ograniczyć do minimum parowanie i przypadkowe zanieczyszczenie, a jednocześnie umożliwić niezbędną wymianę powietrza. Odpowiednie naczynia badawcze, a w szczególności pokrywy, nie powinny umożliwiać zacienienia lub zmian charakterystyki widmowej światła.
15. Kultury i naczynia badawcze nie powinny być trzymane razem. Najłatwiej to osiągnąć, używając oddzielnych komór wzrostowych, inkubatorów lub pomieszczeń. Oświetlenie i temperatura muszą być regulowane i utrzymywane na stałym poziomie (zob. pkt 35-36).
Organizm użyty do badania
16. Organizmem użytym do niniejszego badania jest Lemna gibba lub Lemna minor. Krótkie opisy gatunków rzęsy wodnej, których użyto do badania toksyczności, zamieszczono w dodatku 2. Materiał roślinny można uzyskać ze zbiorów kultur, z innego laboratorium lub z terenu. Jeżeli rośliny zostały zebrane w terenie, przed użyciem należy je hodować przez co najmniej osiem tygodni w tej samej pożywce, co używana do badania. Miejsca w terenie wykorzystane do zebrania kultur wyjściowych muszą być wolne od ewidentnych źródeł zanieczyszczenia. Jeżeli zostały uzyskane z innego laboratorium lub innego zbioru kultur, należy je przechowywać w podobnych warunkach przez co najmniej trzy tygodnie. W sprawozdaniu należy zawsze podać źródło materiału roślinnego oraz gatunek i klon (jeśli jest znany) użyty w badaniu.
17. Należy używać monokultur, które są w sposób widoczny wolne od zanieczyszczenia innymi organizmami, takimi jak glony i pierwotniaki. Zdrowe rośliny L. minor składać się będą z kolonii zawierających od dwóch do pięciu liści, natomiast zdrowe kolonie L. gibba mogą mieć do siedmiu liści.
18. Jakość i jednorodność roślin użytych do badania będzie mieć znaczący wpływ na jego wynik i dlatego należy je starannie wybierać. Należy używać młodych, szybko rosnących roślin bez widocznych uszkodzeń lub odbarwień (chlorozy). O dobrej jakości kultur świadczy duża częstość występowania kolonii zawierających co najmniej dwa liście. Duża liczba pojedynczych liści oznacza stres środowiskowy, np. niedobór składników odżywczych, i materiału roślinnego z takich kultur nie należy używać do badania.
Hodowla
19. Aby zmniejszyć częstotliwość prac w zakresie utrzymania kultur (np. gdy przez pewien okres nie planuje się badań nad Lemna), kultury można utrzymywać w warunkach słabszego oświetlenia i obniżonej temperatury (4- 10 °C). Szczegóły dotyczące kultury podano w dodatku 3. Wyraźne oznaki zanieczyszczenia glonami lub innymi organizmami mogą wymagać powierzchniowej sterylizacji podpróbki liści Lemna, a następnie przeniesienia jej do świeżej pożywki (zob. dodatek 3). W takim przypadku pozostałą zanieczyszczoną kulturę należy odrzucić.
20. Co najmniej siedem dni przed badaniem dostateczną ilość kolonii przenosi się aseptycznie do świeżej sterylnej pożywki i przez 7-10 dni hoduje się kulturę w warunkach badania.
Pożywka
21. Dla Lemna minor i Lemna gibba zalecane są różne pożywki, jak opisano poniżej. Należy starannie rozważyć włączenie bufora pH do pożywki (MOPS (kwasu 4-morfolinopropanosulfonowego, nr CAS 1132-61-2) w pożywce L. minor oraz NaHCO3 w pożywce L. gibba), gdy podejrzewa się, że mógłby on reagować z badaną substancją chemiczną i wpłynąć na wyrażenie jej toksyczności. Dopuszczalna jest również pożywka Steinberga (9), o ile spełnione są kryteria ważności.
22. Do hodowli kultur i badania L. minor zalecana jest modyfikacja pożywki Lemna według normy szwedzkiej (SIS). Skład tej pożywki podano w dodatku 4.
23. Do hodowli kultur i badania L. gibba zaleca się pożywkę 20X AAP, opisaną w dodatku 4.
24. Pożywka Steinberga, opisana w dodatku 4, jest również odpowiednia dla L. minor, lecz może być także użyta do L. gibba, o ile spełnione są kryteria ważności.
Roztwory do badań
25. Roztwory do badań przygotowuje się zazwyczaj przez rozcieńczenie roztworu podstawowego. Roztwory podstawowe badanej substancji chemicznej przygotowuje się zwykle przez rozpuszczenie substancji w pożywce.
26. Najwyższe badane stężenie badanej substancji chemicznej zwykle nie powinno przekraczać rozpuszczalności tej substancji w wodzie w warunkach badania. Należy jednak zauważyć, że gatunki Lemna unoszą się na powierzchni i mogą być wystawione na działanie substancji chemicznych, które gromadzą się na granicy faz woda-powietrze (jak np. substancje słabo rozpuszczalne w wodzie lub hydrofobowe bądź substancje powierzchniowo czynne). W takiej sytuacji narażenie będzie skutkiem oddziaływania substancji innej niż będąca w roztworze i badane stężenia mogą, w zależności od charakterystyki badanej substancji chemicznej, przekroczyć rozpuszczalność w wodzie. W przypadku substancji chemicznych o niskiej rozpuszczalności w wodzie może być konieczne przygotowanie stężonego roztworu podstawowego lub dyspersji substancji chemicznej z użyciem rozpuszczalnika organicznego lub środka dyspergującego, aby ułatwić dodanie precyzyjnych ilości substancji chemicznej do pożywki oraz jej dyspersję i rozpuszczenie. Należy dołożyć wszelkich starań, aby uniknąć użycia takich materiałów. Użycie pomocniczych rozpuszczalników lub środków dyspergujących nie powinno powodować fitotoksyczności. Na przykład do powszechnie używanych rozpuszczalników, które nie powodują fitotoksyczności w stężeniach do 100 μl/l, należą aceton i dimetyloformamid. W przypadku użycia rozpuszczalnika lub środka dyspergującego w sprawozdaniu należy podać jego końcowe stężenie, które powinno być utrzymane na minimalnym poziomie (≤ 100 μl/l) i we wszystkich grupach badanych i grupach kontrolnych należy zachować takie samo stężenie rozpuszczalnika lub środka dyspergującego. Dalsze wskazówki na temat użycia środków dyspergujących podano w (8).
Grupy badane i kontrolne
27. W doborze odpowiednich badanych stężeń pomocna będzie uprzednia znajomość toksyczności badanej substancji chemicznej w stosunku do Lemna, np. z badania ustalającego zakres. W ostatecznym badaniu toksyczności powinno zwykle być co najmniej pięć badanych stężeń uporządkowanych w postaci szeregu geometrycznego. Współczynnik rozdziału pomiędzy badanymi stężeniami w miarę możliwości nie powinien przekraczać 3,2, lecz można zastosować większą wartość, jeżeli krzywa stężenie-odpowiedź jest płaska. Jeżeli użyto mniej niż pięć stężeń, należy podać uzasadnienie. Przy każdym badanym stężeniu należy zastosować co najmniej trzy kontrpróby.
28. Przy ustalaniu zakresu badanych stężeń (w przypadku badania ustalającego zakres lub ostatecznego badania toksyczności) należy wziąć pod uwagę, co następuje:
- aby określić ECx, badane stężenia powinny obejmować swoim zakresem wartość ECx w celu zapewnienia odpowiedniego poziomu ufności. Na przykład jeżeli oszacowuje się EC50, to najwyższe badane stężenie nie powinno być większe od wartości EC50. Jeżeli wartość EC50 leży poza zakresem badanych stężeń, to związane z tym przedziały ufności będą większe i odpowiednia ocena statystycznego dopasowania modelu może nie być możliwa;
- jeżeli celem jest oszacowanie LOEC/NOEC, to najniższe badane stężenie powinno być dostatecznie niskie, aby wzrost nie był znacząco mniejszy niż wzrost w grupie kontrolnej. Ponadto najwyższe badane stężenie powinno być dostatecznie wysokie, aby wzrost był znacząco mniejszy niż w grupie kontrolnej. Jeśli jest inaczej, badanie musi zostać powtórzone przy zastosowaniu innego zakresu stężeń (chyba że najwyższe stężenie równe jest granicznej rozpuszczalności lub maksymalnemu wymaganemu stężeniu granicznemu np. 100 mg/l).
29. Każde badanie powinno obejmować grupy kontrolne zawierające taką samą pożywkę, liczbę liści i kolonii, warunki otoczenia i procedury jak naczynia badawcze, lecz bez badanej substancji chemicznej. Jeżeli użyty jest pomocniczy rozpuszczalnik lub środek dyspergujący, należy włączyć dodatkową grupę kontrolną z obecnością rozpuszczalnika/środka dyspergującego o tym samym stężeniu co w naczyniach z badaną substancją chemiczną. Liczba naczyń kontrolnych z kontrpróbą (oraz, w stosownym wypadku, naczyń z rozpuszczalnikiem) powinna być co najmniej równa, a najlepiej dwukrotnie większa od liczby naczyń użytych do każdego badanego stężenia.
30. Jeżeli wyznaczenie NOEC nie jest wymagane, projekt badania można zmienić, zwiększając liczbę stężeń i zmniejszając liczbę kontrprób przypadających na stężenie. Muszą być jednak zastosowane co najmniej trzy kontrpróby.
Narażenie
31. Kolonie składające się z 2-4 widocznych liści przenosi się z kultury inokulum i losowo przydziela do naczyń badawczych w warunkach aseptycznych. Każde naczynie badawcze powinno zawierać łącznie 9-12 liści. Liczba liści i kolonii powinna być taka sama w każdym naczyniu. Jak wynika z doświadczenia uzyskanego dzięki tej metodzie oraz z danych z badania międzylaboratoryjnego, użycie trzech kontrprób na zabieg, przy czym każda kontrpróba zawiera początkowo 9-12 liści, jest wystarczające do wykrycia różnic we wzroście wynoszących w przybliżeniu 4-7 % zahamowania obliczonego na podstawie szybkości wzrostu (10-15 % w przypadku obliczenia na podstawie przyrostu) pomiędzy zabiegami (7).
32. Wymagany jest randomizowany układ rozmieszczenia naczyń badawczych w inkubatorze, aby ograniczyć do minimum wpływ przestrzennych różnic natężenia światła i temperatury. Podczas dokonywania obserwacji wymagany jest również zblokowany układ lub losowe przestawianie naczyń (albo ich częstsze przestawianie).
33. Jeżeli wstępny test stabilności wykazuje, że nie można utrzymać stężenia badanej substancji chemicznej (tj. mierzone stężenie spada poniżej 80 % zmierzonego początkowego stężenia) w czasie trwania badania (7 dni), zalecane są warunki badania półstatycznego. W takim przypadku kolonie należy wystawić na działanie świeżo przygotowanych roztworów do badań i roztworów kontrolnych co najmniej dwukrotnie w trakcie badania (np. w 3. i 5. dniu). Częstotliwość narażenia na świeżą pożywkę będzie zależeć od stabilności badanej substancji chemicznej; do utrzymania prawie stałych stężeń wysoce nietrwałych lub lotnych substancji chemicznych może być wymagana większa częstotliwość. W niektórych sytuacjach może być konieczna procedura przepływowa (8)(10).
34. Scenariusz narażenia poprzez nałożenie na liście (natrysk) nie jest objęty niniejszą metodą badawczą; natomiast zob. (11).
Warunki inkubacji
35. Należy zastosować ciągłe oświetlenie w postaci ciepłego lub chłodnego białego światła fluorescencyjnego o natężeniu wybranym z zakresu 85-135 mE m- 2s- 1, mierzonym w promieniowaniu fotosyntetycznie czynnym (400-700 nm) w punktach o takiej samej odległości od źródła światła co liście Lemna (równoważnym 6 500- 10 000 luksów). Wszelkie różnice w stosunku do wybranego natężenia światła na badanej powierzchni nie powinny przekraczać ± 15 %. Na wartość pomiarową będzie mieć wpływ metoda detekcji i pomiaru światła, w szczególności typ czujnika. Nad czujniki jednokierunkowe przedkładane są czujniki sferyczne (które reagują na światło padające pod wszystkimi kątami powyżej i poniżej płaszczyzny pomiaru) oraz czujniki "kosinusowe" (które reagują na światło padające pod wszystkimi kątami powyżej płaszczyzny pomiaru) i dają wyższe odczyty w przypadku opisywanego tu typu wielopunktowego źródła światła.
36. Temperatura w naczyniach badawczych powinna wynosić 24 ± 2 °C. Wartość pH pożywki kontrolnej nie powinna wzrosnąć w trakcie badania o więcej niż 1,5 jednostki. Jednakże odchylenie o więcej niż 1,5 jednostki nie spowoduje unieważnienia badania, jeśli można wykazać, że spełnione są kryteria ważności. Dodatkowej uwagi wymaga dryft pH w szczególnych przypadkach, takich jak podczas badania nietrwałych substancji lub metali. Dalsze wskazówki przedstawiono w (8).
Czas trwania
37. Badanie zostaje zakończone po 7 dniach od przeniesienia roślin do naczyń badawczych.
Pomiary i oznaczenia analityczne
38. Na początku badania liczy się i rejestruje liczbę liści w naczyniach badawczych, zwracając uwagę na uwzględnienie wystających, wyraźnie widocznych liści. Liczbę liści, które wyglądają normalnie albo nienormalnie, należy określić na początku badania, co najmniej raz na 3 dni w ciągu okresu narażenia (tj. co najmniej 2 razy podczas 7-dniowego okresu) oraz na zakończenie badania. Należy odnotować zmiany w rozwoju roślin, np. pod względem wielkości liści, wyglądu, oznak martwicy, chlorozy lub garbatości, rozpadu kolonii lub utraty zdolności utrzymywania się na powierzchni wody oraz długości i wyglądu korzeni. Należy również odnotować istotne cechy pożywki (np. obecność nierozpuszczonej substancji, wzrost glonów w naczyniu badawczym).
39. Oprócz określenia liczby liści w trakcie badania ocenia się również wpływ badanej substancji chemicznej na jedną (lub więcej) z następujących zmiennych pomiarowych:
(i) całkowitą powierzchnię liści;
(ii) suchą masę;
(iii) mokrą masę.
40. Całkowita powierzchnia liści ma tę zaletę, że może być określona dla każdego naczynia badawczego i kontrolnego na początku, w trakcie i na koniec badania. Suchą lub mokrą masę należy określić na początku badania na podstawie próbki kultury inokulum reprezentatywnej dla tego, co jest użyte do rozpoczęcia badania, oraz na końcu badania przy użyciu materiału roślinnego z każdego naczynia badawczego i kontrolnego. Jeśli nie mierzy się powierzchni liści, to suchą masę przedkłada się nad mokrą masę.
41. Całkowitą powierzchnię liści, suchą masę i mokrą masę można wyznaczyć następująco:
(i) całkowita powierzchnia liści: całkowitą powierzchnię liści wszystkich kolonii można określić za pomocą analizy obrazu. Sylwetkę naczynia badawczego i roślin można uchwycić za pomocą kamery wideo (np. ustawiając naczynie na kopioramie), a otrzymany w wyniku obraz poddać digitalizacji. Kalibrując za pomocą płaskich kształtów o znanej powierzchni, można następnie wyznaczyć całkowitą powierzchnię liści w naczyniu badawczym. Należy pamiętać, aby wykluczyć interferencję spowodowaną przez obrzeże naczynia badawczego. Alternatywne, choć bardziej pracochłonne podejście polega na wykonaniu fotokopii wszystkich naczyń badawczych i roślin, wycięciu otrzymanej sylwetki kolonii i wyznaczeniu ich powierzchni przy użyciu analizatora powierzchni liści lub papieru milimetrowego. Odpowiednie mogą być również inne techniki (np. określenie stosunku ciężaru papieru z wyciętą powierzchni sylwetki kolonii do ciężaru papieru o powierzchni jednostkowej);
(ii) sucha masa: z każdego naczynia badawczego zbiera się wszystkie kolonie i przepłukuje wodą destylowaną lub dejonizowaną. Odsącza się je na bibule w celu usunięcia nadmiaru wody, a następnie suszy w temperaturze 60 °C do stałej masy. Należy dołączyć fragmenty korzeni. Suchą masę należy wyrazić z dokładnością do co najmniej 0,1 mg;
(iii) mokra masa: wszystkie kolonie przenosi się do uprzednio zważonych probówek z polistyrenu (lub innego obojętnego materiału) z małymi (1 mm) otworami w zaokrąglonym dnie. Następnie probówki odwirowuje się z prędkością 3 000 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Probówki zawierające wysuszone kolonie ponownie waży się i oblicza się mokrą masę przez odjęcie ciężaru pustej probówki.
Częstotliwość pomiarów i oznaczeń analitycznych
42. Jeżeli zastosowany jest układ statyczny, należy zmierzyć pH każdego zabiegu na początku i na końcu badania. Jeżeli zastosowany jest układ półstatyczny, należy zmierzyć pH w każdej partii "świeżego" roztworu do badań przed każdą wymianą oraz w odpowiednich "zużytych" roztworach.
43. Natężenie światła należy zmierzyć w komorze wzrostowej, inkubatorze lub pomieszczeniu w różnych punktach o takiej samej odległości od źródła światła co liście Lemna. Pomiaru należy dokonać co najmniej raz w trakcie badania. Temperaturę pożywki w naczyniu zastępczym utrzymywanym w takich samych warunkach w komorze wzrostowej, inkubatorze lub pomieszczeniu należy rejestrować co najmniej raz dziennie.
44. Podczas badania w odpowiednich odstępach czasu oznacza się stężenia badanej substancji chemicznej. W badaniach statycznych minimalnym wymogiem jest oznaczenie stężeń na początku i na końcu badania.
45. W badaniach półstatycznych, w przypadku których nie oczekuje się, że stężenie badanej substancji chemicznej utrzyma się w granicach ± 20 % stężenia nominalnego, niezbędne jest objęcie analizą wszystkich świeżo przygotowanych roztworów do badań oraz tych samych roztworów przy każdej wymianie (zob. pkt 33). Jednakże w przypadku tych badań, w których zmierzone początkowe stężenie badanej substancji chemicznej nie mieści się w granicach ± 20 % stężenia nominalnego, lecz można dostarczyć dostatecznych dowodów wykazujących, że początkowe stężenia są powtarzalne i stabilne (tj. zawierają się w granicach 80-120 % początkowego stężenia), oznaczenia chemiczne można przeprowadzać tylko na najwyższych i najniższych badanych stężeniach. We wszystkich przypadkach oznaczenie stężeń badanej substancji chemicznej przed wymianą musi być wykonywane tylko na jednym naczyniu z kontrpróbą przy każdym badanym stężeniu (lub na połączonych zawartościach naczyń z kontrpróbą).
46. W przypadku zastosowania badania przepływowego odpowiednim systemem jest system pobierania próbek podobny do opisanego dla badań półstatycznych, wraz z analizą na początku, w trakcie i na końcu badania, lecz w tym przypadku pomiar "zużytych" roztworów nie jest odpowiedni. W tego typu badaniu należy codziennie sprawdzać natężenie przepływu rozcieńczalnika i badanej substancji chemicznej lub roztworu podstawowego badanej substancji chemicznej.
47. Jeżeli istnieją dowody, że stężenie badanej substancji chemicznej zostało zadowalająco utrzymane w granicach ± 20 % nominalnego lub zmierzonego początkowego stężenia w ciągu całego badania, to analizę wyników można oprzeć na nominalnych lub zmierzonych początkowych wartościach. Jeśli odchylenie od nominalnego lub zmierzonego początkowego stężenia nie mieści się w zakresie ± 20 %, to analizę wyników należy oprzeć na średnim geometrycznym stężeniu w ciągu narażenia lub na modelach opisujących spadek stężenia badanej substancji chemicznej (8).
Badanie graniczne
48. W niektórych okolicznościach, na przykład gdy badanie wstępne wskazuje, że badana substancja chemiczna nie ma skutków toksycznych w stężeniach do 100 mg/l lub do jej rozpuszczalności granicznej w pożywce (w zależności od tego, która wartość jest niższa), można przeprowadzić badanie graniczne polegające na porównaniu reakcji w grupie kontrolnej i jednej grupie badanej (o stężeniu 100 mg/l lub równym granicznej rozpuszczalności). Zdecydowanie zaleca się, aby takie badanie było poparte analizą stężenia ekspozycyjnego. Do badania granicznego stosują się wszystkie wcześniej opisane warunki badania i kryteria ważności, z tym że liczba kontrprób poddawanych zabiegowi powinna zostać podwojona. Wzrost w grupie kontrolnej i grupie badanej można poddać analizie przy użyciu testu statystycznego do porównywania średnich, np. testu t-Studenta.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Czas podwojenia
49. Aby określić czas podwojenia (Td) liczby liści oraz spełnienie przez badanie niniejszego kryterium ważności (pkt 12), używa się poniższego wzoru z danymi uzyskanymi z naczyń kontrolnych:
Td = ln 2/m
gdzie m jest średnią właściwą szybkością wzrostu wyznaczoną w sposób opisany w pkt 54-55.
Zmienne zależne
50. Celem badania jest określenie wpływu badanej substancji chemicznej na wzrost wegetatywny Lemna. Niniejsza metoda badawcza opisuje dwie zmienne zależne, gdyż różne jurysdykcje mają różne preferencje i potrzeby regulacyjne. Aby wyniki badania były akceptowalne we wszystkich jurysdykcjach, wpływ należy ocenić przy użyciu obydwu zmiennych zależnych a) i b) opisanych poniżej.
a) średnia właściwa szybkość wzrostu: tę zmienną zależną oblicza się na podstawie zmian logarytmów liczb liści, a także na podstawie zmian logarytmów innego parametru pomiarowego (całkowitej powierzchni liści, suchej masy lub mokrej masy) w czasie (wyrażonych na dzień) w grupach kontrolnych i w każdej grupie badanej. Niekiedy określa się je mianem względnej szybkości wzrostu (12);
b) przyrost: tę zmienną zależną oblicza się na podstawie zmian liczby liści, a także na podstawie zmian innego parametru pomiarowego (całkowitej powierzchni liści, suchej masy lub mokrej masy) w grupach kontrolnych i w każdej grupie badanej, do końca badania.
51. Należy zauważyć, że wartości toksyczności obliczone przy użyciu tych dwóch zmiennych zależnych nie są porównywalne i różnicę tę należy uwzględnić przy wykorzystywaniu wyników badania. Jeżeli spełnione są warunki badania określone w niniejszej metodzie badawczej, wartości ECx oparte na średniej właściwej szybkości wzrostu (ErCx) będą zwykle wyższe od wyników opartych na przyroście (EyCx) ze względu na podstawę matematyczną tych podejść. Nie należy interpretować tego jako różnicy wrażliwości pomiędzy tymi dwiema zmiennymi zależnymi, lecz jedynie jako stwierdzenie, że wartości te są różne pod względem matematycznym. Pojęcie średniej właściwej szybkości wzrostu opiera się na ogólnym przebiegu wzrostu wykładniczego rzęsy w nieograniczonych kulturach, gdzie toksyczność szacuje się na podstawie wpływu na szybkość wzrostu, przy czym nie jest ona zależna od bezwzględnego poziomu właściwej szybkości wzrostu grupy kontrolnej, nachylenia krzywej stężenie-odpowiedź ani czasu trwania badania. Natomiast wyniki oparte na zmiennej zależnej w postaci przyrostu są zależne od wszystkich tych pozostałych zmiennych. EyCx jest zależne od właściwej szybkości wzrostu gatunków rzęsy użytych w każdym badaniu oraz od maksymalnej właściwej szybkości wzrostu, która może być różna dla różnych gatunków, a nawet dla różnych klonów. Tej zmiennej zależnej nie powinno się używać do porównywania wrażliwości na substancje toksyczne pomiędzy gatunkami rzęsy ani nawet różnymi klonami. Choć z naukowego punktu widzenia preferuje się szacowanie toksyczności z wykorzystaniem średniej właściwej szybkości wzrostu, oszacowania toksyczności na podstawie przyrostu również objęto niniejszą metodą badawczą, aby uwzględnić obecne wymogi regulacyjne istniejące w niektórych krajach.
52. Oszacowania toksyczności powinny być oparte na liczbie liści oraz na jednej dodatkowej zmiennej pomiarowej (całkowitej powierzchni liści, suchej masie lub mokrej masie), ponieważ niektóre substancje chemiczne mogą mieć znacznie większy wpływ na inne zmienne pomiarowe niż na liczbę liści. Wpływ ten nie zostałby wykryty w wyniku obliczenia tylko liczby liści.
53. Liczbę liści, jak również każdą inną rejestrowaną zmienną pomiarową, tj. całkowitą powierzchnię liści, suchą masę lub mokrą masę, zapisuje się w postaci tabelarycznej wraz ze stężeniami badanej substancji chemicznej podczas każdego pomiaru. Późniejsza analiza danych, np. w celu oszacowania LOEC, NOEC lub ECx, powinna być oparta na wartościach dla poszczególnych kontrprób, a nie na obliczonych średnich dla każdej grupy badanej.
Średnia właściwa szybkość wzrostu
54. Średnią właściwą szybkość wzrostu dla konkretnego okresu oblicza się jako logarytmiczny przyrost zmiennych wzrostu - liczby liści oraz jednej innej zmiennej pomiarowej (całkowitej powierzchni liści, suchej masy lub mokrej masy) - przy użyciu poniższego wzoru, dla każdej kontrpróby kontrolnej i dla każdego zabiegu:
gdzie:
- mi-j: średnia właściwa szybkość wzrostu od momentu i do j,
- Ni: zmienna pomiarowa w naczyniu badawczym lub kontrolnym o czasie i,
- Nj: zmienna pomiarowa w naczyniu badawczym lub kontrolnym o czasie j,
- t: okres od czasu i do j.
Dla każdej grupy badanej i kontrolnej należy obliczyć średnią wartość szybkości wzrostu wraz z oszacowaniami wariancji.
55. Średnią właściwą szybkość wzrostu należy obliczyć dla całego okresu badania (czas "i" w powyższym równaniu jest początkiem badania, a czas "j" jest końcem badania). Dla każdego stężenia testowego i grupy kontrolnej należy obliczyć średnią wartość średniej właściwej szybkości wzrostu wraz z oszacowaniami wariancji. Ponadto należy ocenić szybkość wzrostu dla poszczególnych odcinków, aby określić wpływ badanej substancji chemicznej występujący w okresie narażenia (np. przez badanie krzywych wzrostu przekształconych na postać logarytmiczną). Znaczące różnice pomiędzy szybkością wzrostu dla poszczególnych odcinków a średnia szybkością wzrostu świadczą o odchyleniu od stałego wzrostu wykładniczego i uzasadniają dokładne zbadanie krzywych wzrostu. W takim przypadku zachowawczym podejściem byłoby porównanie właściwej szybkości wzrostu uzyskanej z kultur objętych badaniem w okresie maksymalnego zahamowania z właściwą szybkością wzrostu dla kultur kontrolnych w tym samym okresie.
56. Następnie można obliczyć procentowe zahamowanie tempa wzrostu (Ir) dla każdego badanego stężenia (grupy badanej) zgodnie z poniższym wzorem:
gdzie:
- % Ir: procentowe zahamowanie średniej właściwej szybkości wzrostu;
- μC: średnia wartość mw grupie kontrolnej,
- μT: średnia wartość m w grupie badanej.
Przyrost
57. Wpływ na przyrost określa się na podstawie dwóch zmiennych pomiarowych: liczby liści oraz jednej innej zmiennej pomiarowej (całkowitej powierzchni liści, suchej masy lub mokrej masy) zmierzonych w każdym naczyniu badawczym na początku i na końcu badania. Dla suchej masy lub mokrej masy początkową biomasę określa się na podstawie próbki liści pobranej z tej samej partii użytej do zaszczepienia naczyń badawczych (zob. pkt 20). Dla każdego badanego stężenia i próby kontrolnej należy obliczyć średnią wartość przyrostu wraz z oszacowaniami wariancji. Średnie procentowe zahamowanie przyrostu (% Iy) można obliczyć dla każdej grupy badanej w następujący sposób:
gdzie:
- % Iy: procentowe zmniejszenie przyrostu,
- bC: biomasa końcowa minus biomasa początkowa dla grupy kontrolnej,
- bT: biomasa końcowa minus biomasa początkowa dla grupy badanej.
Wykreślanie krzywych stężenie-odpowiedź
58. Należy wykreślić krzywe stężenie-odpowiedź wiążące średnie procentowe zahamowanie zmiennej zależnej (Ir lub Iy obliczone w sposób wskazany w pkt 56 lub 57) i logarytm stężenia badanej substancji chemicznej.
Oszacowanie ECx
59. Oszacowania ECx (np. EC50) powinny być oparte zarówno na średniej właściwej szybkości wzrostu (ErCx), jak i na przyroście (EyCx), z których każde powinno opierać się na liczbie liści oraz jednej dodatkowej zmiennej pomiarowej (całkowitej powierzchni liści, suchej masie lub mokrej masie). Wynika to stąd, że istnieją takie badane substancje chemiczne, które wywierają różny wpływ na liczbę liści i inne zmienne pomiarowe. Pożądanymi parametrami toksyczności są więc cztery wartości ECx dla każdego obliczonego poziomu zahamowania x: ErCx (liczba liści); ErCx (całkowita powierzchnia liści, sucha masa lub mokra masa); EyCx (liczba liści); oraz EyCx (całkowita powierzchnia liści, sucha masa lub mokra masa).
Procedury statystyczne
60. Celem jest uzyskanie ilościowej zależności stężenie-odpowiedź za pomocą analizy regresji. Możliwe jest zastosowanie ważonej regresji liniowej po przeprowadzeniu transformacji linearyzującej danych odpowiedzi - na przykład do jednostek probit, logit albo Weibulla (13), lecz preferowane są procedury regresji nieliniowej, które lepiej sprawdzają się w przypadku nieuniknionych nieregularności danych i odchyleń od wyrównanych rozkładów. Przy zbliżaniu się do zerowego albo całkowitego zahamowania nieregularności takie mogą zostać powiększone przez transformację, zakłócając analizę (13). Należy zwrócić uwagę, że standardowe metody analizy przy użyciu transformat probit, logit albo Weibulla są przeznaczone do stosowania do danych binarnych (np. dotyczących śmiertelności lub przeżywalności) i muszą zostać zmodyfikowane, aby uwzględnić dane dotyczące szybkości wzrostu lub przyrostu. Szczegółowe procedury wyznaczania wartości ECx na podstawie danych ciągłych można znaleźć w (14), (15) i (16).
61. Dla każdej zmiennej zależnej, która ma być analizowana, należy zastosować zależność stężenie-odpowiedź do obliczenia oszacowań punktowych wartości ECx. W miarę możliwości dla każdego oszacowania należy określić granice ufności na poziomie 95 %. Zgodność danych odpowiedzi z modelem regresji należy ocenić graficznie lub statystycznie. Analizę regresji należy przeprowadzić z zastosowaniem odpowiedzi z poszczególnych kontrprób, a nie średnich z grup badanych.
62. Oszacowania wartości EC50 i granice ufności można również otrzymać przy użyciu interpolacji liniowej z zastosowaniem metody bootstrap (17), jeżeli dostępne modele/metody regresji są nieodpowiednie do danych.
63. W celu oszacowania LOEC, a następnie NOEC, konieczne jest porównanie średnich z grup badanych przy użyciu technik analizy wariancji (ANOVA). Średnią dla każdego stężenia należy następnie porównać ze średnią kontrolną przy użyciu odpowiedniej metody wielokrotnego porównania lub testu trendu. Przydatny może być test Dunnetta lub Williamsa (18)(19)(20)(21). Należy ocenić, czy przyjęte w ANOVA założenie jednorodności wariancji nadal obowiązuje. Ocenę tę można przeprowadzić graficznie albo za pomocą formalnego testu (22). Odpowiednimi do tego celu testami są testy Levene'a lub Bartletta. Niespełnienie założenia o jednorodności wariancji można niekiedy skorygować za pomocą transformacji logarytmicznej danych. Jeżeli niejednorodność wariancji jest ekstremalna i nie można jej skorygować przez transformację, należy rozważyć analizę za pomocą takich metod jak regresyjne testy Jonckheere'a. Dodatkowe wskazówki dotyczące wyznaczania NOEC można znaleźć w (16).
64. W wyniku najnowszych osiągnięć naukowych zaleca się odstąpienie od stosowania pojęcia NOEC i zastąpienie go opartymi o regresję oszacowaniami punktowymi wartości ECx. Dla niniejszego badania Lemna nie ustalono odpowiedniej wartości x. Wydaje się jednak, że odpowiedni jest przedział 10-20 % (w zależności od wybranej zmiennej zależnej), a najlepiej jest podać zarówno EC10, jak i EC20.
Sprawozdawczość
65. Sprawozdanie z badania musi zawierać poniższe informacje. Badana substancja chemiczna:
- właściwości fizyczne i właściwości fizykochemiczne, w tym graniczna rozpuszczalność w wodzie,
- dane identyfikacyjne substancji chemicznej (np. numer CAS), w tym czystość (zanieczyszczenia).
Badany gatunek:
- nazwa systematyczna, klon (jeśli jest znany) oraz źródło. Warunki badania:
- zastosowana procedura badawcza (statyczna, półstatyczna lub przepływowa);
- data rozpoczęcia badania i czas jego trwania;
- pożywka;
- opis projektu doświadczenia: naczynia badawcze i przykrywki, objętości roztworów, liczba kolonii i liści przypadających na naczynie badawcze na początku badania;
- stężenia testowe (nominalne i zmierzone, gdy jest to stosowne) oraz liczba kontrprób na stężenie;
- metody przygotowywania roztworów podstawowych i roztworów do badań, w tym ewentualne zastosowanie rozpuszczalników lub środków dyspergujących;
- temperatura podczas badania;
- źródło światła, natężenie i jednorodność światła;
- wartości pH pożywki testowej i kontrolnej;
- stężenia badanej substancji chemicznej oraz metoda analizy wraz z odpowiednimi danymi oceny jakości (badania walidacyjne, odchylenia standardowe lub granice ufności analiz);
- metody określania liczby liści i innych zmiennych pomiarowych, np. suchej masy, mokrej masy lub powierzchni liści;
- wszelkie odstępstwa od niniejszej metody badawczej. Wyniki:
- dane surowe: liczba liści oraz inne zmienne pomiarowe w każdym naczyniu badawczym i kontrolnym podczas każdej obserwacji i analizy;
- średnie i odchylenia standardowe dla każdej zmiennej pomiarowej;
- krzywe wzrostu dla każdego stężenia (zalecane ze zmienną pomiarową przekształconą do postaci logarytmicznej, zob. pkt 55);
- czas podwojenia/szybkość wzrostu w grupie kontrolnej na podstawie liczby liści;
- obliczone zmienne zależne dla każdej kontrpróby poddanej zabiegowi wraz z wartościami średnimi i współczynnikiem zmienności dla kontrprób;
- graficzne przedstawienie zależności stężenie/skutek;
- oszacowania toksykologicznych punktów końcowych dla zmiennych zależnych, np. EC50, EC10, EC20, oraz związane z nimi przedziały ufności. LOEC lub NOEC, jeżeli zostały obliczone, oraz metody statystyczne użyte do ich wyznaczenia;
- jeżeli zastosowano ANOVA - wielkość wpływu, który można wykryć (np. najmniejsza znacząca różnica);
- wszelka stymulacja wzrostu stwierdzona w którymkolwiek zabiegu;
- wszelkie wizualne oznaki fitotoksyczności, jak również obserwacje roztworów do badań;
- omówienie wyników, w tym ewentualny wpływ na wynik badania będący skutkiem odstępstw od niniejszej metody badawczej.
BIBLIOGRAFIA
(1) ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (ponownie zatwierdzony w 1998 r.), s. 733-742. W: Annual Book of ASTM Standards, Vol. 11.05 Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides, ASTM, West Conshohocken, PA.
(2) US EPA - Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (1996). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., Public draft. EPA 712-C-96-156. 8 s.
(3) AFNOR - Association Française de Normalisation (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10 s.
(4) SSI - Szwedzki Instytut Normalizacyjny. (1995). Water quality - Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15 s. (w języku szwedzkim).
(5) Environment Canada. (1999). Biological Test Method: Test for Measuring the Inhibition of Growth Using the Freshwater Macrophyte, Lemna minor. EPS 1/RM/37-120 s.
(6) Environment Canada. (1993) Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides: Non-Target Plant Testing and Evaluation. Canadian Wildlife Service, Seria raportów technicznych nr 145.
(7) Sims I., Whitehouse P. i Lacey R. (1999). The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc - Environment Agency.
(8) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Publikacje OECD na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, Seria OECD dotycząca badań i oceny, nr 23. Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju, Paryż.
(9) Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (ISO). ISO DIS 20079. Water Quality - Determination of the Toxic Effect of Water Constituents and Waste Water to Duckweed (Lemna minor) - Duckweed Growth Inhibition Test.
(10) Walbridge C.T. (1977). A flow-through testing procedure with duckweed (Lemna minor L.). Environmental Research Laboratory - Duluth, Minnesota 55804. Raport Agencji Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych nr EPA-600/3-77 108. Wrzesień 1977.
(11) Lockhart W. L., Billeck B. N. i Baron C. L. (1989). Bioassays with a floating plant (Lemna minor) for effects of sprayed and dissolved glyphosate. Hydrobiologia, 118/119, 353-359.
(12) Huebert, D.B. i Shay J.M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environmental Toxicology and Chemistry, 12, 481-483.
(13) Christensen E.R., Nyholm N. (1984): Ecotoxicological Assays with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. Technol. 19: 713-718.
(14) Nyholm N., Sørensen P.S., Kusk K.O. i Christensen E.R. (1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity tests. Environ. Toxicol. Chem. 11: 157-167.
(15) Bruce R.D. i Versteeg D.J. (1992) A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry, 11, 1485-1494.
(16) OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju, Paryż.
(17) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chronic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. US EPA, Duluth, MN.
(18) Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, 1096-1121.
(19) Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, 482-491.
(20) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.
(21) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 519-531.
(22) Brain P. i Cousens R. (1989). An equation to describe dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96.
Dodatek 1
Definicje
Do celów niniejszej metody badawczej użyto następujących definicji i skrótów.
Biomasa jest to sucha masa materii żywej obecnej w populacji. W niniejszym badaniu zwykle mierzy się surogaty biomasy, takie jak liczba lub powierzchnia liści, w związku z czym określenie "biomasa" odnosi się także do tych pomiarów zastępczych.
Substancja chemiczna oznacza substancję lub mieszaninę.
Chloroza jest to żółknięcie tkanki liści.
Klon jest to organizm lub komórka powstałe z pojedynczego osobnika przez rozmnażanie wegetatywne. Osobniki z tego samego klonu są zatem genetycznie identyczne.
Kolonia oznacza skupisko macierzystych lub pochodnych liści (zwykle 2 do 4) przyczepionych do siebie nawzajem. Niekiedy określana jest mianem rośliny.
ECxjest stężeniem badanej substancji chemicznej rozpuszczonej w pożywce, powodującym zmniejszenie wzrostu Lemna o x % (np. 50 %) w danym okresie narażenia (który należy wyraźnie określić, jeśli odbiega od pełnego lub normalnego czasu trwania badania). Aby jednoznacznie oznaczyć wartość EC wynikającą z szybkości wzrostu albo z przyrostu, w odniesieniu do szybkości wzrostu używa się symbolu "ErC", a w odniesieniu do przyrostu - symbolu "EyC", po którym następuje użyta zmienna pomiarowa, np. ErC (liczba liści).
Badanie przepływowe jest to badanie, w którym roztwory do badań są wymieniane w sposób ciągły.
Liść jest to indywidualna/pojedyncza "liściopodobna" struktura rośliny rzęsy wodnej. Jest to najmniejsza jednostka, tj. osobnik, zdolna do rozmnażania się.
Garbatość oznacza liście o wybrzuszonym lub spuchniętym wyglądzie.
Wzrost jest to przyrost zmiennej pomiarowej, np. liczby liści, suchej masy, mokrej masy lub powierzchni liści, w trakcie okresu badania.
Szybkość wzrostu (średnia właściwa szybkość wzrostu) jest to logarytmiczny przyrost biomasy w okresie narażenia.
Najniższe stężenie, przy którym obserwuje się zmiany (LOEC) jest to najniższe badane stężenie, przy którym obserwuje się, że substancja chemiczna ma statystycznie istotny wpływ na ograniczenie wzrostu (przy p < 0,05) w porównaniu z grupą kontrolną w danym czasie narażenia. Jednakże wszystkie badane stężenia powyżej LOEC muszą mieć szkodliwy skutek równy lub większy niż te, które są obserwowane przy LOEC. W przypadku gdy te dwa warunki nie mogą być spełnione, należy szczegółowo wyjaśnić, w jaki sposób wybrano LOEC (a następnie NOEC).
Zmienne pomiarowe są to dowolnego typu zmienne, które mierzy się, aby wyrazić punkt końcowy badania przy użyciu jednej zmiennej zależnej lub większej ich liczby. W niniejszej metodzie zmiennymi pomiarowymi są liczba liści, powierzchnia liści, sucha masa i mokra masa.
Monokultura jest to kultura obejmująca jeden gatunek roślin.
Martwica jest to obumarła (tj. biała lub nasiąknięta wodą) tkanka liściowa.
Stężenie, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC) jest to badane stężenie bezpośrednio poniżej LOEC.
Fenotyp są to obserwowalne cechy organizmu zdeterminowane przez oddziaływanie między jego genami a środowiskiem.
Zmienne zależne są to zmienne służące do szacowania toksyczności, uzyskane z dowolnych zmierzonych zmiennych opisujących biomasę za pomocą różnych metod obliczeniowych. W przypadku niniejszej metody badawczej zmiennymi zależnymi są szybkość wzrostu i przyrost, które otrzymuje się ze zmiennych pomiarowych, takich jak liczba liści, powierzchnia liści, sucha masa lub mokra masa.
Badanie półstatyczne (z wymianą) jest to badanie, w którym roztwór do badań jest okresowo wymieniany w określonych odstępach czasu w trakcie badania.
Badanie statyczne jest to metoda badawcza bez wymiany roztworu do badań w trakcie badania.
Badana substancja chemiczna oznacza dowolną substancję lub mieszaninę badaną za pomocą niniejszej metody badawczej.
Punkt końcowy badania opisuje ogólny czynnik, który będzie ulegał zmianie pod wpływem badanej substancji chemicznej w porównaniu z grupą kontrolną, co jest celem badania. W niniejszej metodzie badawczej punktem końcowym badania jest zahamowanie wzrostu, które można wyrazić za pomocą różnych zmiennych zależnych opartych na jednej zmiennej pomiarowej lub większej ich liczbie.
Pożywka jest to kompletne syntetyczne podłoże, na którym rośliny wzrastają, gdy są narażone na działanie badanej substancji chemicznej. Badana substancja chemiczna jest zwykle rozpuszczona w pożywce.
Przyrost jest to wartość zmiennej pomiarowej wyrażająca biomasę na końcu okresu narażenia minus wartość zmiennej pomiarowej na początku okresu narażenia.
Dodatek 2
Opis gatunków Lemna
Roślina wodna powszechnie zwana rzęsą, obejmująca gatunki Lemna, należy do rodziny Lemnaceae, na którą składa się szereg występujących na całym świecie gatunków w czterech rodzajach. Ich różny wygląd i taksonomia zostały wyczerpująco opisane (1)(2). Lemna gibba i L. minor są gatunkami reprezentatywnymi dla obszarów o klimacie umiarkowanym i są powszechnie używane do badań toksyczności. Obydwa gatunki mają pływającą lub zanurzoną tarczowatą łodygę (liść) i bardzo cienkie wypustki korzenia wychodzące ze środka dolnej powierzchni każdego liścia. Gatunki Lemna rzadko wytwarzają kwiaty i rośliny rozmnażają się wegetatywnie poprzez wytwarzanie nowych liści (3). W porównaniu do starszych roślin młode rośliny bywają zazwyczaj bledsze, mają krótsze korzenie i składają się z dwóch do trzech liści o różnych rozmiarach. Mały rozmiar gatunku Lemna, jego prosta budowa, wegetatywne rozmnażanie się oraz krótki czas trwania pokolenia sprawiają, że rośliny tego rodzaju są bardzo dogodnym obiektem badań laboratoryjnych (4)(5).
Z powodu prawdopodobnej zmienności międzygatunkowej pod względem wrażliwości miarodajne są jedynie porównania wrażliwości w obrębie gatunku.
Przykłady gatunków Lemna, które były używane do badań: literatura przedmiotu dotycząca gatunków
Lemna aequinoctialis: Eklund, B. (1996). The use of the red alga Ceramium strictum and the duckweed Lemna aequinoc-tialis in aquatic ecotoxicological bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Wydział Ekologii Systemów, Uniwersytet w Sztokholmie.
Lemna major: Clark, N.A. (1925). The rate of reproduction of Lemna major as a function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.
Lemna minor: Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., Public draft. EPA 712-C-96-156. 8 s.
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Détermination de l'inhibition de la croissance de Lemna minor. 10 s.
Szwedzki Instytut Normalizacyjny (SIS). (1995). Water quality - Determination of growth inhibition (7-d) Lemna minor, duckweed. SS 02 82 13. 15 s. (w języku szwedzkim).
Lemna gibba: ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static Toxicity Test With Lemna gibba G3. E 1415-91 (ponownie zatwierdzony w 1998 r.), s. 733-742.
Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (US EPA). (1996). OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using Lemna spp., Public draft. EPA 712-C-96-156. 8 s.
Lemna paucicostata: Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981). Lemna (duckweed) as an indicator of water pollution. I. The sensitivity of Lemna paucicostata to heavy metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.
Lemna perpusilla: Clark, J. R. i in. (1981). Accumulation and depuration of metals by duckweed (Lemna perpusilla). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.
Lemna trisulca: Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the assessment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481-483.
Lemna valdiviana: Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.
Źródła gatunków Lemna
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria
Department of Botany, University of Toronto
Toronto, Ontario, Kanada, M5S 3 B2
tel: +1-416-978-3641
faks:+1-416-978-5878
e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca
North Carolina State University
Forestry Dept
Duckweed Culture Collection
Campus Box 8002
Raleigh, NC 27695-8002
Stany Zjednoczone
tel. 001 (919) 515-7572
astomp@unity.ncsu.edu
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University
SE-106 91
STOCKHOLM
SZWECJA
tel: +46 8 674 7240
faks: +46 8 674 7636
Federal Environmental Agency (UBA)
FG III 3.4
Schichauweg 58
12307 Berlin
Niemcy
e-mail: lemna@uba.de
BIBLIOGRAFIA
(1) Hillman, W.S. (1961). The Lemnaceae or duckweeds: A review of the descriptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287.
(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed (Lemnaceae). Tom 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zurych, Szwajcaria.
(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human utilization of duckweeds (Lemnaceae family). ISBN 82-991150-0-0. The Agricultural Research Council of Norway, Uniwersytet w Oslo.
(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14.
(5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environmental Research, 52:7-22.
Dodatek 3
Utrzymanie kultury wyjściowej
Kultury wyjściowe mogą być utrzymywane w niskich temperaturach (4-10 °C) przez dłuższy okres bez konieczności odtwarzania. Pożywka dla gatunku Lemna może być taka sama jak używana do badań, lecz do kultur wyjściowych można używać innych pożywek bogatych w składniki odżywcze.
Okresowo pewną liczbę młodych, jasnozielonych roślin przenosi się do zawierających świeżą pożywkę naczyń przeznaczonych na nowe kultury, stosując technikę aseptyczną. W proponowanych tu chłodniejszych warunkach wydzieloną hodowlę pochodną można prowadzić w odstępach czasu wynoszących do trzech miesięcy.
Należy używać chemicznie czystych (przepłukanych kwasem) i sterylnych naczyń na nowe kultury oraz stosować techniki aseptyczne. W razie zanieczyszczenia kultury wyjściowej, np. glonami lub grzybami, należy podjąć działania w celu wyeliminowania zanieczyszczających organizmów. W przypadku glonów i większości innych zanieczyszczających organizmów można tego dokonać przez powierzchniową sterylizację. Pobiera się próbkę zanieczyszczonego materiału roślinnego i odcina się korzenie. Następnie materiał energicznie wytrząsa się w czystej wodzie, po czym zanurza się w 0,5-procentowym (obj.) roztworze podchlorynu sodu na czas od 30 sekund do 5 minut. Materiał roślinny następnie płucze się sterylną wodą i przenosi się, w partiach, do przeznaczonych na kultury naczyń zawierających świeżą pożywkę. Wiele liści obumrze w wyniku tego zabiegu, zwłaszcza jeśli stosowane będą dłuższe okresy narażenia, lecz niektóre spośród tych, które przeżyją, będą zazwyczaj wolne od zanieczyszczenia. Liści tych można następnie użyć do ponownego zaszczepienia nowych kultur.
Dodatek 4
Pożywki
Dla L. minor i L. gibba zalecane są różne pożywki. Dla L. minor zaleca się zmodyfikowaną pożywkę według normy szwedzkiej (SIS), natomiast dla L. gibba zalecana jest pożywka 20X AAP. Skład obydwu pożywek podano poniżej. Do przygotowania tych pożywek należy użyć odczynników lub substancji chemicznych do analiz oraz wody dejonizowanej.
Pożywka dla Lemna według normy szwedzkiej (SIS)
- Roztwory podstawowe I-V sterylizuje się przez obróbkę w autoklawie (120 °C, 15 min.) lub za pomocą filtracji przez przeponę (o wielkości porów około 0,2 mm).
- Roztwór podstawowy VI (i opcjonalnie VII) sterylizuje się wyłącznie przez filtrację przeponową; roztworów tych nie należy obrabiać w autoklawie.
- Sterylne roztwory podstawowe należy przechowywać w warunkach chłodnych i ciemnych. Roztwory podstawowe I-V należy usunąć po sześciu miesiącach, natomiast roztwory podstawowe VI (i opcjonalnie VII) mają dopuszczalny okres przechowywania wynoszący jeden miesiąc.
| Nr roztworu podstawowego | Substancja | Stężenie w roztworze podstawowym (g/l) | Stężenie w przygotowanej pożywce (mg/ * l) | Przygotowana pożywka |
| Pierwiastek | Stężenie w przygotowanej pożywce (mg/ * l) | ||||
| I | NaNO3 | 8,50 | 85 | Na; N | 32; 14 |
| KH2PO4 | 1,34 | 13,4 | K; P | 6,0; 2,4 | |
| II | MgSO4 7H2O | 15 | 75 | Mg; S | 7,4; 9,8 |
| III | CaCl2 2H2O | 7,2 | 36 | Ca; Cl | 9,8; 17,5 |
| IV | Na2CO3 | 4,0 | 20 | C | 2,3 |
| V | H3BO3 | 1,0 | 1,00 | B | 0,17 |
| MnCl2 4H2O | 0,20 | 0,20 | Mn | 0,056 | |
| Na2MoO4 2H2O | 0,010 | 0,010 | Mo | 0,0040 | |
| ZnSO4 7H2O | 0,050 | 0,050 | Zn | 0,011 | |
| CuSO4 5H2O | 0,0050 | 0,0050 | Cu | 0,0013 | |
| Co(NO3)2 6H2O | 0,010 | 0,010 | Co | 0,0020 | |
| VI | FeCl3 6H2O | 0,17 | 0,84 | Fe | 0,17 |
| Na2-EDTA 2H2O | 0,28 | 1,4 | - | - | |
| VII | MOPS (bufor) | 490 | 490 | - | - |
Aby przygotować jeden litr pożywki SIS, do 900 ml wody dejonizowanej dodaje się:
- 10 ml roztworu podstawowego I,
- 5 ml roztworu podstawowego II,
- 5 ml roztworu podstawowego III,
- 5 ml roztworu podstawowego IV,
- 1 ml roztworu podstawowego V,
- 5 ml roztworu podstawowego VI,
- 1 ml roztworu podstawowego VII (opcjonalnie).
Uwaga: Dla niektórych badanych substancji chemicznych może być potrzebny dodatkowy roztwór podstawowy VII (bufor MOPS) (zob. pkt 11).
pH reguluje się do 6,5 ± 0,2 przy użyciu 0,1- lub 1-molowego HCl albo NaOH, a objętość uzupełnia się do jednego litra, używając wody dejonizowanej.
Pożywka 20X AAP
Roztwory podstawowe przygotowuje się w sterylnej wodzie destylowanej lub dejonizowanej.
Sterylne roztwory podstawowe należy przechowywać w warunkach chłodnych i ciemnych. W takich warunkach dopuszczalny okres przechowywania roztworów podstawowych wynosić będzie co najmniej 6-8 tygodni.
Dla pożywki 20X AAP przygotowuje się pięć roztworów podstawowych składników odżywczych (A1, A2, A3, B i C), używając substancji chemicznych o czystości odczynnikowej. 20 ml każdego roztworu podstawowego składników odżywczych dodaje się do około 850 ml wody dejonizowanej, tworząc pożywkę. pH reguluje się do 7,5 ± 0,1 przy użyciu 0,1- lub 1-molowego HCl albo NaOH, a objętość uzupełnia się do jednego litra, używając wody dejonizowanej. Pożywkę następnie przefiltrowuje się przez filtr przeponowy (około) 0,2 mm do sterylnego pojemnika.
Pożywkę przeznaczoną do badań należy przygotować 1-2 dni przed użyciem, aby pH mogło się ustabilizować. Przed użyciem należy sprawdzić i w razie potrzeby wyregulować pH pożywki przez dodanie 0,1- lub 1-molowego NaOH albo HCl, jak opisano powyżej.
| Nr roztworu podstawowego | Substancja | Stężenie w roztworze podstawowym (g/ * l) (*) | Stężenie w przygotowanej pożywce (mg/ * l) (*) | Przygotowana pożywka |
| Pierwiastek | Stężenie (mg/ * l) (*) | ||||
| A1 | NaNO3 | 26 | 510 | Na; N | 190; 84 |
| MgCl2 6H2O | 12 | 240 | Mg | 58,08 | |
| CaCl2 2H2O | 4,4 | 90 | Ca | 24,04 | |
| A2 | MgSO4 7H2O | 15 | 290 | S | 38,22 |
| A3 | K2HPO4 3H2O | 1,4 | 30 | K; P | 9,4; 3,7 |
| B | H3BO3 | 0,19 | 3,7 | B | 0,65 |
| MnCl2 4H2O | 0,42 | 8,3 | Mn | 2,3 | |
| FeCl3 6H2O | 0,16 | 3,2 | Fe | 0,66 | |
| Na2EDTA 2H2O | 0,30 | 6,0 | - | - | |
| ZnCl2 | 3,3 mg/l | 66 mg/l | Zn | 31 mg/l | |
| CoCl2 6H2O | 1,4 mg/l | 29 mg/l | Co | 7,1 mg/l | |
| Na2MoO4 2H2O | 7,3 mg/l | 145 mg/l | Mo | 58 mg/l | |
| CuCl2 2H2O | 0,012 mg/l | 0,24 mg/l | Cu | 0,080 mg/l | |
| C | NaHCO3 | 15 | 300 | Na; C | 220; 43 |
| (*) O ile nie podano inaczej. Uwaga: Teoretycznie odpowiednie końcowe stężenie wodorowęglanu (które pozwoli uniknąć znacznej regulacji pH) wynosi 15 mg/ l, a nie 300 mg/l. Jednakże historyczne stosowanie odżywki 20X AAP, w tym w badaniu międzylaboratoryjnym dla niniejszej metody, oparte jest na stężeniu 300 mg/l. (I. Sims, P. Whitehouse i R. Lacey. (1999) The OECD Lemna Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc - Environment Agency.) |
Pożywka STEINBERGA (za ISO 20079)
Stężenia i roztwory podstawowe
Zmodyfikowana pożywka Steinberga zastosowana jest w ISO 20079 dla samego Lemna minor (gdyż tylko Lemna minor jest tam dopuszczony), lecz próby wykazały, iż można uzyskiwać dobre wyniki również w przypadku Lemna gibba.
Do przygotowania pożywki należy użyć substancji chemicznych o czystości średniej, odczynnikowej lub do analizy oraz wody dejonizowanej.
Należy przygotować odżywkę z roztworów podstawowych lub 10-krotnie zatężonej odżywki, co pozwala na maksymalne stężenie odżywki bez strącenia.
Tabela 1
Pożywka STEINBERGA o stabilizowanym pH (zmodyfikowana wg Altenburgera)
| Składnik | Pożywka |
| Makroelementy | masa cząsteczkowa | mg/l | mmol/l |
| KNO3 | 101,12 | 350,00 | 3,46 |
| Ca(NO3)2 4H2O | 236,15 | 295,00 | 1,25 |
| KH2PO4 | 136,09 | 90,00 | 0,66 |
| K2HPO4 | 174,18 | 12,60 | 0,072 |
| MgSO4 7H2O | 246,37 | 100,00 | 0,41 |
| H3BO3 | 61,83 | 120,00 | 1,94 |
| ZnSO4 7H2O | 287,43 | 180,00 | 0,63 |
| Na2MoO4 2H2O | 241,92 | 44,00 | 0,18 |
| MnCl2 4H2O | 197,84 | 180,00 | 0,91 |
| FeCl3 6H2O | 270,21 | 760,00 | 2,81 |
| Sól dwusodowa EDTA, dwuwodna | 372,24 | 1 500,00 | 4,03 |
Tabela 2
Roztwory podstawowe (makroelementy)
| 1. Makroelementy (zatężone 50-krotnie) | g/l |
| Roztwór podstawowy 1: | |
| KNO3 | 17,50 |
| KH2PO4 | 4,5 |
| K2HPO4 | 0,63 |
| Roztwór podstawowy 2: | |
| MgSO4 7H2O | 5,00 |
| Roztwór podstawowy 3: | |
| Ca(NO3)2 4H2O | 14,75 |
Tabela 3
Roztwory podstawowe (mikroelementy)
| 2. Mikroelementy (zatężone 1 000-krotnie) | mg/l |
| Roztwór podstawowy 4: | |
| H3BO3 | 120,0 |
| Roztwór podstawowy 5: | |
| ZnSO4 7H2O | 180,0 |
| Roztwór podstawowy 6: | |
| Na2MoO4 2H2O | 44,0 |
| Roztwór podstawowy 7: | |
| MnCl2 4H2O | 180,0 |
| Roztwór podstawowy 8: | |
| FeCl3 6H2O | 760,00 |
| Sól dwusodowa EDTA, dwuwodna | 1 500,00 |
- Roztwory podstawowe 2 i 3 oraz oddzielnie 4-7 można połączyć z sobą (z uwzględnieniem wymaganych stężeń).
- Aby zapewnić dłuższy okres trwałości roztworów podstawowych, należy poddać je obróbce w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min lub, alternatywnie, przeprowadzić sterylną filtrację (0,2 μm). Dla roztworu podstawowego 8 zdecydowanie zaleca się sterylną filtrację (0,2 μm).
Przygotowanie pożywki STEINBERGA (zmodyfikowanej) o stężeniu końcowym
- Dodać 20 ml roztworów podstawowych 1, 2 i 3 (zob. tabela 2) do około 900 ml wody dejonizowanej, aby uniknąć strącenia.
- Dodać 1,0 ml roztworów podstawowych 4, 5, 6, 7 i 8 (zob. tabela 3).
- pH powinno wynosić 5,5 ± 0,2 (wyregulować przez dodanie ograniczonej do minimum objętości roztworu NaOH lub HCl).
- Uzupełnić wodą do 1 000 ml.
- Jeżeli roztwory podstawowe są wysterylizowane i użyto odpowiedniej wody, dalsza sterylizacja nie jest konieczna. Jeżeli sterylizacji dokonuje się na końcowej pożywce, to roztwór podstawowy 8 należy dodać po obróbce w autoklawie (w temperaturze 121 °C przez 20 min).
Przygotowanie 10-krotnie zatężonej pożywki STEINBERGA (zmodyfikowanej) do średnioterminowego przechowywania
- Dodać 20 ml roztworów podstawowych 1, 2 i 3 (zob. tabela 2) do około 30 ml wody, aby uniknąć strącenia.
- Dodać 1,0 ml roztworów podstawowych 4, 5, 6, 7 i 8 (zob. tabela 3). Uzupełnić wodą do 100 ml.
- Jeżeli roztwory podstawowe są wysterylizowane i użyto odpowiedniej wody, dalsza sterylizacja nie jest konieczna. Jeżeli sterylizacji dokonuje się na końcowej pożywce, to roztwór podstawowy 8 należy dodać po obróbce w autoklawie (w temperaturze 121 °C przez 20 min).
- pH pożywki (końcowe stężenie) powinno wynosić 5,5 ± 0,2.
C.27. BADANIE TOKSYCZNOŚCI W UKŁADZIE OSAD-WODA NA OCHOTKOWATYCH Z WYKORZYSTANIEM WZBOGACONEGO OSADU
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna dotyczącej badań wytycznej OECD nr 218 (2004). Niniejszą metodę zaprojektowano, by ocenić skutki przedłużonego narażenia żyjących w osadach larw Chironomus sp., należących do rzędu słodkowodnych muchówek, na działanie chemikaliów. Metoda opiera się na protokołach badania toksyczności obowiązujących dla Chironomus riparius i Chironomus tentans, które opracowano w Europie (1) (2) (3) i Ameryce Płn. (4) (5) (6) (7) (8) i potwierdzono w badaniu międzylaboratoryjnym (1) (6) (9). Można także wykorzystywać inne dobrze udokumentowane gatunki ochotkowatych, np. Chironomus yoshimatsui (10) (11).
2. Scenariusz narażenia stosowany w tej metodzie badawczej polega na wzbogacaniu osadu substancją badaną. Wybór odpowiedniego scenariusza narażenia zależy od zamierzonego zastosowania badania. Scenariusz polegający na wzbogacaniu osadu ma na celu symulację utrzymywania się w osadzie podwyższonego stężenia chemikaliów. Ten układ narażenia obejmuje wzbogacanie osadu w układzie badawczym osad denny-woda.
3. Substancje, które należy przebadać pod kątem organizmów żyjących w osadach, zwykle pozostają w tym układzie przez długi czas. Organizmy żyjące w osadach mogą być narażane na działanie substancji kilkoma drogami. Względne znaczenie danej drogi narażenia i czas, jaki jest potrzebny, by przyczyniła się ona do ogólnych skutków toksycznych, zależy od fizykochemicznych właściwości danej substancji chemicznej. W przypadku substancji silnie adsorbujących (np. substancji o log Kow > 5) lub w przypadku substancji tworzących wiązanie kowalencyjne z osadami, znaczącą drogą narażenia może być przyjmowanie zanieczyszczonego pokarmu. Aby zapobiec niedoszacowaniu toksyczności wysokolipofilowych substancji, można rozważyć zastosowanie pokarmu dodawanego do osadu przed wprowadzeniem substancji badanej. Aby uwzględnić wszelkie możliwe drogi narażenia, niniejsza metoda badawcza ukierunkowana jest na narażenie długoterminowe. Badanie trwa od 20 do 28 dni w przypadku C. riparius i C. yoshimatsui, a w przypadku C. tentans od 28 do 65 dni. Jeśli do określonego celu potrzebne są dane krótkoterminowe, na przykład w celu zbadania skutków działania substancji niestabilnych, po okresie dziesięciu dni można usunąć dodatkowe replikaty.
4. Mierzone punkty końcowe to całkowita liczba wylęgniętych dorosłych osobników i czas do wylęgu. Jeśli potrzebne są dodatkowe dane krótkoterminowe, zaleca się, by pomiarów przeżycia i wzrostu larw dokonywać po okresie dziesięciu dni, korzystając w stosownych przypadkach z dodatkowych replikatów.
5. Zalecane jest stosowanie osadów preparowanych. Osady preparowane są korzystniejsze od osadów naturalnych z kilku względów:
- zmienność eksperymentalna jest ograniczona, ponieważ osad preparowany stanowi odtwarzalną "zestandaryzowaną matrycę", tak że wyeliminowana zostaje potrzeba znalezienia źródeł niezanieczyszczonego i czystego osadu,
- badania można rozpocząć w każdej chwili, unikając zmienności sezonowej badanego osadu i nie jest konieczna wstępna obróbka osadu w celu usunięcia rodzimej fauny; stosowanie osadu preparowanego zmniejsza także koszty związane ze zbieraniem w terenie dostatecznych ilości osadu na potrzeby rutynowych badań,
- zastosowanie osadu preparowanego umożliwia porównanie toksyczności i stosowną klasyfikację substancji.
6. Definicje są zamieszczone w dodatku 1.
ZASADA METODY BADANIA
7. Larwy ochotkowatych w pierwszym stadium larwalnym poddawane są działaniu badanej substancji chemicznej o różnym stopniu stężenia w układach osad denny-woda. Osad wzbogaca się badaną substancją chemiczną, a następnie larwy w pierwszym stadium larwalnym wprowadza się do zlewek, w których ustabilizowano stężenia badanej substancji w osadzie i wodzie. Na końcu badania mierzy się współczynnik wylęgu i rozwoju ochotkowatych. W miarę potrzeby przeżycie i masa larw mogą być także mierzone po 10 dniach (z wykorzystaniem w stosownych przypadkach dodatkowych replikatów). Dane te analizowane są przy użyciu modelu regresyjnego w celu oszacowania stężenia, które spowodowałoby zmniejszenie wylęgu, przeżycia lub wzrostu larw o x % (np.EC15, EC50 itd.) albo przez badanie hipotezy statystycznej w celu określenia stężenia, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC) lub najniższego stężenia, przy którym obserwuje się szkodliwe zmiany (LOEC). To ostatnie wymaga porównania wartości zmian z wartościami kontrolnymi z użyciem badań statystycznych.
INFORMACJE NA TEMAT SUBSTANCJI BADANEJ
8. Należy znać rozpuszczalność substancji badanej w wodzie, prężność par, podział substancji w osadzie oraz jej stabilność w wodzie i osadzie, uzyskane w wyniku pomiarów lub obliczeń. Powinna być dostępna wiarygodna metoda analityczna do oznaczania ilościowego substancji badanej w osadzie, wodzie porowej i warstwie wody powyżej osadu ze znaną i udokumentowaną dokładnością oraz granicą wykrywalności. Użyteczne informacje obejmują wzór strukturalny i czystość substancji badanej. Do przydatnych informacji należą także dane dotyczące chemicznych losów substancji w środowisku (np. jej rozpraszanie, rozkład abiotyczny i biotyczny itd.). Dalsze wskazówki dotyczące badania substancji o własnościach fizykochemicznych utrudniających ich badanie podano w pozycji (12) w bibliografii.
SUBSTANCJE ODNIESIENIA
9. Substancje odniesienia mogą być okresowo badane dla zagwarantowania, że protokół i warunki badania są rzetelne. Przykłady substancji toksycznych stosowanych z powodzeniem w badaniach międzylaboratoryjnych i walidacyjnych: lindan, trifluralina, pentachlorofenol, chlorek kadmu i chlorek potasu (1) (2) (5) (6) (13).
WAŻNOŚĆ BADANIA
10. Aby badanie było ważne, obowiązują następujące warunki:
- odsetek wylęgniętych osobników dorosłych w próbach kontrolnych musi na końcu badania być co najmniej na poziomie 70 % (1) (6),
- w naczyniach zawierających próby kontrolne wylęg osobników dorosłych C. riparius i C. yoshimatsui z larw powinien nastąpić między 12. a 23. dniem od ich wprowadzenia do naczynia; w przypadku C. tentans niezbędny jest okres od 20 do 65 dni,
- na końcu badania należy zmierzyć wartość pH oraz stężenie rozpuszczonego tlenu w każdym naczyniu. Stężenie tlenu powinno wynosić co najmniej 60 procent wartości nasycenia powietrzem (ASV) w wybranej temperaturze, a wartość pH w warstwie wody powyżej osadu powinna we wszystkich naczyniach używanych do badania znajdować się w przedziale 6-9,
- temperatura wody nie powinna różnić się o więcej niż ± 1,0 °C. Temperaturę wody można kontrolować przy użyciu pomieszczenia izotermicznego i w takim przypadku temperatura pomieszczenia powinna być potwierdzana w stosownych odstępach czasowych.
OPIS METODY
Naczynia używane do badania
11. Badanie prowadzone jest w szklanych zlewkach o pojemności 600 ml i średnicy 8 cm. Inne naczynia także mogą nadawać się do badania, powinny jednak zapewniać odpowiednią głębokość warstwy osadu i warstwy wody powyżej. Powierzchnia osadu powinna być wystarczająca, by zapewnić od 2 do 3 cm2 na larwę. Stosunek głębokości warstwy osadu do warstwy wody powyżej powinien wynosić 1:4. Naczynia do badania i inne przyrządy mające kontakt z układem badawczym powinny być w całości wykonane ze szkła lub innego chemicznie obojętnego materiału (np. teflonu).
Wybór gatunków
12. Gatunkiem wykorzystywanym w badaniu powinien być w miarę możliwości Chironomus riparius. Odpowiedni jest także Chironomus tentans, ale jest trudniejszy w hodowli i wymaga dłuższego okresu badania. Można także korzystać z Chironomus yohimatsui. Szczegóły metod hodowli dla Chironomus riparius podano w dodatku 2. Informacje dotyczące warunków hodowli są także dostępne dla innych gatunków, tj. Chironomus tentans (4) i Chironomus yoshimatsui (11). Przed przeprowadzeniem badania należy potwierdzić identyfikację gatunków, ale nie jest to wymagane przed każdym badaniem, jeśli organizmy pochodzą z hodowli wewnątrzlaboratoryjnej.
Osad
13. W miarę możliwości należy stosować osad preparowany (zwany także osadem regenerowanym, sztucznym lub syntetycznym). Jeśli jednak korzysta się z osadu naturalnego, należy go scharakteryzować (co najmniej pod kątem pH, zawartości węgla organicznego, zaleca się także określenie innych parametrów, takich jak stosunek C/N i granulometria). Osad taki powinien być wolny od zanieczyszczeń i innych organizmów, które mogłyby konkurować z ochotkowatymi lub je zjadać. Zaleca się także, by przed jego wykorzystaniem w badaniu toksyczności dla ochotkowatych naturalny osad był przez siedem dni kondycjonowany w tych samych warunkach, jakie panować będą następnie podczas badania. Do wykorzystania w tym badaniu (1) (15) (16) zaleca się następujący osad preparowany oparty na sztucznej glebie stosowanej w metodzie badawczej C.8 (14):
a) torf 4-5 % (w przeliczeniu na suchą masę): wartość pH możliwie najbardziej zbliżona do przedziału 5,5 do 6,0; ważne jest, by stosować torf w postaci sproszkowanej, drobno zmielony (wielkość cząstek ≤ 1 mm) i suszony wyłącznie powietrzem;
b) glinka kaolinowa 20 % (w przeliczeniu na suchą masę) (zawartość kaolinitu w miarę możliwości powyżej 30 %);
c) piasek kwarcowy 75-76 % (w przeliczeniu na suchą masę) (powinien przeważać drobny piasek, w którym ponad 50 % cząstek mierzy od 50 do 200 μm);
d) dla uzyskania wilgotności końcowej mieszkanki na poziomie od 30-50 % dodaje się wodę dejonizowaną;
e) w celu skorygowania pH końcowej mieszaniny osadu do wartości 7,0 ± 0,5 dodaje się do niej chemicznie czysty węglan wapnia (CaCO3). Zawartość węgla organicznego w końcowej mieszaninie powinna wynosić 2 % (± 0,5 %) i należy ją skorygować przy użyciu odpowiednich ilości torfu i piasku, zgodnie z lit. a) i c).
14. Źródło torfu, glinki kaolinowej i piasku powinno być znane. Składniki osadu należy sprawdzić pod kątem zanieczyszczenia chemicznego (np. metalami ciężkimi, związkami chloroorganicznymi, związkami fosforoorganicznymi itp.). W dodatku 3 podano przykładowy sposób przygotowania osadu preparowanego. Dopuszczalne jest także mieszanie suchych składników, o ile wykaże się, że po dodaniu warstwy wody powyżej osadu składniki osadu się nie rozdzielają (np. nie unoszą się cząstki torfu) oraz że torf lub osad jest poddawany dostatecznemu kondycjonowaniu.
Woda
15. Jako wodę do badania można stosować każdy rodzaj wody, której charakterystyka zgodna jest z charakterystyką chemiczną wody nadającej się do rozcieńczania, jak opisano w dodatkach 2 i 4. Do hodowli ochotkowatych i do badania może służyć każdy odpowiedni rodzaj wody, np. woda naturalna (powierzchniowa lub gruntowa), woda regenerowana (zob. dodatek 2) lub odchlorowana woda wodociągowa, pod warunkiem że ochotkowate przeżyją w niej przez okres hodowli i badania bez wykazywania oznak stresu. Na początku badania wartość pH wody do badania powinna wynosić od 6 do 9, a twardość ogółem wody wyrażona w zawartości CaCO3 nie powinna być wyższa niż 400 mg/l. Jeśli jednak podejrzewa się, że między jonami powodującymi twardość wody a substancją badaną dochodzi do interakcji, powinna być stosowana woda o mniejszej twardości (a zatem w takim przypadku nie wolno używać pożywki Elendta M4). Przez okres całego badania należy stosować ten sam rodzaj wody. Cechy jakości wody, wymienione w dodatku 4, należy mierzyć co najmniej dwa razy w roku lub ilekroć zachodzi podejrzenie, że mogły one ulec znacznej zmianie.
Roztwory podstawowe - osady wzbogacane
16. Wzbogacone osady o wybranym stężeniu substancji badanej są zwykle przygotowywane przez dodanie roztworu tej substancji bezpośrednio do osadu. Roztwór podstawowy substancji badanej rozpuszczonej w dejonizowanej wodzie miesza się z osadem gotowym z użyciem walcarki, mieszalnika lub ręcznie. Jeżeli substancja badana słabo rozpuszcza się w wodzie, można ją rozpuścić w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, w możliwie jak najmniejszej jego ilości (np. w heksanie, acetonie lub chloroformie). Roztwór taki następnie miesza się z drobnym piaskiem kwarcowym, w ilości 10 gramów na jedno naczynie. Rozpuszczalnikowi należy pozwolić wyparować i całkowicie zniknąć z piasku; piasek następnie miesza się z osadem w określonej ilości na każdą zlewkę. Do rozpuszczenia, rozrzedzenia lub zemulsyfikowania substancji badanej mogą być użyte jedynie łatwo ulatniające się czynniki. Należy mieć na uwadze, że przy preparowaniu osadu należy uwzględniać piasek zawarty w mieszance substancji badanej z piaskiem (czyli osad należy przygotować z mniejszej ilości piasku). Należy dopilnować, by substancja badana dodana do osadu została w nim starannie i równo rozprowadzona. W razie konieczności dla określenia jednorodności mieszanki należy zanalizować podpróbki.
PROJEKT BADANIA
17. Projekt badania obejmuje dobór liczby badanych stężeń i ich zróżnicowanie, liczby naczyń zawierających dane stężenie substancji i liczby larw na jedno naczynie. Opisano projekty dotyczące punktowego oszacowania wartości EC, oszacowania wartości NOEC i przeprowadzenia badania granicznego.
Projekt analizy regresyjnej
18. Stężenie powodujące zmiany (np. EC15, EC50) i zakres stężeń, powyżej którego skutki działania substancji badanej stają się przedmiotem zainteresowania, należy wyskalować z zastosowaniem stężeń ujętych w badaniu. Ogólnie, dokładność, a w szczególności ważność naukowa, z jaką można oszacować stężenia powodujące zmiany (ECx), poprawia się, gdy stężenie powodujące zmiany wchodzi w zakres badanych stężeń. Należy unikać ekstrapolowania wyników znacznie poniżej najniższego stężenia dającego wynik dodatni lub powyżej najwyższego stężenia. Wstępne badanie ustalające zakres jest pomocne przy wyborze zakresu stężeń do zastosowania (zob. pkt 27).
19. Jeśli trzeba oszacować ECx, należy zbadać co najmniej pięć stężeń i trzy replikaty dla każdego stężenia. W każdym przypadku zaleca się stosowanie dostatecznych stężeń substancji badanej, aby umożliwić dobre oszacowanie parametrów modelu. Współczynnik odstępów między stężeniami nie powinien być większy niż dwa (z wyjątkiem przypadków, gdy krzywa dawka-odpowiedź ma łagodny przebieg). Liczba replikatów przy każdym podaniu dawki substancji badanej może być zmniejszona, jeśli zwiększy się liczbę stężeń substancji badanej dających różne odpowiedzi. Zwiększenie liczby replikatów lub zmniejszenie wielkości odstępów między badanymi stężeniami zwykle prowadzi do zwężenia przedziałów ufności dla danego badania. Jeśli celem jest oszacowanie przeżycia i wzrostu larw w okresie 10 dni, wymagane są dodatkowe replikaty.
Projekt dotyczący oszacowania NOEC/LOEC
20. Jeśli celem jest oszacowanie wartości LOEC lub NOEC, należy zastosować pięć stężeń substancji badanej z co najmniej czterema replikatami, a współczynnik odstępów między stężeniami nie powinien być większy niż dwa. Liczba replikatów powinna być na tyle duża, by zapewnić odpowiednią moc statystyczną dla wykrycia 20 % różnicy z próbą kontrolną przy istotności wynoszącej 5 % (p = 0,05). W przypadku współczynnika rozwoju zwykle stosowna jest analiza wariancji (ANOVA), np. badanie Dunnetta i badanie Williamsa (17) (18) (19) (20). W przypadku współczynnika wylęgu można stosować test Cochrana-Armitage'a, test dokładny Fishera (z korektą Bonferroniego) lub test Mantela-Haenszela.
Badanie graniczne
21. Jeśli we wstępnym badaniu ustalającym zakres nie zaobserwowano żadnych zmian, można przeprowadzić badanie graniczne (jedno stężenie badane i jedna próba kontrolna). Celem badania granicznego jest przeprowadzenie badania przy dostatecznie wysokim stężeniu substancji badanej, by umożliwić decydentom wykluczenie jej ewentualnych toksycznych skutków, a granicę ustala się na poziomie stężenia, co do którego nie przewiduje się, by mogło kiedykolwiek wystąpić. Zaleca się stężenie 1 000 mg/kg (w przeliczeniu na suchą masę). Zazwyczaj konieczne jest co najmniej 6 replikatów zarówno dla próby poddawanej działaniu substancji, jak i dla próby kontrolnej. Należy wykazać odpowiednią moc statystyczną, która pozwala wykryć 20 % różnicę w porównaniu z próbą kontrolną przy 5 % poziomie istotności (p = 0,05). Przy odpowiedzi metrycznej (współczynnik rozwoju i masa) odpowiednią metodą statystyczną jest test t-Studenta, jeśli dane spełniają warunki tego testu (normalność rozkładu zmiennych, jednorodność wariancji). Jeśli te warunki nie są spełnione, można zastosować test t dla nierównych wariancji lub test nieparametryczny, np. test Manna-Whitney-aWilcoxona. W przypadku współczynnika wylęgu odpowiedni jest test dokładny Fishera.
PROCEDURA
Warunki narażenia na działanie substancji
Przygotowanie układu osad wzbogacony - woda
22. Dla podawania substancji badanej zalecana jest procedura wzbogacania opisana w metodzie badawczej C.8: Toksyczność dla dżdżownic (14). Osad wzbogacony umieszcza się w naczyniach, a następnie dodaje się wodę powyżej osadu, aby uzyskać współczynnik objętości osadu do wody równy 1:4 (zob. pkt 11 i 15). Głębokość warstwy osadu powinna znajdować się w przedziale 1,5-3 cm. Podczas dodawania badanej wody w celu uzyskania słupa wody nad osadem, aby uniknąć oddzielenia składników osadu i ponownego zawieszenia w wodzie drobnoziarnistego materiału, osad na czas zalewania można nakryć plastikowym krążkiem, a krążek następnie od razu usunąć. Właściwe może być także zastosowanie innych przyrządów.
23. Naczynia do badania powinny być przykryte (np. szklanymi płytkami). W razie konieczności w czasie badania poziom wody uzupełnia się do pierwotnej objętości, aby wyrównać jej ubytek spowodowany parowaniem. Należy w tym celu używać wody destylowanej lub dejonizowanej, aby zapobiec odkładaniu się soli.
Stabilizacja
24. Po tym jak zostanie już przygotowany osad wzbogacony z warstwą wody powyżej, należy umożliwić podział substancji badanej między fazą wodną i osadem (3) (4) (6) (13). W miarę możliwości powinno się to odbywać w tych samych warunkach temperatury i napowietrzenia, co panujące w badaniu. Okres ustalania stanu równowagi zależy od osadu i substancji chemicznej, i może być rzędu kilku godzin lub kilku dni, a w rzadkich przypadkach trwać do kilku tygodni (4-5 tygodni). Jako że jest to czas wystarczający dla rozkładu wielu chemikaliów, nie oczekuje się stanu równowagi, ale zaleca się stosowanie 48-godzinnego okresu ustalania równowagi. Na koniec tego dalszego okresu ustalania równowagi należy zmierzyć stężenie substancji badanej w warstwie wody powyżej osadu, wodzie porowej i w osadzie, co najmniej przy najwyższym stężeniu i przy niższym stężeniu (zob. pkt 38). Takie oznaczenia analityczne substancji badanej umożlwiają obliczenie bilansu masy i wyrażenie wyników w oparciu o zmierzone stężenia.
Dodanie organizmów badanych
25. Na cztery do pięciu dni przed umieszczeniem organizmów badanych w naczyniach używanych do badania pakiety jaj należy wyjąć z hodowli i umieścić w małych naczyniach w pożywce hodowlanej. Można w tym celu zastosować pożywkę wykorzystywaną w hodowli podstawowej lub pożywkę świeżo przygotowaną. Jeśli stosowana jest ta ostatnia, do pożywki hodowlanej należy dodać niewielką ilość pokarmu, np. zielenice lub kilka kropel filtratu z drobno zmielonej zawiesiny pokarmu w płatkach dla ryb (zob. dodatek 2). Należy korzystać wyłącznie ze świeżo złożonych pakietów jaj. Wylęg larw zaczyna się przeważnie kilka dni po złożeniu pakietów jaj (2 do 3 dni w przypadku Chironomus riparius w temperaturze 20 °C oraz 1 do 4 dni w przypadku Chironomus tentans w temperaturze 23 °C i Chironomus yoshimatsui w temperaturze 25 °C), a wzrost larw następuje w czterech stadiach larwalnych, przy czym każde z nich trwa od 4 do 8 dni. Do badania należy stosować larwy w pierwszym stadium larwalnym (2-3 lub 1-4 dni po wylęgu). Stadium rozwoju kuczmanów można sprawdzić stosując pomiar szerokości puszki głowowej (6).
26. Dwadzieścia larw w pierwszym stadium larwalnym przydziela się losowo do każdego naczynia doświadczalnego zawierającego osad wzbogacony i wodę przy użyciu tępo zakończonej pipety. Po wprowadzeniu larw do naczyń należy zatrzymać napowietrzanie wody i nie uruchamiać go przez dobę po ich wprowadzeniu (zob. pkt 25 i 32). Zgodnie z zastosowanym projektem badania (zob. pkt 19 i 20) w celu oszacowania punktu EC należy zastosować co najmniej 60 larw na stężenie, a w celu oznaczenia wartości NOEC - 80 larw.
Badane stężenia
27. Badanie ustalające zakres może być przydatne do określenia zakresu stężeń dla ostatecznego badania. W tym celu stosuje się szereg roztworów o znacznie różniących się od siebie stężeniach substancji badanej. Aby zapewnić tę samą gęstość powierzchni na ochotkowate, co stosowana w ostatecznym badaniu, ochotkowate poddaje się narażeniu na każde stężenie substancji badanej przez okres pozwalający oszacować odpowiednie jej stężenie badane i nie wymagane są replikaty.
28. Decyzje dotyczące stężeń substancji badanej w ostatecznym badaniu podejmuje się w oparciu o wynik badania ustalającego zakres. Jak opisano w pkt 18 do 20, należy zastosować i wybrać co najmniej pięć stężeń.
Próby kontrolne
29. Naczynia zawierające próby kontrolne bez substancji badanej, ale zawierające osad, powinny być uwzględnione w badaniu z odpowiednią liczbą replikatów (zob. pkt 19 i 20). Jeśli do wprowadzenia substancji badanej został użyty rozpuszczalnik (zob. pkt 16), należy dodać próbę kontrolną zawierającą osad z rozpuszczalnikiem.
Układ badawczy
30. Stosowane są układy statyczne. W wyjątkowych przypadkach, na przykład gdy określone w specyfikacjach cechy jakości wody staną się nieodpowiednie dla organizmu badanego lub naruszą równowagę chemiczną (np. poziomy rozpuszczonego tlenu spadną zbyt nisko, stężenie produktów wydalniczych za bardzo wzrośnie lub nastąpi uwalnianie minerałów z osadu, które wpłynie na wartość pH lub twardość wody) można stosować układy półstatyczne lub przepływowe z okresowym lub stałym odnawianiem wody powyżej osadu. Inne metody poprawy jakości wody powyżej osadu, np. napowietrzanie, zwykle jednak wystarczają i należy w miarę możliwości z nich korzystać.
Pokarm
31. Larwy trzeba karmić, w miarę możliwości codziennie lub co najmniej trzy razy w tygodniu. Odpowiedni do karmienia młodych larw przez pierwsze 10 dni wydaje się pokarm dla ryb (zawiesina w wodzie lub drobno zmielony pokarm, np. Tetra-Min lub Tetra-Phyll; zob. szczegółowe informacje w dodatku 2) w ilości 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg w przypadku C. yoshimatsui) na larwę dziennie. Starsze larwy mogą potrzebować nieco więcej pokarmu: 0,5-1 mg na larwę na dzień powinno być wystarczającą ilością przez pozostałą część badania. Jeśli obserwuje się wzrost grzybów lub śmiertelność w próbach kontrolnych, należy wówczas we wszystkich próbach kontrolnych i doświadczalnych ograniczyć i kontrolować ilość pokarmu. Jeśli nie można powstrzymać rozwoju grzybów, należy powtórzyć badanie. Przy badaniu substancji silnie adsorbujących (np. o log Kow > 5) lub w przypadku substancji tworzących wiązanie kowalencyjne z osadem, ilość pokarmu niezbędną do zapewnienia przeżycia i naturalnego wzrostu organizmów można dodać do osadu preparowanego przed okresem stabilizacji. W tym celu zamiast pokarmu dla ryb należy stosować surowiec roślinny, np. dodatek 0,5 % (w przeliczeniu na suchą masę) drobno zmielonych liści np. pokrzywy zwyczajnej (Urtica dioica), morwy białej (Morus alba), koniczyny białej (Trifolium repens), szpinaku (Spinacia oleracea), można też użyć innego surowca roślinnego (produktu Cerophyl lub alfa-celulozy).
Warunki inkubacji
32. W miarę możliwości w ciągu 24 godzin od wprowadzenia larw należy zapewnić delikatne napowietrzanie warstwy wody powyżej osadu w naczyniach do badania, a następnie kontynuować je przez cały okres badania (należy dopilnować, by stężenie rozpuszczonego tlenu nie spadło poniżej 60 procent ASV). Napowietrzanie prowadzone jest z użyciem szklanej pipety Pasteura przytwierdzonej 2-3 cm nad warstwą osadu (tj. w ilości jednego lub kilku bąbli powietrza/sek.). Przy badaniu lotnych chemikaliów można rozważyć nienapowietrzanie układu osad-woda.
33. Badanie przeprowadza się w stałej temperaturze 20 °C (± 2 °C). Zalecane temperatury w przypadku C. tentans i C. yoshimatsui to odpowiednio 23 °C i 25 °C (± 2 °C). Stosuje się 16-godzinny fotoperiod, a natężenie światła powinno wynosić od 500 do 1 000 luksów.
Czas trwania narażenia
34. Czas trwania narażenia rozpoczyna się od wprowadzenia larw do naczyń z próbą wzbogaconą i naczyń zawierających próby kontrolne. Maksymalny czas trwania narażenia wynosi 28 dni w przypadku C. riparius i C. yoshimatsui, a w przypadku C. tentans 65 dni. Jeśli kuczmany wylęgną się wcześniej, badanie można zakończyć po co najmniej pięciu dniach od wylęgu ostatniego dorosłego osobnika w próbie kontrolnej.
Obserwacje
Wylęg osobników dorosłych
35. Należy określić czas rozwoju i całkowitą liczbę w pełni wylęgniętych samców i samic kuczmanów. Samce łatwo zidentyfikować dzięki ich pierzastym czułkom.
36. Naczynia do badania należy obserwować co najmniej trzy razy w tygodniu w celu wzrokowej oceny ewentualnego nieprawidłowego zachowania (np. porzucanie osadu, nietypowy sposób pływania) w porównaniu z próbą kontrolną. W okresie spodziewanego wylęgu kuczmanów konieczne jest codzienne ich zliczanie. Płeć i liczbę w pełni wylęgniętych kuczmanów należy zapisywać codziennie. Po identyfikacji kuczmany usuwane są z naczyń. Pakiety jaj złożone przed zakończeniem badania należy odnotować, a następnie usunąć, by zapobiec ponownemu wprowadzeniu larw do osadu. Należy także odnotować liczbę widocznych poczwarek, z których nie wylęgły się kuczmany. Wytyczne dotyczące pomiaru wylęgu zawarte są w dodatku 5.
Wzrost i przeżycie
37. Jeśli mają być dostarczone dane dotyczące 10-dniowego przeżycia i wzrostu larw, należy na początku włączyć do badania dodatkowe naczynia, by mogły być w tym celu wykorzystane. Aby zebrać larwy, osad z tych dodatkowych naczyń należy przesiać, używając sita 250 μm. Kryteriami zgonu są nieruchomość lub brak reakcji na bodziec mechaniczny. Larwy nieodzyskane należy także liczyć jako martwe (larwy, które padły na początku badania, mogły zostać rozłożone przez drobnoustroje). Należy określić suchą masę (bez popiołu) larw pozostałych przy życiu na każde naczynie do badania i obliczyć średnią suchą masę pojedynczej larwy na każde naczynie. Przydatne jest określenie, w którym stadium larwalnym znajdują się larwy pozostałe przy życiu; w tym celu można stosować pomiar puszki głowowej każdego osobnika.
Pomiary analityczne
Stężenie substancji badanej
38. Przed rozpoczęciem badania (np. wprowadzeniem larw) z co najmniej jednego naczynia na każde doświadczenie pobiera się próbki całej objętości osadu w celu dokonania pomiarów analitycznych stężenia substancji badanej w osadzie. Zaleca się, by na początku i na końcu badania przeanalizować co najmniej próbki wody z warstwy powyżej osadu, wody porowej i osadu (zob. pkt 24), przy najwyższym stężeniu i przy niższym stężeniu. Takie oznaczenie stężenia substancji badanej daje wiedzę na temat zachowania/podziału substancji badanej w układzie woda-osad.
39. Gdy dokonuje się pomiarów pośrednich (np. w 7. dniu) lub jeśli do analizy potrzeba dużych próbek, których nie można pobrać z naczyń do badania bez wpływania na układ badawczy, należy dokonać oznaczeń analitycznych na próbkach pochodzących z dodatkowych naczyń do badania przygotowanych w ten sam sposób (zawierających także organizmy badane), ale niewykorzystywanych do obserwacji biologicznych.
40. Aby oddzielić wodę porową, zaleca się odwirowanie osadu przy 10 000 g w temp. 4 °C przez 30 min. Jeśli jednak substancja badana nie adsorbuje się na filtrze, dopuszczalna jest też filtracja. W niektórych przypadkach zanalizowanie stężeń w wodzie porowej może nie być możliwe, ponieważ wielkość próbki jest zbyt mała.
Parametry fizykochemiczne
41. Wartość pH i temperatura w naczyniach do badania powinny być odpowiednio mierzone (zob. pkt 10). Twardość i zawartość amoniaku należy zmierzyć w próbach kontrolnych i w jednym naczyniu do badania przy najwyższym stężeniu na początku i na końcu badania.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Opracowanie wyników
42. Celem badania jest określenie wpływu substancji badanej na współczynnik rozwoju i całkowitą liczbę w pełni wylęgniętych samic i samców kuczmanów lub, w przypadku badań 10-dniowych, skutków dla przeżycia i masy larw. Jeśli nie ma wskazań dotyczących statystycznie istotnych różnic we wrażliwości osobników każdej płci, wyniki dotyczące osobników męskich i żeńskich mogą zostać połączone do celów analizy statystycznej. Różnice we wrażliwości między płciami można oszacować statystycznie z wykorzystaniem np. tablicy rozkładu chi-kwadrat χ2-r × 2. W razie konieczności przeżycie larw i średnią suchą masę larwy na naczynie należy określić po 10 dniach.
43. Wartości stężeń powodujące zmiany, wyrażone w suchej masie, należy obliczyć w miarę możliwości w oparciu o zmierzone stężenia substancji w osadzie na początku badania (zob. pkt 38).
44. Aby obliczyć oszacowanie punktowe dla EC50 i innych ECx, jako prawdziwe replikaty można wykorzystywać dane statystyczne dotyczące poszczególnych naczyń. Przy wyliczaniu przedziału ufności dla ECx należy uwzględnić zmienność między naczyniami lub należy wykazać, że zmienność ta jest tak niewielka, że można ją pominąć. Jeżeli model został dopasowany przy użyciu metody najmniejszych kwadratów, do danych statystycznych dotyczących poszczególnych naczyń należy zastosować przekształcenie, aby poprawić jednorodność wariancji. Wartości ECx należy jednak liczyć po przekształceniu odpowiedzi z powrotem do wartości pierwotnej.
45. W przypadku gdy analiza statystyczna ma na celu określenie wartości NOEC/LOEC przez zastosowanie badania hipotezy statystycznej, należy wziąć pod uwagę zmienność między naczyniami, np. przez zastosowanie zagnieżdżonej analizy wariancji. Ewentualnie w przypadkach, w których występują naruszenia zwykłych założeń analizy wariancji, odpowiednie mogą być bardziej odporne testy (21).
Współczynnik wylęgu
46. W przypadku gdy oczekuje się monotonicznej zależności dawka-odpowiedź, a dane te są spójne z tym oczekiwaniem, współczynniki wylęgu, które są danymi dwuwartościowymi, można zanalizować z użyciem testu Cochrana-Armitage'a stosowanego na zasadzie krokowej wstecznej. W innym przypadku można zastosować test dokładny Fishera lub test Mantela-Haenszela z granicznym poziomem istotności skorygowanym metodą Bonferroniego-Holma. Jeśli są dowody na większą zmienność między replikatami w ramach tego samego stężenia, niż wskazywałby na to rozkład dwumianowy (co określa się często jako zmienność większą niż zmienność w rozkładzie dwumianowym), wówczas należy zastosować odporny test Cochrana-Armitage'a lub test dokładny Fishera, tak jak proponuje się w pozycji (21) w bibliografii.
Suma kuczmanów wylęgniętych na każde naczynie, ne, jest określana i dzielona przez liczbę wprowadzonych larw, na:
gdzie:
ER = współczynnik wylęgu,
ne = liczba wylęgniętych kuczmanów na każde naczynie,
na = liczba wprowadzonych larw na każde naczynie.
47. Najwłaściwszą alternatywą w przypadku dużych próbek, w których występuje wariancja większa niż wariancja w rozkładzie dwumianowym, jest traktowanie współczynnika wylęgu jako zmiennej ciągłej i stosowanie takich procedur jak test Williama, gdy oczekuje się monotonicznej zależności dawka-odpowiedź i oczekiwanie to jest zgodne z danymi dotyczącymi współczynnika wylęgu. Jeśli założenie dotyczące monotoniczności nie jest spełnione, odpowiedni byłby test Dunnetta. Uznaje się, że próbka jest duża, gdy zarówno liczba wylęgniętych kuczmanów, jak i liczba larw, z których one nie powstały, przekracza pięć na każde naczynie stanowiące replikat.
48. Aby zastosować metody analizy wariancji, wartości współczynnika wylęgu należy najpierw przekształcić, stosując przekształcenie pierwiastkowe i arcsin lub przekształcenie Freemana-Tukeya w celu otrzymania przybliżonego normalnego rozkładu i wyrównania wariancji. Przy użyciu częstości bezwzględnej można zastosować test Cochrana-Armitage'a, test dokładny Fishera (z korektą Bonferroniego) lub test Mantela-Haenszela. Przekształcenie pierwiastkowe i arcsin stosuje się przez wyznaczenie funkcji odwrotnej względem sinusa (sin-1) pierwiastka współczynnika wylęgu.
49. W przypadku współczynników wylęgu wartości ECx oblicza się, stosując analizę regresji (lub np. analizę probitową (22), logitową, analizę Weibulla, odpowiednie oprogramowanie komercyjne itd.). Jeśli analiza regresji zawodzi (np. w przypadku gdy występują mniej niż dwie częściowe odpowiedzi), stosuje się inne metody nieparametryczne, takie jak średnia krocząca lub prosta interpolacja.
Współczynnik rozwoju
50. Średnia czasu rozwoju to średni czas od wprowadzenia larw (dzień 0 badania) do wylęgu kuczmanów tworzących kohortę badaną (w celu policzenia rzeczywistego czasu rozwoju należy uwzględnić wiek larw w chwili wprowadzenia). Współczynnik rozwoju stanowi odwrotność czasu rozwoju (jednostka: 1/dzień) i przedstawia tę część rozwoju larwy, która następuje każdego dnia. Do celów oceny omawianych badań dotyczących toksyczności w osadzie preferowany jest współczynnik rozwoju, jako że jego wariancja jest mniejsza, jest bardziej jednorodny i bliższy normalnemu rozkładowi w porównaniu z czasem rozwoju. Dlatego silne metody parametryczne badania stosować można raczej w odniesieniu do współczynnika rozwoju niż do czasu rozwoju. Dla współczynnika rozwoju jako odpowiedzi ciągłej można szacować wartości ECx, stosując analizę regresji (zob. np. (23) (24)).
51. Do celów poniższych badań statystycznych przyjmuje się, że liczba kuczmanów zaobserwowanych w dniu kontroli x wylęgła się w średniej arytmetycznej odstępu czasu między dniem x a dniem x-1 (1 = długość odstępu czasowego między kontrolami, zwykle 1 dzień). Średnia arytmetyczna współczynnika rozwoju na każde naczynie (x) liczona jest według następującego wzoru:
gdzie:
: średnia arytmetyczna współczynnika rozwoju na każde naczynie,
i: wskaźnik odstępu czasowego między kontrolami,
m: maksymalna liczba odstępów czasowych między kontrolami,
ƒi: liczba kuczmanów wylęgniętych w odstępie czasowym między kontrolami i,
ne: całkowita liczba kuczmanów wylęgniętych na koniec doświadczenia, (= Σ ƒi)
xi: współczynnik rozwoju kuczmanów wylęgniętych w odstępie czasowym między kontrolami i,
gdzie:
dayi: dzień kontroli (dni od wprowadzenia),
li: długość odstępu czasowego między kontrolami i (w dniach, zwykle 1 dzień).
Sprawozdanie z badania
52. Sprawozdanie z badania musi zawierać co najmniej następujące informacje:
Substancja badana
- cechy fizyczne i w stosownych przypadkach właściwości fizykochemiczne (rozpuszczalność w wodzie, prężność par, współczynnik podziału w glebie (lub w osadzie, jeśli jest dostępny), stabilność w wodzie itd.),
- dane identyfikacyjne substancji chemicznej (nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna, numer CAS, wzór strukturalny) w tym czystość i metoda analityczna oznaczania ilościowego substancji badanej.
Badany gatunek
- zwierzęta wykorzystane w badaniu: gatunek, nazwa naukowa, źródło organizmów i warunki hodowli,
- informacje dotyczące postępowania z pakietami jaj i larwami,
- wiek zwierząt badanych w chwili umieszczenia w naczyniu do badania.
Warunki badania
- użyty osad, tj. osad naturalny lub preparowany,
- w przypadku osadu naturalnego - lokalizacja i opis miejsca pobrania próbki osadu, w tym, jeśli to możliwe, historia zanieczyszczenia; charakterystyka: pH, zawartość węgla organicznego, stosunek C/N i granulometria (w stosownych przypadkach),
- przygotowanie osadu preparowanego: składniki i charakterystyka (zawartość węgla organicznego, pH, wilgotność itd. na początku badania),
- przygotowanie wody do badania (jeśli stosowana jest woda regenerowana) i jej charakterystyka (stężenie tlenu, pH, przewodność właściwa, twardość itd. na początku badania),
- głębokość warstwy osadu i warstwy wody powyżej,
- objętość warstwy wody powyżej osadu i wody porowej; masa mokrego osadu z wodą porową i bez niej,
- naczynia do badania (materiał i wielkość),
- metoda wzbogacania osadu: użyte stężenia badane, liczba replikatów i użyty rozpuszczalnik, jeśli go zastosowano,
- faza stabilizacji i równowagi układu wzbogacony osad-woda: czas trwania i warunki,
- warunki inkubacji: temperatura, cykl i natężenie oświetlenia, napowietrzanie (częstotliwość i natężenie),
- szczegółowe informacje o żywieniu, w tym rodzaj pokarmu, przygotowanie, schemat żywienia i ilość pokarmu.
Wyniki
- nominalne stężenia badane, zmierzone stężenia badane i wyniki wszystkich analiz ustalających stężenia substancji badanej w naczyniach do badań,
- jakość wody w naczyniach do badania, tj. pH, temperatura, rozpuszczony tlen, twardość i zawartość amoniaku,
- uzupełnienie wyparowanej wody do badania, jeśli nastąpiło,
- liczbę wylęgniętych męskich i żeńskich kuczmanów na każde naczynie na każdy dzień,
- liczba larw, z których nie nie wylęgły się kuczmany, na każde naczynie,
- w stosownych przypadkach, średnia sucha masa larw na każde naczynie do badania i na każde stadium larwalne,
- odsetek wylęgniętych kuczmanów na każdy replikat i na każde stężenie substancji badanej (samice i samce kuczmanów łącznie),
- średni współczynnik rozwoju w pełni wylęgniętych kuczmanów na każdy replikat i współczynnik poddania działaniu substancji badanej (samice i samce kuczmanów łącznie),
- oszacowania toksycznych punktów końcowych, np. ECx (i powiązane przedziały ufności), wartość stężenia, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC), lub najniższe stężenie, przy którym obserwuje się szkodliwe zmiany (LOEC) oraz metody statystyczne użyte w celu ich określenia,
- omówienie wyników, w tym ewentualny wpływ na wynik badania będący skutkiem odstępstw od niniejszej metody badawczej.
BIBLIOGRAFIA:
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. M. Streloke i H. Köpp (red.). Berlin 1995.
(2) Fleming R i in. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Sprawozdanie końcowe dla Komisji Europejskiej. Nr sprawozdania: EC 3738. Sierpień 1994. WRc, Zjednoczone Królestwo.
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments. Materiały z warsztatów WOSTA zorganizowanych w Niderlandach.
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Conta-minants with Freshwater Invertebrates. pp 1125-1241. W: ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Tom 11.05. Biological Effects and Environmental Fate;Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Sprawozdanie SPE 1/RM/32. Grudzień 1997.
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Wyd. drugie. EPA 600/R-99/064. Marzec 2000. Zmiana wydania pierwszego z czerwca 1994 r.
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
(9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, and Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada's biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada.
(10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.
(11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57.
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 23.
(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Sprawozdanie EPS 1/RM/30. Wrzesień 1995 r.
(14) Metoda badawcza C.8 z niniejszego załącznika: Toksyczność dla dżdżownic.
(15) Suedel BC and JH Rodgers (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175.
(16) Naylor C and C Rodrigues (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
(17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121.
(18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20: 482-491.
(19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.
(20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.
(21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585.
(22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.
(23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494.
(24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312.
Dodatek 1
DEFINICJE
Dla celów niniejszej metody badawczej stosowane są następujące definicje:
Osad preparowany lub regenerowany, sztuczny lub syntetyczny, stanowi mieszaninę materiałów używaną do naśladowania składników fizycznych naturalnego osadu.
Warstwa wody powyżej osadu to woda, którą zalano osad w naczyniu do badania.
Woda porowa to woda wypełniająca przestrzeń między cząstkami osadu i gleby.
Osad wzbogacony to osad, do którego dodano substancję badaną.
Badana substancja chemiczna: każda substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.
Dodatek 2
Zalecenia dotyczące hodowli Chironomus riparius
1. Larwy ochotki (Chironomus) można hodować w naczyniach krystalizacyjnych lub większych zbiornikach. Na dnie zbiornika rozprowadza się drobny piasek kwarcowy, tworząc cienką warstwę grubości od 5 do 10 mm. Odpowiednim substratem okazała się także ziemia okrzemkowa (np. Merck, Art 8117), w przypadku której wystarczająca jest cieńsza warstwa grubości najwyżej kilku milimetrów. Następnie dodaje się odpowiednią wodę na głębokość kilku centymetrów. Poziomy wody należy uzupełniać, aby wyrównać stratę spowodowaną parowaniem i zapobiec wysychaniu. Wodę w razie konieczności można zastępować. Należy zapewnić delikatne napowietrzanie. Naczynia do chowu larw należy przechowywać w odpowiedniej klatce, aby zapobiec ucieczce wylęgniętych osobników dorosłych. Klatka powinna być na tyle duża, by umożliwić rojenie wylęgniętych osobników dorosłych, inaczej może nie dojść do kopulacji (co najmniej ok. 30 × 30 × 30 cm).
2. Klatki powinny być trzymane w temperaturze pokojowej lub w pomieszczeniu o stałych warunkach środowiska w temperaturze 20 ± 2 °C z fotoperiodem wynoszącym 16 godzin światła (o natężeniu ok. 1 000 luksów) i 8 godzin ciemności. Odnotowywano, że wilgotność powietrza mniejsza niż 60 % RH może przeszkodzić rozmnażaniu.
Woda do rozcieńczania
3. Można stosować każdy rodzaj wody naturalnej lub syntetycznej. Powszechnie stosowana jest woda gruntowa, odchlorowana woda wodociągowa i sztuczne pożywki (np. pożywka Elendta "M4" lub "M7", zob. także poniżej). Woda przed użyciem powinna być napowietrzona. W miarę potrzeby woda do hodowli może być odnawiana przez ostrożne odlewanie lub wypłukiwanie zużytej wody z naczyń hodowlanych bez niszczenia oprzędów larw.
Karmienie larw
4. Larwy Chironomus należy karmić pokarmem w płatkach dla ryb (Tetra Min®, Tetra Phyll® lub innej marki pokarmem dla ryb) w ilości ok. 250 mg na każde naczynie na dzień. Można go podawać w postaci suchego mielonego proszku lub jako zawiesinę w wodzie: 1 g pokarmu w płatkach dodaje się do 20 ml wody do rozcieńczenia i rozdrabnia się do uzyskania jednorodnej mieszanki. Preparat ten można stosować jako pokarm w ilości ok. 5 ml na każde naczynie na dzień (przed użyciem wstrząsnąć). Starsze larwy mogą dostawać go więcej.
5. Żywienie dostosowuje się do jakości wody. Jeśli pożywka do hodowli staje się mętna, należy ograniczyć karmienie. Podawanie pokarmu należy starannie monitorować. Zbyt mała ilość pożywienia spowoduje migrację larw w kierunku słupa wody, a zbyt duża wywoła zwiększoną aktywność drobnoustrojów i zmniejszone stężenie tlenu. Oba rodzaje warunków mogą spowodować ograniczenie współczynnika wzrostu.
6. Przy przygotowywaniu nowych naczyń do hodowli można też dodać komórki niektórych gatunków zielenic (np. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris).
Karmienie wylęgniętych osobników dorosłych
7. Niektórzy badacze sugerują, by do karmienia wylęgniętych osobników dorosłych używać tamponu z wełny bawełnianej nasączonego nasyconym roztworem sacharozy.
Wylęg osobników dorosłych
8. Przy temperaturze 20 ± 2 °C po ok. 13-15 dniach w naczyniach do hodowli z larw wylęgną się osobniki dorosłe. Samce łatwo zidentyfikować dzięki pierzastym czułkom.
Pakiety jaj
9. Po tym, jak osobniki dorosłe pojawią się w klatce hodowlanej, należy trzy razy w tygodniu sprawdzać we wszystkich naczyniach do chowu larw, czy nie zostały złożone galaretowate pakiety jaj. Jeśli tak, należy je ostrożnie usunąć, a następnie przenieść do niewielkiego naczynia zawierającego próbkę wody używanej do hodowli. Pakiety jaj wykorzystuje się do zapoczątkowania hodowli w nowym naczyniu (np. od 2 do 4 pakietów jaj na naczynie) lub do badań toksyczności.
10. Larwy w pierwszym stadium larwalnym powinny wylęgnąć się po 2-3 dniach.
Przygotowanie hodowli w nowych naczyniach
11. Po tym, jak hodowle zostaną założone, powinno być możliwe przygotowanie nowej hodowli larw w świeżym naczyniu raz na tydzień lub rzadziej, w zależności od wymogów badania, przy czym starsze naczynia, po wylęgnięciu się w nich dorosłych kuczmanów, usuwa się. Stosując ten układ, uzyskuje się stałą podaż dorosłych osobników przy zminimalizowaniu zarządzania.
Przygotowanie roztworów testowych "M4" i "M7"
12. Pożywka "M4" została opisana przez Elendta (1990). Pożywkę "M7" przygotowuje się jak pożywkę "M4", z wyjątkiem substancji wskazanych w tabeli 1, których stężenie w "M7" jest czterokrotnie mniejsze niż w "M4". Publikacja na temat pożywki "M7" znajduje się w przygotowaniu (Elendt, informacje własne). Roztwór testowy nie powinien być przygotowywany zgodnie z instrukcjami Elendta i Biasa (1990), ponieważ stężenia NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 oraz K2HPO4 podane dla przygotowania roztworów podstawowych nie są odpowiednie.
Przygotowanie pożywki "M7"
13. Każdy roztwór podstawowy (I) przygotowuje się oddzielnie, a z roztworów podstawowych (I) przygotowuje się łączony roztwór podstawowy (II) (zob. tabela 1). Pięćdziesiąt ml łączonego roztworu podstawowego (II) oraz podane w tabeli 2 ilości każdego roztworu podstawowego makroskładnika odżywczego dopełnia się do 1 litra wodą dejonizowaną, aby przygotować pożywkę "M7". Roztwór podstawowy witamin przygotowuje się przez dodanie trzech witamin do wody dejonizowanej, jak wskazano w tabeli 3. Do końcowej pożywki "M7" na krótko przed użyciem dodaje się 0,1 ml łączonego roztworu podstawowego witamin (roztwór podstawowy witamin przechowuje się zamrożony w małych podwielokrotnościach.) Pożywka jest napowietrzana i stabilizowana.
BIBLIOGRAFIA
BBA (1995 ). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. Edited by M. Streloke and H. Köpp. Berlin 1995.
Tabela 1
Roztwory podstawowe pierwiastków śladowych dla pożywek M4 i M7
| Roztwory podstawowe (I) | Ilość (mg) dopełniana do 1 litra wodą dejonizowaną | W celu przygotowania łączonego roztworu podstawowego (II): zmieszać następujące ilości (ml) roztworów podstawowych (I) i dopełnić do 1 litra wodą dejonizowaną | Końcowe stężenia w roztworach testowych (mg/l) | ||
| M4 | M7 | M4 | M7 | ||
| H3BO3(1) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 |
| MnCl2 4 H2O(1) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 |
| LiCl(1) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 |
| RbCl(1) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 |
| SrCl2 6 H2O(1) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 |
| NaBr(1) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 |
| Na2MoO4 2 H2O(1) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 |
| CuCl2 2 H2O(1) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 |
| ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 |
| CaCl2 6 H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 |
| KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 |
| Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 |
| NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 |
| Na2EDTA 2 H2O(1)(2) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 |
| FeSO4 7 H2O(1)(2) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 |
| (1) Te substancje różnią się w przypadku M4 i M7, jak określono wyżej. (2) Roztwory te są przygotowywane oddzielnie, następnie zlewane razem i niezwłocznie autoklawowane. |
Tabela 2
Roztwory podstawowe makroskładników odżywczych w przypadku pożywek M4 i M7
| Ilość (mg) dopełniana do 1 litra wodą dejonizowaną | Ilość (ml/l) roztworów podstawowych makroskładników odżywczych w celu przygotowania pożywek M4 i M7 | Końcowe stężenia (mg/l) w roztworach testowych pożywek M4 i M7 | |
| CaCl2 2 H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 |
| MgSO4 7 H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 |
| KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 |
| NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 |
| NaSiO3 9 H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 |
| NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 |
| KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 |
| K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 |
Tabela 3
Roztwór podstawowy witamin dla pożywek M4 i M7. Wszystkie trzy roztwory witamin łączy się, by otrzymać jeden roztwór podstawowy witamin
| Ilość (mg) dopełniana do 1 litra wodą dejonizowaną (mg) | Ilość (ml/l) roztworu podstawowego witamin dodawanego w celu przygotowania pożywek M4 i M7 | Końcowe stężenia (mg/l) w roztworach testowych pożywek M4 i M7 | |
| Hydrochlorek tiaminy | 750 | 0,1 | 0,075 |
| Cyjanokobalamina (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 |
| Biotyna | 7,5 | 0,1 | 0,00075 |
BIBLIOGRAFIA
Elendt, B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33.
Elendt, B.P. i W.-R. Bias (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167.
Dodatek 3
PRZYGOTOWANIE OSADU PREPAROWANEGO
Skład osadu
Skład osadu preparowanego powinien być następujący:
| Składnik | Właściwości | % suchej masy osadu |
| Torf | Torf z rozkładu mchu torfowca (Sphagnum), w miarę możliwości o wartości pH równej 5,5-6,0, bez widocznych pozostałości roślin, drobno zmielony (wielkość cząstek ≤ 1 mm), suszony powietrzem | 4-5 |
| Piasek kwarcowy | Wielkość ziaren: > 50 % cząstek powinna mieścić się w przedziale 50-200 μ m. | 75-76 |
| Glinka kaolinowa | Zawartość kaolinitu ≥ 30 % | 20 |
| Węgiel organiczny | Skorygowana przez dodanie torfu i piasku | 2 (± 0,5) |
| Węglan wapnia | CaCO3, sproszkowany, chemicznie czysty | 0,05-0,1 |
| Woda | Przewodność właściwa ≤ 10 μS/cm | 30-50 |
Przygotowanie
Torf suszy się powietrzem i mieli na drobny proszek. Zawiesinę wymaganej ilości proszku torfowego w wodzie dejonizowanej przygotowuje się z użyciem wysokosprawnego urządzenia do homogenizacji. Wartość pH zawiesiny koryguje się z użyciem CaCO3 do poziomu 5,5 ± 0,5. W celu ustabilizowania pH i komponentu mikrobiologicznego zawiesinę kondycjonuje się przez co najmniej dwa dni w temperaturze 20 ± 2 °C, delikatnie ją mieszając. Ponownie mierzy się pH, którego wartość powinna wynosić 6,0 ± 0,5. Następnie zawiesinę torfową miesza się z innymi składnikami (piaskiem i glinką kaolinową) oraz wodą dejonizowaną, aby otrzymać jednorodny osad z zawartością wody w przedziale 30-50 procent suchej masy osadu. Wartość pH końcowej mieszaniny ponownie mierzy się i koryguje w miarę potrzeby za pomocą CaCO3 do poziomu 6,5 do 7,5. Próbki osadu pobiera się, aby określić suchą masę i zawartość węgla organicznego. Następnie przed ich wykorzystaniem w badaniu toksyczności dla ochotkowatych zaleca się, by osad preparowany kondycjonować przez siedem dni w tych samych warunkach, jakie panować będą następnie podczas badania.
Przechowywanie
Suche składniki do przygotowywania osadu sztucznego mogą być przechowywane w suchym i chłodnym miejscu w temperaturze pokojowej. Nie powinno się przechowywać (mokrego) osadu preparowanego przed jego użyciem w badaniu. Osad należy wykorzystać natychmiast po 7-dniowym okresie kondycjonowania, kończącym proces jego przygotowania.
BIBLIOGRAFIA
Rozdział C.8 niniejszego załącznika. Toksyczność dla dżdżownic.
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20.
Dodatek 4
Właściwości chemiczne dopuszczalnej wody do rozcieńczania
| Substancja | Stężenia |
| Cząstki stałe | < 20 mg/l |
| Całkowity węgiel organiczny | < 2 mg/l |
| Niezjonizowany amoniak | < 1 μg/l |
| Twardość w przeliczeniu na CaCO3 | < 400 mg/l(*) |
| Chlor resztkowy | < 10 μg/l |
| Całkowita zawartość pestycydów fosforoorganicznych | < 50 ng/l |
| Całkowita zawartość pestycydów chloroorganicznych plus polichlorowanych bifenyli | < 50 ng/l |
| Całkowity chlor organiczny | < 25 ng/l |
| (*) Należy jednak pamiętać, że jeżeli podejrzewa się interakcję między jonami powodującymi twardość wody a substancją badaną, powinna być stosowana woda o mniejszej twardości (a zatem w takim przypadku nie wolno używać pożywki Elendta M4). |
Dodatek 5
Wytyczne dotyczące monitorowania wylęgu larw ochotkowatych
Na szklanych zlewkach do badania umieszczono pułapki na wylęgnięte kuczmany. Pułapki te potrzebne są od 20 dnia badania do zakończenia badania. Poniżej przedstawiono rysunek przedstawiający przykładową pułapkę:
C.28. BADANIE TOKSYCZNOŚCI W UKŁADZIE OSAD-WODA NA OCHOTKOWATYCH Z WYKORZYSTANIEM WZBOGACONEJ WODY
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD nr 219 (OECD TG 219) (2004). Niniejszą metodę badawczą zaprojektowano, by ocenić skutki przedłużonego narażenia na działanie chemikaliów na żyjących w osadach larw Chironomus sp., należących do rzędu słodkowodnych muchówek. Jest ona oparta głównie na wytycznych BBA dotyczących układu badawczego osad-woda z użyciem sztucznej gleby oraz na scenariuszu narażenia w słupie wody (1). Uwzględnia się w niej również protokoły badania toksyczności obowiązujące dla Chironomus riparius i Chironomus tentans, które opracowano w Europie i Ameryce Płn. (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) i potwierdzono w badaniu międzylaboratoryjnym (1) (6) (9). Można także wykorzystywać inne dobrze udokumentowane gatunki ochotkowatych, np. Chironomus yoshimatsui (10) (11).
2. Scenariusz narażenia stosowany w tej metodzie badawczej polega na wzbogacaniu wody substancją badaną. Wybór odpowiedniego scenariusza narażenia zależy od zamierzonego zastosowania badania. Scenariusz narażenia w wodzie, polegający na wzbogacaniu słupa wody, służy do symulowania znoszenia cieczy roboczej w przypadku pestycydów i obejmuje początkowy szczyt stężenia w wodzie porowej. Jest on również przydatny w odniesieniu do innych rodzajów narażenia (w tym wycieków chemicznych), z wyjątkiem procesów akumulacji trwających dłużej niż okres badania.
3. Substancje, które należy przebadać pod kątem organizmów żyjących w osadach, zwykle pozostają w tym układzie przez długi czas. Organizmy żyjące w osadach mogą być narażane na działanie substancji kilkoma drogami. Względne znaczenie danej drogi narażenia i czas, jaki jest potrzebny, by przyczyniła się ona do ogólnych skutków toksycznych, zależy od fizykochemicznych właściwości danej substancji chemicznej. W przypadku substancji silnie adsorbujących (np. substancji o log Kow > 5) lub w przypadku substancji tworzących wiązanie kowalencyjne z osadami znaczącą drogą narażenia może być przyjmowanie zanieczyszczonego pokarmu. Aby zapobiec niedoszacowaniu toksyczności wysokolipofilowych substancji, można rozważyć zastosowanie pokarmu dodawanego do osadu przed wprowadzeniem substancji badanej. Aby uwzględnić wszelkie możliwe drogi narażenia, niniejsza metoda badawcza ukierunkowana jest na narażenie długoterminowe. Badanie trwa od 20 do 28 dni w przypadku C. riparius i C. yoshimatsui, a w przypadku C. tentans od 28 do 65 dni. Jeśli do określonego celu potrzebne są dane krótkoterminowe, na przykład w celu zbadania skutków działania substancji niestabilnych, po okresie dziesięciu dni można usunąć dodatkowe replikaty.
4. Mierzone punkty końcowe to całkowita liczba wylęgniętych dorosłych osobników i czas do wylęgu. Jeśli potrzebne są dodatkowe dane krótkoterminowe, zaleca się, by pomiarów przeżycia i wzrostu larw dokonywać po okresie dziesięciu dni, korzystając w stosownych przypadkach z dodatkowych replikatów.
5. Zalecane jest stosowanie osadów preparowanych. Osady preparowane są korzystniejsze od osadów naturalnych z kilku względów:
- zmienność eksperymentalna jest ograniczona, ponieważ osad preparowany stanowi odtwarzalną "zestandaryzowaną matrycę", tak że wyeliminowana zostaje potrzeba znalezienia źródeł niezanieczyszczonego i czystego osadu,
- badania można rozpocząć w każdej chwili, unikając zmienności sezonowej badanego osadu, i nie jest konieczna wstępna obróbka osadu w celu usunięcia rodzimej fauny; stosowanie osadu preparowanego zmniejsza także koszty związane ze zbieraniem w terenie dostatecznych ilości osadu na potrzeby rutynowych badań,
- zastosowanie osadu preparowanego umożliwia porównanie toksyczności i stosowną klasyfikację substancji: dane dotyczące toksyczności pochodzące z badań z osadami naturalnymi i sztucznymi były porównywalne dla kilku substancji chemicznych (2).
6. Definicje są zamieszczone w dodatku 1.
ZASADA BADANIA
7. Larwy ochotkowatych w pierwszym stadium larwalnym poddawane są działaniu substancji badanej w różnych stężeniach w układach osad-woda. Badanie rozpoczyna się od umieszczenia larw w pierwszym stadium larwalnym w zlewkach do badania zawierających układ osad-woda, a następnie wzbogaca się wodę w substancję badaną. Na końcu badania mierzy się współczynnik wylęgu i rozwoju ochotkowatych. W miarę potrzeby przeżycie i masa larw mogą być także mierzone po 10 dniach (z wykorzystaniem w stosownych przypadkach dodatkowych replikatów). Dane te analizowane są przy użyciu modelu regresji w celu oszacowania stężenia, które spowodowałoby zmniejszenie wylęgu, przeżycia lub wzrostu larw o x % (np. EC15, EC50 itd.) albo przez testowanie hipotez statystycznych w celu określenia stężenia, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC), lub najniższego stężenia, przy którym obserwuje się szkodliwe zmiany (LOEC). To ostatnie wymaga porównania wartości zmian z wartościami kontrolnymi z użyciem badań statystycznych.
INFORMACJE NA TEMAT SUBSTANCJI BADANEJ
8. Należy znać rozpuszczalność substancji badanej w wodzie, prężność par, podział substancji w osadzie oraz jej stabilność w wodzie i osadzie, uzyskane w wyniku pomiarów lub obliczeń. Powinna być dostępna wiarygodna metoda analityczna do oznaczania ilościowego substancji badanej w osadzie, wodzie porowej i warstwie wody powyżej osadu ze znaną i udokumentowaną dokładnością oraz granicą wykrywalności. Użyteczne informacje obejmują wzór strukturalny i czystość substancji badanej. Do przydatnych informacji należą także dane dotyczące chemicznych losów substancji w środowisku (np. jej rozpraszanie, rozkład abiotyczny i biotyczny itd.). Dalsze wskazówki dotyczące badania substancji o własnościach fizykochemicznych utrudniających ich badanie podano w pozycji (12) w bibliografii.
SUBSTANCJE ODNIESIENIA
9. Substancje odniesienia mogą być okresowo badane dla zagwarantowania, że protokół i warunki badania są rzetelne. Przykłady substancji toksycznych stosowanych z powodzeniem w badaniach międzylaboratoryjnych i walidacyjnych: lindan, trifluralina, pentachlorofenol, chlorek kadmu i chlorek potasu (1) (2) (5) (6) (13).
WAŻNOŚĆ BADANIA
10. Aby badanie było ważne, obowiązują następujące warunki:
- odsetek wylęgniętych osobników dorosłych w próbach kontrolnych musi na końcu badania być co najmniej na poziomie 70 % (1) (6),
- w naczyniach zawierających próby kontrolne wylęg osobników dorosłych C. riparius i C. yoshimatsui z larw powinien nastąpić między 12. a 23. dniem od ich wprowadzenia do naczynia; w przypadku C. tentans niezbędny jest okres od 20 do 65 dni,
- na końcu badania należy zmierzyć wartość pH oraz stężenie rozpuszczonego tlenu w każdym naczyniu. Stężenie tlenu powinno wynosić co najmniej 60 % wartości nasycenia powietrzem (ASV) w wybranej temperaturze, a wartość pH w warstwie wody powyżej osadu powinna we wszystkich naczyniach używanych do badania znajdować się w przedziale 6-9,
- temperatura wody nie powinna różnić się o więcej niż ± 1,0 °C. Temperaturę wody można kontrolować przy użyciu pomieszczenia izotermicznego i w takim przypadku temperatura pomieszczenia powinna być potwierdzana w stosownych odstępach czasowych.
OPIS METODY
Naczynia używane do badania
11. Badanie prowadzone jest w szklanych zlewkach o pojemności 600 ml i średnicy 8 cm. Inne naczynia także mogą nadawać się do badania, powinny jednak zapewniać odpowiednią głębokość warstwy osadu i warstwy wody powyżej. Powierzchnia osadu powinna być wystarczająca, by zapewnić od 2 do 3 cm2 na larwę. Stosunek głębokości warstwy osadu do warstwy wody powyżej powinien wynosić 1:4. Naczynia do badania i inne przyrządy mające kontakt z układem badawczym powinny być w całości wykonane ze szkła lub innego chemicznie obojętnego materiału (np. teflonu).
Wybór gatunków
12. Gatunkiem wykorzystywanym w badaniu powinien być w miarę możliwości Chironomus riparius. Odpowiedni jest także Chironomus tentans, ale jest trudniejszy w hodowli i wymaga dłuższego okresu badania. Można także korzystać z Chironomus yohimatsui. Szczegóły metod hodowli dla Chironomus riparius podano w dodatku 2. Informacje dotyczące warunków hodowli są także dostępne dla innych gatunków, tj. Chironomus tentans (4) i Chironomus yoshimatsui (11). Przed przeprowadzeniem badania należy potwierdzić identyfikację gatunków, ale nie jest to wymagane przed każdym badaniem, jeśli organizmy pochodzą z hodowli wewnątrzlaboratoryjnej.
Osad
13. W miarę możliwości należy stosować osad preparowany (zwany także osadem regenerowanym, sztucznym lub syntetycznym). Jeśli jednak korzysta się z osadu naturalnego, należy go scharakteryzować (co najmniej pod kątem pH, zawartości węgla organicznego, zaleca się także określenie innych parametrów, takich jak stosunek C/N i granulometria). Osad taki powinien być wolny od zanieczyszczeń i innych organizmów, które mogłyby konkurować z ochotkowatymi lub je zjadać. Zaleca się także, by przed jego wykorzystaniem w badaniu toksyczności dla ochotkowatych naturalny osad był przez siedem dni kondycjonowany w tych samych warunkach, jakie panować będą następnie podczas badania. Do wykorzystania w tym badaniu (1) (15) (16) zaleca się następujący osad preparowany oparty na sztucznej glebie stosowanej w metodzie badawczej C.8 (14):
a) torf 4-5 % (w przeliczeniu na suchą masę): wartość pH możliwie najbardziej zbliżona do przedziału 5,5 do 6,0; ważne jest, by stosować torf w postaci sproszkowanej, drobno zmielony (wielkość cząstek ≤ 1 mm) i suszony wyłącznie powietrzem;
b) glinka kaolinowa 20 % (w przeliczeniu na suchą masę) (zawartość kaolinitu w miarę możliwości powyżej 30 %);
c) piasek kwarcowy 75-76 % (w przeliczeniu na suchą masę) (powinien przeważać drobny piasek, w którym ponad 50 % cząstek mierzy od 50 do 200 μm);
d) dla uzyskania wilgotności końcowej mieszkanki na poziomie od 30-50 % dodaje się wodę dejonizowaną;
e) w celu skorygowania pH końcowej mieszanki osadu do wartości 7,0 ± 0,5 dodaje się do niej chemicznie czysty węglan wapnia (CaCO3);
f) zawartość węgla organicznego w końcowej mieszance powinna wynosić 2 % (± 0,5 %) i należy ją skorygować przy użyciu odpowiednich ilości torfu i piasku, zgodnie z lit. a) i c).
14. Źródło torfu, glinki kaolinowej i piasku powinno być znane. Składniki osadu należy sprawdzić pod kątem zanieczyszczenia chemicznego (np. metalami ciężkimi, związkami chloroorganicznymi, związkami fosforoorganicznymi itp.). W dodatku 3 podano przykładowy sposób przygotowania osadu preparowanego. Dopuszczalne jest także mieszanie suchych składników, o ile wykaże się, że po dodaniu warstwy wody powyżej osadu składniki osadu się nie rozdzielają (np. nie unoszą się cząstki torfu) oraz że torf lub osad jest poddawany dostatecznemu kondycjonowaniu.
Woda
15. Jako wodę do badania można stosować każdy rodzaj wody, której charakterystyka zgodna jest z charakterystyką chemiczną wody nadającej się do rozcieńczania, jak opisano w dodatkach 2 i 4. Do hodowli ochotkowatych i do badania może służyć każdy odpowiedni rodzaj wody, np. woda naturalna (powierzchniowa lub gruntowa), woda regenerowana (zob. dodatek 2) lub odchlorowana woda wodociągowa, pod warunkiem że ochotkowate przeżyją w niej przez okres hodowli i badania bez wykazywania oznak stresu. Na początku badania wartość pH wody do badania powinna wynosić od 6 do 9, a twardość ogółem wody w przeliczeniu na CaCO3 nie powinna być wyższa niż 400 mg/l. Jeśli jednak podejrzewa się, że między jonami powodującymi twardość wody a substancją badaną dochodzi do interakcji, powinna być stosowana woda o mniejszej twardości (a zatem w takim przypadku nie wolno używać pożywki Elendta M4). Przez okres całego badania należy stosować ten sam rodzaj wody. Cechy jakości wody, wymienione w dodatku 4, należy mierzyć co najmniej dwa razy w roku lub ilekroć zachodzi podejrzenie, że mogły one ulec znacznej zmianie.
Roztwory podstawowe - woda wzbogacana
16. Badane stężenia oblicza się na podstawie stężeń w słupie wody, tj. w warstwie wody powyżej osadu. Roztwory testowe o wybranych stężeniach są zwykle przygotowywane przez rozcieńczenie roztworu podstawowego. Zalecane jest przygotowanie roztworów podstawowych przez rozpuszczenie substancji badanej w pożywce. W niektórych przypadkach wymagane może być stosowanie rozpuszczalników lub środków dyspergujących w celu uzyskania odpowiednio stężonego roztworu podstawowego. Przykładami odpowiednich rozpuszczalników są aceton, etanol, metanol, eter monoetylowy glikolu etylenowego, eter dimetylowy glikolu etylenowego, dimetyloformamid i glikol trójetylenowy. Dopuszczalne środki dyspergujące to kremofor RH40, Tween 80, metyloceluloza 0,01 % i HCO-40. Stężenie środka rozpuszczającego w końcowej pożywce powinno być minimalne (tj. ≤ 0,1 ml/l) i jednakowe we wszystkich zabiegach. Gdy stosuje się środki rozpuszczające, nie mogą one mieć znaczącego wpływu na przeżycie ani widocznego szkodliwego działania na larwy ochotkowatych, wykazanego w doświadczeniu kontrolnym z rozpuszczalnikiem. Należy jednak dołożyć wszelkich starań, aby uniknąć użycia takich substancji.
PROJEKT BADANIA
17. Projekt badania obejmuje dobór liczby badanych stężeń i ich zróżnicowanie, liczby naczyń zawierających dane stężenie substancji i liczby larw na jedno naczynie. Opisano projekty dotyczące punktowego oszacowania wartości EC, oszacowania wartości NOEC i przeprowadzenia badania granicznego. Zaleca się raczej analizę regresji niż podejście oparte na badaniu hipotez.
Projekt analizy regresyjnej
18. Stężenie efektywne (np. EC15, EC50) i zakres stężeń, powyżej którego skutki działania substancji badanej stają się przedmiotem zainteresowania, należy wyskalować z zastosowaniem stężeń ujętych w badaniu. Na ogół dokładność, a zwłaszcza ważność, z jakimi można dokonać oceny stężeń efektywnych (ECx), są wyższe, gdy stężenie efektywne mieści się w zakresie badanych stężeń. Należy unikać ekstrapolowania wyników znacznie poniżej najniższego stężenia dającego wynik dodatni lub powyżej najwyższego stężenia. Wstępne badanie ustalające zakres jest pomocne przy wyborze zakresu stężeń do zastosowania (zob. pkt 27).
19. Jeśli trzeba oszacować ECx, należy zbadać co najmniej pięć stężeń i trzy replikaty dla każdego stężenia. W każdym przypadku zaleca się stosowanie dostatecznych stężeń substancji badanej, aby umożliwić dobre oszacowanie parametrów modelu. Współczynnik odstępów między stężeniami nie powinien być większy niż dwa (z wyjątkiem przypadków, gdy krzywa dawka-odpowiedź ma łagodny przebieg). Liczba replikatów przy każdym podaniu dawki substancji badanej może być zmniejszona, jeśli zwiększy się liczbę stężeń substancji badanej dających różne odpowiedzi. Zwiększenie liczby replikatów lub zmniejszenie wielkości odstępów między badanymi stężeniami zwykle prowadzi do zwężenia przedziałów ufności dla danego badania. Jeśli celem jest oszacowanie przeżycia i wzrostu larw w okresie 10 dni, wymagane są dodatkowe replikaty.
Projekt dotyczący oszacowania NOEC/LOEC
20. Jeśli celem jest oszacowanie wartości LOEC/NOEC, należy zastosować pięć stężeń substancji badanej z co najmniej czterema replikatami, a współczynnik odstępów między stężeniami nie powinien być większy niż dwa. Liczba replikatów powinna być na tyle duża, by zapewnić odpowiednią moc statystyczną dla wykrycia 20 % różnicy z próbą kontrolną przy istotności wynoszącej 5 % (p = 0,05). W przypadku współczynnika rozwoju zwykle stosowna jest analiza wariancji (ANOVA), np. badanie Dunnetta i badanie Williamsa (17) (18) (19) (20). W przypadku współczynnika wylęgu można stosować test Cochrana-Armitage'a, test dokładny Fishera (z korektą Bonferroniego) lub test Mantela-Haenszela.
Badanie graniczne
21. Jeśli we wstępnym badaniu ustalającym zakres nie zaobserwowano żadnych zmian, można przeprowadzić badanie graniczne (jedno stężenie badane i jedna próba kontrolna). Celem badania granicznego jest pokazanie, że toksyczność substancji badanej jest większa niż zbadane stężenie graniczne. W ramach niniejszej metody badawczej nie można zaproponować zalecanego stężenia; kwestię tę pozostawia się uznaniu organów regulacyjnych. Zazwyczaj koniecznych jest co najmniej 6 replikatów zarówno dla próby poddawanej działaniu substancji, jak i dla próby kontrolnej. Należy wykazać odpowiednią moc statystyczną, która pozwala wykryć 20 % różnicę w porównaniu z próbą kontrolną przy 5 % poziomie istotności (p = 0,05). Przy odpowiedzi metrycznej (współczynnik rozwoju i masa) odpowiednią metodą statystyczną jest test t-Studenta, jeśli dane spełniają warunki tego testu (normalność rozkładu zmiennych, jednorodność wariancji). Jeśli te warunki nie są spełnione, można zastosować test t-Studenta dla nierównych wariancji lub test nieparametryczny, np. test Manna-Whitney-aWilcoxona. W przypadku współczynnika wylęgu odpowiedni jest test dokładny Fishera.
PROCEDURA
Warunki narażenia na działanie substancji
Przygotowanie układu woda wzbogacona-osad
22. Do naczyń do badania dodaje się odpowiednie ilości preparowanego osadu (zob. pkt 13-14 oraz dodatek 3), aby powstała warstwa o grubości co najmniej 1,5 cm. Wodę dodaje się do głębokości 6 cm (zob. pkt 15). Stosunek głębokości warstwy osadu do warstwy wody nie powinien przekraczać 1:4, a warstwa osadu nie powinna być wyższa niż 3 cm. Przed dodaniem organizmów badanych układ osad-woda należy delikatnie napowietrzać przez siedem dni (zob. pkt 14 oraz dodatek 3). Podczas dodawania badanej wody do słupa wody nad osadem, aby uniknąć oddzielenia składników osadu i ponownego zawieszenia w wodzie drobnoziarnistego materiału, osad na czas zalewania można nakryć plastikowym krążkiem, a krążek następnie od razu usunąć. Właściwe może być także zastosowanie innych przyrządów.
23. Naczynia do badania powinny być przykryte (np. szklanymi płytkami). W razie konieczności w czasie badania poziom wody uzupełnia się do pierwotnej objętości, aby wyrównać brak spowodowany jej parowaniem. Należy w tym celu używać wody destylowanej lub dejonizowanej, aby zapobiec odkładaniu się soli.
Dodanie organizmów badanych
24. Na cztery-pięć dni przed umieszczeniem organizmów badanych w naczyniach używanych do badania pakiety jaj należy wyjąć z hodowli i umieścić w małych naczyniach w pożywce hodowlanej. Można w tym celu zastosować pożywkę wykorzystywaną w hodowli podstawowej lub pożywkę świeżo przygotowaną. Jeśli stosowana jest ta ostatnia, do pożywki hodowlanej należy dodać niewielką ilość pokarmu, np. zielenice lub kilka kropel filtratu z drobno zmielonej zawiesiny pokarmu w płatkach dla ryb (zob. dodatek 2). Należy korzystać wyłącznie ze świeżo złożonych pakietów jaj. Wylęg larw zaczyna się przeważnie kilka dni po złożeniu pakietów jaj (2 do 3 dni w przypadku Chironomus riparius w temperaturze 20 °C oraz 1 do 4 dni w przypadku Chironomus tentans w temperaturze 23 °C i Chironomus yoshimatsui w temperaturze 25 °C), a wzrost larw następuje w czterech stadiach larwalnych, przy czym każde z nich trwa od 4 do 8 dni. Do badania należy stosować larwy w pierwszym stadium larwalnym (2-3 lub 1-4 dni po wylęgu). Stadium larwalne kuczmanów można sprawdzić, stosując pomiar szerokości puszki głowowej (6).
25. Dwadzieścia larw w pierwszym stadium larwalnym przydziela się losowo do każdego naczynia doświadczalnego zawierającego osad wzbogacony i wodę przy użyciu tępo zakończonej pipety. Po wprowadzeniu larw do naczyń należy zatrzymać napowietrzanie wody i nie uruchamiać go przez dobę po ich wprowadzeniu (zob. pkt 24 i 32). Zgodnie z zastosowanym projektem badania (zob. pkt 19 i 20) w celu oszacowania punktowego EC należy zastosować co najmniej 60 larw na stężenie, a w celu oznaczenia wartości NOEC - 80 larw.
26. Dwadzieścia cztery godziny po dodaniu larw słup wody powyżej osadu wzbogacany jest w substancję badaną i ponownie zapewniane jest delikatne napowietrzanie. Małe ilości roztworów substancji badanej wprowadza się pod powierzchnię wody za pomocą pipety. Wodę powyżej osadu należy następnie ostrożnie zamieszać, tak aby go nie poruszyć.
Badane stężenia
27. Badanie ustalające zakres może być przydatne do określenia zakresu stężeń dla ostatecznego badania. W tym celu stosuje się szereg roztworów o znacznie różniących się od siebie stężeniach substancji badanej. Aby zapewnić tę samą gęstość powierzchni na ochotkowate, co stosowana w ostatecznym badaniu, ochotkowate poddaje się narażeniu na każde stężenie substancji badanej przez okres pozwalający oszacować odpowiednie jej stężenie badane i nie wymagane są replikaty.
28. Decyzje dotyczące stężeń substancji badanej w ostatecznym badaniu podejmuje się w oparciu o wynik badania ustalającego zakres. Jak opisano w pkt 18 do 20, należy zastosować i wybrać co najmniej pięć stężeń.
Próby kontrolne
29. Naczynia zawierające próby kontrolne bez substancji badanej, ale zawierające osad, powinny być uwzględnione w badaniu z odpowiednią liczbą replikatów (zob. pkt 19 i 20). Jeśli do wprowadzenia substancji badanej został użyty rozpuszczalnik (zob. pkt 16), należy dodać próbę kontrolną zawierającą osad z rozpuszczalnikiem.
Układ badawczy
30. Stosowane są układy statyczne. W wyjątkowych przypadkach, na przykład gdy określone w specyfikacjach cechy jakości wody staną się nieodpowiednie dla organizmu badanego lub naruszą równowagę chemiczną (np. poziomy rozpuszczonego tlenu spadną zbyt nisko, stężenie produktów wydalania za bardzo wzrośnie lub nastąpi uwalnianie minerałów z osadu, które wpłynie na wartość pH lub twardość wody), można stosować układy półstatyczne lub przepływowe z okresowym lub stałym odnawianiem wody powyżej osadu. Inne metody poprawy jakości wody powyżej osadu, np. napowietrzanie, zwykle jednak wystarczają i należy w miarę możliwości z nich korzystać.
Pokarm
31. Larwy trzeba karmić, w miarę możliwości codziennie lub co najmniej trzy razy w tygodniu. Odpowiedni do karmienia młodych larw przez pierwsze 10 dni wydaje się pokarm dla ryb (zawiesina w wodzie lub drobno zmielony pokarm, np. TetraMin lub TetraPhyll, zob. szczegółowe informacje w dodatku 2) w ilości 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg w przypadku C. yoshimatsui) na larwę dziennie. Starsze larwy mogą potrzebować nieco więcej pokarmu: 0,5-1 mg na larwę na dzień powinno być wystarczającą ilością przez pozostałą część badania. Jeśli obserwuje się wzrost grzybów lub śmiertelność w próbach kontrolnych, należy wówczas we wszystkich próbach kontrolnych i doświadczalnych ograniczyć i kontrolować racje żywieniowe. Jeśli nie można powstrzymać rozwoju grzybów, należy powtórzyć badanie. Przy badaniu substancji silnie adsorbujących (np. o log Kow > 5) lub w przypadku substancji tworzących wiązanie kowalencyjne z osadem ilość pokarmu niezbędną do zapewnienia przeżycia i naturalnego wzrostu organizmów można dodać do osadu preparowanego przed okresem stabilizacji. W tym celu zamiast pokarmu dla ryb należy stosować surowiec roślinny, np. dodatek 0,5 % (w przeliczeniu na suchą masę) drobno zmielonych liści np. pokrzywy zwyczajnej (Urtica dioica), morwy białej (Morus alba), koniczyny białej (Trifolium repens), szpinaku (Spinacia oleracea), można też użyć innego surowca roślinnego (produktu Cerophyl lub alfa-celulozy).
Warunki inkubacji
32. W miarę możliwości w ciągu 24 godzin od wprowadzenia larw należy zapewnić delikatne napowietrzanie warstwy wody powyżej osadu w naczyniach do badania, a następnie kontynuować je przez cały okres badania (należy dopilnować, by stężenie rozpuszczonego tlenu nie spadło poniżej 60 % ASV). Napowietrzanie prowadzone jest z użyciem szklanej pipety Pasteura przytwierdzonej 2-3 cm nad warstwą osadu (tj. w ilości jednego lub kilku bąbli powietrza/sek.). Przy badaniu lotnych chemikaliów można rozważyć nienapowietrzanie układu osad-woda.
33. Badanie przeprowadza się w stałej temperaturze 20 °C (± 2 °C). Zalecane temperatury w przypadku C. tentans i C. yoshimatsui to odpowiednio 23 °C i 25 °C (± 2 °C). Stosuje się 16-godzinny fotoperiod, a natężenie światła powinno wynosić od 500 do 1 000 luksów.
Czas trwania narażenia
34. Czas trwania narażenia rozpoczyna się od wprowadzenia larw do naczyń z próbą wzbogaconą i naczyń zawierających próby kontrolne. Maksymalny czas trwania narażenia wynosi 28 dni w przypadku C. riparius i C. yoshimatsui, a w przypadku C. tentans 65 dni. Jeśli kuczmany wylęgną się wcześniej, badanie można zakończyć po co najmniej pięciu dniach od wylęgu ostatniego dorosłego osobnika w próbie kontrolnej.
OBSERWACJE
Wylęg osobników dorosłych
35. Należy określić czas rozwoju i całkowitą liczbę w pełni wylęgniętych samców i samic kuczmanów. Samce łatwo zidentyfikować dzięki ich pierzastym czułkom.
36. Naczynia do badania należy obserwować co najmniej trzy razy w tygodniu w celu wzrokowej oceny ewentualnego nieprawidłowego zachowania (np. porzucanie osadu, nietypowy sposób pływania) w porównaniu z próbą kontrolną. W okresie spodziewanego wylęgu kuczmanów konieczne jest codzienne ich zliczanie. Płeć i liczbę w pełni wylęgniętych kuczmanów należy zapisywać codziennie. Po identyfikacji kuczmany usuwane są z naczyń. Pakiety jaj złożone przed zakończeniem badania należy odnotować, a następnie usunąć, by zapobiec ponownemu wprowadzeniu larw do osadu. Należy także odnotować liczbę widocznych poczwarek, z których nie wylęgły się kuczmany. Wytyczne dotyczące pomiaru wylęgu zawarte są w dodatku 5.
Wzrost i przeżycie
37. Jeśli mają być dostarczone dane dotyczące 10-dniowego przeżycia i wzrostu larw, należy na początku włączyć do badania dodatkowe naczynia, by mogły być w tym celu wykorzystane. Aby zebrać larwy, osad z tych dodatkowych naczyń należy przesiać, używając sita 250 μm. Kryteriami zgonu są nieruchomość lub brak reakcji na bodziec mechaniczny. Larwy nieodzyskane należy także liczyć jako martwe (larwy, które padły na początku badania, mogły zostać rozłożone przez drobnoustroje). Należy określić suchą masę (bez popiołu) larw pozostałych przy życiu na każde naczynie do badania i obliczyć średnią suchą masę pojedynczej larwy na każde naczynie. Przydatne jest określenie, w którym stadium larwalnym znajdują się larwy pozostałe przy życiu; w tym celu można stosować pomiar puszki głowowej każdego osobnika.
Pomiary analityczne
Stężenie substancji badanej
38. Na początku i na końcu badania trzeba przeanalizować co najmniej próbki wody z warstwy powyżej osadu, wody porowej i osadu (najlepiej godzinę po wprowadzeniu substancji badanej), przy najwyższym stężeniu i przy niższym stężeniu. Takie oznaczenie stężenia substancji badanej daje wiedzę na temat zachowania/podziału substancji badanej w układzie woda-osad. Pobieranie próbek osadu na początku badania może wpływać na układ badawczy (np. poprzez usunięcie badanych larw), a zatem do wykonywania oznaczeń analitycznych na początku i w trakcie badania należy w stosownych przypadkach używać dodatkowych naczyń do badania (zob. pkt 39). Pomiary osadu mogą nie być konieczne, jeśli podział substancji badanej między wodą i osadem został wyraźnie określony w badaniu wody/osadu w porównywalnych warunkach (np. stosunek osadu do wody, rodzaj zastosowania, zawartość węgla organicznego w osadzie).
39. Gdy dokonuje się pomiarów pośrednich (np. w 7. dniu) lub jeśli do analizy potrzeba dużych próbek, których nie można pobrać z naczyń do badania bez wpływania na układ badawczy, należy dokonać oznaczeń analitycznych na próbkach pochodzących z dodatkowych naczyń do badania przygotowanych w ten sam sposób (zawierających także organizmy badane), ale nie wykorzystywanych do obserwacji biologicznych.
40. Aby oddzielić wodę porową, zaleca się odwirowanie osadu np. przy 10 000 g w temp. 4 °C przez 30 min. Jeśli jednak substancja badana nie adsorbuje się na filtrze, dopuszczalna jest też filtracja. W niektórych przypadkach zanalizowanie stężeń w wodzie porowej może nie być możliwe, ponieważ wielkość próbki jest zbyt mała.
Parametry fizykochemiczne
41. Wartość pH, stężenie rozpuszczonego tlenu w wodzie do badania i temperatura w naczyniach do badania powinny być odpowiednio mierzone (zob. pkt 10). Twardość i zawartość amoniaku należy zmierzyć w próbach kontrolnych i w jednym naczyniu do badania przy najwyższym stężeniu na początku i na końcu badania.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Opracowanie wyników
42. Celem badania jest określenie wpływu substancji badanej na współczynnik rozwoju i całkowitą liczbę w pełni wylęgniętych samic i samców kuczmanów lub, w przypadku badań 10-dniowych, skutków dla przeżycia i masy larw. Jeśli nie ma wskazań dotyczących statystycznie istotnych różnic we wrażliwości osobników każdej płci, wyniki dotyczące osobników męskich i żeńskich mogą zostać połączone do celów analizy statystycznej. Różnice we wrażliwości między płciami można oszacować statystycznie z wykorzystaniem np. tablicy rozkładu chi-kwadrat χ2-r x 2. W razie konieczności przeżycie larw i średnią suchą masę larwy na naczynie należy określić po 10 dniach.
43. Wartości stężeń powodujące zmiany, wyrażone jako stężenia w wodzie powyżej osadu, należy obliczyć w miarę możliwości w oparciu o zmierzone stężenia na początku badania (zob. pkt 38).
44. Aby obliczyć oszacowanie punktowe dla EC50 i innych ECx, jako prawdziwe replikaty można wykorzystywać dane statystyczne dotyczące poszczególnych naczyń. Przy wyliczaniu przedziału ufności dla ECx należy uwzględnić zmienność między naczyniami lub należy wykazać, że zmienność ta jest tak niewielka, że można ją pominąć. Jeżeli model został dopasowany przy użyciu metody najmniejszych kwadratów, do danych statystycznych dotyczących poszczególnych naczyń należy zastosować przekształcenie, aby poprawić jednorodność wariancji. Wartości ECx należy jednak liczyć po przekształceniu odpowiedzi z powrotem do wartości pierwotnej.
45. W przypadku gdy analiza statystyczna ma na celu określenie wartości NOEC/LOEC przez zastosowanie badania hipotezy statystycznej, należy wziąć pod uwagę zmienność między naczyniami, np. przez zastosowanie zagnieżdżonej analizy wariancji. Ewentualnie w przypadkach, w których występują naruszenia zwykłych założeń analizy wariancji, odpowiednie mogą być bardziej odporne testy (21).
Współczynnik wylęgu
46. W przypadku gdy oczekuje się monotonicznej zależności dawka-odpowiedź, a dane te są spójne z tym oczekiwaniem, współczynniki wylęgu, które są danymi dwuwartościowymi, można zanalizować z użyciem testu Cochrana-Armitage'a stosowanego na zasadzie krokowej wstecznej. W innym przypadku można zastosować test dokładny Fishera lub test Mantela-Haenszela z granicznym poziomem istotności skorygowanym metodą Bonferroniego-Holma. Jeśli są dowody na większą zmienność między replikatami w ramach tego samego stężenia niż wskazywałby na to rozkład dwumianowy (co określa się często jako zmienność większą niż zmienność w rozkładzie dwumianowym), wówczas należy zastosować odporny test Cochrana-Armitage'a lub test dokładny Fishera, tak jak proponuje się w pozycji (21) w bibliografii.
47. Suma kuczmanów wylęgniętych na każde naczynie, ne, jest określana i dzielona przez liczbę wprowadzonych larw, na:
gdzie:
ER = współczynnik wylęgu,
ne = liczba wylęgniętych kuczmanów na każde naczynie,
na = liczba wprowadzonych larw na każde naczynie.
48. Najwłaściwszą alternatywą w przypadku dużych próbek, w których występuje wariancja większa niż wariancja w rozkładzie dwumianowym, jest traktowanie współczynnika wylęgu jako odpowiedzi ciągłej i stosowanie takich procedur jak test Williamsa, gdy oczekuje się monotonicznej zależności dawka-odpowiedź i oczekiwanie to jest zgodne z danymi dotyczącymi współczynnika wylęgu. Jeśli założenie dotyczące monotoniczności nie jest spełnione, odpowiedni byłby test Dunnetta. Uznaje się, że próbka jest duża, gdy zarówno liczba wylęgniętych kuczmanów, jak i liczba larw, z których się one nie wylęgły, przekracza pięć na każde naczynie stanowiące replikat.
49. Aby zastosować metody analizy wariancji, wartości współczynnika wylęgu należy najpierw przekształcić, stosując przekształcenie pierwiastkowe i arcsin lub przekształcenie Freemana-Tukeya w celu otrzymania przybliżonego normalnego rozkładu i wyrównania wariancji. Przy użyciu częstości bezwzględnej można zastosować test Cochrana-Armitage'a, test dokładny Fishera (z korektą Bonferroniego) lub test Mantela-Haenszela. Przekształcenie pierwiastkowe i arcsin stosuje się przez wyznaczenie funkcji odwrotnej względem sinusa (sin-1) pierwiastka współczynnika wylęgu.
50. W przypadku współczynników wylęgu wartości ECx oblicza się, stosując analizę regresji (lub np. analizę probitową (22), logitową, analizę Weibulla, odpowiednie oprogramowanie komercyjne itd.)Jeśli analiza regresji zawodzi (np. w przypadku gdy występują mniej niż dwie częściowe odpowiedzi), stosuje się inne metody nieparametryczne, takie jak średnia krocząca lub prosta interpolacja.
Współczynnik rozwoju
51. Średnia czasu rozwoju to średni czas od wprowadzenia larw (dzień 0 badania) do wylęgu kuczmanów tworzących kohortę badaną (w celu policzenia rzeczywistego czasu rozwoju należy uwzględnić wiek larw w chwili wprowadzenia). Współczynnik rozwoju stanowi odwrotność czasu rozwoju (jednostka: 1/dzień) i przedstawia tę część rozwoju larwy, która następuje każdego dnia. Do celów oceny omawianych badań dotyczących toksyczności w osadzie preferowany jest współczynnik rozwoju, jako że jego wariancja jest mniejsza, jest bardziej jednorodny i bliższy normalnemu rozkładowi w porównaniu z czasem rozwoju. Dlatego silne metody parametryczne badania stosować można raczej w odniesieniu do współczynnika rozwoju niż do czasu rozwoju. Dla współczynnika rozwoju jako odpowiedzi ciągłej można szacować wartości ECx, stosując analizę regresji (zob. np. (23) (24)).
52. Do celów poniższych badań statystycznych przyjmuje się, że liczba kuczmanów zaobserwowanych w dniu kontroli x wylęgła się w średniej arytmetycznej odstępu czasu między dniem x a dniem xl (1 = długość odstępu czasowego między kontrolami, zwykle 1 dzień). Średnia arytmetyczna współczynnika rozwoju na każde naczynie (x) liczona jest według następującego wzoru:
gdzie:
: średnia arytmetyczna współczynnika rozwoju na każde naczynie,
i: wskaźnik odstępu czasowego między kontrolami,
m: maksymalna liczba odstępów czasowych między kontrolami,
ƒi: liczba kuczmanów wylęgniętych w odstępie czasowym między kontrolami i,
ne: całkowita liczba kuczmanów wylęgniętych na koniec doświadczenia, (= Σ ƒi)
xi: współczynnik rozwoju kuczmanów wylęgniętych w odstępie czasowym między kontrolami i,
gdzie:
dayi: dzień kontroli (dni od wprowadzenia),
li: długość odstępu czasowego między kontrolami i (w dniach, zwykle 1 dzień).
Sprawozdanie z badania
53. Sprawozdanie z badania musi zawierać co najmniej następujące informacje:
Substancja badana
- cechy fizyczne i w stosownych przypadkach właściwości fizykochemiczne (rozpuszczalność w wodzie, prężność par, współczynnik podziału w glebie (lub w osadzie, jeśli jest dostępny), stabilność w wodzie itd.),
- dane identyfikacyjne substancji chemicznej (nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna, numer CAS, wzór strukturalny), w tym czystość i metoda analityczna oznaczania ilościowego substancji badanej.
Badany gatunek
- zwierzęta wykorzystane w badaniu: gatunek, nazwa naukowa, źródło organizmów i warunki hodowli,
- informacje dotyczące postępowania z pakietami jaj i larwami,
- wiek zwierząt badanych w chwili umieszczenia w naczyniu do badania.
Warunki badania
- użyty osad, tj. osad naturalny lub preparowany,
- w przypadku osadu naturalnego - lokalizacja i opis miejsca pobrania próbki osadu, w tym, jeśli to możliwe, historia zanieczyszczenia; charakterystyka: pH, zawartość węgla organicznego, stosunek C/N i granulometria (w stosownych przypadkach),
- przygotowanie osadu preparowanego: składniki i charakterystyka (zawartość węgla organicznego, pH, wilgotność itd. na początku badania),
- przygotowanie wody do badania (jeśli stosowana jest woda regenerowana) i jej charakterystyka (stężenie tlenu, pH, przewodność właściwa, twardość itd. na początku badania),
- głębokość warstwy osadu i warstwy wody powyżej,
- objętość warstwy wody powyżej osadu i wody porowej; masa mokrego osadu z wodą porową i bez niej,
- naczynia do badania (materiał i wielkość),
- metody przygotowania roztworu podstawowego i badanych stężeń,
- wprowadzenie substancji badanej: użyte stężeni, liczba replikatów i użyty rozpuszczalnik, jeśli go zastosowano,
- warunki inkubacji: temperatura, cykl i natężenie oświetlenia, napowietrzanie (częstotliwość i natężenie),
- szczegółowe informacje o żywieniu, w tym rodzaj pokarmu, przygotowanie, schemat żywienia i ilość pokarmu.
Wyniki
- nominalne stężenia badane, zmierzone stężenia badane i wyniki wszystkich analiz ustalających stężenia substancji badanej w naczyniach do badań,
- jakość wody w naczyniach do badania, tj. pH, temperatura, rozpuszczony tlen, twardość i zawartość amoniaku,
- uzupełnienie wyparowanej wody do badania, jeśli nastąpiło,
- liczbę wylęgniętych męskich i żeńskich kuczmanów na każde naczynie na każdy dzień,
- liczba larw, z których nie wylęgły się kuczmany, na każde naczynie,
- w stosownych przypadkach średnia sucha masa larw na każde naczynie do badania i na każde stadium larwalne,
- odsetek wylęgniętych kuczmanów na każdy replikat i na każde stężenie substancji badanej (samice i samce kuczmanów łącznie),
- średni współczynnik rozwoju w pełni wylęgniętych kuczmanów na każdy replikat i współczynnik poddania działaniu substancji badanej (samice i samce kuczmanów łącznie),
- oszacowania toksycznych punktów końcowych, np. ECx (i powiązane przedziały ufności), wartość stężenia, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC), lub najniższe stężenie, przy którym obserwuje się szkodliwe zmiany (LOEC) oraz metody statystyczne użyte w celu ich określenia,
- omówienie wyników, w tym ewentualny wpływ na wynik badania będący skutkiem odstępstw od niniejszej metody badawczej.
BIBLIOGRAFIA:
(1) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. M. Streloke i H. Köpp (red.). Berlin 1995.
(2) Fleming R i in. (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Sprawozdanie końcowe dla Komisji Europejskiej. Nr sprawozdania: EC 3738. Sierpień 1994. WRc, Zjednoczone Królestwo.
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environ-ments. Materiały z warsztatów WOSTA zorganizowanych w Niedrlandach.
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contami-nants with Freshwater Invertebrates. 1125-1241. W: ASTM International 2002 Annual Book of Standards. Tom 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohoc-ken, PA.
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chiro-nomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Sprawozdanie SPE 1/RM/32. Grudzień 1997.
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Wyd. drugie. EPA 600/R-99/064. Marzec 2000. Zmiana wydania pierwszego z czerwca 1994 r.
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.
(9) Milani D, Day KE, McLeay DJ, Kirby RS (1996). Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada's biological test methods for measuring sediment toxicity using fresh-water amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius). Technical Report. Environment Canada. National Water Research Institute. Burlington, Ontario, Kanada.
(10) Sugaya Y (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui. Jp. J. Sanit. Zool. 48 (4): 345-350.
(11) Kawai K (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera). Jp. J. Sanit. Zool. 37(1): 47-57.
(12) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment nr 23.
(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sedi-ments Spiked with a Reference Toxicant. Sprawozdanie EPS 1/RM/30. Wrzesień 1995 r.
(14) Rozdział C.8 niniejszego załącznika. Toksyczność dla dżdżownic.
(15) Suedel BC and Rodgers JH (1994). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13: 1163-1175.
(16) Naylor C and Rodrigues C (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
(17) Dunnett CW (1964). A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc. 50: 1096-1121.
(18) Dunnett CW (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20: 482-491.
(19) Williams DA (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117.
(20) Williams DA (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531.
(21) Rao JNK and Scott AJ (1992). A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics 48: 577-585.
(22) Christensen ER (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model. Water Research 18: 213-221.
(23) Bruce and Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous toxicity data. Environmental Toxicology and Chemistry 11: 1485-1494.
(24) Slob W (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci. 66: 298-312.
Dodatek 1
DEFINICJE
Dla celów niniejszej metody badawczej stosowane są następujące definicje:
Osad preparowany lub regenerowany, sztuczny lub syntetyczny stanowi mieszaninę materiałów używaną do naśladowania składników fizycznych naturalnego osadu.
Warstwa wody powyżej osadu to woda, którą zalano osad w naczyniu do badania.
Woda porowa to woda wypełniająca przestrzeń między cząstkami osadu i gleby.
Woda wzbogacona to woda do badania, do której dodano substancję badaną.
Badana substancja chemiczna: każda substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.
Dodatek 2
Zalecenia dotyczące hodowli Chironomus riparius
1. Larwy ochotki (Chironomus) można hodować w naczyniach krystalizacyjnych lub większych zbiornikach. Na dnie zbiornika rozprowadza się drobny piasek kwarcowy, tworząc cienką warstwę grubości od 5 do 10 mm. Odpowiednim substratem okazała się także ziemia okrzemkowa (np. Merck, Art 8117), w przypadku której wystarczająca jest cieńsza warstwa grubości najwyżej kilku milimetrów. Następnie dodaje się odpowiednią wodę na głębokość kilku centymetrów. Poziomy wody należy uzupełniać, aby wyrównać stratę spowodowaną parowaniem i zapobiec wysychaniu. Wodę w razie konieczności można zastępować. Należy zapewnić delikatne napowietrzanie. Naczynia do chowu larw należy przechowywać w odpowiedniej klatce, aby zapobiec ucieczce wylęgniętych osobników dorosłych. Klatka powinna być na tyle duża, by umożliwić rojenie wylęgniętych osobników dorosłych, inaczej może nie dojść do kopulacji (co najmniej ok. 30 × 30 × 30 cm).
2. Klatki powinny być trzymane w temperaturze pokojowej lub w pomieszczeniu o stałych warunkach środowiska w temperaturze 20 ± 2 °C z fotoperiodem wynoszącym 16 godzin światła (o natężeniu ok. 1 000 luksów) i 8 godzin ciemności. Odnotowywano, że wilgotność powietrza mniejsza niż 60 % RH może przeszkodzić rozmnażaniu.
Woda do rozcieńczania
3. Można stosować każdy rodzaj wody naturalnej lub syntetycznej. Powszechnie stosowana jest woda gruntowa, odchlorowana woda wodociągowa i sztuczne pożywki (np. pożywka Elendta "M4" lub "M7", zob. także poniżej). Woda przed użyciem powinna być napowietrzona. W miarę potrzeby woda do hodowli może być odnawiana przez ostrożne odlewanie lub wypłukiwanie zużytej wody z naczyń hodowlanych bez niszczenia oprzędów larw.
Karmienie larw
4. Larwy Chironomus należy karmić pokarmem w płatkach dla ryb (Tetra Min®, Tetra Phyll® lub innej marki pokarmem dla ryb) w ilości ok. 250 mg na każde naczynie na dzień. Można go podawać w postaci suchego mielonego proszku lub jako zawiesinę w wodzie: 1 g pokarmu w płatkach dodaje się do 20 ml wody do rozcieńczenia i rozdrabnia się do uzyskania jednorodnej mieszanki. Preparat ten można stosować jako pokarm w ilości ok. 5 ml na każde naczynie na dzień (przed użyciem wstrząsnąć). Starsze larwy mogą dostawać go więcej.
5. Żywienie dostosowuje się do jakości wody. Jeśli pożywka do hodowli staje się mętna, należy ograniczyć karmienie. Podawanie pokarmu należy starannie monitorować. Zbyt mała ilość pożywienia spowoduje migrację larw w kierunku słupa wody, a zbyt duża wywoła zwiększoną aktywność drobnoustrojów i zmniejszone stężenie tlenu. Oba rodzaje warunków mogą spowodować ograniczenie współczynnika wzrostu.
6. Przy przygotowywaniu nowych naczyń do hodowli można też dodać komórki niektórych gatunków zielenic (np. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris).
Karmienie wylęgniętych osobników dorosłych
7. Niektórzy badacze sugerują, by do karmienia wylęgniętych osobników dorosłych używać tamponu z wełny bawełnianej nasączonego nasyconym roztworem sacharozy.
Wylęg osobników dorosłych
8. Przy temperaturze 20 ± 2 °C po ok. 13-15 dniach w naczyniach do hodowli z larw wylęgną się osobniki dorosłe. Samce łatwo zidentyfikować dzięki pierzastym czułkom.
Pakiety jaj
9. Po tym, jak osobniki dorosłe pojawią się w klatce hodowlanej, należy trzy razy w tygodniu sprawdzać we wszystkich naczyniach do chowu larw, czy nie zostały złożone galaretowate pakiety jaj. Jeśli tak, należy je ostrożnie usunąć, a następnie przenieść do niewielkiego naczynia zawierającego próbkę wody używanej do hodowli. Pakiety jaj wykorzystuje się do zapoczątkowania hodowli w nowym naczyniu (np. 2-4 pakietów jaj na naczynie) lub do badań toksyczności.
10. Larwy w pierwszym stadium larwalnym powinny wylęgnąć się po 2-3 dniach.
Przygotowanie hodowli w nowych naczyniach
11. Po tym, jak hodowle zostaną założone, powinno być możliwe przygotowanie nowej hodowli larw w świeżym naczyniu raz na tydzień lub rzadziej, w zależności od wymogów badania, przy czym starsze naczynia po wylęgnięciu się w nich dorosłych kuczmanów się usuwa. Stosując ten układ, uzyskuje się stałą podaż dorosłych osobników przy zminimalizowaniu zarządzania.
Przygotowanie roztworów testowych "M4" i "M7"
12. Pożywka "M4" została opisana przez Elendta (1990). Pożywkę "M7" przygotowuje się jak pożywkę "M4", z wyjątkiem substancji wskazanych w tabeli 1, których stężenie w "M7" jest czterokrotnie mniejsze niż w "M4". Publikacja na temat pożywki "M7" znajduje się w przygotowaniu (Elendt, informacje własne). Roztwór testowy nie powinien być przygotowywany zgodnie z instrukcjami Elendta i Biasa (1990), ponieważ stężenia NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 oraz K2HPO4 podane dla przygotowania roztworów podstawowych nie są odpowiednie.
Przygotowanie pożywki "M7"
13. Każdy roztwór podstawowy (I) przygotowuje się oddzielnie, a z roztworów podstawowych (I) przygotowuje się łączony roztwór podstawowy (II) (zob. tabela 1). 50 ml łączonego roztworu podstawowego (II) oraz podane w tabeli 2 ilości każdego roztworu podstawowego makroskładnika odżywczego dopełnia się do 1 litra wodą dejonizowaną, aby przygotować pożywkę "M7". Roztwór podstawowy witamin przygotowuje się przez dodanie trzech witamin do wody dejonizowanej, jak wskazano w tabeli 3. Do końcowej pożywki "M7" na krótko przed użyciem dodaje się 0,1 ml łączonego roztworu podstawowego witamin (roztwór podstawowy witamin przechowuje się zamrożony w małych podwielokrotnościach). Pożywka jest napowietrzana i stabilizowana.
Tabela 1
Roztwory podstawowe pierwiastków śladowych w przypadku pożywek M4 i M7
| Roztwory podstawowe (I) | Ilość (mg) dopełniana do 1 litra wodą dejonizowaną | W celu przygotowania łączonego roztworu podstawowego (II): zmieszać następujące ilości (ml) roztworów podstawowych (I) i dopełnić do 1 litra wodą dejonizowaną | Końcowe stężenia w w roztworach testowych (mg/l) | ||
| M4 | M7 | M4 | M7 | ||
| H3BO3(1) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 |
| MnCl2 4 H2O(1) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 |
| LiCl(1) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 |
| RbCl(1) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 |
| SrCl2 6 H2O(1) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 |
| NaBr(1) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 |
| Na2MoO4 2 H2O(1) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 |
| CuCl2 2 H2O(1) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 |
| ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 |
| CaCl2 6 H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 |
| KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 |
| Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 |
| NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 |
| Na2EDTA 2 H2O(1)(2) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 |
| FeSO4 7 H2O(1)(2) | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 |
| (1) Te substancje różnią się w przypadku M4 i M7, jak określono wyżej. (2) Roztwory te są przygotowywane oddzielnie, następnie zlewane razem i niezwłocznie autoklawowane. |
Tabela 2
Roztwory podstawowe makroskładników odżywczych w przypadku pożywek M4 i M7
| Ilość (mg) dopełniana do 1 litra wodą dejonizowaną | Ilość (ml/l) roztworów podstawowych makroskładników odżywczych w celu przygotowania pożywek M4 i M7 | Końcowe stężenia (mg/l) w roztworach testowych pożywek M4 i M7 | |
| CaCl2 2 H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 |
| MgSO4 7 H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 |
| KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 |
| NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 |
| NaSiO3 9 H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 |
| NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 |
| KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 |
| K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 |
Tabela 3
Roztwór podstawowy witamin w przypadku pożywek M4 i M7
Ilość (ml/l) roztworu podstawowego witamin dodawanego w celu przygotowania pożywek M4 i M7
| Wszystkie trzy roztwory witamin łączy się, by otrzymać jeden roztwór podstawowy witamin. | Ilość (mg) dopełniana do 1 litra wodą dejonizowaną | Końcowe stężenia (mg/l) w roztworach testowych pożywek M4 i M7 | |
| Hydrochlorek tiaminy | 750 | 0,1 | 0,075 |
| Cyjanokobalamina (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 |
| Biotyna | 7,5 | 0,1 | 0,00075 |
BIBLIOGRAFIA
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. M. Streloke i H. Köpp (red.). Berlin 1995.
Elendt BP (1990). Selenium Deficiency in Crustacean. Protoplasma 154: 25-33.
Elendt BP i Bias W-R (1990). Trace Nutrient Deficiency in Daphnia magna Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization of Culture Conditions on Life History Parameters of D. magna. Water Research 24 (9): 1157-1167.
Dodatek 3
PRZYGOTOWANIE OSADU PREPAROWANEGO
Skład osadu
Skład osadu preparowanego powinien być następujący:
| Składnik | Właściwości | % suchej masy osadu |
| Torf | Torf z rozkładu mchu torfowca (Sphagnum), w miarę możliwości o wartości pH równej 5,5-6,0, bez widocznych pozostałości roślin, drobno zmielony (wielkość cząstek ≤ 1 mm), suszony powietrzem | 4-5 |
| Piasek kwarcowy | Wielkość ziaren: > 50 % cząstek powinna mieścić się w przedziale 50-200 μ m. | 75-76 |
| Glinka kaolinowa | Zawartość kaolinitu ≥ 30 % | 20 |
| Węgiel organiczny | Skorygowana przez dodanie torfu i piasku | 2 (±0,5) |
| Węglan wapnia | CaCO3, sproszkowany, chemicznie czysty | 0,05-0,1 |
| Woda | Przewodność właściwa ≤ 10 μS/cm | 30-50 |
Przygotowanie
Torf suszy się powietrzem i mieli na drobny proszek. Zawiesinę wymaganej ilości proszku torfowego w wodzie dejonizowanej przygotowuje się z użyciem wysokosprawnego urządzenia do homogenizacji. Wartość pH zawiesiny koryguje się z użyciem CaCO3 do poziomu 5,5 ± 0,5. W celu ustabilizowania pH i komponentu mikrobiologicznego zawiesinę kondycjonuje się przez co najmniej dwa dni w temperaturze 20 ± 2 °C, delikatnie ją mieszając. Ponownie mierzy się pH, którego wartość powinna wynosić 6,0 ± 0,5. Następnie zawiesinę torfową miesza się z innymi składnikami (piaskiem i glinką kaolinową) oraz wodą dejonizowaną, aby otrzymać jednorodny osad z zawartością wody w przedziale 30-50 procent suchej masy osadu. Wartość pH końcowej mieszaniny ponownie mierzy się i koryguje w miarę potrzeby za pomocą CaCO3 do poziomu 6,5 do 7,5. Próbki osadu pobiera się, aby określić suchą masę i zawartość węgla organicznego. Następnie przed ich wykorzystaniem w badaniu toksyczności dla ochotkowatych zaleca się, by osad preparowany kondycjonować przez siedem dni w tych samych warunkach, jakie panować będą następnie podczas badania.
Przechowywanie
Suche składniki do przygotowywania osadu sztucznego mogą być przechowywane w suchym i chłodnym miejscu w temperaturze pokojowej. Nie powinno się przechowywać (mokrego) osadu preparowanego przed jego użyciem w badaniu. Osad należy wykorzystać natychmiast po 7-dniowym okresie kondycjonowania, kończącym proces jego przygotowania.
BIBLIOGRAFIA:
Rozdział C.8 niniejszego załącznika. Toksyczność dla dżdżownic.
Meller M, Egeler P, Rombke J, Schallnass H, Nagel R, Streit B (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20.
Dodatek 4
Właściwości chemiczne dopuszczalnej wody do rozcieńczania
| Substancja | Stężenia |
| Cząstki stałe | < 20 mg/l |
| Całkowity węgiel organiczny | < 2 mg/l |
| Niezjonizowany amoniak | < 1 μg/l |
| Twardość w przeliczeniu na CaCO3 | < 400 mg/l(*) |
| Chlor resztkowy | < 10 μg/l |
| Całkowita zawartość pestycydów fosforoorganicznych | < 50 ng/l |
| Całkowita zawartość pestycydów chloroorganicznych plus polichlorowanych bifenyli | < 50 ng/l |
| Całkowity chlor organiczny | < 25 ng/l |
| (*) Należy jednak pamiętać, że jeżeli podejrzewa się interakcję między jonami powodującymi twardość wody a substancją badaną, powinna być stosowana woda o mniejszej twardości (a zatem w takim przypadku nie wolno używać pożywki Elendta M4). |
Dodatek 5
Wytyczne dotyczące monitorowania wylęgu larw ochotkowatych
Na szklanych zlewkach do badania umieszczono pułapki na wylęgnięte kuczmany. Pułapki te potrzebne są od 20 dnia badania do zakończenia badania. Poniżej przedstawiono rysunek przedstawiający przykładową pułapkę:
C.29. SZYBKA BIODEGRADOWALNOŚĆ - CO2W SZCZELNIE ZAMKNIĘTYCH NACZYNIACH (Badanie fazy gazowej nad roztworem)
WSTĘP
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna z dotyczącą badań wytyczną OECD nr 310 (2006). Niniejsza metoda badawcza jest metodą przesiewową służącą do oceny szybkiej biodegradowalności chemikaliów, która dostarcza podobnych informacji, jak sześć metod badawczych A-F opisanych w rozdziale C.4 niniejszego załącznika. Zatem substancję chemiczną dającą dodatnie wyniki w niniejszej metodzie badawczej można uznać za ulegającą szybkiej biodegradacji, a co za tym idzie, ulegającą szybkiej degradacji w środowisku.
2. Ogólnie przyjętą metodę badania wydzielania się dwutlenku węgla (CO2) (1), opartą na pierwotnym badaniu Sturma (2) służącym ocenie biodegradowalności organicznych substancji chemicznych w drodze pomiaru ilości dwutlenku węgla wytworzonego w wyniku aktywności mikrobiologicznej, wybierano zazwyczaj w pierwszej kolejności, by zbadać słabo rozpuszczalne chemikalia oraz te, które silnie adsorbują. Wybiera się ją także dla chemikaliów rozpuszczalnych (ale nie lotnych), ponieważ wielu uznaje wydzielanie się dwutlenku węgla za jedyny jednoznaczny dowód aktywności mikrobiologicznej. Usuwanie rozpuszczonego węgla organicznego można uzyskać w drodze procesów fizykochemicznych - adsorpcji, ulatniania się, strącania, hydrolizy - jak również aktywności mikrobiologicznej oraz wielu reakcji niebiologicznych, w których zużywany jest tlen; rzadko CO2 powstaje z substancji organicznych w sposób abiotyczny. W pierwotnym i zmodyfikowanymbadaniu Sturma (1) (2) CO2 usuwa się z fazy ciekłej do naczyń absorbujących w drodze napowietrzania (tzn. przepuszczania powietrza poddawanego obróbce przez pożywkę ciekłą celem usunięcia CO2), natomiast w wersji Larsona (3) (4) CO2 przemieszcza się z naczynia reakcyjnego do absorberów dzięki przepuszczaniu powietrza wolnego od CO2 przez fazę gazową nad roztworem i dodatkowo ciągłemu potrząsaniu naczyniem badawczym. Naczyniem reakcyjnym potrząsa się jedynie w modyfikacji Larsona; mieszanie jest przewidziane jedynie w przypadku substancji nierozpuszczalnych wymienionych w normie ISO 9439 (5) oraz w pierwotnej wersji amerykańskiej (6); w obu tych normach przewidziano napowietrzanie, a nie wymianę fazy gazowej nad roztworem. W innej oficjalnej metodzie amerykańskiej EPA (7), opartej na metodzie Gledhilla (8), potrząsane naczynie reakcyjne jest zamknięte dla atmosfery, a wytworzony CO2 gromadzi się w wewnętrznej pułapce alkalicznej bezpośrednio z fazy gazowej, tak jak w klasycznych kolbach respirometrów Warburga/Barcrofta.
3. Wykazano jednak, że węgiel nieorganiczny (IC) kumuluje się w pożywce, gdy standardowe, zmodyfikowane badanie Sturma stosuje się do kilku chemikaliów (9). Stwierdzono stężenie węgla nieorganiczneog w wysokości nawet 8 mg/l w czasie rozkładu aniliny o zawartości 20 mg C/l. Zatem gromadzenie się CO2 w pułapkach alkalicznych nie oddawało wiernie ilości CO2 wyprodukowanego mikrobiologicznie w międzyczasie w trakcie rozkładu. W efekcie specyfikacja, zgodnie z którą, aby badana substancja chemiczna została sklasyfikowana jako ulegająca szybkiej biodegradacji, w ciągu 10-dniowego "okna" (10 dni bezpośrednio po osiągnięciu 10-procentowej biodegradacji) należy zebrać > 60 % teoretycznej maksymalnej ilości wytworzonego CO2 (ThCO2), nie zostanie spełniona dla niektórych chemikaliów, które zostałyby tak sklasyfikowane przy użyciu metody usuwania rozpuszczalnego węgla organicznego (DOC).
4. Jeśli wartość procentowego rozkładu jest mniejsza niż oczekiwana, węgiel nieorganiczny być może nagromadził się w badanym roztworze. Wówczas degradowalność można ocenić za pomocą innych badań na szybką biodegradowalność.
5. Inne wady metodologii Sturma (która jest uciążliwa, czasochłonna, bardziej podatna na błędy doświadczalne i nie daje się zastosować do chemikaliów lotnych) już wcześniej spowodowały poszukiwania techniki z zastosowaniem szczelnie zamkniętych naczyń, innej niż metoda Gledhilla, zamiast metody przepływowogazowej (10) (11). Boatman i in. (12) dokonali przeglądu wcześniejszych metod i przyjęli system zamkniętej przestrzeni nad roztworem, w której CO2 uwalniano do fazy gazowej nad roztworem pod koniec inkubacji poprzez zakwaszenie pożywki. CO2 mierzono metodą chromatografii gazowej (GC)/analizy węgla nieorganicznego (IC) w automatycznie pobieranych próbkach fazy gazowej nad roztworem, jednak nie uwzględniono rozpuszczonego węgla nieorganicznego (DIC) w fazie ciekłej. Ponadto zastosowane naczynia były bardzo małe (20 ml) i zawierały jedynie 10 ml pożywki, co powodowało problemy np. przy dodawaniu z konieczności bardzo małych ilości nierozpuszczalnych badanych substancji chemicznych, a w zaszczepionej pożywce może być niewystarczająca ilość mikroorganizmów zdolnych do rozłożenia badanych substancji chemicznych lub też może ich nie być wcale.
6. Trudności te w niezależnych badaniach przezwyciężyli Struijs i Stoltenkamp (13) oraz Birch i Fletcher (14); drugie z tych badań było inspirowane doświadczeniem badaczy z aparaturą stosowaną w badaniu biodegradacji beztlenowej (15). W poprzedniej metodzie (13) CO2 mierzy się w przestrzeni nad roztworem po zakwaszeniu i ustaleniu stanu równowagi, natomiast w drugiej (14) mierzono DIC zarówno w fazie gazowej, jak i w fazie ciekłej, bez dodawania substancji; ponad 90 % wytworzonego IC znajdowało się w fazie ciekłej. Obie metody posiadały zalety w porównaniu z badaniem Sturma: system badawczy był bardziej zwarty i łatwiejszy w obsłudze, umożliwia on badanie lotnych chemikaliów i możliwe jest uniknięcie opóźnienia w pomiarze wytworzonego CO2.
7. Te dwa podejścia połączono w normie ISO dotyczącej oznaczania gazowego CO2 nad roztworem (16), którą poddano badaniu międzylaboratoryjnemu (17) i to ta norma stanowi podstawę dla niniejszej metody badawczej. Podobnie te dwa podejścia zastosowano w metodzie amerykańskiej EPA (18). Zalecono dwie metody pomiaru CO2, mianowicie CO2 w fazie gazowej nad roztworem po zakwaszeniu (13) oraz IC w fazie ciekłej po dodaniu nadmiaru zasady. Drugą metodę wprowadził Peterson w czasie badania międzylaboratoryjnego CONCAWE (19) niniejszej metody pomiaru CO2 w fazie gazowej nad roztworem, zmodyfikowanej dla celów pomiaru naturalnej podatności na biodegradację. W niniejszą metodę badawczą włączono zmiany wprowadzone w 1992 r. (20) w ramach rewizji metod opisanych w rozdziale C.4 niniejszego załącznika w odniesieniu do szybkiej biodegradowalności, tak że warunki (pożywka, czas trwania itp.) są poza tym takie same, jak zastosowane w poprawionym badaniu Sturma (20). Birch i Fletcher (14) wykazali, że przy pomocy niniejszej metody pomiaru CO2 w fazie gazowej nad roztworem otrzymano bardzo podobne wyniki, jak w przypadku tych samych chemikaliów w badaniu międzylaboratoryjnym OECD (21) w odniesieniu do poprawionych metod badawczych.
ZASADA BADANIA
8. Badaną substancję chemiczną zawierającą zwykle 20 mg C/l, jako jedyne źródło węgla i energii inkubuje się w buforowej pożywce mineralnej, którą zaszczepiono mieszaną populacją mikroorganizmów. Badanie przeprowadza się w szczelnie zamkniętych butlach z powietrzem w fazie gazowej nad roztworem, co zapewnia zbiornik tlenu na potrzeby biodegradacji tlenowej. Wydzielanie się CO2 wynikające z całkowitej biodegradacji tlenowej badanej substancji chemicznej określa się w drodze pomiaru ilości IC wytworzonego w badanych butlach przekraczającej ilość wytworzoną w naczyniach ślepej próby zawierających jedynie zaszczepioną pożywkę. Stopień biodegradacji wyraża się jako odsetek teoretycznej maksymalnej ilości wytworzonego IC (ThIC), w odniesieniu do ilości badanej substancji chemicznej (jak np. węgiel organiczny) dodanej na początku.
9. Możliwy jest również pomiar usuwania DOC lub stopnia pierwotnej biodegradacji badanej substancji chemicznej (20).
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ
10. Zawartość węgla organicznego (% w/w) badanej substancji chemicznej musi być znana z jej struktury chemicznej lub w wyniku pomiaru, tak by możliwe było obliczenie procentowego rozkładu. W przypadku lotnych badanych substancji chemicznych do określenia odpowiedniego stosunku objętości fazy gazowej nad roztworem do objętości cieczy pomocna jest zmierzona lub obliczona stała Henry'ego. Informacje na temat toksyczności badanej substancji chemicznej dla mikroorganizmów są przydatne przy wyborze odpowiedniego stężenia stosowanego w badaniu oraz przy interpretacji wyników wskazujących na słabą biodegradowalność: zaleca się uwzględnienie kontroli hamowania, chyba że wiadomo, że badana substancja chemiczna nie hamuje aktywności mikrobiologicznej (zob. pkt 24).
ZAKRES STOSOWANIA METODY
11. Badanie ma zastosowanie do badanych substancji chemicznych rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych w wodzie, chociaż należy zapewnić dobrą dyspersję badanej substancji chemicznej. Stosując zalecany stosunek objętości fazy gazowej nad roztworem do objętości cieczy 1:2, można badać lotne chemikalia o stałej Henry'ego wynoszącej do 50 Pa.m3.mol-1, gdyż proporcja badanej substancji chemicznej w przestrzeni nad roztworem nie przekroczy 1 % (13). Mniejszą objętość fazy gazowej nad roztworem można zastosować przy badaniu chemikaliów, które są bardziej lotne, ale ich biodostępność może być ograniczona, zwłaszcza jeśli są słabo rozpuszczalne w wodzie. Użytkownicy muszą jednak dopilnować, aby stosunek objętości fazy gazowej nad roztworem do objętości cieczy oraz stężenie badanej substancji chemicznej były takie, że dostępna będzie wystarczająca ilość tlenu, by możliwa była całkowita biodegradacja tlenowa (np. należy unikać wysokiego stężenia substratu i niewielkiej objętości przestrzeni nad roztworem). Wytyczne w tej kwestii można znaleźć w (13) (23).
SUBSTANCJE ODNIESIENIA
12. Celem sprawdzenia procedury badania należy równolegle badać substancję odniesienia o znanej biodegradowalności. W tym celu można zastosować anilinę, benzoesan sodu lub glikol etylenowy przy badaniu rozpuszczalnych w wodzie badanych substancji chemicznych oraz 1-oktanol dla słabo rozpuszczalnych badanych substancji chemicznych (13). Biodegradacja tych chemikaliów musi wynieść > 60 % ThIC w ciągu 14 dni.
ODTWARZALNOŚĆ
13. W przewidzianym normą ISO badaniu międzylaboratoryjnym metody (17) uzyskano następujące rezultaty przy zastosowaniu zalecanych warunków, w tym badanej substancji chemicznej zawierającej 20 mg C/l.
| Badana substancja chemiczna | Średnia biodegradacja procentowa (28d) | Współczynnik zmienności (%) | Liczba laboratoriów |
| Anilina | 90 | 16 | 17 |
| 1-Oktanol | 85 | 12 | 14 |
Zmienność wewnętrzna badania (odtwarzalność) przy zastosowaniu aniliny była niska, a współczynniki zmienności nie przekraczały 5 % w prawie wszystkich rundach badania. W dwóch przypadkach, w których odtwarzalność była gorsza, większa zmienność wynikała prawdopodobnie z dużej produkcji IC w ślepych próbach. Odtwarzalność była gorsza dla 1-oktanolu, jednak nadal wynosiła mniej niż 10 % dla 79 % rund badania. Ta większa zmienność wewnętrzna badania mogła wynikać z błędów w dozowaniu, gdyż trzeba było wstrzyknąć niewielką objętość (3 do 4 μl) 1-oktanolu do szczelnie zamkniętych badanych butli. Wyższe współczynniki zmienności otrzymano by przy zastosowaniu niższych stężeń badanych substancji chemicznych, zwłaszcza stężeń mniejszych niż 10 mg C/l. Można to częściowo przezwyciężyć, redukując stężenie całkowitego węgla nieorganicznego (TIC) w inokulum.
14. W przeprowadzonym w UE badaniu międzylaboratoryjnym (24) pięciu środków powierzchniowo czynnych zawierających 10 mg C/l otrzymano następujące wyniki:
| Badana substancja chemiczna | Średnia biodegradacja procentowa (28d) | Współczynnik zmienności (%) | Liczba laboratoriów |
| Sulfonian tetrapropylenobenzenu | 17 | 45 | 10 |
| Sulfobursztynian diizook- tylu (anionowy) | 72 | 22 | 9 |
| Chlorek heksadecylotrimetylamoniowy(*) (kationowy) | 75 | 13 | 10 |
| Oksyetylenowany izononylofenol9 (niejonowy) | 41 | 32 | 10 |
| Kokamidopropylo Dimetylohydroksy Sulfobetaina (amfoteryczna) | 60 | 23 | 11 |
| (*) Dodano SiO2 celem neutralizacji toksyczności. |
Wyniki pokazują, że na ogół zmienność była wyższa dla środków powierzchniowo czynnych słabiej ulegających rozkładowi. Zmienność wewnętrzna badania wynosiła mniej niż 15 % w ponad 90 % przypadków, przy czym najwyższa dochodziła do 30-40 %.
Uwaga: Większość środków powierzchniowo czynnych nie stanowi pojedynczych odmian cząsteczkowych, ale raczej mieszaniny izomerów, homologów itp., które ulegają rozkładowi po różnym charakterystycznym okresie opóźnienia i z inną szybkością, co skutkuje "niejasnymi", osłabionymi krzywymi, tak że wartość progowa 60 % może nie zostać osiągnięta w 10-dniowym "oknie", nawet jeśli każda z poszczególnych odmian cząsteczkowych poddana badaniu osobno osiągnęłaby wartość > 60 % w ciągu 10 dni. Można to zaobserwować także w przypadku innych złożonych mieszanin.
OPIS METODY
Urządzenia
15. Zwykłe urządzenia laboratoryjne oraz:
a) szklane butelki na osocze, szczelnie zamknięte korkami z kauczuku butylowego i zaciskanymi uszczelkami aluminiowymi. Zalecany rozmiar to "125 ml" o łącznej objętości ok. 160 ml (w tym przypadku objętość każdej butelki powinna być znana jako 160 ± 1 ml). Można użyć mniejszego naczynia, jeżeli wyniki spełniają warunki opisane w pkt 66 i 67;
b) analizator węgla lub inny przyrząd (np. chromatograf gazowy) do pomiarów węgla nieorganicznego;
c) strzykawki o dużej precyzji do pobierania próbek gazowych i ciekłych;
d) wytrząsarka orbitalna w środowisku o kontrolowanej temperaturze;
e) Zaopatrzenie w powietrze wolne od CO2 - można je przygotować przeprowadzając powietrze przez granule wapna sodowanego lub stosując mieszaninę gazową 80 % N2/20 % O2 (fakultatywnie) (zob. pkt 28);
f) membranowe urządzenie filtracyjne o porowatości 0,20-0,45 μ m (fakultatywnie);
g) analizator węgla organicznego (fakultatywnie).
Odczynniki
16. W całym badaniu należy stosować odczynniki do analiz.
Woda
17. Należy stosować wodę destylowaną lub dejonizowaną, zawierającą ≤ 1 mg/l całkowitego węgla organicznego. Odpowiada to ≤ 5 % początkowej zawartości węgla organicznego wprowadzonej zalecaną dawką badanej substancji chemicznej.
Roztwory podstawowe na pożywkę mineralną
18. Roztwory podstawowe oraz pożywki mineralne są podobne do stosowanych w normie ISO 14593 (16) oraz w badaniach C.4 na "szybką biodegradowalność" (20). Zastosowanie większego stężenia chlorku amonu (2,0 g/l zamiast 0,5 g/l) powinno być konieczne jedynie w bardzo wyjątkowych przypadkach, np. kiedy stężenie badanej substancji chemicznej wynosi > 40 mg C/l. Roztwory podstawowe należy przechowywać w warunkach chłodniczych i usuwać po sześciu miesiącach lub wcześniej, jeśli wystąpią objawy strącania lub rozwoju mikroorganizmów. Należy przygotować następujące roztwory podstawowe:
a) diwodorofosforan potasu (KH2PO4) 8,50 g
wodorofosforan potasu, (K2HPO4) 21,75 g
wodorofosforan sodu dwuwodny (Na2HPO4.2H2O) 33,40 g
chlorek amonu (NH4Cl) 0,50 g
Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra. Wartość pH tego roztworu powinna wynosić 7,4 (± 0,2). Jeśli jest inaczej, należy przygotować nowy roztwór;
b) chlorek wapnia dwuwodny (CaCl2.2H2O) 36,40 g
Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra;
c) siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4.7H2O) 22,50 g
Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra;
d) chlorek żelaza(III) sześciowodny (FeCl3.6H20) 0,25 g
Rozpuścić w wodzie i dopełnić do 1 litra oraz dodać jedną kroplę stężonego HCl.
Przygotowanie pożywki mineralnej
19. Zmieszać 10 ml roztworu a) z ok. 800 ml wody (pkt 17), następnie dodać 1 ml roztworów b), c) i d) i dopełnić wodą do 1 litra (pkt 17).
Inne odczynniki
20. Stężony kwas ortofosforowy (H3PO4) (> 85 % w/v).
Roztwór 7M wodorotlenku sodu
21. Rozpuścić 280 g wodorotlenku sodu (NaOH) w 1 litrze wody (pkt 17). Określić stężenie DIC w tym roztworze i uwzględnić tę wartość przy obliczaniu wyników badania (zob. pkt 55 i 61), zwłaszcza w świetle kryterium ważności określonego w pkt 66 b). Przygotować nowy roztwór, jeśli stężenie DIC jest zbyt wysokie.
Badana substancja chemiczna
22. Przygotować roztwór podstawowy wystarczająco rozpuszczalnej w wodzie badanej substancji chemicznej w wodzie (pkt 17) lub w pożywce (pkt 19), najlepiej w stężeniu 100-krotnie większym niż ostateczne stężenie, które ma być zastosowane w badaniu; może być konieczne dostosowanie pH roztworu podstawowego. Roztwór podstawowy należy dodać do pożywki mineralnej, by uzyskać ostateczne stężenie węgla organicznego między 2 a 40 mg C/l, najlepiej 20 mg C/l. Jeśli zastosuje się stężenia mniejsze niż wymienione, uzyskana precyzja może ulec pogorszeniu. Rozpuszczalne i nierozpuszczalne chemikalia ciekłe można dodać bezpośrednio do naczyń za pomocą wysoce precyzyjnych strzykawek. Słabo rozpuszczalne i nierozpuszczalne badane substancje chemiczne mogą wymagać specjalnego podejścia (25). Do wyboru jest:
a) bezpośrednie dodanie znanych, zważonych ilości;
b) rozpraszanie ultradźwiękowe przed dodaniem;
c) dyspersja za pomocą środków emulgujących; wymagane jest określenie przed dodaniem, czy działają one hamująco, czy stymulująco na aktywność mikrobiologiczną;
d) adsorpcja ciekłych badanych substancji chemicznych lub rozpuszczenie w odpowiednim lotnym rozpuszczalniku, na obojętną pożywkę lub podłoże (np. filtr z włókna szklanego), następnie odparowanie rozpuszczalnika, jeśli został użyty, i bezpośrednie dodanie znanych ilości;
e) dodanie do pustego naczynia badawczego znanej objętości roztworu badanej substancji chemicznej w rozpuszczalniku łatwo przechodzącym w fazę lotną, a następnie odparowanie rozpuszczalnika.
Środki lub rozpuszczalniki użyte w lit. c), d) i e) należy zbadać pod kątem ewentualnego działania stymulującego lub hamującego dla aktywności mikrobiologicznej (zob. pkt 42b)).
Substancja odniesienia
23. Przygotować roztwór podstawowy (rozpuszczalnej) substancji odniesienia w wodzie (pkt 17), najlepiej w stężeniu 100-krotnie większym niż ostateczne stężenie, które ma być zastosowane (20 mg C/l) w badaniu.
Kontrola działania hamującego
24. Badane substancje chemiczne często nie wykazują istotnego rozkładu w warunkach stosowanych przy ocenianiu szybkiej biodegradowalności. Jedyną możliwą przyczyną jest to, że badana substancja chemiczna działa hamująco na inokulum w stężeniu, w którym jest stosowana w badaniu. Kontrolę działania hamującego można uwzględnić w projekcie badania celem ułatwienia identyfikacji (z perspektywy czasu) działania hamującego jako możliwej przyczyny lub czynnika przyczyniającego się do tego stanu rzeczy. Ewentualnie kontrola działania hamującego może wykluczyć takie interferencje i wykazać, że zerowy lub niewielki rozkład można przypisać jedynie brakowi podatności na działanie mikroorganizmów w warunkach, w których przeprowadza się badanie. Aby uzyskać informacje co do toksyczności badanej substancji chemicznej dla mikroorganizmów (tlenowych), należy przygotować roztwór w pożywce zawierający badaną substancję chemiczną i substancję odniesienia (pkt 19), każdą odpowiednio w tym samym stężeniu, w jakim jest dodawana (zob. ust 22 i 23).
Inokulum
25. Inokulum można uzyskać z różnych źródeł: osad czynny; odpływ z oczyszczalni ścieków (niechlorowany); wody powierzchniowe i gleby; lub z mieszaniny tychże (20). Należy sprawdzić aktywność biodegradacyjną źródła poprzez zastosowanie substancji odniesienia. Niezależnie od źródła nie należy stosować mikroorganizmów wcześniej narażonych na badaną substancję chemiczną, jeśli procedura ma być stosowana do badania szybkiej biodegradowalności.
Ostrzeżenie: Osad czynny, ścieki i odpływ z oczyszczalni ścieków zawierają czynniki chorobotwórcze i należy obchodzić się z nimi ostrożnie.
26. Z doświadczenia wynika, że optymalna objętość inokulum to taka, która:
- jest wystarczająca, by dać odpowiednią aktywność biodegradacyjną,
- rozkłada substancję odniesienia w określonym procentowo stopniu (zob. pkt 66),
- daje od 102 do 105 jednostek tworzących kolonię na mililitr w mieszaninie końcowej,
- zazwyczaj daje stężenie 4 mg/l zawiesiny ciał stałych w mieszaninie końcowej w przypadku zastosowania osadu czynnego; możliwe jest użycie stężeń do 30 mg/l, jednak mogą one znacznie zwiększyć produkcję CO2 naczyniach ślepej próby (26),
- wnosi mniej niż 10 % pierwotnego stężenia węgla organicznego, wprowadzanego przez badaną substancję chemiczną,
- wynosi na ogół 1-10 ml inokulum na 1 litr badanego roztworu.
Osad czynny
27. Świeżą próbkę osadu czynnego zbiera się z komory napowietrzania oczyszczalni ścieków lub urządzenia w skali laboratoryjnej, przerabiającego głównie ścieki domowe. W razie konieczności cząstki gruboziarniste należy usunąć w drodze odsiewania (np. stosując sito oczkowe o rozmiarze oczek 1 mm2), a osad należy utrzymywać w warunkach tlenowych aż do chwili użycia.
28. Ewentualnie zsedymentować lub odwirować (np. przy 1 100 × g przez 10 minut) po usunięciu wszystkich cząstek gruboziarnistych. Odrzucić supernatant. Można przemyć osad w roztworze mineralnym. Zawiesić stężony osad w pożywce mineralnej dla uzyskania stężenia 3-5 g zawiesiny ciał stałych/l. Następnie napowietrzać do wymaganego momentu.
29. Osad należy pobrać z prawidłowo działającej konwencjonalnej oczyszczalni ścieków. Jeżeli osad trzeba pobrać z oczyszczalni o wysokiej szybkości oczyszczania lub podejrzewa się zawartość inhibitorów, należy go przemyć. Zsedymentować lub odwirować ponownie zawieszony osad po energicznym wymieszaniu, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić przemyty osad w dalszej objętości pożywki mineralnej. Powtarzać tę procedurę do czasu, gdy uzna się, iż osad jest wolny od nadmiaru substratów lub inhibitorów.
30. Po osiągnięciu ponownego zawieszenia lub w przypadku osadu niepoddanego obróbce odstawić próbkę tuż przed jej użyciem celem ustalenia suchej masy ciał stałych w zawiesinie.
31. Inną możliwością jest homogenizacja osadu czynnego (3-5 g zawiesiny ciał stałych/l). Rozdrobnić osad w homogenizatorze Waringa przy średniej szybkości przez 2 minuty. Zsedymentować rozdrobniony osad przez 30 minut lub dłużej, w razie potrzeby, i zdekantować ciecz do użycia jako inokulum w ilości ok. 10 ml/l pożywki mineralnej.
32. Jeszcze większą redukcję wydzielania CO2 w ślepej próbie można osiągnąć napowietrzając osad w nocy powietrzem wolnym od CO2. Jako stężenia inokulum w tym badaniu należy zastosować 4 mg/l ciał stałych z osadu czynnego (13).
Ścieki oczyszczone
33. Ewentualnie inokulum można uzyskać ze ścieków oczyszczonych z oczyszczalni ścieków lub urządzenia w skali laboratoryjnej przyjmującego głównie ścieki domowe. Należy utrzymywać próbkę w warunkach tlenowych i użyć w dniu pobrania lub w razie potrzeby wstępnie kondycjonować. Ścieki należy przefiltrować przez filtr gruboziarnisty celem usunięcia grubych cząstek stałych, a także zmierzyć wartość pH.
34. Celem zmniejszenia zawartości IC filtrat napowietrza się powietrzem wolnym od CO2 (pkt 15-e) przez 1 godzinę, utrzymując pH na poziomie 6,5 za pomocą kwasu ortofosforowego (pkt 20). Wartość pH przywraca się do pierwotnego poziomu za pomocą wodorotlenku sodu (pkt 21), a po sedymentacji przez ok. 1 godzinę odpowiednią objętość supernatantu pobiera się do inokulacji. Wspomniana procedura napowietrzania zmniejsza zawartość IC w inokulum. Np. gdy jako inokulum zastosowano maksymalną zalecaną objętość przefiltrowancyh, napowietrzonych ścieków (100 ml) na litr, ilość IC obecnego w naczyniach kontrolnej ślepej próby kształtowała się w zakresie między 0,4 a 1,3 mg/l (14), co odpowiada 2-6,5 % C w badanej substancji chemicznej przy zawartości 20 mg C/l i 4-13 % przy zawartości 10 mg C/l.
Wody powierzchniowe
35. Pobiera się próbkę odpowiedniej wody powierzchniowej. Należy ją utrzymywać w warunkach tlenowych i użyć w dniu pobrania. Jeżeli to konieczne, należy zatężyć próbkę poprzez filtrację lub odwirowanie. Objętość inokulum do zastosowania w każdym z naczyń badawczych powinna spełniać kryteria podane w pkt 26.
Gleby
36. Pobiera się próbkę odpowiedniej gleby z głębokości do 20 cm poniżej powierzchni gleby. Kamienie, resztki roślin i bezkręgowce należy usunąć z próbki gleby przed przesianiem jej przez sito o oczkach 2 mm (jeśli próbka jest zbyt wilgotna, by można ją było przesiać natychmiast, wówczas należy częściowo wysuszyć ją powietrzem, aby ułatwić przesiewanie). Należy ją utrzymywać w warunkach tlenowych i użyć w dniu pobrania. (Jeśli próbka jest transportowana w luźno zawiązanej torbie polietylenowej, można ją przechowywać w torbie w temperaturze od 2 do 4 °C przez okres do jednego miesiąca).
Wstępne przygotowanie inokulum
37. Inokulum może być wstępnie kondycjonowane do warunków eksperymentalnych, lecz nie wstępnie adaptowane do badanej substancji chemicznej. Wstępne kondycjonowanie może zmniejszyć wydzielanie CO2 w ślepej próbie. Wstępne kondycjonowanie obejmuje napowietrzanie osadu czynnego po rozpuszczeniu w pożywce do 30 mg/l wilgotnym powietrzem wolnym od CO2 przez maksymalnie 5-7 dni w temperaturze badania.
PROCEDURA BADANIA
Liczba butli
38. Liczba butli (pkt 15-a) potrzebnych do badania będzie zależna od częstotliwości analizy i czasu trwania badania.
39. Zaleca się poddawanie analizie trzech butli w wystarczającej liczbie odstępów czasowych, tak aby można było zidentyfikować 10-dniowe okno. Na koniec badania analizuje się co najmniej pięć badanych butli (pkt 15-a) z zestawów a), b) i c) (zob. pkt 42), aby umożliwić obliczenie przedziałów ufności wynoszących 95 % w odniesieniu do średniej wartości procentowej biodegradacji.
Zaszczepiona pożywka
40. Inokulum stosuje się w stężeniu 4 mg/l cząstek stałych osadu czynnego. Bezpośrednio przed użyciem należy przygotować wystarczającą ilość zaszczepionej pożywki poprzez dodanie na przykład 2 ml odpowiednio spreparowanego osadu czynnego (pkt 27-32) w dawce 2 000 mg/l do 1 litra pożywki mineralnej (pkt 19). W przypadku wykorzystania ścieków oczyszczonych należy dodać maksymalnie 100 ml odpływu (pkt 33) do 900 ml pożywki mineralnej (pkt 19) i rozcieńczyć pożywką do objętości 1 litra.
Przygotowanie butli
41. Podwielokrotności zaszczepionej pożywki rozdziela się do replikowanych butli, aby zapewnić stosunek objętości fazy gazowej nad roztworem do objętości cieczy wynoszący 1:2 (np. dodać 107 ml do butli o pojemności 160 ml). Można zastosować inne proporcje - zob. ostrzeżenie w pkt 11. Podczas korzystania z każdego rodzaju inokulum należy dopilnować, aby zaszczepiona pożywka była w wystarczającym stopniu wymieszana, co ma na celu zapewnienie równego rozdzielenia cieczy między butle do badania.
42. Przygotowuje się zestawy butli (pkt 15a) zawierające następujące elementy:
a) naczynia do badania (oznaczone jako FT) zawierające badaną substancję chemiczną;
b) próby ślepe (oznaczone jako FB) zawierające wyłącznie pożywkę do badania wraz z inokulum; należy również dodać wszelkie substancje chemiczne, rozpuszczalniki, środki lub filtry z włókna szklanego użyte do wprowadzenia badanej substancji chemicznej do naczynia do badania;
c) naczynia (oznaczone jako FC) zawierające substancję odniesienia na potrzeby sprawdzenia procedury;
d) w razie potrzeby naczynia (oznaczone jako FI) służące do sprawdzenia możliwych skutków hamujących badanej substancji chemicznej, zawierające zarówno badaną substancję chemiczną, jak i substancję odniesienia w takim samym stężeniu (pkt 24) jak odpowiednio w butlach FT i FC;
e) naczynia (oznaczone jako FS) służące do sprawdzenia możliwego abiotycznego rozkładu jak a) plus 50 mg/l HgCl2 lub wysterylizowane w inny sposób (np. poprzez autoklawowanie).
43. Rozpuszczalne w wodzie badane substancje chemiczne i substancje odniesienia dodaje się jako wodne roztwory podstawowe (pkt 22, 23 i 24), aby uzyskać stężenie wynoszące 10-20 mg C/l.
44. Nierozpuszczalne badane substancje chemiczne i nierozpuszczalne substancje odniesienia dodaje się do butli w różny sposób (zob. pkt 22a-e), w zależności od charakteru badanej substancji chemicznej, albo przed dodaniem zaszczepionej pożywki, albo później - zależnie od metody postępowania z badaną substancją chemiczną. W przypadku korzystania z jednej z procedur określonych w pkt 22a-e, butle na potrzeby ślepej próby FB (pkt 42b) należy potraktować w podobny sposób, lecz z pominięciem badanej substancji chemicznej lub substancji odniesienia.
45. Lotne badane substancje chemiczne należy wstrzyknąć do szczelnie zamkniętych butli (pkt 47) za pomocą mikrostrzykawki. Dawkę oblicza się w oparciu o wstrzykniętą objętość oraz gęstość badanej substancji chemicznej.
46. W razie konieczności do naczyń należy dodać wody, aby uzyskać taką samą objętość cieczy w każdym naczyniu. Trzeba zagwarantować, że stosunek objętości fazy gazowej nad roztworem do objętości cieczy (zazwyczaj 1:2) i stężenie badanej substancji chemicznej były takie, by w fazie gazowej była dostępna wystarczająca ilość tlenu, aby umożliwić całkowitą biodegradację.
47. Następnie wszystkie butle szczelnie się zamyka, na przykład przykrywką z kauczuku butylowego i aluminiową nakrętką. Lotne badane substancje chemiczne należy dodać na tym etapie (pkt 45). Jeżeli spadek stężenia rozpuszczalnego węgla organicznego w roztworze testowym ma być monitorowany, a analizy czasu zerowego mają być przeprowadzone dla wstępnego stężenia węgla nieorganicznego (sterylne kontrole, pkt 42) lub innych wyznaczników, należy odjąć odpowiednią próbkę z naczynia do badania. To naczynie do badania i jego zawartość następnie odrzuca się.
48. Szczelnie zamknięte butle umieszcza się na wytrząsarce obrotowej (pkt 15d), ustawiając wystarczającą szybkością wstrząsania, aby zawartość butli była dobrze wymieszana i utrzymywana w zawiesinie (np. 150-200 obr./min) i inkubuje w ciemności w temperaturze 20 °C, którą należy utrzymywać z maksymalnym odchyleniem ± 1 °C.
Pobieranie próbek
49. Schemat pobierania próbek będzie zależał od okresu zastoju i szybkości biodegradacji badanej substancji chemicznej w ujęciu kinetycznym. Butle są przeznaczane do analizy w dniu pobierania próbek, który powinien przypadać przynajmniej raz w tygodniu lub częściej (np. dwa razy w tygodniu), jeśli potrzebna jest pełna krzywa rozkładu. Wymaganą liczbę replikowanych butli, odpowiadających butlom FT, FB i FC oraz FI i FS, jeżeli są używane, zabiera się z wytrząsarki (zob. pkt 42). Zazwyczaj badanie trwa 28 dni. Jeśli krzywa biodegradacji wskazuje na to, że plateau osiągnięto przed 28. dniem, wówczas badanie można zakończyć wcześniej niż 28. dnia. Należy pobrać próbki z pięciu butli przeznaczonych na 28. dzień badania do analizy i wykorzystać wyniki do obliczenia granic ufności lub współczynnika zmienności wartości procentowej biodegradacji. Z butli na potrzeby kontroli dotyczących hamowania i abiotycznego rozkładu nie trzeba pobierać próbek tak często jak z innych butli - wystarczy w 1. i 28. dniu.
Analiza węgla nieorganicznego
50. Wytwarzanie CO2 w butlach określa się poprzez pomiar wzrostu stężenia węgla nieorganicznego podczas inkubacji. Istnieją dwie dostępne metody zalecane na potrzeby pomiaru ilości węgla nieorganicznego wytworzonej w ramach badaniu. Opisano je bezpośrednio poniżej. Ponieważ metody mogą dawać nieco odmienne wyniki, w jednej rundzie badania należy korzystać tylko z jednej z nich.
51. Metodę a) zaleca się, jeżeli pożywka może zawierać pozostałości np. bibuły filtracyjnej z włókna szklanego lub nierozpuszczalną badaną substancję chemiczną. Analizę tę można wykonać za pomocą chromatografu gazowego, jeżeli analizator węgla jest niedostępny. Ważne jest, aby podczas analizy gazu z fazy gazowej nad roztworem temperatura butli była równa temperaturze badania lub zbliżona do niej. Metoda b) może być łatwiejsza dla laboratoriów wykorzystujących do pomiaru węgla nieorganicznego analizatory węglowe. Ważne jest, aby roztwór wodorotlenku sodu (pkt 21) używany do przekształcenia CO2 w węglan był świeżo przygotowany lub by jego zawartość węgla nieorganicznego była znana, tak aby można było uwzględnić go przy obliczaniu wyników badania (zob. pkt 66-b).
Metoda a): zakwaszenie do pH < 3
52. Przed rozpoczęciem każdej partii analiz analizator węgla nieorganicznego jest kalibrowany przy użyciu odpowiedniej normy dotyczącej węgla nieorganicznego (np. 1 % w/w CO2 w N2). Stężony kwas ortofosforowy (pkt 20) wstrzykuje się przez korek każdej butli, z których pobiera się próbki, aby obniżyć pH pożywki do < 3 (np. dodając 1 ml do 107 ml pożywki do badania). Butle ponownie umieszcza się w wytrząsarce. Po godzinie wytrząsania w temperaturze badania butle są usuwane z wytrząsarki, podwielokrotności (np. 1 ml) gazu są pobierane z fazy gazowej nad roztworem w każdej butli i wstrzykiwane do analizatora węgla nieorganicznego. Zmierzone stężenia węgla nieorganicznego rejestruje się w mg C/l.
53. Zgodnie z zasadą tej metody po zakwaszeniu do pH < 3 i pozostawieniu do ustalenia stanu równowagi w temperaturze 20 °C stała równowagi rozmieszczenia CO2 między fazami ciekłą a gazową w butlach do badania wynosi 1,0, jeżeli jest mierzona jako stężenie (13). Należy to co najmniej raz wykazać dla układu badawczego w następujący sposób:
Przygotować butle zawierające 5 i 10 mg/l węgla nieorganicznego, wykorzystując roztwór bezwodnego węglanu sodu (Na2CO3) w wolnej od CO2 wodzie przygotowanej poprzez zakwaszenie wody do pH 6,5 za pomocą stężonego kwasu ortofosforowego (pkt 20), napowietrzenie przez noc powietrzem niezawierającym CO2 i podniesienie pH do poziomu obojętnego za pomocą zasady. Należy dopilnować, aby stosunek objętości fazy gazowej nad roztworem do objętości cieczy był taki sam jak w badaniu (np. 1:2). Należy zakwasić i pozostawić do ustalenia stanu równowagi w sposób opisany w pkt 52, a następnie zmierzyć stężenie węgla nieorganicznego w fazie gazowej nad roztworem i w fazie ciekłej. Trzeba sprawdzić, czy oba stężenia są jednakowe w dopuszczalnych granicach błędu badania. Jeżeli nie, operator powinien dokonać przeglądu procedur. Tej kontroli rozmieszczenia węgla nieorganicznego pomiędzy fazami ciekłą i gazową nie trzeba przeprowadzać za każdym razem, gdy wykonuje się badanie. Przypuszczalnie można byłoby przeprowadzać ją podczas kalibracji.
54. Jeżeli ma zostać zmierzone usuwanie rozpuszczalnego węgla organicznego (wyłącznie w przypadku badanych substancji chemicznych rozpuszczalnych w wodzie), próbki należy pobrać z fazy ciekłej z oddzielnych (niezakwaszonych) butli, przefiltrować przez filtr membranowy i wstrzyknąć do analizatora rozpuszczalnego węgla organicznego. W razie konieczności można te butle wykorzystać do innych analiz, aby zmierzyć biodegradację pierwotną.
Metoda b): przekształcenie CO2 w węglan
55. Przed każdą serią analiz analizator węgla nieorganicznego jest kalibrowany przy użyciu odpowiedniej normy -na przykład roztworu wodorowęglanu sodu (NaHCO3) w wodzie wolnej od CO2 (zob. pkt 53) w przedziale od 0 do 20 mg/l jako węgiel nieorganiczny. Roztwór wodorotlenku sodu (7M, pkt 21) (np. 1 ml na 107 ml pożywki) wstrzykuje się przez przykrywkę każdej butli, z których pobiera się próbki, a butle wytrząsa się przez godzinę w temperaturze badania. Należy użyć tego samego roztworu NaOH na wszystkich butlach przeznaczonych na określony dzień, lecz niekoniecznie podczas każdego pobierania próbek w czasie trwania badania. Jeżeli przy każdym pobieraniu próbek potrzebne są bezwzględne ślepe wartości węgla nieorganicznego, oznaczanie węgla nieorganicznego w roztworze NaOH będzie niezbędne przy każdym użyciu tego roztworu. Butle wyjmuje się z wytrząsarki i odstawia do ustalenia. Z każdego naczynia pobiera się strzykawką odpowiednie objętości (np. 50 do 1 000 μl) fazy ciekłej. Próbki wstrzykuje się do analizatora węgla nieorganicznego i rejestruje stężenia. Należy dopilnować, aby używany analizator był odpowiednio wyposażony do analizowania próbek zasadowych otrzymywanych w ramach tej metody.
56. Zgodnie z zasadą tej metody po dodaniu zasady i wytrząsaniu stężenie węgla nieorganicznego w fazie gazowej nad roztworem jest nieznaczne. Należy to co najmniej raz skontrolować dla układu badawczego, stosując normy dotyczące węgla nieorganicznego, poprzez dodanie zasady, pozostawienie do ustalenia stanu równowagi i zmierzenie stężenia węgla nieorganicznego w fazie gazowej nad roztworem i w fazie ciekłej (zob. pkt 53). Stężenie w fazie gazowej nad roztworem powinno być zbliżone do zera. Tej kontroli praktycznie całkowitej absorpcji CO2 nie trzeba przeprowadzać za każdy razem, gdy przeprowadza się badanie.
57. Jeżeli ma zostać zmierzone usuwanie rozpuszczalnego węgla organicznego (wyłącznie w przypadku badanych substancji chemicznych rozpuszczalnych w wodzie), próbki należy pobrać z fazy ciekłej z oddzielnych (niezawierających dodatku zasady) butli, przefiltrować przez filtr membranowy i wstrzyknąć do analizatora rozpuszczalnego węgla organicznego. W razie konieczności można te butle wykorzystać do innych analiz, aby zmierzyć biodegradację pierwotną.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Obliczanie wyników
58. Przy założeniu 100 % mineralizacji badanej substancji chemicznej na CO2, nadwyżka ThIC wytworzonego w ślepych próbach kontrolnych jest równa TOC dodanemu do każdej butli do badania na początku badania, czyli:
ThIC = TOC
Całkowita masa (mg) nieorganicznego węgla (TIC) w każdej butli wynosi:
TIC = (mg C w plynie + mg C w fazie gazowej nad roztworem) = (VL × CL) + (VH × CH) równanie [1]
gdzie:
VL = objętość płynu w butli (w litrach),
CL = stężenie IC w płynie (mg/l w przeliczeniu na węgiel),
VH = objętość fazy gazowej nad roztworem (w litrach),
CH = stężenie IC w fazie gazowej nad roztworem (mg/l w przeliczeniu węgiel).
Obliczenia TIC na potrzeby dwóch metod analitycznych stosowanych do pomiaru węgla nieorganicznego w opisanym tu badaniu omówiono w pkt 60 i 61 poniżej. Procentową biodegradację (% D) w każdym przypadku uzyskuje się w następujący sposób:
równanie [2]
gdzie:
TICt = mg TIC w butli do badania w czasie t,
TICb = średni mg TIC w butlach zawierających próby ślepe w czasie t,
TOC = mg TOC dodany na początku badania do naczynia do badania.
Procentową biodegradację % D oblicza się dla butli do badania (FT), butli odniesienia (FC) oraz, jeśli zastosowano, butli do monitorowania działania hamującego (FI), na podstawie odpowiednich ilości TIC wytworzonego do czasu każdego pobierania próbek.
59. W przypadku znaczącego wzrostu zawartości TIC w kontrolach sterylnych (FS) w czasie trwania badania można uznać, że zaszedł abiotyczny rozkład badanej substancji chemicznej i należy to uwzględnić w obliczeniach D w równaniu [2].
Zakwaszanie do pH < 3
60. Jako że zakwaszenie do pH < 3 i ustalenie równowagi skutkują wyrównaniem się stężenia TIC w fazie płynnej i gazowej, jedynie stężenie IC w fazie gazowej wymaga pomiaru. Tym samym z równania [1] TIC = (VL + VH) × CH = VB × CH, gdzie VB = objętość butli z surowicą.
Przekształcenie CO2 w węglan
61. W ramach tej metody obliczenia wykonuje się tak jak w równaniu [1], ale nie uwzględnia się nieznacznej ilości IC w fazie gazowej, czyli VH × CH = 0, a TIC = VL × CL.
Prezentacja wyników
62. Krzywą biodegradacji uzyskuje się poprzez wykreślenie procentowej biodegradacji D w czasie inkubacji oraz, jeśli jest to możliwe, wskazuje się fazę zastoju, fazę biodegradacji, 10-dniowe "okno" i fazę plateau, czyli fazę, w której osiągnięto maksymalny rozkład, a krzywa biodegradacji wyrównała się. Jeśli uzyskano porównywalne wyniki dla równoległych naczyń do badania FT (& 20 % różnicy), wykreśla się średnią krzywą (zob. dodatek 2, rysunek 1); jeśli nie - wykreśla się krzywe dla każdego naczynia. Określa się średnią wartość procentowej biodegradacji w fazie plateau lub dokonuje się oszacowania najwyższej wartości (np. kiedy krzywa spada w fazie plateau), ale istotne jest, by mieć na uwadze, że w tym drugim przypadku wartość ta nie może być wartością odstającą. W sprawozdaniu z badania należy wskazać maksymalny stopień biodegradacji jako "stopień biodegradacji badanej substancji chemicznej". Jeśli liczba naczyń do badania nie była wystarczająca do wskazania fazy plateau, zmierzone dane z ostatniego dnia badania wykorzystuje się do obliczenia wartości średniej. Taka ostatnia wartość, będąca średnią pięciu replikatów, pozwala na wskazanie dokładności, z jaką określono wartość procentową biodegradacji. Należy także przedstawić wartość uzyskaną na koniec okresu 10-dniowego "okna".
63. W taki sam sposób wykreśla się krzywą dla substancji odniesienia, FC, oraz, jeśli je zastosowano, kontroli eliminacji abiotycznej, FS, i kontroli działania hamującego, FI.
64. Ilości TIC obecne w ślepych próbach kontrolnych (FB) odnotowuje się jako te w kolbach FS (kontrola abiotyczna), jeśli takie naczynia uwzględniono w badaniu.
65. Należy obliczyć D dla naczyń FI, w oparciu o teoretyczny wynik IC spodziewany jedynie ze składnika odniesienia mieszaniny. Jeśli, w dniu 28. [(DFC(1) - DFI(2))/DFC] × 100 > 25 %, można założyć, że badana substancja chemiczna zahamowała działanie inokulum, co może wiązać się z niskimi wartościami DFT uzyskanymi w warunkach badania. W takim przypadku badanie można powtórzyć z wykorzystaniem niższego badanego stężenia, a najlepiej zmniejszając DIC w inokulum oraz TIC powstały w ślepych próbach kontrolnych, jako że w przeciwnym wypadku mniejsze stężenie zmniejszy dokładność metody. Można także wykorzystać inne inokulum. Jeśli w butelkach FS (abiotyczne) obserwuje się znaczny wzrost (> 10 %) ilości TIC, mogły zajść procesy rozkładu abiotycznego.
Ważność wyników
66. Badanie uznaje się za ważne, jeśli:
a) średni procentowy rozkład w naczyniach FC zawierających substancję odniesienia wynosi > 60 % do 14. dnia inkubacji; oraz
b) średnia ilość TIC obecnego w ślepych próbach kontrolnych FB na koniec badania wynosi > 3 mg C/l.
Jeśli te pułapy nie zostały osiągnięte, badanie należy powtórzyć z wykorzystaniem inokulum z innego źródła lub należy dokonać przeglądu procedur. Na przykład, jeśli problem stanowi wysoka wartość IC wytworzonego w ślepej próbie, należy zastosować procedurę opisaną w pkt 27-32.
67. Jeśli badana substancja chemiczna nie osiąga 60 % ThIC oraz wykazano, że nie ma działania hamującego (pkt 65), badanie można powtórzyć ze zwiększonym stężeniem inokulum (do 30 mg/l osadu czynnego i 100 ml wcieku/l) lub inokulami z innych źródeł, zwłaszcza jeśli rozkład mieścił się w przedziale 20 do 60 %.
Interpretacja wyników
68. Biodegradacja > 60 % ThIC w ciągu 10-dniowego "okna" w opisanym tu badaniu pokazuje, że badana substancja chemiczna ulega szybkiej biodegradacji w warunkach tlenowych.
69. Jeśli nie osiągnięto wartości progowej 60 % ThIC, należy określić wartość pH w pożywkach w butlach, których odczynu nie zmieniono na kwaśny ani zasadowy; wartość poniżej 6,5 może wskazywać, że doszło do nitryfikacji. W takim przypadku badanie należy powtórzyć z zastosowaniem roztworu buforowego o wyższym stężeniu.
Sprawozdanie z badania
70. Należy sporządzić tabelę z % D dla każdej butli do badania (FT), butli odniesienia (Fc) oraz, jeśli zastosowano, kontrolnej butli działania hamującego (FI) dla każdego dnia pobierania próbek. Jeśli dla butli z replikatami uzyskano porównywalne wyniki, należy wykreślić krzywą średniej % D w czasie. Należy odnotować wartości TIC w ślepych próbach kontrolnych (FB) oraz w sterylnych próbach kontrolnych (FS), a także DOC lub inne wyznaczniki oraz ich procentowe usuwanie.
71. Należy określić średnią wartość % D w fazie plateau lub zastosować najwyższą wartość, jeśli krzywa biodegradacji spada w fazie plateau, oraz przedstawić ją jako "stopień biodegradacji badanej substancji chemicznej". Ważne, by upewnić się, że w drugim przypadku najwyższa wartość nie jest wartością odstającą.
72. Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
Badana substancja chemiczna
- nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna, numer w rejestrze CAS, wzór strukturalny i istotne właściwości fizykochemiczne,
- czystość (zanieczyszczenia) badanej substancji chemicznej.
Warunki badania
- odniesienie do niniejszej metody badawczej,
- opis zastosowanego układu badawczego (np. objętość naczynia, stosunek przestrzeni nadpowierzchniowej do płynu, metoda mieszania itp.),
- wprowadzenie badanej substancji chemicznej oraz substancji odniesienia do układu badawczego; zastosowane badane stężenie i ilość węgla dawkowana do każdej butli do badania, wszelkie zastosowane rozpuszczalniki,
- szczegółowe informacje na temat zastosowanego inokulum, wszelkiego wstępnego poddawania działaniu substancji i wstępnego przygotowywania,
- temperatura inkubacji,
- walidacja zasady analizy IC,
- główne cechy charakterystyczne zastosowanego analizatora IC (oraz wszelkie inne zastosowane metody analityczne),
- liczba replikatów.
Wyniki
- dane surowe i obliczone wartości dotyczące biodegradowalności w formie tabeli,
- wykres procentowego rozkładu w czasie dotyczący badanej substancji chemicznej i substancji odniesienia, faza zastoju, faza rozkładu, 10-dniowe "okno" oraz nachylenie krzywej,
- procentowe usuwanie w fazie plateau, na koniec badania oraz po okresie 10-dniowego "okna",
- uzasadnienie w przypadku ewentualnego odrzucenia wyników badania,
- wszelkie inne fakty, które są istotne dla przeprowadzonej procedury,
- omówienie wyników.
BIBLIOGRAFIA:
(1) Rozdział C.4 niniejszego załącznika: Oznaczenie biodegradowalności - badanie wydzielania CO2 (metoda C.4-C).
(2) Sturm RN (1973). Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test for predicting rate and ultimate biodegradation. J. A. Oil Chem. Soc. 50: 159-167.
(3) Larson RJ (1979). Estimation of biodegradation potential of xenobiotic organic chemicals. Appl Env. Microbiol. 38: 1153-1161.
(4) Larson RJ, Hansmann MA i Bookland EA (1996). Carbon dioxide recovery in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants, Chemosphere 33: 1195-1210.
(5) ISO 9439 (1990; zmienione w 1999). Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium - Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
(6) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3110 Carbon dioxide evolution test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
(7) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substances Washington, DC.
(8) Gledhill WE (1975). Screening test for assessment of biodegradability: Linear alkyl benzene sulfonate. Appl Microbiol. 30: 922-929.
(9) Weytjens D, Van Ginneken I i Painter HA (1994). The recovery of carbon dioxide in the Sturm test for ready biodegradability. Chemosphere 28: 801-812.
(10) Ennis DM i Kramer A (1975). A rapid microtechnique for testing biodegradability of nylons and polyamides. J. Food Sci. 40: 181-185.
(11) Ennis DM, Kramer A, Jameson CW, Mazzoccki PH and Bailey PH (1978). Appl. Env. Microbiol. 35: 51-53.
(12) Boatman RJ, Cunningham SL i Ziegler DA (1986). A method for measuring the biodegradation of organic chemicals, Env. Toxicol. Chem. 5: 233-243.
(13) Struijs J i Stoltenkamp J (1990). Head space determination of evolved carbon dioxide in a biodegradability screening test. Ecotox. Env. Safety 19: 204-211.
(14) Birch RR i Fletcher RJ (1991). The application of dissolved inorganic carbon measurements to the study of aerobic biodegradability. Chemosphere 23: 507-524.
(15) Birch RR, Biver C, Campagna R, Gledhill WE, Pagga U, Steber J, Reust H, i Bontinck WJ (1989). Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19: 1527-1550.
(16) ISO 14593, (1999) Water Quality - Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in an aerobic mediummethod by analysis of inorganic carbon in sealed vessels (C02 headspace test).
(17) Battersby NS (1997). The ISO headspace C02 biodegradation test, Chemosphere 34: 1813-1822.
(18) US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed vessel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance Washington, DC.
(19) Battersby NS, Ciccognani D, Evans MR, King D, Painter HA, Peterson DR i Starkey M (1999). An "inherent" biodegradability test for oil products: description and results of an international ring test. Chemosphere 38: 3219-3235.
(20) Rozdział C.4 niniejszego załącznika: Oznaczenie biodegradowalności.
(21) OECD (1988). OECD Ringtest of methods for determining ready biodegradability: Chairman's report (M. Hashimoto; MITI) and final report (M. Kitano i M. Takatsuki; CITI). Paryż.
(22) Rozdział 11 niniejszego załącznika, Badanie zahamowania oddychania osadu czynnego.
(23) Struijs J, Stoltenkamp-Wouterse MJ i Dekkers ALM (1995). A rationale for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests. Biodegradation 6: 319-327.
(24) UE (1999). Ringtest of the ISO Headspace CO2 method: application to surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697, Water Research Centre, May 1999, Medmenham, SL7 2HD, Zjednoczone Królestwo.
(25) ISO 10634 (1996) Water Quality - Guidance for the preparation and treatment of poorly watersoluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
______
(1) Procentowy rozkład w naczyniu FC zawierającym substancję odniesienia.
(2) Procentowy rozkład w naczyniu FI.
Dodatek 1
SKRÓTY I DEFINICJE
IC: węgiel nieorganiczny
ThCO2: teoretyczny dwutlenek węgla (mg) to ilość dwutlenku węgla obliczona jako wytworzona ze znanej lub zmierzonej zawartości węgla w badanej substancji chemicznej, przy pełnej mineralizacji; wyrażana także jako mg dwutlenku węgla wydzielonego na mg badanej substancji chemicznej.
DOC: rozpuszczony węgiel organiczny to węgiel organiczny obecny w roztworze lub taki, który przechodzi przez filtr o średnicy 0,45 mikrometra lub pozostaje w supernatancie po odwirowaniu przy ok. 4 000 g (około 40 000 m sec-2) przez 15 min.
DIC: rozpuszczony węgiel nieorganiczny
ThIC: teoretyczny węgiel nieorganiczny
TIC: całkowity węgiel nieorganiczny
Ulegający szybkiej biodegradacji: arbitralna klasyfikacja substancji chemicznych, które spełniają kryteria pewnych określonych badań przesiewowych dotyczących ostatecznej biodegradacji; badania te są tak rygorystyczne, iż zakłada się, że takie substancje chemiczne szybko i w pełni ulegną biodegradacji w środowisku wodnym w warunkach tlenowych.
10-dniowe "okno": 10 dni bezpośrednio po osiągnięciu 10 % biodegradacji.
Biodegradowalność naturalna: klasyfikacja substancji chemicznych, w przypadku których istnieją jednoznaczne dowody na biodegradację (pierwotną lub ostateczną) wynikające z jakiegokolwiek badania biodegradowalności.
Ostateczna biodegradacja tlenowa: stopień rozkładu osiągnięty, kiedy badana substancja chemiczna jest w pełni zutylizowana przez mikroorganizmy w wyniku wytwarzania dwutlenku węgla, wody, soli mineralnych i nowych elementów komórek (biomasa).
Mineralizacja: całkowity rozkład organicznej substancji chemicznej na CO2 i H2O w warunkach tlenowych, oraz na CH4, CO2 i H2O w warunkach beztlenowych.
Faza zastoju: czas od początku badania do czasu aklimatyzacji lub adaptacji mikroorganizmów rozkładających oraz do czasu zwiększenia się stopnia biodegradacji badanej substancji chemicznej lub materii organicznej do wykrywalnego poziomu (np. 10 % maksymalnej teoretycznej biodegradacji lub mniej, w zależności od dokładności techniki pomiaru).
Faza rozkładu: czas od zakończenia okresu zastoju do czasu osiągnięcia 90 % maksymalnego stopnia rozkładu.
Faza plateau: faza, podczas której osiągnięto maksymalny rozkład, a krzywa biodegradacji wyrównała się.
Badana substancja chemiczna: jakakolwiek substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.
Dodatek 2
Przykładowa krzywa biodegradacji
Rysunek 1
Biodegradacja 1-oktanolu w ramach badania CO2 w fazie gazowej nad roztworem
Glosariusz:
Biodegradacja
Faza rozkładu
Maksymalny stopień biodegradacji
Faza plateau
10-dniowe "okno"
Czas przeprowadzania badania (dni)
C. 30. BIOAKUMULACJA W SKĄPOSZCZETACH LĄDOWYCH
WSTĘP
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD nr 317 (OECD TG 317) (2010). W odniesieniu do metod badawczych dotyczących wpływu na środowisko metodę "Biokoncentracja: badanie ryb w warunkach przepływu" (rozdział C.13 niniejszego załącznika (49)) oraz metodę "Bioakumulacja w bentosowych skąposzczetach żyjących w osadzie" (53) opublikowano odpowiednio w 1996 i 2008 r. Ekstrapolacja danych dotyczących bioakumulacji w gatunkach wodnych na organizmy lądowe, takie jak dżdżownice, jest trudna, a często w ogóle niemożliwa. Do oceny bioakumulacji substancji chemicznych w glebie stosuje się obecnie modele obliczeniowe oparte na lipofilności badanej substancji chemicznej, np. (14) (37), na przykład w wytycznych technicznych UE (19). Potrzeba opracowania metody badawczej specyficznej dla danego ustroju została już poruszona, np. (55). Taka metoda jest w szczególności istotna w ocenie zatrucia wtórnego w lądowych łańcuchach pokarmowych (4). Istnieje kilka krajowych metod badawczych, za pomocą których bada się kwestię bioakumulacji w organizmach innych niż ryby, np. (2) i (72). Metodę pomiaru bioakumulacji z zanieczyszczonych gleb w dżdżownicach (Eisenia fetida, Savigny) i wazonkowcowatych opracowało Amerykańskie Stowarzyszenie Badań i Materiałów (ASTM) (3). Uznana na scenie międzynarodowej metoda określania bioakumulacji w glebie wzbogaconej zwiększy efektywność oceny ryzyka związanego z obecnością substancji chemicznych w ekosystemach lądowych, np. (25) (29).
2. Bezkręgowce spożywające glebę są narażone na związane w glebie substancje chemiczne. Wśród takich zwierząt są skąposzczety lądowe, które odgrywają ważną rolę dla struktury i funkcji gleb (15) (20). Skąposzczety lądowe żyją w glebie i częściowo na powierzchni gleby (zwłaszcza w ściółce); często stanowią najliczniejszą grupę gatunków w biomasie (54). Przyczyniając się do bioturbacji gleby oraz stanowiąc żer dla innych zwierząt, zwierzęta te mogą mieć silny wpływ na biodostępność substancji chemicznych dla innych organizmów, takich jak bezkręgowce (np. drapieżne roztocza i chrząszcze; np. (64)) lub drapieżniki z grupy kręgowców (np. lisy i mewy) (18) (62). Niektóre gatunki skąposzczetów lądowych wykorzystywane obecnie w badaniach ekotoksykologicznych opisano w dodatku 5.
3. W opracowanym przez ASTM standardowym przewodniku dotyczącym przeprowadzania badań laboratoryjnych toksyczności i bioakumulacji w glebie z wykorzystaniem gatunku z rodziny dżdżownicowatych Eisenia fetida oraz gatunku z rodziny wazonkowcowatych Enchytraeus albidus (3) przedstawiono wiele ważnych i użytecznych szczegółowych informacji na temat wyników niniejszej metody badawczej dotyczącej bioakumulacji w glebie. Inne dokumenty, do których odniesienia zawiera niniejsza metoda badawcza, to rozdział C.13 niniejszego załącznika "Biokoncentracja: badanie ryb w warunkach przepływu" (49) oraz OECD TG 315 "Bioakumulacja w bentosowych skąposzczetach żyjących w osadzie" (53). Ważnymi źródłami informacji na temat niniejszej metody badawczej są również praktyczne doświadczenia dotyczące badań nad bioakumulacją w glebie opisane w literaturze, np. (1) (5) (11) (12) (28) (40) (43) (45) (57) (59) (76) (78) (79).
4. Niniejsza metoda badawcza może w większości przypadków być stosowana w odniesieniu do stabilnych, neutralnych organicznych substancji chemicznych, które ulegają adsorpcji do gleb. Za pomocą niniejszej metody badawczej możliwe jest badanie pod kątem bioakumulacji wiązanych w glebie, stabilnych związków metaloorganicznych. Metoda ta ma zastosowanie również w przypadku metali i innych pierwiastków śladowych.
WARUNEK KONIECZNY
5. Badania pomiaru bioakumulacji substancji chemicznej w skąposzczetach lądowych przeprowadza się z wykorzystaniem metali ciężkich (zob. np. (63)) oraz trwałych organicznych substancji chemicznych o wartościach log Kow pomiędzy 3,0 a 6,0, np. (40). Takie badania mają także zastosowanie do:
- substancji chemicznych o log Kow powyżej 6,0 (superhydrofobowe substancje chemiczne),
- substancji chemicznych, które należą do klasy organicznych substancji chemicznych, o których wiadomo, że mają zdolność do bioakumulacji w żywych organizmach, np. substancji powierzchniowo czynnych lub wysoce adsorpcyjnych,
- substancji chemicznych, które wskazują na zdolność do bioakumulacji z racji właściwości strukturalnych, np. analogi substancji chemicznych, o których wiadomo, że mają zdolność do bioakumulacji, oraz
- metali.
6. Informacje na temat badanej substancji chemicznej, takie jak nazwa zwyczajowa, nazwa chemiczna (najlepiej nazwa IUPAC), wzór strukturalny, numer w rejestrze CAS, czystość, środki ostrożności, odpowiednie warunki przechowywania oraz metody analityczne, należy uzyskać przed rozpoczęciem badania. Ponadto znane powinny być następujące informacje:
a) rozpuszczalność w wodzie;
b) współczynnik podziału oktanol/woda, Kow;
c) współczynnik podziału glebawoda, wyrażony jako Koc;
d) prężność par;
e) podatność na rozkład (np. w glebie, wodzie);
f) znane metabolity.
7. Można zastosować badane substancje chemiczne znakowane izotopowo lub nieznakowane izotopowo. Aby ułatwić analizę, zaleca się jednak stosowanie substancji chemicznej znakowanej izotopowo. Taką decyzję należy podjąć na podstawie granic wykrywalności lub wymogu pomiaru macierzystej badanej substancji chemicznej i metabolitów. Jeśli stosuje się badaną substancję chemiczną znakowaną izotopowo i dokonuje się pomiaru całkowitych pozostałości radioaktywnych, ważne jest, by znakowane izotopowo pozostałości, zarówno w glebie, jak i w organizmach badanych, zostały scharakteryzowane pod kątem procentowej zawartości macierzystej badanej substancji chemicznej i znakowanej niemacierzystej substancji chemicznej, np. w próbkach pobranych w stanie ustalonym lub pod koniec etapu absorpcji, w celu umożliwienia obliczenia współczynnika bioakumulacji dla macierzystej badanej substancji chemicznej i danych metabolitów w glebie (zob. pkt 50). Konieczne może być zmodyfikowanie opisanej tu metody, np. w celu zapewnienia wystarczającej biomasy, na potrzeby pomiaru nieznakowanych izotopowo organicznych badanych substancji chemicznych lub metali. Przy pomiarze całkowitych pozostałości radioaktywnych (za pomocą scyntylacyjnego licznika cieczowego po ekstrakcji, spaleniu lub rozpuszczeniu tkanek) współczynnik bioakumulacji określa się na podstawie macierzystej badanej substancji chemicznej i metabolitów. Współczynnik bioakumulacji należy obliczyć na podstawie stężenia macierzystej badanej substancji chemicznej w organizmach oraz całkowitych pozostałości radioaktywnych. Następnie na podstawie współczynnika bioakumulacji należy obliczyć współczynnik akumulacji biota-gleba, znormalizowany do zawartości lipidów organizmu oraz zawartości węgla organicznego w glebie, aby zapewnić porównywalność wyników z różnych badań bioakumulacji.
8. Toksyczność badanej substancji chemicznej dla gatunków wykorzystanych w badaniu powinna być znana, np. stężenie efektywne (ECx) lub stężenie śmiertelne (LCx) dla okresu etapu absorpcji (np. (19)). Wybrane stężenie badanej substancji chemicznej powinno wynosić około 1 % jej ostrego bezobjawowego LC50, oraz powinno być co najmniej dziesięciokrotnie wyższe niż jej granica wykrywalności w glebie dla zastosowanej metody analitycznej. Preferowanymi wartościami dotyczącymi toksyczności są wartości pozyskane z długoterminowych badań nad subletalnymi punktami końcowymi (51) (52), jeśli takie dane są dostępne. Jeśli jednak nie są one dostępne, pomocnych informacji dostarczy badanie toksyczności ostrej (zob. np. (23)).
9. Dostępna powinna być odpowiednia metoda analityczna o znanej dokładności, precyzji oraz czułości w celu oznaczenia ilościowego substancji chemicznej w badanych roztworach, w glebie oraz w materiale biologicznym, wraz ze szczegółowymi informacjami na temat przygotowania i przechowywania próbek oraz kartami charakterystyki materiałów. Znane powinny być także analityczne granice wykrywalności jednostki badanej w glebie oraz tkance organizmów. Jeśli stosuje się badaną substancję chemiczną znakowaną węglem 14C, znana powinna być promieniotwórczość właściwa (np. Bq mol-1) oraz odsetek promieniotwórczości związany z zanieczyszczeniami. Promieniotwórczość właściwa badanej substancji chemicznej powinna być dostatecznie wysoka, aby ułatwić analizę, zaś stężenia badane nie powinny wywoływać skutków toksycznych.
10. Badanie można przeprowadzić z wykorzystaniem gleby sztucznej lub gleb naturalnych. Informacje na temat cech charakterystycznych zastosowanej gleby naturalnej, np. pochodzenia gleby lub jej składników, pH, zawartości węgla organicznego, rozkładu wielkości cząstek (procent piasku, iłu i gliny) oraz zdolności zatrzymywania wody, powinny być znane przed rozpoczęciem badania (3) (48).
ZASADA BADANIA
11. Parametry, które charakteryzują bioakumulację badanej substancji chemicznej obejmują współczynnik bioakumulacji (BAF), stałą szybkości absorpcji (ks) oraz stałą szybkości eliminacji (ke). Ich definicje podano w dodatku 1.
12. Badanie składa się z dwóch etapów: etapu absorpcji (narażenia) i etapu eliminacji (po narażeniu). Podczas etapu absorpcji replikaty z grupami organizmów poddaje się narażeniu poprzez glebę, którą wzbogacono badaną substancją chemiczną. Oprócz zwierząt badanych, w identycznych warunkach niezawierających jednak badanej substancji chemicznej przetrzymuje się grupy organizmów kontrolnych. Mierzy się masę suchą i zawartość lipidów organizmów badanych. Pomiary można przeprowadzić z wykorzystaniem organizmów z grupy kontrolnej. Wartości dotyczące analizy tła (ślepa próba) można uzyskać poprzez analizę próbek organizmów kontrolnych i gleby. Na potrzeby etapu eliminacji organizmy przenosi się do gleby niezawierającej badanej substancji chemicznej. Etap eliminacji jest zawsze wymagany, chyba że absorpcja badanej substancji chemicznej podczas etapu narażenia nie była znacząca. Etap eliminacji dostarcza informacji na temat szybkości, z jaką badana substancja chemiczna jest wydalana przez organizmy badane (np. (27)). Jeśli podczas etapu absorpcji nie osiągnięto stanu ustalonego, parametry kinetyczne - kinetyczny współczynnik bioakumulacji (BAFk), stałą lub stałe szybkości absorpcji i eliminacji - należy określić w oparciu o jednoczesne dopasowanie wyników z etapu absorpcji i eliminacji. Stężenie badanej substancji chemicznej w/na organizmach monitoruje się w trakcie obydwu etapów badania.
13. Podczas etapu absorpcji pomiarów dokonuje się w chwili pobierania próbek przez okres trwający do 14 dni (w przypadku wazonkowcowatych) lub 21 dni (w przypadku dżdżownic), do czasu osiągnięcia stanu ustalonego (11) (12) (67). Stan ustalony zachodzi, gdy wykres stężenia w organizmach w czasie jest równoległy do osi czasu, a trzy następujące po sobie analizy stężenia wykonane na próbkach pobranych w odstępach czasowych co najmniej dwóch dni nie różnią się od siebie więcej niż o ± 20 % na podstawie porównań statystycznych (np. analiza wariancji, analiza regresji).
14. Etap eliminacji składa się z przeniesienia organizmów badanych do naczyń z takim samym podłożem, lecz niezawierającym badanej substancji chemicznej. Podczas etapu eliminacji pomiarów dokonuje się w chwili pobierania próbek przez 14 dni (w przypadku wazonkowcowatych) lub 21 dni (w przypadku dżdżownic), o ile wcześniej oznaczenie analityczne nie wykaże redukcji pozostałości badanej substancji chemicznej w organizmach na poziomie 90 %. Stężenie badanej substancji chemicznej w organizmach pod koniec etapu eliminacji przedstawia się w sprawozdaniu jako niewyeliminowane pozostałości. Współczynnik bioakumulacji w stanie ustalonym (BAFss) należy obliczać zarówno jako stosunek stężenia w organizmach (Ca) i w glebie (Cs) przy ewidentnym stanie ustalonym, jak i jako kinetyczny współczynnik bioakumulacji (BAFK), czyli stosunek stałej szybkości absorpcji z gleby (ks) oraz stałej szybkości eliminacji (ke) (zob. definicje w dodatku 1), przy założeniu kinetyki reakcji pierwszego rzędu (zob. obliczenia w dodatku 2). Jeśli w sposób ewidentny kinetyka reakcji pierwszego rzędu nie znajduje zastosowania, należy zastosować inne modele.
15. Stała szybkości absorbcji, stała szybkości eliminacji (lub stałe, jeśli zastosowano inne modele), kinetyczny współczynnik bioakumulacji (BAFK) oraz, tam, gdzie to możliwe, granice ufności każdego z tych parametrów, oblicza się za pomocą komputerowych modeli równań (zob. wytyczne w dodatku 2). Odpowiedniość dopasowania modelu można określić na podstawie, na przykład, współczynnika korelacji lub współczynnika determinacji (współczynniki o wartościach zbliżonych do 1 wskazują na dobre dopasowanie) lub chi-kwadrat. Zakres błędu standardowego lub granicy ufności dla szacowanych parametrów także może wskazywać na odpowiedniość dopasowania modelu.
16. Aby zmniejszyć zróżnicowanie wyników badania dla badanych substancji chemicznych o wysokim poziomie lipofilności, współczynniki bioakumulacji należy wyrazić w odniesieniu do zawartości lipidów oraz węgla organicznego (kg węgla organicznego w glebie kg-1 zawartości lipidów w organizmie). Takie podejście wynika z faktu, że w przypadku niektórych klas substancji chemicznych istnieje wyraźne powiązanie między zdolnością do bioakumulacji a lipofilnością; zostało to potwierdzone w przypadku ryb (47). Istnieje związek między zawartością lipidów w rybach a bioakumulacją takich substancji chemicznych. W przypadku organizmów bentosowych stwierdzono podobne korelacje, np. (30) (44). Taką korelację wykazano także w przypadku skąposzczetów lądowych, np. (5) (6) (7) (14). Jeśli dostępna jest wystarczająca ilość tkanek organizmów, zawartość lipidów w zwierzętach badanych można określić z wykorzystaniem tego samego materiału biologicznego, który zastosowano do określenia stężenia badanej substancji chemicznej. Do pomiaru zawartości lipidów można wykorzystać także zwierzęta kontrolne.
WAŻNOŚĆ BADANIA
17. Aby badanie było ważne, grupy kontrolne oraz grupy poddane działaniu substancji muszą spełnić następujące kryteria:
- pod koniec badania całkowita śmiertelność podczas etapu absorpcji i etapu eliminacji nie powinna przekroczyć 10 % (w przypadku dżdżownic) lub 20 % (w przypadku wazonkowcowatych) całkowitej liczby organizmów wykorzystanych w badaniu,
- w przypadku gatunków Eisenia fetida i Eisenia andrei średnia strata masy według pomiarów na koniec etapu absorpcji i na koniec etapu eliminacji nie powinna przekraczać 20 % w porównaniu z początkową żywą wagą na początku każdego z etapów.
OPIS METODY
Badane gatunki
18. Do badania bioakumulacji zaleca się wykorzystanie kilku gatunków skąposzczetów lądowych. Najczęściej stosowane gatunki, Eisenia fetida lub Eisenia andrei (dżdżownicowate), lub też Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus lub Enchytraeus luxuriosus (wazonkowcowate), opisano w dodatku 5.
Przyrządy
19. Należy dołożyć starań, aby unikać stosowania materiałów, w odniesieniu do wszystkich części sprzętu, które mogą rozpuścić badaną substancję chemiczną, sprawić, że ulegnie ona adsorpcji, lub też wypłukać inne substancje chemiczne, a także materiałów, które mają szkodliwe działanie na zwierzęta badane. Można zastosować standardowe prostokątne lub cylindryczne naczynia, wykonane z chemicznie obojętnego materiału i posiadające odpowiednią pojemność, zgodnie ze wskaźnikiem obciążenia, tj. liczbą organizmów badanych. Sprzęt mający kontakt z badanymi pożywkami może być wykonany ze stali nierdzewnej, plastiku lub szkła. Naczynia do badania należy odpowiednio nakrywać, aby zapobiec uciekaniu organizmów, jednocześnie zapewniając im wystarczający dopływ powietrza. W przypadku substancji chemicznych o wysokich współczynnikach adsorpcji, takich jak syntetyczne pyretroidy, konieczne może być zastosowanie szkła silanizowanego. W takich sytuacjach sprzęt po użyciu należy wyrzucić (49). Jednostki badane znakowane izotopowo oraz substancje lotne należy zabezpieczyć przed uchodzeniem. Należy zastosować pułapki (np. szklane płuczki gazowe) zawierające odpowiednie absorbenty zatrzymujące wszelkie pozostałości odparowujące z naczyń do badania.
Gleba
20. Badana gleba powinna być takiej jakości, która pozwoli na przeżycie oraz optymalnie także rozmnażanie organizmów badanych w okresie aklimatyzacji i badanych okresów, przy czym takie organizmy nie powinny charakteryzować się nieprawidłowym wyglądem ani zachowaniem. Organizmy powinny zakopywać się w glebie.
21. Jako podłoże w badaniach zaleca się wykorzystanie sztucznej gleby opisanej w rozdziale C.8 niniejszego załącznika (48). Opis przygotowania sztucznej gleby do wykorzystania w badaniach bioakumulacji oraz zalecenia dotyczące przechowywania sztucznej gleby podano w dodatku 4. Wysuszoną powietrzem sztuczną glebę można przechowywać do czasu jej wykorzystania w temperaturze pokojowej.
22. Naturalne gleby z niezanieczyszczonych miejsc mogą jednak również posłużyć jako gleba badana lub jako gleba do hodowli. Gleby naturalne należy scharakteryzować, podając co najmniej ich pochodzenie (miejsce zebrania), pH, zawartość węgla organicznego, rozkład wielkości cząstek (procent piasku, iłu i gliny), maksymalną zdolność zatrzymywania wody oraz procentową zawartość wilgoci (3). Użytecznych informacji powinna dostarczyć także analiza gleby lub jej składników pod kątem mikrozanieczyszczeń, przeprowadzona przed zastosowaniem takiej gleby. Jeśli wykorzystuje się glebę z użytków rolnych, taka gleba nie powinna być wcześniej poddawana działaniu środków ochrony roślin ani obornika od zwierząt poddanych działaniu takich substancji, przez co najmniej jeden rok w przypadku nawozów, a w przypadku nawozów organicznych - przez co najmniej sześć miesięcy przed pobraniem próbek (50). Procedury manipulacji dotyczące gleb naturalnych przed ich zastosowaniem w badaniach ekotoksykologicznych przeprowadzanych z wykorzystaniem skąposzczetów opisano w (3). W przypadku gleb naturalnych okres ich przechowywania w laboratorium powinien być możliwie jak najkrótszy.
Zastosowanie badanej substancji chemicznej
23. Badaną substancję chemiczną wprowadza się do gleby. Pod uwagę należy wziąć fizykochemiczne właściwości badanej substancji chemicznej. Badaną substancję chemiczną rozpuszczalną w wodzie należy przed jej zmieszaniem z glebą całkowicie rozpuścić w wodzie. Zalecana procedura wzbogacania dla badanych substancji chemicznych słabo rozpuszczalnych w wodzie obejmuje powleczenie badaną substancją chemiczną jednego lub większej liczby składników (sztucznej) gleby. Na przykład piasek kwarcowy, lub jego część, można namoczyć w roztworze badanej substancji chemicznej i odpowiedniego rozpuszczalnika organicznego, który następnie powoli odparuje do sucha. Taką powleczoną frakcję można następnie wymieszać z mokrą glebą. Największą zaletą tej procedury jest to, że do gleby nie wprowadza się rozpuszczalnika. W przypadku zastosowania gleby naturalnej badaną substancję chemiczną można dodać poprzez wzbogacenie wysuszonej powietrzem części gleby, zgodnie z opisem dotyczącym sztucznej gleby powyżej, lub poprzez wmieszanie badanej substancji chemicznej do mokrej gleby, przeprowadzając następnie etap odparowania, jeśli zastosowano środek rozpuszczający. Zasadniczo w miarę możliwości należy unikać kontaktu mokrej gleby z rozpuszczalnikami. Należy wziąć pod uwagę następujące kwestie (3):
- Jeśli zastosowano rozpuszczalnik inny niż woda, powinien to być rozpuszczalnik, który można wymieszać z wodą lub odprowadzić (na przykład odparować), pozostawiając na glebie wyłącznie badaną substancję chemiczną.
- Jeśli stosuje się kontrolę rozpuszczalnika, nie ma potrzeby kontroli ujemnej. W kontroli rozpuszczalnika należy zastosować najwyższe stężenie rozpuszczalnika dodane do gleby oraz rozpuszczalnik z tej samej partii, którą wykorzystano do wykonania roztworu podstawowego. Toksyczność i lotność rozpuszczalnika oraz rozpuszczalność badanej substancji chemicznej w wybranym rozpuszczalniku powinny być głównymi kryteriami branymi pod uwagę przy wyborze odpowiedniego środka rozpuszczającego.
24. W przypadku substancji chemicznych, które są słabo rozpuszczalne w wodzie oraz w rozpuszczalnikach organicznych, z daną ilością badanej substancji chemicznej można wymieszać drobno zmielony piasek kwarcowy, w ilości 2,0-2,5 g na jedno naczynie do badania, np. używając moździerza i tłuczka, w celu otrzymania pożądanego badanego stężenia. Taką mieszaninę piasku kwarcowego i badanej substancji chemicznej dodaje się do uprzednio zwilżonej gleby i dokładnie miesza z odpowiednią ilością dejonizowanej wody w celu otrzymania wymaganej zawartości wilgoci. Otrzymaną mieszaninę przekłada się do naczyń do badania. Procedurę tę powtarza się dla każdego badanego stężenia, a także przygotowuje się odpowiednią kontrolę z wykorzystaniem drobno zmielonego piasku kwarcowego, w ilości 2,0-2,5 g na jedno naczynie do badania.
25. Stężenie badanej substancji chemicznej w glebie należy określić po wzbogacaniu. Jednolite rozprowadzenie badanej substancji chemicznej w glebie należy zweryfikować przed wprowadzeniem badanych organizmów. Metodę zastosowaną do wzbogacania oraz uzasadnienie wyboru określonej procedury wzbogacania, należy przedstawić w sprawozdaniu (24).
26. Równowagę między glebą a wodą porową należy najlepiej uzyskać przed dodaniem organizmów; zaleca się okres czasu wynoszący cztery dni przy temperaturze 20 °C. W przypadku wielu organicznych substancji słabo rozpuszczalnych w wodzie czas wymagany do osiągnięcia prawdziwej równowagi między frakcją, która uległa adsorpcji a frakcją, która uległa rozpuszczeniu, liczy się w dniach lub miesiącach. W zależności od celu badania, na przykład, jeśli dąży się do odtworzenia warunków środowiskowych, wzbogacona gleba może być "postarzana" przez dłuższy okres, np. w przypadku metali może on wynosić trzy tygodnie przy temperaturze 20 °C (22).
Hodowla badanych organizmów
27. Organizmy należy przetrzymywać w stałej kulturze laboratoryjnej. Wytyczne na temat metod dotyczących kultur laboratoryjnych dla gatunków Eisenia fetida i Eisenia andrei oraz gatunków z rodziny wazonkowcowatych przedstawiono w dodatku 5 (zob. również (48) (51) (52)).
28. Organizmy wykorzystane w badaniach nie powinny wykazywać dających się zaobserwować oznak chorób, anomalii ani pasożytów.
PRZEPROWADZENIE BADANIA
29. Podczas etapu absorpcji organizmy są narażone na działanie badanej substancji chemicznej. Etap absorpcji powinien trwać 14 dni (w przypadku wazonkowcowatych) lub 21 dni (w przypadku dżdżownic), chyba że wykazano, iż osiągnięto stan ustalony.
30. Na potrzeby etapu eliminacji organizmy przenosi się do gleby niezawierającej badanej substancji chemicznej. Pierwszą próbkę należy pobrać po 4-24 godzinach po rozpoczęciu etapu eliminacji. Przykłady harmonogramów pobierania próbek, dla etapu absorpcji trwającego 21 dni i etapu eliminacji trwającego 21 dni, przedstawiono w dodatku 3.
Organizmy badane
31. W przypadku wielu gatunków lądowych z rodziny wazonkowcowatych masa poszczególnych osobników jest bardzo niska (np. 5-10 mg masy mokrej na jednego osobnika w przypadku Enchytraeus albidus oraz jeszcze mniej w przypadku Enchytraeus crypticus lub Enchytraeus luxuriosus); w celu przeprowadzenia pomiarów masy i analizy chemicznej konieczne może być łączne ważenie organizmów z naczyń do badania stanowiących replikaty (tj. wszystkie organizmy z naczynia stanowiącego replikat zostaną wykorzystane do uzyskania jednego wyniku analizy tkanki). Do każdego replikatu dodaje się 20 osobników z rodziny wazonkowcowatych; należy wykorzystać co najmniej trzy replikaty. Jeśli analityczna granica wykrywalności badanej substancji chemicznej jest wysoka, konieczne może być wykorzystanie większej liczby organizmów. W przypadku gatunków badanych o większej masie poszczególnych osobników (Eisenia fetida i Eisenia andrei) można wykorzystać naczynia stanowiące replikaty zawierające jednego osobnika.
32. Dżdżownice wykorzystane w badaniu powinny mieć podobną masę (np. osobniki z gatunku Eisenia fetida i Eisenia andrei powinny mieć masę 250-600 mg na jednego osobnika). Wazonkowcowate (np. Enchytraeus albidus) powinny mieć długość około 1 cm. Wszystkie organizmy wykorzystane w konkretnym badaniu powinny pochodzić z tego samego źródła, a także powinny być dorosłymi zwierzętami z klitellum (zob. dodatek 5). Jako że masa i wiek zwierzęcia mogą mieć wpływ na wartości współczynnika bioakumulacji (np. z powodu różnej zawartości lipidów lub obecności jaj), takie parametry należy dokładnie odnotować i wziąć pod uwagę podczas interpretacji wyników. Ponadto w trakcie etapu narażenia może dojść do złożenia kokonów, co również będzie miało wpływ na wartości współczynnika bioakumulacji. Zaleca się zważenie podpróbki organizmów badanych przed rozpoczęciem badania w celu oszacowania ich średniej masy suchej i mokrej.
33. Należy zastosować wysoki stosunek gleby do organizmów w celu zminimalizowania spadku stężenia badanej substancji chemicznej w glebie podczas etapu absorpcji. W przypadku gatunków Eisenia fetida i Eisenia andrei zaleca się minimalną ilość wynoszącą 50 g suchej masy gleby na jeden organizm, a w przypadku wazonkow-cowatych - co najmniej 10-20 g suchej masy gleby na jedno naczynie do badania. Naczynia powinny zawierać warstwę gleby głębokości 2-3 cm (w przypadku wazonkowcowatych) lub 4-5 cm (w przypadku dżdżownic).
34. Organizmy zastosowane w badaniu usuwa się z hodowli (np. wazonkowcowate za pomocą pęsety jubilerskiej). Dorosłe zwierzęta przenosi się do badanej gleby niepoddanej działaniu badanej substancji chemicznej w celu ich aklimatyzacji, oraz karmi (zob. pkt 36). Jeśli warunki badania różnią się od warunków hodowli, do przystosowania organizmów do warunków badania powinien wystarczyć etap aklimatyzacji trwający 24-72 godziny. Po aklimatyzacji dżdżownice opłukuje się w szklanych naczyniach (np. szalkach Petriego) z czystą wodą, a następnie waży przed wprowadzeniem ich do gleby badanej. Przed ważeniem nadmiar wody należy usunąć z dżdżownic poprzez delikatne otarcie ich o krawędź naczynia lub poprzez ich ostrożne osuszenie za pomocą lekko zwilżonego ręcznika papierowego.
35. Zachowania badanych organizmów związane z zakopywaniem się w glebie należy obserwować i odnotowywać. W badaniach z wykorzystaniem dżdżownic zwierzęta (kontrolne i poddawane działaniu substancji) zazwyczaj zakopują się w glebie w ciągu okresu trwającego kilka godzin. Należy to sprawdzić nie później niż 24 godziny po wprowadzeniu organizmów do naczyń do badania. Jeśli dżdżownice nie zakopują się w glebie (np. ponad 10 % organizmów przez ponad połowę etapu absorpcji), oznacza to, że warunki badania nie są odpowiednie lub badane organizmy nie są zdrowe. W takim przypadku badanie należy przerwać i powtórzyć. Wazonkow-cowate żyją w większości przypadków w porach w glebie oraz ich integument często może jedynie częściowo pozostawać w kontakcie z otaczającym ich podłożem. Zakłada się, że narażenie wazonkowcowatych zakopujących się w glebie i niezakopujących się jest równoważne, a więc w przypadku wazonkowcowatych niezakopujących się powtórzenie badania nie jest konieczne.
Karmienie
36. Należy zaplanować karmienie, jeśli stosuje się glebę z niską całkowitą zawartością węgla organicznego. Jeśli zastosowano glebę sztuczną, zaleca się tygodniową porcję pożywienia (tj. organizmy należy karmić raz na tydzień) wynoszącą 7 mg wysuszonego obornika na g masy suchej gleby w przypadku dżdżownic, oraz tygodniową porcję wynoszącą 2-2,5 mg zmielonych płatków owsianych na g masy suchej gleby w przypadku wazonkowcowatych (11). Pierwszą porcję pożywienia należy wymieszać z glebą bezpośrednio przed dodaniem badanych organizmów. Zaleca się stosowanie tego samego rodzaju pożywienia co w przypadku hodowli (zob. dodatek 5).
Światło i temperatura
37. Badania należy przeprowadzać w warunkach kontrolowanego cyklu światło/ciemność 16/8 godzin, z zalecanym natężeniem światła na obszarze z naczyniami do badania na poziomie 400-800 luksów (3). Temperatura przeprowadzania badania powinna wynosić 20 ± 2 °C przez cały czas trwania badania.
Badane stężenia
38. Stosuje się jedno stężenie. Sytuacje, w których wymagane jest dodatkowe stężenie lub stężenia, należy uzasadnić. Jeśli toksyczność (ECx) badanej substancji chemicznej jest zbliżona do analitycznej granicy wykrywalności, zaleca się stosowanie badanej substancji chemicznej znakowanej izotopowo z wysokim poziomem promieniotwórczości właściwej. W przypadku metali stężenie powinno być wyższe niż poziom naturalnego tła w tkankach i glebie.
Replikaty
39. Minimalna liczba naczyń stanowiących replikaty poddanych działaniu substancji na potrzeby pomiarów kinetycznych (etap absorpcji i eliminacji) powinna wynosić trzy na jeden punkt pobierania próbek. Całkowita liczba przygotowanych replikatów powinna być wystarczająca, by objąć wszystkie pobrania próbek podczas etapu absorpcji i eliminacji.
40. Na potrzeby obserwacji biologicznych i pomiarów (np. stosunek masy suchej do masy mokrej, zawartość lipidów) oraz na potrzeby analizy stężeń tła w organizmach i glebie, należy zapewnić co najmniej 12 naczyń stanowiących replikaty kontroli ujemnej (cztery pobrane na początku i cztery na koniec etapu absorpcji, oraz cztery pobrane na koniec etapu eliminacji), jeśli nie zastosowano rozpuszczalnika innego niż woda. Jeśli do zastosowania badanej substancji chemicznej wykorzystano środek rozpuszczający, oprócz replikatów poddanych działaniu substancji należy zapewnić kontrolę rozpuszczalnika obejmującą wszystkie składniki prócz jednostki badanej (na początku etapu absorpcji należy pobrać próbki z czterech naczyń stanowiących replikaty oraz cztery próbki na koniec etapu absorpcji i cztery na koniec etapu eliminacji). W takim przypadku można zapewnić także cztery dodatkowe naczynia stanowiące replikaty kontroli ujemnej (bez rozpuszczalnika) na potrzeby opcjonalnego pobierania próbek na koniec etapu absorpcji. Takie replikaty można porównać pod kątem parametrów biologicznych z kontrolą rozpuszczalnika w celu uzyskania informacji na temat możliwego wpływu rozpuszczalnika na organizmy badane. Zaleca się zapewnienie wystarczającej liczby dodatkowych rezerwowych naczyń stanowiących replikaty (np. ośmiu) na potrzeby poddawania działaniu substancji i kontroli.
Częstotliwość pomiarów jakości gleby
41. pH gleby, zawartość wilgoci w glebie oraz jej temperaturę (stałą) w pomieszczeniu badawczym należy mierzyć na początku i na końcu etapu absorpcji i etapu eliminacji. Raz na tydzień należy skontrolować zawartość wilgoci w glebie poprzez zważenie naczyń do badania oraz porównanie faktycznych mas z początkowymi masami na początku badania. Straty wody należy uzupełniać poprzez dodanie dejonizowanej wody.
Pobieranie próbek oraz analiza organizmów i gleby
42. Przykładowy harmonogram etapów absorpcji i eliminacji w badaniach bioakumulacji z wykorzystaniem dżdżownic i wazonkowcowatych przedstawiono w dodatku 3.
43. Próbki gleby pobiera się z naczyń do badania w celu określenia stężenia badanej substancji chemicznej przed dodaniem organizmów, a także podczas etapu absorpcji i etapu eliminacji. Podczas badania określa się stężenia badanej substancji chemicznej w organizmach i glebie. Zasadniczo mierzy się całkowite stężenia w glebie. Opcjonalnie można dokonać pomiaru stężeń w wodzie porowej. W takim przypadku należy przed rozpoczęciem badania przedstawić uzasadnienie i odpowiednie metody oraz takie informacje należy uwzględnić także w sprawozdaniu.
44. Próbki organizmów i gleby pobiera się co najmniej sześć razy podczas etapu absorpcji i eliminacji. Jeśli wykazano stabilność badanej substancji chemicznej, liczbę analiz gleby można zmniejszyć. Zaleca się analizowanie co najmniej trzech replikatów na początku i na końcu etapu absorpcji. Jeśli stężenie w glebie mierzone na końcu etapu absorpcji różni się od stężenia początkowego o ponad 30 %, próbki gleby pobrane w innych datach należy również poddać analizie.
45. Za każdym razem przy pobieraniu próbek należy usunąć z gleby organizmy znajdujące się w danym replikacie (np. przez wyłożenie gleby z replikatu na płytką tackę i wyjęcie organizmów za pomocą miękkiej pęsety jubilerskiej), a następnie opłukać je szybko w wodzie na płytkiej szklanej lub metalowej tacce. Należy usunąć nadmiar wody (zob. pkt 34). Następnie należy ostrożnie przenieść organizmy do zważonego uprzednio naczynia i od razu je zważyć, wraz z zawartością układu pokarmowego.
46. Dżdżownicom (Eisenia sp.) należy umożliwić wypróżnienie się przez noc, np. na wilgotnej bibule filtracyjnej na przykrytych szalkach Petriego (zob. pkt 34). Gdy dżdżownice się wypróżnią, należy określić masę organizmów w celu dokonania oceny ewentualnego spadku biomasy podczas badania (zob. kryteria ważności opisane w pkt 17). Ważenie i analizę tkanek wazonkowcowatych przeprowadza się bez etapu wypróżniania, jako że jest to technicznie trudne z uwagi na mały rozmiar tych organizmów. Po końcowym określeniu masy organizmy należy niezwłocznie uśmiercić, za pomocą najbardziej odpowiedniej metody (np. używając ciekłego azotu lub zamrażając je w temperaturze poniżej -18 °C).
47. Podczas etapu eliminacji organizmy wymieniają zanieczyszczoną zawartość układu pokarmowego na czystą glebę. Oznacza to, że pomiary próbek pobranych z organizmów bez wypróżnienia (w tym przypadku wazon-kowcowatych) bezpośrednio przed etapem eliminacji zawierają zanieczyszczoną glebę z układu pokarmowego. W przypadku skąposzczetów wodnych zakłada się, że większość zanieczyszczonej zawartości układu pokarmowego zostaje zastąpiona czystym osadem po początkowym okresie etapu eliminacji trwającym 4-24 godziny, np. (46). Podobne ustalenia odnotowano w przypadku dżdżownic w badaniach dotyczących akumulacji znakowanego izotopowo kadmu i cynku (78). W przypadku wazonkowcowatych bez wypróżnienia jako stężenie w tkance po wypróżnieniu można przyjąć stężenie pierwszej próbki pobranej podczas etapu eliminacji. Aby uwzględnić rozcieńczenie stężenia jednostki badanej przez niezanieczyszczoną glebę podczas etapu eliminacji, masę zawartości układu pokarmowego można oszacować na podstawie stosunku masy mokrej organizmu/masy popiołu z organizmu lub masy suchej organizmów/masy popiołu z organizmu.
48. Próbki gleby i organizmów należy poddać analizie niezwłocznie po usunięciu organizmów (tj. w ciągu 1-2 dni), aby zapobiec rozkładowi lub innym stratom, a także zaleca się obliczenie przybliżonej szybkości absorpcji i eliminacji w trakcie trwania badania. Jeśli analizę wykonuje się z opóźnieniem, próbki należy przechowywać z zastosowaniem odpowiedniej metody, np. głębokiego zamrażania (≤ -18 °C).
49. Należy sprawdzić, czy dokładność i odtwarzalność analizy chemicznej, a także odzysk badanej substancji chemicznej z próbek gleby i organizmów są zadowalające dla danej metody. Należy odnotować efektywność ekstrakcji, granicę wykrywalności oraz granicę oznaczalności. Należy także sprawdzić, czy badana substancja chemiczna nie jest wykrywalna w naczyniach kontrolnych w stężeniach wyższych niż tło. Jeśli stężenie badanej substancji chemicznej w organizmie badanym Ca wynosi > 0 w organizmach kontrolnych, należy to uwzględnić przy obliczaniu parametrów kinetycznych (zob. dodatek 2). Przez cały okres trwania badania wszystkimi próbkami należy posługiwać się w taki sposób, by zminimalizować ich zanieczyszczenie i straty (np. wynikające z adsorpcji badanej substancji chemicznej na przyrządzie do pobierania próbek).
50. W przypadku zastosowania badanych substancji chemicznych znakowanych izotopowo możliwe jest przeprowadzenie analizy macierzystej substancji chemicznej i metabolitów. Określenie ilościowe macierzystej badanej substancji chemicznej i metabolitów w stanie ustalonym lub na koniec etapu absorpcji dostarcza ważnych informacji. Próbki powinny wtedy być "oczyszczone", aby macierzysta badana substancja chemiczna mogła zostać osobno określona ilościowo. Jeśli poszczególne metabolity przekraczają 10 % całkowitej promieniotwórczości w analizowanej próbce lub próbkach, zaleca się określenie takich metabolitów.
51. Odzysk całkowity, oraz odzysk badanej substancji chemicznej w organizmach, glebie a także, jeśli zastosowano, w pułapkach zawierających absorbenty umożliwiające zatrzymanie odparowującej badanej substancji chemicznej, należy odnotować i przedstawić w sprawozdaniu.
52. Łączne traktowanie osobników pochodzących z konkretnego naczynia do badania jest dopuszczalne w przypadku organizmów z rodziny wazonkowcowatych, które są mniejsze niż dżdżownice. Jeśli takie łączenie obejmuje zmniejszenie liczby replikatów, ogranicza to statystyczne procedury, jakie można zastosować do danych. Jeśli wymagana jest konkretna procedura i moc statystyczna, należy w badaniu zastosować odpowiednią liczbę naczyń do badania stanowiących replikaty, w celu uwzględnienia pożądanego łączenia, procedury i mocy.
53. Zaleca się, by współczynnik bioakumulacji był wyrażony zarówno jako funkcja całkowitej masy suchej oraz, w razie konieczności (np. w przypadku wysoce hydrofobowych substancji chemicznych), jako funkcja zawartości lipidów. Do określenia zawartości lipidów należy zastosować odpowiednie metody (w tym celu należy dostosować istniejące metody, np. (31) (58)). W ramach takich metod stosuje się technikę ekstrakcji z wykorzystaniem chloroformu/metanolu. W celu uniknięcia jednak rozpuszczalników chlorowanych należy zastosować zmodyfikowaną metodę Bligha i Dyera (9) zgodnie z opisem w (17). Jako że w wyniku zastosowania różnych metod można uzyskać różniące się wartości, ważne jest podanie szczegółowych informacji na temat zastosowanej metody. Jeśli jest to możliwe, tj. jeśli jest dostępna wystarczająca ilość tkanki organizmów, analizę lipidów należy przeprowadzić z użyciem tej samej próbki lub ekstraktu, których użyto do analizy badanej substancji chemicznej, jako że lipidy często muszą zostać usunięte z ekstraktu przed analizą za pomocą chromatografii (49). Do pomiaru zawartości lipidów można również wykorzystać zwierzęta kontrolne, a wartości dotyczące zawartości lipidów mogą następnie zostać wykorzystane do normalizowania wartości współczynnika bioakumulacji. Przy zastosowaniu tego drugiego podejścia ogranicza się zanieczyszczenie przyrządów badaną substancją chemiczną.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Opracowanie wyników
54. Krzywą absorpcji badanej substancji chemicznej uzyskuje się poprzez wykreślenie jej stężenia w/na organizmach podczas etapu absorpcji w czasie w skali arytmetycznej. Kiedy krzywa osiągnie plateau lub stan ustalony (zob. definicje w dodatku 1), współczynnik bioakumulacji w stanie ustalonym oblicza się na podstawie:
Ca w stanie ustalonym lub na końcu etapu absorpcji (średnia)
Cs w stanie ustalonym lub na końcu etapu absorpcji (średnia)
Ca stanowi stężenie badanej substancji chemicznej w organizmie badanym.
Cs stanowi stężenie badanej substancji chemicznej w glebie.
55. W przypadku nieosiągnięcia stanu ustalonego kinetyczny współczynnik akumulacji (BAFK), oparty na stałych szybkości, należy określić na podstawie współczynnika bioakumulacji w stanie równowagi zgodnie z poniższym opisem:
- należy określić współczynnik akumulacji (BAFK) jako stosunek ks/ke,
- szybkość absorpcji i eliminacji najlepiej obliczyć jednocześnie (zob. równanie 11 w dodatku 2),
- stałą szybkości eliminacji (ke) określa się zazwyczaj na podstawie krzywej eliminacji (tj. wykresu stężenia jednostki badanej w organizmach podczas etapu eliminacji). Stałą szybkości absorpcji ks oblicza się następnie na podstawie takiego ke oraz wartości Ca, którą uzyskuje się z krzywej absorpcji - zob. opis tych metod w dodatku 2. Preferowaną metodą uzyskania kinetycznego współczynnika akumulacji oraz stałych szybkości, ks i ke jest zastosowanie nieliniowych komputerowych metod estymacji parametrycznej. Jeśli w sposób ewidentny eliminacja nie jest procesem pierwszego rzędu, należy zastosować bardziej złożone modele.
Sprawozdanie z badania
56. Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:
Badana substancja chemiczna
- wszelkie dostępne informacje na temat toksyczności ostrej lub przewlekłej (np. ECx, LCx" NOEC) badanej substancji chemicznej w odniesieniu do żyjących w glebie skąposzczetów,
- czystość, cechy fizyczne i właściwości fizykochemiczne, np. współczynnik podziału oktanol/woda, rozpuszczalność w wodzie,
- dane identyfikacyjne substancji chemicznej; źródło jednostki badanej, nazwę i stężenie wszelkich zastosowanych rozpuszczalników,
- w przypadku zastosowania badanej substancji chemicznej znakowanej izotopowo, dokładne położenie znakowanych atomów, promieniotwórczość właściwą oraz czystość radiochemiczną.
Badane gatunki
- nazwę naukową, szczep, źródło, wszelkie przypadki wcześniejszego poddania działaniu, aklimatyzację, wiek, rozmiar-zakres itp.
Warunki badania
- zastosowaną procedurę badania,
- rodzaj i charakterystykę zastosowanego oświetlenia i jego cykl lub cykle,
- projekt badania (np. liczbę i rozmiar naczyń do badania, masę gleby i wysokość warstwy gleby, liczbę replikatów, liczbę organizmów w każdym replikacie, liczbę badanych stężeń, czas trwania etapu absorpcji i eliminacji, częstotliwość pobierania próbek),
- uzasadnienie wyboru materiału, z którego wykonano naczynia do badania,
- metodę przygotowania i zastosowania jednostki badanej, a także uzasadnienie wyboru konkretnej metody,
- badane stężenia nominalne, średnie mierzonych wartości oraz ich odchylenia standardowe w naczyniach do badania, a także metodę uzyskania takich wartości,
- źródło składników gleby sztucznej lub - w przypadku zastosowania gleb naturalnych - pochodzenie gleby, opis wszelkich wcześniejszych procesów, jakim została poddana, wyniki kontroli (przeżycie, rozwój biomasy, rozmnażanie), charakterystykę gleby (pH, całkowitą zawartość węgla organicznego, rozkład wielkości cząstek (procent piasku, iłu i gliny), maksymalną zdolność zatrzymywania wody, procentową zawartość wilgoci na początku i na końcu badania, oraz wszelkie inne dokonane pomiary),
- szczegółowe informacje na temat traktowania próbek gleby i organizmów, w tym szczegółowe informacje na temat procedur przygotowania, przechowywania, wzbogacania, ekstrakcji oraz procedur analitycznych (oraz precyzji) zastosowanych w odniesieniu do jednostki badanej w organizmach i glebie, oraz zawartość lipidów (jeśli zmierzono), a także odzysk jednostki badanej.
Wyniki
- śmiertelność organizmów kontrolnych i organizmów w każdym naczyniu do badania oraz wszelkie zaobserwowane niestandardowe zachowania (np. unikanie gleby, nierozmnażanie się w badaniu bioakumulacji z wykorzystaniem wazonkowcowatych),
- stosunek masy suchej do masy mokrej gleby i organizmów badanych (przydatne do normalizacji),
- masy mokre organizmów przy każdym pobieraniu próbek; w przypadku dżdżownic masy mokre na początku badania oraz przy każdym pobieraniu próbek, przed wypróżnieniem się i po wypróżnieniu się organizmów,
- zawartość lipidów w organizmach badanych (jeśli ustalono),
- krzywe, pokazujące kinetykę absorpcji i eliminacji badanej substancji chemicznej w organizmach, oraz okres czasu konieczny do osiągnięcia stanu ustalonego,
- Ca i Cs (wraz z odchyleniem standardowym i zakresem, w stosownych przypadkach) dla wszystkich przypadków pobierania próbek (Ca wyrażone jako g kg-1 mokrej i suchej masy całego ciała, a Cs wyrażone jako g kg-1 mokrej i suchej masy gleby). Jeśli wymagany jest współczynnik akumulacji biota-gleba (np. na potrzeby porównania wyników z dwóch lub większej liczby badań przeprowadzonych z wykorzystaniem zwierząt o różnej zawartości lipidów), Ca można dodatkowo wyrazić jako g kg-1 zawartości lipidów organizmu, a Cs jako g kg-1 węgla organicznego w glebie,
- współczynnik bioakumulacji (wyrażony jako kg glebykg-1 organizmu), stałą szybkości absorpcji gleby ks (wyrażoną jako g gleby kg-1 organizmu dzień-1), stałą szybkości eliminacji ke (wyrażoną w dzień-1); współczynnik akumulacji biota-gleba (wyrażony jako kg węgla organicznego w glebie kg-1 zawartość lipidów w organizmach) należy również przedstawić w sprawozdaniu,
- jeśli zmierzono: procent macierzystej substancji chemicznej, metabolitów oraz związanych substancji resztkowych (tj. procent badanej substancji chemicznej, która nie może zostać poddana ekstrakcji za pomocą powszechnych metod ekstrakcji) wykryte w glebie i zwierzętach badanych,
- metody statystyczne zastosowane do analizy danych.
Ocena wyników
- zgodność wyników z kryteriami ważności wymienionymi w pkt 17,
- nieoczekiwane lub niestandardowe wyniki, np. niepełna eliminacja badanej substancji chemicznej ze zwierząt badanych.
BIBLIOGRAFIA:
(1) Amorim M (2000). Chronic and toxicokinetic behavior of Lindane (γ-HCH) in the Enchytraeid Enchytraeus albidus. Praca magisterska, Uniwersytet w Coimbrze.
(2) ASTM (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates. Amerykańskie Stowarzyszenie Badań i Materiałów (ASTM), E 1688-00a.
(3) ASTM International (2004). Standard guide for conducting laboratory soil toxicity or bioaccumulation tests with the Lumbricid earthworm Eisenia fetida and the Enchytraeid potworm Enchytraeus albidus. ASTM International, E1676-04: 26 s.
(4) Beek B, Boehling S, Bruckmann U, Franke C, Joehncke U, Studinger G (2000). The assessment of bioaccumulation. W: Hutzinger, O. (red.), The Handbook of Environmental Chemistry, t. 2 część J (t. red.: B. Beek): Bioaccumulation - New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235-276.
(5) Belfroid A, Sikkenk M, Seinen W, Van Gestel C, Hermens J (1994). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in soil. Environ. Toxicol. Chem. 13: 93-99.
(6) Belfroid A, Van Wezel A, Sikkenk M, Van Gestel C, Seinen W & Hermens J (1993). The toxicokinetic behavior of chlorobenzenes in earthworms (Eisenia andrei): Experiments in water. Ecotox. Environ. Safety 25: 154-165.
(7) Belfroid A, Meiling J, Drenth H, Hermens J, Seinen W, Van Gestel C (1995). Dietary uptake of superlipophilic compounds by earthworms (Eisenia andrei). Ecotox. Environ. Safety 31: 185-191.
(8) Bell AW (1958). The anatomy of Enchytraeus albidus, with a key to the species of the genus Enchytraeus. Ann. Mus. Novitat. 1902: 1-13.
(9) Bligh EG i Dyer WJ (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Pysiol. 37: 911-917.
(10) Bouche M (1972). Lombriciens de France. Ecologie et Systematique. INRA, Annales de Zoologie-Ecologie animale, Paris, 671 s.
(11) Bruns E, Egeler Ph, Moser T, Römbke J, Scheffczyk A, Spörlein P (2001a). Standardisierung und Validierung eines Bioakkumulationstests mit terrestrischen Oligochaeten. Report to the German Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D nr: 298 64 416.
(12) Bruns E, Egeler Ph, Römbke J Scheffczyk A, Spörlein P (2001b). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by the oligochaetes Enchytraeus luxuriosus and Enchytraeus albidus (Enchytraeidae, Oligochaeta, Annelida). Hydrobiologia 463: 185-196.
(13) Conder JM i Lanno RP (2003). Lethal critical body residues as measures of Cd, Pb, and Zn bioavailability and toxicity in the earthworm Eisenia fetida. J. Soils Sediments 3: 13-20.
(14) Connell DW i Markwell RD (1990). Bioaccumulation in the Soil to Earthworm System. Chemosphere 20: 91-100.
(15) Didden WAM (1993). Ecology of Terrestrial Enchytraeidae. Pedobiologia 37: 2-29.
(16) Didden W (2003). Oligochaeta, w: Bioindicators and biomonitors. Markert, B.A., Breure, A.M. & Zechmeister, H.G. (red.). Elsevier Science Ltd., The Netherlands, s. 555-576.
(17) De Boer J, Smedes F, Wells D, Allan A (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2, Exercise 1000, EU, Standards, Measurement and Testing Programme.
(18) Dietrich DR, Schmid P, Zweifel U, Schlatter C, JenniEiermann S, Bachmann H, Bühler U, Zbinden N (1995). Mortality of birds of prey following field application of granular carbofuran: A Case Study. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 29: 140-145.
(19) Rozporządzenie (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 18 grudnia 2006 r. w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH), utworzenia Europejskiej Agencji Chemikaliów, zmieniające dyrektywę 1999/45/WE i rozporządzenie Rady (EWG) nr 793/93 i rozporządzenie Komisji (WE) nr 1488/94, jak również dyrektywę Rady 76/769/EWG i dyrektywy Komisji 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/WE i 2000/21/WE (Dz.U. L 396 z 30.12.2006, s. 1).
(20) Edwards CA i Bohlen PJ (1996). Biology and ecology of earthworms. wydanie trzecie, Chapman & Hall, Londyn, 426 s.
(21) OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paryż.
(22) Egeler Ph, Gilberg D, Scheffczyk A, Moser Th i Römbke J (2009). Validation of a Soil Bioaccumulation Test with Terrestrial Oligochaetes by an International Ring Test (Validierung einer Methode zur standardisierten Messung der Bioakkumulation mit terrestrischen Oligochaeten). Sprawozdanie dla federalnej agencji środowiskowej (Umweltbundesamt Dessau-Rosslau), R&D nr: 204 67 458: 149 s. Dostępne do pobrania pod adresem: http://www.oecd.org/dataoecd/12/20/42552727.pdf.
(23) Elmegaard N i Jagers op Akkerhuis GAJM (2000). Safety factors in pesticide risk assessment, Differences in species sensitivity and acute-chronic relations. National Environmental Research Institute, NERI Technical Report 325: 57 s.
(24) Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
(25) Prokuratura Europejska (EPPO) (2003). Environmental Risk Assessment scheme for plant protection products. Soil organisms and functions, EPPO (European Plant Protection Organization) Standards, Bull, OEPP/EPPO 33: 195-208.
(26) Franke C (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment? Chemosphere 32: 1897-1905.
(27) Franke C, Studinger G, Berger G, Böhling S, Bruckmann U, Cohors-Fresenborg D, Jöhncke U (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29: 1501-1514.
(28) Füll C (1996). Bioakkumulation und Metabolismus von -1,2,3,4,5,6-Hexachlorcyclohexan (Lindan) und 2-(2,4-Dichlorphenoxy)-propionsäure (Dichlorprop) beim Regenwurm Lumbricus rubellus (Oligochaeta, Lumbricidae). Praca naukowa, Uniwersystet w Moguncji, 156 s.
(29) Füll C, Schulte C, Kula C (2003). Bewertung der Auswirkungen von Pflanzenschutzmitteln auf Regenwürmer. UWSF - Z. Umweltchem, Ökotox. 15: 78-84.
(30) Gabric A.J, Connell DW, Bell PRF (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24: 1225-1231.
(31) Gardner WS, Frez WA, Cichocki EA, Parrish CC (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30: 1099-1105.
(32) Hawker DW i Connell DW (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcen-tration kinetics with fish. Wat. Res. 22: 701-707.
(33) Hund-Rinke K i Wiechering H (2000). Earthworm avoidance test for soil assessments: An alternative for acute and reproduction tests. J. Soils Sediments 1: 15-20.
(34) Hund-Rinke K, Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Beurteilung der Lebensraumfunktion von Böden mit Hilfe von Regenwurmtests. In: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (red.), Spektrum Verl., Heidelberg, 59-81.
(35) ISO 11268-2 (1998) Soil Quality - Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida). Part 2: Determination of effects on reproduction.
(36) Jaenike J (1982). "Eisenia foetida" is two biological species. Megadrilogica 4: 6-8.
(37) Jager T (1998). Mechanistic approach for estimating bioconcentration of organic chemicals in earthworms (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 17: 2080-2090.
(38) Jager T, Sanchez PA, Muijs B, van der Welde E, Posthuma L (2000). Toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons in Eisenia andrei (Oligochaeta) using spiked soil. Environ. Toxicol. Chem. 19: 953-961.
(39) Jager T, Baerselman R, Dijkman E, De Groot AC, Hogendoorn EA, DeJong A, Kruitbosch JAW, Peijnenburg W J G. M (2003a). Availability of polycyclic aromatic hydrocarbons to earthworms (Eisenia andrei, Oligochaeta) in field-polluted soils and soil-sediment mixtures. Environ. Toxicol. Chem. 22: 767-775.
(40) Jager T, Fleuren RLJ, Hoogendoorn E, de Korte G (2003b). Elucidating the routes of exposure for organic chemicals in the earthworm, Eisenia andrei (Oligochaeta). Environ. Sci. Technol. 37: 3399-3404.
(41) Janssen MPM, Bruins A, De Vries TH, Van Straalen NM (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305-312.
(42) Kasprzak K (1982). Review of enchytraeid community structure and function in agricultural ecosystems. Pedobiologia 23: 217-232.
(43) Khalil AM (1990). Aufnahme und Metabolismus von 14C-Hexachlorbenzol und 14C-Pentachlornitrobenzol in Regenwürmern. Praca naukowa, uniwersytet w Monachium, 137 s.
(44) Landrum PF (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23: 588-595.
(45) Marinussen MPJC, Van der Zee SEATM, De Haan FA (1997). Cu accumulation in Lumbricus rubellus under laboratory conditions compared with accumulation under field conditions. Ecotox. Environ. Safety 36: 17-26.
(46) Mount DR, Dawson TD, Burkhard LP (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegates. Environ. Toxicol. Chem. 18: 1244-1249.
(47) Nendza M (1991). QSARs of bioaccumulation: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations, w: R. Nagel and R. Loskill (red.): Bioaccumulation in aquatic systems, Contributions to the assessment, Proceedings of an international workshop, Berlin 1990, VCH, Weinheim.
(48) Rozdział C.8 niniejszego załącznika. Toksyczność dla dżdżownic.
(49) Rozdział C.13 niniejszego załącznika. Biokoncentracja: badanie ryb w warunkach przepływu.
(50) Rozdział C.21 niniejszego załącznika. Mikroorganizmy żyjące w glebie: badanie przemian azotu.
(51) OECD (2004a), Enchytraeid reproduction test, Test Guideline No. 220, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paryż.
(52) Oecd (2004b), Earthworm reproduction test (Eisenia fetida/Eisenia Andrei), Test Guideline No. 222, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paryż.
(53) OECD (2008), Bioaccumulation in Sediment-dwelling Benthic Oligochates, Test Guideline No. 315, Guidelines for the testing of chemicals, OECD, Paryż.
(54) .Petersen H i Luxton M (1982). A comparative analysis of soil fauna populations and their role in decompo-sition processes. Oikos 39: 287-388.
(55) Phillips DJH (1993). Bioaccumulation. In: Handbook of Ecotoxicology Vol. 1. Calow P. (ed.). Blackwell Scien-tific Publ., Oxford. 378-396.
(56) Pflugmacher J (1992). Struktur-Aktivitätsbestimmungen (QSAR) zwischen der Konzentration von Pflanzen-schutzmitteln und dem Octanol-WasserKoeffzienten UWSF- Z. Umweltchem. Ökotox. 4: 77-81.
(57) Posthuma L, Weltje L, Anton-Sanchez FA (1996). Joint toxic effects of cadmium and pyrene on reproduction and growth of the earthworm Eisenia fetida. RIVM Report No. 607506001, Bilthoven.
(58) Randall RC, Lee II H, Ozretich RJ, Lake JL, Pruell RJ (1991). Evaluation of selected lipid methods for norma-lising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10: 1431-1436.
(59) Römbke J, Egele, P, Füll C (1998). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestri-schen Medium. UBA-Texte 28/98, 84 s.
(60) Römbke J and Moser Th (1999). Organisation and performance of an international ring-test for the validation of the Enchytraeid reproduction test. UBA-Texte 4/99: 373 s.
(61) Römbke J, Riepert F, Achazi R (2000). Enchytraeen als Testorganismen, w: Toxikologische Beurteilung von Böden. Heiden, S., Erb, R., Dott, W. & Eisentraeger, A. (red.). Spektrum Verl., Heidelberg. 105-129.
(62) Romijn CA.FM, Luttik R, Van De Meent D, Slooff W,Canton JH (1993). Presentation of a General Algorithm to Include Effect Assessment on Secondary Poisoning in the Derivation of Environmental Quality Criteria, Part 2: Terrestrial food chains. Ecotox. Envir. Safety 27: 107-127.
(63) Sample BE, Suter DW, Beauchamp JJ, Efroymson RA (1999). Literature-derived bioaccumulation models for earthworms: Development and validation. Environ. Toxicol. Chem. 18: 2110-2120.
(64) Schlosser H-J i Riepert F (1992). Entwicklung eines Prüfverfahrens für Chemikalien an Bodenraubmilben (Gamasina), Teil 2: Erste Ergebnisse mit Lindan und Kaliumdichromat in subletaler Dosierung. Zool. Beitr. NF 34: 413-433.
(65) Schmelz R i Collado R (1999). Enchytraeus luxuriosus sp. nov., a new terrestrial oligochaete species (Enchytra-eide, Clitellata, Annelida). Carolinea 57: 93-100.
(66) Sims R W i Gerard BM (1985). Earthworms, w: Kermack, D. M. & Barnes, R. S. K. (Hrsg.): Synopses of the British Fauna (New Series) No. 31. 171 S. London: E. J. Brill/Dr W. Backhuys.
(67) Sousa JP, Loureiro S, Pieper S, Frost M, Kratz W, Nogueira AJA, Soares AMVM (2000). Soil and plant diet exposure routes and toxicokinetics of lindane in a terrestrial isopod. Environ. Toxicol. Chem. 19: 2557-2563.
(68) Spacie A i Hamelink JL (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320.
(69) Stephenson GL, Kaushik A, Kaushik NK, Solomon KR, Steele T, Scroggins RP (1998). Use of an avoidance-response test to assess the toxicity of contaminated soils to earthworms. w: Advances in earthworm ecoto-xicology. S. Sheppard, J. Bembridge, M. Holmstrup, L. Posthuma (red.). Setac Press, Pensacola, 67-81.
(70) Sterenborg I, Vork NA, Verkade SK, Van Gestel CAM, Van Straalen NM (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167-1171.
(71) UBA (Umweltbundesamt) (1991). Bioakkumulation - Bewertungskonzept und Strategien im Gesetzesvollzug. UBA-Texte 42/91. Berlin.
(72) US EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Second Edition, EPA 600/R-99/064, US, Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000.
(73) Van Brummelen TC i Van Straalen NM (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277-285.
(74) Van Gestel CAM. (1992). The influence of soil characteristics on the toxicity of chemicals for earthworms; a review, w: Ecotoxicology of Earthworms (red. Becker, H, Edwards, PJ, Greig-Smith, PW & Heimbach, F). Intercept Press, Andover (GB).
(75) Van Gestel CA i Ma WC (1990). An approach to quantitative structure-activity relationships (QSARs) in earthworm toxicity studies. Chemosphere 21: 1023-1033.
(76) Van Straalen NM, Donker MH, Vijver MG, van Gestel CAM (2005). Bioavailability of contaminants estimated from uptake rates into soil invertebrates. Environmental Pollution 136: 409-417.
(77) Venter JM i Reinecke AJ (1988). The life-cycle of the compost-worm Eisenia fetida (Oligochaeta). South African J. Zool. 23: 161-165.
(78) Vijver MG, Vink JPM, Jager T, Wolterbeek HT, van Straalen NM, van Gestel CAM (2005). Biphasic elimination and uptake kinetics of Zn and Cd in the earthworm Lumbricus rubellus exposed to contaminated floodplain soil. Soil Biol, Biochem. 37: 1843-1851.
(79) Widianarko B i Van Straalen NM (1996). Toxicokinetics-based survival analysis in bioassays using nonpersis-tent chemicals, Environ. Toxicol. Chem. 15: 402-406.
Dodatek 1
DEFINICJE
Bioakumulacja to wzrost stężenia badanej substancji chemicznej w organizmie lub na organizmie w stosunku do stężenia badanej substancji chemicznej w otaczającym środowisku. Bioakumulacja wynika zarówno z procesu biokoncen-tracji, jak i z procesu biomagnifikacji (zob. poniżej).
Biokoncentracja to wzrost stężenia badanej substancji chemicznej w/na organizmie, wynikający z absorpcji substancji chemicznej wyłącznie z otaczającego środowiska (np. poprzez powierzchnię ciała oraz spożytą glebę), w stosunku do stężenia badanej substancji chemicznej w otaczającym środowisku.
Biomagnifikacja to wzrost stężenia badanej substancji chemicznej w/na organizmie, wynikający głównie ze absorpcji zanieczyszczonego pożywienia lub żeru, w stosunku do stężenia badanej substancji chemicznej w takim pożywieniu lub żerze. Biomagnifikacja może prowadzić do przeniesienia lub akumulacji jednostki badanej w ramach sieci pokarmowych.
Eliminacja badanej substancji chemicznej stanowi stratę takiej substancji chemicznej z tkanki badanego organizmu w drodze czynnych lub biernych procesów, przy czym taka strata zachodzi niezależnie od obecności lub braku jednostki badanej w otaczającym środowisku.
Współczynnik bioakumulacji (BAF) w dowolnym momencie podczas etapu absorpcji w trakcie opisanego tu badania bioakumulacji stanowi stężenie badanej substancji chemicznej w/na badanym organizmie (Ca wyrażone w gkg-1 suchej masy organizmu) podzielone przez stężenie substancji chemicznej w otaczającym środowisku (Cs wyrażone jako gkg-1 suchej masy gleby); współczynnik bioakumulacji wyraża się w jednostkach kg glebykg-1 organizmu.
Współczynnik bioakumulacji w stanie ustalonym (BAFss) to współczynnik bioakumulacji w stanie ustalonym, który nie zmienia się w znaczący sposób przez długi okres czasu, a stężenie badanej substancji chemicznej w otaczającym środowisku (Cs wyrażane jako g.kg-1 suchej masy gleby) jest podczas tego okresu stałe.
Współczynniki bioakumulacji obliczane bezpośrednio na podstawie stosunku stałej szybkości absorpcji gleby do stałej szybkości eliminacji (ks oraz ke, zob. poniżej) nazywa się kinetycznymi współczynnikami bioakumulacji (BAFK).
Współczynnik akumulacji biota-gleba (BSAF) stanowi stężenie badanej substancji chemicznej o znormalizowanym poziomie lipidów w/na organizmie badanym, podzielone przez stężenie badanej substancji chemicznej o znormalizowanym poziomie węgla organicznego w glebie w stanie ustalonym. Ca w takim przypadku wyraża się jako gkg-1 zawartości lipidów w organizmie, a Cs jako gkg-1 zawartości węgla organicznego w glebie; współczynnik akumulacji biota-gleba wyraża się w kg węgla organicznegokg-1 lipidów.
Plateau lub stan ustalony określa się jako równowagę między procesem absorpcji a procesem eliminacji, które zachodzą równolegle podczas etapu narażenia. Stan ustalony zostaje osiągnięty na wykresie współczynnika bioakumulacji w czasie w momencie, kiedy krzywa staje się równoległa do osi czasu, a trzy następujące po sobie analizy współczynnika bioakumulacji, wykonane na próbkach pobranych w odstępach co najmniej dwóch dni, różnią się od siebie nie więcej niż w 20 % i między trzema okresami pobierania próbek nie ma statystyczne istotnych różnic. W przypadku badanych substancji chemicznych, które wolno ulegają absorpcji, bardziej odpowiednie będą odstępy czasowe wynoszące siedem dni (49).
Współczynnik podziału węgiel organiczny-woda (Koc) to stosunek stężenia substancji chemicznej w/na frakcji węgla organicznego gleby i stężenia substancji chemicznej w wodzie w warunkach równowagi.
Współczynnik podziału oktanol-woda (Kow) jest to stosunek rozpuszczalności substancji chemicznej w n-oktanolu i wodzie w warunkach równowagi, określany czasami także jako Pow. Logarytm Kow (log Kow) wykorzystuje się jako wskaźnik zdolności substancji chemicznej do bioakumulacji w organizmach wodnych.
Etap absorpcji lub narażenia to czas, w trakcie którego organizmy badane poddaje się narażeniu na działanie badanej substancji chemicznej.
Stała szybkości absorpcji gleby (ks) stanowi wartość liczbową określającą szybkość wzrostu stężenia jednostki badanej w/na organizmie badanym, wynikającego z etapu absorpcji substancji z gleby. ks wyraża się jako g gleby kg-1 organizmu d-1.
Etap eliminacji to czas następujący po przeniesieniu organizmów badanych z zanieczyszczonego środowiska do środowiska niezawierającego jednostki badanej, kiedy to bada się eliminację (lub stratę netto) substancji chemicznej z organizmów badanych.
Stała szybkości eliminacji (ke) stanowi wartość liczbową określającą szybkość zmniejszania się stężenia jednostki badanej w/na organizmie badanym, po przeniesieniu organizmów badanych ze środowiska zawierającego jednostkę badaną do środowiska niezawierającego danej substancji chemicznej; ke wyraża się jako d-1.
Badana substancja chemiczna: jakakolwiek substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.
Dodatek 2
Obliczanie parametrów absorpcji i eliminacji
Głównym punktem końcowym badania bioakumulacji jest współczynnik bioakumulacji. Zmierzony współczynnik bioakumulacji można obliczyć poprzez podzielenie stężenia w organizmie badanym, Ca, przez stężenie w glebie, Cs, w stanie ustalonym. Jeśli podczas etapu absorpcji nie osiągnięto stanu ustalonego, oblicza się kinetyczny współczynnik bioakumulacji na podstawie stałych szybkości zamiast współczynnika bioakumulacji w stanie ustalonym. Należy jednak zwrócić uwagę, czy współczynnik bioakumulacji jest oparty na stężeniach w stanie ustalonym, czy też nie.
Kinetyczny współczynnik bioakumulacji, stałą szybkości absorpcji (ks) i stałą szybkości eliminacji (ke) uzyskuje się zazwyczaj poprzez zastosowanie komputerowych, nieliniowych metod estymacji parametrycznej, np. na podstawie modeli opisanych w (68). Jeśli przyjąć zestaw danych dotyczących czasu sekwencyjnego stężenia i równania modelowe:
0 ˂ t ˂ tc [równanie 1]
lub
t ˃ tc [równanie 2]
gdzie:
Ca = stężenie substancji chemicznej w organizmach [g kg-1 masy mokrej lub suchej],
ks = stała szybkości absorpcji w tkance [g gleby kg-1 organizmu d-1],
Cs = stężenie substancji chemicznej w glebie [g kg-1 masy mokrej lub suchej],
ke = stała szybkości eliminacji [d-1],
tc = czas na koniec etapu absorpcji,
takie programy komputerowe obliczają wartości dla kinetycznego współczynnika bioakumulacji, ks i ke.
Gdy stężenie tła w organizmach nienarażonych na działanie substancji, np. w dniu 0, różni się znacznie od zera (taka sytuacja może pojawić się na przykład w przypadku metali), takie stężenie tła (Ca0) należy uwzględnić w takich równaniach, aby wyglądały one następująco:
0 ˂ t ˂ tc [równanie 3]
lub
t ˃ tc [równanie 4]
W przypadku zaobserwowania podczas etapu absorpcji znaczącego spadku w czasie stężenia badanej substancji chemicznej w glebie, należy zastosować następujące modele, np. (67) (79):
Cs = C0(e-k 0 t) [równanie 5]
gdzie:
Cs = stężenie substancji chemicznej w glebie [g kg-1 masy mokrej lub suchej],
k0 = stała szybkości rozkładu w glebie [d-1],
C0 = początkowe stężenie substancji chemicznej w glebie [g kg-1 masy mokrej lub suchej].
0 ˂ t ˂ tc [równanie 6]
t ˃ tc [równanie 7]
gdzie:
Ca = stężenie substancji chemicznej w organizmach [g kg-1 masy mokrej lub suchej],
ks = stała szybkości absorpcji w tkance [g gleby kg-1 organizmu d-1],
k0 = stała szybkości rozkładu w glebie [d-1],
ke = stała szybkości eliminacji [d-1],
tc = czas na koniec etapu absorpcji.
W przypadku osiągnięcia podczas etapu absorpcji stanu ustalonego (tj. t = ∞ ) równanie 1
0 ˂ t ˂ tc [równanie 1]
można zredukować do:
lub
Ca/Cs = ks/ke = BAFK [równanie 8]
Stężenie jednostki badanej w tkance organizmu w stanie ustalonym (Cass) oblicza się wtedy za pomocą ks/ke x Cs.
Współczynnik akumulacji biota-gleba można obliczyć w następujący sposób:
[równanie 9]
gdzie foc stanowi frakcję węgla organicznego w glebie, a flip frakcję lipidów w organizmie, przy czym wartości te należy określić na podstawie próbek pobranych z badania oraz, odpowiednio, na podstawie masy suchej lub mokrej.
Kinetykę eliminacji można modelować za pomocą danych z etapu eliminacji oraz poprzez zastosowanie następującego modelu równania oraz komputerowej, nieliniowej metody estymacji parametrycznej. Jeśli dane pomiarowe wykreślone w czasie wskazują na stały wykładniczy spadek stężenia jednostki badanej w zwierzętach, do opisania przebiegu eliminacji w czasie można zastosować model jednoprzedziałowy (równanie 9).
Ca(t) = Ca,ss × e-k et [równanie 10]
Procesy eliminacji czasami okazują się dwufazowe, wykazując szybki spadek Ca na wczesnych etapach, który zmienia się w wolniejszą stratę jednostek badanych na późniejszych etapach eliminacji, np. (27) (68). Takie dwa etapy można interpretować, zakładając, że w organizmie istnieją dwa różne przedziały, z których jednostka badana jest eliminowana z różną szybkością. W takich przypadkach należy przeanalizować odnośną literaturę, np. (38) (39) (40) (78).
Przy zastosowaniu modeli równań przedstawionych powyżej parametry kinetyczne (ks i ke) można obliczyć również za jednym razem, stosując model kinetyki reakcji pierwszego rzędu do wszystkich danych z etapu absorpcji i eliminacji jednocześnie. Aby poznać opis metody, która pozwala na takie połączone obliczanie stałych szybkości absorpcji i eliminacji, można zapoznać się z pozycjami w bibliografii (41), (73) i (70).
[równanie 11]
Uwaga: Jeśli parametry absorpcji i eliminacji szacuje się jednocześnie na podstawie połączonych danych z etapu absorpcji i eliminacji, "m" w równaniu 11 stanowi deskryptor, który umożliwia programowi komputerowemu przypisanie podterminów równania do zestawów danych z odpowiedniego etapu oraz poprawne przeprowadzenie oceny (m = 1 dla etapu absorpcji, m = 2 dla etapu eliminacji).
Niemniej jednak takie modele równań należy stosować z ostrożnością, zwłaszcza jeśli podczas badania zachodzą zmiany w biodostępności badanej substancji chemicznej, biodegradacja lub rozkład (zob. np. (79)).
Dodatek 3
PRZYKŁADOWE HARMONOGRAMY BADAŃ BIOAKUMULACJI W GLEBIE
Badanie z wykorzystaniem dżdżownic
a) Etap absorpcji z pobieraniem próbek w 8 datach na potrzeby obliczenia kinetyki
| Dzień | Czynność |
| -6 | kondycjonowanie przygotowanej gleby przez 48 godzin; |
| -4 | wzbogacenie frakcji gleby roztworem substancji chemicznej; odparowanie wszelkich rozpuszczalników; wymieszanie składników gleby; rozprowadzenie gleby do naczyń do badania; osiąganie równowagi w warunkach badania - 4 dni (3 tygodnie w przypadku gleby wzbogaconej metalem); |
| -3 do -1 | oddzielenie organizmów badanych od kultury w celu ich aklimatyzacji; przygotowanie i nawilżenie składników gleby; |
| 0 | pomiar temperatury i pH gleby; usunięcie próbek gleby z naczyń poddawanych działaniu substancji oraz kontroli rozpuszczalnika w celu określenia stężenia badanej substancji chemicznej; dodanie porcji pożywienia; zważenie i randomizowane rozprowadzenie organizmów do naczyń do badania; zachowanie wystarczającej liczby podpróbek organizmów na potrzeby określenia analitycznych wartości dotyczących tła, masy mokrej i suchej oraz zawartości lipidów; zważenie wszystkich naczyń do badania w celu kontrolowania wilgotności gleby; skontrolowanie dopływu powietrza, jeśli stosuje się zamknięty system badania; |
| 1 | skontrolowanie dopływu powietrza, odnotowanie zachowań organizmów i temperatury; pobranie próbek gleby i organizmów w celu określenia stężenia jednostki badanej; |
| 2 | takie jak w dniu 1; |
| 3 | skontrolowanie dopływu powietrza, zachowań organizmów i temperatury; |
| 4 | takie jak w dniu 1; |
| 5-6 | takie jak w dniu 3; |
| 7 | takie jak w dniu 1; dodanie porcji pożywienia; kontrola wilgotności gleby poprzez ponowne zważenie naczyń do badania oraz uzupełnienie odparowanej wody; |
| 8-9 | takie jak w dniu 3; |
| 10 | takie jak w dniu 1; |
| 11-13 | takie jak w dniu 3; |
| 14 | takie jak w dniu 1; dodanie porcji pożywienia; kontrola wilgotności gleby poprzez ponowne zważenie naczyń do badania oraz uzupełnienie odparowanej wody; |
| 15-16 | takie jak w dniu 3; |
| 17 | takie jak w dniu 1; |
| 18-20 | takie jak w dniu 3; |
| 21 | takie jak w dniu 1; pomiar temperatury i pH gleby; kontrola wilgotności gleby poprzez ponowne zważenie naczyń do badania; koniec etapu absorpcji; przeniesienie organizmów z pozostałych poddawanych narażeniu replikatów do naczyń zawierających czystą glebę w celu rozpoczęcia etapu eliminacji (bez wypróżniania się organizmów); pobranie próbek gleby i organizmów z kontroli rozpuszczalnika. |
| Czynności wykonywane przed narażeniem (etap osiągania równowagi) należy zaplanować w czasie, uwzględniając właściwości badanej substancji chemicznej. | |
| Czynności opisane dla dnia 3 należy wykonywać codziennie (przynajmniej w dni robocze). |
b) Etap eliminacji
| Dzień | Czynność |
| -6 | przygotowanie i nawilżenie składników gleby; kondycjonowanie przygotowanej gleby przez 48 godzin; |
| -4 | wymieszanie składników gleby; rozprowadzenie gleby do naczyń do badania; inkubacja w warunkach badania przez 4 dni; |
| 0 (koniec etapu absorpcji) | pomiar temperatury i pH gleby; ważenie i randomizowane rozprowadzenie organizmów do naczyń do badania; dodanie porcji pożywienia; przeniesienie organizmów z pozostałych poddawanych narażeniu replikatów do naczyń zawierających czystą glebę; pobranie próbek gleby i organizmów po 4-6 godzinach w celu określenia stężenia badanej substancji chemicznej; |
| 1 | skontrolowanie dopływu powietrza, odnotowanie zachowań organizmów i temperatury; pobranie próbek gleby i organizmów w celu określenia stężenia badanej substancji chemicznej; |
| 2 | takie jak w dniu 1; |
| 3 | skontrolowanie dopływu powietrza, zachowań organizmów i temperatury; |
| 4 | takie jak w dniu 1; |
| 5-6 | takie jak w dniu 3; |
| 7 | takie jak w dniu 1; dodanie porcji pożywienia; kontrola wilgotności gleby poprzez ponowne zważenie naczyń do badania oraz uzupełnienie odparowanej wody; |
| 8-9 | takie jak w dniu 3; |
| 10 | takie jak w dniu 1; |
| 11-13 | takie jak w dniu 3; |
| 14 | takie jak w dniu 1; dodanie porcji pożywienia; kontrola wilgotności gleby poprzez ponowne zważenie naczyń do badania oraz uzupełnienie odparowanej wody; |
| 15-16 | takie jak w dniu 3; |
| 17 | takie jak w dniu 1; |
| 18-20 | takie jak w dniu 3; |
| 21 | takie jak w dniu 1; pomiar temperatury i pH gleby; kontrola wilgotności gleby poprzez ponowne zważenie naczyń do badania; pobranie próbek gleby i organizmów z kontroli rozpuszczalnika. |
| Przygotowanie gleby przed rozpoczęciem etapu eliminacji należy przeprowadzać w taki sam sposób, w jaki miało to miejsce w przypadku etapu absorpcji. | |
| Czynności opisane dla dnia 3 należy wykonywać codziennie (przynajmniej w dni robocze). |
Badanie z wykorzystaniem wazonkowcowatych
a) Etap absorpcji z pobieraniem próbek w 8 datach na potrzeby obliczenia kinetyki
| Dzień | Czynność |
| -6 | kondycjonowanie przygotowanej gleby przez 48 godzin; |
| -4 | wzbogacanie frakcji gleby roztworem substancji chemicznej; odparowanie wszelkich rozpuszczalników; wymieszanie składników gleby; rozprowadzenie gleby do naczyń do badania; osiąganie równowagi w warunkach badania - 4 dni (3 tygodnie w przypadku gleby wzbogaconej metalem); |
| Dzień | Czynność |
| -3 do -1 | oddzielenie organizmów badanych od kultury w celu ich aklimatyzacji; przygotowanie i nawilżenie składników gleby; |
| 0 | pomiar temperatury i pH gleby; usunięcie próbek gleby z naczyń poddawanych działaniu substancji oraz kontroli rozpuszczalnika w celu określenia stężenia badanej substancji chemicznej; dodanie porcji pożywienia; zważenie i randomizowane rozprowadzenie organizmów do naczyń do badania; zachowanie wystarczającej liczby podpróbek organizmów na potrzeby określenia analitycznych wartości dotyczących tła, masy mokrej i suchej oraz zawartości lipidów; zważenie wszystkich naczyń do badania w celu kontrolowania wilgotności gleby; skontrolowanie dopływu powietrza, jeśli stosuje się zamknięty system badania; |
| 1 | skontrolowanie dopływu powietrza, odnotowanie zachowań organizmów i temperatury; pobranie próbek gleby i organizmów w celu określenia stężenia jednostki badanej; |
| 2 | takie jak w dniu 1; |
| 3 | skontrolowanie dopływu powietrza, zachowań organizmów i temperatury; |
| 4 | takie jak w dniu 1; |
| 5-6 | takie jak w dniu 3; |
| 7 | takie jak w dniu 1; dodanie porcji pożywienia; kontrola wilgotności gleby poprzez ponowne zważenie naczyń do badania oraz uzupełnienie odparowanej wody; |
| 9 | takie jak w dniu 1; |
| 10 | takie jak w dniu 3; |
| 11 | takie jak w dniu 1; |
| 12-13 | takie jak w dniu 3; |
| 14 | takie jak w dniu 1; dodanie porcji pożywienia; pomiar temperatury i pH gleby; kontrola wilgotności gleby poprzez ponowne zważenie naczyń do badania; koniec etapu absorpcji; przeniesienie organizmów z pozostałych poddawanych narażeniu replikatów do naczyń zawierających czystą glebę w celu rozpoczęcia etapu eliminacji (bez wypróżniania się organizmów); pobranie próbek gleby i organizmów z kontroli rozpuszczalnika. |
| Czynności wykonywane przed narażeniem (etap osiągania równowagi) należy zaplanować w czasie, uwzględniając właściwości badanej substancji chemicznej. | |
| Czynności opisane dla dnia 3 należy wykonywać codziennie (przynajmniej w dni robocze). |
Dodatek 4
Gleba sztuczna - zalecenia dotyczące jej przygotowania i przechowywania
Jako że gleby naturalne z konkretnego źródła mogą nie być dostępne przez cały rok, a organizmy rodzime oraz obecność mikrozanieczyszczeń mogą mieć wpływ na badanie, w opisanym tu badaniu zaleca się stosowanie podłoża sztucznego, sztucznej gleby zgodnie z rozdziałem C.8 niniejszego załącznika, Toksyczność dla dżdżownic (48). W takiej glebie przeżyć, rozwijać się i rozmnażać może kilka gatunków badanych, a także zapewnia się w ten sposób maksymalną standaryzację oraz porównywalność warunków badania i hodowli w ramach danego laboratorium oraz między laboratoriami.
Składniki gleby
| Torf: | 10 % | Torf z rozkładu torfowca (Sphagnum), zgodnie z wytyczną OECD nr 207 (48); |
| Piasek kwarcowy: | 70 % | Pprzemysłowy piasek kwarcowy (wysuszony powietrzem); wielkość ziaren: ponad 50 % cząstek powinna mieścić się w przedziale 50-200 μ m, ale wszystkie cząstki powinny być ≤ 2 mm; |
| Glinka kaolinowa: | 20 % | Zawartość kaolinitu ≥ 30 %; |
| Węglan wapnia: | ≤ 1 % | CaCO3, sproszkowany, chemicznie czysty. |
Opcjonalnie zawartość węgla organicznego w glebie sztucznej można zmniejszyć, np. poprzez obniżenie zawartości torfu do 4-5 % suchej gleby oraz odpowiednie zwiększenie zawartości piasku. Dzięki takiemu zmniejszeniu zawartości węgla organicznego mogą zmniejszyć się możliwości adsorpcji badanej substancji chemicznej do gleby (węgiel organiczny), a dostępność badanej substancji chemicznej dla organizmów może wzrosnąć (74). Wykazano, że gatunki Enchytraeus albidus i Eisenia fetida mogą spełniać warunki ważności dotyczące rozmnażania, jeśli bada się je w glebach naturalnych o niższej zawartości węgla organicznego, np. 2,7 % (33) (61), oraz istnieją doświadczenia pokazujące, że pozwala na to również zastosowanie gleby sztucznej przy zawartości torfu na poziomie 5 %.
Przygotowanie
Suche składniki gleby dokładnie się miesza (np. w dużym mieszalniku laboratoryjnym). Taką czynność należy przeprowadzić około tygodnia przed rozpoczęciem badania. Wymieszane suche składniki gleby należy nawilżyć dejonizowaną wodą co najmniej 48 godzin przed zastosowaniem badanej jednostki, w celu wyrównania/stabilizacji kwasowości. W celu określenia pH stosuje się mieszaninę gleby i roztworu 1 M KCl w stosunku 1:5. Jeśli wartość pH nie mieści się w wymaganym przedziale (6,0 ± 0,5), do gleby dodaje się odpowiednią ilość CaCO3 lub przygotowuje się nową partię gleby.
Maksymalną zdolność zatrzymywania wody gleby sztucznej określa się zgodnie z ISO 11268-2 (35). Co najmniej dwa dni przed rozpoczęciem badania suchą glebę sztuczną nawilża się poprzez dodanie odpowiedniej ilości wody dejonizowanej lub regenerowanej w celu uzyskania około połowy końcowej zawartości wody. Końcowa zawartość wody powinna wynosić 40-60 % maksymalnej zdolności zatrzymywania wody. Na początku badania uprzednio nawilżoną glebę dzieli się na liczbę partii odpowiadającą liczbie badanych stężeń oraz kontroli zastosowanych w badaniu, a zawartość wilgoci dostosowuje się do poziomu 40-60 % maksymalnej zdolności zatrzymywania wody poprzez zastosowanie roztworu jednostki badanej lub poprzez dodanie wody dejonizowanej lub regenerowanej. Zawartość wilgoci określa się na początku i na końcu badania (przy temperaturze 105 °C). Zawartość wilgoci powinna być optymalna dla wymogów dotyczących danego gatunku (zawartość wilgoci sprawdza się w następujący sposób: jeśli glebę delikatnie ściśnie się w dłoni, między palcami powinny pojawić się kropelki wody).
Przechowywanie
Suche składniki gleby sztucznej można, do czasu ich wykorzystania, przechowywać w temperaturze pokojowej. Przygotowaną i uprzednio nawilżoną glebę można przed wzbogaceniem przechowywać w chłodnym miejscu przez maksymalny okres trzech dni; należy dołożyć starań, by zminimalizować odparowanie wody. Glebę wzbogaconą jednostką badaną należy zastosować niezwłocznie, chyba że istnieją informacje wskazujące, że daną glebę można przechowywać bez wpływu dla toksyczności i biodostępności jednostki badanej. Próbki wzbogaconej gleby można następnie, do czasu ich analizy, przechowywać w warunkach zalecanych dla danej jednostki badanej.
Dodatek 5
Gatunki skąposzczetów lądowych zalecane do wykorzystania w badaniu bioakumulacji z gleby
Dżdżownice
Zaleca się wykorzystanie w badaniu gatunku Eisenia fetida (Savigny 1826), należącego do rodziny dżdżownicowatych. Od 1972 r. rozróżnia się dwa podgatunki tego gatunku (Eisenia fetida i Eisenia andrei (10)). Według Jaenike (36) są to dwa prawdziwie osobne gatunki. Eisenia fetida można łatwo rozpoznać dzięki jej jasnym żółtym paskom między segmentami, zaś Eisenia andrei charakteryzuje się jednolitą ciemnoczerwoną barwą. Gatunki te pochodzą prawdopodobnie z regionu Morza Czarnego, a obecnie występują na całym świecie, zwłaszcza w siedliskach modyfikowanych przez działalność człowieka, na przykład w pryzmach kompostowych. Organizmy obydwu tych gatunków można wykorzystywać do badań ekotoksykologicznych i badań bioakumulacji.
Eisenia fetida i Eisenia andrei są dostępne na rynku, np. jako przynęta na ryby. W porównaniu z innymi dżdżownicami z rodziny dżdżownicowatych organizmy te mają krótki cykl życia i osiągają dojrzałość w ciągu ok. 2-3 miesięcy (w temperaturze pokojowej). Optymalną dla nich temperaturą jest ok. 20-24 °C. Gatunki te preferują względnie wilgotne podłoża z prawie neutralnym pH oraz wysoką zawartością materiału organicznego. Jako że od około 25 lat powszechnie wykorzystuje się je w zestandaryzowanych badaniach ekotoksykologicznych, ich hodowla jest dobrze opisana (48) (77).
Obydwa gatunki można hodować w różnych odchodach zwierzęcych. Pożywką hodowlaną zalecaną przez ISO (35) jest mieszanina obornika końskiego lub krowiego oraz torfu w stosunku 50:50. Taka pożywka powinna mieć wartość pH na poziome około 6 do 7 (regulowane węglanem wapnia), niskie przewodnictwo jonowe (niższe niż 6 mS/cm lub niższe niż 0,5 % stężenia soli) oraz nie powinna być zbyt zanieczyszczona amoniakiem lub zwierzęcym moczem. Można także zastosować dostępną na rynku glebę ogrodniczą niezawierającą dodatków lub też glebę sztuczną zgodnie z OECD (48), lub też mieszaninę takich dwóch gleb w proporcji 50:50. Podłoże powinno być wilgotne, ale nie zbytnio mokre. Do hodowli odpowiednie są skrzynki hodowlane o pojemności od 10 do 50 litrów.
Aby uzyskać organizmy o standardowym wieku i masie, hodowlę najlepiej rozpocząć z zastosowaniem kokonów. W tym celu dorosłe organizmy dodaje się do skrzynki hodowlanej zawierającej świeże podłoże w celu wytworzenia kokonów. Doświadczenie pokazuje, że dobre wskaźniki rozmnażania uzyskuje się przy zagęszczeniu na poziomie około 100 dorosłych organizmów na kg podłoża (masa mokra). Po 28 dniach usuwa się dorosłe organizmy. Dżdżownice wyklute z kokonów wykorzystuje się do badania w chwili, gdy osiągną one dojrzałość po co najmniej 2 miesiącach, lecz nie dłużej niż po 12 miesiącach.
Organizmy z gatunków opisanych powyżej można uznać za zdrowe, jeśli przekopują się przez podłoże, nie próbują opuścić podłoża oraz rozmnażają się w sposób ciągły. Bardzo powolne poruszanie się lub żółta tylna końcówka (w przypadku Eisenia fetida) wskazują na zużycie podłoża. W takim przypadku zaleca się zastosowanie świeżego podłoża lub mniejszej liczby zwierząt na jedną skrzynkę.
Dodatkowa wybrana bibliografia
Gerard BM (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6 Lumbricidae. Linnean Soc. Londyn, 6: 1-58.
Graff O (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Landwirtsch. 7: 1-81.
Römbke J, Egeler P, Füll C (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 909, 86 S.
Rundgren S (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden. Oikos 28: 49-55.
Satchell JE (1955). Some aspects of earthworm ecology. Soil Zoology (Kevan): 180-201.
Sims RW and Gerard BM (1985). A synopsis of the earthworms. Linnean Soc. Londyn 31: 1-171.
Tomlin AD (1984). The earthworm bait market in North America. In: Earthworm Ecology - from Darwin to vermicul-ture. Satchell, J.E. (ed.), Chapman & Hall, Londyn. 331-338 s.
Wazonkowcowate
Zaleca się wykorzystanie w badaniu gatunku Enchytraeus albidus Henle 1837. Enchytraeus albidus jest jednym z największych (do 15 mm) gatunków z rodziny wazonkowcowatych, typ: pierścienice, klasa: skąposzczety, oraz występuje na całym świecie (8). Organizmy tego gatunku można spotkać w siedliskach morskich, limnicznych i lądowych, głównie w rozkładającej się materii organicznej (wodorosty, kompost), oraz rzadziej także na łąkach (42). Ta duża tolerancja ekologiczna oraz niektóre odmiany morfologiczne wskazują, że w przypadku tego gatunku mogą istnieć różne rasy.
Enchytraeus albidus jest dostępny na rynku, sprzedawany jako pokarm dla ryb. Należy sprawdzić, czy kultura nie jest zanieczyszczona innymi, zazwyczaj mniejszymi, gatunkami (60). Jeśli takie zanieczyszczenie występuje, wszystkie organizmy badane należy umyć w wodzie na szalkach Petriego. Następnie w celu rozpoczęcia nowej kultury wybiera się duże
dorosłe osobniki z gatunku Enchytraeus albidus (z pomocą mikroskopu stereoskopowego). Wszystkie inne organizmy odrzuca się. Cykl życia tego gatunku jest krótki i organizmy osiągają dojrzałość w okresie od 33 dni (przy temperaturze 18 °C) do 74 dni (przy temperaturze 12 °C). W badaniu należy wykorzystać wyłącznie kultury przechowywane w laboratorium przez okres co najmniej 5 tygodni bez żadnych problemów (jedno pokolenie).
Inne gatunki z rodzaju Enchytraeus również nadają się do wykorzystania w badaniu, zwłaszcza Enchytraeus luxuriosus. Organizmy tego gatunku są prawdziwymi mieszkańcami gleby, co zostało opisane w (65). W przypadku wykorzystania innych gatunków Enchytraeus należy je wyraźnie zidentyfikować oraz przedstawić uzasadnienie wyboru gatunku.
Enchytraeus crypticus (Westheide & Graefe 1992) jest gatunkiem należącym do tej samej grupy co Enchytraeus luxuriosus. Nie ma pewności, czy gatunek ten żyje na polach, jako że jego opisy dotyczą wyłącznie kultur dżdżownic i pryzm kompostowych (Römbke 2003). Tym samym nieznane są jego pierwotne wymagania ekologiczne. Niemniej jednak niedawne badania laboratoryjne z wykorzystaniem różnych gleb naturalnych potwierdziły, że gatunek ten ma dużą tolerancję na właściwości gleby, takie jak pH i tekstura (Jänsch i in. 2005). Ostatnio gatunek ten często wykorzystuje się w badaniach ekotoksykologicznych z uwagi na łatwość jego hodowli i badania, np. Kuperman i in. 2003). Jednak w porównaniu z Enchytraeus albidus jest to gatunek o małym rozmiarze (3-12 mm; średnio 7 mm (Westheide & Müller 1996)), co utrudnia jego stosowanie. Przy wykorzystaniu tego gatunku, zamiast Enchytraeus albidus, rozmiar naczynia do badania może być mniejszy, lecz nie musi. Ponadto należy wziąć pod uwagę, że ten gatunek rozmnaża się bardzo szybko i jego czas trwania pokolenia wynosi mniej niż 20 dni przy temperaturze 20 ± 2 °C (Achazi i in. 1999), a nawet krócej w wyższych temperaturach.
Organizmy z gatunku Enchytraeus albidus (a także inne gatunki z rodzaju Enchytraeus) można hodować w dużych plastikowych skrzyniach (np. o wymiarach 30 × 60 × 10 cm lub 20 × 12 × 8 cm, które są odpowiednie do hodowli organizmów małego rozmiaru) wypełnionych mieszaniną gleby sztucznej i dostępnej na rynku niezanieczyszczonej gleby ogrodowej niezawierającej dodatków. Należy unikać kompostu, ponieważ może on zawierać toksyczne substancje chemiczne, na przykład metale ciężkie. Przed wykorzystaniem gleby hodowlanej należy z niej usunąć faunę poprzez trzykrotne głębokie zamrażanie. Można także wykorzystać czystą glebę sztuczną, jednak szybkość rozmnażania może być wtedy mniejsza niż wyniki uzyskiwane przy zastosowaniu podłoża mieszanego. Podłoże powinno mieć pH na poziomie 6,0 ± 0,5. Kulturę przechowuje się w inkubatorze w temperaturze 15 ± 2 °C, bez światła. We wszystkich przypadkach należy unikać temperatury wyższej niż 23 °C. Gleba sztuczna/naturalna powinna być wilgotna, lecz nie mokra. Gdy glebę delikatnie ściśnie się w dłoni, między palcami powinny pojawić się jedynie małe krople wody. We wszystkich przypadkach należy unikać warunków beztlenowych (np. jeśli stosuje się pokrywę, należy wykonać odpowiednią liczbę otworów w pokrywie w celu zapewnienia wystarczającej wymiany powietrza). Gleba hodowlana powinna być napowietrzana poprzez ostrożne wymieszanie jej raz w tygodniu.
Organizmy należy karmić raz w tygodniu ad libitum płatkami owsianymi, które umieszcza się w zagłębieniu na powierzchni gleby i przykrywa glebą. Jeśli w pojemniku pozostało pożywienie z poprzedniego karmienia, ilość podawanego pożywienia należy odpowiednio dostosować. Jeśli na pozostałym pożywieniu wyrosły grzyby, należy je wymienić na nową porcję płatków owsianych. W celu stymulowania rozmnażania co dwa tygodnie do płatków owsianych można dodać dostępny na rynku proszek proteinowy z witaminami. Po trzech miesiącach zwierzęta przenosi się do świeżo przygotowanej kultury lub podłoża do hodowli. Płatki owsiane, które należy przechowywać w szczelnie zamykanych naczyniach, należy autoklawować lub podgrzać, aby uniknąć infekcji przenoszonych przez roztocza żerujące na pokarmach suchych (np. Glyzyphagus sp., Astigmata, Acarina) lub roztocza drapieżne (np. Hypoaspis (Cosmolaelaps) miles, Gamasida, Acarina). Po zdezynfekowaniu pożywienie się mieli, aby można je było łatwo rozmieścić na powierzchnię gleby. Innym możliwym źródłem pożywienia są drożdże piekarskie lub pokarm dla ryb TetraMin®.
Zasadniczo warunki hodowli są wystarczające, jeśli organizmy nie starają się opuścić podłoża, przekopują się szybko poprzez glebę, mają lśniącą zewnętrzną powłokę bez przyklejających się do niej cząstek gleby, mają mniej więcej białawą barwę oraz jeśli widoczne są organizmy w różnym wieku. Organizmy można uznać za zdrowe, jeśli rozmnażają się w sposób ciągły.
Dodatkowa wybrana bibliografia
Achazi RK, Fröhlich E, Henneken M, Pilz C (1999). The effect of soil from former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid Enchytraeus crypticus (Enchytraeidae, Oligochaeta). Newsletter on Enchytraeidae 6: 117-126.
Jänsch S, Amorim MJB, Römbke J (2005). Identification of the ecological requirements of important terrestrial ecotoxi-cological test species. Environ. Reviews 13: 51-83.
Kuperman RG, Checkai RT, Simini M, Phillips CT, Kolakowski JE, Kurnas CW, Sunahara GI (2003). Survival and reproduction of Enchytraeus crypticus (Oligochaeta, Enchytraeidae) in a natural sandy loam soil amended with the nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX. Pedobiologia 47: 651-656.
Römbke J (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review. Pedobiologia 47: 607-616.
Westheide W i Graefe U (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species (Oligochaeta, Annelida). J. Nat. Hist. 26: 479-488.
Westheide W i Müller MC (1996). Cinematographic documentation of enchytraeid morphology and reproductive biology. Hydrobiologia 334: 263-267.
C.31. BADANIE ROŚLIN LĄDOWYCH: BADANIE WSCHODÓW I WZROSTU SIEWEK
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna z dotyczącą badań wytyczną OECD nr 208 (2006). Okresowo dokonuje się przeglądu metod badawczych w świetle postępu naukowego i możliwości zastosowania do użytku regulacyjnego. Niniejsza zaktualizowana metoda badawcza ma służyć ocenie potencjalnego wpływu substancji chemicznych na wschody i wzrost siewek. W związku z tym nie obejmuje ona wpływu długoterminowego ani wpływu na rozrodczość (tj. zawiązywanie nasion, tworzenie kwiatów, dojrzewanie owoców). Należy uwzględnić warunki narażenia i właściwości badanej substancji chemicznej, aby upewnić się, że stosowane są odpowiednie metody badawcze (np. w przypadku badania metali/związków metali należy uwzględnić wpływ pH i powiązanych przeciwjonów) (1). Niniejsza metoda badawcza nie dotyczy roślin narażonych na działanie oparów substancji chemicznych. Przedmiotowa metoda badawcza ma zastosowanie do badania substancji chemicznych ogólnego zastosowania, produktów biobójczych i środków ochrony roślin (znanych również jako pestycydy). Metodę opracowano na podstawie istniejących metod (2) (3) (4) (5) (6) (7). Uwzględniono również inne odniesienia istotne dla badania roślin (8) (9) (10). Zastosowane definicje są podane w dodatku 1.
ZASADA BADANIA
2. W badaniu ocenia się wpływ na wschody siewek i wczesny wzrost wyższych roślin po narażeniu na badaną substancję chemiczną w glebie (albo innej odpowiedniej matrycy gleby). Nasiona umieszcza się w kontakcie z glebą, do której wprowadzono badaną substancję chemiczną, i ocenia pod kątem skutków zwykle po upływie 14-21 dni, gdy wzejdzie 50 % siewek w grupie kontrolnej. Pomiar punktów końcowych polega na wizualnej ocenie wschodów siewek, suchej masy kiełków (ewentualnie mokrej masy kiełków) oraz, w niektórych przypadkach, wysokości kiełków, jak również na ocenie widocznego szkodliwego wpływu na różne części rośliny. Uzyskane pomiary i obserwacje porównuje się z pomiarami i obserwacjami dotyczącymi roślin z grupy kontrolnej niepoddanej zabiegowi.
3. W zależności od oczekiwanej drogi narażenia badaną substancję chemiczną łączy się z glebą (lub ewentualnie ze sztuczną matrycą gleby) albo umieszcza na jej powierzchni, co prawidłowo odzwierciedla potencjalną drogę narażenia na substancję chemiczną. Łączenie z glebą polega na wprowadzaniu do gleby luzem. Po wprowadzeniu glebę przenosi się do doniczek, a następnie wysiewa się do niej nasiona danego gatunku rośliny. Podanie powierzchniowe odbywa się na glebę umieszczoną w doniczkach, do której wysiano już nasiona. Zestawy badawcze (próby kontrolne i glebę poddaną zabiegowi wraz z nasionami) umieszcza się następnie w odpowiednich warunkach sprzyjających kiełkowaniu/wzrostowi roślin.
4. Badanie można przeprowadzić w celu wyznaczenia krzywej dawka-odpowiedź albo przy jednym stężeniu/ poziomie jako badanie graniczne, w zależności od celu badania. Jeżeli wyniki badania przeprowadzonego przy jednym stężeniu/poziomie przekraczają określony poziom toksyczności (np. jeśli obserwowany jest wpływ większy niż x %), przeprowadza się badanie ustalające zakres, aby określić górne i dolne limity toksyczności, a następnie badanie przy wielu stężeniach/poziomach w celu uzyskania krzywej dawka-odpowiedź. Stosuje się odpowiednią analizę statystyczną w celu uzyskania stężenia efektywnego x % lub wskaźnika efektywnego stosowania Erx (np. EC25, ER25, EC50, ER50) w odniesieniu do najbardziej wrażliwego parametru lub parametrów będących przedmiotem zainteresowania. Ponadto w niniejszym badaniu można obliczyć najwyższe stężenie, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC), oraz najniższe stężenie, przy którym obserwuje się zmiany (LOEC).
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ
5. Poniższe informacje są przydatne do ustalenia oczekiwanej drogi narażenia na substancję chemiczną oraz przy opracowywaniu badania: wzór strukturalny, czystość, rozpuszczalność w wodzie, rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych, współczynnik podziału 1-oktanol/woda, sorpcyjne właściwości gleby, prężność pary, trwałość w wodzie i pod działaniem światła oraz biodegradowalność.
WAŻNOŚĆ BADANIA
6. Aby badanie było ważne, muszą być spełnione następujące kryteria wykonania w próbach kontrolnych:
- wschody siewek muszą wynieść co najmniej 70 %;
- siewki nie przejawiają widocznych oznak fitotoksyczności (np. chlorozy, martwicy, więdnięcia, deformacji liści i łodygi), a rośliny przejawiają wyłącznie wahania w zakresie wzrostu i morfologii typowe dla danego gatunku;
- średnia przeżywalność wzeszłych siewek z próby kontrolnej wynosi co najmniej 90 % w okresie badania;
- warunki otoczenia dla danego gatunku są identyczne i pożywka zawiera taką samą ilość matrycy gleby, pożywki pomocniczej lub podłoża z tego samego źródła.
SUBSTANCJA CHEMICZNA ODNIESIENIA
7. Substancję chemiczną odniesienia można badać w regularnych odstępach czasu, aby upewnić się, że wynik badania i reakcja danych badanych roślin oraz warunki badania nie uległy znacznej zmianie w czasie. Ewentualnie można wykorzystać historyczne pomiary biomasy lub wzrostu w próbach kontrolnych w celu dokonania oceny wyników układu badawczego w określonych laboratoriach; mogą one posłużyć jako międzylaboratoryjny pomiar jakości prób kontrolnych.
OPIS METODY
Gleba naturalna - podłoże sztuczne
8. Rośliny można uprawiać w doniczkach wypełnionych gliną piaszczystą, piaskiem gliniastym lub gliną piaszczysto-ilastą o zawartości węgla organicznego do 1,5 % (około 3 % materii organicznej). Można również zastosować dostępną na rynku ziemię doniczkową lub syntetyczną mieszankę glebową o zawartości węgla organicznego do 1,5 %. Nie należy stosować gleb gliniastych, jeżeli wiadomo, że badana substancja chemiczna ma wysokie powinowactwo do glin. Glebę z pola należy przesiać do cząstek o wielkości 2 mm, tak aby ją ujednorodnić i usunąć cząstki gruboziarniste. Należy odnotować rodzaj i teksturę gleby, zawartość procentową węgla organicznego, pH i zawartość soli, jak również przewodnictwo elektronowe ostatecznie przygotowanej gleby. Glebę należy sklasyfikować zgodnie ze standardowym schematem klasyfikacji (11). Glebę można poddać pasteryzacji lub obróbce cieplnej w celu zmniejszenia wpływu patogenów występujących w glebie.
9. Naturalna gleba może utrudnić interpretację wyników i zwiększyć ich zmienność ze względu na zróżnicowane właściwości fizyczne/chemiczne i populacje mikrobiologiczne. Z kolei te zmienne modyfikują zdolność zatrzymywania wilgoci, efekt wiązania chemicznego, napowietrzenie oraz zawartość składników odżywczych i pierwiastków śladowych. Poza różnicami w zakresie wspomnianych czynników fizycznych będą również występowały różnice we właściwościach chemicznych, takich jak pH i potencjał redoks, co może wpłynąć na biodostępność badanej substancji chemicznej (12) (13) (14).
10. Podłoża sztuczne zazwyczaj nie są stosowane do badania środków ochrony roślin, ale można je wykorzystywać do badania substancji chemicznych ogólnego zastosowania albo w przypadku gdy wskazane jest zmniejszenie zmienności powodowanej przez naturalne gleby i zwiększenie porównywalności wyników badania. Zastosowane podłoża powinny składać się z obojętnych materiałów, które minimalizują oddziaływanie z badaną substancją chemiczną, nośnikiem rozpuszczalnikowym lub obydwoma tymi elementami. Ustalono, że odpowiednimi obojętnymi materiałami, które w minimalnym stopniu absorbują badaną substancję chemiczną (15), zapewniając maksymalną dostępność substancji chemicznej dla siewki poprzez pobieranie przez korzenie, są piasek kwarcowy przemyty kwasem, wełna mineralna oraz kulki szklane (np. o średnicy 0,35-0,85 mm). Nieodpowiednimi podłożami będą między innymi wermikulit, perlit albo inne wysoce absorpcyjne materiały. Należy zapewnić składniki odżywcze wspomagające wzrost rośliny, aby zagwarantować, że rośliny nie znajdują się w warunkach stresowych ze względu na niedobór składników odżywczych, i w razie potrzeby należy to ocenić za pomocą analizy chemicznej lub wizualnej oceny roślin z próby kontrolnej.
Kryteria doboru badanych gatunków
11. Zakres wybranych gatunków powinien być w miarę możliwości szeroki, np. uwzględniający ich zróżnicowanie taksonomiczne w królestwie roślin, rozmieszczenie, liczebność, charakterystykę cyklu życiowego danego gatunku oraz region występowania w naturze, tak aby uzyskać pewien zakres odpowiedzi (8) (10) (16) (17) (18) (19) (20). Przy doborze badanych gatunków należy wziąć pod uwagę następujące cechy możliwych gatunków:
- gatunki mają jednolite nasiona, które można łatwo uzyskać ze standardowych źródłach nasion i które zapewniają powtarzalne, niezawodne i równe kiełkowanie, jak również jednolity wzrost siewek;
- roślina jest odpowiednia do badań w laboratorium i może dawać wiarygodne i powtarzalne wyniki na tych samych i różnych urządzeniach badawczych;
- wrażliwość gatunku wykorzystywanego do badań powinna być spójna z reakcjami roślin znalezionych w otoczeniu i wystawionych na działanie substancji chemicznej;
- zostały one wykorzystane w pewnym stopniu we wcześniejszych badaniach toksyczności i ich wykorzystanie na przykład w pomiarach aktywności biologicznej herbicydów, badaniu przesiewowym na obecność metali ciężkich, badaniach zasolenia lub niedoboru składników mineralnych lub badaniach allelopatii wskazuje na wrażliwość na szereg różnorodnych stresorów;
- są zgodne z warunkami wzrostu określonymi w metodzie badawczej;
- spełniają kryteria ważności badania.
Niektóre z badanych gatunków, które historycznie najczęściej wykorzystywano do badań, są wymienione w dodatku 2, zaś potencjalne gatunki nieużywane do upraw znajdują się w dodatku 3.
12. Liczba gatunków, które zostaną objęte badaniem, zależy od odpowiednich wymogów regulacyjnych, w związku z czym nie jest określona w niniejszej metodzie badawczej.
Zastosowanie badanej substancji chemicznej
13. Substancję chemiczną należy wprowadzić w odpowiednim nośniku (np. wodzie, acetonie, etanolu, glikolu polietylenowym, gumie arabskiej, piasku). Badanie może również obejmować mieszaniny (produkty gotowe do stosowania lub preparaty) zawierające substancje czynne i różne adiuwanty.
Wprowadzenie do gleby / podłoża sztucznego
14. Substancje chemiczne, które są rozpuszczalne w wodzie lub zawieszone w wodzie, można dodać do wody, a następnie otrzymany roztwór miesza się z glebą w odpowiednim urządzeniu mieszającym. Tego rodzaju badanie może być odpowiednie, jeżeli narażenie na substancję chemiczną następuje za pośrednictwem gleby lub glebowej wody porowej oraz jeżeli istnieją obawy dotyczące pobierania przez korzenie. Dodanie badanej substancji chemicznej nie powinno powodować przekroczenia pojemności wodnej gleby. Objętość dodanej wody powinna być taka sama dla każdego badanego stężenia, ale powinna być ograniczona, aby zapobiec zbrylaniu się gleby.
15. Substancje chemiczne o niższej rozpuszczalności w wodzie należy rozpuścić w odpowiednim lotnym rozpuszczalniku (np. acetonie, etanolu) i wymieszać z piaskiem. Następnie rozpuszczalnik można usunąć z piasku, kierując strumień powietrza i jednocześnie stale mieszając piasek. Tak przygotowany piasek miesza się z glebą doświadczalną. Do drugiej próby kontrolnej dodaje się tylko piasek i rozpuszczalnik. Do wszystkich poziomów zabiegu i drugiej próby kontrolnej dodaje się równe ilości piasku z wmieszanym i usuniętym rozpuszczalnikiem. W przypadku nierozpuszczalnych badanych substancji chemicznych będących ciałami stałymi suchą glebę i substancję chemiczną miesza się w odpowiednim urządzeniu mieszającym. Następnie glebę przekłada się do doniczek i natychmiast wysiewa się nasiona.
16. Jeżeli zamiast gleby stosuje się podłoże sztuczne, substancje chemiczne, które są rozpuszczalne w wodzie, można rozpuścić w substancji biogennej tuż przed rozpoczęciem badania. Substancje chemiczne, które nie są rozpuszczalne w wodzie, ale które można zawiesić w wodzie za pomocą nośnika rozpuszczalnikowego, należy dodać wraz z nośnikiem do substancji biogennej. Nierozpuszczalne w wodzie substancje chemiczne, dla których nie jest dostępny nietoksyczny, rozpuszczalny w wodzie nośnik, należy rozpuścić w odpowiednim lotnym rozpuszczalniku. Otrzymany roztwór miesza się z piaskiem lub kulkami szklanymi, umieszcza w próżniowej wyparce rotacyjnej i odparowuje, pozostawiając jednolitą warstwę substancji chemicznej na piasku lub kulkach. Przed wypełnieniem doniczek zważoną porcję kulek należy poddać ekstrakcji w tym samym rozpuszczalniku organicznym i oznaczyć substancję chemiczną.
Zastosowanie powierzchniowe
17. W przypadku środków ochrony roślin badaną substancję chemiczną często aplikuje się poprzez zroszenie powierzchni gleby roztworem do badań. Cały sprzęt wykorzystany do przeprowadzenia badań, w tym sprzęt wykorzystany do przygotowania i podania badanej substancji chemicznej, powinien charakteryzować się taką konstrukcją i pojemnością, aby można było przeprowadzić badania z udziałem tego sprzętu w sposób precyzyjny oraz aby otrzymane pokrycie było odtwarzalne. Pokrycie powinno być jednolite na wszystkich powierzchniach gleby. Należy dołożyć starań, aby uniknąć możliwej adsorbcji substancji chemicznych przez sprzęt lub zajścia reakcji między substancjami a sprzętem (np. rury z tworzywa sztucznego i lipofilowe substancje chemiczne czy części stalowe i pierwiastki). Badaną substancję chemiczną rozpryskuje się na powierzchnię gleby, symulując typową aplikację za pomocą opryskiwacza. Zasadniczo objętości użyte do opryskiwania powinny być zgodne z normalną praktyką rolniczą i zwykle stosowanymi objętościami (należy uwzględnić w sprawozdaniu ilość wody itp.). Należy dobrać rodzaj dyszy, aby zapewnić jednolite pokrycie powierzchni gleby. W przypadku gdy stosowane są rozpuszczalniki i nośniki, należy utworzyć drugą grupę kontrolną roślin otrzymującą wyłącznie rozpuszczalnik/nośnik. Jest to konieczne w przypadku środków ochrony roślin badanych w formie preparatów.
Weryfikacja stężenia/poziomu badanej substancji chemicznej
18. Stosowane stężenia/poziomy muszą zostać potwierdzone odpowiednią weryfikacją analityczną. W przypadku rozpuszczalnych substancji chemicznych weryfikację wszystkich badanych stężeń/poziomów można potwierdzić za pomocą analizy najwyższego stężenia roztworu użytego do badań wraz z dokumentacją na temat późniejszego rozcieńczenia i wykorzystania skalibrowanego sprzętu do podawania substancji (np. skalibrowanych naczyń szklanych do analizy, kalibracji urządzeń do opryskiwania). W przypadku nierozpuszczalnych substancji chemicznych weryfikacja związku musi obejmować wagi badanej substancji chemicznej dodanej do gleby. Jeżeli wymagane jest wykazanie jednorodności, konieczna może być analiza gleby.
PROCEDURA
Projekt badania
19. Do doniczek wysiewa się nasiona tego samego gatunku. Liczba wysianych nasion na doniczkę będzie zależała od gatunku, wielkości doniczki i czasu trwania badania.Liczba roślin na doniczkę powinna zapewniać odpowiednie warunki wzrostu oraz uniemożliwiać nadmierne zagęszczenie roślin w doniczce przez cały czas trwania badania. Maksymalna gęstość wysiewu wynosi około 3-10 nasion na 100 cm2 w zależności od wielkości nasion. Przykładowo zaleca się od jednego do dwóch nasion kukurydzy, soi, pomidora, ogórka lub buraka cukrowego na pojemnik o długości 15 cm; trzy nasiona rzepaku lub grochu na pojemnik o długości 15 cm; oraz 5-10 nasion cebuli, pszenicy albo innych małych nasion na pojemnik o długości 15 cm. Liczba nasion i doniczek z kontrpróbą (kontrpróbę definiuje się jako doniczkę, dlatego też rośliny w tej samej doniczce nie stanowią kontrpróby) powinna być odpowiednia dla optymalnej analizy statystycznej (21). Należy zauważyć, że zmienność będzie większa dla tych badanych gatunków, w przypadku których wysiewa się mniejszą liczbę dużych nasion na doniczkę (kontrpróba), niż dla tych, w przypadku których możliwe jest użycie większej liczby małych nasion na doniczkę. Zmienność tę można zminimalizować, wysiewając jednakową liczbę nasion do każdej doniczki.
20. Stosuje się grupy kontrolne w celu upewnienia się, że obserwowany wpływ jest związany wyłącznie z narażeniem na badaną substancję chemiczną lub można go przypisać wyłącznie takiemu narażeniu. Odpowiednia grupa kontrolna powinna być identyczna pod każdym względem z grupą badaną z wyjątkiem narażenia na badaną substancję chemiczną. W ramach danego badania wszystkie rośliny wykorzystane do badań łącznie z próbą kontrolną powinny pochodzić z tego samego źródła. Aby zapobiec błędowi systematycznemu, wymagane jest losowe przydzielanie doniczek do grupy badanej i kontrolnej.
21. Należy unikać stosowania nasion zaprawionych insektycydem lub fungicydem. Niektóre organy regulacyjne dopuszczają jednak stosowanie określonych fungicydów o działaniu powierzchniowym, tzw. fungicydów kontaktowych (takich jak kaptan, tiuram) (22). Jeżeli istnieje obawa dotycząca patogenów przenoszonych przez nasiona, można na krótko zanurzyć nasiona w słabym 5-procentowym roztworze podchlorynu, a następnie opłukać je obficie pod bieżącą wodą i osuszyć. Zapobiegawcze podawanie innych środków ochrony roślin jest niedozwolone.
Warunki badania
22. Warunki badania powinny być zbliżone do warunków koniecznych dla normalnego wzrostu badanych gatunków i odmian (przykładowe warunki badania zawiera dodatek 4). Wschodzące rośliny należy utrzymywać zgodnie z dobrą praktyką ogrodniczą w komorach, fitotronach lub szklarniach o kontrolowanym środowisku. W przypadku korzystania z systemów wspomagających wzrost takie praktyki zwykle obejmują kontrolowanie i odpowiednio częste (np. codzienne) rejestrowanie temperatury, wilgotności, stężenia dwutlenku węgla, światła (natężenia, długości fali, promieniowania fotosyntetycznie czynnego) oraz okresu oświetlenia, sposobów nawadniania itp., aby zagwarantować prawidłowy wzrost roślin ustalony na podstawie porównania z roślinami wybranego gatunku z próby kontrolnej. Temperaturę w szklarni należy kontrolować za pomocą systemów wentylacji, ogrzewania lub chłodzenia. Następujące warunki są zasadniczo zalecane w przypadku badań prowadzonych w szklarniach:
- temperatura: 22 °C ± 10 °C;
- wilgotność: 70 % ± 25 %;
- fotoperiod: co najmniej 16 godzin światła;
- natężenie światła: 350 ± 50 mE/m2/s; dodatkowe oświetlenie może być konieczne, jeżeli natężenie spada poniżej 200 mE/m2/s, długość fali 400-700 nm, z wyjątkiem niektórych gatunków, które mają mniejsze wymagania w zakresie światła.
Warunki otoczenia należy monitorować i odnotowywać w sprawozdaniach przez cały czas trwania badania. Rośliny należy uprawiać w nieporowatych doniczkach z tworzywa sztucznego lub doniczkach szkliwionych z podstawką lub spodkiem pod doniczką. Okresowo można zmieniać ustawienie doniczek, aby zminimalizować różnice we wzroście roślin (ze względu na różnice w warunkach badania w obrębie systemów wspomagających wzrost). Doniczki muszą być wystarczająco duże, aby umożliwiać normalny wzrost.
23. W razie potrzeby można uzupełniać składniki odżywcze w glebie w celu utrzymania odpowiedniego wigoru. Zapotrzebowanie na dodatkowe składniki odżywcze i częstotliwość ich podawania można ocenić na podstawie obserwacji roślin z grupy kontrolnej. Zaleca się nawadnianie pojemników badawczych od strony dna (np. za pomocą sznurów z włókna szklanego). Początkowo można jednak stosować nawadnianie od góry w celu stymulowania kiełkowania nasion; w przypadku aplikacji na powierzchnię gleby taki sposób nawadniania ułatwia wniknięcie substancji chemicznej do gleby.
24. Konkretne warunki wzrostu powinny być odpowiednie dla badanego gatunku i badanej substancji chemicznej. Rośliny w grupie kontrolnej i grupie badanej muszą być utrzymywane w identycznych warunkach otoczenia, należy jednak podjąć stosowne działania, aby zapobiec narażeniu krzyżowemu (np. na lotne substancje chemiczne) pomiędzy różnymi zabiegami oraz narażeniu grup kontrolnych na badaną substancję chemiczną.
Badanie przy jednym stężeniu/poziomie
25. Aby ustalić odpowiednie stężenie/poziom substancji chemicznej do celów przeprowadzenia badania przy jednym stężeniu lub poziomie (prowokacyjnym/granicznym), należy uwzględnić szereg czynników. W przypadku substancji chemicznych ogólnego zastosowania obejmują one właściwości fizyczne/chemiczne substancji chemicznej. W przypadku środków ochrony roślin należy wziąć pod uwagę właściwości fizyczne/ chemiczne i schemat stosowania badanej substancji chemicznej, jej maksymalne stężenie lub poziom stosowania, liczbę zastosowań na sezon lub trwałość badanej substancji chemicznej. Aby ustalić, czy substancja chemiczna ogólnego zastosowania posiada właściwości fitotoksyczne, wskazane może być wykonanie badania przy maksymalnym poziomie 1 000 mg/kg suchej gleby.
Badanie ustalające zakres stężeń
26. W razie potrzeby można wykonać badanie ustalające zakres, aby zapewnić wytyczne dotyczące stężeń/ poziomów, które należy zbadać w ostatecznym badaniu dawka-odpowiedź. Na potrzeby badania ustalającego zakres badane stężenia/poziomy powinny znacznie różnić się od siebie (np. 0,1, 1,0, 10, 100 i 1 000 mg/kg suchej gleby). W przypadku środków ochrony roślin stężenia/poziomy powinny opierać się na zalecanych lub maksymalnych stężeniach lub poziomach stosowania, np. 1/100, 1/10, 1/1 zalecanego lub maksymalnego stężenia lub poziomu stosowania.
Badania przy wielu stężeniach/poziomach
27. Celem badania przy wielu stężeniach/poziomach jest określenie zależności dawka-odpowiedź oraz ustalenie wartości ECx lub ERx w odniesieniu do wschodów, biomasy lub zmian wizualnych w porównaniu z próbami kontrolnymi nienarażonymi na działanie substancji, zgodnie z wymaganiami organów regulacyjnych.
28. Liczba i zróżnicowanie stężeń lub poziomów powinny być wystarczające do uzyskania wiarygodnej zależności dawka-odpowiedź i równania regresji oraz otrzymania oszacowania ECx. lub ERx. Wybrane stężenia/poziomy powinny obejmować wartości ECx lub ERx, które mają zostać ustalone. Na przykład jeżeli wymagana jest wartość EC50, wskazane byłoby wykonanie badania przy poziomach, które dają skutek rzędu 20-80 %. Aby to uzyskać, zalecana liczba badanych stężeń/poziomów wynosi co najmniej pięć stężeń/poziomów uporządkowanych w szereg geometryczny plus jedna grupa kontrolna nieobjęta działaniem substancji, przy czym każde kolejne stężenie nie powinno być większe niż trzykrotność poprzedniego. Dla każdej grupy badanej i kontrolnej liczba kontrprób powinna wynosić co najmniej cztery, a całkowita liczba nasion powinna wynosić co najmniej 20. W celu zwiększenia mocy statystycznej badania potrzebna może być większa liczba kontrprób roślin o wolniejszym tempie kiełkowania lub zmiennych schematach wzrostu. W przypadku zastosowania większej liczby badanych stężeń/poziomów można zmniejszyć liczbę kontrprób. Jeżeli wymagane jest oszacowanie NOEC, konieczne może być zastosowanie większej liczby kontrprób w celu uzyskania pożądanej mocy statystycznej (23).
Obserwacje
29. W okresie obserwacji, tj. po upływie 14-21 dni po wzejściu 50 % roślin z grupy kontrolnej (również z grup kontrolnych z rozpuszczalnikiem, jeżeli są dostępne), rośliny są często obserwowane (co najmniej raz w tygodniu, a w miarę możliwości codziennie) pod kątem wschodów i widocznych oznak fitotoksyczności i śmiertelności. Po zakończeniu badania należy odnotować pomiar procentowych wschodów i biomasy ocalałych roślin, jak również widoczny negatywny wpływ na różne części rośliny. Wspomniane negatywne skutki obejmują anomalie w wyglądzie siewek, zahamowany wzrost, chlorozę, zmianę barwy, śmiertelność i wpływ na rozwój roślin. Biomasę końcową można zmierzyć z wykorzystaniem końcowej średniej suchej masy kiełków ocalałych roślin, ścinając kiełki przy powierzchni gleby i susząc je do otrzymania stałej masy w temperaturze 60 °C. Ewentualnie biomasę końcowa można zmierzyć z wykorzystaniem mokrej masy kiełków. Kolejnym parametrem docelowym może być wysokość kiełków, jeżeli jest to wymagane przez organy regulacyjne. Do oceny obserwowalnych efektów toksycznych należy zastosować jednolity system oceny punktowej widocznych uszkodzeń. Przykłady przeprowadzania jakościowej i ilościowej oceny wizualnej i przyznawania punktów można znaleźć w pozycjach (23) (24).
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Analiza statystyczna
Badanie przy jednym stężeniu/poziomie
30. Analizę danych dotyczących każdego gatunku roślin należy przeprowadzić z wykorzystaniem odpowiedniej metody statystycznej (21). Należy odnotować w sprawozdaniu poziom skutku przy badanym stężeniu/poziomie albo brak określonego skutku przy badanym stężeniu/poziomie (np. przy stężeniu lub poziomie y zaobserwowano x % skutku).
Badanie przy wielu stężeniach/poziomach
31. Zależność dawka-odpowiedź określa się na podstawie równania regresji. Zastosować można różne modele, na przykład w celu oszacowania wartości ECx lub ERx (np. EC25, ER25, EC50, ER50) i ich granic ufności w postaci danych binarnych w odniesieniu do wschodów odpowiednie mogą być np. metody analizy logitowej, probitowej, analizy Weibulla, metoda Spearmana-Kärbera czy uproszczona metoda Spearmana-Kärbera. W odniesieniu do wzrostu siewek (wagi i wysokości) jako ciągłych punktów końcowych, ECx lub ERx i ich granice ufności można oszacować, stosując odpowiednią analizę regresji (np. analizę regresji nieliniowej Bruce'a-Versteega (25)). W miarę możliwości R2 powinno wynosić co najmniej 0,7 w przypadku najwrażliwszych gatunków, a zastosowane badane stężania/poziomy powinny obejmować 20-80 % skutków. Jeżeli konieczne jest oszacowanie NOEC, zaleca się zastosowanie testów statystycznych o dużej mocy, które należy wybrać na podstawie rozkładu danych (21) (26).
Sprawozdanie z badania
32. Sprawozdanie z badania powinno zawierać wyniki badań, jak również szczegółowy opis warunków badania, dokładne omówienie wyników, analizę danych oraz wnioski wyciągnięte z analizy. Należy przedstawić tabelaryczne zestawienie oraz streszczenie wyników. Sprawozdanie musi zawierać następujące informacje.
Badana substancja chemiczna:
- dane identyfikacyjne substancji chemicznej, istotne właściwości badanej substancji chemicznej (np. logarytm Pow, rozpuszczalność w wodzie, prężność pary oraz informacje o losach środowiskowych i zachowaniu w środowisku, jeżeli są dostępne);
- szczegółowe dane dotyczące sporządzenia roztworu do badań oraz weryfikacji badanych stężeń, jak określono w pkt 18.
Badany gatunek:
- szczegółowe informacje dotyczące organizmu użytego do badania: gatunek/odmiana, rodzina roślin, nazwa systematyczna i zwyczajowa, źródło oraz jak najbardziej szczegółowa historia nasion (np. nazwa dostawcy, zdolność kiełkowania, klasa wielkości nasion, numer partii lub serii, rok pochodzenia nasion lub sezonu wegetacyjnego podczas którego je zebrano, data oceny kiełkowania), żywotność itd.;
- liczba badanych gatunków jedno- i dwuliściennych;
- uzasadnienie wyboru gatunków;
- opis przechowywania, zaprawiania i konserwacji nasion. Warunki badania:
- aparatura badawcza (np. komora wzrostu, fitotron i szklarnia);
- opis układu badawczego (np. wymiary doniczek, materiał, z którego wykonano doniczki, i ilości gleby);
- charakterystyka gleby (tekstura lub rodzaj gleby: rozmieszczenie cząstek gleby i klasyfikacja, właściwości fizykochemiczne w tym % materii organicznej, % węgla organicznego i pH);
- przygotowanie gleby/podłoża przed badaniem (np. gleba, sztuczna gleba, piasek i inne);
- opis pożywki, jeżeli została zastosowana;
- zastosowanie badanej substancji chemicznej: opis metody zastosowania, opis sprzętu, poziomy narażenia i objętości, w tym weryfikacja chemiczna, opis metody kalibracji oraz opis warunków otoczenia panujących podczas zastosowania;
- natężenie światła (np. PAR, promieniowanie fotosyntetycznie czynne), fotoperiod, maksymalne/minimalne temperatury, harmonogram i sposób nawadniania, nawożenie;
- liczba nasion na doniczkę, liczba roślin na dawkę, liczba kontrprób (doniczek) na poziom narażenia;
- rodzaj i liczba prób kontrolnych (ujemne lub dodatnie próby kontrolne, próba kontrolna z rozpuszczalnikiem, jeżeli została zastosowana);
- czas trwania badania. Wyniki:
- zestawienie wszystkich punktów końcowych w przypadku każdej kontrpróby, badanego stężenia/poziomu i gatunku;
- liczba i procent wschodów w porównaniu z próbami kontrolnymi;
- pomiary biomasy (suchej lub mokrej masy kiełków) roślin jako odsetek prób kontrolnych;
- wysokość kiełków roślin jako odsetek prób kontrolnych, jeżeli została zmierzona;
- procent widocznych uszkodzeń oraz jakościowy i ilościowy opis widocznych uszkodzeń (chloroza, martwica, więdnięcie, deformacja liści i łodygi, jak również ewentualny brak skutków) spowodowanych badaną substancją chemiczną w porównaniu z roślinami z próby kontrolnej;
- opis skali stosowanej do oceny widocznych uszkodzeń, jeżeli przeprowadzono ocenę wizualną;
- w przypadku badań obejmujących jeden poziom w sprawozdaniu należy odnotować odsetek uszkodzeń;
- wartości ECx lub ERx (np. EC50, ER50, EC25, ER25) i powiązane granice ufności. Jeżeli zastosowana została analiza regresji, należy przedstawić błąd standardowy w odniesieniu do równania regresji oraz błąd standardowy w przypadku poszczególnych oszacowań parametru (np. nachylenie, punkt przecięcia);
- wartości NOEC (oraz LOEC), jeżeli zostały obliczone;
- opis procedur statystycznych oraz wykorzystane założenia;
- graficzne przedstawienie tych danych oraz zależności dawka-odpowiedź w przypadku badanych gatunków.
Odchylenia od procedur opisanych w niniejszej metodzie badawczej oraz wszelkie nietypowe zdarzenia, jakie miały miejsce podczas badania.
BIBLIOGRAFIA
(1) Schrader G., Metge K. i Bahadir M. (1998). Importance of salt ions in ecotoxicological tests with soil arthropods. Applied Soil Ecology, 7, 189-193.
(2) Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna. (1993). ISO 11269-1. Soil Quality - Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora - Part 1: Method for the Measurement of Inhibition of Root Growth.
(3) Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna. (1995). ISO 11269-2. Soil Quality - Determination of the Effects of Pollutants on Soil Flora - Part 2: Effects of Chemicals on the Emergence and Growth of Higher Plants.
(4) Amerykańskie Stowarzyszenie Badań i Materiałów (ASTM). (2002). E 1963-98. Standard Guide for Conducting Terrestrial Plant Toxicity Tests.
(5) U.S. EPA. (1982). FIFRA, 40CFR, część 158.540. Poddział J, części 122-1 i 123-1.
(6) US EPA. (1996). OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 850. Ecological Effects Test Guidelines:
- 850.4000: Background - Non-target Plant Testing;
- 850.4025: Target Area Phytotoxicity;
- 850.4100: Terrestrial Plant Toxicity, Tier I (Seedling Emergence);
- 850.4200: Seed Germination/Root Elongation Toxicity Test;
- 850.4225: Seedling Emergence, Tier II;
- 850.4230: Early Seedling Growth Toxicity Test.
(7) AFNOR, X31-201. (1982). Essai d'inhibition de la germination de semences par une substance. AFNOR X31-203/ISO 11269-1. (1993) Determination des effets des polluants sur la flore du sol: Méthode de mesurage de l'inhibition de la croissance des racines.
(8) Boutin C., Freemark K.E. i Keddy C.J. (1993). Proposed guidelines for registration of chemical pesticides: Nontarget plant testing and evaluation. Seria raportów technicznych nr 145. Canadian Wildlife Service (siedziba główna), Environment Canada, Hull, Québec, Kanada.
(9) Forster R., Heimbach U., Kula C. i Zwerger P. (1997). Effects of Plant Protection Products on Non-Target Organisms - A contribution to the Discussion of Risk Assessment and Risk Mitigation for Terrestrial NonTarget Organisms (Flora and Fauna). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd. Nr 48.
(10) Hale B., Hall J.C., Solomon K. i Stephenson G. (1994). A Critical Review of the Proposed Guidelines for Registration of Chemical Pesticides; Non-Target Plant Testing and Evaluation, Centrum Toksykologii, Uniwersytet w Guelph, Ontario, Kanada.
(11) Soil Texture Classification (systemy US i FAO): Weed Science, 33, suplement 1 (1985) oraz Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26:305 (1962).
(12) Audus L.J. (1964). Herbicide behaviour in the soil. W: Audus, L.J. (red.) The Physiology and biochemistry of Herbicides, Londyn, Nowy York, Academic Press, NY, rozdział 5, s. 163-206.
(13) Beall M.L., Jr. i Nash R.G. (1969). Crop seedling uptake of DDT, dieldrin, endrin, and heptachlor from soil, J. Agro. 61:571-575.
(14) Beetsman G.D., Kenney D.R. i Chesters G. (1969). Dieldrin uptake by corn as affected by soil properties, J. Agro. 61:247-250.
(15) Urząd ds. Żywności i Leków (FDA) Stanów Zjednoczonych. (1987). Environmental Assessment Technical Handbook. Environmental Assessment Technical Assistance Document 4.07, Seedling Growth, 14 s., FDA, Waszyngton D.C.
(16) McKelvey R.A., Wright J.P., Honegger J.L. i Warren L.W. (2002). A Comparison of Crop and Non-crop Plants as Sensitive Indicator Species for Regulatory Testing. Pest Management Science tom 58: 1161-1174
(17) Boutin C., Elmegaard N. i Kjaer C. (2004). Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: Implications for risk assessment. Ecotoxicology, tom 13(4): 349-369.
(18) Boutin C. i Rogers C.A. (2000). Patterns of sensitivity of plant species to various herbicides - An analysis with two databases. Ecotoxicology, tom 9(4): 255-271.
(19) Boutin C. i Harper J.L. (1991). A comparative study of the population dynamics of five species of Veronica in natural habitats. J. Ecol. 9:155-271.
(20) 155-271. Boutin C., Lee H.-B., Peart T.E., Batchelor S.P. i Maguire R.J. (2000). Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Envir. Toxicol. Chem. 19 (10): 2532-2541.
(21) OECD (2006). Guidance Document, Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Seria dotycząca badań i oceny, nr 54, Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju, Paryż.
(22) Hatzios K.K. i Penner D. (1985). Interactions of herbicides with other agrochemicals in higher plants. Rev. Weed Sci. 1:1-63.
(23) Hamill P.B., Marriage P.B. i G. Friesen. (1977). A method for assessing herbicide performance in small plot experiments. Weed Science 25: 386-389.
(24) Frans R.E. i Talbert R.E. (1992). Design of field experiments and the measurement and analysis of plant response. W: B. Truelove (red.) Research Methods in Weed Science, wydanie 2. Southern weed Science Society, Auburn, 15-23.
(25) Bruce R.D. i Versteeg D.J. (1992). A Statistical Procedure for Modelling Continuous Toxicity Data. Environmental Toxicology and Chemistry 11, 1 485-1 492.
(26) Rozdział C.33 niniejszego załącznika: Badanie rozrodczości dżdżownic (Eisenia fetida/Eisenia andrei).
Dodatek 1
DEFINICJE
Substancja czynna (lub substancja aktywna) jest to materiał służący do wywołania określonego skutku biologicznego (np. zwalczania owadów, zwalczania chorób roślin, zwalczania chwastów na obszarze, na którym przeprowadza się zabieg), znany również jako czysty technicznie składnik aktywny.
Substancja chemiczna oznacza substancję lub mieszaninę.
Środki ochrony roślin lub pestycydy są to materiały posiadające określoną biologiczną aktywność, wykorzystywane specjalnie w celu ochrony roślin przed szkodnikami (np. grzybicami, owadami i konkurencyjnymi roślinami).
ECx, stężenie efektywne x %, lub ERx, dawka powodująca zmianę x % oznacza stężenie lub dawkę, których wynikiem jest niepożądana zmiana lub modyfikacja o x % w punkcie końcowym badania zmierzona w odniesieniu do próby kontrolnej (np. zmniejszenie o 25 % lub 50 % w zakresie wschodów siewek, wagi kiełków, ostatecznej liczby roślin lub zwiększenie liczby widocznych uszkodzeń stanowiłyby odpowiednio EC25/ER25 lub EC50/ER50).
Wschód oznacza wykształcenie się koleoptylu lub liścienia nad powierzchnią gleby.
Preparat jest to dostępna w handlu użytkowa postać produktu zawierająca substancję czynną (składnik aktywny), znana również jako gotowy preparat 11 lub typowy produkt końcowego przeznaczenia.
LOEC (najniższe stężenie, przy którym obserwuje się zmiany) oznacza najniższe stężenie badanej substancji chemicznej, przy którym zaobserwowano szkodliwe zmiany. W niniejszym badaniu stężenie odpowiadające LOEC ma statystycznie istotny skutek (p < 0,05) w danym okresie narażenia przy porównaniu z próbą kontrolną i jest wyższe niż wartość NOEC.
Rośliny niebędące przedmiotem badania są to rośliny, które znajdują się poza docelowym obszarem porośniętym przez rośliny. W przypadku środków ochrony roślin dotyczy to zazwyczaj roślin znajdujących się poza obszarem, na którym przeprowadza się zabieg.
NOEC (stężenie, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian) oznacza najwyższe stężenie badanej substancji chemicznej, przy którym nie zaobserwowano żadnych szkodliwych zmian. W niniejszym badaniu stężenie odpowiadające NOEC nie ma statystycznie istotnego skutku (p < 0,05) w danym okresie narażenia, jeżeli porówna się je z próbą kontrolną.
Fitotoksyczność to negatywne odchylenia (oceniane na podstawie pomiarów i oceny wizualnej) od normalnego wzorca wyglądu i wzrostu roślin w reakcji na podanie danej substancji chemicznej.
Kontrpróba oznacza jednostkę doświadczalną, która odpowiada grupie kontrolnej lub grupie badanej. W niniejszych badaniach doniczka jest zdefiniowana jako kontrpróba.
Ocena wizualna oznacza oszacowanie widocznych uszkodzeń na podstawie obserwacji stanu roślin, wigoru, deformacji, chlorozy, martwicy i ogólnego wyglądu w porównaniu z próbą kontrolną.
Badana substancja chemiczna jest to dowolna substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.
Dodatek 2
Lista gatunków stosowanych w przeszłości w badaniach roślin
| Rodzina | Gatunek | Nazwy zwyczajowe |
| DWULIŚCIENNE |
| Selerowate (Apiaceae, Umbelliferae) | Daucus carota | Marchew |
| Astrowate (Asteraceae, Compositae) | Helianthus annuus | Słonecznik |
| Astrowate (Asteraceae, Compositae) | Lactuca sativa | Sałata siewna |
| Kapustowate (Brassicaceae, Cruciferae) | Sinapis alba | Gorczyca jasna |
| Kapustowate (Brassicaceae, Cruciferae) | Brassica campestris var. chinensis | Kapusta chińska |
| Kapustowate (Brassicaceae, Cruciferae) | Brassica napus | Rzepak |
| Kapustowate (Brassicaceae, Cruciferae) | Brassica oleracea var. capitata | Kapusta |
| Kapustowate (Brassicaceae, Cruciferae) | Brassica rapa | Rzepa |
| Kapustowate (Brassicaceae, Cruciferae) | Lepidium sativum | Rzeżucha ogrodowa |
| Kapustowate (Brassicaceae, Cruciferae) | Raphanus sativus | Rzodkiew zwyczajna |
| Komosowate (Chenopodiaceae) | Beta vulgaris | Burak cukrowy |
| Dyniowate (Cucurbitaceae) | Cucumis sativus | Ogórek |
| Bobowate (Fabaceae, Leguminosae) | Glycine max (G. soja) | Soja |
| Bobowate (Fabaceae, Leguminosae) | Phaseolus aureus | Fasola mung |
| Bobowate (Fabaceae, Leguminosae) | Phaseolus vulgaris | Fasola karłowa, fasola zwykła, fasola |
| Bobowate (Fabaceae, Leguminosae) | Pisum sativum | Groch |
| Bobowate (Fabaceae, Leguminosae) | Trigonella foenum- graecum | Kozieradka pospolita |
| Bobowate (Fabaceae, Leguminosae) | Lotus corniculatus | Komonica zwyczajna |
| Bobowate (Fabaceae, Leguminosae) | Trifolium pratense | Koniczyna czerwona |
| Bobowate (Fabaceae, Leguminosae) | Vicia sativa | Wyka |
| Lnowate (Linaceae) | Linum usitatissimum | Len |
| Rdestowate (Polygonaceae) | Fagopyrum esculentum | Gryka zwyczajna |
| Psiankowate (Solanaceae) | Solanum lycopersicon | Pomidor |
| JEDNOLIŚCIENNE |
| Liliowate (Liliaceae, Amarylladaceae) | Allium cepa | Cebula |
| Wiechlinowate (Poaceae, Gramineae) | Avena sativa | Owies zwyczajny |
| Wiechlinowate (Poaceae, Gramineae) | Hordeum vulgare | Jęczmień |
| Wiechlinowate (Poaceae, Gramineae) | Lolium perenne | Życica trwała |
| Wiechlinowate (Poaceae, Gramineae) | Oryza sativa | Ryż |
| Wiechlinowate (Poaceae, Gramineae) | Secale cereale | Żyto |
| Wiechlinowate (Poaceae, Gramineae) | Sorghum bicolor | Ziarno sorgo, sorgo cukrowe |
| Wiechlinowate (Poaceae, Gramineae) | Triticum aestivum | Pszenica |
| Wiechlinowate (Poaceae, Gramineae) | Zea mays | Kukurydza zwyczajna |
Dodatek 3
Lista potencjalnych gatunków nieuprawnych
OECD Potencjalne gatunki, które wykorzystać można w badaniu toksyczności wobec roślin
Uwaga: Niniejsza tabela zawiera informacje dotyczące 52 gatunków nieuprawnych (w nawiasach podane zostały odniesienia dla każdej pozycji). Przedstawione poziomy wschodów zaczerpnięto z opublikowanej literatury i stanowią one jedynie ogólne wytyczne. Poszczególne doświadczenia mogą różnić się w zależności od źródła nasion i innych czynników.
| RODZINA Nazwa botaniczna gatunku (polska nazwa zwyczajowa) | Długość życia (1) i siedlisko | Waga nasiona (mg) | Fotoperiod w okresie kiełkowania lub wzrostu (2) | Głębokość wysiewu (mm) (3) | Okres do wykiełkowania (dni) (4) | Specjalne zabiegi (5) | Badanie toksyczności (6) | Dostawcy nasion (7) | Inne odniesienia (8) |
| SELEROWATE (APIACEAE) Torilis japónica (kłobuczka pospolita) | А, В obszary naruszone, żywopłoty, pastwiska (16, 19) | 1,7-1,9 (14, 19) | Ś = C (14) | 0 (1, 19) | 5 (50 %) (19) | stratyfikacja chłodna (7, 14, 18, 19) konieczne może być dojrzewanie (19) brak światła hamuje kiełkowanie (1, 19) brak specjalnych zabiegów (5) | PO (5) | ||
| ASTROWATE (ASTERACEAE) Bellis perennis (stokrotka pospolita) | Ρ obszary trawiaste, grunty orne, darń (16, 19) | 0,09-0,17 (4, 19) | Ś = C (14) | 0 (4) | 3 (50 %) (19) 11 (100 %) (18) | natężenie promieniowania nie ma wpływu na kiełkowanie (18, 19) brak specjalnych zabiegów (4, 14) | PO (4) | A, D, F | 7 |
| Centaurea cyanus (chaber bławatek) | A pola, pobocza dróg, otwarte siedliska (16) | 4,1-4,9 (4, 14) | Ś = C (14) | 0-3 (2, 4, 14) | 14-21 (100 %) (14) | brak specjalnych zabiegów (2, 4) | PO (2,4) | A, D, E, F | 7 |
| Centaurea nigra (chaber ciemny) | Ρ pola, pobocza dróg, otwarte siedliska (16, 19) | 2,4-2,6 (14, 19) | Ś = C (14) | 0 (19) | 3 (50 %) (19) 4 (97 %) (18) | konieczne może być dojrzewanie (18, 19) brak światła hamuje kiełkowanie (19) brak specjalnych zabiegów (5, 14, 26) | PO (5, 22, 26) | A | |
| Inula helenium (oman wielki) | Ρ wilgotne, obszary naruszone (16) | 1-1,3 (4, 14, 29) | 0 (4, 29) | brak specjalnych zabiegów (4) | PO (4) | A, F |
| Leontodon hispidus (mlecz) | Ρ pola, pobocza dróg, obszary naruszone (16, 19) | 0,85-1,2 (14, 19) | Ś = C (14) | 0 (19) | 4 (50 %) (19) 7 (80 %) (18) | brak światła hamuje kiełkowanie (17, 18, 19) brak specjalnych zabiegów (5, 23) | PO (5, 22, 23) | ||
| Rudbeckia hirta (rudbekia owłosiona) | Β, Ρ obszary naruszone (16) | 0,3 (4), 14 | Ś = C (14) | 0 (4, 33) | < 10 (100 %) (33) | brak specjalnych zabiegów (4, 14, 33) | PO (4, 33) | C, D, E, F | |
| Solidago canadensis (nawłoć kanadyjska) | Ρ pastwiska, otwarte obszary (16) | 0,06-0,08 (4, 14) | Ś = C (11) | 0 (4) | 14-21 (11) | wymieszać z równą częścią piasku i namaczać w 500 ppm kwasu giberelinowego przez 24 godz. (11) brak specjalnych zabiegów (4) | PO (4) | E, F | |
| Xanthium pensylvanicum (rzepień) | A pola, otwarte siedliska (16) | 25-61 (14, 29) | 0(1) 5(29) | brak światła może hamować kiełkowanie (1) namaczać w ciepłej wodzie przez 12 godz. (29) | PRZED i PO (31) | A | |||
| Xanthium spinosum (rzepień kolczasty) | A otwarte siedliska (16) | 200 (14) | Ś = C (14) Ś > C (6) | 10 (6) | wertykulacja (14) brak specjalnych zabiegów (6) | PRZED i PO (6) | A | ||
| Xanthium strumarium (rzepień pospolity) | A pola, otwarte siedliska (16) | 67,4 (14) | Ś = C (14) | 10-20 (6, 21) | brak specjalnych zabiegów (6, 14, 21) | PRZED i PO (6, 21, 28, 31) | A | ||
| KAPUSTOWATE (BRASSICACEAE) Cardamine pratensis (rzeżucha łąkowa) | Ρ pola, pobocza dróg, darń (16, 19) | 0,6 (14), 19 | Ś = C (14) | 0 (19) | 5 (50 %) (19) 15 (98 %) (18) | brak światła hamuje kiełkowanie (18, 19) brak specjalnych zabiegów (5, 14, 22) | PO (5, 22) | F | |
| GOŹDZIKOWATE (CARYOPHYLLACEAE) Lychnis flos-cuculi (firletka poszarpana) | Ρ (16) | 0,21 (14) | Ś = C (14) | < 14 (100 %) (14, 25) | konieczne może być dojrzewanie (18) brak specjalnych zabiegów (5, 14, 15, 22-26) | PO (5, 15, 22-26) | F | ||
| KOMOSOWATE (CHENOPODIACEAE) Chenopodium album (komosa biała) | A miedze, obszary naruszone (16, 19) | 0,7-1,5 (14, 19, 34) | Ś = C (14) | 0 (1, 19) | 2 (50 %) (19) | poddanie zabiegom różni się w zależności od koloru nasiona (19) suche przechowywanie w okresie spoczynku (19) brak światła hamuje kiełkowanie (1, 18, 19) stratyfikacja chłodna (18) brak specjalnych zabiegów (14, 34) | PRZED i PO (28, 31, 34) | A | 32 |
| KLUZJOWATE (CLUSIACEAE) Hypericum perforatum (dziurawiec zwyczajny) | Ρ pola, grunty orne, otwarte siedliska (16, 19) | 0,1-0,23 (14, 19) | Ś = C (14) | 0 (1, 19) | 3 (19) 11 (90 %) (18) | brak światła hamuje kiełkowanie (1, 18, 19) brak specjalnych zabiegów (5, 14, 15, 25, 27) | PO (5, 15, 25, 27) | A, E, F | |
| POWOJOWATE (CONVOLVULACEAE) Ipomoea hederacea (wilec bluszczowy) | A pobocza dróg, otwarte siedliska, pola uprawne (16) | 28,2 (14) | Ś > C (6, 10) | 10-20 (6, 10, 21) | 4 (100 %) (10) | natężenie promieniowania nie ma wpływu na kiełkowanie (1) brak specjalnych zabiegów (6, 21) | PRZED i PO (6, 12, 21, 28) | A | |
| TURZYCOWATE (CYPERACEAE) Cyperus rotundus (turzyca) | Ρ grunty orne, pastwiska, pobocza dróg (16, 30) | 0,2 (14) | Ś = C (14) | 0 (1) 10-20 (6, 10) | 12 (91 %) (10) | brak światła hamuje kiełkowanie (1) brak specjalnych zabiegów (6, 10, 14) | PRZED i PO (6, 28, 31) | B | 7 |
| BOBOWATE (FABACEAE) Lotus corniculatus (komonica zwyczajna) | Ρ obszary trawiaste, pobocza dróg, otwarte siedliska (16, 19) | 1-1,67 (14, 19) | Ś = C (14) | 1 (50 %) (19) | wertykulacja (14, 19) natężenie promieniowania nie ma wpływu na kiełkowanie (18, 19) brak specjalnych zabiegów (23, 25) | PO (5, 23, 25) | A, D, E, F | ||
| Senna obtusifolia (strączyniec tępoliściowy) | A wilgotne lasy (16) | 23-28 (9) | Ś = C (14) Ś > C (9) | 10-20 (6,9) | namaczać nasiona w wodzie przez 24 godz. (9) wertykulacja (14) żywotność nasion różni się w zależności od koloru (1) brak specjalnych zabiegów (6) | PO (6,9) | A | ||
| Sesbania exaltata (konopie) | A gleba aluwialna (16) | 11-13 (9, 14) | Ś > C (9) | 10-20 (9, 21) | namaczać nasiona w wodzie przez 24 godz. (9) natężenie promieniowania nie ma wpływu na kiełkowanie (1) brak specjalnych zabiegów (21) | PRZED i PO (9, 21, 28, 31) | A | ||
| Trifolium pratense (koniczyna czerwona) | Ρ pola, pobocza dróg, grunty orne (16, 19) | 1,4-1,7 (14, 19) | Ś = C (14) | 1 (50 %) (19) | wertykulacja (14, 18) konieczne może być dojrzewanie (19) natężenie promieniowania nie ma wpływu na kiełkowanie (1, 19) brak specjalnych zabiegów (5) | PO (5) | A, E, F | ||
| LAMIACEAE Leonurus cardiaca (serdecznik pospolity) | Ρ otwarte obszary (16) | 0,75-1,0 (4, 14) | Ś = C (14) | 0 (4) | brak specjalnych zabiegów (4, 14) | PO (4) | F | ||
| Mentha spicata (mięta zielona) | Ρ wilgotne obszary (16) | 2,21 (4) | 0 (4) | brak specjalnych zabiegów (4) | PO (4) | F | |||
| Nepeta cataria (kocimiętka właściwa) | Ρ obszary naruszone (16) | 0,54 (4, 14) | Ś = C (14) | 0 (4) | brak specjalnych zabiegów (2, 4, 14) | PO (2,4) | F | ||
| Prunella vulgaris (głowienka pospolita) | Ρ grunty orne, obszary trawiaste, obszary naruszone (16, 19) | 0,58-1,2 (4, 14, 19) | Ś = C (14) | 0 (4, 19) | 5 (50 %) (19) 7 (91 %) (18) | Ś = C brak światła hamuje kiełkowanie (18, 19) większe kiełkowanie w przypadku większych nasion (1) brak specjalnych zabiegów (4, 14, 22) | PO (4, 22) | A, F | |
| Stachys officinalis (bukwica zwyczajna) | Ρ obszary trawiaste, miedze (19) | 14-18 (14, 19) | Ś = C (14) | 7 (50 %) (19) | brak specjalnych zabiegów (5, 14, 22) | PO (5, 22) | F | ||
| ŚLAZOWATE (MALVACEAE) Abutilón theophrasti (zaślaz pospolity) | A pola, otwarte siedliska (16) | 8,8 (14) | Ś = C (14) | 10-20 (6, 10, 21) | 4 (84 %) (10) | wertykulacja (14) brak specjalnych zabiegów (5, 10, 21) | PRZED i PO (6, 22, 28, 31) | A, F | |
| Sida spinosa (ślazowiec ciernisty) | A pola, pobocza dróg (16) | 3,8 (14) | Ś = C (14) | 10-20 (6, 21) | wertykulacja (14) natężenie promieniowania nie ma wpływu na kiełkowanie (1) brak specjalnych zabiegów (6, 21) | PRZED i PO (6, 21, 28, 31) | A, F | ||
| MAKOWATE (PAPAVERACEAE) Papaver rhoeas (mak polny) | A pola, pola uprawne, obszary naruszone (16, 19) | 0,1-0,3 (4, 14, 19, 29) | Ś = C (14) | 0 (4, 29) | 4 (50 %) (19) | stratyfikacja chłodna i wertykulacja (1, 19, 32) brak specjalnych zabiegów (4, 14, 29) | PO (4) | A, D, E, F, G | |
| WIECHLINOWATE (POACEAE) Agrostis tenuis (mietlica pospolita) | trawniki, pastwiska (16) | 0,07 (14) | Ś > C (Ю) | 20 (10) | 10 (62 %) (10) | brak światła hamuje kiełkowanie (1, 17-19) brak specjalnych zabiegów (10) | PO (10) | A, E | |
| Alopecurus myosuroides (wyczyniec polny) | A pola, otwarte siedliska (16) | 0,9-1,6 (29, 34) | Ś = C (14) | 2 (29) | < 24 (30 %) (34) | wertykulacja (14) poddanie działaniu 101 mg/L KNO3 (14) stratyfikacja ciepła (1) brak światła hamuje kiełkowanie (1) brak specjalnych zabiegów (34) | PRZED i PO (28, 34) | A | 32 |
| Avena fatua (owies głuchy) | A obszary uprawne, otwarte siedliska (16) | 7-37,5 (14, 30) | Ś = C (14) Ś > C (6) | 10-20 (6, 10) | 3 (70 %) (18) | wertykulacja (7, 32) brak światła hamuje kiełkowanie (1) stratyfikacja chłodna (1, 18) brak specjalnych zabiegów (6, 10, 14) | PRZED i PO (6, 10, 28, 31) | A | |
| Bromus tectorum (stokłosa dachowa) | A pola, pobocza dróg, grunty orne (16) | 0,45-2,28 (14, 29) | Ś = C (14) | 3 (29) | okres dojrzewania (1, 7, 32) kiełkowanie hamowane przez światło (1)) brak specjalnych zabiegów (14) | PRZED i PO (28, 31) | A | ||
| Cynosurus cristatus (grzebienica pospolita) | P pola, pobocza dróg, otwarte siedliska (16, 19) | 0,5-0,7 (14, 19, 29) | Ś = C (14) | 0 (29) | 3 (50 %) (19) | natężenie promieniowania nie ma wpływu na kiełkowanie (19) brak specjalnych zabiegów (14, 29) | PO (5) | A | |
| Digitaria sanguinalis (palusznik krwawy) | A pola, darń, otwarte siedliska (16) | 0,52-0,6 (14, 30) | Ś = C (14) | 10-20 (21) | 7 (75 %) 14 (94 %) (7) | wertykulacja, stratyfikacja chłodna i dojrzewanie (1, 7, 14, 32) poddać działaniu 101 mg/L KNO3 (14) brak światła hamuje kiełkowanie (1) brak specjalnych zabiegów (21) | PRZED i PO (18, 25, 31) | A | |
| Echinochioa crusgalli (chwastnica jednostronna) | A (16) | 1,5 (14) | Ś = C (14) Ś > C (3) | 10-20 (7, 21) | wertykulacja (7, 32) natężenie promieniowania nie ma wpływu na kiełkowanie (1) brak specjalnych zabiegów (3, 14, 21) | PRZED i PO (3, 21, 28, 31) | A | ||
| Elymus canadensis (wydmuchrzyca kanadyjska) | P obszary nadbrzeżne, obszary naruszone (16) | 4-5 (14, 30) | Ś = C (11) | 1 (11) | 14-28 (11) | brak specjalnych zabiegów (2, 11) | PO (2) | C, D, E | |
| Festuca pratensis (kostrzewa łąkowa) | P pola, wilgotne obszary (16, 19) | 1,53-2,2 (16, 19) | Ś = C (14) Ś > C (10) | 20 (10) | 9 (74 %) (10) 2 (50 %) (19) | brak specjalnych zabiegów (10, 19) | PO (10) | A | 7 |
| Hordeum pusillum (gatunek jęczmienia) | A pastwiska, pobocza dróg, otwarte siedliska (16) | 3,28 (14) | stratyfikacja ciepła (1) natężenie promieniowania nie ma wpływu na kiełkowanie (1) | PRZED (31) | 7 | ||||
| Phieum pratense (Timothy) | P pastwiska, pola uprawne, obszary naruszone (16, 19) | 0,45 (14), 19 | Ś > C (10, 14) | 0-10 (10, 19) | 2 (74 %) (10) 8 (50 %) (19) | brak światła hamuje kiełkowanie (19) natężenie promieniowania nie ma wpływu na kiełkowanie (17) brak specjalnych zabiegów (10, 14, 17, 19) | PO (10) | A, E | |
| RDESTOWATE (POLYGONACEAE) Polygonum convolvulus (rdestówka powojowata) | A otwarte siedliska, pobocza dróg (16) | 5-8 (4, 14, 29) | Ś = C (20) | 0-2 (4, 29) | stratyfikacja chłodna przez 4-8 tygodni (1, 2, 4, 20, 29) natężenie promieniowania nie ma wpływu na kiełkowanie (1) | PRZED i PO 1, 2, 20, 28, 31 | A | 32 | |
| Polygonum lapathifolium (rdest szczawiolistny) | A wilgotna gleba (16) | 1,8-2,5 (14) | Ś > C (6) | 5 (94 %) (18) | natężenie promieniowania nie ma wpływu na kiełkowanie (1) brak światła hamuje kiełkowanie (18) stratyfikacja chłodna (1) brak specjalnych zabiegów (5) | PRZED i PO (6) | A, E | ||
| Polygonum pennsylvanicum (rdest pensylwański) | A pola, otwarte siedliska (16) | 3,6-7 (14, 29) | 2 (29) | stratyfikacja chłodna przez 4 tygodnie w temperaturze 0-5 oC (1, 29) brak światła hamuje kiełkowanie (1) | PRZED (31) | A, E | |||
| Polygonum periscaria (rdest plamisty) | A obszary naruszone, pola uprawne (16, 19) | 2,1-2,3 (14, 19) | Ś > C (13) | 0 (19) | < 14 (13) 2 (50 %) (19) | wertykulacja, stratyfikacja chłodna, poddanie działaniu GA (14) stratyfikacja chłodna, dojrzewanie (17-19) brak światła hamuje kiełkowanie (19) brak specjalnych zabiegów (13) | PO (13) | A | 32 |
| Rumex crispus (szczaw kędzierzawy) | P grunty orne, pobocza dróg, otwarte obszary (16, 19) | 1,3-1,5 (4, 14, 19) | Ś = C (14, 33) | 0 (4, 19, 33) | 3 (50 %) (19) 6 (100 %) (33) | brak światła hamuje kiełkowanie (18, 19) konieczne może być dojrzewanie (18) brak specjalnych zabiegów (4, 14, 33) | PO (4, 33) | A, E | 32 |
| PIERWIOSNKOWATE (PRIMULACEAE) Anagallis arvensis (kurzyślad polny) | A grunty orne, otwarte obszary, obszary naruszone (16, 19) | 0,4-0,5 (4, 14, 19) | Ś = C (14) | 1 (50 %) (19) | stratyfikacja chłodna, poddanie działaniu kwasu giberelinowego (1, 14, 18, 19, 32) światło jest do kiełkowania konieczne (1) brak specjalnych zabiegów (2, 4) | PO (2,4) | A, F | ||
| PIERWIOSNKOWATE (RANUNCULACEAE) Ranunculus acris (jaskier ostry) | Ρ grunty orne, pobocza dróg, otwarte obszary (16, 19) | 1,5-2 (14, 19, 29) | Ś = C (14) | 1 (29) | 41-56 (19, 29) | brak specjalnych zabiegów (5, 14, 22, 24-26) | PO (5, 22, 24-26) | 32 | |
| RÓŻOWATE (ROSACEAE) Geum urbanum (kuklik pospolity) | Ρ żywopłoty, wilgotne obszary (16, 19) | 0,8-1,5 (14, 19) | Ś = C (14) | 0 (19) | 5 (50 %) (19) 16 (79 %) (18) | brak światła hamuje kiełkowanie (18, 19) stratyfikacja ciepła (1) brak specjalnych zabiegów (5, 14, 22, 25, 26) | PO (5, 22, 25, 26) | A | |
| MARZANOWATE (RUBIACEAE) Galium aparine (przytulia czepna) | A grunty orne, wilgotne obszary, obszary naruszone (16, 19) | 7-9 (14, 19) | Ś = C (14) | 5 (50 %) (19) 6 (100 %) (18) | stratyfikacja chłodna (1, 18, 19) natężenie promieniowania nie ma wpływu na kiełkowanie (18, 19) światło hamuje kiełkowanie (1) brak specjalnych zabiegów (6, 14) | PRZED i PO (6, 28) | A | 32 | |
| Galium mollugo (przytulia pospolita) | Ρ żywopłoty, otwarte obszary (8) | 7 (29) | Ś = C (14) | 2 (29) | brak specjalnych zabiegów (5, 14, 22, 24, 26, 29) | PO (5, 22, 24, 26) | A | ||
| TRĘDOWNIKOWATE (SCROPHULARIACEAE) Digitalis purpurea (naparstnica purpurowa) | Β, Ρ żywopłoty, otwarte obszary (16, 19) | 0,1-0,6 (4, 14, 19) | Ś = C (14) | 0 (4, 19) | 6 (50 %) (19) 8 (99 %) (18) | brak światła hamuje kiełkowanie (1, 17-19) brak specjalnych zabiegów (4, 22-26) | PO (4, 22- 26) | D, G, F | |
| Veronica persica (przetacznik perski) | A grunty orne, otwarte obszary, obszary naruszone (16, 19) | 0,5-0,6 (14, 19) | Ś = C (14) | 0 (19) | 3(19) 5 (96 %) (18) | brak światła hamuje kiełkowanie (18, 19) stratyfikacja chłodna (18) brak specjalnych zabiegów (14) | PRZED i PO (28) | A | 32 |
| (1) A = rośliny jednoroczne, В = rośliny dwuletnie, Ρ = rośliny wieloletnie. (2) Odniesienia 11, 14 i 33 wskazują na stosunek światła (Ś) do braku światła (C) konieczny do wywołania kiełkowania nasion. Odniesienia 3, 6, 9, 10, 13, 20 wskazują na warunki wzrostu w szklarniach. (3) 0 mm wskazuje, że nasiona wysiano na powierzchni gleby albo że nasiona potrzebują światła do kiełkowania. (4) Przedstawione liczby oznaczają liczbę dni do momentu wykiełkowania określonego odsetka nasion zgodnie z przedstawionymi odniesieniami np. 3 dni (50 %) kiełkowania (odniesienie 19). (5) Czas trwania dojrzewania lub stratyfikacji nie zawsze jest znany. Poza wymogami związanymi z utrzymywaniem chłodu warunki temperaturowe nie są sprecyzowane, ponieważ w przypadku badań w szklarni kontrolowanie temperatury jest ograniczone. Większość nasion wykiełkuje w warunkach normalnych zmian temperatury panujących w szklarniach. (6) Wskazuje, że gatunek został wykorzystany w badaniu toksyczności wobec roślin przed wzejściem (PRZED) lub po wzejściu (PO) obejmującym herbicydy. (7) Przedstawia przykładowych komercyjnych dostawców nasion. (8) Przedstawia dwie alternatywne pozycje literatury, do których się odwołano. |
Przywołani dostawcy nasion
| Identyfikator dostawcy | Informacje o dostawcy |
| A | Herbiseed New Farm, Mire Lane, West End, Twyford RG10 0NJ WIELKA BRYTANIA +44 (0) 1189 349 464 www.herbiseed.com |
| B | Tropilab Inc. 8240 Ulmerton Road, Largo, FL 33771-3948 STANY ZJEDNOCZONE (727) 344 - 4050 www.tropilab.com |
| C | Pterophylla - Native Plants & Seeds #316 Regional Road 60, RR#1, Walsingham, ON N0E 1X0 KANADA (519) 586-3 985 |
| D | Applewood Seed Co. 5380 Vivian St., Arvada, CO 80002 STANY ZJEDNOCZONE (303) 431-7 333 www.applewoodseed.com |
| E | Ernst Conservation Seeds 9006 Mercer Pike, Meadville, PA 16335 STANY ZJEDNOCZONE (800) 873 - 3321 www.ernstseed.com |
| F | Chiltern Seeds Bortree Stile, Ulverston, Cumbria LA12 7PB WIELKA BRYTANIA +44 1229 581137 www.chiltemseeds.co.uk |
| G | Thompson & Morgan P.O. P.O. Box 1051, Fort Erie, ON L2A 6C7 KANADA (800) 274 - 7333 www.thompson-morgan.com |
PRZYWOŁANE POZYCJE LITERATURY
(1) Baskin, C.C. i Baskin J.M. 1998. Seeds. Academic Press, Toronto
(2) Blackburn, L.G. & Boutin, C. 2003. Subtle effects of herbicide use in the context of genetically modified crops: a case study with glyphosate (Round-Up®). Ecotoxicology, 12: 271-285.
(3) Boutin C., Lee H-B., Peart T., Batchelor P.S. i Maguire R.J. 2000. Effects of the sulfonylurea herbicide metsulfuron methyl on growth and reproduction of five wetland and terrestrial plant species. Environmental Toxicology & Chemistry, 19(10): 2 532-2 541.
(4) Boutin C., Elmegaard N. i Kjaer C. 2004. Toxicity testing of fifteen non-crop plant species with six herbicides in a greenhouse experiment: implications for risk assessment. Ecotoxicology, 13: 349-369.
(5) Breeze V., Thomas G. i Butler R. 1992. Use of a model and toxicity data to predict the risks to some wild plant species from drift of four herbicides. Annals of Applied Biology, 121: 669-677.
(6) Brown R.A. i Farmer D. 1991. Track-sprayer and glasshouse techniques for terrestrial plant bioassays with pesticides. W: Plants for toxicity assessment: tom 2. ASTM STP 1115, J.W. Gorsuch, W.R. Lower, W.Wang, i M. A. Lewis, (red.). Amerykańskie Stowarzyszenie Badań i Materiałów, Filadelfia. s. 197-208.
(7) Buhler, D.D. i Hoffman M.L. 1999. Anderson's guide to practical methods of propagating weeds and other plants. Weed Science Society of America, Lawrence, K.
(8) Clapham A.R., Tutin T.G. i Warburg E.F. 1981. Excursion flora of the British Isles, wyd. 3. Cambridge University Press, Cambridge
(9) Clay, P.A. i Griffin, J.L. 2000. Weed seed production and seedling emergence response to late-season glyphosate applications. Weed Science, 48:481-486.
(10) Cole, J.F.H. i Canning L. 1993. Rationale for the choice of species in the regulatory testing of the effects of pesticides on terrestrial non-target plants. BCPC - Weeds. s. 151 - 156.
(11) Fiely M. (Ernst Conservation Seeds). 2004. Informacje własne. (www.ernstseed.com)
(12) Fletcher J.S., Johnson F.L. i McFarlane J.C. 1990. Influence of greenhouse versus field testing and taxonomic differences on plant sensitivity to chemical treatment. Environmental Toxicology & Chemistry, 9: 769-776.
(13) Fletcher J.S., Pfleeger T.G., Ratsch H.C. i Hayes, R. 1996. Potential impact of low levels of chlorsulfuron and other herbicides on growth and yield of nontarget plants. Environmental Toxicology & Chemistry, 15(7): 1189- 1196.
(14) Flynn S., Turner R.M. i Dickie J.B. 2004. Seed Information Database (wersja 6.0, październik 2004 r.) Royal Botanic Gardens, Kew (www.rbgkew.org.uk/data/sid)
(15) Franzaring J., Kempenaar C. i van der Eerden L.J.M. 2001. Effects of vapours of chlorpropham and ethofumesate on wild plant species. Environmental Pollution, 114:21-28.
(16) Gleason, H.A. i Cronquist A. 1991. Manual of vascular plants of northeastern United States and adjacent Canada, wydanie 2. New York Botanical Garden, Bronx, NY.
(17) Grime, J.P. 1981. The role of seed dormancy in vegetation dynamics. Annals of Applied Biology, 98: 555-558.
(18) Grime J.P., Mason G., Curtis A.V., Rodman J., Band S.R., Mowforth M.A.G., Neal A.M. i Shaw S. 1981. A comparative study of germination characteristics in a local flora. Journal of Ecology, 69: 1 017-1 059.
(19) Grime J.P., Hodgson J.G. i Hunt R. 1988. Comparative plant ecology: a functional approach to common British species. Unwin Hyman Ltd., Londyn.
(20) Kjaer C. 1994. Sublethal effects of chlorsulfuron on black bindweed (Polygonum convolvulus L.). Weed Research, 34: 453-459.
(21) Klingaman T.E., King C.A. i Oliver L.R. 1992. Effect of application rate, weed species, and weed stage of growth on imazethapyr activity. Weed Science, 40: 227-232.
(22) Marrs R.H., Williams C.T., Frost A.J. i Plant R.A. 1989. Assessment of the effects of herbicide spray drift on a range of plant species of conservation interest. Environmental Pollution, 59: 71-86.
(23) Marrs R.H., Frost A.J. i Plant R.A. 1991. Effects of herbicide spray drift on selected species of nature conservation interest: the effects of plant age and surrounding vegetation structure. Environmental Pollution, 69: 223-235.
(24) Marrs R.H., Frost A.J. i Plant R.A. 1991. Effects of mecoprop drift on some plant species of conservation interest when grown in standardized mixtures in microcosms. Environmental Pollution, 73: 25-42.
(25) Marrs R.H., Frost A.J., Plant R.A. i Lunnis P. 1993. Determination of buffer zones to protect seedlings of nontarget plants from the effects of glyphosate spray drift. Agriculture, Ecosystems, & Environment, 45:283-293.
(26) Marrs, R.H. i Frost, A.J. 1997. A microcosm approach to detection of the effects of herbicide spray drift in plant communities. Journal of Environmental Management, 50:369-388.
(27) Marshall, E.J.P. i Bernie, J.E. 1985. Herbicide effects on field margin flora. BCPC - Weeds. s. 1021-1028.
(28) McKelvey R.A., Wright J.P. i Honegger J.L. 2002. A comparison of crop and non-crop plants as sensitive species for regulatory testing. Pest Management Science, 58:1161-1174.
(29) Morton S. (Herbiseed). 2004. Informacje własne. (http://www.herbiseed.com)
(30) Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA), Służba Ochrony Zasobów Naturalnych (NRCS). 2004. The Plants Database, wersja 3.5 (http://plants.usda.gov). National Plant Data Centre, Baton Rouge, LA 70874-4490 STANY ZJEDNOCZONE.
(31) USEPA. 1999. One-Liner Database. [Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych / Biuro Programów Pestycydowych / Wydział Losów i Skutków Środowiskowych / Dział Epidemiologii Środowiskowej].
(32) Webster, R.H. 1979. Sprawozdanie techniczne nr 56: Growing weeds from seeds and other propagules for experimental purposes. Agricultural Research Council Weed Research Organization, Oxford.
(33) White A. L. i Boutin C. (National Wildlife Research Centre, Environment Canada). 2004. Informacje własne.
(34) Zwerger P. i Pestemer W. 2000. Testing the phytotoxic effects of herbicides on higher terrestrial non-target plants using a plant life-cycle test. Z. PflKrankh. PflSchutz, Sonderh., 17: 711-718.
Dodatek 4
Przykłady odpowiednich warunków wzrostu w przypadku niektórych gatunków roślin uprawnych
Następujące warunki uznano za odpowiednie w przypadku 10 gatunków roślin uprawnych - można je potraktować jako wytyczne na potrzeby badań w komorach wzrostu również w przypadku niektórych innych gatunków:
stężenie dwutlenku węgla: 350 ± 50 ppm;
wilgotność względna: 70 ± 5 % podczas okresów oświetlenia i 90 ± 5 % podczas okresów braku światła;
temperatura: 25 ± 3 °C w ciągu dnia, 20 ± 3 °C w nocy;
fotoperiod: 16 godz. światła / 8 godz. bez dostępu światła, przy średniej długości fali wynoszącej 400-700 nm;
światło: luminacja wynosząca 350 ± 50 mE/m2/s, mierzona ponad roślinami.
Gatunki roślin uprawnych:
- pomidor (Solanum lycopersicon);
- ogórek (Cucumis sativus);
- sałata (Lactuca sativa);
- soja (Glycine max);
- kapusta (Brassica oleracea var. capitata);
- marchew (Daucus carota);
- owies zwyczajny (Avena sativa);
- życica trwała (Lolium perenne);
- kukurydza zwyczajna (Zea mays);
- cebula (Allium cepa).
C.32. BADANIE ROZRODCZOŚCI WAZONKOWCOWATYCH
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 3.
C.33. BADANIE ROZRODCZOŚCI DŻDŻOWNIC (EISENIA FETIDA/EISENIA ANDREI)
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 3.
C.34. OKREŚLENIE ZAHAMOWANIA AKTYWNOŚCI BAKTERII BEZTLENOWYCH - OGRANICZENIE WYTWARZANIA GAZU Z BEZTLENOWO FERMENTUJĄCYCH OSADÓW (ŚCIEKOWYCH)
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna z dotyczącą badań wytyczną OECD nr 224 (2007). Substancje chemiczne odprowadzane do środowiska wodnego przechodzą przez obszary tlenowe i beztlenowe, w których mogą ulec rozkładowi lub mogą zahamować aktywność bakterii; w niektórych przypadkach mogą pozostać nienaruszone w obszarach beztlenowych przez dziesięciolecia lub dłużej. Na pierwszym etapie procesu oczyszczania ścieków, tj. na etapie osadzania wstępnego, zachodzą procesy tlenowe w supernatancie i procesy beztlenowe w osadzie pod supernatantem. Na kolejnym etapie zachodzą procesy tlenowe w komorze napowietrzania osadu czynnego oraz procesy beztlenowe w osadzie pod supernatantem w osadniku wtórnym. Osad z obu etapów poddaje się zwykle obróbce beztlenowej, w wyniku czego powstaje metan i dwutlenek węgla, które z reguły wykorzystuje się do wytwarzania energii elektrycznej. W środowisku naturalnym substancje chemiczne docierające do osadów w zatokach, ujściach rzek i morzu najczęściej pozostają w tych strefach beztlenowych na zawsze, jeśli nie ulegną biodegradacji. Większe ilości niektórych substancji chemicznych zapewne dotrą do tych obszarów ze względu na ich właściwości fizyczne, takie jak niska rozpuszczalność w wodzie, wysoka adsorpcja w zawiesinie, jak również niezdolność do biodegradacji w warunkach tlenowych.
2. Chociaż pożądane jest, aby substancje chemiczne uwalniane do środowiska ulegały biodegradacji zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych, zasadnicze znaczenie ma to, aby takie substancje chemiczne nie hamowały aktywności mikroorganizmów w żadnej ze stref. W Zjednoczonym Królestwie wystąpiło kilka przypadków całkowitego zahamowania produkcji metanu spowodowanego na przykład obecnością pentachlorofenolu w odprowadzanych ściekach przemysłowych, czego skutkiem był bardzo kosztowny wywóz takiego osadu z komór fermentacyjnych w "bezpieczne" miejsca oraz przywóz zdrowych osadów fermentujących z sąsiednich instalacji. Miało jednak miejsce wiele przypadków mniej poważnego zakłócenia fermentacji przez szereg innych substancji chemicznych, w tym fluorowęglowodory alifatyczne (czyszczenie chemiczne) i detergenty, co doprowadziło do poważnego osłabienia efektywności komory fermentacyjnej.
3. Zahamowania aktywności bakterii (oddychania osadu czynnego) dotyczy tylko jedna metoda badawcza C.11 (1), w ramach której ocenia się wpływ badanych substancji chemicznych na poziom poboru tlenu w obecności podłoża. Metoda ta jest powszechnie stosowana w celu wczesnego ostrzegania przed możliwym szkodliwym wpływem substancji chemicznych na obróbkę tlenową ścieków, jak również w celu wskazania niehamujących stężeń badanych substancji chemicznych, które mają być stosowane w różnych badaniach pod kątem biodegradowalności. Metoda badawcza C.43 (2) daje ograniczoną możliwość określenia toksyczności badanej substancji chemicznej dla wytwarzania gazu przez osad beztlenowy, rozcieńczony do jednej dziesiątej normalnej zawartości substancji stałych, tak aby umożliwić wystarczająco precyzyjną ocenę odsetka biodegradacji. Ponieważ rozcieńczony osad może być bardziej wrażliwy na hamujące substancje chemiczne, grupa ISO podjęła decyzję o opracowaniu metody badania z wykorzystaniem osadu nierozcieńczonego. Przeanalizowano co najmniej trzy projekty (z Danii, Niemiec i Zjednoczonego Królestwa) i ostatecznie opracowano dwie normy ISO - jedną z wykorzystaniem osadu nierozcieńczonego, ISO 13641-1 (3), i drugą z wykorzystaniem osadu rozcieńczonego w stosunku 1:100, ISO 13641-2 (4), tak aby uwzględnić szlam i osady o niskiej populacji bakterii. Obydwie metody poddano badaniu międzylaboratoryjnemu (5); część 1 potwierdzono jako akceptowalną normę, natomiast zdania na temat części 2 były podzielone. Zjednoczone Królestwo stwierdziło, że ponieważ znaczna część uczestników zgłosiła bardzo niski poziom lub brak wytwarzania gazu, po części ze względu na zbyt wysoki procent powierzchni gazowej (75 %), aby zapewnić optymalną czułość, metoda wymaga przeprowadzenia dalszych analiz.
4. We wcześniejszych pracach prowadzonych w Zjednoczonym Królestwie (6)(7) opisywano metodę manometryczną z wykorzystaniem nierozcieńczonego osadu fermentującego oraz surowego osadu ściekowego jako podłoża w kolbach o pojemności 500 ml; aparatura ta była nieporęczna, a fetor surowego osadu był odrażający. Bardziej kompaktowe i wygodne urządzenie Sheltona i Tiedje (8) opracowane przez Battersby'ego i Wilsona (9) zostało jakiś czas później zastosowane z powodzeniem przez Wilsona i in. (10). Kawahara i in. (11) z powodzeniem przygotowali bardziej standardowe osady w laboratorium do celów wykorzystania w badaniach różnych substancji chemicznych pod kątem biodegradowalności i zahamowania w warunkach beztlenowych. Co więcej, do celów badania surowy osad jako podłoże zastąpiono osadem beztlenowym rozcieńczonym w stosunku 1:100 albo szlamem, osadami itp. o niskiej aktywności bakterii.
5. Przedmiotowa metoda może dostarczyć informacji, które są przydatne w przewidywaniu ewentualnego wpływu badanej substancji chemicznej na wytwarzanie gazu w beztlenowych komorach fermentacyjnych. Niemniej wyłącznie dłuższe badania w większym stopniu symulujące pracę komór fermentacyjnych mogą wskazać, czy może nastąpić adaptacja mikroorganizmów do badanej substancji chemicznej czy też substancje chemiczne, w przypadku których prawdopodobna jest absorpcja i adsorpcja w osadzie, mogą w miarę upływu czasu wytworzyć stężenie toksyczne wyższe niż dozwolone w danym badaniu.
ZASADA BADANIA
6. Podwielokrotności mieszaniny beztlenowo fermentującego osadu (od 20 g/l do 40 g/l łącznej zawartości części stałych) i degradowalnego roztworu podłoża są inkubowane oddzielnie i równocześnie z różnymi stężeniami badanej substancji chemicznej w zamkniętych naczyniach przez okres do 3 dni. Ilość wyprodukowanego gazu (metanu i dwutlenku węgla) mierzy się wzrostem ciśnienia (Pa) w butlach. Procent zahamowania wytwarzania gazu spowodowanego różnymi stężeniami badanej substancji chemicznej oblicza się na postawie ilości wytworzonych w poszczególnych butlach badanych i kontrolnych. EC50 i inne stężenia efektywne oblicza się na podstawie wykresów procentu zahamowania w stosunku do stężenia badanych substancji chemicznych albo, częściej, za pomocą jego logarytmu.
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ
7. Badane substancje chemiczne powinny być zwykle stosowane w najczystszej łatwo dostępnej postaci, ponieważ zanieczyszczenia występujące w niektórych substancjach chemicznych, np. chlorofenole, mogą być o wiele bardziej toksyczne niż sama badana substancja chemiczna. Należy jednak rozważyć konieczność zbadania substancji chemicznych w postaci, w jakiej są one produkowane / udostępniane na rynku. Nie zaleca się rutynowego stosowania produktu w postaci użytkowej, niemniej w przypadku słabo rozpuszczalnych badanych substancji chemicznych właściwe może być zastosowanie takiego materiału. Właściwości badanej substancji chemicznej, które powinny być znane to: rozpuszczalność w wodzie i niektórych rozpuszczalnikach organicznych, prężność pary, współczynnik adsorpcji, hydroliza i biodegradowalność w warunkach beztlenowych.
ZAKRES STOSOWANIA METODY
8. Badanie ma zastosowanie do substancji chemicznych, które są rozpuszczalne albo nierozpuszczalne w wodzie, z uwzględnieniem lotnych substancji chemicznych. Należy jednak zachować szczególną uwagę w przypadku materiałów o niskiej rozpuszczalności w wodzie (zob. bibliografia pozycja (12)) oraz o dużej lotności. Można również wykorzystać inokula z innych obszarów beztlenowych, np. szlam, gleby nasycone czy osady. Beztlenowe systemy bakteryjne, które uprzednio były narażone na toksyczne substancje chemiczne, można zaadaptować, tak aby utrzymać ich aktywność w obecności ksenobiotycznych substancji chemicznych. Inokula z zaadaptowanych systemów bakteryjnych mogą wykazywać wyższą tolerancję na badane substancje chemiczne w porównaniu z inokulami uzyskanymi z niezaadaptowanych systemów.
SUBSTANCJE CHEMICZNE ODNIESIENIA
9. W celu sprawdzenia procedury bada się chemiczną substancję odniesienia, ustawiając odpowiednie naczynia równolegle w ramach zwykłych rund badania; wykazano, że 3,5-dichlorofenol jest stałym inhibitorem beztlenowego wytwarzania gazu, jak również zużycia tlenu przez osad czynny i inne reakcje biochemiczne. Jak wykazano, dwie pozostałe substancje chemiczne, tj. metyleno-bis(tiocyjanian) i pentachlorofenol, mają większy wpływ hamujący na produkcję metanu niż 3,5-dichlorofenol, niemniej wyniki z udziałem tych substancji nie zostały potwierdzone. Pentachlorofenol nie jest zalecany ze względu na fakt, że nie jest łatwo dostępny w czystej postaci.
ODTWARZALNOŚĆ WYNIKÓW
10. W międzynarodowym badaniu międzylaboratoryjnym (5) odnotowano jedynie zadowalającą odtwarzalność w wartościach EC50 wśród 10 uczestniczących laboratoriów dla 3,5-dichlorofenolu i kwasu 2-bromoetano-sulfonowego. (Zakres dla pierwszego wynosił od 32 mg/l do 502 mg/l, zaś dla drugiego - 220-2 190 mg/l.)
| Liczba laboratoriów | W mg/l | W mg/g osadu | ||||
| średnia | odchylenie standardowe | cv(%) | średnia | odchylenie standardowe | cv(%) |
| 3,5-dichlorofenol |
| 10 | 153 | 158 | 103 | 5 | 4,6 | 92 |
| kwas 2-bromoetano-sulfonowy |
| 10 | 1 058 | 896 | 85 | 34 | 26 | 76 |
Wartości EC50 uzyskane w badaniu międzylaboratoryjnym - nierozcieńczony osad.
11. Wysokie współczynniki zmienności między poszczególnymi laboratoriami w dużym zakresie odzwierciedlają różnice we wrażliwości mikroorganizmów osadowych wynikające z ich wcześniejszego narażenia na badaną substancję chemiczną lub inną substancję o zbliżonym składzie chemicznym lub z braku takiego narażenia. Wartość EC50 określono na podstawie stężenia osadu z dokładnością niewiele większą niż wartość "objętościową" (mg/l). Trzy laboratoria, które zanotowały dokładne wartości EC50 dla 3,5-dichlorofenolu, wykazały współczynniki zmienności (odpowiednio 22 %, 9 %, i 18 % dla EC50 mg/g) znacznie niższe niż średnia tych współczynników dla wszystkich dziesięciu laboratoriów. Poszczególne średnie dla tych trzech laboratoriów wynosiły odpowiednio 3,1, 3,2 i 2,8 mg/g. Niższe dopuszczalne współczynniki zmienności między laboratoriami porównane ze znacznie wyższymi współczynnikami między wartościami laboratoryjnymi, mianowicie 9-22 % por. 92 %, wskazują na występowanie znacznych różnic we właściwościach poszczególnych osadów.
OPIS METODY
Aparatura
12. Wymagany jest zwykły sprzęt laboratoryjny i następujące przyrządy:
a) inkubator - iskrobezpieczny, z regulacją temperatury 35 C ± 2 C;
b) ciśnieniowe szklane naczynia badawcze o odpowiednich wymiarach nominalnych 12 , każde wyposażone w gazoszczelną septę, która może wytrzymać ciśnienie około 2 barów lub 2 × 105 Pa (jako powłoki użyć np. PTFE = politetrafluoroetylenu). Szklane butelki do surowicy o pojemności nominalnej 125 ml i pojemności rzeczywistej około 160 ml, zamknięte szczelnymi septami 13 i obciskanymi pierścieniami aluminiowymi; z powodzeniem można stosować też butelki o całkowitej pojemności wynoszącej 0,1-1 l;
c) precyzyjny ciśnieniomierz 14 i połączenie z igłą;
całkowite wytwarzanie gazu (metanu i dwutlenku węgla) mierzone za pomocą ciśnieniomierza przystosowanego do mierzenia i uwalniania wytworzonego gazu; przykładem takiego odpowiedniego urządzenia jest ręczny precyzyjny ciśnieniomierz podłączony do igły strzykawki; gazoszczelny zawór trójdrogowy ułatwia obniżenie nadmiernego ciśnienia (dodatek 1). Wewnętrzna objętość przewodów przetwornika ciśnienia i zaworu powinna być jak najmniejsza, aby błędy wynikające z pominięcia objętości aparatury były niewielkie;
d) izolowane pojemniki wykorzystywane do transportowania osadu fermentującego;
e) trójdrogowe zawory ciśnieniowe;
f) sito o kwadratowych oczkach wielkości 1 mm;
g) zbiornik do fermentowania osadu - szklana lub wykonana z polietylenu o wysokiej gęstości butelka o pojemności około 5 litrów wyposażona w mieszadło i urządzenia umożliwiające przepuszczanie strumienia azotu (zob. pkt 13) przez fazę nadpowierzchniową;
h) filtry membranowe (0,2 µm) przeznaczone do sterylizacji podłoża;
i) mikrostrzykawki służące do gazoszczelnego połączenia przetwornika ciśnienia (zob. pkt 12 lit. c)) z fazą nadpowierzchniową w butelkach (zob. pkt 12 lit. b)), a także do dodawania nierozpuszczalnych ciekłych materiałów badanych do butelek;
j) komora rękawicowa, opcjonalnie, ale zalecana, w której utrzymywane jest niewielkie nadciśnienie azotu.
Odczynniki
13. W całym badaniu należy stosować odczynniki czyste do analizy. W całym badaniu należy stosować wysokiej czystości azot z zawartością tlenu nieprzekraczającą 5 µl/l.
Woda
14. Jeżeli na jakimkolwiek etapie badania wymagane jest rozcieńczenie, należy zastosować wodę dejonizowaną, która została wcześniej odpowietrzona. Nie ma potrzeby sporządzania analitycznych prób kontrolnych tej wody, ale należy zapewnić regularny przegląd aparatury służącej do dejonizacji. Stosować wodę dejonizowaną także do przygotowywania roztworu podstawowego. Przed dodaniem inokulum beztlenowego do jakiegokolwiek roztworu lub przed rozcieńczeniem badanego materiału upewnić się, że roztwór i badany materiał są odtlenione. Można to zrobić, przepuszczając przez wodę rozcieńczającą (lub rozcieńczenia) azot przez 1 godzinę przed dodaniem inokulum, lub alternatywnie, podgrzewając wodę rozcieńczającą do punktu wrzenia i schładzając ją do temperatury pokojowej w atmosferze beztlenowej.
Przefermentowany osad
15. Aktywnie fermentujący osad pobrać z komory fermentacyjnej oczyszczalni ścieków lub z laboratoryjnej komory fermentacyjnej, w której oczyszczane są głównie ścieki domowe. Informacje praktyczne dotyczące osadu pochodzącego z laboratoryjnej komory fermentacyjnej można znaleźć w pozycji bibliograficznej (11). Jeżeli przewiduje się zastosowanie zaadaptowanego inokulum, można brać pod uwagę zastosowanie fermentującego osadu z oczyszczalni ścieków przemysłowych. Do pobierania osadu używać butelek z szeroką szyjką, wykonanych z polietylenu o wysokiej gęstości lub podobnego materiału, który może się rozszerzać. Napełnić butelki do pobierania próbek osadem do wysokości około 1 cm od wylotu butelki i szczelnie zamknąć, najlepiej używając do tego celu zaworu bezpieczeństwa (pkt 12 lit. e)), a następnie w celu zminimalizowania szoku termicznego umieścić w izolowanych pojemnikach (pkt 12 lit. d)) do momentu przeniesienia ich do inkubatora, którego temperaturę utrzymuje się na poziomie 35 °C ± 2 °C. Otwierając butelki, należy pamiętać o obniżeniu nadmiernego ciśnienia gazu przez ostrożne rozszczelnienie korka lub za pomocą trójdrogowego zaworu ciśnieniowego (pkt 12 lit. e)). Zaleca się wykorzystanie osadu w ciągu kilku godzin od pobrania, w przeciwnym wypadku należy przechowywać go w temperaturze 35 °C ± 2 °C w fazie nadopwierzchniowej azotu, jednak nie dłużej niż przez 3 dni, gdyż w takim okresie występuje zwykle niewielka utrata aktywności.
Uwaga - Fermentujący osad wytwarza łatwopalne gazy, które powodują ryzyko pożaru i wybuchu: zawiera również potencjalnie patogenne organizmy, dlatego mając do czynienia z osadem, należy zachować właściwe środki ostrożności. Ze względów bezpieczeństwa do pobierania osadu nie stosować szklanych naczyń.
Inokulum
16. Bezpośrednio przed zastosowaniem należy połączyć osad, delikatnie mieszając go i przepuszczając przez sito o oczkach wielkości 1 mm2 (pkt 12 lit. f)) do odpowiedniej butelki (pkt 12 lit. g)) przez której fazę nadpowierzchniową przechodzi strumień azotu. Odłożyć próbkę do pomiaru stężenia całkowitej zawartości substancji stałych (zob. np. norma ISO 11923 (13) lub równoważna norma UE). Zasadniczo stosować osad bez jego rozcieńczania. Stężenie części stałych wynosi zwykle 2-4 % (stężenie masowe). Sprawdzić wartość pH osadu i w razie potrzeby skorygować do 7 ± 0,5.
Podłoże użyte w badaniu
17. W 100 ml wody dejonizowanej rozpuścić 10 g pożywki bulionowej (np. Oxoid), 10 g wyciągu z drożdży i 10 g D-glukozy. Wysterylizować, filtrując na filtrze membranowym 0,2 µm (pkt 12 lit. h)), i natychmiast zastosować lub przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 dzień.
Badana substancja chemiczna
18. Przygotować oddzielny roztwór podstawowy dla każdej rozpuszczalnej w wodzie badanej substancji chemicznej, tak aby zawierał na przykład 10 g/l substancji chemicznej w odtlenionej wodzie rozcieńczającej (pkt 14). Stosować odpowiednie objętości tych roztworów podstawowych w celu przegotowania mieszanin reakcyjnych zawierających progresywne stężenia. Alternatywnie przygotować serię rozcieńczeń każdego roztworu podstawowego, tak aby objętość dodana do butelek badawczych była taka sama dla każdego wymaganego stężenia końcowego. W razie potrzeby skorygować pH roztworów podstawowych do 7 ± 0,2.
19. W przypadku badanych substancji chemicznych, które są niewystarczająco rozpuszczalne w wodzie, sprawdzić w normie ISO 10634 (12) lub równoważnej normie UE. Jeżeli wymagane jest zastosowanie rozpuszczalnika organicznego, unikać rozpuszczalników takich jak chloroform lub tetrachlorek węgla, o których wiadomo, że znacząco hamują wytwarzanie metanu. Przygotować roztwór o odpowiednim stężeniu, składający się z nierozpuszczalnej w wodzie substancji chemicznej rozpuszczonej we właściwym rozpuszczalniku lotnym, na przykład acetonie, eterze dietylowym. Dodać wymaganą objętość roztworu z rozpuszczalnikiem do pustych butelek badawczych (pkt 12 lit. b)) i odparować rozpuszczalnik przed dodaniem osadu. W odniesieniu do innych zabiegów stosować normę ISO 10634 (12) lub równoważną normę UE, jednak należy pamiętać o tym, że wszelkie środki powierzchniowo czynne wykorzystywane do produkcji emulsji mogą być inhibitorem beztlenowego wytwarzania gazu. Jeżeli uznaje się, że obecność rozpuszczalników organicznych i środków emulgujących powoduje powstanie artefaktów, badaną substancję chemiczną można dodać bezpośrednio do badanej mieszaniny w postaci substancji w proszku lub cieczy. Lotne substancje chemiczne i nierozpuszczalne w wodzie ciekłe badane substancje chemiczne można wstrzyknąć do butelek do surowicy zawierających inokulum, używając mikrostrzykawek (pkt 12 lit. i)).
20. Dodać badane substancje chemiczne do butelek w celu uzyskania geometrycznego ciągu stężeń, na przykład, 500 mg/l, 250 mg/l, 125 mg/l, 62,5 mg/l, 31,2 mg/l i 15,6 mg/l. Jeżeli na podstawie podobnych substancji chemicznych nie można określić zakresu toksyczności, w celu określenia odpowiedniego zakresu należy najpierw przeprowadzić wstępne badanie ustalające zakres przy wykorzystaniu stężeń 1 000 mg/l, 100 mg/l i 10 mg/l.
Substancja chemiczna odniesienia
21. Przygotować roztwór wodny 3,5-dichlorofenolu (10 g/l), stopniowo dodając minimalną ilość roztworu wodorotlenku sodu, wynoszącą 5 mol/l, do substancji stałej i jednocześnie mieszając powstający roztwór do momentu jego rozpuszczenia. Następnie dodać odtlenioną wodę rozcieńczającą (pkt 14) do wymaganej objętości; sonikacja może wspomóc proces rozpuszczania. Inne substancje chemiczne odniesienia można stosować w przypadku uzyskania średniego zakresu EC50 w co najmniej trzech badaniach wykorzystujących różne inokula (inne źródła lub inne czasy pobrania inokulów).
INTERFERENCJA/BŁĘDY
22. Niektóre składniki osadu mogłyby przypuszczalnie reagować z potencjalnymi inhibitorami enzymatycznymi, sprawiając, że będą one niedostępne dla mikroorganizmów, a przez to skutkując niskim zahamowaniem lub jego brakiem. Również w przypadku gdy osad zawiera już substancję chemiczną będącą inhibitorem enzymatycznym, uzyskano by błędny wynik, gdyby tę substancją chemiczną poddano badaniu. Oprócz tych możliwości istnieje szereg zidentyfikowanych czynników, które mogą prowadzić do błędnych wyników. Czynniki te wymieniono w dodatku 3 wraz z metodami eliminowania lub przynajmniej ograniczania błędów.
PROCEDURA BADANIA
23. Liczba koniecznych kontrprób zależy od stopnia dokładności wymaganego w odniesieniu do wskaźników zahamowania. W przypadku gdy korki butelek są wystarczająco gazoszczelne przez cały okres badania, stosować tylko jedną partię (obejmującą co najmniej trzy naczynia) butelek badawczych w odniesieniu do każdego wymaganego stężenia. Podobnie stosować jedną partię butelek z substancją chemiczną odniesienia i jeden zbiór prób kontrolnych. Jeżeli korki butelek nadają się tylko do jednorazowego przekłucia lub niewielkiej liczby przekłuć, zastosować partię (np. obejmującą trzy naczynia) butelek badawczych w odniesieniu do każdego odstępu czasowego (t), dla którego wymagane są wyniki dotyczące wszystkich stężeń badanej substancji chemicznej, które mają zostać zbadane. Podobnie zastosować "t" partii butelek w odniesieniu do substancji chemicznej odniesienia i w odniesieniu do prób kontrolnych.
24. Zaleca się wykorzystanie komory rękawicowej (pkt 12 lit. j)). Co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem badania rozpocząć przepuszczanie azotu przez komorę rękawicową wyposażoną w cały niezbędny sprzęt. Dopilnować, aby podczas manipulowania butelkami i szczelnego zamykania butelek temperatura osadu wynosiła 35 °C ± 2 °C
Badanie wstępne
25. Jeżeli aktywność osadu nie jest znana, zaleca się wykonanie badania wstępnego. Sporządzić próby kontrolne w celu uzyskania na przykład stężeń części stałych wynoszących 10 g/l, 20 g/l i 40 g/l z podłożem, ale bez użycia badanej substancji chemicznej. Należy również stosować różne objętości mieszaniny reakcyjnej w celu uzyskania trzech lub czterech stosunków objętości fazy nadpowierzchniowej względem objętości cieczy. Na podstawie wyników zmierzonej objętości gazów w różnych odstępach czasu wybrać najbardziej odpowiednie warunki umożliwiające dokonywanie dwa razy dziennie pomiarów z pozyskaniem każdego dnia znacznych objętości gazu i obniżeniem ciśnienia przy optymalnej czułości 15 i bez zagrożenia eksplozjami.
Dodanie badanych substancji chemicznych
26. Napełnić puste butelki badawcze rozpuszczalnymi w wodzie badanymi substancjami chemicznymi (pkt 12 lit. b)) w formie roztworów wodnych (pkt 18). W odniesieniu do każdego zakresu stężeń stosować zbiory butelek obejmujące co najmniej trzy naczynia (pkt 20). W przypadku gdy badana substancja chemiczna nie rozpuszcza się lub słabo się rozpuszcza, przy użyciu mikrostrzykawki wstrzyknąć jej roztwory w rozpuszczalnikach organicznych do pustych butelek w celu uzyskania zbiorów kontrprób każdego z pięciu stężeń badanej substancji chemicznej. Odparować rozpuszczalnik przez przepuszczenie strumienia azotu nad powierzchnią roztworów w butelkach badawczych. Alternatywnie dodać nierozpuszczalną stałą substancję chemiczną w formie ważonych ilości substancji chemicznej bezpośrednio do butelek badawczych.
27. Jeżeli nie dodaje się nierozpuszczalnych i słabo rozpuszczalnych w wodzie ciekłych badanych substancji chemicznych przy użyciu rozpuszczalnika, dodać je za pomocą mikrostrzykawki bezpośrednio do butelek badawczych po dodaniu inokulum i substratu użytego w badaniu (zob. pkt 30). W ten sam sposób można dodawać lotne badane substancje chemiczne.
Dodanie inokulum i substratu
28. Wmieszać odpowiednią objętość przesianego osadu fermentującego (zob. pkt 16) w 5-litrowej butelce (pkt 12 lit. g)), przy jednoczesnym przepuszczaniu strumienia azotu przez fazę nadpowierzchniową. W celu usunięcia powietrza wypłukać butelki badawcze, zawierające roztwory wodne lub odparowane roztwory badanej substancji chemicznej z rozpuszczalnikiem, pod strumieniem azotu przez około dwie minuty. Umieścić podwielokrotności, np. 100 ml, dobrze wymieszanego osadu w butelkach badawczych za pomocą pipety z dużą końcówką lub cylindra miarowego. Istotne jest napełnienie pipety jednorazowo dokładną wymaganą objętością osadu ze względu na łatwość osadzania się części stałych osadu. W przypadku pobrania zbyt dużej ilości osadu należy opróżnić pipetę i jeszcze raz pobrać osad.
29. Następnie należy dodać wystarczającą ilość roztworu substratu (pkt 17), aby każda pożywka bulionowa, wyciąg z drożdży i D-glukoza w mieszaninie uzyskały stężenie wynoszące 2 g/l, a jednocześnie nadal płukać azotem. Poniżej przedstawiono przykład dla badanych partii.
| Końcowe stężenie masowe badanej substancji chemicznej w butelkach badawczych (mg/l) | Objętość badanej substancji chemicznej (ml) | Odczynniki i podłoża (ml) | |||
| Roztwór podstawowy a) 10 g/l pkt 18 | Roztwór podstawowy b) 1 g/l pkt 18 | Woda rozcieńczająca pkt 14 | Inokulum pkt 16 | Podłoże pkt 17 | |
| 0 | - | 0 | 1,0 | 100 | 2 |
| 1 | - | 0,1 | 0,9 | 100 | 2 |
| 3,3 | - | 0,33 | 0,67 | 100 | 2 |
| 10 | 0,1 | - | 0,9 | 100 | 2 |
| 33 | 0,33 | - | 0,67 | 100 | 2 |
| 100 | 1,0 | - | 0 | 100 | 2 |
| Całkowita pojemność butelki = 160 ml. Objętość cieczy = 103 ml. Objętość gazu = 57 ml lub 35,6 % całkowitej objętości. |
30. Podobnie przepłukać dostatecznie azotem puste butelki badawcze, aby móc w nich usunąć wszelkie lotne lub nierozpuszczalne ciekłe badane substancje chemiczne (zob. pkt 27).
Próby kontrolne i substancja chemiczna odniesienia
31. W celu sporządzenia próby kontrolnej zastosować zestawy butelek obejmujące co najmniej trzy naczynia, zawierające wyłącznie osad i podłoże. Przygotować kolejne butelki z kontrpróbą zawierające osad i podłoże oraz wystarczającą ilość roztworu podstawowego substancji chemicznej odniesienia, 3,5-dichlorofenolu (pkt 21), potrzebną do uzyskania stężenia końcowego wynoszącego 150 mg/l. Takie stężenie powinno hamować wytwarzanie gazu o około 50 %. Alternatywnie przygotować zakres stężeń substancji chemicznej odniesienia. Ponadto przygotować cztery dodatkowe butelki do pomiaru pH zawierające osad, odtlenioną wodę i podłoże. Dodać badaną substancję chemiczną do dwóch butelek w najwyższych badanych stężeniach, a do pozostałych dwóch butelek dodać odtlenioną wodę.
32. Zapewnić, aby wszystkie butelki - butelki badawcze, butelki zawierające substancje chemiczne odniesienia i butelki do prób kontrolnych - zawierały tę sama objętość (VR) cieczy; w razie konieczności dodać odtlenioną wodę dejonizowaną (pkt 14), aby osiągnąć tę wymaganą objętość. Faza nadpowierzchniowa powinna stanowić 10-40 % pojemności butelki, a jej faktyczną wartość ustala się na podstawie danych uzyskanych w badaniu wstępnym. Po dodaniu wszystkich składników do butelek usunąć igłę, przez którą wypływa gaz, i szczelnie zamknąć każdą butelkę za pomocą kauczukowego korka z nasadką aluminiową (pkt 12 lit. b)), zwilżając korek kroplą wody dejonizowanej, aby ułatwić jego umieszczenie. Wstrząsnąć każdą butelką w celu wymieszania jej zawartości.
Inkubacja butelek
33. Przenieść butelki do regulowanego termostatycznie inkubatora, najlepiej wyposażonego we wstrząsarkę, i utrzymywanego w temperaturze 35 °C ± 2 °C. Butelki inkubuje się bez dostępu światła. Po upływie około godziny wyrównać ciśnienie w butelkach do ciśnienia atmosferycznego, wprowadzając igłę strzykawki dołączoną do ciśnieniomierza (pkt 12 lit. c)) kolejno przez korek każdej butelki, otworzyć zawór i odczekać aż ciśnieniomierz wskaże zero, po czym zamknąć zawór. Igłę należy umieścić pod kątem około 45° w celu uniemożliwienia wyciekania gazu z butelek. Jeżeli butelki są inkubowane w inkubatorach bez wstrząsarek, dwa razy dziennie ręcznie wstrząsać każdą butelką przez cały okres inkubacji w celu stabilizacji układu. Inkubować butelki i odwrócić je w celu uniemożliwienia jakiejkolwiek utraty gazu przez septę. Odwracanie nie jest jednak wskazane w przypadkach gdy nierozpuszczalne badane substancje chemiczne mogą przylegać do dna kolby.
Pomiar ciśnienia
34. Jeżeli butelki osiągnęły temperaturę 35 °C ± 2 °C, zmierzyć i zanotować wartość pH zawartości dwóch z czterech butelek przygotowanych do celów badania, a następnie usunąć ich zawartość; kontynuować inkubowanie pozostałych butelek bez dostępu światła. Mierzyć i notować wartość ciśnienia w butelkach dwa razy dziennie przez kolejne 48-72 godziny, wprowadzając igłę ciśnieniomierza przez korek każdej kolejnej butelki, przy czym pomiędzy pomiarami należy igłę osuszyć. W czasie pomiaru przechowywać wszystkie elementy butelki w temperaturze inkubacji, a pomiar ten należy przeprowadzić możliwie najszybciej. Umożliwić ustabilizowanie i zanotowanie odczytu ciśnienia. Następnie otworzyć zawór w celu wentylacji i zamknąć, gdy ciśnieniomierz wskaże zero. Kontynuować badanie zwykle przez 48 godzin od momentu pierwszego wyrównania ciśnienia, oznaczonego jako "godzina 0". Liczba odczytów i powtórzeń wentylacji powinna być ograniczona w przypadku lotnych substancji chemicznych do jednego (pod koniec inkubacji) lub dwóch w celu minimalizacji straty badanej substancji chemicznej (10).
35. W przypadku odczytu ciśnienia wskazującego na wartości ujemne nie otwierać zaworu. W igle i rurkach strzykawek zbiera się czasem wilgoć, na co wskazują niewielkie ujemne wartości odczytu ciśnienia. W takim przypadku należy igłę wyjąć, wstrząsnąć rurką, wysuszyć ją za pomocą bibuły, a następnie podłączyć nową igłę.
Pomiar pH
36. Zmierzyć i zanotować wartość pH zawartości każdej butelki po przeprowadzeniu końcowego pomiaru ciśnienia.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Przedstawienie wyników
37. Obliczyć sumę i średnią wartości ciśnienia zanotowanych w każdym odstępie czasowym w odniesieniu do każdego zbioru butelek z kontrpróbą i obliczyć średnie sumaryczne ciśnienie gazu brutto w każdym odstępie czasowym w odniesieniu do każdego zbioru kontrprób. Wykreślić krzywe średniego sumarycznego wytwarzania gazu (Pa) w funkcji czasu w odniesieniu do butelek z próbą kontrolną, butelek badawczych i butelek odniesienia. Wybrać czas na liniowej części krzywej, zwykle 48 godzin, i na podstawie poniższego równania obliczyć procentowe zahamowanie (I) w odniesieniu do każdej wartości stężenia [1]:
I = (1 - Pt/PC) × 100 [1], gdzie
I procentowe zahamowanie, wyrażone w %;
Pt ciśnienie gazu wytworzone za pomocą badanego materiału w wybranym czasie, wyrażone w paskalach (Pa);
Pc ciśnienie gazu wytworzone w próbie kontrolnej w tym samym czasie, wyrażone w paskalach (Pa).
Zaleca się sporządzenie obu wykresów, tj. wykresu I w funkcji stężenia oraz w funkcji logarytmu stężenia, tak aby można było wybrać krzywą o bardziej liniowym kształcie. Ocenić wartość EC50 (mg/l) wizualnie lub za pomocą analizy regresji na podstawie krzywej o bardziej liniowym kształcie. Do celów porównawczych bardziej przydatne może być wyrażenie stężenia substancji chemicznej jako mg substancji chemicznej / g całkowitej zawartości części stałych. Aby uzyskać to stężenie, należy podzielić stężenie objętościowe (mg/l) przez stężenie objętościowe części stałych suchego osadu (g/l) (pkt 16).
38. Obliczyć procentowe zahamowanie spowodowane przez określone stężenie zastosowanej substancji chemicznej odniesienia lub EC50, jeżeli zbadano wystarczającą liczbę stężeń.
39. Przeliczyć średnie ciśnienie gazu wytworzonego w próbie kontrolnej Pc(Pa) na objętość, odnosząc się do krzywej kalibracyjnej ciśnieniomierza (dodatek 2) i na podstawie tego obliczyć wydajność gazową, wyrażoną jako objętość wytworzona w ciągu 48 godzin ze 100 ml nierozcieńczonego osadu w stężeniu części stałych wynoszącym od 2 % (20 g/l) do 4 % (40 g/l).
Kryteria ważności
40. Wyniki uzyskane w międzylaboratoryjnym badaniu ISO (5) wykazały, że substancja chemiczna odniesienia (3,5-dichlorofenol) wywołała 50-procentowe zahamowanie wytwarzania gazu w zakresie stężeń wynoszącym 32- 510 mg/l przy średniej wartości 153 mg/l (10). Zakres ten jest tak szeroki, że nie można z wystarczającą pewnością wyznaczyć stałych limitów w odniesieniu do zahamowania jako kryteriów ważności; możliwość taka powinna istnieć w przypadkach, w których rezultaty badań wykazały, w jaki sposób można wytworzyć bardziej spójne inokula. Objętości gazu wytworzonego w kontrolnych butlach w ciągu 48 godzin wahały się w zakresie 21-149 ml/g suchej masy osadu (ze średnią 72 ml/g). Nie istniał żaden oczywisty związek między objętością wytworzonego gazu a odpowiadającą jej wartością EC50. Końcowa wartość pH wahała się w zakresie 6,1-7,5.
41. Badanie uważa się za ważne, jeżeli w próbie kontrolnej odniesienia zawierającej 150 mg/l 3,5-dichlorofenolu uzyska się zahamowanie większe niż 20 %, w próbie ślepej wytworzy się ponad 50 ml gazu na gram suchej masy, a na końcu badania wartość pH mieści się w zakresie 6,2-7,5.
Sprawozdanie z badania
42. Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje. Badana substancja chemiczna
- nazwa zwyczajowa, nazwa systematyczna, numer CAS, wzór strukturalny i istotne właściwości fizykochemiczne;
- czystość (zanieczyszczenia) badanej substancji chemicznej. Warunki badania
- objętości zawartości ciekłych i fazy nadpowierzchniowej w naczyniach badawczych;
- opisy naczyń badawczych i pomiar gazu (np. rodzaj ciśnieniomierza);
- wprowadzenie badanej substancji chemicznej i substancji chemicznej odniesienia do układu badawczego, zastosowane badane stężenie i stosowanie wszelkich rozpuszczalników;
- informacje dotyczące zastosowanego inokulum: nazwa oczyszczalni ścieków, opis źródła oczyszczonych ścieków (np. temperatura robocza, czas retencji osadu, głównie ścieki domowe lub przemysłowe itd.), stężenie części stałych, aktywność wytwarzania gazu w beztlenowej komorze fermentacyjnej, poprzednie narażenie lub ewentualna wstępna adaptacja do toksycznych substancji chemicznych lub miejsce pobrania szlamu, osadu itp.;
- temperatura i zakres inkubacji;
- liczba kontrprób.
Wyniki
- wartości pH pod koniec badania;
- w razie potrzeby wszystkie dane zmierzone w naczyniach badawczych, naczyniach z próbą ślepą i naczyniach z próbą kontrolną wykonaną na substancji chemicznej odniesienia (np. ciśnienie w Pa lub milibarach) w formie tabeli;
- procentowe zahamowanie w butelkach badawczych i butelkach odniesienia oraz krzywe wykresu zahamowanie-stężenie;
- obliczenie wartości EC50, wyrażonych w mg/l i mg/g;
- wytwarzanie gazu na gram osadu w ciągu 48 godzin;
- uzasadnienie ewentualnego odrzucenia wyników badania;
- omówienie wyników, obejmujące wszelkie odchylenia od procedur stosowanych w tej metodzie badawczej, oraz omówienie wszelkich odchyleń w wynikach badania w stosunku do oczekiwanych wyników, wynikających z interferencji i błędów;
- określenie, czy celem badania było zmierzenie toksyczności dla mikroorganizmów wstępnie narażonych, czy dla takich, które nie były wstępnie narażone.
BIBLIOGRAFIA
(1) Rozdział C.11 niniejszego załącznika: Osad czynny, badanie zahamowania oddychania.
(2) Rozdział C.43 niniejszego załącznika: Biodegradowalność beztlenowa związków organicznych w przefermentowanym osadzie: za pomocą pomiaru wytwarzanego gazu.
(3) Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (2003) ISO 13641-1 Water Quality - Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria - Part 1: General Test.
(4) Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (2003) ISO 13641-2 Water Quality - Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria - Part 2: Test for low biomass concentrations.
(5) ISO (2000) badanie międzylaboratoryjne ISO 13641-1 i ISO 13641-2. Determination of inhibition of activity of anaerobic bacteria. BL 6958/A. Evans MR, Painter HA. Brixham Environmental Laboratory, AstraZeneca UK Ltd., Brixham, TQ5 8BA UK.
(6) Swanwick JD, Foulkes M (1971). Inhibition of anaerobic digestion of sewage sludge by chlorinated hydrocarbons. Wat. Pollut. Control, 70, 58-70.
(7) HMSO (1986) Determination of the inhibitory effects of chemicals and waste waters on the anaerobic digestion of sewage sludge. ISBN 0 117519 43 X, w: Methods for the Examination of Waters and Associated Materials UK.
(8) Shelton DR, Tiedje JM (1984). General method for determining anaerobic biodegradation potential. Appl. Env. Microbiol. 47 850-857.
(9) Battersby N.S. i Wilson V. (1988). Evaluation of a serum bottle technique for assessing the anaerobic biodegra-dability of organic compounds under methanogenic conditions. Chemosphere 17, 2 441-2 460.
(10) Wilson V., Painter H.A. i Battersby N.S. (1992). A screening method for assessing the inhibition of the anaerobic gas production from sewage sludge. Proc. Int. Symp. on Ecotoxicology. Ecotoxicological Relevance of Test Methods, GSF Forschungzentrum, Neuherberg, Niemcy (1990). wyd. Steinberg C i Kettrup A, s. 117-132 (1992).
(11) Kawahara K., Yakabe Y., Chida T. i Kida K. (1999). Evaluation of laboratory-made sludge for an anaerobic biodegradability test and its use for assessment of 13 chemicals. Chemosphere, 39 (12), 2007-2018.
(12) Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (1995) ISO 10634 Jakość wody - Wytyczne dotyczące przygotowania i obróbki słabo rozpuszczalnych związków organicznych w celu oceny ich biodegradacji w środowisku wodnym.
(13) Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (1997) ISO 11923 Water Quality - Determination of suspended solids by filtration through glass-fibre filters.
Dodatek 1
Przykład aparatury do mierzenia wytwarzania biogazu na podstawie ciśnienia gazu
Legenda:
1 - ciśnieniomierz
2 - gazoszczelny zawór 3-drogowy
3 - igła do strzykawki
4 - gazoszczelny korek (obciskana nasadka i septa)
5 - faza nadpowierzchniowa
6 - inokulum z przefermentowanego osadu
Naczynia badawcze w środowisku o temperaturze 35 °C ± 2 °C
Dodatek 2
Przeliczanie odczytów ciśnieniomierza
Odczyty z ciśnieniomierza można powiązać z objętościami gazu, wykorzystując w tym celu standardową krzywą i na podstawie tego można obliczyć objętość gazu wytworzoną na gram suchego osadu w ciągu 48 godzin. Ten wskaźnik aktywności stosuje się jako jedno z kryteriów oceny ważności wyników badań. Krzywą kalibracyjną wykreśla się na podstawie wstrzykiwania znanych objętości gazu w temperaturze 35 °C ± 2 °C do butelek do surowicy, zawierających objętość wody równą objętości mieszaniny reakcyjnej VR;
- umieścić podwielkrotności VR ml wody, utrzymywane w temperaturze 35 °C ± 2 °C, w pięciu butelkach do surowicy. Butelki szczelnie zamknąć i pozostawić na 1 godzinę w łaźni wodnej w temperaturze 35 °C ± 2 °C do stabilizacji;
- włączyć ciśnieniomierz, poczekać aż się ustabilizuje, i ustawić wartość zerową;
- wprowadzić igłę strzykawki przez korek jednej z butelek, otworzyć zawór i odczekać aż ciśnieniomierz wskaże zero, po czym zamknąć zawór;
- procedurę tę należy powtórzyć w przypadku pozostałych butelek;
- do każdej butelki wstrzyknąć 1 ml powietrza o temperaturze 35 °C ± 2 °C. Wprowadzić igłę (na mierniku) przez korek jednej z butelek i poczekać, aż odczyt ciśnienia ustabilizuje się. Zanotować ciśnienie, otworzyć zawór i odczekać, aż ciśnieniomierz wskaże zero, po czym zamknąć zawór;
- procedurę tę należy powtórzyć w przypadku pozostałych butelek;
- powtórzyć całą procedurę z zastosowaniem 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, 12 ml, 16 ml, 20 ml i 50 ml powietrza;
- wykreślić krzywą przeliczeniową ciśnienia (Pa) w funkcji objętości wstrzykniętego gazu (ml). Dane wskazane przez instrument mają charakter liniowy w zakresie od 0 Pa do 70 000 Pa oraz od 0 ml do 50 ml wytwarzanego gazu.
Dodatek 3
Zidentyfikowane czynniki, które mogą prowadzić do błędnych wyników
a) Jakość nasadek do butelek
W handlu dostępne są różne rodzaje sept do butelek do surowicy; wiele z nich, w tym butylowe septy kauczukowe, tracą gazoszczelność po przekłuciu igłą w warunkach tego badania. Czasami po przekłuciu septy igłą strzykawki ciśnienie spada bardzo wolno. Zaleca się stosowanie gazoszczelnych sept w celu uniknięcia wycieków (pkt 12 lit. b)).
b) Wilgoć w igle strzykawki
W igle i rurkach strzykawek zbiera się czasem wilgoć wykazana przez odczyty ciśnienia wskazujące niewielkie wartości ujemne. Aby pozbyć się wilgoci, należy usunąć igłę, wstrząsnąć rurką, wysuszyć ją za pomocą bibuły, a następnie podłączyć nową igłę (pkt 12 lit. c) i pkt 35).
c) Zanieczyszczenie tlenem
Metody beztlenowe podlegają błędom wynikającym z zanieczyszczenia tlenem, które może spowodować mniejsze wytwarzanie gazu. W tej metodzie możliwość zanieczyszczenia tlenem powinna być zminimalizowana przez zastosowanie wyłącznie technik beztlenowych, w tym komory rękawicowej.
d) Wyraźne elementy podłoża w osadzie
Na beztlenowe wytwarzanie gazu i wrażliwość osadu wpływają elementy podłoża przenoszone z inokulum do butelek badawczych. Przefermentowany osad pochodzący z domowych beztlenowych komór fermentacyjnych często dalej zawiera rozpoznawalną materię, taką jak pozostałości włosów i roślin w celulozie, które zwykle utrudniają pobieranie próbek reprezentatywnych. Można usunąć wyraźną nierozpuszczalną materię z osadu poprzez przesianie, co zwiększy prawdopodobieństwo próbek reprezentatywnych (pkt 16).
e) Lotne badane substancje chemiczne
Lotne badane substancje chemiczne zostaną uwolnione do fazy nadpowierzchniowej butelek badawczych. Takie uwolnienie może skutkować utratą niektórych badanych materiałów z układu w czasie odgazowywania po pomiarze ciśnienia i błędnym wykazaniem wysokich wartości EC50. Odpowiednio wybierając stosunek objętości fazy nadpowierzchniowej względem objętości cieczy i nie odgazowując po zmierzeniu ciśnienia, można ograniczyć błąd (10).
f) Nieliniowość wytwarzania gazu
Jeżeli wykres średniego sumarycznego wytwarzania gazu w funkcji czasu inkubacji nie jest w przybliżeniu liniowy w okresie 48 godzin, dokładność badania może być obniżona. Aby rozwiązać ten problem, zalecane może być wykorzystanie osadu fermentującego pochodzącego z różnych źródeł lub dodanie zwiększonego stężenia podłoża użytego w badaniu - pożywki bulionowej, wyciągu z drożdży i glukozy (pkt 29).
Dodatek 4
Zastosowanie do próbek środowiskowych o niskim stężeniu biomasy - beztlenowy szlam, osady itp.
WPROWADZENIE
A.1 Ogólnie rzecz biorąc, szczególna aktywność mikrobiologiczna (objętość wytworzonego gazu na gram części stałych) naturalnie występującego szlamu beztlenowego, osadu, gleby itp., jest znacznie niższa niż aktywność mikrobiologiczna beztlenowego osadu pochodzącego ze ścieków. Z tego powodu, jeżeli zmierzone ma zostać działanie hamujące substancji chemicznych w stosunku do tych mniej aktywnych próbek, należy zmodyfikować niektóre warunki doświadczalne. W przypadku tych mniej aktywnych próbek możliwe są dwie ogólne metody działania:
a) wykonanie zmodyfikowanego badania wstępnego (pkt 25) na nierozcieńczonej próbce szlamu, gleby itp. w temperaturze 35 °C ± 2 °C lub w temperaturze miejsca pobrania próbki w celu uzyskania dokładniejszej symulacji (jak w części 1 normy ISO 13641);
b) lub wykonanie badania z rozcieńczonym (1 na 100) osadem pochodzącym z komory fermentacyjnej w celu symulacji niskiej aktywności oczekiwanej w odniesieniu do próbki środowiskowej, ale przy utrzymaniu temperatury 35 °C ± 2 °C (jak w części 2 normy ISO 13641).
A.2 Wariant a) można uzyskać za pomocą następującej metody opisanej tutaj (równoważnej względem części 1 normy ISO 13641), ale koniczne jest wykonanie badania wstępnego (pkt 25) w celu zapewnienia optymalnych warunków, o ile nie są one jeszcze znane na podstawie poprzednich badań. Próbka szlamu lub osadu powinna być dokładnie wymieszana, np. w wytrząsarce, i w razie potrzeby rozcieńczona w niewielkiej ilości odpowietrzonej wody rozcieńczającej (pkt 14), tak aby istniała możliwość przeniesienia jej np. za pomocą pipety o grubej końcówce lub cylindra miarowego. Jeżeli uznaje się, że może brakować składników odżywczych, można odwirować próbkę szlamu (w warunkach beztlenowych) i ponownie zawiesić w pożywce mineralnej zawierającej wyciąg z drożdży (A.11).
A.3 Wariant b). Wariant ten odpowiednio obrazuje niską aktywność próbek środowiskowych, ale wykazuje brak wysokiego stężenia zawiesin występujących w tych próbkach. Nie jest znana rola tych części stałych w zahamowaniu, ale możliwe jest, że reakcja zachodząca między tymi badanymi substancjami chemicznymi i składnikami szlamu oraz adsorpcja badanych substancji chemicznych do części stałych mogłyby obniżyć toksyczność badanej substancji chemicznej.
A.4 Innym istotnym czynnikiem jest temperatura: na potrzeby samej symulacji, badania można wykonywać w temperaturze miejsca pobrania próbki, ponieważ różne grupy konsorcjów bakterii wytwarzających metan funkcjonują w różnych zakresach temperatur, mianowicie baterie termofilne (~ 30-35 °C), mezofilne (20-25 °C) i psychrofilne (< 20 °C), które mogą wykazywać różne modele pod względem zahamowania.
A.5 Czas trwania. W badaniu ogólnym, opisanym w części 1, wykonanym przy zastosowaniu nierozcieńczonego osadu, ilość gazu wytworzonego w ciągu 2-4 dni była zawsze wystarczająca, natomiast w badaniu międzyla-boratoryjnym, opisanym w części 2, wykonanym przy zastosowaniu osadu rozcieńczonego w stosunku jeden do stu, w tym samym okresie nie wytworzono gazu lub wytworzono niewystarczającą jego ilość. Madsen i in. (1996), opisując to drugie badanie, stwierdził, że powinno się dopuścić wykonywanie tego badana przez co najmniej 7 dni.
Wykonywanie badania przy niskim stężeniu biomasy (wariant b)
Należy wprowadzić następujące zmiany, dodając treść do niektórych istniejących punktów i podpunktów tekstu głównego lub zastępując te punkty i podpunkty.
A.6 W pkt 6 dodaje się treść w brzmieniu: zasada badania;
"Tę technikę można wykorzystać w przypadku rozcieńczenia beztlenowego osadu w stosunku 1 do 100, częściowo w celu symulacji niskiej aktywności szlamu i osadów. Temperatura inkubacji może wynosić 35 °C lub może być równa temperaturze miejsca, z którego pobrano próbkę. Ponieważ w nierozcieńczonym osadzie aktywność bakterii jest znacznie mniejsza, okres inkubacji należy wydłużyć do co najmniej 7 dni".
A.7 W pkt 12 lit. a) dodaje się treść w brzmieniu:
"powinna istnieć możliwość utrzymywania inkubatora w temperaturze minimalnej 15 °C.".
A.8 Po pkt 13 dodaje się dodatkowy odczynnik:
"kwas fosforowy (H3PO4), 85 % masy w wodzie". A.9 Na końcu pkt 16 dodaje się zdanie w brzmieniu:
"Zastosować stężenie końcowe całkowitej zawartości części stałych w badaniu wynoszące 0,20 ± 0,05 g/l". A.10 Zob. pkt 17. Podłoże użyte w badaniu
Nie należy stosować tego podłoża, ale zastąpić je wyciągiem z drożdży (zob. pkt 17; A.11, A.12, A.13).
A.11 Do beztlenowego rozcieńczania osadu wymagane jest podłoże mineralne, obejmujące pierwiastki śladowe, i dla wygody do tego podłoża dodaje się substrat organiczny - wyciąg z drożdży.
Po pkt 17 dodaje się litery w brzmieniu:
"a) badane podłoże mineralne, zawierające wyciąg z drożdży.
Przygotowuje się je z podłoża o 10-krotnym stężeniu (pkt 17 lit. b; A.12) z roztworem pierwiastka śladowego (pkt 17 lit. c); A.13). Zastosować świeżo dostarczony dziewięciowodny siarczek sodu, (pkt 17 lit. b); A.12) lub przemyć i osuszyć dziewięciowodny siarczek sodu przed zastosowaniem, aby miał wystarczającą zdolność redukcji. Jeżeli badanie jest wykonywane bez wykorzystania komory rękawicowej (pkt 12 lit. j)), należy zwiększyć stężenie siarczku sodu w roztworze podstawowym do 2 g/l (z 1 g/l). Siarczek sodu można też dodać z odpowiedniego roztworu podstawowego przez septę zamkniętych butelek badawczych, ponieważ taka procedura zmniejsza ryzyko utleniania, w celu uzyskania stężenia końcowego wynoszącego 0,2 g/l. Alternatywnie można zastosować cytrynian tytanu (III) (pkt 17 lit. b)). Należy dodać go przez septę zamkniętych butelek badawczych w celu uzyskania stężenia 0,8 mmol/l do 1,0 mmol/l. Cytrynian tytanu (III) stanowi wysoce skuteczny środek redukujący o niskiej toksyczności, który przygotowuje się w następujący sposób: rozpuścić 2,94 g cytrynianu trisodu, dihydratu w 50 ml odtlenionej wody rozcieńczającej (pkt 14) (w wyniku czego powstaje roztwór 200 mmol/l) i dodać 5 ml roztworu chlorku tytanu (III) (15 g/100 ml wody rozcieńczającej). Należy zneutralizować go do pH 7 ± 0,5 za pomocą węglanu sodu i umieścić w odpowiedniej butelce do surowicy pod strumieniem azotu. Stężenie cytrynianu tytanu (III) w tym roztworze podstawowym wynosi 164 mmol/l. Natychmiast zastosować pożywkę lub przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 1 dzień;
A.12 b) pożywka o dziesięciokrotnym stężeniu, przygotowywana przy użyciu:
bezwodnego diwodorofosforanu potasu (KH2PO4) 2,7 g
wodorofosforanu sodu (Na2HPO4) 4,4 g
(lub 11,2 g dwunastowodnego wodorofosforanu sodu); 5,3 g
chlorku amonu (NH4Cl)
chlorku wapnia, dwuwodnego (CaCl2 * 2H2O) 0,75 g
chlorku magnezu, sześciowodnego (MgCl2 * 6H2O) 1,0 g
chlorku żelaza (II), czterowodnego (FeCl2* 4H2O) 0,2 g
resaryzuny (wskaźnika redoks) 0,01 g;
siarczku sodu, dziewięciowodnego (Na2S * 9H2O) 1,0 g
(lub cytrynianu tytanu (III)) stężenie końcowe 0,8 mmol/l do 1,0 mmol/l
roztworu pierwiastka śladowego (zob. pkt 17 lit. c); A.13) 10,0 ml
wyciągu z drożdży 100 g
Rozpuścić w wodzie rozcieńczającej (pkt 14) i dopełnić do: 1 000 ml;
A.13 c) roztwór pierwiastka śladowego, przygotowany przy użyciu:
chlorku manganu (II), czterowodnego (MnCl2 * 4H2O) 0,5 g
kwasu borowego (H3BO3) 0,05 g
chlorku cynku (ZnCl2) 0,05 g
chlorku miedzi (II) (CuCl2) 0,03 g
molibdenianu sodu, dwuwodnego (Na2MoO4 * 2H2O) 0,01 g
chlorku kobaltu (II), sześciowodnego (CoCl2 * 6H2O) 1,0 g
chlorku niklu (II), sześciowodnego (NiCl2 * 6H2O) 0,1 g
selenianu disodu (Na2SeO3) 0,05 g
Rozpuścić w wodzie rozcieńczającej (pkt 14) i dopełnić do: 1 000 ml".
A.14 Zob. pkt 25: badanie wstępne
Konieczne jest wykonanie badania wstępnego zgodnie z opisem zawartym w pkt 24, z tym, że stężenia części stałych osadu powinny wynosić jedną setną podanych stężeń, tj. 0,1 g/l, 0,2 g/l i 0,4 g/l. Czas trwania inkubacji powinien wynosić co najmniej 7 dni.
Uwaga: w badaniu międzylaboratoryjnym (5) objętość fazy nadpowierzchniowej była zbyt wysoka - na poziomie 75 % całkowitej objętości; powinna zawierać się w zalecanym zakresie 10-40 %. Istotne kryterium stanowi, że objętość gazu wytwarzanego przy zahamowaniu na poziomie 80 % powinna być możliwa do zmierzenia z akceptowalną precyzją (np. od ± 5 % do ± 10 %).
A.15 Punkty 26-30: dodanie badanej substancji chemicznej, inokulum i podłoża.
Powyższe substancje dodaje się w taki sam sposób jak opisano w tych punktach, z tym że roztwór podłoża (pkt 17) zastępuje się pożywką oraz podłożem z wyciągu z drożdży (A.11).
Ponadto stężenie końcowe suchych części stałych osadu obniża się z 2 g/l-4 g/l do 0,2 ± 0,05 g/l (A.9). Dwa przykłady dodania składników do mieszaniny stosowanej w badaniu przedstawiono w tabeli A.1, którą zastępuje się tabelę w pkt 29.
A.16 Punkt 33: inkubacja butelek
Ze względu na mniejszą intensywność wytwarzania gazu, czas trwania inkubacji wynosi co najmniej 7 dni.
A.17 Punkt 34: pomiary ciśnienia
Do pomiaru ciśnienia fazy nadpowierzchniowej w butelkach stosuje się taką samą procedurę, jaką określono w pkt 34, jeżeli wymagane są wartości w fazie gazowej. Jeżeli wymaga się dokonania pomiaru całkowitych ilości CO2 plus CH4, pH fazy ciekłej obniża się do około pH 2 poprzez wstrzyknięcie H3PO4 do każdej właściwej butelki oraz dokonanie pomiaru po 30 minutach wstrząsania w temperaturze badania. Więcej informacji na temat jakości inokulum można uzyskać jednak poprzez dokonanie pomiaru ciśnienia w każdej butelce przed zakwaszeniem i po zakwaszeniu. Przykładowo, jeżeli intensywność wytwarzania CO2 jest znacznie wyższa niż intensywność wytwarzania metanu, czułość bakterii fermentacyjnych może ulec zmianie lub badana substancja chemiczna w pierwszej kolejności wywiera wpływ na bakterie metanogenne.
A.18 Punkt 36: pomiar pH
Jeżeli ma zostać zastosowane H3PO4, do celów pomiaru pH należy przygotować dodatkowe butelki, do których nie dodaje się H3PO4.
BIBLIOGRAFIA
Madsen, T., Rasmussen, H.B. i Nilsson, L. (1996), Methods for screening anaerobic biodegradability and toxicity of organic chemicals. Project No.336, Insytut Jakości Wody, Duńska Agencja Ochrony Środowiska, Kopenhaga.
Tabela A.1
Przykłady konfiguracji badawczej dla badanych partii
| Składniki mieszaniny reakcyjnej | Przykład 1 | Przykład 2 | Normalna kolejność dodawania |
| Stężenie przygotowanego inokulum (g/l) | 0,42 | 2,1 | - |
| Objętość dodawanego inokulum (ml) | 45 | 9 | 4 |
| Stężenie inokulum w butelkach badawczych (g/l) | 0,20 | 0,20 | - |
| Objętość dodawanej pożywki (ml) | 9 | 9 | 2 |
| Objętość dodawanej wody rozcieńczającej (ml) | 36 | 72 | 3 |
| Stężenie wyciągu z drożdży w butelkach badawczych (g/l) | 9,7 | 9,7 | - |
| Objętość roztworu podstawowego badanej substancji chemicznej (ml) | 3 | 3 | 1 |
| Całkowita objętość cieczy (ml) | 93 | 93 | - |
Dodatek 5
Definicje
Dla celów niniejszej metody badawczej stosowane są następujące definicje:
Substancja chemiczna oznacza substancję lub mieszaninę.
Badana substancja chemiczna oznacza dowolną substancję lub mieszaninę badaną za pomocą niniejszej metody badawczej.
C.35 BADANIE TOKSYCZNOŚCI W UKŁADZIE OSAD DENNY-WODA NA LUMBRICULUS Z WYKORZYSTANIEM WZBOGACONEGO OSADU
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna z dotyczącą badań wytyczną OECD nr 225 (2007). Organizmy bentosowe żyjące w osadzie są potencjalnie narażone na związane w osadzie substancje chemiczne, w związku z czym należy zwrócić na nie szczególną uwagę, np. (1), (2), (3). Wśród tych organizmów czerpiących pokarm z osadu znajdują się skąposzczety wodne, których rola w osadach systemów wodnych jest istotna. Przyczyniając się do bioturbacji osadu oraz stanowiąc żer dla innych organizmów, zwierzęta te mogą mieć silny wpływ na biodostępność takich substancji dla innych organizmów, np. ryb poszukujących pokarmu w osadzie. W przeciwieństwie do organizmów żyjących na powierzchni osadów, wodne skąposzczety żyjące w osadach (np. Lumbriculus variegatus) zakopują się w osadzie i zjadają cząstki osadu znajdujące się pod jego powierzchnią. Powoduje to narażenie organizmów użytych do badania na badaną substancję chemiczną przez wiele dróg absorpcji (np. przez bezpośredni kontakt i spożycie zanieczyszczonych cząstek osadu, lecz również przez wodę porową i wodę nadosadową).
2. Niniejsza metoda badawcza ma służyć ocenie skutków długotrwałego narażenia żyjących w osadach skąposzczetów Lumbriculus variegatus (Müller) na działanie substancji chemicznych związanych z osadem. Metoda ta opiera się na istniejących metodach badania toksyczności osadu i protokołach badania bioakumulacji, np. (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (10). Niniejszą metodę opisano w odniesieniu do warunków badania statycznego. Scenariusz narażenia stosowany w tej metodzie badawczej polega na wzbogacaniu osadu badaną substancją chemiczną. Stosowanie wzbogaconego osadu ma na celu symulację osadu zanieczyszczonego badaną substancją chemiczną.
3. Substancje chemiczne, które należy przebadać pod kątem organizmów żyjących w osadach, zwykle pozostają w tym układzie przez długi czas. Organizmy żyjące w osadach mogą być narażone poprzez różne drogi. Względne znaczenie danej drogi narażenia i czas, jaki jest potrzebny, by przyczyniła się ona do ogólnych skutków toksycznych, zależy od fizykochemicznych właściwości danej substancji chemicznej i jej ostatecznego działania na zwierzę. W przypadku silnie adsorbujących substancji chemicznych (np. substancji o log Kow > 5) lub w przypadku substancji chemicznych tworzących wiązania kowalencyjne z osadem drogą narażenia o istotnym znaczeniu może być przyjmowanie zanieczyszczonego pokarmu. Aby nie doprowadzić do zaniżenia toksyczności takich substancji chemicznych, pokarm niezbędny do rozmnażania i rozwoju organizmów używanych do badania dodaje się do osadu przed zastosowaniem badanej substancji chemicznej (11). Niniejszą metodę badawczą przedstawiono w sposób wystarczająco szczegółowy, aby umożliwić wykonanie badania, pozwalając jednocześnie na wprowadzanie zmian w projekcie doświadczenia, w zależności od warunków w konkretnych laboratoriach i zróżnicowanych właściwości badanych substancji chemicznych.
4. Celem niniejszej metody badawczej jest określenie wpływu badanej substancji chemicznej na rozrodczość i biomasę organizmów użytych do badania. Mierzonymi parametrami biologicznymi są całkowita liczba żyjących organizmów oraz zawartość biomasy (suchej masy) na koniec okresu narażania. Dane te poddaje się analizie poprzez zastosowanie modelu regresji celem oszacowania stężenia, przy którym wpływ osiągnąłby poziom x % (np. EC50, EC25, i EC10) albo poprzez zastosowanie metody testowania hipotez statystycznych w celu określenia stężenia, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC) oraz najniższego stężenia, przy którym obserwuje się zmiany (LOEC).
5. W rozdziale C.27 niniejszego załącznika, "Badanie toksyczności w układzie osad-woda na ochotkowatych z wykorzystaniem wzbogaconego osadu" (6), zawarto wiele informacji istotnych i przydatnych do zastosowania przedstawionej metody badawczej dotyczącej toksyczności osadu. W związku z tym niniejszy dokument stanowi podstawę, według której opracowano zmiany konieczne do wykonania badań toksyczności osadu z wykorzystaniem gatunku Lumbriculus variegatus. Ponadto zawarto odniesienia do takich dokumentów jak: Standard Guide for Determination of the Bioaccumulation of Sediment-Associated Contaminants by Benthic Invertebrates (3) opracowany przez ASTM, Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates (7) opracowany przez EPA oraz Standard Guide for Collection, Storage, Characterization, and Manipulation of Sediments for Toxicological Testing and for selection of samplers used to collect benthic invertebrates (12) opracowany przez ASTM. Dodatkowo głównym źródłem informacji, z którego korzystano przy opracowywaniu niniejszego dokumentu, jest doświadczenie praktyczne zdobyte w trakcie wykonywania badań międzylaboratoryjnych z wykorzystaniem niniejszej metody badawczej (sprawozdanie z badania międzylaboratoryjnego, (13)).
WARUNKI WSTĘPNE I WYTYCZNE
6. Informacje na temat badanej substancji chemicznej, obejmujące np. środki ostrożności, odpowiednie warunki przechowywania i metody analityczne, należy uzyskać przed rozpoczęciem badania. Dalsze wytyczne dotyczące badania substancji chemicznych o własnościach fizykochemicznych utrudniających wykonanie badania przedstawiono w pozycji (14) bibliografii.
7. Przed rozpoczęciem badania powinny być znane następujące informacje o badanej substancji chemicznej:
- nazwa zwyczajowa, nazwa systematyczna (najlepiej nazwa wg IUPAC), wzór strukturalny, numer CAS, czystość;
- prężność pary;
- rozpuszczalność w wodzie.
8. Przed rozpoczęciem badania warto zgromadzić następujące dodatkowe informacje:
- współczynnik podziału oktanol-woda, Kow;
- współczynnik węgiel organiczny-woda, wyrażony jako Koc;
- hydroliza;
- fototransformacja w wodzie;
- biodegradowalność;
- napięcie powierzchniowe.
9. Informacje na temat niektórych właściwości osadu, jaki należy zastosować, powinno się uzyskać przed rozpoczęciem badania (7). Informacje szczegółowe zawarto w pkt 22-25.
ZASADA BADANIA
10. Osobniki o podobnym stanie fizjologicznym (zsynchronizowane, jak określono w dodatku 5) poddaje się narażeniu na działanie szeregu stężeń substancji toksycznej wprowadzanych do osadu w układzie osad-woda. Jako pożywkę należy stosować sztuczny osad i wodę regenerowaną. Naczynia badawcze bez zawartości badanej substancji chemicznej stanowią próby kontrolne. Badaną substancją chemiczną wzbogaca się całą objętość osadu w odniesieniu do każdego poziomu stężenia, aby ograniczyć do minimum zmienność między kontrpróbami dla każdego poziomu stężenia, a następnie organizmy użyte do badania wprowadza się do naczyń badawczych, w których ustabilizowano stężenia badanej substancji w osadzie i wodzie (zob. pkt 29). Zwierzęta użyte do badań naraża się na działanie substancji chemicznej w układach osad-woda przez 28 dni. W związku z niską zawartością składników odżywczych w osadzie sztucznym, do osadu należy dodać źródło pokarmu (zob. pkt 22-23 oraz dodatek 4), aby organizmy rozwijały się i rozmnażały w warunkach kontrolowanych. W ten sposób można zagwarantować, że zwierzęta użyte do badań będą narażone zarówno przez wodę i osad, jak i przez pożywienie.
11. Preferowanym punktem końcowym w tego rodzaju badaniu jest osiągnięcie ECx (np. EC50, EC25, i EC10; stężenie, przy którym obserwuje się zmiany mające wpływ na x % organizmów użytych do badania) w odniesieniu do odpowiednio rozrodczości i biomasy, w porównaniu do próby kontrolnej. Należy jednak pamiętać, ze biorąc pod uwagę wysoki stopień niepewności pomiaru niskiego ECx (np. EC10, EC25) wraz ze skrajnie wysokimi granicami ufności na poziomie 95 % (np. (15)) oraz moc statystyczną obliczaną podczas testu hipotez, za najbardziej wiarygodny punkt końcowy uznaje się EC50. Ponadto można obliczyć stężenie, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC), oraz najniższe stężenie, przy którym obserwuje się zmiany (LOEC), w odniesieniu do zawartości biomasy i poziomu rozrodczości, jeżeli obliczenia te znajdują potwierdzenie w projekcie badania i danych (zob. pkt 34-38). Projekt badania będzie zależny od celu badania, jakim jest uzyskanie ECx lub NOEC.
BADANIA PORÓWNAWCZE
12. Oczekuje się, że zdolność danego laboratorium do wykonywania badania skuteczność zostanie w wystarczającym stopniu wykazana na podstawie badania organizmów kontrolnych, a w przypadku gdy dane historyczne są dostępne, powtarzalności badania. Ponadto można wykonywać porównawcze badania toksyczności w regularnych odstępach czasu, stosując substancję toksyczną odniesienia, aby ocenić wrażliwość organizmów użytych do badania. Porównawcze badania toksyczności trwające 96 godzin wykonywane tylko w wodzie z powodzeniem mogą wykazywać wrażliwość i stan zwierząt użytych do badań (4), (7). Informacje na temat toksyczności pentachlorofenolu (PCP) w pełnych badaniach (narażenie przez 28 dni we wzbogaconym osadzie) zawarto w dodatku 6 oraz w sprawozdaniu dotyczącym badania międzylaboratoryjnego z wykorzystaniem niniejszej metody badawczej (13). Ostrą toksyczność PCP, odnoszącą się wyłącznie do wody, opisano np. w pozycji (16) bibliografii. Informacje te można wykorzystać w celu porównania wrażliwości organizmu użytego do badania w badaniach porównawczych, w których stosuje się PCP jako substancję toksyczną odniesienia. Na potrzeby badania L. variegatus zaleca się stosowanie chlorku potasu (KCl) lub siarczanu miedzi (CuSO4) jako substancji toksycznych odniesienia (4) (7). Ustalenie kryteriów jakości w oparciu o dane dotyczące toksyczności KCl do dziś sprawia trudności ze względu na brak danych na temat L. variegatus w literaturze. Informacje na temat toksyczności miedzi w stosunku do L. variegatus można znaleźć w pozycjach bibliografii (17)-(21).
WAŻNOŚĆ BADANIA
13. Aby badanie było ważne, należy spełnić następujące warunki:
- w badaniu międzylaboratoryjnym (13) należy wykazać, że w przypadku Lumbriculus variegatus średnia liczba żywych osobników na jedną kontrpróbę w próbach kontrolnych powinna wzrosnąć co najmniej 1,8-krotnie na koniec okresu narażenia w stosunku do liczby osobników na kontrpróbę na początku okresu narażenia;
- pH warstwy wody nadosadowej należy utrzymać na poziomie 6-9 przez cały czas trwania badania;
- stężenie tlenu w wodzie nadosadowej nie powinno być niższe niż 30 % wartości nasycenia powietrzem (ASV) w temperaturze badania w trakcie badania.
OPIS METODY BADAWCZEJ
Układ badawczy
14. Zaleca się stosowanie systemów statycznych bez wymiany wody nadosadowej. Jeżeli stosunek osadu do wody (zob. pkt 15) jest odpowiedni, delikatne napowietrzanie jest zwykle wystarczające, aby utrzymać jakość wody na poziomie dopuszczalnym dla organizmów użytych do badania (np. maksymalizacja poziomów stężenia rozpuszczonego tlenu, minimalizacja odkładania się produktów wydalniczych). Układy półstatyczne lub przepływowe z okresowym lub stałym odnawianiem wody nadosadowej należy stosować wyłącznie w wyjątkowych przypadkach, ponieważ oczekuje się, że regularne odnawianie wody nadosadowej naruszy równowagę chemiczną (np. spowoduje utratę badanej substancji chemicznej z układu badawczego).
Naczynia badawcze i aparatura badawcza
15. Narażenie przeprowadza się w szklanych zlewkach o pojemności 250 ml i średnicy 6 cm. Inne naczynia także mogą nadawać się do badania, powinny jednak zapewniać odpowiednią głębokość wody nadosadowej i warstwy osadu. W każdym naczyniu należy umieścić warstwę osadu preparowanego o grubości około 1,5- 3 cm. Stosunek głębokości warstwy osadu do głębokości wody nadosadowej powinien wynosić 1:4. Naczynia powinny mieć odpowiednią pojemność, zgodnie ze wskaźnikiem obciążenia, tj. liczbą badanych osobników dodawanych na jednostkę masy osadu (zob. również pkt 39).
16. Naczynia badawcze i inna aparatura badawcza, mające kontakt z badaną substancją chemiczną, powinny być w całości wykonane ze szkła lub innych chemicznie obojętnych materiałów. W odniesieniu do wszystkich części sprzętu należy starać się unikać stosowania materiałów, które mogą rozpuścić badaną substancję chemiczną, sprawić, że ulegnie ona absorpcji, lub też wypłukać inne substancje chemiczne, a także materiałów, które mają szkodliwe działanie na zwierzęta użyte do badań. Sprzęt mający kontakt z badanymi pożywkami musi być wykonany z politetrafluoroetylenu (PTFE), ze stali nierdzewnej lub szkła. W przypadku organicznych substancji chemicznych wymagane może być użycie szkła silanizowanego. W takich sytuacjach sprzęt po użyciu należy wyrzucić.
Badany gatunek
17. Badanym gatunkiem wykorzystywanym w tym badaniu jest słodkowodny skąposzczet Lumbriculus variegatus (Müller). Gatunek ten toleruje różne rodzaje osadu i jest powszechnie stosowany w badaniach toksyczności i bioakumulacji (np. (3), (5), (7), (9), (13), (15), (16), (22), (23), (24), (25), (26), (27), (28), (29), (30), (31), (32), (33), (34), (35)). W sprawozdaniu należy przedstawić pochodzenie zwierząt użytych do badań, potwierdzenie identyfikacji gatunku (np. (36)) oraz warunki hodowli. Potwierdzenie identyfikacji gatunku nie jest wymagane przed każdym badaniem, jeśli organizmy pochodzą z hodowli wewnątrzlaboratoryjnej.
Hodowla organizmów używanych do badania
18. Aby zapewnić wystarczającą liczbę osobników do wykonania badań toksyczności osadu, warto przechowywać je w stałej hodowli laboratoryjnej. Wytyczne dotyczące metod hodowli Lumbriculus variegatus oraz źródeł hodowli starterowych zawarto w dodatku 5. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat tworzenia hodowli tego gatunku, zob. (3), (7), (27).
19. W mieć pewność, że w badaniach stosowano zwierzęta tego samego gatunku, zdecydowanie zaleca się tworzenie hodowli jednego gatunku. Należy zadbać, aby hodowle, a w szczególności osobniki wykorzystywane w badaniach, nie wykazywały dających się zaobserwować oznak chorób ani anomalii.
Woda
20. Zgodnie z rozdziałem C.1 niniejszego załącznika (37) w badaniach zaleca się stosowanie wody regenerowanej jako wody nadosadowej; można wykorzystywać ją również w laboratoryjnych hodowlach organizmów (zob. dodatek 2, aby uzyskać informacje na temat przygotowania). W razie potrzeby można stosować wodę naturalną. Jakość wybranej wody powinna umożliwiać rozwój i rozmnażanie badanych gatunków przez okres trwania aklimatyzacji i okres badań, a także nie powodować pojawiania się ich nietypowego wyglądu lub zachowania. Wykazano, że w takiej wodzie osobniki z gatunku Lumbriculus variegatus są w stanie przeżyć, rozwijać się i rozmnażać (30), a także zapewnia się w ten sposób maksymalną standaryzację warunków badania i hodowli. W przypadku gdy stosuje się wodę regenerowaną, w sprawozdaniu należy podać jej skład oraz właściwości przed użyciem, w tym co najmniej odczyn pH, zawartość tlenu oraz twardość (wyrażoną jako mg CaCO3/l). Wykonanie badania wody na obecność mikrozanieczyszczeń przed jej użyciem może dostarczyć również użytecznych informacji (zob. np. dodatek 3).
21. Odczyn pH wody nadosadowej powinien mieścić się w przedziale 6,0-9,0 (zob. pkt 13). Jeżeli oczekuje się podniesienia poziomu amoniaku, za użyteczne uznaje się utrzymywanie pH na poziomie 6,0-8,0. W przypadku wykonywania badań np. słabych kwasów organicznych zaleca się dostosowanie pH poprzez buforowanie wody, która ma zostać wykorzystana na potrzeby badania, w sposób opisany np. w pozycji bibliografii (16). Całkowita twardość wody stosowanej w badaniu powinna wynosić 90-300 mg CaCO3 na litr w przypadku wody naturalnej. W dodatku 3 zawarto podsumowanie dodatkowych kryteriów dotyczących dopuszczalnej wody rozcieńczającej według wytycznej OECD nr 210 (38).
Osad
22. Ponieważ niezanieczyszczone, naturalne osady pochodzące z określonego źródła mogą nie być dostępne przez cały rok, a organizmy rodzime oraz obecność mikrozanieczyszczeń mogą mieć wpływ na badanie, w opisanym tu badaniu zaleca się stosowanie osadu preparowanego (zwanego również osadem regenerowanym, sztucznym lub syntetycznym). Stosowanie osadu preparowanego i wprowadzenie rodzimej fauny ograniczają do minimum zmienność warunków badania. Zgodnie z (6), (39) i (40) podstawę opisanego poniżej osadu preparowanego stanowi osad sztuczny. Na potrzeby tego badania zaleca się stosowanie ((6), (10), (30), (41), (42), (43)):
a) 4-5 % torfu sfagnowego (w przeliczeniu na suchą masę); ważne jest, by stosować torf w postaci sproszkowanej, o "średnim" stopniu rozkładu, drobno zmielonego (wielkość cząstek ≤ 0,5 mm); suszonego wyłącznie powietrzem;
b) 20 ± 1 % glinki kaolinowej (w przeliczeniu na suchą masę) (zawartość kaolinitu najlepiej powyżej 30 %);
c) 75-76 % piasku kwarcowego (w przeliczeniu na suchą masę) (drobnego piasku o wielkość ziaren: ≤ 2 mm, ale > 50 % cząstek powinno mieścić się w przedziale 50-200 μm);
d) wody dejonizowanej, 30-50 % suchej masy osadu, oprócz suchych składników osadu;
e) chemicznie czysty węglan wapnia (CaCO3) dodaje się w celu dostosowania pH końcowej mieszaniny osadu;
f) zawartość całkowitego węgla organicznego w mieszaninie końcowej powinna wynosić 2 % (± 0,5 %) suchej masy osadu i należy ją dostosować przy użyciu odpowiednich ilości torfu i piasku, zgodnie z lit. a) i c);
g) np. sproszkowanych liści pokrzywy zwyczajnej (z gatunku Urtica, zgodnie z farmaceutycznymi standardami dotyczącymi spożycia przez ludzi) lub mieszaniny sproszkowanych liści z gatunku Urtica i alfa celulozy (1:1) na poziomie 0,4-0,5 % suchej masy osadu jako dodatku do składników suchego osadu; aby uzyskać więcej informacji, zob. dodatek 4.
23. Źródło torfu, glinki kaolinowej, surowca pokarmowego i piasku powinno być znane. Jako dodatek do lit. g) w rozdziale C.27 niniejszego załącznika (6) wymieniono alternatywne surowce roślinne stosowane jako źródła pokarmu: suszone liście morwy białej (Morus alba), koniczyny białej (Trifolium repens), szpinaku (Spinacia oleracea) lub trawy zbóż.
24. Wybrane źródło pokarmu należy dodać przed wzbogaceniem osadu badaną substancją chemiczną lub w jego trakcie. Wybrane źródło pokarmu powinno umożliwić uzyskanie co najmniej dopuszczalnego poziomu rozmnażania w próbach kontrolnych. Wykonanie badania osadu sztucznego lub jego składników na obecność mikrozanieczyszczeń przed ich zastosowaniem może dostarczyć użytecznych informacji. W dodatku 4 opisano przykładowy sposób przygotowania osadu preparowanego. Dopuszczalne jest także mieszanie suchych składników, o ile wykaże się, że po dodaniu wody nadosadowej składniki osadu nie rozdzielają się (np. cząstki torfu nie unoszą się na powierzchni wody) oraz że torf lub osad został poddany dostatecznemu kondycjonowaniu (zob. również pkt 25 i dodatek 4). Osad sztuczny należy scharakteryzować co najmniej pod względem pochodzenia składników, rozkładu wielkości ziaren (procent piasku, iłu i gliny), zawartości całkowitego węgla organicznego, zawartości wody i odczynu pH. Pomiar potencjału redoks jest nieobowiązkowy.
25. W miarę potrzeby, np. do celów związanych z konkretnymi badaniami, naturalne osady z niezanieczyszczonych obszarów mogą również służyć za osad do badań lub hodowli (3). Jeżeli jednak wykorzystuje się osad naturalny, to nie powinien zawierać zanieczyszczeń ani innych organizmów, które mogłyby konkurować z organizmami używanymi do badania lub żerować na tych organizmach, i należy go scharakteryzować, podając co najmniej pochodzenie (miejsce pobrania), pH i zawartość amoniaku w wodzie porowej, zawartość całkowitego węgla organicznego, rozkład wielkości cząstek (procent piasku, iłu i gliny) oraz procentową zawartość wody (7). Pomiar potencjału redoks i pojemności wymiany kationów jest nieobowiązkowy. Zaleca się także, aby przed jego wzbogaceniem badaną substancją chemiczną naturalny osad był przez siedem dni kondycjonowany w tych samych warunkach, jakie panować będą następnie podczas badania. Na koniec okresu kondycjonowania należy zebrać i wylać warstwę wody nadosadowej.
26. Jakość użytego osadu powinna umożliwiać przeżycie oraz rozmnażanie organizmów kontrolnych w okresie narażenia, przy czym takie organizmy nie powinny charakteryzować się nietypowym wyglądem ani zachowaniem. Organizmy kontrolne powinny zakopać się w osadzie i pobierać go wraz z pokarmem. Rozmnażanie w próbach kontrolnych powinno odbywać się co najmniej zgodnie z kryterium ważności opisanym w pkt 13. Obecność lub brak na powierzchni osadu odchodów, które wskazują, że organizmy spożywają osad, należy odnotować w sprawozdaniu, co może być pomocne przy interpretacji wyników badania dotyczących dróg narażenia. Dodatkowe informacje na temat przyjmowania osadu można uzyskać, stosując metody opisane w pozycjach bibliografii (24), (25), (44) i (45), w których opisano procesy przyjmowania osadu lub wyboru cząstek przez organizmy użyte do badania.
27. Procedury manipulacji dotyczące osadów naturalnych przed ich zastosowaniem w laboratorium popisano w pozycjach (3), (7) i (12). Informacje na temat przygotowywania i przechowywania osadu sztucznego zalecanego do stosowania w badaniach z wykorzystaniem Lumbriculus przedstawiono w dodatku 4.
Zastosowanie badanej substancji chemicznej
28. Osad wzbogaca się badaną substancją chemiczną. Ponieważ oczekuje się, że większość badanych substancji chemicznych charakteryzuje się niską rozpuszczalnością w wodzie, w celu przygotowania roztworu podstawowego w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym (np. acetonie, n-heksanie, cykloheksanie) należy rozpuszczać jak najmniejsze objętości tych substancji. W celu przygotowania roztworów do badań roztwór podstawowy rozcieńcza się przy użyciu tego samego rozpuszczalnika. Toksyczność i lotność rozpuszczalnika oraz rozpuszczalność danej badanej substancji chemicznej w wybranym rozpuszczalniku powinny stanowić główne kryteria wyboru odpowiedniego środka rozpuszczającego. W przypadku każdego poziomu stężenia należy stosować tę samą objętość odpowiedniego roztworu. Należy wzbogacić całą objętość osadu w odniesieniu do każdego poziomu stężenia, aby zminimalizować zmienność stężenia badanej substancji chemicznej między kontrpróbami. Każdy roztwór do badań następnie miesza się z piaskiem kwarcowym, jak opisano w pkt 22 (przykładowo dodaje się 10 g piasku kwarcowego na naczynie badawcze). Aby całkowicie nasączyć piasek kwarcowy, na każdy gram piasku wystarczy dodać 0,20-0,25 ml roztworu. Następnie rozpuszczalnik należy odparować do sucha. Aby zminimalizować straty badanej substancji chemicznej w wyniku łącznego parowania (np. w zależności od prężności pary danej substancji chemicznej), powleczony substancją piasek należy użyć natychmiast po osuszeniu. Suchy piasek miesza się z odpowiednią ilością osadu preparowanego o właściwym poziomie stężenia. Należy mieć na uwadze, że przy preparowaniu osadu należy uwzględniać piasek zawarty w mieszaninie badanej substancji chemicznej i piasku (zatem osad należy przygotować z mniejszą ilością piasku). Największą zaletą tej procedury jest to, że do osadu praktycznie nie wprowadza się rozpuszczalnika (7). Ewentualnie, na przykład w przypadku osadów pobranych w terenie, badaną substancję chemiczną można dodać poprzez wzbogacanie osuszonej i drobno zmielonej części osadu, zgodnie z opisem dotyczącym piasku kwarcowego przedstawionym powyżej, lub poprzez wmieszanie badanej substancji chemicznej do mokrego osadu, a następnie przeprowadzić etap odparowania, jeśli zastosowano środek rozpuszczający. Należy dopilnować, by badana substancja chemiczna dodana do osadu została w nim starannie i równomiernie rozprowadzona. W razie potrzeby dla określenia jednorodności mieszanki można przeanalizować podpróbki w celu potwierdzenia docelowych poziomów stężenia w osadzie oraz w celu określenia stopnia jednorodności. Użyteczne może również być przeprowadzenie analizy podpróbek roztworu do badań w celu potwierdzenia docelowych poziomów stężeń w osadzie. Ponieważ do celów powlekania piasku kwarcowego warstwą badanej substancji chemicznej używa się rozpuszczalnika, należy wykorzystać próbę kontrolną z rozpuszczalnikiem, którą przygotowuje się, dodając tyle samo rozpuszczalnika co badanych osadów. Metodę zastosowaną do wzbogacania oraz uzasadnienie wyboru określonej procedury wzbogacania, innej niż procedury opisanej powyżej, należy przedstawić w sprawozdaniu. Metodę wzbogacania można dostosować do właściwości fizykochemicznych badanej substancji chemicznej, np. aby uniknąć strat w wyniku ulatniania się podczas wzbogacania lub wyrównywania stężeń. Dodatkowe wytyczne dotyczące procedur wzbogacania przedstawiono w Environment Canada (1995) (46).
29. Po przygotowaniu wzbogaconego osadu, rozprowadzeniu go do naczyń badawczych z kontrpróbą i zalaniu wodą do badania, należałoby umożliwić rozdzielenie badanej substancji chemicznej między fazę wodną i osad (np. (3), (7), (9)). W miarę możliwości powinno się to odbywać w tych samych warunkach temperatury i napowietrzenia, jakie zastosowano na potrzeby badania. Czas wyrównania stężeń zależy od osadu i substancji chemicznych, i może być rzędu kilku godzin lub kilku dni, a w rzadkich przypadkach trwać do kilku tygodni (4-5 tygodni) (np. (27), (47)). W badaniu tym nie oczekuje się osiągnięcia stanu wyrównania stężeń, lecz zaleca się stosowanie okresu wyrównania stężeń trwającego od 48 godzin do 7 dni. W związku z tym czas wystarczający dla degradacji badanej substancji chemicznej będzie ograniczony do minimum. W zależności od celu badania, na przykład jeśli dąży się do odtworzenia warunków otoczenia, wzbogacony osad może być stabilizowany lub "postarzany" przez dłuższy okres.
30. Na koniec tego okresu wyrównania stężeń należy pobrać próbki co najmniej wody nadosadowej i całej objętości osadu co najmniej przy najwyższym stężeniu i przy niższym stężeniu do celów wykonania analizy stężenia badanej substancji chemicznej. Takie oznaczenia analityczne badanej substancji chemicznej powinny umożliwić obliczenie bilansu masy i wyrażenie wyników w oparciu o zmierzone stężenia początkowe. Na ogół pobieranie próbek zakłóca lub niszczy układ osad-woda. W związku z tym stosowanie tych samych kontrprób w celu pobrania próbek osadu i osobników jest na ogół niemożliwe. Należy przygotować dodatkowe naczynia do analizy o odpowiednich wymiarach, które są traktowane w ten sam sposób (łącznie z obecnością organizmów użytych do badania), lecz nie są wykorzystywane do obserwacji biologicznych. Wymiary naczyń należy dobrać tak, aby pozwoliły na uzyskanie odpowiedniej liczby próbek wymaganych w tej metodzie analitycznej. Informacje szczegółowe na temat pobierania próbek przedstawiono w pkt 53.
WYKONANIE BADANIA
Badanie wstępne
31. Jeżeli brakuje informacji na temat toksyczności badanej substancji chemicznej dla Lumbriculus variegatus, użyteczne może być wykonanie wstępnego doświadczenia w celu określenia zakresu stężeń, które należy zbadać w ostatecznym badaniu, oraz zoptymalizowania warunków dla wykonania badania ostatecznego. W tym celu stosuje się szereg roztworów o znacznie różniących się od siebie stężeniach badanej substancji chemicznej. Osobniki poddaje się narażeniu na każde stężenie badanej substancji chemicznej przez okres (np. 28 dni, jak w przypadku badania ostatecznego), pozwalający oszacować odpowiednie badane stężenie; kontrpróby nie są wymagane. Zachowanie osobników, na przykład unikanie osadu, co może być spowodowane przez badaną substancję chemiczną lub sam osad, należy obserwować i notować podczas badania wstępnego. W badaniu wstępnym nie należy badać stężeń przekraczających 1 000 mg/kg suchej masy osadu.
Badanie ostateczne
32. W badaniu ostatecznym stosuje się i wybiera co najmniej pięć stężeń, np. na podstawie wyników uzyskanych we wstępnym badaniu ustalającym zakres (pkt 31) oraz zgodnie z opisem przedstawionym w pkt 35, 36, 37 i 38.
33. Oprócz serii badanej należy przygotować jedną próbę kontrolną (aby uzyskać informacje na temat powtórzeń, zob. pkt 36, 37 i 38), zawierającą wszystkie składniki, z wyjątkiem badanej substancji chemicznej. Jeżeli wykorzystuje się środek rozpuszczający w celu zastosowania badanej substancji chemicznej, nie powinien on mieć znacznego wpływu na organizmy użyte do badania, jak wykazano w dodatkowej próbie kontrolnej zawierającej wyłącznie rozpuszczalnik.
Projekt badania
34. Projekt badania obejmuje dobór liczby badanych stężeń i ich zróżnicowanie, liczby naczyń zawierających dane stężenie substancji i liczby osobników na jedno naczynie. W pkt 35, 36, 37 i 38 opisano projekty dotyczące oszacowania wartości ECx i NOEC oraz wykonania badania granicznego.
35. Stężenie efektywne (np. EC50 EC25, EC10) i zakres stężeń, powyżej którego skutki działania badanej substancji chemicznej stają się przedmiotem zainteresowania, należy umieścić między wartościami stężeń objętych badaniem. Należy unikać ekstrapolowania wyników uzyskanych znacznie poniżej najniższego stężenia, przy którym obserwuje się zmiany mające wpływ na organizmy użyte do badania, lub powyżej najwyższego badanego stężenia. Jeżeli - w wyjątkowych przypadkach - dokonano takiej ekstrapolacji, w sprawozdaniu należy przedstawić pełne uzasadnienie.
36. Jeśli ma być oszacowane ECx, należy zbadać co najmniej pięć stężeń i wykonać przynajmniej trzy kontrpróby dla każdego stężenia; zaleca się wykonanie sześciu kontrprób dla próby kontrolnej lub - jeżeli jest wykorzystywana - próby kontrolnej z rozpuszczalnikiem w celu poprawy szacunków zmienności w próbach kontrolnych. W każdym przypadku zaleca się stosowanie dostatecznych badanych stężeń, aby umożliwić dobre oszacowanie parametrów modelu. Odstępy między stężeniami nie powinny być większe niż ich dwukrotność (z wyjątkiem przypadków, gdy krzywa zależności stężenie-odpowiedź ma łagodne nachylenie). Liczba kontrprób dla każdej grupy badanej może być zmniejszona, jeśli zwiększy się liczbę badanych stężeń dających odpowiedzi mieszczące się w zakresie 5-95 %. Zwiększanie liczby kontrprób lub zmniejszanie wielkości odstępów między badanymi stężeniami zwykle prowadzi do zawężenia przedziałów ufności dla danego badania.
37. Jeśli celem jest oszacowanie wartości LOEC/NOEC, należy zastosować co najmniej pięć badanych stężeń z co najmniej czterema kontrpróbami (zaleca się wykonanie sześciu kontrprób dla próby kontrolnej lub - jeżeli jest wykorzystywany - próby kontrolnej z rozpuszczalnikiem w celu poprawy szacunków zmienności w próbach kontrolnych), a współczynnik rozstawienia stężeń nie powinien przekraczać dwóch. Pewne informacje dotyczące mocy statystycznej zebrane podczas testowania hipotezy w badaniu międzylaboratoryjnym metody badawczej znajdują się w dodatku 6.
38. Jeśli nie oczekuje się żadnych zmian aż do 1 000 mg/kg suchej masy osadu (np. w wyniku wstępnego badania ustalającego zakres) lub jeżeli wykonanie badania przy jednym stężeniu będzie odpowiednie, aby potwierdzić wartość NOEC będącą przedmiotem zainteresowania, można wykonać badanie graniczne (stosując jedno badane stężenie i próby kontrolne). W tym drugim przypadku szczegółowe uzasadnienie wyboru stężenia granicznego należy włączyć do sprawozdania z badania. Celem badania granicznego jest wykonanie badania przy dostatecznie wysokim stężeniu, by umożliwić decydentom wykluczenie ewentualnych skutków toksycznych danej substancji chemicznej, a granicę ustala się na poziomie stężenia, co do którego nie przewiduje się, by mogło kiedykolwiek wystąpić. Zaleca się stężenie 1 000 mg/kg (w przeliczeniu na suchą masę). Zazwyczaj koniecznych jest co najmniej sześć kontrprób zarówno dla próby badanej, jak i dla prób kontrolnych. Pewne informacje dotyczące mocy statystycznej zebrane podczas testowania hipotezy w badaniu międzylaboratoryjnym metody badawczej znajdują się w dodatku 6.
Warunki narażenia
Organizmy użyte do badania
39. Badanie wykonuje się, używając co najmniej 10 organizmów na każdą kontrpróbę stosowaną w celu określenia parametrów biologicznych. Wskazana liczba organizmów odpowiada około 50-100 mg mokrej biomasy. Przyjmując, że zawartość suchej masy wynosi 17,1 % (48), można uzyskać około 9-17 mg suchej biomasy na jedno naczynie. Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (U.S.EPA) (2000 (7)) zaleca stosowanie wskaźnika obciążenia nieprzekraczającego 1:50 (stosunek suchej biomasy do zawartości całkowitego węgla organicznego). W przypadku osadu preparowanego, który opisano w pkt 22, odpowiada to około 43 g osadu (w przeliczeniu na suchą masę) na 10 osobników przy zawartości całkowitego węgla organicznego na poziomie 2,0 % suchego osadu. W przypadkach, w których wykorzystuje się więcej niż 10 osobników na jedno naczynie, należy odpowiednio dostosować ilość osadu i nadosadowej.
40. Wszystkie osobniki wykorzystane w konkretnym badaniu powinny pochodzić z tego samego źródła i powinny być w podobnym stanie fizjologicznym (zob. dodatek 5). Należy dobrać osobniki o podobnej wielkości (zob. pkt 39). Zaleca się zważenie podpróbki partii osobników przed rozpoczęciem badania w celu ustalenia średniej masy.
41. Osobniki, które mają zostać wykorzystane do badania, usuwa się z hodowli (aby uzyskać szczegółowe informacje, zob. dodatek 5). Duże (dorosłe) osobniki bez oznak niedawnej fragmentacji przenosi się do szklanych naczyń (np. szalek Petriego) zawierających czystą wodę. Następnie synchronizuje się je, jak opisano w dodatku 5. Po regeneracji trwającej 10-14 dni do celów badania należy wykorzystać nienaruszone i kompletne organizmy podobnej wielkości, które po zastosowaniu delikatnych bodźców mechanicznych aktywnie pływają lub pełzają. Jeśli warunki badania różnią się od warunków hodowli (np. temperatura, warunki oświetlenia i woda nadosadowa), etap aklimatyzacji trwający np. 24 godziny, przy zastosowaniu takich samych warunków w zakresie temperatury, oświetlenia i wody nadosadowej jak w badaniu, powinien być wystarczający, aby osobniki dostosowały się do warunków badania. Przystosowane skąposzczety należy losowo umieścić w naczyniach badawczych.
Karmienie
42. Ponieważ pokarm dodaje się do osadu przed zastosowaniem badanej substancji chemicznej (lub w trakcie jej podawania), osobniki nie są dodatkowo karmione w trakcie badania.
Światło i temperatura
43. Fotoperiod w hodowli komórek i w badaniu zwykle wynosi 16 godzin (3), (7). Należy utrzymywać niskie natężenie światła (np. 100-500 lx), aby imitować warunki naturalne na powierzchni osadu, a także należy dokonywać jego pomiarów co najmniej raz w ciągu okresu narażenia. Temperatura powinna wynosić 20 °C ± 2 °C przez cały czas trwania badania. W ciągu jednego dnia pomiarów różnica temperatury między naczyniami badawczymi nie powinna być wyższa niż ± 1 °C. Naczynia badawcze należy umieścić w sposób losowy w inkubatorze do badań lub w obszarze badania, np. w celu zminimalizowania błędu systematycznego rozrodczości wynikającego z lokalizacji naczynia.
Napowietrzanie
44. Woda nadosadowa w naczyniu badawczym powinna być delikatnie napowietrzana (np. 2-4 pęcherzyki powietrza na sekundę) przez pipetę Pasteura, której koniec znajduje się około 2 cm powyżej powierzchni osadu w celu zminimalizowania zakłóceń osadu. Należy dopilnować, aby stężenie rozpuszczonego tlenu nie spadło poniżej 30 % wartości nasycenia powietrzem (ASV). Należy kontrolować dopływ powietrza i w razie potrzeby regulować co najmniej raz dziennie w dni robocze.
Pomiary jakości wody
45. Należy wykonać pomiary następujących parametrów jakości wody w wodzie nadosadowej:
| Temperatura: | co najmniej w jednym naczyniu badawczym na każdym poziomie stężenia i w jednym naczyniu badawczym prób kontrolnych raz na tydzień oraz na początku i na końcu okresu narażenia; w miarę możliwości można dodatkowo zapisywać temperaturę otaczającego środowiska (powietrze atmosferyczne lub łaźnia wodna), np. w odstępach co godzinę |
| Zawartość rozpuszczonego tlenu: | co najmniej w jednym naczyniu badawczym na każdym poziomie stężenia i w jednym naczyniu badawczym prób kontrolnych raz na tydzień oraz na początku i na końcu okresu narażenia; wyrażona w mg/l i jako % ASV (wartość nasycenia powietrzem) |
| Dopływ powietrza: | należy kontrolować co najmniej raz dziennie w dni robocze i w razie potrzeby wyregulować |
| pH: | co najmniej w jednym naczyniu badawczym na każdym poziomie stężenia i w jednym naczyniu badawczym prób kontrolnych raz na tydzień oraz na początku i na końcu okresu narażenia |
| Całkowita twardość wody: | co najmniej w jednej kontrpróbie prób kontrolnych i w jednym naczyniu badawczym przy najwyższym stężeniu, na początku i na końcu okresu narażenia; wyrażona w mg/l CaCO3 |
| Całkowita zawartość amoniaku: | co najmniej w jednej kontrpróbie prób kontrolnych i w jednym naczyniu badawczym przy każdym poziomie stężenia na początku i na końcu okresu narażenia, kolejno 3 razy w tygodniu; wyrażona w mg/l NH4+ lub NH3 lub jako całkowity azot w postaci amoniaku. |
Jeżeli pomiary parametrów jakości wody wymagają usunięcia znaczących próbek wody z naczyń, zaleca się założenie oddzielnych naczyń do wykonywania pomiarów parametrów jakości wody, tak aby stosunek objętości wody do osadu nie uległ zmianie.
Obserwacje biologiczne
46. Podczas narażenia należy obserwować naczynia badawcze, aby ocenić wizualne różnice i zmiany w zachowaniu osobników (np. unikanie osadu, odchody widoczne na powierzchni osadu) w porównaniu z próbami kontrolnymi. Należy odnotowywać obserwacje.
47. Na końcu badania każdą kontrpróbę poddaje się badaniu (dodatkowe naczynia przeznaczone do analizy chemicznej mogą być wyłączone z badania). Należy zastosować odpowiednią metodę, aby odzyskać wszystkie osobniki z naczynia badawczego. Należy zachować ostrożność, aby wszystkie osobniki zostały odzyskane w stanie nienaruszonym. Jedną z możliwych metod jest odsiewanie osobników z osadu. Można w tym celu zastosować sito ze stali nierdzewnej o odpowiedniej wielkości oczek. Większość wody nadosadowej dekantuje się ostrożnie, a pozostały osad i wodę miesza się do uzyskania mułu, który można przepuścić przez sito. Jeżeli użyte zostanie sito o wielkości oczek 500 µm, większość cząstek osadu bardzo szybko przejdzie przez sito; proces przesiewania powinien jednak przebiegać szybko, aby uniemożliwić osobnikom pełzanie w kierunku oczek sita lub przez nie. Zastosowanie sita o wielkości oczek 250 µm uniemożliwi osobnikom wpełzanie w oczka sita lub przeciśnięcie się lub przez nie; należy jednak uważać, aby na sicie pozostało jak najmniej cząstek osadu. Przesiany muł z każdego naczynia z kontrpróbą można powtórnie przesiać w celu zapewnienia odzysku wszystkich osobników. Alternatywną metodę może stanowić ogrzanie osadu przez umieszczenie naczynia badawczego w łaźni wodnej o temperaturze 50-60 °C; osobniki opuszczą roztwór i mogą zostać zebrane z powierzchni osadu za pomocą szerokiej pipety z krawędziami wylotu nadtopionymi nad ogniem. Kolejna możliwa metoda może mieć na celu wytworzenie mułu z osadu i przelanie go do płytkiej szalki o odpowiednim rozmiarze. Osobniki można wyjąć z płytkiej warstwy mułu za pomocą stalowej igły lub pęsety zegarmistrzowskiej (użytej jako widelec, a nie szczypczyki, aby uniknąć uszkodzenia osobników) i przenieść do czystej wody. Po oddzieleniu osobników od mułu osadu opłukuje się je w płynie użytym w badaniu i liczy.
48. Niezależnie od stosowanej metody, laboratoria powinny wykazać, że ich personel jest w stanie odzyskać średnio co najmniej 90 % organizmów z całego osadu. Na przykład do osadu z próby kontrolnej lub do osadu użytego do badania można dodać pewną liczbę organizmów użytych do badania, odzysk może być określony po upływie jednej godziny (7).
49. Należy odnotować i poddać ocenie całkowitą liczbę żywych i martwych osobników w przeliczeniu na kontrpróbę. Następujące grupy osobników uznaje się za martwe:
a) brak reakcji na delikatne bodźce mechaniczne;
b) widoczne są oznaki rozkładu (w połączeniu z punktem "a");
c) szereg brakujących osobników.
Ponadto żywe osobniki można przypisać do jednej z trzech grup:
a) duże kompletne osobniki (dorosłe) bez zregenerowanych obszarów ciała;
b) kompletne osobniki ze zregenerowanymi obszarami ciała o jaśniejszym kolorze (tj. z nowymi tylnymi częściami, z nowymi przednimi częściami lub z nowymi tylnymi i przednimi częściami);
c) niekompletne osobniki (tj. takie, które przeszły fragmentację, a obszary ich ciała nie zregenerowały się).
Te dodatkowe obserwacje nie są obowiązkowe, ale można je wykorzystać przy dodatkowej interpretacji wyników biologicznych (np. duża liczba osobników przypisanych do grupy c) może wskazywać na opóźnienie w rozmnażaniu lub regeneracji w ramach danego zabiegu). Ponadto jeżeli zaobserwowane zostaną jakiekolwiek różnice w wyglądzie (np. uszkodzenia integumentu, obrzęknięte części ciała) między badanymi osobnikami a osobnikami z próby kontrolnej, fakt ten należy odnotować.
50. Bezpośrednio po policzeniu/dokonaniu oceny, żywe osobniki znalezione w każdej kontrpróbie przenosi się do suchych, uprzednio zważonych i oznakowanych zważonych szalek (jedna na kontrpróbę), a następnie uśmierca, stosując kroplę etanolu na zważoną szalkę. Zważone szalki umieszcza się w piecu suszarniczym w temperaturze 100 ± 5 °C i poddaje całonocnemu suszeniu, po którym ochładza się je w eksykatorze, a następnie waży i określa suchą masę osobnika (najlepiej w gramach z dokładnością co najmniej do czwartego miejsca po przecinku).
51. Oprócz całkowitej suchej masy można określić suchą masę bez popiołu, zgodnie z pozycją bibliograficzną (49), aby uwzględnić elementy nieorganiczne pochodzące ze spożytego osadu obecnego w przewodzie pokarmowym osobników.
52. Biomasę określa się jako całkowitą biomasę na kontrpróbę obejmującą osobniki dorosłe i młode. Martwych osobników nie uwzględnia się przy określaniu biomasy na kontrpróbę.
Weryfikacja stężeń badanej substancji chemicznej
Pobieranie próbek
53. Próbki badanej substancji chemicznej przeznaczone do analizy chemicznej należy pobrać co najmniej w najwyższym i najniższym stężeniu, co najmniej na koniec etapu ustalenia stanu równowagi (przed dodaniem organizmów użytych do badania) oraz na koniec badania. Do analizy należy pobrać co najmniej całą objętość osadu i wody nadosadowej. Należy pobrać co najmniej dwie próbki na matrycę i zabieg w każdym dniu pobierania próbek. Jedną z dwóch próbek można przechowywać jako rezerwę (do analizy np. w przypadku gdy wstępna analiza wykracza poza zakres ± 20 % od stężenia nominalnego). W przypadku szczególnych właściwości chemicznych, np. jeżeli spodziewana jest szybka degradacja badanej substancji chemicznej, można dopracować schemat analityczny (np. zwiększyć częstotliwość pobierania próbek, poddać analizie więcej poziomów stężeń) na podstawie swojej najlepszej wiedzy. Próbki można wówczas pobierać w dni pośredniego pobierania próbek (np. siódmego dnia od rozpoczęcia narażenia).
54. Wodę nadosadową należy pobrać, ostrożnie ją dekantując lub syfonując, aby zminimalizować zakłócenia osadu. Należy odnotować objętość próbek.
55. Po usunięciu wody nadosadowej osad należy poddać homogenizacji i przenieść do odpowiedniego pojemnika. Należy odnotować masę próbki mokrego osadu.
56. Jeżeli dodatkowo wymagana jest analiza badanej substancji chemicznej w wodzie porowej, zważone próbki osadu poddane homogenizacji należy odwirować, aby otrzymać wodę porową. Na przykład około 200 ml mokrego osadu można przelać do 250 ml zlewek do odwirowywania. Następnie próbki należy odwirować bez filtrowania w celu wyodrębnienia wody porowej, np. na poziomie 10 000 ± 600 × g przez 30-60 min w temperaturze nieprzekraczającej temperatury stosowanej w badaniu. Po odwirowaniu supernatant dekantuje się lub wprowadza się go za pomocą pipety, uważając, aby nie zassać żadnych cząstek osadu, oraz odnotowuje się jego objętość. Odnotowuje się masę pozostałego osadu. Może to ułatwić oszacowanie bilansu masy lub odzysku badanej substancji chemicznej w układzie woda-osad, jeżeli suchą masę osadu określa się w każdym dniu pobierania próbek. W niektórych przypadkach analiza stężeń w wodzie porowej może być uniemożliwiona ze względu na zbyt małą próbkę.
57. Jeżeli analiza nie zostanie wykonana bezzwłocznie, wszystkie próbki należy przechowywać w odpowiedni sposób, np. zgodnie z warunkami dotyczącymi przechowywania, zalecanymi w celu zminimalizowania degradacji określonej badanej substancji chemicznej (np. próbki środowiskowe zwykle przechowuje się w temperaturze - 18 °C bez dostępu światła). Przed rozpoczęciem badania należy uzyskać informacje na temat właściwych warunków przechowywania określonej badanej substancji chemicznej - np. okresu trwania i temperatury przechowywania, procedur ekstrakcji itd.
Metoda analityczna
58. Ze względu na to, że cała procedura uzależniona jest zasadniczo od dokładności, precyzji i czułości metody analitycznej wykorzystywanej w odniesieniu do badanej substancji chemicznej, należy sprawdzić doświadczalnie, czy precyzja oraz odtwarzalność analizy chemicznej, a także odzyskiwanie badanej substancji chemicznej z wody i z próbek osadu, są zadowalające w przypadku danej metody co najmniej na poziomie najniższego i najwyższego badanego stężenia. Należy także sprawdzić, czy badana substancja chemiczna nie jest wykrywalna w komorach z próbą kontrolną w stężeniach wyższych niż granica oznaczalności. W razie potrzeby należy skorygować stężenie nominalne w odniesieniu do odzysku dobrej jakości substancji użytych do wzbogacenia prób kontrolnych (np. w przypadku gdy odzysk nie mieści się w przedziale 80-120 % wzbogaconej ilości). Przez cały okres trwania badania ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się w taki sposób, aby zminimalizować ich zanieczyszczenie i straty (np. wynikające z adsorpcji badanej substancji chemicznej na przyrządzie do pobierania próbek).
59. Odzysk badanej substancji chemicznej, granica oznaczalności i granica wykrywalności w osadzie i wodzie powinny być odnotowane i zgłoszone.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Opracowanie wyników
60. Biomasa i całkowita liczba osobników na kontrpróbę stanowią główne obowiązkowe zmienne zależne badania, które należy ocenić pod względem statystycznym. Ocenie można również poddać, nieobowiązkowo, rozrodczość (jako wzrost liczby osobników) oraz wzrost (jako zwiększenie suchej biomasy). W takim przypadku szacowaną suchą masę osobników w momencie rozpoczęcia narażenia należy otrzymać np. z pomiarów suchej masy typowej podpróbki partii zsynchronizowanych organizmów użytych w badaniu.
61. Chociaż śmiertelność nie stanowi punktu końcowego tego badania, należy w miarę możliwości poddać ją ocenie. Aby oszacować skalę śmiertelności, szereg osobników, które nie reagują na delikatne bodźce mechaniczne lub wykazują widoczne oznaki rozkładu, oraz brakujące osobniki należy uznać za martwe. Śmiertelność należy przynajmniej odnotować i uwzględnić przy interpretacji wyników badania.
62. Stężenia powodujące zmiany należy wyrażać w mg/kg suchej masy osadu. Jeżeli odzysk badanej substancji chemicznej mierzonej w osadzie lub osadzie i wodzie nadosadowej w momencie rozpoczęcia narażenia wynosi 80-120 % stężenia nominalnego, stężenia powodujące zmiany (ECx, NOEC, LOEC) można wyrazić w oparciu o stężenia nominalne. Jeżeli odzysk odbiega od stężeń nominalnych o więcej niż ± 20 % wartości stężeń nominalnych, stężenia powodujące zmiany (ECx, NOEC, LOEC) powinny opierać się na stężeniach zmierzonych na początku narażenia, np. z uwzględnieniem bilansu masy badanej substancji chemicznej w układzie badawczym (zob. pkt 30). W takich przypadkach dodatkowe informacje można otrzymać dzięki analizie roztworu podstawowego lub zastosowanych roztworów, aby potwierdzić, że badane osady przygotowano poprawnie.
ECx
63. Wartości ECx w odniesieniu do parametrów określonych w pkt 60 oblicza się za pomocą odpowiednich metod statystycznych (np. analizy probitowej, krzywej logistycznej, funkcji Weibulla, metody Spearmana-Kärbera lub prostej interpolacji). Wytyczne dotyczące oceny statystycznej znajdują się w pozycjach bibliograficznych (15) i (50). ECx otrzymuje się, wstawiając wartość odpowiadającą x % średniej grupy kontrolnej do wybranego równania. Aby obliczyć EC50 lub każdą inną wartość ECx, należy przeprowadzić analizę regresyjną średnich (X) z okresu przed wprowadzeniem substancji chemicznej.
NOEC/LOEC
64. Jeżeli analiza statystyczna ma na celu wyznaczenie NOEC/LOEC, niezbędne są dane statystyczne dotyczące poszczególnych naczyń (poszczególne naczynia uznaje się za kontrpróby). Należy zastosować odpowiednie metody statystyczne. Ogólnie rzecz biorąc, niekorzystne skutki podania badanej substancji chemicznej w porównaniu z grupą kontrolną bada się, stosując test jednostronnej (mniejszej) hipotezy na poziomie p ≤ 0,05. Przykłady znajdują się w kolejnych punktach. Wytyczne dotyczące wyboru odpowiednich metod statystycznych określono w pozycjach bibliograficznych (15) i (50).
65. Normalny rozkład danych można zbadać np. za pomocą testu zgodności Kołmogrowa-Smirnowa, testu stosunku zakresu do standardowego odchylenia (test R/s) lub testu Shapiro-Wilka (dwustronny, p ≤ 0,05). W badaniu jednorodności wariancji można zastosować test Cochrana, test Levene'a lub test Bartletta (dwustronny, p ≤ 0,05). Jeżeli warunki metod parametrycznych badania (normalność, jednorodność wariancji) są spełnione, można wykonać jednokierunkową analizę wariancji (ANOVA) i kolejne testy wielokrotnego porównywania. Testy porównywania par (np. test t Dunnetta) lub testy regresyjne (test Williamsa) mogą być stosowane w celu obliczenia, czy istnieje znacząca różnica (p ≤ 0,05) między próbami kontrolnymi a różnymi stężeniami badanej jednostki. W przeciwnym razie NOEC i LOEC należy określić za pomocą metod nieparametrycznych (np. za pomocą korekty Bonferroniego zgodnie z testem trendu Holma lub Jonckheere'a-Terpstry).
Badanie graniczne
66. Jeżeli przeprowadzono badanie graniczne (porównanie próby kontrolnej z jedną tylko próbą poddaną zabiegowi) i spełnione zostały warunki wstępne dotyczące parametrycznych procedur badania (normalność, jednorodność), odpowiedzi metryczne (całkowita liczba osobników oraz biomasa jako sucha masa osobników) można ocenić za pomocą testu t-Studenta. Jeżeli warunki te nie zostały spełnione, można zastosować test t-Studenta (test t-Welcha) dla nierównych wariancji lub test nieparametryczny, taki jak test Manna-Whitneya. Informacje dotyczące mocy statystycznej zebrane podczas testowania hipotezy w badaniu międzylaborato-ryjnym metody znajdują się w dodatku 6.
67. Aby określić znaczące różnice między próbami kontrolnymi (próbą kontrolną i próbą kontrolną z rozpuszczalnikiem), można wykonać badanie kontrprób każdej próby kontrolnej zgodnie z opisem dotyczącym badania granicznego. Jeżeli w wyniku tych badań nie zostaną wykryte znaczące różnice, wszystkie próby kontrolne i kontrpróby kontrolne z rozpuszczalnikiem mogą być połączone. W przeciwnym wypadku wszystkie zabiegi należy porównać z próbą kontrolną z rozpuszczalnikiem.
Interpretacja wyników
68. Wyniki badania należy interpretować ostrożnie, jeżeli miały miejsce odstępstwa od tej metody badawczej oraz w przypadku gdy mierzone stężenia badanych roztworów występują na poziomach zbliżonych do granicy wykrywalności stosowanej metody analitycznej. Należy zwrócić uwagę na wszelkie odstępstwa od opisywanej metody badawczej.
Sprawozdanie z badania
69. Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:
- Badana substancja chemiczna:
- dane identyfikacyjne substancji chemicznej (nazwa zwyczajowa, nazwa systematyczna, wzór strukturalny, numer CAS itp.), w tym czystość i metodę analityczną określania ilościowego badanej substancji chemicznej; źródło badanej substancji chemicznej, nazwę i stężenie wszelkich zastosowanych rozpuszczalników;
- wszelkie dostępne informacje dotyczące właściwości fizycznych i właściwości fizykochemicznych, uzyskane przed rozpoczęciem badania (np. rozpuszczalność w wodzie, prężność pary, współczynnik podziału w glebie (lub w osadzie, jeśli jest dostępny), log Kow, stabilność w wodzie itd.).
- Badany gatunek:
- nazwa systematyczna, źródło, wszelkie przypadki obróbki wstępnej, aklimatyzacja, warunki hodowli itp.
- Warunki badania:
- zastosowana procedura badawcza (np. statyczna, półstatyczna lub przepływowa);
- projekt badania (np. liczba, materiał i wielkość komór badawczych, objętość wody na każde naczynie, masę i objętość osadu na każde naczynie, (w przypadku procedury przepływowej i półstatycznej: tempo wymiany objętości wody), napowietrzanie zastosowane przed badaniem i podczas badania, liczba kontrprób, liczba osobników w każdej kontrpróbie w momencie rozpoczęcia narażenia, liczba badanych stężeń, czas trwania etapu kondycjonowania, osiąganie równowagi i narażenia, częstotliwość pobierania próbek);
- głębokość warstwy osadu i warstwy wody nadosadowej;
- metoda wstępnej obróbki i wzbogacania/wprowadzenia badanej substancji chemicznej;
- badane stężenia nominalne, szczegóły dotyczące pobierania próbek do analizy chemicznej oraz metody analityczne, dzięki którym otrzymano stężenia badanej substancji chemicznej;
- charakterystyka osadu, zgodnie z pkt 24-25, oraz wszelkie inne wykonane pomiary;
- przygotowanie wody badawczej (jeśli stosowana jest woda regenerowana) i jej charakterystyka (stężenie tlenu, pH, przewodność właściwa, twardość i wszelkie inne wykonane pomiary) przed rozpoczęciem badania;
- szczegółowe informacje o karmieniu, w tym rodzaj pokarmu, przygotowanie, schemat żywienia i ilość pokarmu;
- natężenie światła i fotoperiod(-y);
- metody stosowane w celu określenia wszystkich parametrów biologicznych (np. pobieranie próbek, kontrola, ważenie organizmów użytych do badania) i wszystkich parametrów abiotycznych (np. parametry jakości wody i osadu);
- objętość lub waga wszystkich próbek do analizy chemicznej;
- szczegółowe informacje na temat opracowania wszystkich próbek przeznaczonych do analizy chemicznej, w tym szczegółowe informacje na temat procedur przygotowania, przechowywania, wzbogacania, ekstrakcji oraz procedur analitycznych (oraz precyzji) zastosowanych w odniesieniu do badanej substancji chemicznej oraz odzysk badanej substancji chemicznej.
- Wyniki:
- jakość wody w naczyniach badawczych, (pH, temperatura, stężenie rozpuszczonego tlenu, twardość, stężenia amoniaku i wszelkie inne wykonane pomiary);
- zawartość całkowitego węgla organicznego (TOC), stosunek suchej masy do mokrej masy, pH osadu i wszelkie inne wykonane pomiary;
- całkowita liczba osobników oraz, jeżeli ustalono, liczba kompletnych i niekompletnych osobników w każdej komorze badawczej na końcu badania;
- sucha masa osobników w każdej komorze badawczej na końcu badania oraz, jeżeli zmierzono, sucha masa podpróbki osobników na początku badania;
- wszelkie zaobserwowane nietypowe zachowania w porównaniu z próbami kontrolnymi (np. unikanie osadu, obecność lub brak odchodów);
- wszelkie zaobserwowane przypadki śmiertelności;
- oszacowanie toksycznych punktów końcowych (np. ECx, NOEC lub LOEC) oraz metody statystyczne użyte w celu ich określenia;
- badane stężenia nominalne, zmierzone badane stężenia i wyniki wszystkich analiz ustalających stężenie badanej substancji chemicznej w naczyniach badawczych;
- wszelkie odstępstwa od kryteriów ważności.
- Ocena wyników
- zgodność wyników z kryteriami ważności wymienionymi w pkt 13;
- omówienie wyników, w tym ewentualny wpływ na wynik badania będący skutkiem odstępstw od niniejszej metody badawczej.
BIBLIOGRAFIA
(1) Komisja Europejska (2003). Dokument ze wskazówkami technicznymi uzupełniający dyrektywę Komisji 93/67/EWG w sprawie oceny ryzyka ze strony substancji notyfikowanych, rozporządzenie Komisji (WE) nr 1488/94 w sprawie oceny ryzyka stwarzanego przez istniejące substancje oraz dyrektywę 98/8/WE Parlamentu Europejskiego i Rady dotyczącą wprowadzania do obrotu produktów biobójczych; część I-IV. Urząd Publikacji Unii Europejskiej (Komisja Europejska), Luksemburg.
(2) OECD (1992a). Report of the OECD workshop on effects assessment of chemicals in sediment. OECD Monographs No. 60. Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD), Paryż.
(3) ASTM International (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, E 1688-00a. W: ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
(4) ASTM International (2002). Standard Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates, E1706-00. W: ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
(5) Phipps, G.L., Ankley, G.T., Benoit, D.A. i Mattson, V.R. (1993). Use of the aquatic Oligochaete Lumbriculus variegatus for assessing the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants. Environ.Toxicol. Chem. 12, 269-279.
(6) Rozdział C.27 niniejszego załącznika, Badanie toksyczności w układzie osad-woda na ochotkowatych z wykorzystaniem wzbogaconego osadu.
(7) U.S. EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Wydanie 2. EPA 600/R-99/064, U.S. Environmental Protection Agency, Duluth, MN, March 2000.
(8) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius). Biological Test Method. Report SPE 1/RM/32. grudzień 1997 r.
(9) Hill, I.R., Matthiessen, P., Heimbach, F. (red.), 1993, Guidance document on Sediment Toxicity Tests and Bioassays for freshwater and Marine Environments, From the SETAC-Europe Workshop On Sediment Toxicity Assessment, 8-10 listopada 1993 r., Renesse (NL).
(10) BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system. M. Streloke i H.Köpp (red.). Berlin 1995.
(11) Riedhammer C. i B. Schwarz-Schulz (2001). The Newly Proposed EU Risk Assessment Concept for the Sediment Compartment. J. Soils Sediments 1(2), 105-110.
(12) ASTM International (2004). Standard guide for collection, storage, characterisation, and manipulation of sediment for toxicological testing and for selection of samplers used to collect benthic invertebrates. Amerykańskie Stowarzyszenie Badań i Materiałów. E 1391-03.
(13) Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H.J. i Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. We współpracy z R. Nagelem i B. Karaoglanem. Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 202 67 429.
(14) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Publikacje OECD na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, Seria OECD dotycząca badań i oceny, nr 23.
(15) Environment Canada (2003). Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests; piąty projekt, marzec 2003 r.; Report EPS 1/RM/
(16) Nikkilä A., Halme A., Kukkonen J.V.K. (2003). Toxicokinetics, toxicity and lethal body residues of two chlorop-henols in the oligochaete worm, Lumbriculus variegatus, in different sediments. Chemosphere 51: 35-46.
(17) Baily H.C. i Liu D.H.W. (1980). Lumbriculus variegatus, a Benthic Oligochaete, as a Bioassay Organism. s. 205- 215. W J.C. Eaton, P.R. Parrish i A.C. Hendricks (red.). Aquatic Toxicology, ASTM STP 707. Amerykańskie Stowarzyszenie Badań i Materiałów.
(18) Chapman K. K., Benton M. J., Brinkhurst R. O. i Scheuerman P. R. (1999). Use of the aquatic oligochaetes Lumbriculus variegatus and Tubifex tubifex for assessing the toxicity of copper and cadmium in a spiked-artificial-sediment toxicity test. Environmental Toxicology. 14(2): 271-278.
(19) Meyer J.S., Boese C.J. i Collyard S.A. (2002). Whole-body accumulation of copper predicts acute toxicity to an aquatic oligochaete (Lumbriculus variegatus) as pH and calcium are varied. Comp. Biochem. Physiol. Part C 133:99-109.
(20) Schubauer-Berigan M.K., Dierkes J.R., Monson P.D. i Ankley G.T. (1993). pH-dependent toxicity of cadmium, copper, nickel, lead and zinc to Ceriodaphnia dubia, Pimephales promelas, Hyalella azteca and Lumbriculus variegatus. Environ. Toxicol. Chem. 12(7):1261-1266.
(21) West, C.W., V.R. Mattson, E.N. Leonard, G.L. Phipps i G.T. Ankley (1993). Comparison of the relative sensitivity of three benthic invertebrates to copper-contaminated sediments from the Keweenaw Waterway. Hydrobiol. 262:57-63.
(22) Ingersoll, C.G., Ankley, G.T., Benoit D.A., Brunson, E.L., Burton, G.A., Dwyer, F.J., Hoke, R.A., Landrum, P. F., Norberg-King, T. J. i Winger, P.V. (1995). Toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants using freshwater invertebrates: A review of methods and applications. Environ. Toxicol. Chem. 14, 1885-1894.
(23) Kukkonen, J. i Landrum, P.F. (1994). Toxicokinetics and toxicity of sediment-associated Pyrene to Lumbriculus variegatus (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 13, 1457-1468.
(24) Leppänen, M.T. i Kukkonen, J.V.K. (1998a). Relationship between reproduction, sediment type and feeding activity of Lumbriculus variegatus (Müller): Implications for sediment toxicity testing. Environ. Toxicol. Chem. 17: 2 196-2 202.
(25) Leppänen, M.T. i Kukkonen, J.V.K. (1998b). Factors affecting feeding rate, reproduction and growth of an oligochaete Lumbriculus variegatus (Müller). Hydrobiologia 377: 183-194.
(26) Landrum, P.F., Gedeon, M.L., Burton, G.A., Greenberg. M.S. i Rowland, C.D. (2002). Biological Responses of Lumbriculus variegatus Exposed to Fluoranthene-Spiked Sediment. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 42: 292-302.
(27) Brunson, E.L., Canfield, T.J., Ingersoll, C.J. i Kemble, N.E. (1998). Assessing the bioaccumulation of contaminants from sediments of the Upper Mississippi river using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 35, 191-201.
(28) Ingersoll, C.G., Brunson, E.L., Wang N., Dwyer, F.J., Ankley, G.T., Mount D.R., Huckins J., Petty. J. i Landrum, P. F. (2003). Uptake and depuration of non-ionic organic contaminants from sediment by the oligochaete, Lumbriculus variegatus. Environmental Toxicology and Chemistry 22, 872-885.
(29) Rodriguez, P. i Reynoldson, T.B. (1999). Laboratory methods and criteria for sediment bioassessment. W: A. Mudroch, J.M. Azcue i P. Mudroch (red.): Manual of Bioassessment of aquatic sediment quality. Lewis Publishers, Boca Raton, CRC Press LLC.
(30) Liebig, M., Egeler, Ph. Oehlmann, J. i Knacker, Th. (2005). Bioaccumulation of14C-17α-ethinylestradiol by the oligochaete Lumbriculus variegatus in artificial sediment. Chemosphere 59, 271-280.
(31) Brust, K., O. Licht, V. Hultsch, D. Jungmann i R. Nagel (2001). Effects of Terbutryn on Aufwuchs and Lumbriculus variegatus in Artificial Indoor Streams. Environ. Toxicol. Chemistry, t. 20, s. 2000-2007.
(32) Oetken, M., K.-U. Ludwichowski i R. Nagel (2000). Sediment tests with Lumbriculus variegatus and Chironomus riparius and 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA) within the scope of EG-AltstoffV. Na zlecenie Federalnej Agencji Ochrony Środowiska (Umweltbundesamt Berlin), FKZ 360 12 001, marzec 2000 r.
(33) Leppänen M.T. i Kukkonen, J.V.K. (1998). Relative importance of ingested sediment and porewater as bioaccu-mulation routes for pyrene to oligochaete (Lumbriculus variegatus, Müller). Environ. Sci. Toxicol. 32, 1503-1508.
(34) Dermott R. i M. Munawar (1992). A simple and sensitive assay for evaluation of sediment toxicity using Lumbriculus variegatus (Müller). Hydrobiologia 235/236: 407-414.
(35) Drewes C.D. i Fourtner (1990). Morphallaxis in an aquatic oligochaete, Lumbriculus variegatus: Reorganisation of escape reflexes in regenerating body fragments. Develop. Biol. 138: 94-103.
(36) Brinkhurst, R.O. (1971). A guide for the identification of British aquatic oligochaeta. Freshw. Biol. Assoc., Sci. Publ. nr 22.
(37) Rozdział C.1 niniejszego załącznika, Ryby, badanie toksyczności ostrej.
(38) OECD (1992c). Guidelines for Testing of Chemicals No. 210. Fish, Early-life Stage Toxicity Test. OECD, Paryż.
(39) Egeler, Ph., Römbke, J., Meller, M., Knacker, Th., Franke, C., Studinger, G. i Nagel, R. (1997). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by tubificid sludgeworms (Oligochaeta) under standardised laboratory conditions. Chemosphere 35, 835-852.
(40) Meller, M., P. Egeler, J. Roembke, H. Schallnass, R. Nagel i B. Streit. (1998). Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulphate on Tubificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media. Ecotox. and Environ. Safety 39: 10-20.
(41) Egeler, Ph., Römbke, J., Knacker, Th., Franke, C. i Studinger, G. (1999). Workshop on Bioaccumulation: Sediment test using benthic oligochaetes, 26-27.4.1999, Hochheim/Main, Niemcy. Report on the R+D-project No. 298 67 419, Umweltbundesamt, Berlin.
(42) Suedel, B.C. and Rodgers, J.H. (1993). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13, 1163-1175.
(43) Naylor, C. i C. Rodrigues. (1995). Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment. Chemosphere 31: 3291-3303.
(44) Kaster, J.L., Klump, J.V., Meyer, J., Krezoski, J. i Smith, M.E. (1984). Comparison of defecation rates of Limnodrilus hoffmeisteri using two different methods. Hydrobiologia 11, 181-184.
(45) Martinez-Madrid, M., Rodriguez, P., Perez-Iglesias, J.I. i Navarro, E. (1999). Sediment toxicity bioassays for assessment of contaminated sites in the Nervion river (Northern Spain). 2. Tubifex tubifex (Müller) reproduction sediment bioassay. Ecotoxicology 8, 111-124.
(46) Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
(47) Landrum, P.F. (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Technol. 23, 588-595.
(48) Brooke, L.T., Ankley, G.T., Call, D.J. & Cook, P.M. (1996). Gut content and clearance for three species of freshwater invertebrates. Environ. Toxicol. Chem. 15, 223-228.
(49) Mount, D.R., Dawson, T.D. i Burkhard, L.P. (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegatus. Environ. Toxicol. Chem. 18, 1244-1249.
(50) OECD 2006. Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Seria OECD dotycząca badań i oceny, nr 54, OECD, Paryż, Francja.
(51) Liebig M., Meller M. i Egeler P. (2004). Sedimenttoxizitätstests mit aquatischen Oligochaeten - Einfluss verschiedener Futterquellen im künstlichen Sediment auf Reproduktion und Biomasse von Lumbriculus variegatus. Proceedings 5/2004: Statusseminar Sedimentkontakttests. 24-25 marca 2004 r. BfG (Bundesanstalt für Gewässerkunde), Koblencja, Niemcy, s. 107-119.
Dodatkowe pozycje dotyczące procedur statystycznych:
Dunnett, C.W. (1955). A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control. Amer. Statist. Ass. J. 50, 1096-1121.
Dunnett, C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics 20, 482-491.
Finney, D.J. (1971). Probit Analysis (wydanie 3), s. 19-76. Cambridge Univ. Press.
Finney, D.J. (1978). Statistical Method in Biological Assay. Charles Griffin & Company Ltd, Londyn.
Hamilton M.A., R.C. Russo i R.V. Thurston. (1977). Trimmed Spearman-Karber Method for estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environ. Sci. Technol. 11(7), 714-719; sprostowanie: Environ. Sci. Technol. 12 (1998), 417.
Holm, S. (1979). A simple sequentially rejective multiple test procedure. Scand. J. Statist. 6, 65-70.
Sokal, R.R. i F.J. Rohlf. (1981) Biometry. The principle and practice of statistics in biological research. Wydanie 2. W. H. Freeman and Company. Nowy Jork.
Miller, R.G., Jr. (1986). Beyond ANOVA, basics of applied statistics. John Wiley & Sons. Nowy Jork.
Shapiro S.S. i Wilk M.B (1965). An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika 52: 591- 611.
Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27, 103-117.
Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics 28, 519-531.
Dodatek 1
Definicje
Dla celów niniejszej metody badawczej stosowane są następujące definicje:
Substancja chemiczna oznacza substancję lub mieszaninę.
Okres kondycjonowania stosuje się w celu ustabilizowania komponentu mikrobiologicznego osadu i usunięcia np. amoniaku pochodzącego z komponentów osadu; odbywa się przed wzbogaceniem osadu badaną substancją chemiczną. Zwykle woda nadosadowa jest usuwana po kondycjonowaniu.
ECxjest stężeniem badanej substancji chemicznej w osadzie mającym x % wpływu (np. 50 %) na właściwości biologiczne w danym okresie narażenia.
Okres wyrównania stężeń stosuje się w celu rozprowadzenia badanej substancji chemicznej między fazą stałą, wodą porową i wodą nadosadową; odbywa się po wzbogaceniu osadu badaną substancją chemiczną i przed dodaniem organizmów użytych do badania.
Etap narażenia to czas, w trakcie którego organizmy użyte do badania poddaje się narażeniu na działanie badanej substancji chemicznej.
Osad preparowany lub odtworzony, sztuczny lub syntetyczny stanowi mieszaninę materiałów używaną do symulowania składników fizycznych naturalnego osadu.
Najniższe stężenie, przy którym obserwuje się zmiany (LOEC) jest to najmniejsze badane stężenie badanej substancji chemicznej, przy którym obserwuje się znaczące działanie toksyczne (przy p ≤ 0,05) w porównaniu z próba kontrolną. Jednakże wszystkie badane stężenia powyżej LOEC muszą oddziaływać w równym lub większym stopniu niż te, które są obserwowane przy LOEC. Jeżeli te dwa warunki nie mogą być spełnione, należy szczegółowo wyjaśnić, w jaki sposób ustalono LOEC (a następnie NOEC).
Stężenie, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC) jest stężeniem badanym bezpośrednio poniżej LOEC, które w porównaniu z próbą kontrolną nie ma statystycznie istotnego skutku (p ≤ 0,05) w danym okresie narażenia.
Współczynnik podziału oktanol-woda (Kow; czasem wyrażany również jako Pow) to stosunek rozpuszczalności substancji chemicznej w n-oktanolu i wodzie w warunkach równowagi, odzwierciedlający lipofilność substancji chemicznej (rozdział A.24 niniejszego załącznika). Kow lub jego logarytm Kow (log Kow) wykorzystuje się jako wskaźnik zdolności substancji chemicznej do bioakumulacji w organizmach wodnych.
Współczynnik podziału węgiel organiczny-woda (Koc) to stosunek stężenia substancji chemicznej w/na frakcji węgla organicznego osadu i stężenia substancji chemicznej w wodzie w warunkach równowagi.
Woda nadosadowa jest to woda pokrywająca osad w naczyniu badawczym.
Woda porowa jest to woda wypełniająca przestrzeń między cząstkami osadu i gleby.
Osad wzbogacony jest to osad, do którego dodano substancję chemiczną.
Badana substancja chemiczna oznacza dowolną substancję lub mieszaninę badaną za pomocą niniejszej metody badawczej.
Dodatek 2
Skład zalecanej wody regenerowanej
(w rozumieniu rozdziału C.1 niniejszego załącznika (1))
a) Roztwór chlorku wapnia
Rozpuścić 11,76 g CaCl2 2H2O w wodzie dejonizowanej, dopełnić do 1 l wodą dejonizowaną.
b) Roztwór siarczanu magnezu
Rozpuścić 4,93 g MgSO4 7H2O w wodzie dejonizowanej, dopełnić do 1 l wodą dejonizowaną.
c) Roztwór wodorowęglanu sodu
Rozpuścić 2,59 g NaHCO3 w wodzie dejonizowanej, dopełnić do 1 l wodą dejonizowaną.
d) Roztwór chlorku potasu
Rozpuścić 0,23 g KCl w wodzie dejonizowanej, dopełnić do 1 l wodą dejonizowaną.
Wszystkie substancje chemiczne muszą być czyste do analizy.
Przewodność właściwa wody destylowanej lub dejonizowanej nie powinna przekraczać 10 µScm- 1.
Należy wymieszać 25 ml każdego z roztworów a)-d) i dopełnić całkowitą objętość wodą dejonizowaną do 1 l. Suma jonów wapnia i magnezu w tych roztworach wynosi 2,5 mmol/l.
Stosunek jonów Ca:Mg wynosi 4:1, a jonów Na:K wynosi 10:1. Pojemność kwasowa KS4.3 w tym roztworze wynosi 0,8 mmol/l.
Wodę rozcieńczającą należy poddać aeracji do osiągnięcia nasycenia tlenem, a następnie przechowywać ją przez około dwa dni bez dalszego napowietrzania przed zastosowaniem.
BIBLIOGRAFIA
1) Rozdział C.1 niniejszego załącznika, Ryby, badanie toksyczności ostrej.
Dodatek 3
Właściwości fizykochemiczne dopuszczalnej wody rozcieńczającej
| Składnik | Stężenia |
| Cząstki stałe | < 20 mg/l |
| Całkowity węgiel organiczny | < 2 µg/l |
| Niezjonizowany amoniak | < 1 µg/l |
| Chlor resztkowy | < 10 µg/l |
| Całkowita zawartość pestycydów fosforoorganicznych | < 50 ng/l |
| Całkowita zawartość pestycydów chloroorganicznych oraz polichlorowanych bifenyli | < 50 ng/l |
| Całkowity chlor organiczny | < 25 ng/l |
| (dostosowano za OECD (1992)(1)) |
BIBLIOGRAFIA
(1) OECD (1992). Guidelines for Testing of Chemicals No. 210. Fish, Early-life Stage Toxicity Test. OECD, Paryż.
Dodatek 4
Zalecany osad sztuczny - wytyczne w zakresie przygotowania i przechowywania
Składniki osadu
| Składnik | Właściwości | % suchej masy osadu |
| Torf | Torf sfagnowy o "średnim" stopniu rozkładu, suszony na powietrzu, bez widocznych pozostałości roślin, drobno zmielony (wielkość cząstek ≤ 0,5 mm) | 5 ± 0,5 |
| Piasek kwarcowy | Wielkość ziaren: ≤ 2 mm, ale > 50 % cząstek powinna mieścić się w przedziale 50-200 μm | 75-76 |
| Glinka kaolinowa | Zawartość kaolinitu ≥ 30 % | 20 ± 1 |
| Źródło pokarmu | Np. sproszkowana pokrzywa (Folia urticae), liście Urtica dioica (pokrzywy zwyczajnej), drobno zmielone (wielkość cząstek ≤ 0,5 mm) zgodna z farmaceutycznymi standardami dotyczącymi spożycia przez ludzi; jako dodatek do suchego osadu | 0,4-0,5 % |
| Węgiel organiczny | Korygowany przez dodanie torfu i piasku | 2 ± 0,5 |
| Węglan wapnia | CaCO3, sproszkowany, chemicznie czysty, jako dodatek do suchego osadu | 0,05-1 |
| Woda dejonizowana | Przewodność właściwa ≤ 10 µS/cm, jako dodatek do suchego osadu | 30-50 |
Uwaga: Jeżeli przewiduje się podwyższone stężenia amoniaku, np. jeżeli wiadomo, że badana substancja chemiczna hamuje nitryfikację, użyteczne może być zastąpienie 50 % bogatej w azot sproszkowanej pokrzywy celulozą (np. chemicznie czystym proszkiem z alfa-celulozy, wielkość cząsteczek ≤ 0,5 mm; (1) (2)).
Przygotowanie
Torf suszy się na powietrzu i mieli na drobny proszek. Zawiesinę wymaganej ilości proszku torfowego w wodzie dejonizowanej przygotowuje się za pomocą wysokosprawnego urządzenia do homogenizacji. Wartość pH zawiesiny koryguje się do poziomu 5,5 ± 0,5, stosując CaCO3. W celu ustabilizowania pH i komponentu mikrobiologicznego zawiesinę kondycjonuje się przez co najmniej dwa dni w temperaturze 20 ± 2 °C, delikatnie mieszając. Ponownie mierzy się pH, którego wartość powinna wynosić 6,0 ± 0,5. Następnie zawiesinę torfową miesza się z innymi składnikami (piaskiem i glinką kaolinową) oraz wodą dejonizowaną, aby otrzymać jednorodny osad o zawartości wody wynoszącej 30-50 % suchej masy osadu. Ponownie mierzy się wartość pH końcowej mieszaniny i koryguje w razie potrzeby za pomocą CaCO3 do poziomu 6,5-7,5. Jeżeli jednak przewiduje się powstawanie amoniaku, przydatne może okazać się utrzymywanie pH w osadzie poniżej 7,0 (np. w zakresie 6,0-6,5). Próbki osadu pobiera się, aby określić suchą masę i zawartość węgla organicznego. Jeżeli przewiduje się powstawanie amoniaku, możliwe jest kondycjonowanie osadu preparowanego przez siedem dni w tych samych warunkach, jakie panować będą następnie podczas badania (np. stosunek osad-woda 1: 4, wysokość warstwy osadu jak w naczyniach badawczych)
przed wzbogaceniem go badaną substancją chemiczną, tj. należy uzupełnić go wodą, która powinna zostać napowietrzona. Na koniec okresu kondycjonowania należy usunąć i odrzucić wodę nadosadową. Następnie wzbogacony piasek kwarcowy miesza się z osadem na każdym poziomie zabiegu, osad rozdziela się do naczyń badawczych do kontrprób i uzupełnia wodą do badania. Naczynia są następnie inkubowane w takich samych warunkach, jakie panować będą następnie podczas badania. W tym momencie rozpoczyna się okres wyrównywania stężeń. Warstwa wody nadosadowej powinna być napowietrzona.
Wybrane źródło pokarmu należy dodać przed wzbogaceniem osadu badaną substancją chemiczną lub w jego trakcie. Może ona zostać zmieszana z zawiesiną torfową (zob. powyżej). Nadmiernego rozkładu źródła pokarmu przed dodaniem organizmów użytych do badań, np. w przypadku długiego okresu wyrównywania stężeń, można jednak uniknąć, zachowując jak najkrótszy okres między dodaniem pokarmu i rozpoczęciem narażenia. W celu zapewnienia wystarczającego wzbogacenia pokarmu badaną substancją chemiczną, źródło pokarmu należy wymieszać z osadem nie później niż w dniu wzbogacenia osadu badaną substancją chemiczną.
Przechowywanie
Suche składniki sztucznego osadu mogą być przechowywane w suchym i chłodnym miejscu lub w temperaturze pokojowej. Przygotowany osad wzbogacony badaną substancją chemiczną należy niezwłocznie użyć do badania. Próbki wzbogaconego osadu można, do czasu ich analizy, przechowywać w warunkach zalecanych w odniesieniu do danej badanej substancji chemicznej.
BIBLIOGRAFIA
(1) Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H.J. i Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. We współpracy z R. Nagelem i B. Karaoglanem. Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 202 67 429.
(2) Liebig M., Meller M. i Egeler P. (2004). Sedimenttoxizitätstests mit aquatischen Oligochaeten - Einfluss verschiedener Futterquellen im künstlichen Sediment auf Reproduktion und Biomasse von Lumbriculus variegatus. Proceedings 5/2004: Statusseminar Sedimentkontakttests. 24-25 marca 2004 r. BfG (Bundesanstalt für Gewässerkunde), Koblencja, Niemcy, s. 107-119.
Dodatek 5
Metody hodowli Lumbriculus variegatus
Gatunek Lumbriculus variegatus (MÜLLER), Lumbriculidae, Oligochaeta zamieszkuje osady słodkich wód i jest powszechnie wykorzystywany w badaniach ekotoksykologicznych. Jego hodowla w warunkach laboratoryjnych jest łatwa. Poniżej podano ogólny opis metod hodowli.
Metody hodowli
Warunki hodowli w przypadku Lumbriculus variegatus zostały szczegółowo przedstawione w Phippsa i in. (1993) (1), Brunson i in. (1998) (2), ASTM (2000) (3), U.S. EPA (2000) (4). Poniżej przedstawione zostało krótkie streszczenie tych warunków. Główną zaletę L. variegatus stanowi jego szybkie rozmnażanie się, skutkujące szybko rosnącą biomasą w populacjach hodowanych w laboratoriach (np. (1), (3), (4), (5)).
Osobniki można hodować w dużych akwariach (57-80 l) w temperaturze 23 °C przy fotoperiodzie wynoszącym 16L:8D (100-1 000 luksów), stosując codzienne odnawianą naturalną wodę (45-50 l na akwarium). Podłoże przygotowuje się poprzez pocięcie niebielonych brązowych papierowych ręczników na paski, które można następnie na kilka sekund wymieszać z wodą do hodowli, aby wytworzyć małe kawałki papierowego podłoża. Podłoża można następnie użyć bezpośrednio w akwariach do hodowli Lumbriculus, pokrywając dno zbiornika, lub przechowywać zamrożone w dejonizowanej wodzie do późniejszego wykorzystania. Nowe podłoże w zbiorniku zasadniczo zachowa trwałość przez około dwa miesiące.
Każdą hodowlę rozpoczyna się od 500-1 000 organizmów karmionych 10 ml zawiesiny zawierającej 6 g pokarmu przeznaczonego dla młodych pstrągów 3 razy w tygodniu w warunkach wymiany lub przepływu. W przypadku hodowli statycznych lub pół-statycznych dostarczane porcje pożywienia powinny być mniejsze, aby zapobiec rozwojowi bakterii i grzybów.
W tych warunkach liczba osobników w hodowli zasadniczo ulega podwojeniu w ciągu 10-14 dni.
Lumbriculus variegatus można ewentualnie hodować w systemach składających się z warstwy piasku kwarcowego, takiego jakiego używa się do sztucznego osadu (1-2 cm głębokości), i wody regenerowanej. Jako naczynia do hodowli wykorzystać można pojemniki wykonane ze szkła lub stali nierdzewnej o wysokości 12 do 20 cm. Zbiornik z wodą należy delikatnie napowietrzać (np. 2 pęcherzyki powietrza na sekundę) przez pipetę Pasteura umieszczoną około 2 cm powyżej powierzchni osadu. Aby zapobiec gromadzeniu się np. amoniaku, wodę nadosadową należy wymieniać, stosując układ przepływowy lub manualnie co najmniej raz w tygodniu. Skąposzczety mogą być trzymane w temperaturze pokojowej z fotoperiodem wynoszącym 16 godzin światła (o natężeniu 100- 1 000 luksów) i 8 godzin bez dostępu światła. W przypadku hodowli pół-statycznych (wymiana wody raz na tydzień) osobniki karmione są karmą TetraMin dwa razy na tydzień (np. 0,6-0,8 mg na cm2 powierzchni osadu), która może być podawana w formie zawiesiny 50 mg TetraMinu na 1 ml wody dejonizowanej.
Lumbriculus variegatus można usuwać z hodowli, np. przesiewając podłoże na siatce o małych oczkach lub wyjmując organizmy za pomocą pipety o szerokim wylocie (około 5 mm średnicy) z krawędzią nadtopioną nad ogniem i przenosząc do oddzielnej zlewki. Jeżeli do zlewki zostało również przeniesione podłoże, zlewkę zawierającą organizmy i podłoże pozostawia się na noc w warunkach przepływu, co pozwala usunąć podłoże ze zlewki, natomiast organizmy pozostaną na dnie naczynia. Można je następnie wprowadzić do nowo przygotowanych zbiorników do hodowli lub poddać dalszej obróbce na potrzeby badania jak przedstawiono w (3) i (4) lub w dalszej części opisu.
Kwestią, do której należy podejść krytycznie w przypadku zastosowania L. variegatus w badaniach bioakumulacji osadu, jest sposób rozmnażania tego gatunku (architomia lub morfalaksja, np. (6)). Wynikiem takiego bezpłciowego rozmnażania są dwa fragmenty, które nie pobierają pokarmu przez pewien okres do momentu regeneracji części głowy lub ogona (np. (7)(8)). Oznacza to, że w przypadku L. variegatus pobieranie zanieczyszczonego osadu nie odbywa się w sposób ciągły.
W związku z tym w celu zminimalizowania niekontrolowanego rozmnażania i regeneracji oraz późniejszej dużej zmienności w wynikach badań, należy dokonać synchronizacji. Zmienność taka może mieć miejsce w przypadku gdy niektóre osobniki, które uległy fragmentacji i w związku z tym nie pobierają pokarmu przez pewien okres, są w mniejszym stopniu narażone na działanie badanej substancji niż inne osobniki, które nie uległy fragmentacji podczas badania, np. (9), (10), (11). Na 10-14 dni przed rozpoczęciem narażenia organizmy należy sztucznie podzielić (synchronizacja). W celu synchronizacji należy wybrać duże (dorosłe) osobniki, które nie wykazują oznak niedawnej morfalaksji. Organizmy te można umieścić na szklanym szkiełku w kropli wody do hodowli i rozciąć w okolicy środkowej części ciała za pomocą skalpela. Należy dopilnować, aby tylne końce były podobnej długości. Tylne końce należy następnie pozostawić w celu odtworzenia nowych głów w naczyniu do hodowli zawierającym to samo podłoże, co wykorzystane w hodowli, i wodę regenerowaną aż do momentu rozpoczęcia narażenia. Oznaką regeneracji nowych głów jest zakopywanie się zsynchronizowanych organizmów w substracie (obecność zregenerowanych głów można potwierdzić, sprawdzając reprezentatywne podróbki pod dwuokularowym mikroskopem). Przewiduje się, że organizmy użyte do badań będą potem w podobnym stanie fizjologicznym. Oznacza to, że jeśli podczas badania następuje rozmnażanie przez morfalaksję w przypadku zsynchronizowanych organizmów, praktycznie wszystkie zwierzęta będą w równym stopniu narażone na wzbogacony osad. Pierwsze karmienie zsynchronizowanych organizmów powinno zostać wykonane w momencie, gdy organizmy zaczną zakopywać się w podłożu lub 7 dni po rozcięciu. Schemat żywienia powinien wyglądać podobnie jak w przypadku zwykłych hodowli, ale zaleca się karmienie zsynchronizowanych organizmów tym samym źródłem pożywienia, które ma być wykorzystane w badaniu. Organizmy należy przechowywać w temperaturze badania wynoszącej 20 ± 2 °C. Po regeneracji w badaniu zastosować należy nienaruszone i kompletne osobniki, które pod wpływem delikatnych bodźców mechanicznych aktywnie pływają lub pełzają. Należy zapobiegać zranieniom lub autotomii organizmów, np. stosując do ich przenoszenia pipety z krawędziami nadtopionymi nad ogniem lub narzędzia stomatologiczne ze stali nierdzewnej.
Źródła kultur starterowych Lumbriculus variegatus (adresy w Stanach Zjednoczonych podane za (4))
Europa
ECT Oekotoxikologie GmbH Bayer Crop Science AG
Böttgerstr. 2-14 Development - Ecotoxicology
D-65439 Flörsheim/Main Alfred-Nobel-Str. 50
Niemcy D-40789 Monheim
Niemcy
University of Joensuu Dresden University of Technology
Laboratory of Aquatic Toxicology Institut für Hydrobiologie
Dept. of Biology Fakultät für Forst-, Geo- und Hydrowissenschaften
Yliopistokatu 7, P.O. Box 111 Mommsenstr. 13
FIN-80101 Joensuu D-01062 Dresden
Finlandia Niemcy
C.N.R.- I.R.S.A.
Italian National Research Council
Water Research Institute
Via Mornera 25
I-20047 Brugherio MI
STANY ZJEDNOCZONE AMERYKI
U.S. Environmental Protection Agency Michigan State University
Mid-Continent Ecological Division Department of Fisheries and Wildlife
6201 Congdon Boulevard No. 13 Natural Resources Building
Duluth, MN 55804 East Lansing, MI 48824-1222
U.S. Environmental Protection Agency Wright State University
Environmental Monitoring System Laboratory Institute for Environmental Quality
26 W. Martin Luther Dr. Dayton, OH 45435
Cincinnati, OH 45244
Columbia Environmental Research Center Great Lakes Environmental Research
U.S. Geological Survey Laboratory, NOAA
4200 New Haven Road 2205 Commonwealth Boulevard
Columbia, MO 65201 Ann Arbor, MI 48105-1593
BIBLIOGRAFIA
(1) Phipps, G.L., Ankley, G.T., Benoit, D.A. i Mattson, V.R. (1993). Use of the aquatic Oligochaete Lumbriculus variegatus for assessing the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants. Environ.Toxicol. Chem. 12, 269-279.
(2) Brunson, E.L., Canfield, T.J., Ingersoll, C.J. i Kemble, N.E. (1998). Assessing the bioaccumulation of contaminants from sediments of the Upper Mississippi river using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 35, 191-201.
(3) ASTM International (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, E 1688-00a. W: ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM International, West Conshohocken, PA.
(4) U.S. EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Wydanie 2. EPA 600/R-99/064, U.S. Environmental Protection Agency, Duluth, MN, marzec 2000 r.
(5) Kukkonen, J. i Landrum, P.F. (1994). Toxicokinetics and toxicity of sediment-associated Pyrene to Lumbriculus variegatus (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 13, 1457-1468.
(6) Drewes C.D. i Fourtner (1990). Morphallaxis in an aquatic oligochaete, Lumbriculus variegatus: Reorganisation of escape reflexes in regenerating body fragments. Develop. Biol. 138: 94-103.
(7) Leppänen, M.T. i Kukkonen, J.V.K. (1998a). Relationship between reproduction, sediment type and feeding activity of Lumbriculus variegatus (Müller): Implications for sediment toxicity testing. Environ. Toxicol. Chem. 17: 2 196-2 202.
(8) Leppänen, M.T. i Kukkonen, J.V.K. (1998b). Factors affecting feeding rate, reproduction and growth of an oligochaete Lumbriculus variegatus (Müller). Hydrobiologia 377: 183-194.
(9) Brust, K., O. Licht, V. Hultsch, D. Jungmann i R. Nagel (2001). Effects of Terbutryn on Aufwuchs and Lumbriculus variegatus in Artificial Indoor Streams. Environ. Toxicol. Chemistry, t. 20, s. 2000-2007.
(10) Oetken, M., K.-U. Ludwichowski i R. Nagel (2000). Sediment tests with Lumbriculus variegatus and Chironomus riparius and 3,4-dichloroaniline (3,4-DCA) within the scope of EG-AltstoffV. Na zlecenie Federalnej Agencji Ochrony Środowiska (Umweltbundesamt Berlin), FKZ 360 12 001, marzec 2000 r.
(11) Leppänen M.T. i Kukkonen, J.V.K. (1998). Relative importance of ingested sediment and porewater as bioaccu-mulation routes for pyrene to oligochaete (Lumbriculus variegatus, Müller). Environ. Sci. Toxicol. 32, 1503- 1508.
Dodatek 6
Podsumowanie wyników badań międzylaboratoryjnych "Badanie toksyczności osadu przy wykorzystaniu Lumbriculus variegatus"
Tabela 1
Wyniki poszczególnych serii badań międzylaboratoryjnych: średnia liczba organizmów w próbach kontrolnych i w próbach kontrolnych z rozpuszczalnikiem na koniec badania; SD = odchylenie standardowe; CV = współczynnik zmienności
| Średnia liczba organizmów w próbach kontrolnych | SD | CV (%) | n | Średnia liczba organizmów w próbach kontrolnych z rozpuszczalnikiem | SD | CV (%) | n | |
| 32,3 | 7,37 | 22,80 | 3 | 39,0 | 3,61 | 9,25 | 3 | |
| 40,8 | 6,55 | 16,05 | 6 | 36,0 | 5,29 | 14,70 | 3 | |
| 41,5 | 3,54 | 8,52 | 2 | 38,5 | 7,05 | 18,31 | 4 | |
| 16,3 | 5,99 | 36,67 | 6 | 30,8 | 6,70 | 21,80 | 4 | |
| 24,3 | 10,69 | 43,94 | 3 | 26,3 | 3,06 | 11,60 | 3 | |
| 28,5 | 8,29 | 29,08 | 4 | 30,7 | 1,15 | 3,77 | 3 | |
| 28,3 | 3,72 | 13,14 | 6 | 28,8 | 2,56 | 8,89 | 6 | |
| 25,3 | 5,51 | 21,74 | 3 | 27,7 | 1,53 | 5,52 | 3 | |
| 23,8 | 2,99 | 12,57 | 4 | 21,3 | 1,71 | 8,04 | 4 | |
| 36,8 | 8,80 | 23,88 | 6 | 35,0 | 4,20 | 11,99 | 6 | |
| 33,0 | 3,58 | 10,84 | 6 | 33,5 | 1,73 | 5,17 | 4 | |
| 20,7 | 2,73 | 13,22 | 6 | 15,0 | 6,68 | 44,56 | 4 | |
| 42,0 | 7,07 | 16,84 | 6 | 43,7 | 0,58 | 1,32 | 3 | |
| 18,2 | 3,60 | 19,82 | 6 | 21,7 | 4,04 | 18,65 | 3 | |
| 32,0 | 3,95 | 12,34 | 6 | 31,3 | 4,79 | 15,32 | 4 | |
| Średnia z badań międzylaboratoryjnych | 29,59 | 20,10 | 30,61 | 13,26 | ||||
| SD | 8,32 | 10,03 | 7,57 | 10,48 | ||||
| n | 15 | 15 | ||||||
| min | 16,3 | 15,0 | ||||||
| maks | 42,0 | 43,7 | ||||||
| CV (%) | 28,1 | 24,7 |
Tabela 2
Wyniki poszczególnych serii badań międzylaboratoryjnych: średnia całkowita sucha masa organizmów w kontrpróbie w próbach kontrolnych i w próbach kontrolnych z rozpuszczalnikiem na koniec badania; SD = odchylenie standardowe; CV = współczynnik zmienności
| Całkowita sucha masa organizmów w kontrpróbie (próbach kontrolnych) | SD | CV (%) | n | Całkowita sucha masa organizmów w kontrpróbie (w próbach kontrolnych z rozpuszczalnikiem) | SD | CV (%) | n | |
| 24,72 | 6,31 | 25,51 | 3 | 27,35 | 4,08 | 14,93 | 3 | |
| 30,17 | 2,04 | 6,75 | 6 | 33,83 | 10,40 | 30,73 | 3 | |
| 23,65 | 3,61 | 15,25 | 2 | 28,78 | 4,68 | 16,28 | 4 | |
| 12,92 | 6,83 | 52,91 | 6 | 24,90 | 6,84 | 27,47 | 4 | |
| 21,31 | 4,17 | 19,57 | 3 | 25,87 | 5,30 | 20,49 | 3 | |
| 22,99 | 4,86 | 21,16 | 4 | 24,64 | 5,09 | 20,67 | 3 | |
| 18,91 | 1,91 | 10,09 | 6 | 19,89 | 1,77 | 8,89 | 6 | |
| 24,13 | 1,63 | 6,75 | 3 | 25,83 | 2,17 | 8,41 | 3 | |
| 22,15 | 3,18 | 14,34 | 4 | 22,80 | 2,60 | 11,40 | 4 | |
| 35,20 | 8,12 | 23,07 | 6 | 31,42 | 8,45 | 26,90 | 6 | |
| 41,28 | 5,79 | 14,02 | 6 | 41,42 | 4,37 | 10,55 | 4 | |
| 15,17 | 5,78 | 38,09 | 6 | 10,50 | 3,42 | 32,53 | 4 | |
| 35,69 | 8,55 | 23,94 | 6 | 38,22 | 1,23 | 3,21 | 3 | |
| 19,57 | 5,21 | 26,65 | 6 | 28,58 | 6,23 | 21,81 | 3 | |
| 29,40 | 2,16 | 7,34 | 6 | 31,15 | 2,70 | 8,67 | 4 | |
| Średnia z badań międzylaboratoryjnych | 25,15 | 20,36 | 27,68 | 17,53 | ||||
| SD | 7,87 | 12,56 | 7,41 | 9,10 | ||||
| n | 15 | 15 | ||||||
| min | 12,9 | 10,5 | ||||||
| maks | 41,3 | 41,4 | ||||||
| CV (%) | 31,3 | 26,8 |
Tabela 3
Toksyczność PCP: podsumowanie punktów końcowych w badaniu międzylaboratoryjnym; średnia z badań międzylaboratoryjnych dla EC50, NOEC i LOEC; SD = odchylenie standardowe; CV = współczynnik zmienności
| Parametr biologiczny | Średnia z badań międzylaboratoryjnych (mg/kg) | min | maks | Współczynnik wyników badań międzylaboratoryjnych (mg/kg) | SD | CV (%) | średnia geometryczna (mg/kg) | |
| całkowita liczba organizmów | EC50 NOEC | 23,0 9,9 | 4,0 2,1 | 37,9 22,7 | 9,4 10,7 | 10,7 7,2 | 46,3 72,3 | 19,9 7,6 |
| LOEC | 27,9 | 4,7 | 66,7 | 14,2 | 19,4 | 69,4 | 20,9 | |
| MDD (%) | 22,5 | 7,1 | 39,1 | |||||
| całkowita sucha masa organizmów | EC50 NOEC | 20,4 9,3 | 7,3 2,1 | 39,9 20,0 | 5,5 9,4 | 9,1 6,6 | 44,5 70,4 | 18,2 7,4 |
| LOEC | 25,7 | 2,1 | 50,0 | 23,5 | 16,8 | 65,5 | 19,4 | |
| MDD (%) | 24,8 | 10,9 | 44,7 | |||||
| śmiertelność/ przeżycie | LC50 | 25,3 | 6,5 | 37,2 | 5,7 | 9,4 | 37,4 | 23,1 |
| NOEC | 16,5 | 2,1 | 40,0 | 18,8 | 10,3 | 62,4 | 12,8 | |
| LOEC | 39,1 | 4,7 | 66,7 | 14,2 | 18,1 | 46,2 | 32,6 | |
| rozmnażanie (wzrost liczby organizmów w kontrpróbie) | EC50 | 20,0 | 6,7 | 28,9 | 4,3 | 7,6 | 37,9 | 18,3 |
| NOEC | 7,9 | 2,1 | 20,0 | 9,4 | 5,2 | 66,0 | 6,4 | |
| LOEC | 22,5 | 2,1 | 50,0 | 23,5 | 15,4 | 68,6 | 16,0 | |
| MDD (%) | 29,7 | 13,9 | 47,9 | |||||
| wzrost (wzrost biomasy na kontrpróbę) | EC50 | 15,3 | 5,7 | 29,9 | 5,2 | 7,1 | 46,5 | 13,7 |
| NOEC | 8,7 | 2,1 | 20,0 | 9,4 | 6,0 | 68,1 | 6,9 | |
| LOEC | 24,0 | 2,1 | 50,0 | 23,5 | 15,7 | 65,5 | 17,3 | |
| MDD (%) | 32,2 | 13,6 | 65,2 |
| MDD: minimalna wykrywalna różnica w odniesieniu do wartości prób kontrolnych podczas testowania hipotez; stosowana jako miara mocy statystycznej |
BIBLIOGRAFIA
Egeler, Ph., Meller, M., Schallnaß, H.J. i Gilberg, D. (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. We współpracy z R. Nagelem i B. Karaoglanem. Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 202 67 429.
C.36 BADANIE ROZRODCZOŚCI DRAPIEŻNYCH ROZTOCZY (HYPOASPIS (GEOLAELAPS) ACULEIFER) W GLEBIE
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 3.
C.37. 21-DNIOWE BADANIE RYB: KRÓTKOTERMINOWE BADANIE PRZESIEWOWE AKTYWNOŚCI ESTROGENNEJ I ANDROGENNEJ ORAZ ZAHAMOWANIE AROMATAZY
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna z dotyczącą badań wytyczną OECD nr 230 (2009). Konieczność opracowania i zweryfikowania badania ryb umożliwiającego wykrycie określonych substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego wynika z obawy, że środowiskowe poziomy substancji chemicznych mogą wywoływać działania niepożądane zarówno u ludzi, jak i w przypadku dzikiej flory i fauny ze względu na interakcję tych substancji chemicznych z układem hormonalnym. W 1998 r. OECD zapoczątkowała działania o najwyższym priorytecie mające na celu przegląd istniejących wytycznych dotyczących badań i opracowanie nowych wytycznych dotyczących odsiewania i badania potencjalnych substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego. Jednym z elementów tych działań było opracowanie wytycznej dotyczącej badań w odniesieniu do odsiewania substancji chemicznych oddziałujących na układ hormonalny określonych gatunków ryb. 21-dniowe badanie przesiewowe układu hormonalnego ryb poddano zakrojonemu na szeroką skalę programowi weryfikacji, który obejmował badania międzylaboratoryjne z wykorzystaniem wybranych substancji chemicznych, aby wykazać, że badanie przesiewowe stanowi istotną i wiarygodną metodę wykrywania substancji chemicznych hamujących aktywność estrogenną i aromatazę (1, 2, 3, 4, 5) u trzech badanych gatunków ryb (Pimephales promelas, ryżanki japońskiej i danio pręgowanego); wykrycie działania androgennego jest możliwe u Pimephales promelas i ryżanki, lecz nie w przypadku danio pręgowanego. Niniejsza metoda badawcza nie pozwala jednak na wykrycie substancji chemicznych o działaniu antyandrogennym. Działania weryfikacyjne zostały zrecenzowane przez panel ekspertów powołanych przez koordynatorów krajowych programu wytycznych dotyczących badań (6). Przedmiotowe badanie nie ma na celu zidentyfikowania konkretnych mechanizmów zaburzeń hormonalnych, ponieważ zwierzęta użyte do badania mają nieuszkodzoną oś podwzgórze-przysadka-gonady, która może reagować na substancje chemiczne wywierające wpływ na oś podwzgórze-przysadka-gonady na różnych poziomach. Krótkoterminowe badanie rozrodczości ryb (dotycząca badań wytyczna OECD nr 229) obejmuje płodność i, w razie potrzeby, histopatologię gonad w przypadku Pimephales promelas, jak również wszystkie punkty końcowe uwzględnione w niniejszej metodzie badawczej. W dotyczącej badań wytycznej OECD nr 229 przewidziano badanie przesiewowe substancji chemicznych, które mają wpływ na rozrodczość, za pomocą różnych mechanizmów, w tym zmian hormonalnych. Należy to rozważyć przed wyborem najodpowiedniejszej metody badawczej.
2. W niniejszej metodzie badawczej opisuje się badanie przesiewowe in vivo, w którym dojrzałe płciowo samce ryb i samice ryb w okresie tarła przetrzymuje się razem i poddaje działaniu substancji chemicznej przez ograniczoną część ich cyklu życia (21 dni). Na zakończenie 21-dniowego okresu narażenia, w zależności od wykorzystanego gatunku, mierzy się jeden lub dwa punkty końcowe dotyczące biomarkerów dla samców i samic jako wskaźniki działania estrogennego, zahamowania aromatazy lub działania androgennego badanej substancji chemicznej; te punkty końcowe to witellogenina i drugorzędne cechy płciowe. Witellogeninę mierzy się u Pimephales promelas, ryżanki japońskiej i danio pręgowanego, zaś drugorzędne cechy płciowe mierzy się tylko u Pimephales promelas i ryżanki japońskiej.
3. Ten test biologiczny służy jako badanie przesiewowe in vivo dla określonych trybów działania hormonalnego, a jego zastosowanie należy rozpatrywać w kontekście dokumentu zatytułowanego "OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals" (28).
UWAGI WSTĘPNE I OGRANICZENIA
4. Witellogenina jest normalnie wytwarzana w wątrobie jajorodnych kręgowców płci żeńskiej w reakcji na endogenny estrogen w układzie krążenia. Jest ona prekursorem białek żółtka i po wytworzeniu w wątrobie jest przenoszona przez krew do jajnika, gdzie jest pobierana i modyfikowana przez rozwijające się komórki jajowe. Witellogenina jest niemalże niewykrywalna w osoczu niedojrzałych samic i samców ryb, ponieważ nie mają one wystarczającej ilości estrogenu w krwiobiegu; wątroba ma jednak zdolność syntezy i wydzielania witello-geniny w reakcji na egzogenną stymulację estrogenem.
5. Pomiar witellogeniny służy wykrywaniu substancji chemicznych o różnych estrogennych charakterach działania. Wykrycie estrogennych substancji chemicznych jest możliwe dzięki pomiarowi indukcji witellogeniny u samców ryb i zostało bogato udokumentowane w recenzowanej literaturze naukowej (np. (7). Indukcję witellogeniny wykazano również po narażeniu na działanie aromatyzowalnych androgenów (8, 9). Obniżenie poziomu estrogenu w układzie krążenia w przypadku samic, na przykład na skutek zahamowania aromatazy przekształcającej endogenny androgen w naturalny estrogen 17β-estradiol, powoduje zmniejszenie poziomu witellogeniny, co wykorzystuje się do wykrywania substancji chemicznych działających jak inhibitory aromatazy (10, 11). Biologiczne znaczenie reakcji witellogeniny po zahamowaniu aktywności substancji estrogennej/aromatazy zostało ustalone i szeroko udokumentowane. Możliwe jest jednak, że na wytwarzanie VTG u samic mogą również wpływać ogólna toksyczność i niehormonalne charaktery działania toksycznego, np. hepatotok-syczność.
6. Opracowano i znormalizowano z dobrym wynikiem kilka metod pomiaru w celu rutynowego wykorzystywania. Dotyczy to metod opartych na właściwym dla danego gatunku teście immunoenzymatycznym (ELISA), w którym wykorzystuje się immunochemię do oznaczenia ilościowego wytworzonej witellogeniny w małych próbkach krwi lub wątroby pobranych od pojedynczych osobników ryb (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). W celu dokonania pomiaru VTG pobiera się próbki krwi Pimephales promelas, krwi lub homogenatu głowy/ogona danio pręgowanego i wątroby ryżanki japońskiej. W przypadku ryżanki istnieje dobra korelacja między VTG mierzoną w próbkach krwi i wątroby (19). W dodatku 6 przedstawia się zalecane procedury pobierania próbek do celów analizy witellogeniny. Zestawy do pomiaru witellogeniny są powszechnie dostępne; powinny one opierać się na zweryfikowanej, właściwej dla danego gatunku metodzie ELISA.
7. Drugorzędne cechy płciowe samców niektórych gatunków ryb są widoczne na zewnątrz, są kwantyfikowalne oraz reagują na poziom endogennych androgenów w krwiobiegu; dotyczy to Pimephales promelas i ryżanki, lecz nie danio pręgowanego, który nie posiada kwantyfikowalnych drugorzędnych cech płciowych. Samice zachowują zdolność do wykształcania drugorzędnych męskich cech płciowych, gdy zostaną narażone na działanie androgennych substancji chemicznych w wodzie. W literaturze przedmiotu można znaleźć kilka badań, które dokumentują tego rodzaju reakcję u Pimephales promelas (20) i ryżanki (21). Zmniejszenie nasilenia drugorzędnych cech płciowych u samców należy interpretować ostrożnie, ze względu na niską wartość mocy statystycznej, oraz opierać się na specjalistycznej opinii i wadze dowodów. Istnieją ograniczenia w zakresie wykorzystania danio pręgowanego w tym badaniu ze względu na brak kwantyfikowalnych drugorzędnych cech płciowych, które reagują na substancje chemiczne o działaniu androgennym.
8. W przypadku Pimephales promelas głównym wskaźnikiem egzogennego narażenia na działanie androgenne jest liczba guzków godowych na pysku samic ryb. W przypadku ryżanki liczba procesów tworzenia się brodawek stanowi główny marker egzogennego narażenia samic ryb na substancje chemiczne o działaniu androgennym. W dodatkach 5A i 5B wskazano zalecane procedury, które należy stosować do oceny cech płciowych odpowiednio u Pimephales promelas i ryżanki.
9. Definicje stosowane w niniejszej metodzie badawczej przedstawiono w dodatku 1.
ZASADA BADANIA
10. W trakcie badania samce i samice ryb w stanie reprodukcyjnym poddaje się wspólnie narażeniu w naczyniach badawczych. Ich status osobników dorosłych oraz ich stan reprodukcyjny pozwalają na wyraźne rozróżnienie płci, a w związku z tym zapewniają możliwość przeprowadzenia związanej z płcią analizy każdego parametru docelowego, jak również wrażliwość na egzogenne substancje chemiczne. Po zakończeniu badania płeć potwierdza się w badaniu makroskopowym gonad po otwarciu brzucha wzdłuż linii środkowej za pomocą nożyczek. Przegląd odpowiednich warunków testu biologicznego przedstawiono w dodatku 2. Badanie zwykle rozpoczyna się od pobrania próbki ryb z populacji w okresie tarła; nie należy wykorzystywać starzejących się zwierząt. Wytyczne dotyczące wieku ryb i stanu reprodukcyjnego podano w części dotyczącej wyboru ryb. Badanie przeprowadza się z zastosowaniem trzech stężeń ekspozycyjnych, jak również próby kontrolnej z wodą oraz, w razie potrzeby, próby kontrolnej z rozpuszczalnikiem. Stosuje się dwa naczynia lub kontrpróby na zabieg (każde naczynie zawiera 5 samców i 5 samic) w przypadku ryżanki i danio pręgowanego, zaś w przypadku Pimephales promelas stosuje się cztery naczynia lub kontrpróby na zabieg (przy czym każde naczynie zawiera 2 samce i 4 samice). Służy to uwzględnieniu zachowania terytorialnego samców Pimephales promelas, przy równoczesnym utrzymaniu wystarczającej mocy testu. Narażenie trwa 21 dni, a pobranie próbek ryb odbywa się w 21. dniu narażenia.
11. Przy pobraniu próbek w 21. dniu wszystkie zwierzęta uśmierca się w sposób humanitarny. Drugorzędne cechy płciowe mierzy się u Pimephales promelas i ryżanki (zob. dodatki 5A i 5B); próbki krwi pobiera się w celu oznaczenia witellogeniny u danio pręgowanego i Pimephales promelas, ewentualnie można pobrać głowę/ogon w celu oznaczenia witellogeniny u danio pręgowanego (dodatek 6); w celu analizy VTG u ryżanki pobiera się wątrobę (dodatek 6).
KRYTERIA AKCEPTACJI BADANIA
12. Aby wyniki badania były akceptowalne, muszą zostać spełnione następujące warunki:
- śmiertelność w próbach kontrolnych z wodą (lub rozpuszczalnikiem) nie powinna przekraczać 10 % na koniec okresu narażenia;
- stężenie tlenu rozpuszczonego powinno wynosić co najmniej 60 % wartości nasycenia powietrzem (ASV) w trakcie okresu narażenia;
- różnica temperatury wody między naczyniami badawczymi przez cały okres narażenia nie może być większa niż ± 1,5 °C i musi być utrzymywana w granicach 2 °C zakresu temperatur określonego w odniesieniu do badanego gatunku (dodatek 2);
- powinny być dostępne dowody pozwalające wykazać, że stężenia badanej substancji chemicznej w roztworze utrzymano w granicach ± 20 % średnich wartości pomiarowych.
OPIS METODY
Aparatura
13. Zwykły sprzęt laboratoryjny, w szczególności:
a) mierniki tlenu i pehametry;
b) sprzęt do oznaczania twardości i zasadowości wody;
c) odpowiednia aparatura do pomiaru temperatury, zalecane jest stałe monitorowanie;
d) zbiorniki wykonane z chemicznie obojętnego materiału o odpowiedniej objętości w zależności od zalecanego obciążenia i obsady (zob. dodatek 2);
e) podłoże tarłowe dla Pimephales promelas i danio pręgowanego, niezbędne informacje podano w dodatku 4;
f) waga o odpowiedniej dokładności (tj. dokładności do ± 0,5 mg).
Woda
14. Każda woda, w której badane gatunki wykazują odpowiednie długoterminowe przeżycie i wzrost, może być stosowana jako woda do badań. Powinna mieć stałą jakość w okresie trwania badania. Wartość pH wody powinna mieścić się w zakresie 6,5-8,5, lecz w trakcie danego badania powinna wynosić ± 0,5 jednostki pH. Aby upewnić się, że woda rozcieńczająca nie będzie wpływała zbytnio na wyniki badania (np. przez komplek-sowanie badanej substancji chemicznej), należy okresowo pobierać próbki wody do analizy. W przypadku gdy wiadomo, że woda rozcieńczająca ma względnie stałą jakość, należy mierzyć, np. co trzy miesiące, zawartość metali ciężkich (np. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd i Ni), głównych anionów i kationów (np. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, i SO42-), pestycydów (np. całkowitą zawartość pestycydów fosforoorganicznych i chloroorganicznych), całkowitą zawartość węgla organicznego i zawiesinę ogólną. Jeśli można wykazać, że jakość wody była stała przez co najmniej rok, oznaczeń można dokonywać rzadziej i w większych odstępach czasu (np. co sześć miesięcy). Niektóre właściwości chemiczne dopuszczalnej wody rozcieńczającej wymieniono w dodatku 3.
Roztwory do badań
15. Roztwory do badań o wybranych stężeniach przygotowuje się przez rozcieńczenie roztworu podstawowego. Zalecane jest przygotowanie roztworu podstawowego przez zwykłe wymieszanie lub zbełtanie badanej substancji chemicznej w wodzie rozcieńczającej w sposób mechaniczny (np. za pomocą mieszadła lub ultradźwięków). Kolumny nasyceniowe (rozpuszczające) stosuje się w celu uzyskania odpowiednio stężonego roztworu podstawowego. Nie zaleca się stosowania nośnika rozpuszczalnikowego. W przypadku gdy rozpuszczalnik jest niezbędny, należy równolegle przeprowadzić próbę kontrolną z rozpuszczalnikiem w tym samym stężeniu rozpuszczalnika, które zastosowano w grupie poddanej zabiegom chemicznym. W przypadku substancji chemicznych, których badanie nastręcza trudności, rozpuszczalnik możne stanowić najlepsze rozwiązanie z technicznego punktu widzenia; należy zapoznać się z wydanym przez OECD "Guidance Document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures" (22). Wybór rozpuszczalnika będzie uwarunkowany chemicznymi właściwościami substancji chemicznej. W wytycznych OECD zaleca się maksymalne stężenie 100 µl/l i do tego zalecenia należy się zastosować. W niedawnym przeglądzie (23) podkreślono jednak dodatkowe obawy związane ze stosowaniem rozpuszczalników do badania funkcjonowania układu hormonalnego. W związku z tym zaleca się, aby w razie konieczności minimalizować stężenie rozpuszczalnika, jeżeli tylko jest to technicznie wykonalne (w zależności od właściwości fizykochemicznych badanej substancji chemicznej).
16. Zastosowany zostanie przepływowy układ badawczy. Układ taki stale dozuje i rozcieńcza roztwór podstawowy badanej substancji chemicznej (np. pompa dozująca, rozcieńczalnik proporcjonalny, układ nasycalnika) w celu przesyłania szeregu stężeń do komór badawczych. Natężenia przepływów roztworów podstawowych i wody rozcieńczającej należy sprawdzać okresowo, najlepiej codziennie, przez cały okres badania, przy czym nie mogą różnić się one o więcej niż 10 % w trakcie badania. Należy starać się unikać stosowania rur z tworzywa sztucznego niskiej klasy lub innych materiałów, które mogą zwierać aktywne biologicznie substancje chemiczne. Podczas selekcji materiału do przepływowego układu badawczego należy uwzględnić możliwą adsorpcję badanej substancji chemicznej do danego materiału.
Utrzymanie ryb
17. Badane ryby należy wybrać z populacji laboratoryjnej, najlepiej z jednego stada, które przez co najmniej dwa tygodnie przed badaniem było aklimatyzowane w warunkach jakości wody i oświetlenia zbliżonych do stosowanych w badaniu. Ważne jest, aby wskaźnik obciążenia i obsada (definicje można znaleźć w dodatku 1) były odpowiednie dla gatunków użytych do badania (zob. dodatek 2).
18. Po 48-godzinnym okresie adaptacji odnotowuje się przypadki śmiertelności i zastosowanie mają następujące kryteria:
- śmiertelność przekracza 10 % populacji w ciągu siedmiu dni: należy odrzucić całą partię;
- śmiertelność na poziomie 5-10 % populacji: aklimatyzacja przez siedem dodatkowych dni; jeżeli śmiertelność przekroczy 5 % w ciągu tych kolejnych siedmiu dni, należy odrzucić całą partię;
- śmiertelność poniżej 5 % populacji w ciągu siedmiu dni: należy zaakceptować partię.
19. Ryby nie powinny być leczone na żadną chorobę w okresie aklimatyzacji, w okresie poprzedzającym narażenie ani w okresie narażenia.
Okres poprzedzający narażenie i wybór ryb
20. Zaleca się tygodniowy okres poprzedzający narażenie, w którym zwierzęta umieszcza się w naczyniach podobnych do faktycznych naczyń użytych do badania. Ryby należy karmić bez ograniczeń przez cały okres utrzymywania i na etapie narażenia. Etap narażenia rozpoczyna się z wykorzystaniem dorosłych ryb wykazujących dymorfizm płciowy z laboratoryjnego źródła zwierząt dojrzałych płciowo (np. o wyraźnych drugorzędnych cechach płciowych widocznych w przypadku Pimephales promelas i ryżanki), oraz wykazujących aktywność tarłową. Zgodnie z ogólną wytyczną (której nie należy stosować w oderwaniu od obserwacji rzeczywistego stanu reprodukcyjnego danej partii ryb) Pimephales promelas powinny być w wieku około 20 tygodni (± 2 tygodnie), zakładając, że były hodowane w temperaturze 25 ± 2 °C przez całą długość życia. Ryżanki japońskie powinny być w wieku około 16 tygodni (± 2 tygodnie), zakładając, że były hodowane w temperaturze 25 ± 2 °C przez całą długość życia. Danio pręgowane powinny być w wieku około 16 tygodni (± 2 tygodnie), zakładając, że były hodowane w temperaturze 26 ± 2 °C przez całą długość życia.
PROJEKT BADANIA
21. Stosuje się trzy stężenia badanej substancji chemicznej, jedną próbę kontrolną (z wodą) i, w razie potrzeby, jedną próbę kontrolną z rozpuszczalnikiem. Dane można analizować w celu określenia statystycznie istotnych różnic między reakcjami w grupie badanej i grupie kontrolnej. Analizy te dostarczą informacji, czy wymagane jest dalsze długoterminowe badanie substancji chemicznej pod kątem negatywnych skutków (mianowicie wpływu na przeżycie, rozwój, wzrost i rozrodczość), czy też badanie takie ma służyć do oceny ryzyka (24).
22. W przypadku danio pręgowanego i ryżanki w 21. dniu badania pobiera się próbkę samców i samic z każdego poziomu zabiegu (5 samców i 5 samic w każdej z dwóch kontrprób) i z grup kontrolnych w celu dokonania pomiaru witellogeniny i, w stosownych przypadkach, drugorzędnych cech płciowych. W przypadku Pimephales promelas w 21. dniu narażenia pobiera się próbkę samców i samic (2 samce i 4 samice z każdej z czterech kontrprób i z grup kontrolnych) w celu dokonania pomiaru witellogeniny i drugorzędnych cech płciowych.
Dobór badanych stężeń
23. Do celów niniejszego badania najwyższym stężeniem badanej substancji powinna być wartość maksymalnego tolerowanego stężenia wyznaczonego w badaniu ustalającym zakres lub za pomocą innych danych dotyczących toksyczności, lub 10 mg/l lub wartość maksymalnej rozpuszczalności w wodzie, w zależności od tego, która wartość jest najniższa. Maksymalne tolerowane stężenie definiuje się jako najwyższe stężenie badanej substancji chemicznej, którego skutkiem jest mniej niż 10 % przypadków śmiertelnych. Przy zastosowaniu tego podejścia zakłada się istnienie empirycznych danych dotyczących ostrych przypadków toksyczności lub innych danych dotyczących toksyczności, na podstawie których można oszacować maksymalne tolerowane stężenie. Oszacowanie MTC może być niedokładne i zazwyczaj wymaga jeszcze oceny według najlepszej fachowej wiedzy osoby wykonującej badanie.
24. Wymagane są trzy badane stężenia, które różnią się o taką samą wielokrotność nieprzekraczającą 10, oraz próba kontrolna z wodą rozcieńczającą (oraz, w razie potrzeby, z rozpuszczalnikiem). Zaleca się współczynnik rozstawienia stężeń wynoszący od 3,2 do 10.
PROCEDURA
Wybór i ważenie ryb użytych do badania
25. Istotne jest, aby zminimalizować zmienność masy ryb na początku badania. Odpowiedni zakres wielkości dla różnych gatunków zalecanych do wykorzystania w tym badaniu podano w dodatku 2. W odniesieniu do całej partii ryb wykorzystanych w badaniu zakres poszczególnych mas samców i samic ryb na początku badania należy w miarę możliwości utrzymać w zakresie ± 20 % średniej arytmetycznej masy dla tej samej płci. Zaleca się zważenie podpróbki ze stada ryb przed rozpoczęciem badania w celu oszacowania średniej masy.
Warunki narażenia
Czas trwania
26. Czas trwania badania, następujący po okresie poprzedzającym narażenie, wynosi 21 dni. Zalecany okres poprzedzający narażenie wynosi tydzień.
Karmienie
27. Ryby należy karmić bez ograniczeń, podając odpowiedni pokarm (dodatek 2), w porcjach wystarczających do utrzymania stanu fizycznego. Należy starać się zapobiegać rozwojowi mikroorganizmów i mętności wody. Zgodnie z ogólną wytyczną dzienną dawkę pokarmową można podzielić na dwie lub trzy równe porcje podawane w kilku karmieniach dziennie w odstępach co najmniej trzech godzin między karmieniami. Dopuszczalna jest jedna większa dawka, w szczególności w weekendy. Karmienia ryb należy zaprzestać na 12 godzin przed pobraniem próbek/autopsją.
28. Paszę dla ryb należy ocenić pod kątem obecności zanieczyszczeń, takich jak pestycydy chloroorganiczne, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), polichlorowane bifenyle (PCB). Należy unikać pokarmów o podwyższonej zawartości fitoestrogenów, które mogłyby zakłócić w badaniu reakcję na znanego agonistę estrogenu (np. 17β-estradiol).
29. Niezjedzony pokarm i odchody należy usuwać z naczyń badawczych co najmniej dwa razy w tygodniu, np. ostrożnie czyszcząc dno każdego zbiornika za pomocą syfonu.
Światło i temperatura
30. Fotoperiod i temperatura wody muszą być odpowiednie dla badanego gatunku (zob. dodatek 2).
Częstotliwość analitycznych oznaczeń i pomiarów
31. Przed rozpoczęciem okresu narażenia należy upewnić się, że system podawania substancji chemicznej działa prawidłowo. Należy ustalić wszystkie potrzebne metody analityczne, w tym zgromadzić dostateczną wiedzę na temat stabilności układu badawczego. W trakcie badania stężenia badanej substancji chemicznej oznacza się w regularnych odstępach czasu w następujący sposób: natężenia przepływów rozcieńczalnika i roztworu podstawowego substancji toksycznej należy sprawdzać najlepiej codziennie, a co najmniej dwa razy na tydzień, przy czym nie powinny one różnić się o więcej niż 10 % przez cały okres trwania badania. Zaleca się, aby faktyczne stężenia badanej substancji chemicznej mierzyć we wszystkich naczyniach na początku badania, a następnie w odstępach tygodniowych.
32. Zaleca się, aby wyniki były oparte na mierzonych stężeniach. Jeżeli jednak stężenie badanej substancji chemicznej w roztworze można z powodzeniem utrzymywać w zakresie ± 20 % nominalnego stężenia przez okres badania, wówczas wyniki mogą opierać się albo na wartościach nominalnych, albo na wartościach pomiarowych.
33. Próbki mogą wymagać przefiltrowania (np. przez filtr z porami o średnicy 0,45 μm) lub odwirowania. Jeżeli jest to konieczne, wówczas zalecaną procedurą jest odwirowanie. Jeżeli jednak badany materiał nie ulega adsorpcji na filtrze, dopuszczalna jest też filtracja.
34. Podczas badania we wszystkich naczyniach badawczych co najmniej raz na tydzień należy zmierzyć stężenie rozpuszczonego tlenu, temperaturę i pH. Całkowitą twardość i zasadowość należy mierzyć w próbach kontrolnych i w jednym naczyniu przy najwyższym stężeniu co najmniej raz na tydzień. Zalecane jest stałe monitorowanie temperatury w co najmniej jednym naczyniu badawczym.
Obserwacje
35. W czasie trwania badania albo po jego zakończeniu ocenia się szereg reakcji ogólnych (np. przeżycie) i podstawowych reakcji biologicznych (np. poziomy witellogeniny). Procedurę pomiaru i oceny tych punktów końcowych i ich przydatność opisano poniżej.
Przeżycie
36. W okresie badania ryby należy badać codziennie i odnotowywać wszelkie przypadki śmiertelne, zaś martwe ryby należy jak najszybciej usuwać. Martwych ryb nie należy zastępować nowymi ani w naczyniu kontrolnym, ani w naczyniu z badaną substancją. Płeć ryb, które padają w trakcie badania, należy ustalić poprzez makroskopową ocenę gonad.
Zachowanie i wygląd
37. Należy odnotować wszelkie przypadki nietypowego zachowania (w porównaniu z grupami kontrolnymi), które mogą obejmować oznaki ogólnej toksyczności, w tym hiperwentylację, nieskoordynowane pływanie, utratę równowagi i nietypowy spokój lub nietypowy sposób żerowania. Dodatkowo należy odnotować anomalie zewnętrzne (takie jak krwotok, sinica). Do takich oznak toksyczności należy podchodzić ostrożnie podczas interpretacji danych, ponieważ mogą one wskazywać na stężenia, przy których biomarkery aktywności hormonalnej nie są wiarygodne. Takie obserwacje zachowania mogą również dostarczyć przydatnych informacji jakościowych na potrzeby potencjalnych przyszłych wymogów dotyczących badań ryb. Na przykład zaobserwowano agresję terytorialną u normalnych samców lub zmaskulinizowanych samic Pimephales promelas po narażeniu na substancję o działaniu androgennym; u danio pręgowanego charakterystyczne zachowania związane z kryciem i tarłem po pojawieniu się światła o brzasku ulegają ograniczeniu lub zmniejszeniu wskutek narażenia na substancje o działaniu estrogennym i antyandrogennym.
38. Ponieważ niektóre aspekty wyglądu (przede wszystkim zabarwienie) mogą zmieniać się szybko w zależności od sposobu postępowania, ważne jest, aby obserwacji jakościowych dokonywać przed usunięciem zwierząt z układu badawczego. Jak wynika z dotychczasowych doświadczeń z Pimephales promelas, niektóre substancje chemiczne zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego mogą początkowo wywoływać zmiany w następujących cechach zewnętrznych: zabarwieniu ciała (jasne albo ciemne), wzorze zabarwienia (występowanie pionowych pręg) i kształcie ciała (głowa i obszar piersiowy). Dlatego też wygląd fizyczny ryb należy obserwować w trakcie badania i po jego zakończeniu.
Humanitarne uśmiercanie ryb
39. W 21. dniu, tj. po zakończeniu narażenia, ryby należy uśpić, podając im odpowiednie ilości trikainy (metanosul-fonioanu trikainy, MS-222 (CAS 886-86-2) 100-500 mg/l buforowanej 300 mg/l NaHCO3 (wodorowęglanu sodu, CAS 144-55-8) w celu ograniczenia podrażnienia błon śluzowych; następnie pobiera się próbki krwi lub tkanek w celu oznaczenia witellogeniny, jak wyjaśniono w części dotyczącej witellogeniny.
Obserwacja drugorzędnych cech płciowych
40. Niektóre substancje chemiczne zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego mogą wywoływać zmiany w wyspecjalizowanych drugorzędnych cechach płciowych (liczbie guzków godowych u Pimephales promelas, procesie tworzenia się brodawek u samców ryżanki). Zwłaszcza substancje chemiczne o określonym charakterze działania mogą powodować nietypowe pojawianie się drugorzędnych cech płciowych u zwierząt przeciwnej płci; na przykład substancje będące agonistami receptorów androgenowych, takie jak trenbolon, metylotestosteron i dihydrotestosteron, mogą spowodować powstawanie u samic Pimephales promelas widocznych guzków godowych lub tworzenie się brodawek u samic ryżanki (11, 20, 21). Odnotowano również, że agoniści receptorów estrogenowych mogą zmniejszać liczebność guzków godowych i wielkość wyściółki tłuszczowej na grzbiecie u dorosłych samców (25, 26). Takie całościowe obserwacje morfologiczne mogą również dostarczyć przydatnych informacji ilościowych i jakościowych na potrzeby potencjalnych przyszłych wymogów dotyczących badań ryb. Liczbę i wielkość guzków godowych u Pimephales promelas i procesów tworzenia się brodawek u ryżanki można określić ilościowo bezpośrednio albo, co jest bardziej praktycznym sposobem, u utrwalonych okazów. Zalecane procedury oceny drugorzędnych cech płciowych u Pimephales promelas i ryżanki można znaleźć odpowiednio w dodatkach 5A i 5B.
Witellogenina (VTG)
41. Krew pobiera się z tętnicy/żyły ogonowej za pomocą kapilary mikrohematokrytowej powlekanej heparyną lub ewentualnie przez nakłucie serca za pomocą strzykawki. W zależności od wielkości ryby objętość krwi, jaką można pobrać, wynosi zwykle 5-60 µl na osobnika w przypadku Pimephales promelas i 5-15 µl na osobnika w przypadku danio pręgowanego. Osocze oddziela się od krwi przez odwirowanie i przechowuje z inhibitorami proteaz w temperaturze - 80 °C do czasu przeprowadzenia analizy pod kątem witellogeniny. Alternatywnym źródłem tkanki do oznaczenia witellogeniny u ryżanki będzie wątroba, zaś u danio pręgowanego można wykorzystać homogenat głowy/ogona (dodatek 6). Pomiar VTG powinien opierać się na zweryfikowanej homologicznej metodzie ELISA, w której wykorzystuje się homologiczną normę VTG i homologiczne przeciwciała. Zaleca się stosowanie metody pozwalającej na wykrycie poziomów VTG wynoszących zaledwie kilka ng/ml osocza (lub ng/mg tkanki), co stanowi poziom tła w przypadku samców ryb nienarażonych na działanie substancji.
42. Kontrola jakości analizy poziomu witellogeniny zostanie przeprowadzona z wykorzystaniem norm, prób ślepych i przynajmniej analiz powtórnych. W przypadku każdej metody ELISA należy przeprowadzić test na wpływ matrycy (wpływ rozcieńczenia próbki) w celu oznaczenia minimalnego współczynnika rozcieńczenia próbki. Każda płytka do testu ELISA wykorzystana do badań VTG powinna zawierać następujące próbki kontroli jakości: co najmniej 6 wzorców kalibracyjnych obejmujących zakres oczekiwanych stężeń witellogeniny i co najmniej jedną niespecyficzną wiążącą próbę ślepą (poddawaną analizom powtórnym). Absorbancja tych prób ślepych powinna wynosić poniżej 5 % maksymalnej absorbancji wzorca kalibracyjnego. Analizę przeprowadza się dla co najmniej dwóch podwielokrotności (zduplikowane studzienki) każdej rozcieńczonej próbki. Zduplikowane studzienki, które różnią się o więcej niż 20 %, należy poddać ponownej analizie.
43. Współczynnik korelacji (R2) w przypadku krzywych kalibracyjnych powinien być wyższy niż 0,99. Wysoka korelacja nie jest jednak wystarczająca, aby zagwarantować odpowiednią prognozę stężenia we wszystkich zakresach. Oprócz wystarczająco wysokiej korelacji dla krzywej kalibracyjnej stężenie każdego wzorca, obliczone na podstawie krzywej kalibracyjnej, powinno mieścić się w przedziale 70-120 % stężenia nominalnego. Jeżeli stężenia nominalne oddalają się od kalibracyjnej linii regresji (np. przy niższych stężeniach), konieczny może być podział krzywej kalibracyjnej na zakresy niskie i wysokie lub zastosowanie modelu nieliniowego, aby odpowiednio dopasować dane dotyczące absorbancji. Jeżeli krzywa zostanie podzielona, oba odcinki linii powinny mieć R2 >0,99.
44. Granicę wykrywalności definiuje się jako najniższe stężenie wzorca analitycznego, a granicę oznaczalności definiuje się jako najniższe stężenie wzorca analitycznego pomnożone przez najniższy współczynnik rozcieńczenia.
45. Każdego dnia, w którym przeprowadza się badania witellogeniny, zostanie przeanalizowana próbka wzmocniona przygotowana z zastosowaniem międzylaboratoryjnego wzorca referencyjnego (dodatek 7). Stosunek oczekiwanego stężenia do zmierzonego stężenia zostanie odnotowany wraz z wynikami każdego zbioru badań przeprowadzonych w danym dniu.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Ocena reakcji biomarkerów za pomocą analizy wariancji (ANOVA)
46. W celu zidentyfikowania potencjalnego działania substancji chemicznej zaburzającego funkcjonowanie układu hormonalnego porównuje się reakcje grup badanych i grup kontrolnych z zastosowaniem analizy wariancji (ANOVA). W przypadku wykorzystania próby kontrolnej z rozpuszczalnikiem należy przeprowadzić odpowiedni test statystyczny dla próby kontrolnej z wodą rozcieńczającą i próby kontrolnej z rozpuszczalnikiem w odniesieniu do każdego punktu końcowego. Wytyczne na temat wykorzystania danych dotyczących próby kontrolnej z wodą rozcieńczającą i próby kontrolnej z rozpuszczalnikiem w późniejszej analizie statystycznej można znaleźć w OECD, 2006c (27). Wszystkie dane na temat reakcji biologicznej należy analizować i odnotowywać oddzielnie dla każdej płci. Jeśli wymagane założenia dotyczące metod parametrycznych nie zostaną spełnione - rozkład nienormalny (np. test Shapiro-Wilka) lub niejednorodna wariancja (test Bartletta lub Levene'a), należy rozważyć przekształcenie danych w celu ujednorodnienia wariancji przed przeprowadzeniem ANOVA lub ważonej ANOVA. W przypadku niemonotonicznej zależności dawka-odpowiedź można zastosować test Dunnetta (parametryczny) wielokrotnych porównań w parach lub test Manna-Whitneya z korektą Bonferroniego (nieparametryczny). Inne testy statystyczne (np. test Jonckheere'a-Terpstry lub test Williamsa) można zastosować, jeżeli zależność dawka-odpowiedź jest w przybliżeniu monotoniczna. W dodatku 8 przedstawiono schemat statystyczny, który ma pomóc w wyborze najodpowiedniejszego testu statystycznego. Dodatkowe informacje można również znaleźć w dokumencie OECD "Document on Current Approaches to Statistical Analysis of Ecotoxicity Data" (27).
Sprawozdania z wyników testów
47. Dane uzyskane w ramach badania powinny obejmować poniższe informacje. Placówka badawcza:
- informacje na temat odpowiedzialnych pracowników i ich obowiązków w zakresie badań;
- każde laboratorium powinno wykazać się biegłością w stosowaniu szeregu reprezentatywnych substancji chemicznych.
Badana substancja chemiczna:
- charakterystyka badanej substancji chemicznej;
- właściwości fizyczne i stosowne właściwości fizykochemiczne;
- metody i częstotliwość przygotowywania badanych stężeń;
- informacje dotyczące stabilności i biodegradowalności. Rozpuszczalnik:
- charakterystyka rozpuszczalnika (charakter, wykorzystane stężenie);
- uzasadnienie wyboru rozpuszczalnika (jeśli jest inny niż woda). Zwierzęta użyte do badania:
- gatunek i szczep;
- dostawca i określony zakład dostawcy;
- wiek ryb na początku badania i stan reprodukcyjny/okres tarła;
- szczegóły dotyczące procedur aklimatyzacji zwierząt;
- masa ciała ryb na początku okresu narażenia (na podstawie podpróbki ze stada ryb). Warunki badania:
- zastosowana procedura badawcza (rodzaj badania, wskaźnik obciążenia, obsada itd.);
- metoda przygotowania roztworów podstawowych i natężenie przepływu;
- badane stężenia nominalne, cotygodniowo mierzone stężenia roztworów do badań i zastosowana metoda analityczna, średnie wartości pomiarowych oraz ich odchylenia standardowe w naczyniach badawczych, a także dowody świadczące o tym, że pomiary odnoszą się do stężeń badanej substancji chemicznej w prawdziwym roztworze;
- charakterystyka wody rozcieńczającej (w tym pH, twardość, zasadowość, temperatura, stężenie rozpuszczonego tlenu, poziom chloru resztkowego, całkowity węgiel organiczny, zawiesina i wszelkie inne wykonane pomiary);
- jakość wody w naczyniach badawczych: pH, twardość, temperatura i stężenie rozpuszczonego tlenu;
- szczegółowe informacje dotyczące karmienia (np. rodzaj pokarmu, jego źródło, podana ilość i częstotliwość podawania oraz analiza pod kątem odpowiednich zanieczyszczeń (np. PCB, WWA oraz pestycydów chloroorganicznych), jeżeli jest dostępna.
Wyniki:
- dowód, że próby kontrolne spełniają kryteria akceptacji badania;
- dane na temat śmiertelności występującej w jakimkolwiek z badanych stężeń i jakiejkolwiek próbie kontrolnej;
- zastosowane techniki statystyczno-analityczne, przetwarzanie danych i uzasadnienie zastosowanych technik;
- dane dotyczące biologicznych obserwacji morfologii makroskopowej, z uwzględnieniem drugorzędnych cech płciowych i witellogeniny;
- wyniki analiz danych, przedstawione najlepiej w formie tabelarycznej i graficznej;
- przypadki wszystkich nietypowych reakcji ryb i wszystkie widoczne efekty spowodowane przez badaną substancję chemiczną.
WYTYCZNE DOTYCZĄCE INTERPRETACJI I AKCEPTACJI WYNIKÓW BADANIA
48. W niniejszej części przedstawiono kilka kwestii, które należy uwzględnić przy interpretacji wyników badania w odniesieniu do różnych zmierzonych punktów końcowych. Wyniki te należy interpretować ostrożnie, ilekroć wydaje się, że badana substancja chemiczna powoduje widoczną toksyczność lub wpływa na ogólny stan badanego zwierzęcia.
49. Ustalając zakres badanych stężeń, należy dołożyć starań, aby nie przekroczyć maksymalnego tolerowanego stężenia i umożliwić miarodajną interpretację danych. Ważne jest, aby otrzymać co najmniej jedną próbę poddaną zabiegowi, w której nie ma oznak skutków toksycznych. Oznaki choroby i skutków toksycznych należy dokładnie ocenić i odnotować. Możliwe jest na przykład, że na wytwarzanie VTG u samic mogą również wpływać ogólna toksyczność i niehormonalne sposoby działania toksycznego, np. hepatotoksyczność. Interpretację skutków mogą jednak wzmocnić inne poziomy zabiegu, których nie zakłóci toksyczność ogólnoustrojowa.
50. Istnieje kilka aspektów, które należy rozważyć do celów akceptacji wyników badania. Jako wytyczną można przyjąć, że poziomy VTG w grupach kontrolnych samców i samic powinny być odmienne i powinny się różnić o około trzy rzędy wielkości w przypadku Pimephales promelas i danio pręgowanego oraz o około jeden rząd wielkości w przypadku ryżanki. Przykłady zakresu wartości osiąganych w grupach kontrolnych i badanych są dostępne w sprawozdaniach z weryfikacji (1, 2, 3, 4). Wysokie wartości VTG u samców w grupie kontrolnej mogą zakłócić czułość badania i jego zdolność do wykrywania słabych agonistów estrogenu. Niskie wartości VTG u samic w próbie kontrolnej mogą zakłócić czułość badania i jego zdolność do wykrywania inhibitorów aromatazy i agonistów estrogenu. Do opracowania tej wytycznej wykorzystano badania weryfikacyjne.
51. Jeżeli laboratorium nie przeprowadzało jeszcze takiego badania albo wprowadzono istotne zmiany w badaniu (takie jak zmiana gatunku lub dostawcy ryb), zaleca się przeprowadzenie badania biegłości technicznej. Zaleca się stosowanie substancji chemicznych, które mają wiele różnych sposobów działania lub wpływają na wiele punktów końcowych badania. W praktyce zachęca się każde laboratorium do zgromadzenia własnych historycznych danych kontrolnych w odniesieniu do samców i samic oraz do przeprowadzenia kontroli dodatniej pod kątem działania estrogennego (np. 17β-estradiolu w stężeniu 100 ng/l lub znanego słabego agonisty), które prowadzi do podwyższenia poziomu VTG u samców ryb, kontroli dodatniej pod kątem zahamowania aromatazy (np. fadrozolu lub prochlorazu w stężeniu 300 µg/l), które prowadzi do zmniejszenia poziomu VTG u samic ryb, oraz kontroli dodatniej pod kątem działania androgennego (np. 17β-trenbolonu w stężeniu 5 µg/l), które prowadzi do wykształcenia drugorzędnych cech płciowych u samicy Pimephales promelas i ryżanki. Aby zagwarantować biegłość laboratorium, wszystkie te dane można porównać z danymi dostępnymi z badań weryfikacyjnych (1, 2, 3).
52. Zasadniczo pomiary witellogeniny należy uznać za dodatnie, jeżeli występuje statystycznie istotny wzrost poziomu VTG u samców (p < 0,05) lub statystycznie istotny spadek poziomu u samic (p < 0,05) przynajmniej przy najwyższej badanej dawce w porównaniu z grupą kontrolną i przy braku oznak ogólnej toksyczności. Wynik dodatni jest poparty ponadto wykazaniem biologicznie wiarygodnej zależności między dawką a krzywą odpowiedzi. Jak już wspomniano, spadek poziomu witellogeniny może nie mieć wyłącznie hormonalnego pochodzenia; wynik dodatni należy jednak zasadniczo interpretować jako dowód na działanie zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego in vivo i powinien on zwykle stanowić bodziec do podjęcia działań w celu dalszego wyjaśnienia.
BIBLIOGRAFIA
(1) OECD (2006a). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1A). Publikacje OECD na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, Seria OECD dotycząca badań i oceny, nr 60, ENV/JM/MONO(2006)27.
(2) OECD (2006b). Report of the Initial Work Towards the Validation of the 21-Day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine active Substances (Phase 1 B). Publikacje OECD na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, Seria OECD dotycząca badań i oceny, nr 61, ENV/JM/MONO(2006)29.
(3) OECD (2007). Final report of the Validation of the 21-day Fish Screening Assay for the Detection of Endocrine Active Substances. Phase 2: Testing Negative Substances. Publikacje OECD na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, Seria OECD dotycząca badań i oceny, nr 78, ENV/JM/MONO(2007)25.
(4) Owens JW (2007). Phase 3 report of the validation of the OECD Fish Screening Assay. CEFIC LRI Project, Endocrine. http://www.cefic-lri.org/index.php?page=projects (18/09/08).
(5) Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych 2007. Validation of the Fish Short-Term Reproduction Assay: Integrated Summary Report. Nieopublikowane sprawozdanie z dnia 15 grudnia 2007 r. Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych, Waszyngton DC. 104 s.
(6) OECD, 2008. Report of the Validation Peer Review for the 21-Day Fish Endocrine Screening Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. Publikacje OECD na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, Seria OECD dotycząca badań i oceny, nr 94, ENV/JM/MONO(2008)21.
(7) Sumpter i Jobling (1995). Vitellogenesis as a biomarker for estrogenic contamination of the aquatic environment. Environmental Health Perspectives;103 suplement 7:173-8 Review.
(8) Pawlowski S, Sauer A, Shears JA, Tyler CR, Braunbeck T (2004). Androgenic and estrogenic effects of the synthetic androgen 17alpha-methyltestosterone on sexual development and reproductive performance in the fathead minnow (Pimephales promelas) determined using the gonadal recrudescence assay. Aquatic Toxicology; 68 (3):277-91.
(9) Andersen L, Goto-Kazato R, Trant JM, Nash JP, Korsgaard B, Bjerregaard P (2006). Short-term exposure to low concentrations of the synthetic androgen methyltestosterone affects vitellogenin and steroid levels in adult male zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology; 76(3-4):343-52.
(10) Ankley GT, Kahl MD, Jensen KM, Hornung MW, Korte JJ, Makynen EA, Leino RL (2002). Evaluation of the aromatase inhibitor fadrozole in a short-term reproduction assay with the fathead minnow (Pimephales promelas). Toxicological Sciences; 67(1):121-30.
(11) Panter GH, Hutchinson TH, Hurd KS, Sherren A, Stanley RD, Tyler CR (2004). Successful detection of (anti-) androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development. Aquatic Toxicology; 70(1):11-21.
(12) Parks LG, Cheek AO, Denslow ND, Heppell SA, McLachlan JA, LeBlanc GA, Sullivan CV (1999). Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 123(2):113-25.
(13) Panter GH, Tyler CR, Maddix S, Campbell PM, Hutchinson TH, Länge R, Lye C, Sumpter JP, 1999. Application of an ELISA to quantify vitellogenin concentrations in fathead minnows (Pimephales promelas) exposed to endocrine disrupting chemicals. CEFIC-EMSG odniesienie do raportu z badania AQ001. CEFIC, Bruksela, Belgia.
(14) Fenske M., van Aerle, R.B., Brack, S.C., Tyler, C.R., Segner, H., (2001). Development and validation of a homologous zebrafish (Danio rerio Hamilton- Buchanan) vitellogenin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and its application for studies on estrogenic chemicals. Comp. Biochem. Phys. C 129 (3): 217-232.
(15) Holbech H, Andersen L, Petersen GI, Korsgaard B, Pedersen KL, Bjerregaard P. (2001). Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio). Comparative Biochemistry and Physiology. Part C Pharmacology, toxicology and endocrinology; 130: 119-131.
(16) Rose J, Holbech H, Lindholst C, Noerum U, Povlsen A, Korsgaard B, Bjerregaard P. 2002. Vitellogenin induction by 17β-estradiol and 17β-ethinylestradiol in male zebrafish (Danio rerio). Comp. Biochem. Physiol. C. 131: 531-539.
(17) Brion F, Nilsen BM, Eidem JK, Goksoyr A, Porcher JM, Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology and Chemistry; tom 21: 1699-1708.
(18) Yokota H, Morita H, Nakano N, Kang IJ, Tadokoro H, Oshima Y, Honjo T, Kobayashi K., 2001. Development of an ELISA for determination of the hepatic vitellogenin in Medaka (Oryzias latipes). Jpn J Environ Toxicol 4:87- 98.
(19) Tatarazako N, Koshio M, Hori H, Morita M i Iguchi T., 2004. Validation of an enzyme-linked immunosorbent assay method for vitellogenin in the Medaka. Journal of Health Science 50:301-308.
(20) Ankley GT, Jensen KM, Makynen EA, Kahl MD, Korte JJ, Homung MW, Henry TR, Denny JS, Leino RL, Wilson VS, Cardon MC, Hartig PC, Gray LE (2003). Effects of the androgenic growth promoter 17-beta-trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environmental Toxicology and Chemistry; 22 (6): 1350-60.
(21) Seki M, Yokota H, Matsubara H, Maeda M, Tadokoro H, Kobayashi K (2004). Fish full life-cycle testing for androgen methyltestosterone on medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry; 23 (3):774-81.
(22) OECD (2000) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Publikacje na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa. Seria dotycząca badań i oceny. nr 23. Paryż.
(23) Hutchinson TH, Shillabeer N, Winter MJ, Pickford DB, 2006a. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Review. Aquatic Toxicology, 76; s. 69-92.
(24) Hutchinson TH, Ankley GT, Segner H, Tyler CR, 2006b. Screening and testing for endocrine disruption in fish-biomarkers as "signposts," not "traffic lights", in risk assessment. Environmental Health Perspectives;114 Suppl 1:106-14.
(25) Miles-Richardson, SR, Kramer VJ, Fitzgerald SD, Render JA, Yamini B, Barbee SJ, Giesy JP. 1999. Effects of waterborne exposure to 17β-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of the fathead minnow (Pimephales promelas). Aquat. Toxicol. 47, 129-145.
(26) Martinovic, D., L.S. Blake, E.J. Durhan, K.J. Greene, M.D. Kahl, K.M., Jensen, E.A. Makynen, D.L. Villeneuve i G.T. Ankley. 2008. Characterization of reproductive toxicity of vinclozolin in the fathead minnow and co-treatment with an androgen to confirm an anti-androgenic mode of action. Environ. Toxicol. Chem. 27, 478-488.
(27) OECD (2006c). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Publikacje OECD na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, Seria OECD dotycząca badań i oceny, nr 54. ENV/JM/MONO(2006)18.
(28) OECD (2012) OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupters (zmieniony). Annex I to Draft Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. Seria OECD dotycząca badań i oceny, nr 150. ENV/JM/MONO(2012)22.
Dodatek 1
Skróty i definicje
Substancja chemiczna: substancja lub mieszanina.
CV: współczynnik zmienności.
ELISA: test immunoenzymatyczny.
Wskaźnik obciążenia: mokra masa ryb na objętość wody.
Obsada: liczba ryb na objętość wody.
VTG (witellogenina): fosfolipidoglikoproteinowy prekursor białek żółtka jajka występujący zwykle u aktywnych płciowo samic wszystkich gatunków jajorodnych.
Oś HPG: oś podwzgórze-przysadka-gonady.
MTC: maksymalne tolerowane stężenie, stanowiące około 10 % LC50.
Badana substancja chemiczna: dowolna substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.
Dodatek 2
Warunki doświadczalne badania przesiewowego układu hormonalnego ryb
| 1. Zalecany gatunek | (Pimephales promelas) | Ryżanka japońska (Oryzias latipes) | Danio pręgowany (Danio rerio) |
| 2. Rodzaj badania | Przepływowe | Przepływowe | Przepływowe |
| 3. Temperatura wody | 25 ± 2 °C | 25 ± 2 °C | 26 ± 2 °C |
| 4. Jakość oświetlenia | Fluorescencyjne żarówki (szerokie spektrum) | Fluorescencyjne żarówki (szerokie spektrum) | Fluorescencyjne żarówki (szerokie spektrum) |
| 5. Natężenie światła | 10-20 µE/m2/s, 540-1 000 luksów lub 50-100 ft-c (poziomy w laboratoryjnych warunkach otoczenia) | 10-20 µE/m2/s, 540-1 000 luksów lub 50-100 ft-c (poziomy w laboratoryjnych warunkach otoczenia) | 10-20 µE/m2/s, 540-1 000 luksów lub 50-100 ft-c (poziomy w laboratoryjnych warunkach otoczenia) |
| 6. Fotoperiod (fazy brzasku/zmierzchu są fakultatywne, nie są jednak uważane za niezbędne) | 16 godzin światła, 8 godzin bez dostępu światła | 12-16 godzin światła, 12- 8 godzin bez dostępu światła | 12-16 godzin światła, 12-8 godzin bez dostępu światła |
| 7. Wskaźnik obciążenia | < 5 g na l | < 5 g na l | < 5 g na l |
| 8. Wielkość komory badawczej | 10 l (minimum) | 2 l (minimum) | 5 l (minimum) |
| 9. Objętość roztworu do badań | 8 l (minimum) | 1,5 l (minimum) | 4 l (minimum) |
| 10. Wymiana objętości roztworów do badań | Minimum 6 razy dziennie | Minimum 5 razy dziennie | Minimum 5 razy dziennie |
| 11. Wiek organizmów użytych do badania | Zob. pkt 20 | Zob. pkt 20 | Zob. pkt 20 |
| 12. Przybliżona mokra masa dorosłych ryb (g) | Samice: 1,5 ± 20 % Samce: 2,5 ± 20 % | Samice: 0,35 ± 20 % Samce: 0,35 ± 20 % | Samice: 0,65 ± 20 % Samce: 0,4 ± 20 % |
| 13. Liczba ryb na naczynie badawcze | 6 (2 samce i 4 samice) | 10 (5 samców i 5 samic) | 10 (5 samców i 5 samic) |
| 14. Liczba zabiegów | = 3 (oraz odpowiednie próby kontrolne) | = 3 (oraz odpowiednie próby kontrolne) | = 3 (oraz odpowiednie próby kontrolne) |
| 15. Liczba naczyń na zabieg | Minimum 4 | Minimum 2 | Minimum 2 |
| 16. Liczba ryb na badane stężenie | 16 dorosłych samic i 8 samców (4 samice i 2 samce w każdym naczyniu z kontrpróbą) | 10 dorosłych samic i 10 samców (5 samic i 5 samców w każdym naczyniu z kontrpróbą) | 10 dorosłych samic i 10 samców (5 samic i 5 samców w każdym naczyniu z kontrpróbą) |
| 17. Schemat żywienia | Żywe lub zamrożone dorosłe solowce lub naupliusy dwa lub trzy razy dziennie (bez ograniczeń), pokarm dostępny na rynku lub połączenie obu wariantów | Naupliusy solowca dwa lub trzy razy dziennie (bez ograniczeń), pokarm dostępny na rynku lub połączenie obu wariantów | Naupliusy solowca dwa lub trzy razy dziennie (bez ograniczeń), pokarm dostępny na rynku lub połączenie obu wariantów |
| 18. Napowietrzanie | Bez napowietrzania dopóki stężenie rozpuszczonego tlenu (DO) nie spadnie poniżej 60 % nasycenia | Bez napowietrzania dopóki stężenie rozpuszczonego tlenu (DO) nie spadnie poniżej 60 % nasycenia | Bez napowietrzania dopóki stężenie rozpuszczonego tlenu (DO) nie spadnie poniżej 60 % nasycenia |
| 19. Woda rozcieńczająca | Czysta woda powierzchniowa, woda ze studni lub regenerowana lub odchlorowana woda wodociągowa | Czysta woda powierzchniowa, woda ze studni lub regenerowana lub odchlorowana woda wodociągowa | Czysta woda powierzchniowa, woda ze studni lub regenerowana lub odchlorowana woda wodociągowa |
| 20. Okres poprzedzający narażenie | Zaleca się 7 dni | Zaleca się 7 dni | Zaleca się 7 dni |
| 21. Czas trwania narażenia na substancję chemiczną | 21 dni | 21 dni | 21 dni |
| 22. Biologiczne punkty końcowe | przeżywalność zachowanie drugorzędne cechy płciowe VTG | przeżywalność zachowanie drugorzędne cechy płciowe VTG | przeżywalność zachowanie VTG |
| 23. Akceptowalność badania | Rozpuszczony tlen > 60 % nasycenia; średnia temperatura 25 ± 2 °C; 90 % przeżywalności ryb w próbach kontrolnych; zmierzone badane stężenia w granicach 20 % średnich zmierzonych wartości na każdy poziom zabiegowy. | Rozpuszczony tlen > 60 % nasycenia; średnia temperatura 24 ± 2 °C; 90 % przeżywalności ryb w próbach kontrolnych; zmierzone badane stężenia w granicach 20 % średnich zmierzonych wartości na każdy poziom zabiegowy. | Rozpuszczony tlen > 60 % nasycenia; średnia temperatura 26 ± 2 °C; 90 % przeżywalności ryb w próbach kontrolnych; zmierzone badane stężenia w granicach 20 % średnich zmierzonych wartości na każdy poziom zabiegowy. |
Dodatek 3
Niektóre właściwości chemiczne dopuszczalnej wody rozcieńczającej
| Składnik | Stężenia |
| Cząstki stałe | < 20 mg/l |
| Całkowity węgiel organiczny | < 2 mg/l |
| Niezjonizowany amoniak | < 1 µg/l |
| Chlor resztkowy | < 10 µg/l |
| Pestycydy fosforoorganiczne ogółem | < 50 ng/l |
| Całkowita zawartość pestycydów chloroorganicznych plus polichlorowanych bifenyli | < 50 ng/l |
| Całkowity chlor organiczny | < 25 ng/l |
Dodatek 4a
Podłoże tarłowe dla danio pręgowanego
Tacka na ikrę: naczynie na narzędzia w całości wykonane ze szkła na przykład o wymiarach 22 × 15 × 5,5 cm (D × S × W), przykryte zdejmowaną pokrywą z siatki z drutu ze stali nierdzewnej (oczka o średnicy 2 mm). Siatka powinna przykrywać naczynie na narzędzia tak, aby zachodziła poniżej krawędzi.
Do siatki należy przymocować podłoże tarłowe. Powinno ono stworzyć strukturę, w którą mogą wpłynąć ryby. Odpowiednie są na przykład sztuczne rośliny akwariowe wykonane z zielonego tworzywa sztucznego (uwaga: należy uwzględnić możliwą adsorpcję badanej substancji chemicznej do tworzywa sztucznego). Należy wypłukać tworzywo sztuczne w wystarczającej ilości ciepłej wody przez wystarczająco długi czas, aby upewnić się, że żadne substancje chemiczne nie zostaną uwolnione do wody wykorzystanej do badania. W przypadku zastosowania materiałów szklanych należy dopilnować, aby ryby nie odniosły obrażeń ani nie były stłoczone w trakcie aktywności tarłowej.
Odległość między tacką i szklanymi szybkami powinna wynosić co najmniej 3 cm, aby mieć pewność, że tarło nie odbywa się poza tacą. Komórki jajowe złożone na tackę spadają przez siatkę i po upływie 45-60 minut od rozpoczęcia naświetlania można pobrać próbki. Przezroczyste komórki jajowe nie są lepkie i można je łatwo policzyć, używając światła poprzecznego. Jeżeli zastosowano pięć samic na naczynie, liczebność komórek jajowych na poziomie do 20 dziennie można uznać za niską, do 100 za średnią i powyżej 100 za wysoką. Tackę na ikrę należy wyjąć, zebrać komórki jajowe, a następnie ponownie umieścić tackę w naczyniu badawczym jak najpóźniej wieczorem albo bardzo wcześnie rano. Czas do ponownego umieszczenia tacki nie powinien przekraczać jednej godziny, w przeciwnym razie bodźce z podłoża tarłowego mogą wywołać indywidualne tarło i złożenie ikry w nietypowym czasie. Jeżeli okoliczności wymagają późniejszego wprowadzenia tacki na ikrę, należy to zrobić co najmniej 9 godzin po rozpoczęciu naświetlania. O tak później porze dnia nie można już wywołać tarła.
Dodatek 4B
Podłoże tarłowe dla Pimephales promelas
Dwie lub trzy połączone płytki i tacki na ikrę wykonane z tworzywa sztucznego, ceramiczne, szklane lub ze stali nierdzewnej umieszcza się w każdej komorze badawczej (np. szara półkolista rynna o długości 80 mm umieszczona na tacce z wygiętymi krawędziami o długości 130 mm) (zob. rysunek). Wykazano, że na podłoże tarłowe nadają się odpowiednio przygotowane płytki z polichlorku winylu lub ceramiczne (Thorpe i in., 2007).
Zaleca się, aby płytki były oszlifowane, w celu zapewnienia lepszej przyczepności. Tacka powinna być również osłonięta, aby ryby nie miały dostępu do złożonej ikry, chyba że wykazano wysoką przyczepność zastosowanego podłoża tarłowego dla ikry.
Podstawę zaprojektowano tak, aby pomieściła wszystkie komórki jajowe, które nie przyczepią się do powierzchni płytki i w związku z tym spadłyby na dno zbiornika (lub komórki jajowe złożone bezpośrednio na płaską podstawę z tworzywa sztucznego). Przed zastosowaniem wszystkie podłoża tarłowe należy płukać przez co najmniej 12 godzin w wodzie rozcieńczającej.
BIBLIOGRAFIA
Thorpe KL, Benstead R, Hutchinson TH, Tyler CR, 2007. An optimised experimental test procedure for measuring chemical effects on reproduction in the fathead minnow, Pimephales promelas. Aquatic Toxicology, 81, 90-98.
Dodatek 5 A
Ocena drugorzędnych cech płciowych u Pimephales promelas w celu wykrycia określonych substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego
Zarys ogólny
Potencjalnie istotne cechy wyglądu fizycznego osobników dorosłych Pimephales promelas w badaniu substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego obejmują zabarwienie ciała (tj. jasne/ciemne), wzór zabarwienia (tj. występowanie lub brak pionowych pręg), kształt ciała (tj. kształt głowy i obszaru piersiowego, wydęcie jamy brzusznej) i wyspecjalizowane drugorzędne cechy płciowe (tj. liczba i wielkość guzków godowych, wielkość wyściółki tłuszczowej na grzbiecie i pokładełka).
Guzki godowe znajdują się na głowie (wyściółce grzbietowej) aktywnych rozrodczo samców Pimephales promelas i zwykle układają się w dwustronny symetryczny wzór (Jensen i in. 2001). Samice z próby kontrolnej oraz młodociane samce i samice nie wykształcają guzków (Jensen i in. 2001). Wokół oczu i między nozdrzami samców może występować do ośmiu pojedynczych guzków. Największa liczba guzków i największe guzki są rozmieszczone w dwóch równoległych liniach tuż poniżej nozdrzy i powyżej otworu gębowego. U wielu ryb skupiska guzków występują poniżej dolnej szczęki; te, które znajdują się najbliżej otworu gębowego, zwykle występują jako pojedyncza para, zaś te znajdujące się bliżej brzucha mogą obejmować do czterech guzków. Faktyczna liczba guzków rzadko wynosi więcej niż 30 (zakres: 18-28, Jensen i in. 2001). Dominujące guzki (pod względem liczby) pojawiają się jako pojedyncze, relatywnie okrągłe struktury o wysokości w przybliżeniu równej promieniowi. U większości aktywnych rozrodczo samców przynajmniej niektóre guzki są powiększone i wyraźniejsze, tak że nie da się ich odróżnić jako pojedynczych struktur.
Niektóre rodzaje substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego mogą powodować nietypowe pojawianie się drugorzędnych cech płciowych u zwierząt przeciwnej płci; na przykład substancje będące agonistami receptorów androgenowych, takie jak 17β-metylotestosteron lub 17β-trenbolon mogą spowodować powstawanie guzków godowych u samic Pimephales promelas (Smith 1974; Ankley i in. 2001; 2003), zaś agonisty receptorów estrogenu mogą obniżać liczbę guzków godowych u samców (Miles-Richardson i in. 1999; Harries i in. 2000).
Poniżej znajduje się opis charakterystyki guzków godowych u Pimephales promelas opracowany na podstawie procedur stosowanych w laboratorium amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska w Duluth w stanie Minnesota. Poszczególne produkty lub sprzęt można zastąpić dostępnymi porównywalnymi materiałami.
Najlepszy ogląd otrzymuje się, stosując podświetlane szkło powiększające lub mikroskop stereoskopowy 3X z podświetleniem. Ryby należy oglądać od strony grzbietowej i od przodu (głową w kierunku oglądającego).
a) Umieścić rybę na małej szalce Petriego (np. o średnicy 100 mm), głową do przodu i brzuchem do dołu. Ustawić wizjer tak, aby umożliwić identyfikację guzków. Delikatnie i powoli przekręcać rybę z jednej strony na drugą, aby zidentyfikować obszary z guzkami. Policzyć i ocenić guzki.
b) Powtórzyć obserwację na powierzchni głowy po stronie brzusznej, umieszczając rybę na szalce Petriego na grzbiecie, głową do przodu.
c) Obserwacje każdej ryby powinny trwać do 2 minut.
Liczenie i ocena guzków
Zidentyfikowano sześć konkretnych obszarów do oceny występowania i rozwoju guzków u osobników dorosłych Pimephales promelas. Opracowano szablon do określenia miejsca i liczby występujących guzków (zob. część końcowa niniejszego dodatku). Odnotowuje się liczbę guzków, a ich wielkość można ocenić ilościowo dla każdego organizmu w następujący sposób: 0 - brak, 1 - występują, 2 - powiększone i 3 - wyraźne (rys. 1).
Ocena 0 - brak jakichkolwiek guzków. Ocena 1 - występują; identyfikacja jakichkolwiek guzków z pojedynczym punktem, którego wysokość jest niemal równa promieniowi (średnicy). Ocena 2 - powiększone; identyfikacja tkanki przypominającej wyglądem gwiazdkę, zwykle mające duży promień podstawy oraz wyżłobienia lub bruzdy wychodzące ze środka. Wysokość guzka jest zwykle bardziej nieregularna, czasami może on być jednak lekko zaokrąglony. Ocena 3 - wyraźne; guzki są zwykle dość duże i zaokrąglone, o mniej określonej strukturze. Niekiedy guzki będą występowały razem, tworząc jednolitą masę wzdłuż jednego obszaru lub kilku obszarów (B, C i D, opisane poniżej). Zabarwienie i wzór są podobne jak w ocenie 2, czasami jednak trudno je rozróżnić. Zastosowanie tego systemu oceny zwykle prowadzi do otrzymania łącznej oceny guzków wynoszącej < 50 u normalnych samców z próby kontrolnej posiadających 18-20 guzków (Jensen i in. 2001).
Rysunek 1
Faktyczna liczba guzków u niektórych ryb może być większa niż liczba rubryk w szablonie (dodatek A) dla danego obszaru oceny. Jeżeli tak się stanie, dodatkowe punkty oceny można zaznaczyć w rubryce lub na prawo lub na lewo od niej. Szablon nie musi być zatem symetryczny. Dodatkową techniką mapowania guzków, które są połączone w pary lub połączone pionowo wzdłuż poziomej płaszczyzny otworu gębowego, może być podwójne zaznaczanie dwóch punktów oceny guzków w jednej rubryce.
Obszary oznaczania:
A - Guzki zlokalizowane wokół oka. Oznaczanie od strony grzbietowej do strony brzusznej wokół przedniej krawędzi oka. Licznie i powszechnie występują u dorosłych samców z próby kontrolnej, nie występują u samic z próby kontrolnej, a u samic narażonych na działanie androgenów zwykle występują w parach (po jednej w pobliżu każdego oka) lub pojedynczo.
B - Guzki zlokalizowane między nozdrzami (porami kanałów sensorycznych). Zwykle występują w parach u samców z próby kontrolnej na wyższych poziomach (2 - powiększone lub 3 - wyraźne). Nie występują u samic z próby kontrolnej, u samic narażonych na działanie androgenów występują i rozwijają się w pewnym stopniu.
C - Guzki zlokalizowane bezpośrednio z przodu nozdrzy, równolegle do otworu gębowego. Zwykle są powiększone lub wyraźne u dojrzałych samców z próby kontrolnej. Występują lub są powiększone u mniej rozwiniętych samców lub samic poddanych działaniu androgenów.
D - Guzki zlokalizowane równolegle wzdłuż linii otworu gębowego. Zwykle oceniane jako rozwinięte u samców z próby kontrolnej. Brak u samic z próby kontrolnej, ale występują u samic narażonych na działanie androgenów.
E - Guzki zlokalizowane na dolnej szczęce, w pobliżu otworu gębowego, zwykle niewielkie i często występujące w parach. Różne u samców z próby kontrolnej lub badanej i samic z próby badanej.
F - Guzki zlokalizowane po stronie brzusznej w kierunku E. Zwykle małe i występujące w parach. Występują u samców z próby kontrolnej i samic poddanych działaniu androgenów.
BIBLIOGRAFIA
(1) Ankley GT, Jensen KM, Kahl MD, Korte JJ, Makynen ME. 2001. Description and evaluation of a short-term reproduction test with the fathead minnow (Pimephales promelas). Environ Toxicol Chem 20:1276-1290.
(2) Ankley GT, Jensen KM, Makynen EA, Kahl MD, Korte JJ, Hornung MW, Henry TR, Denny JS, Leino RL, Wilson VS, Cardon MC, Hartig PC, Gray EL. 2003. Effects of the androgenic growth promoter 17-β trenbolone on fecundity and reproductive endocrinology of the fathead minnow. Environ Toxicol Chem 22:1350-1360.
(3) Harries JE, Runnalls T, Hill E, Harris CA,Maddix S, Sumpter JP, Tyler CR. 2000. Development of a reproductive performance test for endocrine disrupting chemicals using pair-breeding fathead minnows (Pimephales promelas). Environ Sci Technol 34:3003-3011.
(4) Jensen KM, Korte JJ, Kahl MD, Pasha MS, Ankley GT. 2001. Aspects of basic reproductive biology and endocrinology in the fathead minnow (Pimephales promelas). Comp Biochem Physiol C 128:127-141.
(5) Kahl MD, Jensen KM, Korte JJ, Ankley GT. 2001. Effects of handling on endocrinology and reproductive performance of the fathead minnow. J Fish Biol 59:515-523.
(6) Miles-Richardson SR, Kramer VJ, Fitzgerald SD, Render JA, Yamini B, Barbee SJ, Giesy JP. 1999. Effects of waterborne exposure of 17-estradiol on secondary sex characteristics and gonads of fathead minnows (Pimephales promelas). Aquat Toxicol 47:129-145.
(7) Smith RJF. 1974. Effects of 17-methyltestosterone on the dorsal pad and tubercles of fathead minnows (Pimephales promelas). Can J Zool 52:1031-1038.
Szablon dot. guzków Skala numeryczna
Nr __________ 1 - występują
Data __________ 2 - powiększone
Suma ocen __________ 3 - wyraźne
| A | X1 | X1 | X1 | X1 | |||||||
| B | X1 | X1 | X1 | X1 | |||||||
| C | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | |
| D | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 | X1 |
| E | X1 | X1 | ||||||||
| F | X1 | X1 | X1 | X1 |
Dodatek 5 B
Ocena drugorzędnych cech płciowych u ryżanki w celu wykrycia określonych substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego
Poniżej opisano procedurę pomiaru procesów tworzenia się brodawek (*), które stanowią drugorzędne cechy płciowe u ryżanki (Oryzias latipes).
(*) Procesy tworzenia się brodawek zwykle zachodzą wyłącznie u dorosłych samców na promieniach płetw od drugiego do siódmego lub ósmego, licząc od tylnego końca płetwy odbytowej (rys. 1 i 2). Procesy te rzadko zachodzą jednak na pierwszym promieniu płetwy od tylnego końca płetwy odbytowej. Niniejsza standardowa procedura operacyjna obejmuje pomiar procesów na pierwszym promieniu płetwy (numer promienia płetwy w niniejszej procedurze odpowiada ich kolejności, począwszy od tylnego końca płetwy odbytowej).
1) Po wycięciu wątroby (dodatek 6) zwłoki umieszcza się w probówce stożkowej zawierającej około 10 ml 10 % obojętnej buforowanej formaliny (głową do góry i ogonem do dołu). Jeżeli gonada jest utrwalona w roztworze innym niż 10 % obojętna buforowana formalina, wykonać poprzeczne nacięcie zwłok między przednim obszarem płetwy odbytowej a odbytem za pomocą ostrza, uważając, aby nie uszkodzić gonopora i samej gonady (rys. 3). Umieścić ciało ryby od strony czaszki w roztworze utrwalającym w celu utrwalenia gonady, zaś stronę ogonową - w 10 % obojętnej buforowanej formalinie, jak opisano powyżej.
2) Po umieszczeniu ciała ryby w 10 % obojętnej buforowanej formalinie chwycić przedni obszar płetwy odbytowej pęsetą i złożyć ją na około 30 sekund, tak aby płetwa odbytowa pozostała otwarta. Chwytając płetwę odbytową pęsetą, ostrożnie złapać kilka promieni płetwy w przednim obszarze, uważając, aby nie zeskrobać procesów tworzenia się brodawek.
3) Po utrzymywaniu otwartej płetwy odbytowej przez około 30 sekund ciało ryby należy umieścić w 10 % obojętnej buforowanej formalinie w temperaturze pokojowej do czasu dokonania pomiaru procesów tworzenia się brodawek (pomiar należy przeprowadzić po utrwalaniu przez co najmniej 24 godziny).
Pomiar
1) Po utrwalaniu ciała ryby w 10 % obojętnej buforowanej formalinie przez co najmniej 24 godziny wyjąć zwłoki ryby z probówki stożkowej i wytrzeć formalinę bibułą filtracyjną (lub ręcznikiem papierowym).
2) Położyć rybę stroną brzuszną do góry. Następnie ostrożnie odciąć płetwę odbytową za pomocą małych nożyczek chirurgicznych (zaleca się odcięcie płetwy odbytowej wraz z niewielką ilością pterygioforu).
3) Chwycić przedni obszar odciętej płetwy odbytowej pęsetą i umieścić na szkiełku z kilkoma kroplami wody. Następnie przykryć płetwę odbytową szkiełkiem nakrywkowym. Należy zachować ostrożność, aby nie zeskrobać procesów tworzenia się brodawek podczas chwytania płetwy odbytowej pęsetą.
4) Policzyć płytki łączące, na których zachodzą procesy tworzenia się brodawek, za pomocą licznika pod mikroskopem biologicznym (mikroskopem dolnostolikowym lub odwróconym). Uznaje się, że zachodzą procesy tworzenia się brodawek, jeśli ich niewielkie skupisko jest widoczne na tylnym obrzeżu płytki łączącej. Zapisać liczbę płytek łączących, na których zachodzą procesy tworzenia się brodawek dla każdego promienia płetwy w karcie badania (np. pierwszy promień płetwy: 0, drugi promień płetwy: 10, trzeci promień płetwy: 12 itd.) i wpisać sumę tych liczb dla poszczególnych ryb do arkusza kalkulacyjnego Excel. W razie potrzeby zrobić zdjęcie płetwy odbytowej i policzyć na zdjęciu liczbę płytek łączących, na których zachodzą procesy tworzenia się brodawek.
5) Po dokonaniu pomiaru umieścić płetwę odbytową w probówce stożkowej opisanej w (1) i zachować.
Rys.1.
Schemat przedstawiający różnice w kształcie i wielkości płetwy odbytowej pomiędzy płciami. A - samiec, B - samica. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218.
Rys. 2
A - procesy zachodzące na płytkach łączących promienia płetwy odbytowej. J.P. - płytka łącząca (ang. joint plate); A.S. - przestrzeń między osiami (ang. axial space); P. - proces. B - tylny koniec promienia płetwy. Actinotrichia (Act.) znajdują się na zakończeniu. Oka, T. B., 1931. On the processes on the fin rays of the male of Oryzias latipes and other sex characters of this fish. J. Fac. Sci., Tokyo Univ., IV, 2: 209-218.
Rys. 3.
Zdjęcie ciała ryby przedstawiające miejsce odcięcia, w przypadku gdy gonada jest utrwalona w roztworze utrwalającym innym niż 10 % obojętna buforowana formalina. W takim przypadku pozostała część ciała zostanie odcięta pomiędzy przednim obszarem płetwy odbytowej a odbytem za pomocą ostrza (czerwony pasek); część ciała ryby z głową zostanie umieszczona w roztworze utrwalającym dla gonad, natomiast część ciała ryby z ogonem zostanie umieszczona w 10 % obojętnej buforowanej formalinie.
Dodatek 6
Zalecane procedury pobierania próbek do celów analizy witellogeniny
Należy starać się zapobiegać zanieczyszczeniu krzyżowemu między próbkami VTG pobranymi od samców i samic.
Procedura 1A: Pimephales promelas, pobieranie krwi z żyły/tętnicy ogonowej
Po znieczuleniu trzon ogona nacina się częściowo ostrzem skalpela i pobiera się krew z żyły/tętnicy ogonowej za pomocą kapilary mikrohematokrytowej powlekanej heparyną. Po pobraniu krwi szybko izoluje się osocze przez odwirowanie przy 15 000 g przez 3 minuty (lub ewentualnie przy 15 000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C). W razie potrzeby po odwirowaniu można oznaczyć hematokryt wyrażony w procentach. Następnie usuwa się osocze z kapilary mikrohematokrytowej i przechowuje w probówce do wirówki z 0,13 jednostki aprotyniny (inhibitor proteaz) w temperaturze - 80 °C, do czasu aż będzie można oznaczyć poziom witellogeniny. W zależności od wielkości Pimephales promelas (która jest zależna od płci) objętość osocza, jaką można pobrać, wynosi zwykle 5- 60 mikrolitrów na rybę (Jensen i in. 2001).
Procedura 1B: Pimephales promelas, pobieranie krwi z serca
Krew można również ewentualnie pobrać przez nakłucie serca za pomocą heparynizowanej strzykawki (1 000 jednostek heparyny na ml). Krew przenosi się następnie do probówek Eppendorfa (trzymanych na lodzie) a następnie odwirowuje (5 min, 7 000 g, temperatura pokojowa). Osocze należy przenieść do czystych probówek Eppendorfa (w podwielokrotnościach, jeżeli pozwala na to objętość osocza) i niezwłocznie zamrozić w temperaturze - 80 °C do czasu przeprowadzenia analizy (Panter i in., 1998).
Procedura 2 A: Ryżanka japońska, wycięcie wątroby u ryżanki
Wyjęcie ryb przeznaczonych do badania z komory badawczej
1) Ryby przeznaczone do badania należy wyjąć z komory badawczej za pomocą małego podbieraka. Należy uważać, aby nie wrzucić ryb przeznaczonych do badania do innych komór badawczych.
2) Zasadniczo ryby przeznaczone do badania należy wyjmować w następującej kolejności: próba kontrolna, próba kontrolna z rozpuszczalnikiem (w stosownych przypadkach), próba z najniższym stężeniem, próba ze średnim stężeniem, próba z najwyższym stężeniem, próba z kontrolą dodatnią. Ponadto z jednej komory badawczej należy najpierw wyjąć wszystkie samce, a dopiero potem samice.
3) Płeć każdej z ryb przeznaczonych do badania identyfikuje się na podstawie zewnętrznych drugorzędnych cech płciowych (np. kształtu płetwy odbytowej).
4) Rybę przeznaczoną do badania umieścić w pojemniku transportowym i przenieść do stanowiska badawczego w celu wycięcia wątroby. Sprawdzić poprawność etykiet komory badawczej i pojemnika transportowego oraz potwierdzić, że liczba ryb wyjętych z komory badawczej i liczba ryb pozostających w komorze jest zgodna z oczekiwaniami.
5) Jeżeli nie można zidentyfikować płci na podstawie wyglądu zewnętrznego ryby, wyjąć wszystkie ryby z komory badawczej. W takim przypadku płeć należy określić przez obserwację gonad lub drugorzędnych cech płciowych pod mikroskopem stereoskopowym.
Wycięcie wątroby
1) Przenieść ryby przeznaczone do badania z pojemnika transportowego do roztworu środka znieczulającego za pomocą małego podbieraka.
2) Po znieczuleniu przenieść ryby przeznaczone do badania na bibułę filtracyjną (lub ręcznik papierowy) za pomocą pęsety (typu ogólnodostępnego). Chwytając ryby przeznaczone do badania, przyłożyć pęsetę do boków głowy, aby zapobiec złamaniu ogona.
3) Wytrzeć wodę z powierzchni ryb bibułą filtracyjną (lub ręcznikiem papierowym).
4) Położyć rybę stroną brzuszną do góry. Następnie wykonać małe poprzeczne nacięcie w połowie odległości między brzusznym obszarem szyjnym a środkowym obszarem brzusznym za pomocą nożyczek chirurgicznych.
5) Włożyć nożyczki chirurgiczne do niewielkiego nacięcia i rozciąć jamę brzuszną od punktu ogonowego w kierunku pokrywy skrzelowej do odbytu od strony czaszki wzdłuż środkowej linii jamy brzusznej. Należy uważać, aby nie włożyć nożyczek chirurgicznych zbyt głęboko i nie uszkodzić wątroby i gonady.
6) Przeprowadzić następujące czynności pod mikroskopem stereoskopowym.
7) Położyć rybę przeznaczoną do badania stroną brzuszną do góry na ręczniku papierowym (można również wykorzystać szklaną szalkę Petriego lub szkiełko).
8) Rozszerzyć ściany jamy brzusznej pęsetą precyzyjną i wyciągnąć organy wewnętrzne na zewnątrz. W razie potrzeby dopuszcza się również wyjęcie organów wewnętrznych przez usunięcie ściany jamy brzusznej z jednej strony.
9) Odsłonić połączoną część wątroby i pęcherzyka żółciowego za pomocą drugiej pęsety precyzyjnej. Następnie chwycić przewód żółciowy i odciąć pęcherzyk żółciowy. Należy uważać, aby nie przerwać ściany pęcherzyka żółciowego.
10) Chwycić przełyk i odciąć przewód pokarmowy od wątroby w ten sam sposób. Należy uważać, aby zawartość przewodu pokarmowego nie rozlała się. Odciąć ogonową część przewodu pokarmowego od odbytu i usunąć przewód z jamy brzusznej.
11) Odciąć pas tłuszczu i innych tkanek od brzegów wątroby. Należy uważać, aby nie zadrapać wątroby.
12) Chwycić za przestrzeń wrotną wątroby za pomocą pęsety precyzyjnej i wyjąć wątrobę z jamy brzusznej.
13) Położyć wątrobę na szkiełku. W razie potrzeby należy usunąć z powierzchni wątroby dodatkowy tłuszcz i tkankę obcą (np. powłoki jamy brzusznej) za pomocą pęsety precyzyjnej.
14) Zmierzyć masę wątroby wraz z mikroprobówką o pojemności 1,5 ml jako tarą za pomocą elektronicznej wagi analitycznej. Odnotować wartość w karcie badania (odczyt z dokładnością do 0,1 mg). Potwierdzić informacje dotyczące identyfikacji na etykiecie umieszczonej na mikroprobówce.
15) Zamknąć mikroprobówkę z wątrobą. Przechowywać ją na statywie chłodzącym (lub w pudełku z lodem).
16) Po wycięciu jednej wątroby wyczyścić narzędzia chirurgiczne albo wymienić je na czyste.
17) Wyciąć wątroby wszystkich ryb znajdujących się w pojemniku transportowym zgodnie z powyższym opisem.
18) Po wycięciu wątrób ze wszystkich ryb znajdujących się w pojemniku transportowym (tj. wszystkich samców lub samic w komorze badawczej) umieścić wszystkie próbki wątroby na statywie z probówkami opatrzonymi etykietą do celów identyfikacji i przechowywać w zamrażarce. W przypadku gdy wątroby przekazuje się do obróbki wstępnej niedługo po wycięciu, przenosi się je do kolejnego stanowiska badawczego na statywie chłodzącym (lub w pudełku z lodem).
Po wycięciu wątroby można wykonać pomiar drugorzędnych cech płciowych ryb.
Próbka
Przechowywać próbki wątroby pobrane z ryb przeznaczonych do badania w temperaturze ≤ - 70 °C, jeżeli nie wykorzystuje się ich do obróbki wstępnej niedługo po wycięciu.
Rys. 1
Nacięcie nożyczkami wykonuje się tuż przed płetwami piersiowymi.
Rys. 2
Środkową linię brzucha nacina się nożyczkami do punktu znajdującego się około 2 mm od odbytu w kierunku czaszki.
Rys. 3
Ściany jamy brzusznej rozszerza się szczypczykami w celu odsłonięcia wątroby i innych organów wewnętrznych. (Ewentualnie można przytrzymać ściany jamy brzusznej po bokach).
Rys. 4
Wątrobę wyraźnie się izoluje i wycina za pomocą szczypczyków.
Rys. 5
Jelita delikatnie wyciąga się za pomocą szczypczyków.
Rys. 6
Oba końce jelit i wszelkie przyczepy krezki odcina się za pomocą nożyczek.
Rys. 7 (samica)
W przypadku samicy stosuje się identyczną procedurę.
Rys. 8
Koniec procedury.
Procedura 2 B: Ryżanka japońska (Oryzias latipes), obróbka wstępna wątroby przed analizą poziomu witellogeniny.
Wziąć butelkę z roztworem buforowym do homogenizacji z zestawu ELISA i schłodzić ją kruszonym lodem (temperatura roztworu: ≤ 4 °C). W przypadku zastosowania roztworu buforowego do homogenizacji z układu EnBio ELISA rozmrozić roztwór w temperaturze pokojowej, a następnie schłodzić butelkę kruszonym lodem.
Obliczyć objętość roztworu buforowego do homogenizacji wątroby na podstawie jej masy (dodając 50 µl roztworu buforowego do homogenizacji na 1 mg masy wątroby do homogenatu). Na przykład jeżeli masa wątroby wynosi 4,5 mg, objętość roztworu buforowego do homogenizacji wątroby wynosi 225 µl. Przygotować listę objętości roztworu buforowego do homogenizacji dla wszystkich wątrób.
Przygotowanie wątroby do obróbki wstępnej
1) Bezpośrednio przed rozpoczęciem obróbki wstępnej wyjąć z zamrażarki mikroprobówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą wątrobę.
2) Obróbkę wstępną wątroby pobranej od samców należy przeprowadzać przed obróbką wstępną wątroby pobranej od samic, aby zapobiec zanieczyszczeniu witellogeniną. Ponadto obróbkę wstępną badanych grup należy przeprowadzać w następującej kolejności: próba kontrolna, próba kontrolna z rozpuszczalnikiem (w stosownych przypadkach), próba z najniższym stężeniem, próba ze średnim stężeniem, próba z najwyższym stężeniem, próba z kontrolą dodatnią.
3) Liczba mikroprobówek o pojemności 1,5 ml z próbkami wątroby, wyjętych jednorazowo z zamrażarki, nie powinna przekraczać liczby, którą można odwirować w tym samym czasie.
4) Ułożyć mikroprobówki o pojemności 1,5 ml z próbkami wątroby na statywie chłodzącym w kolejności według numeru próbki (nie ma potrzeby rozmrażania wątroby).
Obróbka wstępna
1. Dodanie roztworu buforowego do homogenizacji
1) Sprawdzić na liście, jaką objętość roztworu buforowego do homogenizacji należy zastosować w przypadku danej próbki wątroby, i wyregulować mikropipetę (zakres objętości: 100-1 000 µl) do odpowiedniej objętości. Przymocować czystą końcówkę do mikropipety.
2) Pobrać roztwór buforowy do homogenizacji z butelki z odczynnikiem i dodać bufor do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml zawierającej wątrobę.
3) Dodać roztwór buforowy do homogenizacji do wszystkich mikroprobówek o pojemności 1,5 ml zawierających wątrobę zgodnie z procedurą opisaną powyżej. Nie ma potrzeby zmieniać końcówki mikropipety na nową. Jeżeli jednak końcówka jest zanieczyszczona lub podejrzewa się, że jest zanieczyszczona, należy ją wymienić.
2. Homogenizacja wątroby
1) Przymocować nowy tłuczek do homogenizacji do homogenizatora do mikroprobówek.
2) Włożyć tłuczek do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml. Przytrzymać homogenizator do mikroprobówek w taki sposób, aby zgnieść wątrobę między powierzchnią tłuczka a wewnętrzną ścianą mikroprobówki o pojemności 1,5 ml.
3) Uruchomić homogenizator do mikroprobówek na 10-20 sekund. W tym czasie chłodzić mikroprobówkę o pojemności 1,5 ml kruszonym lodem.
4) Wyjąć tłuczek z mikroprobówki o pojemności 1,5 ml i odstawić ją na około 10 sekund. Następnie przeprowadzić kontrolę wzrokową stanu zawiesiny.
5) Jeżeli w zawiesinie widoczne są kawałki wątroby, powtórzyć działania (3) i (4), aby otrzymać zadowalający homogenat wątroby.
6) Zawiesinę homogenatu wątroby chłodzić na statywie z lodem do czasu odwirowania.
7) Do sporządzenia każdego homonegatu użyć nowego tłuczka.
8) Przeprowadzić homogenizację wszystkich wątrób z roztworem buforowym do homogenizacji zgodnie z opisaną wyżej procedurą.
3. Odwirowanie zawiesiny homogenatu wątroby
1) Upewnić się, że temperatura schłodzonej komory wirówki wynosi ≤ 5 °C.
2) Włożyć mikroprobówki o pojemności 1,5 ml zawierające zawiesinę homogenatu wątroby do schłodzonej wirówki (w razie potrzeby wyważając).
3) Odwirować zawiesinę homogenatu wątroby przy 13 000 g przez 10 min w temperaturze ≤ 5 °C. Jeżeli jednak supernatanty są właściwie oddzielone, moc i czas odwirowania można dostosować według potrzeb.
4) Po odwirowaniu sprawdzić, czy supernatanty są odpowiednio oddzielone (powierzchnia: lipid, warstwa pośrednia: supernatant, warstwa dolna: tkanka wątroby). Jeżeli oddzielenie nie jest odpowiednie, ponownie odwirować zawiesinę w tych samych warunkach.
5) Wyjąć wszystkie próbki ze schładzanej wirówki i ułożyć je na statywie z lodem w kolejności według numeru próbki. Należy uważać, aby po odwirowaniu żadna z oddzielonych warstw nie zawiesiła się ponownie.
4. Zbieranie supernatantu
1) Umieścić cztery mikroprobówki do przechowywania supernatantu o pojemności 0,5 ml na statywie na probówki.
2) Zebrać 30 µl każdego supernatantu (oddzielonego jako warstwa pośrednia) za pomocą mikropipety i wprowadzić do jednej mikroprobówki o pojemności 0,5 ml. Należy uważać, aby nie zebrać lipidu z powierzchni ani tkanki wątroby z warstwy dolnej.
3) Zebrać supernatant i wprowadzić do pozostałych dwóch mikroprobówek o pojemności 0,5 ml w sposób opisany powyżej.
4) Zebrać pozostałą część supernatantu za pomocą mikropipety (jeżeli jest to możliwe: ≥ 100 µl). Następnie wprowadzić supernatant do ostatniej mikroprobówki o pojemności 0,5 ml. Należy uważać, aby nie zebrać lipidu z powierzchni ani tkanki wątroby z warstwy dolnej.
5) Zamknąć mikroprobówkę o pojemności 0,5 ml i zapisać na etykiecie objętość supernatantu. Następnie natychmiast schłodzić mikroprobówki na statywie z lodem.
6) W przypadku każdego supernatantu wymienić końcówkę mikropipety na nową. Jeżeli do końcówki przyczepi się duża ilość lipidu, należy natychmiast wymienić ją na nową, aby zapobiec zanieczyszczeniu wyciągu z wątroby tłuszczem.
7) Cały odwirowany supernatant wprowadzić do czterech mikroprobówek o pojemności 0,5 ml zgodnie z wyżej opisaną procedurą.
8) Po wprowadzeniu supernatantu do mikroprobówek o pojemności 0,5 ml umieścić je wszystkie na statywie na probówki z etykietą identyfikacyjną, a następnie natychmiast zamrozić w zamrażarce. Jeżeli stężenia VTG mierzy się natychmiast po obróbce wstępnej, należy schłodzić jedną mikroprobówkę o pojemności 0,5 ml (zawierającą 30 µl supernatantu) na statywie na probówki i przenieść do stanowiska badawczego, gdzie przeprowadza się test ELISA. W takim przypadku umieścić pozostałe mikroprobówki na statywach na probówki i zamrozić w zamrażarce.
9) Po zebraniu supernatantu odrzucić pozostałości.
Przechowywanie próbki
Przechowywać mikroprobówki o pojemności 0,5 ml zawierające supernatant z homogenatu wątroby w temperaturze ≤ - 70 °C do czasu wykorzystania ich w teście ELISA.
Procedura 3 A: Danio pręgowany, pobieranie krwi z żyły/tętnicy ogonowej
Natychmiast po znieczuleniu trzon ogona nacina się poprzecznie i pobiera się krew z żyły/tętnicy ogonowej za pomocą kapilary mikrohematokrytowej powlekanej heparyną. Objętość krwi wynosi 5-15 μl, w zależności od wielkości ryby. Do mikrokapilary dodaje się taką samą objętość roztworu buforowego aprotyniny (6 μgml w PBS), a osocze oddziela się od krwi przez odwirowanie (5 minut przy 600 g). Osocze zbiera się w probówkach badawczych i przechowuje w temperaturze - 20 °C do czasu przeprowadzenia analizy witellogeniny i innych białek, które są przedmiotem zainteresowania.
Procedura 3 B: Danio pręgowany; pobranie krwi przez nakłucie serca
Aby zapobiec krzepnięciu krwi i degradacji białek, próbki pobiera się w roztworze chlorku sodu buforowanym fosforanami (PBS) zawierającym heparynę (1 000 jednostek/ml) i inhibitor proteaz aprotyninę (2 TIU/ml). Zaleca się, aby roztwór buforowy składał się z soli amonowej heparyny i liofilizowanej aprotyniny. Do pobierania próbek krwi zaleca się używanie strzykawki (1 ml) z cienką igłą (np. Braun Omnikan-F). Strzykawkę należy wstępnie napełnić roztworem buforowym (w przybliżeniu 100 μl), aby w pełni eluować niewielkie objętości krwi z każdej ryby. Próbki krwi pobiera się przez punkcję serca. Na początku rybę należy znieczulić za pomocą MS-222 (100 mg/l). Dzięki podaniu znieczulenia w odpowiedni sposób można rozpoznać bicie serca danio pręgowanego. Podczas nakłuwania serca delikatnie naciskać tłok strzykawki. Zakres objętości krwi do pobrania wynosi 20-40 mikrolitrów. Po nakłuciu serca wypełnić probówkę mieszaniną krwi i roztworu buforowego. Osocze oddziela się od krwi przez odwirowanie (20 min.; 5 000 g) i należy je przechowywać w temperaturze - 80 °C do czasu, aż będzie potrzebne do analizy.
Procedura 3C: Standardowa procedura operacyjna: danio pręgowany, homogenizacja głowy i ogona
1) Ryby znieczula się i usypia zgodnie z opisem badania.
2) Głowę i ogon odcina się od ryby zgodnie z rys. 1.
Uwaga: Przyrządy do przeprowadzania sekcji i deskę do krojenia należy wypłukać i odpowiednio wyczyścić (np. za pomocą 96 % etanolu) przed obróbką każdej ryby w celu uniknięcia przeniesienia "zanieczyszczenia witellogeniną" z samic lub samców, u których VTG występuje, na samce, u których ona nie występuje.
Rysunek 1
3) Łączną masę głowy i ogona każdej z ryb mierzy się z dokładnością do pełnego miligrama.
4) Po zważeniu tych części umieszcza się je w odpowiednich probówkach (np. probówkach Eppendorfa o pojemności 1,5 ml) i zamraża w temperaturze - 80 °C do czasu homogenizacji albo bezpośrednio poddaje homogenizacji z lodem za pomocą dwóch tłuczków z tworzywa sztucznego. (Zastosować można również inne metody, pod warunkiem że stosując je, używa się lodu, i można uzyskać jednorodną masę). Uwaga: Probówki należy odpowiednio ponumerować, aby głowa i ogon danej ryby mogły zostać przypisane do odpowiadających im części ciała wykorzystywanych do histologii gonad.
5) Po uzyskaniu jednorodnej masy dodaje się 4-krotność wagi tkanki lodowatego roztworu buforowego do homogenizacji * . Mieszaninę należy dalej rozdrabniać za pomocą tłuczków, dopóki nie stanie się jednorodna. Ważna uwaga: W przypadku każdej ryby wykorzystuje się nowe tłuczki.
6) Próbki umieszcza się z lodem aż do odwirowania w temp. 4 °C przy 50 000 × g przez 30 min.
7) Użyć pipety do wprowadzenia porcji supernatantu o objętości 20 µl do co najmniej dwóch probówek przez zanurzenie końcówki pipety pod znajdującą się na wierzchu warstwę tłuszczu i ostrożne zassanie supernatantu bez fragmentów tłuszczu lub grudek.
8) Do momentu wykorzystania probówki przechowuje się w temperaturze - 80 °C.
Dodatek 7
Próbki wzmocnione witellogeniny i międzylaboratoryjny wzorzec referencyjny
Każdego dnia, w którym przeprowadza się badania witellogeniny, zostanie przeanalizowana próbka wzmocniona przygotowana z zastosowaniem międzylaboratoryjnego wzorca referencyjnego. Witellogenina wykorzystana do przygotowania międzylaboratoryjnego wzorca referencyjnego będzie pochodzić z innej partii niż partia wykorzystana do przygotowania wzorców kalibracyjnych w odniesieniu do przeprowadzanego badania.
Próbka wzmocniona zostanie przygotowana przez dodanie znanej ilości międzylaboratoryjnego wzorca do próbki osocza pobranego od samca z próby kontrolnej. Próbka zostanie wzmocniona w celu otrzymania stężenia witello-geniny będącego 10-100-krotnością oczekiwanego stężenia witellogeniny u samców ryb z próby kontrolnej. Próbka osocza pobranego od samca z próby kontrolnej, która zostanie wzmocniona, może pochodzić od pojedynczej ryby albo może składać się z próbek pobranych od kilku ryb.
Podpróbka niewzmocnionego osocza samców z próby kontrolnej zostanie poddana analizie w co najmniej dwóch zduplikowanych studzienkach. Próbka wzmocniona również zostanie poddana analizie w co najmniej dwóch zduplikowanych studzienkach. Średnia ilość witellogeniny w obu niewzmocnionych próbkach osocza pobranych od samców z próby kontrolnej zostanie dodana do obliczonej ilości witellogeniny dodanej do próbek w celu ich wzmocnienia, aby oznaczyć przewidywane stężenie. Stosunek oczekiwanego stężenia do zmierzonego stężenia zostanie odnotowany wraz z wynikami każdego zestawu badań przeprowadzonych w danym dniu.
Dodatek 8
Schemat decyzyjny do celów analizy statystycznej
C.38. BADANIE PRZEOBRAŻENIA PŁAZÓW
WPROWADZENIE
1. Opisywana metoda badawcza jest równoważna z wytyczną OECD nr 231 (2009 r.) w sprawie badań. Konieczność opracowania i zweryfikowania badania umożliwiającego wykrycie substancji chemicznych oddziałujących na tarczycę kręgowców wynika z obawy, że środowiskowe poziomy substancji chemicznych mogą wywoływać działania niepożądane zarówno u ludzi, jak i w przypadku dzikiej fauny i flory. W 1998 r. OECD zapoczątkowała działania mające na celu przegląd istniejących wytycznych w sprawie badań i opracowanie nowych wytycznych dotyczących przeglądu i badania potencjalnych substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego, nadając tym działaniom wysoki priorytet. Jednym z elementów tych działań było opracowanie wytycznej w sprawie badań dotyczącej przeglądu substancji chemicznych oddziałujących na gruczoł tarczowy kręgowców. Zaproponowano zarówno ulepszenie 28-dniowego badania toksyczności doustnej wywołanej powtarzanym dawkowaniem u gryzoni (rozdział B.7 niniejszego załącznika), jak i badanie przeobrażenia płazów. Ulepszoną metodę badawczą B.7 poddano weryfikacji, a następnie wydano zweryfikowaną metodę badania. Badanie przeobrażenia płazów poddano zakrojonemu na szeroką skalę programowi weryfikacji, który obejmował badania wewnątrzlaboratoryjne i międzylaboratoryjne wykazujące istotność i wiarygodność badania (1, 2). Następnie weryfikacja badania stała się przedmiotem wzajemnej oceny przez zespół niezależnych ekspertów (3). Niniejsza metoda badawcza jest efektem doświadczeń zdobytych podczas badań weryfikacyjnych związanych z wykrywaniem substancji chemicznych oddziałujących na tarczycę i prac prowadzonych w innych państwach będących członkami OECD.
ZASADA BADANIA
2. Badanie przeobrażenia płazów jest badaniem przesiewowym mającym na celu empiryczną identyfikację substancji chemicznych, które mogą zaburzać prawidłowe funkcjonowanie osi podwzgórze-przysadka-tarczyca. Badanie przeobrażenia płazów odpowiada ogólnemu modelowi kręgowców w zakresie, w jakim oparte jest ono na zachowanych strukturach i funkcjach osi podwzgórze-przysadka-tarczyca. Jest to ważne badanie, ponieważ przeobrażenie płazów stanowi dobrze zbadany, zależny od tarczycy proces, będący odpowiedzią na substancje chemiczne aktywne w obrębie osi podwzgórze-przysadka-tarczyca i jest jedynym istniejącym badaniem umożliwiającym wykrycie aktywności tarczycy u zwierzęcia w fazie rozwoju morfologicznego.
3. Zasadniczo plan doświadczalny obejmuje poddanie kijanek Xenopus laevis w 51. stadium działaniu co najmniej trzech prób z różnymi stężeniami badanej substancji chemicznej i próbie kontrolnej z wodą rozcieńczającą przez 21 dni. Istnieją cztery powtórzenia każdego zabiegu. W momencie rozpoczęcia badania zagęszczenie kijanek w stadium larwalnym wynosi 20 sztuk na zbiornik badawczy w odniesieniu do wszystkich grup poddawanych zabiegom. Punkty końcowe obserwacji obejmują: długość kończyn tylnych, długość mierzona od otworu gębowego do odbytu, stadium rozwojowe, mokra masa, histologia tarczycy i dzienne obserwacje śmiertelności.
OPIS METODY
Badany gatunek
4. Gatunek Xenopus laevis hoduje się rutynowo w laboratoriach na całym świecie i jest on łatwo dostępny za pośrednictwem dostawców komercyjnych. Ten gatunek można łatwo skłonić do rozmnażania przez cały rok, stosując zastrzyki z ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG), a uzyskane w ten sposób larwy można hodować w dużej liczbie aż do osiągnięcia wybranego stadium rozwoju, aby umożliwić wykorzystanie protokołów badań dotyczących konkretnego stadium. Zaleca się, aby larwy użyte do badania pochodziły od własnych dorosłych osobników. Inną możliwość, chociaż nie jest to preferowana procedura, stanowi przewiezienie komórek jajowych lub zarodków do laboratorium przeprowadzającego badanie i następnie poddanie ich aklimatyzacji; wysyłanie stadiów larwalnych do wykorzystania w badaniu jest niedopuszczalne.
Sprzęt i materiały
5. W celu wykonania niniejszego badania wymagane jest zastosowanie następującego sprzętu i materiałów:
a) układu narażenia (zob. opis poniżej);
b) akwariów wykonanych ze szkła lub stali nierdzewnej (zob. opis poniżej);
c) zbiorników reprodukcyjnych;
d) aparatury do regulacji temperatury (np. urządzeń do ogrzewania lub chłodzenia (ustawionych na temperaturę 22 ± 1 °C));
e) termometru;
f) dwuokularowego mikroskopu preparacyjnego;
g) aparat cyfrowego o rozdzielczości co najmniej 4 megapikseli i z funkcją mikro;
h) oprogramowania do cyfrowej obróbki obrazu;
i) płytek Petriego (np. 100 × 15 mm) lub przeźroczystej komory porównywalnej wielkości z tworzywa sztucznego;
j) wagi analitycznej umożliwiającej pomiar z dokładnością do trzeciego miejsca po przecinku (mg);
k) miernika rozpuszczonego tlenu;
l) pehametru;
m) miernika natężenia światła umożliwiającego pomiar w luksach;
n) różnych laboratoryjnych naczyń szklanych i narzędzi;
o) regulowanych pipet (10-5 000 μl) lub różnych pipet o równoważnych pojemnościach;
p) badanej substancji chemicznej w ilościach wystarczających do wykonania badania, najlepiej z jednej partii;
q) instrumentów analitycznych odpowiednich dla badanej substancji chemicznej lub zakontraktowanych usług analitycznych.
Testowalność chemiczna
6. Badanie przeobrażenia płazów jest oparte na protokole narażenia w środowisku wodnym, zgodnie z którym badana substancja chemiczna jest wprowadzana do komór badawczych za pośrednictwem układu przepływowego. Metody przepływowe mają jednak ograniczenia dotyczące rodzaju substancji chemicznej, która może być badana, wynikające z jej właściwości fizykochemicznych. W związku z tym przed zastosowaniem tego protokołu należy uzyskać podstawowe informacje na temat danej substancji chemicznej, istotne dla określania jej testowalności, oraz należy sprawdzić informacje podane w wytycznej OECD dotyczącej badania toksyczności wodnej trudnych substancji i mieszanin (Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures) (4). Właściwości wskazujące, że badanie danej substancji chemicznej w środowisku wodnym może być utrudnione: wysoki współczynnik podziału oktanol/woda (log Kow), duża lotność, podatność na hydrolizę i podatność na fotolizę w warunkach oświetlenia, które występują w laboratorium. Inne czynniki również mogą mieć znaczenie przy określaniu testowalności i należy je ustalić indywidualnie dla każdego przypadku. Jeżeli w przypadku danej substancji chemicznej nie można przeprowadzić badania z wykorzystaniem przepływowego układu badawczego, można wykorzystać układ wymiany statycznej. Jeżeli żaden z układów nie nadaje się do wprowadzania badanej substancji chemicznej, wówczas standardowo nie bada się jej na podstawie tego protokołu.
Układ narażenia
7. W miarę możliwości preferowany jest układ przepływowy z wykorzystaniem rozcieńczalnika zamiast układu wymiany statycznej. Jeżeli właściwości fizyczne lub chemiczne którejkolwiek z badanych substancji chemicznych nie pozwalają wprowadzić jej do układu przepływowego z rozcieńczalnikiem, wówczas można zastosować alternatywny układ narażenia (np. wymianę statyczną). Części składowe układu, które mają kontakt z wodą, powinny być wykonane ze szkła, stali nierdzewnej lub politetrafluoroetylenu. Można jednak zastosować odpowiednie tworzywa sztuczne, o ile nie wpływa to na protokół badania. Jako zbiorniki do badań narażenia należy stosować akwaria wykonane ze szkła lub stali nierdzewnej i wyposażone w syfony, o objętości od około 4,0 do 10,0 l i minimalnej głębokości wody 10-15 cm. Układ powinien umożliwiać utrzymanie wszystkich stężeń ekspozycyjnych i próby kontrolnej z czterema kontrpróbami na każdy zabieg. Natężenie przepływu do każdego zbiornika powinno być stałe zarówno względu na utrzymanie warunków biologicznych, jak i narażenia chemicznego (np. 25 ml/min.). Zbiorniki do zabiegów narażenia należy losowo umieścić w układzie narażenia w celu ograniczenia ewentualnych skutków wynikających z ich umiejscowienia, między innymi niewielkich różnic temperatury, natężenia światła itd. Należy zastosować światło fluorescencyjne, aby zapewnić fotoperiod wynoszący 12 godzin światła i 12 godzin ciemności, o natężeniu wynoszącym 600-2 000 luksów (lumenów/m2) na powierzchni wody. W każdym zbiorniku testowym temperatura wody powinna być utrzymana na poziomie 22 ± 1 °C, pH utrzymane w przedziale 6,5-8,5, a stężenie rozpuszczonego tlenu > 3,5 mg/l (> 40 % nasycenia powietrzem). Minimalną temperaturę wody, pH i rozpuszczony tlen należy mierzyć raz w tygodniu, jednak w co najmniej jednym naczyniu badawczym temperaturę należy monitorować w sposób ciągły. W dodatku 1 przedstawione zostały warunki doświadczalne, w jakich należy stosować protokół. W celu uzyskania dalszych informacji dotyczących skompilowania przepływowych układów ekspozycji lub układów wymiany statycznej należy zapoznać się z opracowanymi przez ASTM wytycznymi dotyczącymi przeprowadzania badań toksyczności ostrej na materiale badawczym przy użyciu ryb, dużych bezkręgowców i płazów (Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests on Test Materials with Fishes, Macroinver-tebrates, and Amphibians) (5) oraz ogólnymi badaniami toksyczności w środowisku wodnym.
Jakość wody
8. Można użyć każdej wody, która jest dostępna w danym miejscu (np. woda źródlana lub woda wodociągowa przefiltrowana przez filtr węglowy) i która umożliwia normalny wzrost i rozwój kijanek X. laevis. Ponieważ jakość lokalnie dostępnej wody może znacząco różnić się w zależności od obszaru, należy wykonać analizy jakości wody, w szczególności jeżeli nie są dostępne historyczne dane dotyczące przydatności wody do hodowli Xenopus. Szczególną uwagę należy zwrócić na to, aby woda nie zawierała miedzi, chloru i chloramin, ponieważ wszystkie te substancje są toksyczne dla żab i kijanek. Zaleca się również zbadanie wody pod kątem poziomów tła fluorku, nadchloranu i chloranu (produktów ubocznych dezynfekcji wody pitnej), ponieważ wszystkie te aniony są substratami dla transportera jodu tarczycy i podwyższony poziom któregokolwiek z nich może zakłócić wynik badania. Analiza powinna zostać wykonana przed rozpoczęciem badania, a woda użyta do badania powinna zazwyczaj być pozbawiona tych anionów.
Stężenie jodku w badanej wodzie
9. Aby tarczyca mogła syntezować hormony tarczycy, larwy muszą mieć dostęp do wystarczającej ilości związków jodu dostarczonych za pośrednictwem wody lub pożywienia. Obecnie nie istnieją żadne określone empirycznie wytyczne dotyczące minimalnego stężenia jodu. Obecność jodu może jednak wpływać na zdolność reagowania tarczycy na substancje aktywne oddziałujące na gruczoł tarczowy i wiadomo, że jod moduluje podstawową aktywność tarczycy - aspekt, który należy uwzględnić, interpretując wyniki histopatologii tarczycy. W sprawozdaniu należy podać stężenia jodu w wodzie do badania. Na podstawie dostępnych danych z badania weryfikacyjnego wykazano, że protokół funkcjonuje odpowiednio, jeżeli stężenia jodu (I-) w wodzie do badania mieszczą się w przedziale 0,5-10 µg/l. Najlepiej byłoby, gdyby minimalne stężenie jodu w wodzie do badania wynosiło 0,5 μg/l. Jeżeli do badania stosowana jest woda regenerowana odtworzona z wody dejonizowanej, należy dodać jod w minimalnym stężeniu wynoszącym 0,5 μg/l. W sprawozdaniu należy uwzględnić każde dodatkowe uzupełnienie wody do badania jodem lub innymi solami.
Trzymanie zwierząt
Opieka na osobnikami dorosłymi i hodowla
10. Opieka nad osobnikami dorosłymi i hodowla przebiegają zgodnie ze standardowymi wytycznymi, a w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji należy zapoznać się ze standardowymi wytycznymi dotyczących badania teratogenezy w zarodkach żab (Frog Embryo Teratogenesis Assay (FETAX)) (6). Takie standardowe wytyczne zawierają przykład odpowiednich metod opieki i hodowli, ale ich ścisłe ich przestrzeganie nie jest konieczne. W celu nakłonienia zwierząt do rozmnażania się parom (3-5) dorosłych samic i samców wstrzykuje się ludzką gonadotropinę kosmówkową (hCG). Żeńskim i męskim osobnikom wstrzykuje się, odpowiednio, 800-1 000 IU i 600-800 IU hCG rozpuszczonego w 0,6-0,9 % roztworze soli fizjologicznej. Pary hodowlane trzymane są w dużych zbiornikach zapewniających spokój i niezmienne warunki dla przyjęcia pozycji ampleksusu. Dno każdego akwarium reprodukcyjnego powinno posiadać fałszywe dno wykonane z nierdzewnej stali lub siatki z tworzywa sztucznego, które umożliwia opadanie pakietów jaj na dno zbiornika. Żaby, które otrzymały zastrzyk późnym popołudniem, zazwyczaj złożą większość skrzeku późnym rankiem następnego dnia. Po złożeniu i zapłodnieniu wystarczającej liczby komórek jajowych dorosłe osobniki powinny zostać usunięte z akwariów reprodukcyjnych.
Opieka nad larwami i selekcja
11. Po usunięciu dorosłych osobników z akwarium reprodukcyjnego komórki jajowe zbiera się i ocenia pod kątem ich żywotności, wykorzystując w tym celu reprezentatywną próbkę zarodków ze wszystkich akwariów reprodukcyjnych. Należy zachować najlepszy skrzek (zaleca się 2-3 pakiety w celu oceny jakości skrzeku) na podstawie żywotności zarodków i ich odpowiedniej liczby (minimum 1 500). Wszystkie organizmy wykorzystane w badaniu powinny pochodzić z jednego okresu godowego (tj. nie należy mieszać skrzeków z różnych okresów). Zarodki należy umieścić na dużej, płaskiej szalce lub płytce i za pomocą pipety lub zakraplacza usunąć wszystkie jaja, które są ewidentnie martwe lub wykazują nieprawidłowości (zob. definicja w (5)). Zdrowe zarodki z każdego z trzech pakietów skrzeku przenosi się do trzech oddzielnych zbiorników wylęgowych. Po czterech dniach od umieszczenia jaj w zbiornikach wylęgowych wybiera się najlepszy skrzek pod względem żywotności i skutecznego wylęgu i przenosi się larwy do odpowiedniej liczby zbiorników hodowlanych o temperaturze 22 ± 1 °C. Ponadto pewną liczbę dodatkowych larw przenosi się do dodatkowych zbiorników w celu zastąpienia larw w razie wystąpienia upadków w zbiornikach hodowlanych w pierwszym tygodniu. Procedura ta pozwala zachować stałe zagęszczenie organizmów i przez to ograniczyć rozbieżności rozwojowe w kohorcie pochodzącej z jednego skrzeku. Wszystkie zbiorniki hodowlane należy codziennie opróżniać do czysta przez syfon. Jako środek ostrożności zaleca się stosowanie rękawic winylowych lub nitrylowych zamiast rękawic lateksowych. Padnięte zwierzęta należy usuwać codziennie i dodawać larwy zastępcze w celu utrzymania zagęszczenia organizmów podczas pierwszego tygodnia. Karmienie powinno mieć miejsce co najmniej dwa razy dziennie.
12. Na etapie poprzedzającym narażenie kijanki są aklimatyzowane do warunków właściwego etapu narażenia, w tym do rodzaju pokarmu, temperatury, cyklu światła/ciemności i pożywki hodowlanej. W związku z tym zaleca się, aby na etapie poprzedzającym narażenie i etapie narażenia była wykorzystywana ta sama woda do hodowli/woda rozcieńczająca. Jeżeli stosowany jest statyczny system hodowli kijanek na etapie poprzedzającym narażenie, pożywkę hodowlaną należy całkowicie wymieniać co najmniej dwa razy w tygodniu. Należy unikać zatłoczenia spowodowanego nadmierną liczebnością larw w trakcie etapu poprzedzającego narażenie, ponieważ może to znacznie wpłynąć na rozwój kijanek na kolejnych etapach badania. W związku z tym zagęszczenie hodowli nie powinno przekraczać w przybliżeniu czterech kijanek na jedną pożywkę hodowlaną (układ statycznego narażenia) lub 10 kijanek na jedną pożywkę hodowlaną (np. przy natężeniu przepływu wynoszącym 50 ml/min. w układzie poprzedzającym narażenie lub układzie hodowlanym). W takich warunkach kijanki powinny w ciągu dwunastu dni rozwinąć się ze stadium 45/46 do stadium 51. Kijanki reprezentatywne dla tej populacji wyjściowej należy codziennie kontrolować pod względem stadium rozwojowego w celu oszacowania odpowiedniego momentu do rozpoczęcia narażenia. Należy dbać, aby ograniczyć do minimum stres i traumę, na jakie narażone są kijanki, w szczególności podczas poruszania, czyszczenia akwariów i przenoszenia larw. Należy unikać stresujących warunków/działań, takich jak głośny lub nieustanny hałas, stukanie palcem w akwarium, drgania w akwariach, nadmierna aktywność w laboratorium i nagłe zmiany warunków środowiskowych (dostępności światła, temperatury, pH, stężenie rozpuszczonego tlenu, wartości natężenia przepływów itd.). Jeżeli kijanki nie osiągną 51. stadium w ciągu 17 dni po zapłodnieniu, za potencjalną przyczynę należy uznać nadmierny stres.
Hodowla i karmienie larw
13. Kijanki karmi się dostępnym w handlu pokarmem dla kijanek wykorzystywanym podczas badania weryfikacyjnego (zob. również dodatek 1) w okresie poprzedzającym narażenie (za Nieuwkoopem i Faberem (NF) 45/46. stadium (8)) i w takcie całego okresu trwania badania wynoszącego 21 dni lub stosuje się inna dietę, która wykazywała takie samo działanie w badaniu przeobrażenia płazów. Schemat żywienia w okresie poprzedzającym narażenie należy dokładnie dostosować do potrzeb rozwijających się kijanek. Oznacza to, że nowo wyklutym kijankom należy dostarczać małe porcje pokarmu kilka razy dziennie (co najmniej dwa). Należy unikać podawania nadmiaru pokarmu, aby i) zachować jakość wody oraz ii) aby zapobiec zatkaniu filtrów skrzelowych cząsteczkami pokarmu i drobnej materii organicznej. W przypadku pokarmu dla kijanek stosowanego w badaniach weryfikacyjnych dzienne dawki pokarmu należy zwiększać w miarę wzrostu kijanki do około 30 mg na zwierzę na dobę tuż przed rozpoczęciem badania. Badania weryfikacyjne wykazały, że dostępny w handlu pokarm wspomaga właściwy wzrost i rozwój kijanek gatunku X. laevis, a dzięki dużemu rozdrobnieniu jego cząstki pozostają zawieszone w wodzie na długi okres i są wypłukiwane przez przepływającą wodę. W związku z tym całkowitą dzienną ilość pokarmu należy podzielić na mniejsze porcje i podawać co najmniej dwa razy dziennie. W przypadku takiego pokarmu schemat żywienia został przestawiony w tabeli 1. Należy rejestrować porcje pokarmu. Pokarm może być podawany na sucho lub jako roztwór podstawowy przygotowany w wodzie rozcieńczającej. Roztwór podstawowy tego rodzaju należy sporządzać na nowo co drugi dzień i przechowywać w temperaturze do 4 °C, gdy nie jest używany.
Tabela 1.
Schemat żywienia dostępnym w handlu pokarmem dla kijanek zastosowany podczas badań weryfikacyjnych w odniesieniu do kijanek X. laevis w trakcie rozwojowej części badania przeobrażenia płazów w warunkach przepływu
| Dzień badania | Dawka pokarmu (mg pokarmu/zwierzę/dobę) |
| 0-4. | 30 |
| 5-7 | 40 |
| 8-10 | 50 |
| 11-14 | 70 |
| 15-21 | 80 |
Chemia analityczna
14. Przed przystąpieniem do badania należy ocenić stabilność badanej substancji chemicznej, wykorzystując w tym celu istniejące informacje dotyczące jej rozpuszczalności, podatności na rozkład i lotności. Z każdego zbiornika z kontrpróbą należy pobrać do analiz chemicznych co najmniej cztery próbki roztworów do badań w każdym stężeniu w momencie rozpoczęcia badania (dzień 0) i co tydzień w trakcie trwania badania. Zaleca się również analizę każdego badanego stężenia podczas przygotowywania układu przed rozpoczęciem badania w celu zweryfikowania efektywności układu. Ponadto zaleca się analizę roztworów podstawowych podczas ich wymiany, w szczególności jeżeli objętość roztworu podstawowego nie zapewnia odpowiednich ilości substancji chemicznej na cały czas trwania okresów rutynowego pobierania próbek. W przypadku substancji chemicznych, których nie można wykryć na pewnym poziomie stężenia lub na poziomie wszystkich stężeń wykorzystanych w badaniu, należy dokonać pomiaru roztworów podstawowych i odnotować natężenie przepływu w układzie w celu obliczenia stężeń nominalnych.
Dostarczanie substancji chemicznej
15. Metoda wprowadzania badanej substancji chemicznej do układu może różnić się w zależności od właściwości fizykochemicznych substancji. Substancje chemiczne rozpuszczalne w wodzie można rozpuszczać w podwielok-rotnych częściach wody do badania w stężeniu, które pozwoli na wprowadzenie tych substancji w docelowym stężeniu badanym do układu przepływowego. Substancje chemiczne, które są płynne w temperaturze pokojowej i słabo rozpuszczalne w wodzie, można wprowadzać, wykorzystując do tego celu metody saturatora ciecz-ciecz. Substancje chemiczne stałe w temperaturze pokojowej i słabo rozpuszczalne w wodzie mogą zostać wprowadzone za pomocą saturatorów z kolumną wypełnioną watą szklaną (7). Zaleca się zastosowanie układu badawczego bez nośnika, jednak różne badane substancje chemiczne będą posiadały różne właściwości fizykochemiczne, które będą prawdopodobnie wymagały różnego podejścia do przygotowania wody służącej do narażenia na działanie substancji chemicznej. Zaleca się unikać stosowania rozpuszczalników lub nośników, ponieważ: i) niektóre rozpuszczalniki same mogą powodować toksyczność lub niepożądane albo nieoczekiwane reakcje endokrynologiczne, ii) badanie substancji chemicznych, których rozpuszczalność w wodzie zostaje przekroczona (co często ma miejsce w wyniku stosowania rozpuszczalników), może skutkować niedokładnym określeniem efektywnych stężeń oraz iii) stosowanie rozpuszczalników w przypadku badań długoterminowych może skutkować znacznym rozrostem biofilmu związanym z aktywnością mikroorganizmów. W przypadku substancji chemicznych, których badanie nastręcza trudności, rozpuszczalnik można zastosować tylko w ostateczności, a w celu wyboru najlepszej metody należy zapoznać się z wytyczną OECD dotyczącą badania toksyczności wodnej trudnych substancji i mieszanin (Guidance Document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures) (4). Wybór rozpuszczalnika będzie uwarunkowany chemicznymi właściwościami substancji chemicznej. Do rozpuszczalników, które okazały się skuteczne w przypadku badań toksyczności w środowisku wodnym, zalicza się aceton, etanol, metanol, dimetyloformamid i glikol trójetylenowy. W przypadku wykorzystania rozpuszczalnika jako nośnika stężenie rozpuszczalnika powinno być niższe niż chroniczne stężenie NOEC (stężenie, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian); w wytycznej OECD zaleca się maksymalne stężenie 100 µl/l, a zgodnie z ostatnim przeglądem zaleca się stosowanie stężenia rozpuszczalnika wynoszącego zaledwie 20 µl/l wody rozcieńczającej (12). Jeżeli zastosowane zostaną nośniki rozpuszczalnikowe, oprócz prób kontrolnych bez rozpuszczalnika (czysta woda) należy również ocenić odpowiednie próby kontrolne z rozpuszczalnikiem. Jeżeli nie możliwe jest podanie substancji chemicznej z wodą ze względu na jej właściwości fizykochemiczne (niska rozpuszczalność) albo ograniczoną dostępność chemiczną, można rozważyć jej wprowadzanie z pokarmem. Przeprowadzono wstępne prace nad narażeniem z pokarmem, jednak ta droga narażenia nie jest powszechnie stosowana. Wybór metody należy udokumentować i zweryfikować w sposób analityczny.
Dobór badanych stężeń
Ustalenie wysokiego stężenia badanego
16. Do celów niniejszego badania wysokie stężenie badane odpowiada granicy rozpuszczalności badanej substancji chemicznej; maksymalnemu tolerowanemu stężeniem (MTC) w przypadku substancji chemicznych o dużej toksyczności; albo 100 mg/l, w zależności od tego, która z tych wartości jest najniższa.
17. MTC jest definiowane jako najwyższe badane stężenie substancji chemicznej, którego skutkiem jest mniej niż 10 % przypadków śmiertelności ostrej. Przy zastosowaniu tego podejścia zakłada się istnienie empirycznych danych dotyczących śmiertelności ostrej, na podstawie których oszacować można MTC. Oszacowanie MTC może być niedokładne i zazwyczaj wymaga odwołania się do swojej najlepszej wiedzy. Chociaż wykorzystanie modeli regresji jest najodpowiedniejszym pod względem technicznym podejściem do oszacowania MTC, przydatne przybliżenie MTC można uzyskać na podstawie istniejących danych dotyczących przypadków śmiertelności ostrej dzięki zastosowaniu 1/3 wartości LC50. Dane dotyczące toksyczności ostrej dla badanych gatunków mogą jednak być niedostępne. Jeżeli niedostępne są dane dotyczące toksyczności ostrej charakterystyczne dla danego gatunku, można wówczas przeprowadzić 96-godzinne badanie LC50 na kijankach reprezentatywnych (tj. w tym samym stadium) dla kijanek uczestniczących w badaniu przeobrażenia płazów. Jeżeli dostępne są dane dotyczące innych gatunków wodnych (np. badania LC50 dla ryb lub innych gatunków płazów), można odwołać się do swojej najlepszej wiedzy w celu oszacowania prawdopodobnego MTC na podstawie międzygatunkowej ekstrapolacji.
18. W przypadkach, gdy substancja chemiczna nie charakteryzuje się toksycznością ostrą i jej rozpuszczalność wynosi powyżej 100 mg/l, za najwyższe badane stężenie należy uznać 100 mg/l, ponieważ takie stężenie uznaje się zazwyczaj za "praktycznie nietoksyczne".
19. W przypadku gdy metody przepływowe nie pozwalają uzyskać MTC, można zastosować metody wymiany statycznej, chociaż nie jest to zalecana procedura. Jeżeli zastosowane zostały metody wymiany statycznej, wówczas należy udokumentować stabilność stężenia badanej substancji chemicznej, które nie powinna przekraczać limitów kryteriów efektywności. Zaleca się, aby okresy wymiany wynosiły dwadzieścia cztery godziny. Okresy wymiany nie mogą przekraczać 72 godzin. Ponadto parametry jakości wody (np. DO, temperatura, pH itd.) należy mierzyć pod koniec każdego okresu wymiany bezpośrednio przed wymianą.
Zakres badanych stężeń
20. Wymagane jest zastosowanie minimum trzech badanych stężeń i próby z czystą wodą (oraz, jeżeli jest to konieczne, grupy kontrolnej nośnika). Minimalna różnica badanych stężeń pomiędzy najwyższym a najniższym stężeniem powinna wynosić mniej więcej jeden rząd wielkości. Maksymalna wartość między dawkami wynosi 0,1, a minimalna - 0,33.
PROCEDURA:
Rozpoczęcie i przeprowadzenie badania
Dzień 0
21. Narażanie należy rozpocząć w momencie, gdy wystarczająca liczba kijanek podstawowej populacji przed narażeniem osiągnęła 51. stadium rozwojowe zgodnie z kryteriami Nieuwkoopa i Fabera (8), co oznacza wiek nie przekraczający 17 po zapłodnieniu. W celu wyboru zwierząt, które zostaną użyte do badania, zdrowe i normalnie wyglądające kijanki z podstawowej populacji należy umieścić razem w pojedynczym naczyniu zawierającym odpowiednią ilość wody rozcieńczającej. Aby określić stadium rozwoju, kijanki należy pojedynczo wyjmować ze wspólnego zbiornika za pomocą małej siatki lub sitka i przenosić do przezroczystej komory pomiarowej (np. na płytkę Petriego o wymiarach 100 mm) zawierającej wodę rozcieńczającą. W celu określenia stadium rozwoju zaleca się, aby nie stosować znieczulenia, chociaż przed przeniesieniem można znieczulić poszczególne kijanki stosując 100 mg/l metanosulfonioanu trikainy (np. MS-222) odpowiednio zbuforowanego wodorowęglanem sodu (pH 7,0). W przypadku zastosowania tego sposobu metodę dotyczącą odpowiedniego użycia np. MS-222 do znieczulenia należy otrzymać od doświadczonych laboratoriów i podać wraz z wynikami badań. Należy ostrożnie obchodzić się ze zwierzętami podczas przenoszenia, aby zminimalizować wynikający z tego stres i nie dopuścić do zranienia.
22. Stadium rozwojowe zwierząt określa się, stosując dwuokularowy mikroskop preparacyjny. W celu zminimalizowania zasadniczej zmienności w odniesieniu do stadium rozwojowego ważne jest, aby etap ten został przeprowadzony w jak najdokładniejszy sposób. Według Nieuwkoopa i Fabera (8) pierwotnym wyznacznikiem rozwoju decydującym o określeniu 51. stadium rozwojowego organizmów jest morfologia kończyny tylnej. Morfologiczne właściwości kończyn tylnych należy zbadać pod mikroskopem. Chociaż w celu uzyskania wyczerpujących informacji dotyczących oceny stadium kijanek należy zapoznać się z całym przewodnikiem Nieuwkoopa i Fabera (8), stadium można w wiarygodny sposób ocenić, wykorzystując wyraźnie widoczne morfologiczne cechy charakterystyczne. Poniższa tabela może zostać wykorzystana do uproszczenia i standaryzacji procesu oceny stadium dzięki określeniu tych wyraźnie widocznych morfologicznych cech charakterystycznych związanych z różnymi stadiami, przy założeniu, że rozwój przebiega prawidłowo.
Tabela 2.
Wyraźnie widoczne morfologiczne cechy charakterystyczne wyznaczające stadium rozwoju na podstawie wskazówek Nieuwkoopa i Fabera.
| Wyraźnie widoczne morfologiczne cechy charakterystyczne | Stadium rozwojowe | |||||||||||||||
| 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | |
| Kończyna tylna | X | X | X | X | X | X | X | |||||||||
| Kończyna przednia | X | X | X | X | X | |||||||||||
| Struktura twarzoczaszki | X | X | X | X | ||||||||||||
| Morfologia nerwu węchowego | X | X | X | |||||||||||||
| Długość ogona | X | X | X | X | ||||||||||||
23. W momencie rozpoczęcia badania wszystkie kijanki powinny znajdować się 51. stadium rozwoju. Najbardziej widoczną morfologicznie cechą charakterystyczną określającą stadium jest w przypadku tego stadium morfologia kończyny tylnej, która została pokazana na rys. 1.
Rysunek 1.
Morfologia kończyny tylnej kijanki X. laevis w 51. stadium.
24. Oprócz wyboru na podstawie stadium rozwojowego zastosować można opcjonalnie wybór na podstawie wielkości zwierząt użytych do badania. W tym celu w dniu 0 należy zmierzyć długość całego ciała (nie długość mierzoną od otworu gębowego do odbytu) dla podpróby około 20 kijanek w 51. stadium według Nieuwkoopa i Fabera. Po obliczeniu średniej długości całego ciała dla tej grupy zwierząt można określić minimalną i maksymalną graniczną wartość długości całego ciała zwierząt użytych do badania, dopuszczając średnią wartość ± 3 mm (średnie wartości długości całego ciała dla kijanek w 51. stadium mieszczą się w przedziale między 24,0 i 28,1 mm). Stadium rozwojowe stanowi jednak zasadniczy parametr przy określaniu gotowości każdego z badanych zwierząt. Z badania wykluczyć należy kijanki z wyraźnie widocznymi wadami rozwojowymi lub urazami.
25. Kijanki spełniające opisane powyżej kryteria stadium rozwojowego przechowywane są w zbiorniku hodowlanym z czystą wodą do czasu ukończenia procesu oceny stadium. Po zakończeniu oceny stadium larwy losowo rozmieszcza się w zbiornikach zabiegowych, tak aby w każdym zbiorniku znalazło się 20 larw. Każdy ze zbiorników zabiegowych sprawdza się następnie pod kątem zwierząt o nietypowym wyglądzie (np. urazy, nietypowe zachowanie podczas pływania itd.). Kijanki mające wyraźnie niezdrowy wygląd należy usunąć ze zbiorników zabiegowych i zastąpić nowo wybranymi larwami ze wspólnego zbiornika.
Uwagi
26. W celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji dotyczących procedur zakończenia badania i postępowania z kijankami należy zapoznać się z wytyczną OECD dotyczącą histologii tarczycy płazów (Guidance Document on Amphibian Thyroid Histology) (9).
Dzień 7 Pomiary
27. W 7. dniu z każdego zbiornika badawczego usuwa się pięć losowo wybranych kijanek na każdą kontrpróbę. Wykorzystanie losowej procedury powinno zapewnić każdemu organizmowi użytemu do badania takie samo prawdopodobieństwo zostania wybranym. Można to osiągnąć, wykorzystując dowolną metodę randomizacji, ale konieczne jest złapanie każdej kijanki. Niewybrane kijanki wracają do zbiornika, z którego pochodzą, a wybrane kijanki zostają w humanitarny sposób uśmiercone za pomocą 150-200 mg/l np. MS-222 odpowiednio zbuforowanego wodorowęglanem sodu do uzyskania pH 7,0. Uśmiercone kijanki opłukuje się w wodzie i osusza na bibule, a następnie określa się ich masę ciała z dokładnością do pełnego miligrama. W odniesieniu do każdej kijanki określa się długość kończyn tylnych, długość mierzoną od otworu gębowego do odbytu i stadium rozwojowe (wykorzystując dwuokularowy mikroskop preparacyjny).
21. dzień - Pomiary (Zakończenie badania)
28. W dniu zakończenia badania (21. dzień) pozostałe kijanki usuwa się ze zbiorników badawczych i w humanitarny sposób uśmierca, jak powyżej, za pomocą 150-200 mg/l np. MS-222 odpowiednio zbuforowanego wodorowęglanem sodu. Kijanki płucze się w wodzie i osusza na bibule, a następnie określa się ich masę ciała z dokładnością do pełnego miligrama. W odniesieniu do każdej kijanki określa się jej stadium rozwojowe, długość mierzoną od otworu gębowego do odbytu i długość kończyn tylnych.
29. Wszystkie larwy umieszcza się w utrwalaczu Davidsona na 48-72 godzin albo jako próbki w postaci całego ciała albo jako próbki w postaci wyciętego fragmentu tkanki głowy zawierającego dolną szczękę do oceny histologicznej. Do celów histopatologicznych należy pobrać próbki od ogółem pięciu kijanek z każdego zbiornika z kontrpróbą. Ponieważ wysokość komórek folikularnych jest zależna od stadium (10), najodpowiedniejszym podejściem do pobierania próbek do analizy histologicznej jest wykorzystanie, o ile to możliwe, osobników dopasowane pod względem stadium. W celu wyboru osobników dopasowanych pod względem stadium wszystkie larwy muszą najpierw zostać ocenione pod kątem stadium rozwojowego przed wyborem i późniejszym przetwarzaniem na potrzeby gromadzenia danych i utrwalania. Jest to konieczne, ponieważ normalna rozbieżność w rozwoju spowoduje zróżnicowany rozkład stadiów w każdym zbiorniku z kontrpróbą.
30. Zwierzęta wybrane do badań histopatologicznych (n = 5 z każdej kontrpróby) powinny, w miarę możliwości, odpowiadać medianie stadium prób kontrolnych (połączone kontrpróby). W przypadku zbiorników z kontrpróbą, w których znajduje się więcej niż pięć larw w odpowiednim stadium, należy wybrać losowo pięć larw.
31. W przypadku zbiorników z kontrpróbą, w których znajduje się mniej niż pięć larw w odpowiednim stadium, należy losowo wybrać osobniki znajdujące się w bezpośrednio niższym lub wyższym stadium rozwoju w celu uzyskania całkowitej wielkości próby wynoszącej pięć larw na kontrpróbę. Decyzję o wybraniu dodatkowych larw z albo bezpośrednio niższego, albo bezpośrednio wyższego stadium rozwoju zaleca się podjąć na podstawie ogólnej oceny rozkładu stadiów w próbie kontrolnej i w grupie poddanej zabiegom chemicznym. Oznacza to, że jeżeli zabieg chemiczny związany jest z opóźnieniem rozwoju, należy wybrać dodatkowe larwy z bezpośrednio niższego stadium rozwoju. Jeżeli z kolei zabieg chemiczny związany jest z przyspieszeniem rozwoju, wtedy należy wybrać dodatkowe larwy z bezpośrednio wyższego stadium.
32. W przypadkach znacznych zmian w rozwoju kijanek spowodowanych zabiegami z badaną substancją chemiczną rozkład stadiów w grupie poddanej działaniu badanej substancji chemicznej może nie pokrywać się z obliczoną medianą stadium rozwojowego w próbie kontrolnej. Tylko w takich przypadkach należy zmodyfikować proces wyboru poprzez wykorzystanie stadium innego niż mediana stadium próby kontrolnej w celu uzyskania próby larw dopasowanych pod względem stadium na potrzeby histopatologii tarczycy. Ponadto jeżeli stadia są nieokreślone (tj. asynchroniczne), do analizy histologicznej należy losowo wybrać 5 kijanek z każdej kontrpróby. Należy podać przesłanki leżące u podstaw wyboru każdej larwy, której stadium nie odpowiada medianie stadium rozwojowego w próbie kontrolnej.
Określenie biologicznych punktów końcowych
33. W takcie trwającego 21 dni etapu narażenia pomiar pierwszorzędowych punktów końcowych wykonuje się w 7. i 21. dniu, konieczna jest jednak codzienna obserwacja zwierząt użytych do badania. Tabela 3 przedstawia przegląd punktów końcowych objętych pomiarami i odpowiadające im punkty czasowe obserwacji. Bardziej szczegółowe informacje dotyczące technicznych procedur pomiaru szczytowych punktów końcowych i ocen histologicznych można znaleźć w wytycznych OCED (9).
Tabela 3.
Punkty czasowe obserwacji dla pierwotnych punktów końcowych w badaniu przeobrażenia płazów
| Szczytowe punkty końcowe | Codziennie | Dzień 7 | Dzień 21 |
| - Śmiertelność | • | ||
| - Stadium rozwojowe | • | • | |
| - Długość kończyn tylnych | • | • | |
| - Długość mierzona od otworu gębowego do odbytu | • | • | |
| - Mokra masa ciała | • | • | |
| - Histologia tarczycy | • |
Szczytowe punkty końcowe
34. Stadium rozwojowe, długość kończyn tylnych, długość mierzona od otworu gębowego do odbytu oraz masa mokra to szczytowe punkty końcowe w badaniu przeobrażenia płazów, z których każdy opisano pokrótce poniżej. Dodatkowe informacje techniczne dotyczące gromadzenia tych danych są dostępne w wytycznych, o których mowa w bibliografii, obejmujących procedury wspomaganej komputerowo analizy, którą zaleca się stosować.
Stadium rozwojowe
35. Stadium rozwojowe kijanek X. laevis określa się, stosując kryteria oceny stadiów Nieuwkoopa i Fabera (8). Dane dotyczące stadium rozwojowego wykorzystuje się w celu określenia, czy rozwój jest przyspieszony, asynchroniczny, opóźniony, czy też nie ulega zmianie. Przyśpieszenie lub opóźnienie rozwoju jest określane przez porównanie mediany stadium w próbie kontrolnej i w grupach poddawanych badaniu. Rozwój asynchroniczny występuje wówczas, gdy badane tkanki nie mają wad rozwojowych lub nie są nieprawidłowe, ale odpowiedni przebieg morfogenezy lub rozwój różnych tkanek w czasie u pojedynczej kijanki są zakłócone.
Długość kończyn tylnych
36. Zróżnicowanie i rozwój kończyn tylnych są kontrolowane przez hormony tarczycy i stanowią główne charakterystyczne cechy rozwojowe wykorzystywane już do określania stadium rozwojowego. Rozwój kończyn tylnych jest wykorzystywany do jakościowej oceny stadium rozwojowego, ale tutaj uznawany jest za ilościowy punkt końcowy. W związku z tym długość kończyn tylnych mierzona jest jako punkt końcowy umożliwiający wykrycie wpływu na oś tarczycy (rys. 2). W celu zachowania spójności długość kończyn tylnych mierzy się na lewej kończynie tylnej. Długość kończyn tylnych ocenia się zarówno w 7. dniu, jak i w 21. dniu badania. W 7. dniu mierzenie długości kończyn tylnych jest proste, jak pokazano na rys. 2. Mierzenie długości kończyn tylnych w 21. dniu jest jednak bardziej skomplikowane ze względu na zagięcia kończyny. W związku z tym mierzenie długości kończyn tylnych w 21. dniu powinno rozpoczynać się przy korpusie i następnie wzdłuż środkowej linii kończyny, przechodząc przez wszystkie zgięcia. Zmiany długości kończyn tylnych w 7. dniu, nawet jeżeli nie są widoczne w 21. dniu, są nadal uznawane za znaczące ze względu na potencjalną czynność tarczycy. Pomiary długości pozyskuje się z cyfrowych fotografii, wykorzystując oprogramowanie przeznaczone do analizy obrazu, jak opisano w wytycznej OECD dotyczącej histologii tarczycy płazów (Guidance Document on Amphibian Thyroid Histology) (9).
Długość ciała i masa mokra
37. Oznaczenia długości mierzonej od otworu gębowego do odbytu (rys. 2) i masy mokrej są zawarte w protokole badań służącym do oceny ewentualnych skutków badanych substancji chemicznych na wskaźnik wzrostu kijanek w porównaniu z grupą kontrolną i są przydatne w wykrywaniu toksyczności ogólnej badanej substancji chemicznej. Ponieważ wysuszenie wody chroniącej skórę kijanek w celu określenia masy może być dla kijanek stresujące oraz powodować uszkodzenie skóry, do pomiarów wykonywanych w 7. dniu wykorzystuje się podpróbę kijanek, a wszystkie pozostałe kijanki są mierzone w dniu zakończenia badania (21. dzień). W celu zachowania spójności do pomiaru należy wykorzystać punkt położony przeciwlegle do odbytu od strony czaszkowej jako graniczny punkt pomiaru od strony ogona.
38. Długość mierzoną od otworu gębowego do odbytu wykorzystuje się do oceny wzrostu, jak przedstawiono na rys. 2.
Rysunek 2.
(A) Rodzaje pomiarów długości ciała oraz (B) pomiary długości kończyn tylnych w przypadku kijanek X. laevis (1).
Histologia gruczołu tarczowego
39. Chociaż stadium rozwojowe i długość kończyn tylnych stanowią istotne punkty końcowe pozwalające ocenić zmiany w rozwoju metamorficznym związane z narażeniem, opóźnienie w rozwoju nie może samo w sobie zostać uznane za diagnostyczny wskaźnik niekorzystnego oddziaływania na gruczoł tarczowy. Niektóre zmiany mogą zostać zauważone tylko w wyniku rutynowej analizy histopatologicznej. Kryteria diagnostyczne obejmują przerost/atrofię tarczycy, przerost komórek pęcherzykowych, hiperplazję komórek pęcherzykowych, a dodatkowe kryteria jakościowe obejmują światła pęcherzyka tarczycowego, jakość koloidu i wysokość/kształt komórek pęcherzykowych. Należy podać klasyfikację intensywności (4 stopnie). Informacje dotyczące uzyskiwania i przetwarzania próbek dla celów analiz histologicznych i dla celów przeprowadzania analiz histologicznych na próbkach tkanek są dostępne w wytycznych "Badanie przeobrażenia płazów: Częsć 1 - Wytyczne techniczne pobierania próbek morfologicznych i preparatyki histologicznej" (Amphibian Metamorphosis Assay: Part 1 - Technical guidance for morphologic sampling and histological preparation) oraz "Badanie przeobrażenia płazów: Część 2 - Interpretacja badań, kryteria diagnostyczne, klasyfikacja intensywności i kręg szczytowy" (Amphibian Metamorphosis Assay: Part 2 - Approach to reading studies, diagnostic criteria, severity grading and atlas) (9). Laboratoria przeprowadzające analizę po raz pierwszy powinny zwrócić się o radę do doświadczonych patologów w celu przeszkolenia, zanim przystąpią do analizy histologicznej i oceny tarczycy. Widoczne i znaczące zmiany szczytowych punktów końcowych wskazujące na przyspieszenie rozwoju lub rozwój asynchroniczny mogą wykluczyć konieczność przeprowadzenia analizy histopatologicznej tarczycy. Brak widocznych zmian morfologicznych lub dowodów opóźnień rozwojowych daje jednak podstawy do analiz histologicznych.
Śmiertelność
40. Należy codziennie sprawdzać wszystkie zbiorniki badawcze pod kątem martwych kijanek, których liczbę należy odnotować w odniesieniu do każdego zbiornika. W przypadku wykrycia każdego śmiertelnego przypadku należy odnotować datę, stężenie i numer zbiornika. Martwe zwierzęta należy usunąć ze zbiornika testowego natychmiast po ich zauważeniu. Wskaźnik śmiertelności powyżej 10 % może wskazywać na nieodpowiednie warunki badania lub toksyczny wpływ skutki badanej substancji chemicznej.
Dodatkowe obserwacje
41. Należy odnotować przypadki nietypowego zachowania oraz wyraźnie widocznych wad rozwojowych i uszkodzeń. Każdorazowo w przypadku stwierdzenia nietypowego zachowania, wyraźnie widocznych wad rozwojowych lub uszkodzeń należy odnotować datę, stężenie i numer zbiornika. Normalnie zachowujące się kijanki są zawieszone w słupie wody z ogonem wyżej niż głowa, ich płetwa ogonowa uderza regularnie i rytmicznie, okresowo wynurzają się na powierzchnię, poruszają pokrywami skrzelowymi i reagują na bodźce. Nietypowe zachowania obejmowałyby na przykład unoszenie się na powierzchni, leżenie na dnie zbiornika, pływanie brzuchem do góry lub w nieregularny sposób, brak wynurzania się na powierzchnię i brak reakcji na bodźce. Ponadto należy rejestrować wyraźne różnice w spożyciu pokarmu występujące między zabiegami. Wyraźnie widoczne wady rozwojowe i uszkodzenia mogą obejmować m.in. nieprawidłowości morfologiczne (np. zdeformowane kończyny), krwawiące uszkodzenia, zakażenia bakteryjne i grzybicze. Ustalenia te mają charakter jakościowy i powinno się je uważać za równoznaczne z klinicznymi objawami choroby/stresu oraz dokonywać, porównując ze zwierzętami z próby kontrolnej. Jeżeli występowanie lub częstotliwość występowania są większe w zbiorniku narażonym na działanie substancji chemicznej niż w próbach kontrolnych, należy je uznać za dowody widocznej toksyczności.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Gromadzenie danych
42. Wszystkie dane należy gromadzić przy użyciu systemów elektronicznych lub ręcznych, które są zgodne z dobrą praktyką laboratoryjną (GLP). Dane uzyskane w ramach badania powinny obejmować poniższe informacje.
Badana substancja chemiczna:
- charakterystyka badanej substancji chemicznej: właściwości fizykochemiczne; informacje dotyczące stabilności i biodegradowalności;
- informacje i dane dotyczące substancji chemicznej: metody i częstotliwości przygotowywania rozcieńczeń; informacje dotyczące badanej substancji chemicznej obejmują rzeczywiste i nominalne stężenia badanej substancji chemicznej oraz, w niektórych przypadkach, w razie potrzeby, niemacierzystej substancji chemicznej. Pomiary badanej substancji chemicznej mogą być wymagane w odniesieniu do roztworów podstawowych, jak również do roztworów do badań;
- rozpuszczalnik (jeżeli jest inny niż woda): uzasadnienie wyboru rozpuszczalnika i charakterystyka rozpuszczalnika (charakter, wykorzystane stężenie).
Warunki badania:
- dokumentacja działań: zawiera obserwacje odnoszące się do funkcjonowania układu badawczego oraz wspierającego środowiska i infrastruktury; typowa dokumentacja obejmuje: temperaturę otoczenia, temperaturę badania, fotoperiod, status najważniejszych części układu narażenia (np. pompy, liczniki cyklów, ciśnienia), natężenia przepływu, stany wody, zmiany butelek laboratoryjnych i dokumentacja dotycząca żywienia; ogólne parametry jakości wody obejmują pH, stężenie rozpuszczonego tlenu, przewodność właściwą, łączną zawartość jodu, zasadowość i twardość;
- odchylenia od metody badawczej: te informacje powinny obejmować wszystkie informacje lub opisy odchyleń od metody badawczej.
Wyniki:
- obserwacje biologiczne i dane: obejmują one dzienne obserwacje śmiertelności, spożycia pokarmu, nietypowe zachowanie podczas pływania, letarg, utratę równowagi, wady rozwojowe, uszkodzenia itd. Obserwacje i dane zgromadzone w uprzednio ustalonych odstępach obejmują: stadia rozwojowe, długość kończyn tylnych, długość mierzoną od otworu gębowego do odbytu i masę mokrą;
- zastosowane techniki statystyczno-analityczne i uzasadnienie zastosowanych technik, wyniki analizy statystycznej, najlepiej w formie tabeli;
- dane histologiczne: obejmują opisy, jak również stopnie ciężkości obserwowanych zmian i częstości ich występowania, jak szczegółowo przedstawiono w wytycznej dotyczącej histopatologii;
- obserwacje ad hoc: obserwacje te powinny obejmować opisy badania, które nie mieszczą się we wcześniej opisanych kategoriach.
Raportowanie danych
43. Dodatek 2 zawiera arkusze kalkulacyjne do codziennego gromadzenia danych, które można wykorzystać jako wytyczne dotyczące wprowadzania danych surowych i do obliczania statystyk podsumowujących. Dodatkowo dołączono tabele sprawozdawcze, które ułatwiają przekazywanie zestawień danych dotyczących punktów końcowych. Tabele sprawozdawcze dotyczące oceny histologicznej można znaleźć w dodatku 2.
Kryteria efektywności i akceptowalność/ważność badania
44. Na ogół wyraźne odchylenia od metody badawczej będą prowadziły do uzyskania danych, które będą nie do przyjęcia do celów interpretacji i sprawozdawczości. W związku z tym opracowano następujące kryteria, podane w tabeli 4, jako wytyczne w celu ustalenia jakości przeprowadzonego badania i ogólnej efektywności organizmów kontrolnych.
Tabela 4.
Kryteria efektywności dla badania przeobrażenia płazów.
| Kryterium | Dopuszczalne granice |
| Badane stężenia | Utrzymane na poziomie ≤ 20 % współczynnika zmienności (zmienność mierzonego badanego stężenia) w trakcie 21 dni badania. |
| Śmiertelność w próbach kontrolnych | ≤ 10 % - śmiertelność w dowolnej kontrpróbie w próbach kontrolnych nie powinna przekraczać 2 kijanek. |
| Minimalna mediana stadium rozwojowego w próbach kontrolnych na koniec badania | 57 |
| Rozkład stadium rozwojowego w grupie kontrolnej | 10. i 90. percentyl rozkładu stadiów rozwojowych nie powinny różnić się o więcej niż 4 stadia. |
| Rozpuszczony tlen | ≥ 40 % nasycenia powietrzem (*) |
| Kryterium | Dopuszczalne granice |
| pH | pH należy utrzymać w przedziale 6,5-8,5. Różnice między kontrpróbami i między zabiegami nie powinny przekraczać 0,5. |
| Temperatura wody | 22 ± 1 °C - różnice między kontrpróbami i między zabiegami nie powinny przekraczać 0,5 °C |
| Badane stężenia bez widocznej toksyczności | ≥ 2 |
| Wyniki kontrpróby | W całym badaniu zakłócenia mogą wystąpić w ≤ 2 kontrpróbach. |
| Szczególne warunki stosowania rozpuszczalnika | Jeżeli stosuje się nośnik rozpuszczalnikowy, należy zastosować próby kontrolne z rozpuszczalnikiem i próby kontrolne z czystą wodą, a wyniki należy zamieścić w sprawozdawaniu. |
| Statystycznie istotne różnice między próbami kontrolnymi z rozpuszczalnikiem i próbami kontrolnymi z wodą traktuje się w sposób szczególny. Więcej informacji można znaleźć poniżej. | |
| Szczególne warunki stosowania systemu wymiany statycznej | Reprezentatywne analizy chemiczne przed wymianą i po wymianie należy zamieścić w sprawozdaniu. |
| Poziom amoniaku należy zmierzyć bezpośrednio przed wymianą. | |
| Wszystkie parametry jakości wody wymienione w tabeli 1 w dodatku 1 należy mierzyć bezpośrednio przed wymianą. | |
| Okres wymiany nie powinien przekraczać 72 godzin. | |
| Odpowiedni schemat żywienia (50 % dziennej dawki pokarmowej dostępnej w handlu paszy dla kijanek). |
| (*) Napowietrzanie wody można utrzymać za pomocą bełkotek. Zaleca się ustawianie bełkotek na poziomie, który nie powoduje nadmiernego stresu u kijanek. |
Ważność badania
45. Aby badanie zostało zaakceptowane/uznane za ważne, powinno ono spełnić poniższe wymogi:
Ważny eksperyment w badaniu, którego wynik określono jako ujemny pod względem oddziaływania na gruczoł tarczowy:
(1) w odniesieniu do każdego zabiegu (łącznie z próbami kontrolnymi) śmiertelność nie może przekroczyć 10 %. W odniesieniu do każdej kontrpróby śmiertelność nie może przekroczyć trzech kijanek, w przeciwnym razie kontrpróbę uznaje się za zakłóconą;
(2) do analizy powinny być dostępne co najmniej dwa poziomy zabiegów ze wszystkimi czterema niezakłóconymi kontrpróbami;
(3) do analizy powinny być dostępne najmniej dwa poziomy zabiegów bez widocznej toksyczności.
Ważny eksperyment w badaniu, którego wynik określono jako dodatni pod względem oddziaływania na gruczoł tarczowy:
(1) w grupie kontrolnej śmiertelność nie może być większa niż dwie kijanki na kontrpróbę/grupę kontrolną.
Schemat decyzyjny do przeprowadzenia badania przeobrażenia płazów (AMA)
46. Schemat decyzyjny został opracowany na potrzeby badania przeobrażenia płazów w celu zapewnienia logicznej pomocy przy wykonywaniu i interpretacji wyników testu biologicznego (zob. schemat blokowy na rys. 3). Zasadniczo w schemacie decyzyjnym przypisuje się wagę punktom końcowym, przy czym rozwojowi zaawansowanemu, rozwojowi asynchronicznemu i histopatologii tarczycy przypisuje się dużą wagę, natomiast rozwojowi opóźnionemu, długości mierzonej od otworu gębowego do odbytu i mokrej masie ciała, czyli parametrom, na które może ewentualnie mieć wpływ toksyczność ogólna, przypisuje się mniejszą wagę.
Rysunek 3.
Schemat decyzyjny na potrzeby badania przeobrażenia płazów (AMA)
(*) Niektóre organy regulacyjne mogą wymagać badania histologicznego mimo znaczących różnic między rozwojem zaawansowanym i asynchronicznym. Jednostkę przeprowadzającą to badanie zachęca się do zasięgnięcia opinii właściwych organów przed przeprowadzeniem badania w celu ustalenia wymaganych punktów końcowych.
Zaawansowany rozwój (określony na podstawie stadium rozwojowego, długości mierzonej od otworu gębowego do odbytu i długości kończyn tylnych)
47. Wiadomo, że zaawansowany rozwój występuje wyłącznie w wyniku oddziaływań powiązanych z hormonem tarczycy. Mogą to być oddziaływania na tkanki obwodowe, takie jak bezpośrednia interakcja z receptorem hormonu tarczycy (takim jak T4) lub oddziaływania prowadzące do zmian poziomu hormonu tarczycy w układzie krążenia. W obu przypadkach uznaje się to za wystarczający dowód wskazujący, że substancja chemiczna oddziałuje na gruczoł tarczowy. Zaawansowany rozwój ocenia się na jeden z dwóch sposobów. Zgodnie z pierwszym sposobem ogólne stadium rozwojowe można ocenić, stosując metodę standardową, którą opisują szczegółowo Nieuwkoop i Faber (8). Drugi sposób polega na ilościowym określeniu cech morfologicznych, takich jak długość kończyn tylnych, w 7. i 21. dniu, co ma pozytywny związek z agonistycznym wpływem na receptor hormonu tarczycy. Jeżeli występuje istotne pod względem statystycznym przyspieszenie rozwoju lub zwiększenie długości kończyn tylnych, wówczas badanie wskazuje, że substancja chemiczna oddziałuje na gruczoł tarczowy.
48. Ocena zwierząt użytych do badania pod kątem przyspieszonego rozwoju w odniesieniu do populacji kontrolnej będzie oparta na wynikach analiz statystycznych przeprowadzonych w odniesieniu do następujących czterech punktów końcowych:
- długości kończyn tylnych (znormalizowanej długością mierzoną od otworu gębowego do odbytu) w 7. dniu badania
- długości kończyn tylnych (znormalizowanej długością mierzoną od otworu gębowego do odbytu) w 21. dniu badania
- stadium rozwojowego w 7. dniu badania
- stadium rozwojowego w 21. dniu badania.
49. Analizy statystyczne długości kończyn tylnych należy przeprowadzać na podstawie pomiarów długości lewej kończyny tylnej. Długość kończyn tylnych normalizuje się, przyjmując stosunek długości kończyn tylnych do długości mierzonej od otworu gębowego do odbytu osobnika. Następnie porównuje się średnią znormalizowanych wartości w odniesieniu do każdego poziomu zabiegu. Znaczące zwiększenie średniej długości (znormalizowanej) kończyn tylnych w badanej grupie poddawanej zabiegowi chemicznemu w porównaniu z grupą kontrolną w 7. lub 21. dniu badania wskazuje wówczas na przyspieszenie rozwoju (zob. dodatek 3).
50. Analizy statystyczne stadium rozwojowego należy przeprowadzać na podstawie ustalania stadiów rozwojowych zgodnie z kryteriami morfologicznymi, które opisują Nieuwkoop i Faber (8). Znaczące zwiększenie wartości stadium rozwojowego w badanej grupie poddawanej zabiegowi chemicznemu w porównaniu z grupą kontrolną w 7. lub 21. dniu badania, wykrytego w drodze analizy wielocentylowej, wskazuje na przyspieszenie rozwoju.
51. W metodzie badania przeobrażenia płazów znacząca zmiana w którymś z wyżej wspomnianych punktów końcowych jest uznawana za wystarczającą dla wykrycia przyspieszonego rozwoju. Oznacza to, że znaczący wpływ na długość kończyn tylnych w danym momencie nie wymaga potwierdzenia przez znaczący wpływ na długość kończyn tylnych w innym momencie ani znaczący wpływ na stadium rozwojowe w tym danym momencie. Z kolei znaczący wpływ na stadium rozwojowe w danym momencie nie wymaga potwierdzenia przez znaczący wpływ na stadium rozwojowe w innym momencie ani przez znaczący wpływ na długość kończyn tylnych w tym danym momencie. Waga dowodów przyspieszonego rozwoju zwiększy się jednak, jeżeli znaczący wpływ zostanie wykryty w przypadku większej liczby punktów końcowych niż jeden.
Rozwój asynchroniczny (określony na podstawie kryteriów stadium rozwojowego)
52. Rozwój asynchroniczny charakteryzuje się zakłóceniem przebiegu morfogenezy w czasie lub rozwoju różnych tkanek u pojedynczej kijanki. Niezdolność do wyraźnego ustalenia stadium rozwoju organizmu z wykorzystaniem ciągu morfologicznych punktów końcowych uznawanych za typowe dla danego stadium wskazuje, że tkanki rozwijają się asynchronicznie podczas przemiany. Rozwój asynchroniczny stanowi wskaźnik oddziaływania na gruczoł tarczowy. Jedyne znane działanie wywołujące rozwój asynchroniczny polega na wpływie substancji chemicznych na obwodowe działanie hormonu tarczycy lub na metabolizm hormonu tarczycy w rozwijających się tkankach, który obserwuje się na przykład dla inhibitorów dejodynazy.
53. Ocena zwierząt użytych do badania pod kątem rozwoju asynchronicznego w odniesieniu do populacji kontrolnej będzie oparta na bezpośredniej ocenie morfologicznej badanych zwierząt w 7. i 21. dniu badania.
54. Opis prawidłowego rozwoju Xenopus laevis u Nieuwkoopa i Fabera (8) stanowi ramy identyfikacji kolejności prawidłowej przebudowy tkanek. Termin "rozwój asynchroniczny" odnosi się konkretnie do tych odchyleń w ogólnym rozwoju morfologicznym kijanek, które uniemożliwiają ostateczne ustalenie stadium rozwoju zgodnie z kryteriami Nieuwkoopa i Fabera (8), ponieważ kluczowe charakterystyczne cechy morfologiczne wykazują właściwości różnych stadiów.
55. Jak wskazuje termin "rozwój asynchroniczny", należy uwzględniać tylko przypadki wykazujące odchylenia w postępie przebudowy konkretnych tkanek względem postępu przebudowy innych tkanek. U niektórych klasycznych fenotypów występuje opóźnienie w pojawieniu się kończyn przednich lub ich brak mimo prawidłowego lub zaawansowanego rozwoju tkanek kończyn tylnych i ogona lub wczesna resorpcja skrzeli w stosunku do stadium morfogenetycznego kończyn tylnych i resorpcji ogona. Zwierzę zostanie zarejestrowane jako rozwijające się asynchronicznie, jeżeli nie można przypisać go do stadium, ponieważ nie spełnia większości kryteriów rozwojowych dotyczących charakterystycznych punktów w odniesieniu do danego stadium Nieuwkoopa i Fabera (8) lub jeżeli występuje skrajne opóźnienie lub przyspieszenie wystąpienia co najmniej jednej kluczowej cechy (np. ogon całkowicie resorbowany, ale kończyny przednie nie powstały). Ocena ta przeprowadzana jest w sposób jakościowy i powinna umożliwić zbadanie pełnego ciągu charakterystycznych cech wymienionych przez Nieuwkoopa i Fabera (8). Nie jest jednak konieczne rejestrowanie stanu rozwoju różnych cech charakterystycznych obserwowanych zwierząt. Zwierzęta zarejestrowane jako wykazujące rozwój asynchroniczny nie są przypisane do stadium rozwojowego Nieuwkoopa i Fabera (8).
56. W związku z tym głównym kryterium wyznaczania przypadków nieprawidłowego rozwoju morfologicznego jako przypadków "rozwoju asynchronicznego" jest zakłócenie odpowiedniego przebieg przebudowy tkanek i morfogenezy tkanek w czasie, przy czym morfologia narażonych tkanek nie wykazuje wyraźnych nieprawidłowości. Jednym z przykładów ilustrujących tę interpretację ogólnych nieprawidłowości morfologicznych jest to, że opóźniona morfogeneza kończyn tylnych w stosunku do rozwoju innych tkanek spełni kryterium "rozwoju asynchronicznego", natomiast przypadki braku kończyn tylnych, nieprawidłowej liczby kończyn (np. ektrodaktylia, polidaktylia) lub występowanie innych wyraźnych wad rozwojowych kończyn nie powinny być traktowane jako przypadki "rozwoju asynchronicznego".
57. W tym kontekście główne morfologiczne cechy charakterystyczne, które należy ocenić pod kątem ich skoordynowanego rozwoju metamorficznego, powinny obejmować morfogenezę kończyn tylnych, morfogenezę kończyn przednich, powstanie kończyn przednich, etap resorpcji ogona i morfologię głowy (np. rozmiar skrzeli i etap resorpcji skrzeli, morfologię dolnej szczęki, wystawanie chrząstki Meckela).
58. W zależności od charakteru działania substancji chemicznej mogą wystąpić różne ogólne fenotypy morfologiczne. U niektórych klasycznych fenotypów występuje brak kończyn przednich lub opóźnienie w ich pojawieniu się pomimo prawidłowego lub zaawansowanego rozwoju tkanek kończyn tylnych i ogona lub wczesnej resorpcji skrzeli w stosunku do przebudowy kończyn tylnych i ogona.
Histopatologia
59. Jeżeli substancja chemiczna nie powoduje widocznej toksyczności i nie przyspiesza rozwoju ani nie powoduje rozwoju asynchronicznego, ocenia się histopatologię tarczycy kierując się odpowiednimi wytycznymi (9). Opóźnienie rozwojowe przy braku toksyczności stanowi wyraźny wskaźnik niekorzystnego oddziaływania na gruczoł tarczowy, analiza stadium rozwojowego jest jednak mniej wrażliwa i charakteryzuje się słabszą diagnostyką niż analiza histopatologiczna tarczycy. W związku z tym przeprowadzanie analiz histopatologicznych tarczycy jest w tym przypadku wymagane. Zmiany w histologii tarczycy zostały wykazane przy braku zmian rozwojowych. Jeżeli występują zmiany w histopatologii tarczycy, uważa się, że substancja chemiczna oddziałuje na gruczoł tarczowy. Jeżeli nie zaobserwuje się żadnych opóźnień rozwojowych ani uszkodzeń histologicznych w tarczycy, uważa się, że substancja chemiczna nie oddziałuje na gruczoł tarczowy. Uzasadnienie tej decyzji jest takie, że na gruczoł tarczowy wpływa TSH i każda substancja chemiczna, która wpływa na poziom hormonu tarczycy w układzie krążenia w wystarczającym stopniu, aby zmienić wydzielanie TSH, wywoła zmiany histopatologiczne w tarczycy. Różne tryby i mechanizmy działania mogą powodować zmiany poziomu hormonu tarczycy w układzie krążenia. Tak więc chociaż poziom hormonu tarczycy wskazuje na zmiany związane z tarczycą, nie wystarczy określić, który tryb czy mechanizm działania jest związany z tą reakcją.
60. W związku z tym, że do tego punktu końcowego nie da się zastosować podstawowych metod statystycznych, określenie wpływu związanego z narażeniem na substancję chemiczną powinno nastąpić w oparciu o ekspertyzę patologa.
Rozwój opóźniony (określony na podstawie kryteriów stadium rozwojowego, długości kończyn tylnych, masy ciała, długości mierzonej od otworu gębowego do odbytu)
61. Opóźniony rozwój może być spowodowany przez mechanizmy antytyroidowe i przez toksyczność pośrednią. Lekkie opóźnienia rozwojowe połączone z widocznymi oznakami toksyczności prawdopodobnie wskazują na niespecyficzne działanie toksyczne. Ocena toksyczności pozatarczycowej stanowi istotną część badania mającego na celu zmniejszenie prawdopodobieństwa fałszywie dodatnich wyników. Nadmierna śmiertelność stanowi oczywiste wskazanie, że występują inne toksyczne mechanizmy. Podobnie umiarkowane zmniejszenie wzrostu, określone przez masę mokrą lub długość mierzoną od otworu gębowego do odbytu, również wskazuje na toksyczność pozatarczycową. Widoczne przyspieszenia wzrostu obserwuje się powszechnie w przypadku substancji chemicznych, które mają negatywny wpływ na prawidłowy rozwój. W związku z tym obecność większych osobników nie musi wskazywać na toksyczność pozatarczycową. W celu określenia toksyczności tarczycowej nie należy jednakże polegać wyłącznie na wzroście. Należy raczej wykorzystywać wzrost w połączeniu ze stadium rozwojowym i histopatologią tarczycy w celu określenia oddziaływania na gruczoł tarczowy. Przy określaniu widocznej toksyczności należy raczej uwzględniać również inne punkty końcowe, takie jak obrzęk, uszkodzenia krwotoczne, letarg, ograniczone spożycie pokarmu, nieskoordynowane ruchy lub zmienione zachowanie podczas pływania itp. Jeżeli wszystkie badane stężenia wykazują oznaki widocznej toksyczności, badana substancja chemiczna powinna zostać poddana ponownej ocenie przy niższych badanych stężeniach, zanim określi się, czy ta substancja chemiczna potencjalnie oddziałuje na tarczycę, czy nie.
62. Przy braku innych oznak wyraźnej toksyczności istotne statystycznie opóźnienia rozwojowe wskazują, że substancja chemiczna oddziałuje na tarczycę (działanie antagonistyczne). Przy braku istotnych statystycznie reakcji wynik ten może zostać poszerzony o wyniki z histopatologii tarczycy.
Analizy statystyczne
63. Statystyczne analizy danych najlepiej jest wykonywać zgodnie z procedurami opisanymi w dokumencie "Aktualne podejście do statystycznej analizy danych ekotoksyczności: wytyczne stosowania" (Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application) (11). W przypadku wszystkich ciągłych ilościowych punktów końcowych (długości kończyn tylnych, długości mierzonej od otworu gębowego do odbytu, masy mokrej) zgodnych z monotoniczną zależnością dawka-odpowiedź należy zastosować regresyjny test Jonckheere'a-Terpstry w celu ustalenia istotnego wyniku zabiegu.
64. W przypadku ciągłych punktów końcowych, które nie są zgodne z monotoniczną zależnością dawka-odpowiedź, dane należy oceniać pod kątem normalności (preferuje się stosowanie testu Shapiro-Wilka lub testu Andersona-Darlinga) i jednorodności wariancji (preferuje się stosowanie testu Levene'a). Oba testy przeprowadza się na resztach ANOVA. Zamiast tych formalnych badań normalności i jednorodności wariancji można oprzeć się na swojej najlepszej wiedzy, jednak preferowane są badania formalne. W przypadku stwierdzenia odchylenia od normy lub niejednorodności wariancji, należy dążyć do transformacji normalizującej i stabilizującej wariancję. Jeżeli dane (na przykład po transformacji) mają rozkład normalny o jednorodnej wariancji, określa się istotny wynik zabiegu na podstawie testu Dunnetta. Jeżeli dane (na przykład po transformacji) posiadają rozkład normalny o niejednorodnej wariancji, określa się istotny wynik zabiegu na podstawie testu Tamhane'a-Dunnetta albo testu T3 lub testu U Manna-Whitmana-Wilcoxona. W przypadku gdy nie można ustalić żadnej normalizującej transformacji, istotny wynik zabiegu określa się na podstawie testu U Manna-Whitneya-Wilcoxona z wykorzystaniem dopasowania wartośći p Bonferroniego-Holma. Test Dunnetta stosuje się niezależnie od testu ANOVA F, a test Manna-Whitneya stosuje się niezależnie od ogólnego testu Kruskalla-Wallisa.
65. Nie przewiduje się istotnej śmiertelności, należy ją jednak ocenić na podstawie regresyjnego testu Cochrana-Armitage'a, gdzie dane są zgodne z monotonicznością zależności dawka-odpowiedź, a w innych przypadkach z dokładnym testem Fischera z dopasowaniem Bonferroniego-Holma.
66. Istotny wynik zabiegu dla stadium rozwojowego określa się na podstawie regresyjnego testu Jonckheere'a-Terpstry zastosowanego do median kontrprób. Ewentualnie lepiej jest zastosować wielocentylowy test Jonckheere'a od 20. do 80. percentyla do określenia wyniku, ponieważ uwzględnia się w nim zmiany w profilu rozmieszczenia.
67. Właściwą jednostką analizy jest kontrpróba, zatem dane składają się z median kontrprób w przypadku zastosowania testu Jonckheere'a-Terpstry lub testu U Manna-Whitneya lub ze średnich kontrprób, jeżeli stosuje się test Dunnetta. Monotoniczność zależności dawka-odpowiedź można ocenić wzrokowo na podstawie średnich lub median kontrpróby i zabiegu lub na podstawie testów formalnych, takich jak opisane powyżej (11). Przy liczbie kontrprób na zabieg lub próbę kontrolną mniejszej niż pięć należy zastosować wersje dokładnych permutacji tekstów Jonckheere'a-Terpstry i Manna-Whitneya, jeżeli są one dostępne. Poziom istotności statystycznej wszystkich wskazanych testów ocenia się na poziomie istotności 0,05.
68. Rysunek 4 przedstawia schemat blokowy do przeprowadzania testów statystycznych na danych ciągłych.
Rysunek 4.
Schemat blokowy przedstawiający statystyczne metody w odniesieniu do danych będących zmiennymi ciągłymi.
Schemat blokowy do przeprowadzania testów na danych ciągłych
Szczególne warunki analizy danych
Wykorzystanie zakłóconych poziomów zabiegu
69. Przy ustalaniu, czy kontrpróba lub cały zabieg wykazują wyraźną toksyczność i powinny zostać usunięte z analizy, należy uwzględnić kilka czynników. Wyraźną toksyczność definiuje się jako śmiertelność w dowolnej kontrpróbie > 2, którą można wyjaśnić wyłącznie toksycznością, a nie błędem technicznym. Inne oznaki wyraźnej toksyczności to krwotok, nietypowe zachowania, nietypowe wzorce pływania, brak łaknienia i wszelkie inne kliniczne objawy choroby. W przypadku subletalnych objawów toksyczności niezbędne mogą być oceny jakościowe, które zawsze należy przeprowadzać w odniesieniu do grupy kontrolnej z czystą wodą.
Próby kontrolne z rozpuszczalnikiem
70. Użycie rozpuszczalnika należy brać pod uwagę tylko w ostateczności, po uwzględnieniu wszystkich innych opcji wprowadzenia substancji chemicznej. W przypadku zastosowania rozpuszczalnika należy jednocześnie wykonać próbę kontrolną z czystą wodą. Na zakończenie badania należy przeprowadzić ocenę potencjalnego wpływu rozpuszczalnika. Dokonuje się tego porównując statystycznie grupę kontrolną z rozpuszczalnikiem i grupę kontrolną z czystą wodą. Najbardziej właściwe punkty końcowe, które należy uwzględnić w tej analizie, to stadium rozwojowe, długość mierzona od otworu gębowego do odbytu i masa mokra, które mogą zmienić się pod wpływem toksyczności pozatarczycowej. Jeżeli w tych punktach końcowych wykryje się statystycznie istotne różnice między grupą kontrolną z czystą wodą i grupą kontrolną z rozpuszczalnikiem, należy określić punkty końcowe dla zmierzonych wielkości reakcji z wykorzystaniem próby kontrolnej z czystą wodą. Jeżeli nie istnieje żadna statystycznie istotna różnica między próbą kontrolną z czystą wodą i próbą kontrolną z rozpuszczalnikiem dla wszystkich zmierzonych zmiennych wielkości reakcji, należy określić punkty końcowe badania w odniesieniu do pomiarów wielkości reakcji, wykorzystując w tym celu połączone próby kontrolne z wodą rozcieńczającą i próby kontrolne z rozpuszczalnikiem.
Grupy badane poddane zabiegowi osiągające 60. stadium rozwoju i wyższe
71. Po 60. stadium rozwoju następuje zmniejszenie wymiarów i wagi kijanek ze względu na resorpcję tkanek i zmniejszenie bezwzględnej zawartości wody w ich organizmie. Zatem nie można odpowiednio wykorzystywać pomiarów masy mokrej i długości mierzonej od otworu gębowego do odbytu w analizach statystycznych, których przedmiotem są różnice w tempie wzrostu. W związku z tym dane dotyczące masy mokrej i długości organizmów > NF60 należy odciąć i nie można wykorzystywać ich do analiz średnich lub median kontrprób. Do analizy tych dwóch parametrów związanych ze wzrostem można zastosować dwa różne podejścia.
72. Jedno podejście polega na uwzględnieniu wyłącznie kijanek w stadiach rozwojowych niższych lub równych 60. stadium dla celów analiz statystycznych masy mokrej lub długości mierzonej od otworu gębowego do odbytu. Uważa się, że podejście to zapewnia uzyskanie wystarczająco szczegółowych informacji na temat intensywności możliwych zmian wzrostu, jeżeli z analiz usuwa się tylko niewielką część zwierząt użytych do badania (≤ 20 %). Jeżeli większa liczba kijanek wykazuje rozwój wykraczający poza 60. stadium (≥ 20 %) w co najmniej jednym stężeniu nominalnym, w odniesieniu do wszystkich kijanek należy zastosować dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) o zagnieżdżonej strukturze wariancji w celu dokonania oceny wpływu zabiegów chemicznych na wzrost, uwzględniając wpływ zaawansowanego stadium rozwoju na wzrost. Dodatek 3 przedstawia wytyczne dotyczące dwuczynnikowej analizy ANOVA masy i długości.
BIBLIOGRAFIA
(1) OECD (2004) Report of the Validation of the Amphibian Metamorphosis Assay for the detection of thyroid active substances: Phase 1 - Optimisation of the Test Protocol. Publikacje na temat zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego. Seria dotycząca badań i oceny, nr 77, Paryż.
(2) OECD (2007) Final Report of the Validation of the Amphibian Metamorphosis Assay: Phase 2 - Multi-chemical Interlaboratory Study. Publikacje na temat zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego. Seria dotycząca badań i oceny, nr 76, Paryż.
(3) OECD (2008) Report of the Validation Peer Review for the Amphibian Metamorphosis Assay and Agreement of the Working Group of the National Coordinators of the Test Guidelines Programme on the Follow-up of this Report. Publikacje na temat zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego. Seria dotycząca badań i oceny, nr 92, Paryż.
(4) OECD (2000): Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Publikacje na temat zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego. Seria dotycząca badań i oceny, nr 23, Paryż.
(5) ASTM (2002) Standard Guide for Conducting Acute Toxicity Tests on Test Materials with Fishes, Macroinverte-brates, and Amphibians. Amerykańskie Stowarzyszenie Badań i Materiałów, ASTM E729-96(2002), Filadelfia, PA.
(6) ASTM (2004) Standard Guide for Conducting the Frog Embryo Teratogenesis Assay - Xenopus (FETAX). E 1439-98.
(7) Kahl, M.D., Russom, C.L., DeFoe, D.L. i Hammermeister, D.E. (1999) Saturation units for use in aquatic bioassays. Chemosphere 39, s. 539-551.
(8) Nieuwkoop, P.D. i Faber, J. (1994) Normal Table of Xenopus laevis. Garland Publishing, Nowy Jork.
(9) OECD (2007) Guidance Document on Amphibian Thyroid Histology. Publikacje na temat zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego. Seria dotycząca badań i oceny, nr 82, Paryż.
(10) Dodd,M.H.I. & Dodd,J.M. (1976) Physiology of Amphibia. Lofts,B. (red.), Academic Press, Nowy Jork, s. 467-599
(11) OECD (2006) Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application. Publikacje na temat zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego. Seria dotycząca badań i oceny, nr 54, Paryż.
(12) Hutchinson, T.H., Shillabeer, N., Winter, M.J., Pickford, D.B., 2006. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Review. Aquatic Toxicology, 76; ss. 69-92.
Dodatek 1
Tabela 1
Warunki doświadczalne dla 21-dniowego badania przeobrażenia płazów
| Zwierzę użyte do badania | Larwy Xenopus laevis |
| Etap: początkowe stadium larwalne | 51. stadium Nieuwkoopa i Fabera |
| Okres narażenia | 21 dni |
| Kryteria wyboru larw | Stadium rozwojowe i długość całkowita (opcjonalnie) |
| Badane stężenia | Co najmniej 3 stężenia obejmujące w przybliżeniu jeden rząd wielkości |
| System narażenia | Przepływowy (preferowany) lub wymiana statyczna |
| Prędkość przepływu układu badawczego | 25 ml/min. (pełna wymiana objętości co ok. 2,7 h) |
| Podstawowe parametry docelowe/ dni określania | Śmiertelność | Codziennie |
| Stadium rozwojowe | 7. i 21. dzień | |
| Długość kończyn tylnych | 7. i 21. dzień | |
| Długość mierzona od otworu gębowego do odbytu: | 7. i 21. dzień | |
| Mokra masa ciała | 7. i 21. dzień | |
| Histologia tarczycy | 21. dzień |
| Woda rozcieńczająca/ laboratoryjna próba kontrolna | Odchlorowana woda wodociągowa (filtrowana na węglu aktywnym) lub woda laboratoryjna o równoważnych właściwościach |
| Zagęszczenie larw | 20 larw na naczynie badawcze (5/l) |
| Roztwór do badań/ naczynie badawcze | 4-10 l (minimalny poziom wody 10-15 cm) / naczynie badawcze ze szkła lub stali nierdzewnej (np. 22,5 cm × 14 cm × 16,5 cm) |
| Kontrpróby | 4 naczynia badawcze z kontrpróbą/ badane stężenie i próba kontrolna |
| Akceptowalny wskaźnik śmiertelności w próbach kontrolnych | ≤ 10 % na naczynie badawcze z kontrpróbą |
| Utrwalenie tarczycy | Utrwalona liczba | Wszystkie kijanki (początkowo ocenia się 5 na kontrpróbę) |
| Strefa | Głowa lub całe ciało | |
| Płyn utrwalający | Utrwalacz Davidsona | |
| Karmienie | Pokarm | Sera Micron® lub równoważny |
| Ilość / Częstotliwość | Zob. tabela 1 dotycząca schematu żywienia przy wykorzystaniu Sera Micron® | |
| Oświetlenie | Fotoperiod | 12 h światła: 12 h ciemności |
| Intensywność | 600- 2 000 luksów (mierzone na powierzchni wody) |
| Temperatura wody | 22 ± 1 °C |
| pH | 6,5 - 8,5 |
| Stężenie rozpuszczonego tlenu (DO) | > 3,5 mg/l (> 40 % nasycenia powietrzem) |
| Harmonogram analiz chemicznych próby | Raz na tydzień (4 pobrania/badanie) |
Dodatek 2
Tabele sprawozdawcze do gromadzenia danych surowych i zestawień danych
Tabela 1
Informacje ogólne na temat badanej substancji chemicznej
| Informacje dotyczące substancji chemicznej: |
| Podać badaną substancję chemiczną, jednostki stężenia i zabiegi |
| Badana substancja chemiczna: | |||
| Jednostki stężenia: | |||
| Zabieg 1 | |||
| Zabieg 2 | |||
| Zabieg 3 | |||
| Zabieg 4 | |||
| Data (dzień 0): | Podać datę (dd/mm/yy) | ||
| Data (dzień 7): | Podać datę (dd/mm/yy) | ||
| Data (dzień 21): | Podać datę (dd/mm/yy) |
Tabela 2
Arkusze do gromadzenia danych surowych z 7. i 21. dnia
| DZIEŃ X DATA: 00/00/00 |
| Stężenie | Numer zabiegu | Numer kontrpróby | Numer osobnika | Identyfikator osobnika | Stadium rozwojowe | Długość mierzona od otworu gębowego do odbytu (mm) | Długość kończyn tylnych (mm) | Mokra masa całego organizmu (mg) | |
| WIERSZ | TRT | TRT# | REP | IND | ID# | STADIUM | BL | Długość kończyn tylnych | MASA |
| 1 | 0,00 | 1 | |||||||
| 2 | 0,00 | 1 | |||||||
| 3 | 0,00 | 1 | |||||||
| 4 | 0,00 | 1 | |||||||
| 5 | 0,00 | 1 | |||||||
| 6 | 0,00 | 1 | |||||||
| 7 | 0,00 | 1 | |||||||
| 8 | 0,00 | 1 | |||||||
| 9 | 0,00 | 1 | |||||||
| 10 | 0,00 | 1 | |||||||
| 11 | 0,00 | 1 | |||||||
| 12 | 0,00 | 1 | |||||||
| 13 | 0,00 | 1 | |||||||
| 14 | 0,00 | 1 | |||||||
| 15 | 0,00 | 1 | |||||||
| 16 | 0,00 | 1 | |||||||
| 17 | 0,00 | 1 | |||||||
| 18 | 0,00 | 1 | |||||||
| 19 | 0,00 | 1 | |||||||
| 20 | 0,00 | 1 | |||||||
| 21 | 0,00 | 2 | |||||||
| 22 | 0,00 | 2 | |||||||
| 23 | 0,00 | 2 | |||||||
| 24 | 0,00 | 2 | |||||||
| 25 | 0,00 | 2 | |||||||
| 26 | 0,00 | 2 | |||||||
| 27 | 0,00 | 2 | |||||||
| 28 | 0,00 | 2 | |||||||
| 29 | 0,00 | 2 | |||||||
| 30 | 0,00 | 2 | |||||||
| 31 | 0,00 | 2 | |||||||
| 32 | 0,00 | 2 | |||||||
| 33 | 0,00 | 2 | |||||||
| 34 | 0,00 | 2 | |||||||
| 35 | 0,00 | 2 | |||||||
| 36 | 0,00 | 2 | |||||||
| 37 | 0,00 | 2 | |||||||
| 38 | 0,00 | 2 | |||||||
| 39 | 0,00 | 2 | |||||||
| 40 | 0,00 | 2 | |||||||
| 41 | 0,00 | 3 | |||||||
| 42 | 0,00 | 3 | |||||||
| 43 | 0,00 | 3 | |||||||
| 44 | 0,00 | 3 | |||||||
| 45 | 0,00 | 3 | |||||||
| 46 | 0,00 | 3 | |||||||
| 47 | 0,00 | 3 | |||||||
| 48 | 0,00 | 3 | |||||||
| 49 | 0,00 | 3 | |||||||
| 50 | 0,00 | 3 | |||||||
| 51 | 0,00 | 3 | |||||||
| 52 | 0,00 | 3 | |||||||
| 53 | 0,00 | 3 | |||||||
| 54 | 0,00 | 3 | |||||||
| 55 | 0,00 | 3 | |||||||
| 56 | 0,00 | 3 | |||||||
| 57 | 0,00 | 3 | |||||||
| 58 | 0,00 | 3 | |||||||
| 59 | 0,00 | 3 | |||||||
| 60 | 0,00 | 3 | |||||||
| 61 | 0,00 | 4 | |||||||
| 62 | 0,00 | 4 | |||||||
| 63 | 0,00 | 4 | |||||||
| 64 | 0,00 | 4 | |||||||
| 65 | 0,00 | 4 | |||||||
| 66 | 0,00 | 4 | |||||||
| 67 | 0,00 | 4 | |||||||
| 68 | 0,00 | 4 | |||||||
| 69 | 0,00 | 4 | |||||||
| 70 | 0,00 | 4 | |||||||
| 71 | 0,00 | 4 | |||||||
| 72 | 0,00 | 4 | |||||||
| 73 | 0,00 | 4 | |||||||
| 74 | 0,00 | 4 | |||||||
| 75 | 0,00 | 4 | |||||||
| 76 | 0,00 | 4 | |||||||
| 77 | 0,00 | 4 | |||||||
| 78 | 0,00 | 4 | |||||||
| 79 | 0,00 | 4 | |||||||
| 80 | 0,00 | 4 |
Tabela 3
Obliczone zestawienia danych dotyczących punktów końcowych z 7. i 21. dnia
| Stadium rozwojowe | Długość mierzona od otworu gębowego do odbytu (mm) | Długość kończyn tylnych (mm) | Masa (mg) |
| TRT | REP | MIN | MEDIANA | MAX | ŚREDNIA | ODCHYLENIE STANDARDOWE | ŚREDNIA | ODCHYLENIE STANDARDOWE | ŚREDNIA | ODCHYLENIE STANDARDOWE |
| 1 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| 1 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| 1 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| 1 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| 2 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| 2 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| 2 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| 2 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| 3 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| 3 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| 3 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| 3 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| 4 | 1 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| 4 | 2 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| 4 | 3 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| 4 | 4 | 0 | #NUM! | 0 | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! | #DIV/0! |
| Uwaga: wartości obliczone w komórkach są powiązane z danymi wprowadzonymi do tabeli 2. |
Tabela 4
Dzienne dane dotyczące śmiertelności
| Dzień badania | Data | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 0 | 00/00/00 | ||||||||||||||||
| 1 | #Value! | ||||||||||||||||
| 2 | #Value! | ||||||||||||||||
| 3 | #Value! | ||||||||||||||||
| 4 | #Value! | ||||||||||||||||
| 5 | #Value! | ||||||||||||||||
| 6 | #Value! | ||||||||||||||||
| 7 | #Value! | ||||||||||||||||
| 8 | #Value! | ||||||||||||||||
| 9 | #Value! | ||||||||||||||||
| 10 | #Value! | ||||||||||||||||
| 11 | #Value! | ||||||||||||||||
| 12 | #Value! | ||||||||||||||||
| 13 | #Value! | ||||||||||||||||
| 14 | #Value! | ||||||||||||||||
| 15 | #Value! | ||||||||||||||||
| 16 | #Value! | ||||||||||||||||
| 17 | #Value! | ||||||||||||||||
| 18 | #Value! | ||||||||||||||||
| 19 | #Value! | ||||||||||||||||
| 20 | #Value! | ||||||||||||||||
| 21 | #Value! | ||||||||||||||||
| Liczba kontrprób | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Liczba zabiegów | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Uwaga: wartości obliczone w komórkach są powiązane z danymi wprowadzonymi do tabeli 1. |
Tabela 5
Kryteria jakości wody
| Układ narażenia (przepływowy/wymiana statyczna): |
| Temperatura: |
| Natężenie światła: |
| Cykl światło/ciemność: |
| Pokarm: |
| Częstotliwość karmienia: |
| pH wody: |
| Stężenie jodu w wodzie użytej do badania: |
Tabela 6
Podsumowanie danych chemicznych
| Nazwa systematyczna: |
| Nr CAS: |
| Dzień badania | Data | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 0 | 00/00/00 | ||||||||||||||||||||
| 1 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 2 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 3 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 4 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 5 | #Value! |
| 6 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 7 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 8 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 9 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 10 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 11 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 12 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 13 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 14 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 15 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 16 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 17 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 18 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 19 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 20 | #Value! | ||||||||||||||||||||
| 21 | #Value! |
| Uwaga: wartości obliczone w komórkach są powiązane z danymi wprowadzonymi do tabeli 1. |
Tabela 7
Histopatologiczne tabele sprawozdawcze dotyczące podstawowych kryteriów
| Data: | Substancja chemiczna: | Patolog: |
| Przerost gruczołu tarczowego | Atrofia gruczołu tarczowego | Przerost komórek pęcherzykowych | Hiperplazja komórek pęcherzykowych | Przerost gruczołu tarczowego | Atrofia gruczołu tarczowego | Przerost komórek pęcherzykowych | Hiperplazja komórek pęcherzykowych | |||||
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 1 | Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 1 | |||||||||||
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 2 | Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 2 | |||||||||||
| Ogółem: | Ogółem: | |||||||||
| Przerost gruczołu tarczowego | Atrofia gruczołu tarczowego | Przerost komórek pęcherzykowych | Hiperplazja komórek pęcherzykowych | Przerost gruczołu tarczowego | Atrofia gruczołu tarczowego | Przerost komórek pęcherzykowych | Hiperplazja komórek pęcherzykowych | |||||
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 1 | Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 1 | |||||||||||
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 2 | Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 2 | |||||||||||
| Ogółem: | Ogółem: |
Tabela 8
Dodatkowe kryteria histopatologiczne
| Data | Substancja chemiczna: | Patolog: |
| Powiększenie światła pęcherzyka tarczycowego | Zmniejszenie światła pęcherzyka tarczycowego | Powiększenie światła pęcherzyka tarczycowego | Zmniejszenie światła pęcherzyka tarczycowego | |||||
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 1 | Identyfikator zwierzęcia z grupy dawkowania -kontrpróba 1 | |||||||
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 2 | Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 2 | |||||||
| Ogółem: | Ogółem: | |||||
| Powiększenie światła pęcherzyka tarczycowego | Zmniejszenie światła pęcherzyka tarczycowego | Powiększenie światła pęcherzyka tarczycowego | Zmniejszenie światła pęcherzyka tarczycowego | |||||
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 1 | Identyfikator zwierzęcia z grupy dawkowania -kontrpróba 1 | |||||||
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 2 | Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 2 | |||||||
| Ogółem: | Ogółem: |
Tabela 9
Opis wyników badań histopatologicznych
Data:
Substancja chemiczna:
Patolog:
Opis
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 1 | ||
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 2 | ||
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 1 | ||
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 2 | ||
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 1 | ||
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 2 | ||
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 1 | ||
| Identyfikator zwierzęcia z próby kontrolnej - kontrpróba 2 | ||
Tabela 10
Wzór zbiorczej tabeli sprawozdawczej w odniesieniu do dnia x (7 lub 21) badania przeobrażenia płazów
| Próba kontrolna | Dawka 1 | Dawka 2 | Dawka 3 |
| Punkt końcowy | Kontrpróba | Średnia | SD | CV | N | Średnia | SD | CV | N | wartość p | Średnia | SD | CV | N | wartość p | Średnia | SD | CV | N | wartość p |
| Długość kończyn tylnych (mm) | 1 | |||||||||||||||||||
| 2 | ||||||||||||||||||||
| 3 | ||||||||||||||||||||
| 4 | ||||||||||||||||||||
| Średnia: | ||||||||||||||||||||
| Długość mierzona od otworu gębowego do odbytu (SVL) (mm) | 1 | |||||||||||||||||||
| 2 | ||||||||||||||||||||
| 3 | ||||||||||||||||||||
| 4 | ||||||||||||||||||||
| Średnia: | ||||||||||||||||||||
| Masa mokra (mg) | 1 | |||||||||||||||||||
| 2 | ||||||||||||||||||||
| 3 | ||||||||||||||||||||
| 4 | ||||||||||||||||||||
| Średnia: |
Tabela 11
Wzór zbiorczej tabeli sprawozdawczej w odniesieniu do danych dotyczących stadium rozwojowego z dnia x (7. lub 21.) badania przeobrażenia płazów (AMA)
| Próba kontrolna | Dawka 1 | Dawka 2 | Dawka 3 |
| Kontrpróba | Mediana | Min | Maks | N | Mediana | Min | Maks | N | wartość p | Mediana | Min | Maks | N | wartość p | Mediana | Min | Maks | Mediana | wartość p | |
| Stadium rozwojowe | 1 | |||||||||||||||||||
| 2 | ||||||||||||||||||||
| 3 | ||||||||||||||||||||
| 4 | ||||||||||||||||||||
| Średnia: |
Dodatek 3
Alternatywna analiza masy i długości w przypadku zaawansowanego stadium rozwoju u ponad 20 % kijanek w co najmniej jednym stężeniu
Jeżeli większa liczba kijanek wykazuje tendencje rozwojowe wykraczające poza 60. stadium (≥ 20 %) w co najmniej jednym stężeniu nominalnym, w odniesieniu do wszystkich kijanek należy zastosować dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) o zagnieżdżonej strukturze wariancji w celu dokonania oceny wpływu zabiegów chemicznych na wzrost, uwzględniając wpływ zaawansowanego stadium rozwoju na wzrost.
Proponuje się wykorzystanie wszystkich danych, uwzględniając wpływ zaawansowanego stadium rozwoju. Można tego dokonać za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji ANOVA o zagnieżdżonej strukturze wariancji. W pozycji LateStage podać "tak" w odniesieniu do zwierzęcia, jeżeli jego stadium rozwojowe to co najmniej 61. stadium. W przeciwnym razie w pozycji LateStage podać "nie". Następnie można wykonać dwuczynnikową analizę wariancji ANOVA obejmującą stężenie i pozycję LateStage oraz ich interakcję, przyjmując czynnik losowy Rep(Conc) i inny efekt losowy Tadpole(Rep). Rep jest tu jeszcze traktowane jako jednostka analizy i zasadniczo pozwala na osiągnięcie takich samych wyników jak ważona analiza wartości średnich rep*latestage, ważona liczbą zwierząt w stosunku do wartości średniej. Jeżeli dane naruszają wymogi normalności lub jednorodności analizy wariancji ANOVA, można wykonać znormalizowaną transformację hierarchii, aby pozbyć się tego zastrzeżenia.
Oprócz standardowych testów F ANOVA w odniesieniu do efektów Conc, LateStage i ich interakcji, test F interakcji można podzielić na dwa dodatkowe testy F ANOVA, jeden dotyczący średnich reakcji w poszczególnych stężeniach w odniesieniu do LateStage="nie" i drugi dotyczący średnich reakcji w poszczególnych stężeniach w odniesieniu do LateStage="tak". Dalsze porównania średnich z grup poddawanych zabiegowi z próbą kontrolną wykonuje się w ramach każdego poziomu zaawansowanego stadium. Analizę trendu można wykonać, stosując odpowiednie przeciwieństwa, lub można dokonać zwykłego porównania par, jeżeli istnieją dowody niemonotonnej zależności dawka-odpowiedź w ramach poziomu zmiennej stadium zaawansowanego. Korekty wartości p metodą Bonfer-roniego-Holma dokonuje się jedynie wówczas, gdy odpowiednia część F rozkładu nie jest znacząca. Można dokonać tego za pomocą systemu SAS oraz przypuszczalnie za pomocą innych pakietów oprogramowania statystycznego. Komplikacje mogą pojawić się w przypadku gdy w niektórych stężeniach nie występują zwierzęta w zaawansowanym stadium rozwoju, ale z takimi sytuacjami można jednak poradzić sobie w zwykły sposób.
Dodatek 4
Definicje
Substancja chemiczna: oznacza substancję lub mieszaninę.
Badana substancja chemiczna: oznacza dowolną substancję lub mieszaninę badaną za pomocą opisywanej metody badawczej
C.39. BADANIE ROZRODCZOŚCI SKOCZOGONKÓW (COLLEMBOLA) W GLEBIE
Skreślono pełny opis tej metody badania. Równoważną międzynarodową metodę badania przedstawiono w części 0 tabela 3.
C.40. BADANIE TOKSYCZNOŚCI W UKŁADZIE OSAD-WODA W CYKLU ŻYCIA OCHOTKOWATYCH Z WYKORZYSTANIEM WZBOGACONEJ WODY LUB WZBOGACONEGO OSADU
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna z wytyczną OECD nr 233 (2010 r.) w sprawie badań. Metoda ma na celu ocenę skutków trwającego przez całe życie narażenia słodkowodnych muchówek z gatunku Chironomus na działanie substancji chemicznych i obejmuje w całości pierwsze pokolenie (pokolenie P) oraz początek drugiego pokolenia (pokolenie F1). Stanowi ona rozszerzenie istniejących metod badawczych C.28 (1) lub C.27 (15), w których stosuje się, odpowiednio, scenariusz narażenia we wzbogaconej wodzie lub scenariusz narażenia we wzbogaconym osadzie. Uwzględnia się w niej protokoły badania toksyczności obowiązujące dla Chironomus riparius i Chironomus dilutus (zwanego wcześniej C. tentans (2)), które opracowano w Europie i Ameryce Płn. (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9), a następnie potwierdzono w badaniach międzylaborato-ryjnych (1) (7) (10) (11) (12). Możliwe jest również zastosowanie innych dobrze udokumentowanych gatunków ochotkowatych, np. Chironomus yoshimatsui (13) (14). Całkowity czas trwania narażenia wynosi około 44 dni w przypadku C. riparius i C. yoshimatsui, a w przypadku C. dilutus - około 100 dni.
2. W niniejszej metodzie badawczej opisano zarówno scenariusz narażenia w wodzie, jak i w osadzie. Wybór odpowiedniego scenariusza narażenia zależy od zamierzonego zastosowania badania. Scenariusz narażenia w wodzie, polegający na wzbogaceniu słupa wody, służy do symulacji znoszenia cieczy roboczej w przypadku pestycydów i obejmuje początkowe szczytowe stężenie w wodzie powierzchniowej. Wzbogacenie wody jest również przydatne w odniesieniu do innych rodzajów narażenia (w tym wycieków chemicznych), z wyjątkiem procesów akumulacji w osadzie trwających dłużej niż okres badania. W tym przypadku, a także w przypadku gdy główną drogą przedostawania się pestycydów do akwenów wodnych jest ich spływanie, bardziej właściwy może być projekt badania wzbogaconego osadu. Jeżeli przedmiotem zainteresowania są inne scenariusze narażenia, projekt badania można łatwo dostosować. Na przykład jeżeli dystrybucja badanej substancji chemicznej między fazę wodną i warstwę osadu nie jest przedmiotem zainteresowania oraz jeżeli należy zminimalizować adsorpcję przez osad, można rozważyć wykorzystanie zastępczego sztucznego osadu (np. piasku kwarcowego).
3. Substancje chemiczne, które wymagają badania na organizmach żyjących w osadach, mogą pozostawać w osadzie przez długi czas. W odniesieniu do organizmów żyjących w osadach możliwe są różne drogi narażenia. Względne znaczenie danej drogi narażenia i czas, w jakim każda z tych dróg przyczynia się do ogólnego efektu toksycznego, zależą od fizykochemicznych właściwości danej substancji chemicznej. W przypadku silnie adsorbujących substancji chemicznych lub w przypadku substancji chemicznych tworzących wiązania kowalencyjne z osadem znaczącą drogą narażenia może być przyjmowanie zanieczyszczonego pokarmu. Aby zapobiec niedoszacowaniu toksyczności wysokolipofilowych substancji chemicznych, można rozważyć dodanie pokarmu do osadu przed wprowadzeniem badanej substancji chemicznej (zob. pkt 31). W ten sposób możliwe jest uwzględnienie wszystkich dróg narażenia na każdym z etapów życia.
4. Mierzone punkty końcowe obejmują: całkowitą liczbę przepoczwarzonych osobników dorosłych (w odniesieniu do pierwszego i drugiego pokolenia), tempo rozwoju (dla pierwszego i drugiego pokolenia), proporcję płci w odniesieniu do w pełni przepoczwarzonych i żywych osobników dorosłych (pierwszego i drugiego pokolenia), liczbę sznurów jaj przypadającą na samicę (tylko pierwsze pokolenie) oraz płodność sznurów jaj (tylko pierwsze pokolenie).
5. Zdecydowanie zaleca się stosowanie osadu preparowanego. Osad preparowany posiada szereg zalet, których nie mają osady naturalne:
- zmienność eksperymentalna jest ograniczona, ponieważ osad preparowany stanowi odtwarzalną "standardową matrycę" i wyeliminowana zostaje potrzeba znalezienia źródła niezanieczyszczonego, czystego osadu;
- badania można rozpocząć w każdej chwili, unikając zmienności sezonowej badanego osadu, i nie ma konieczności poddawania osadu wstępnej obróbce w celu usunięcia rodzimej fauny;
- mniejsze koszty w porównaniu z pobieraniem w terenie dostatecznych ilości osadu dla potrzeb rutynowych badań.
- zastosowanie osadu preparowanego umożliwia porównanie toksyczności między badaniami oraz stosowną klasyfikację substancji chemicznych (3).
6. Zastosowane definicje są zamieszczone w dodatku 1.
ZASADA BADANIA
7. Larwy ochotkowatych w pierwszym stadium larwalnym poddaje się działaniu badanej substancji chemicznej o różnym stopniu stężenia w układzie osad-woda. Badanie rozpoczyna się od umieszczenia larw w pierwszym stadium larwalnym (pierwsze pokolenie) w zlewkach badawczych zawierających wzbogacony osad albo badaną substancję chemiczną dodaje się do wody po dodaniu larw. Ocenia się wylęg ochotkowatych, czas do wylęgu oraz proporcję płci w odniesieniu do w pełni przepoczwarzonych i żywych muchówek. Przepoczwarzone osobniki dorosłe przenosi się do klatek hodowlanych w celu ułatwienie rojenia, godów i składania jaj. Ocenie podlega liczba sznurów jaj i ich płodność. Z tych sznurów jaj pozyskuje się larwy w pierwszym stadium larwalnym z drugiego pokolenia. Larwy umieszcza się w świeżo przygotowanych zlewkach badawczych (procedura wzbogacania taka sama jak w przypadku pierwszego pokolenia) w celu określenia żywotności drugiego pokolenia poprzez ocenę wylęgu, czasu do wylęgu oraz proporcji płci w odniesieniu do w pełni przepoczwarzonych i żywych muchówek (schemat badania cyklu życia zamieszczony jest w dodatku 5). Wszystkie dane analizuje się przy użyciu modelu regresji w celu oszacowania stężenia, które spowodowałoby X % zmniejszenie w odniesieniu do danego punktu końcowego albo w drodze testowania hipotez w celu oznaczenia stężenia, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC). To ostatnie wymaga porównania reakcji na zabieg z reakcjami odpowiednich prób kontrolnych za pomocą badań statystycznych. Należy zauważyć, że w przypadku scenariusza z zastosowaniem wzbogaconej wody w odniesieniu do szybko rozkładających się substancji chemicznych na późniejszych etapach życia każdego pokolenia (np. stadium poczwarki) zwierzęta mogą być narażone na znacznie niższy poziom stężenia w wodzie nadosadowej niż larwy w pierwszym stadium rozwoju larwalnego. Jeżeli stanowi to problem, a w przypadku każdego stadium konieczne jest zastosowanie porównywalnego poziomu narażenia, można rozważyć następujące zmiany metody badawczej:
- równoległe serie z wzbogacaniem na różnych etapach życia lub
- powtarzane wzbogacanie (lub odnawianie wody nadosadowej) w układzie badawczym w ciągu obydwu faz badania (pierwsze i drugie pokolenie), przy czym odstępy czasowe między wzbogacaniem (wymianą) powinny być dostosowane do charakterystyki losów badanej substancji chemicznej.
Zmiany takie są możliwe tylko w przypadku scenariusza ze wzbogaconą wodą, a nie ze wzbogaconym osadem.
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ
8. Należy znać rozpuszczalność badanej substancji chemicznej w wodzie, prężność par i log Kow oraz ilość substancji, która przedostała się do osadu oraz jej stabilność w wodzie i osadzie, uzyskane w wyniku pomiarów lub obliczeń. Powinna być dostępna wiarygodna metoda analityczna do oznaczania ilościowego badanej substancji chemicznej w osadzie, wodzie porowej i warstwie wody nadosadowej ze znaną i udokumentowaną dokładnością oraz granicą wykrywalności. Użyteczne informacje obejmują wzór strukturalny i czystość badanej substancji chemicznej. Przydatne są także dane dotyczące chemicznych losów badanej substancji chemicznej w środowisku (np. jej rozpraszanie się, rozkład abiotyczny i biotyczny itd.). Dalsze wskazówki dotyczące badania substancji chemicznych o własnościach fizykochemicznych utrudniających ich badanie podano w pozycji (16) bibliografii.
SUBSTANCJE CHEMICZNE ODNIESIENIA
9. Można okresowo badać chemiczne substancje odniesienia, aby upewnić się, czy wrażliwość populacji laboratoryjnej nie uległa zmianie. W przypadku rozwielitek wystarczające byłoby przeprowadzenie 48-godzinnego badania toksyczności ostrej (zgodnie z 17). Dopóki jednak nie będą dostępne wytyczne dotyczące zweryfikowanego badania toksyczności ostrej, można rozważyć zastosowanie badania toksyczności przewlekłej zgodnie z rozdziałem C.28 niniejszego załącznika. Przykłady toksycznych substancji odniesienia stosowanych z powodzeniem w badaniach międzylaboratoryjnych i badaniach weryfikacyjnych to: lindan, trifluralina, pentachlorofenol, chlorek kadmu i chlorek potasu. (1) (3) (6) (7) (18).
WAŻNOŚĆ BADANIA
10. Aby badanie było ważne, muszą zostać spełnione następujące warunki:
- średni odsetek wylęgniętych osobników dorosłych w próbie kontrolnej poddanej zabiegowi powinien wynosić co najmniej 70 % na koniec okresu narażenia dla obydwu pokoleń (1) (7);
- w odniesieniu do C. riparius i C. yoshimatsui 85 % wszystkich przepoczwarzonych dorosłych muchówek z próby kontrolnej poddanej zabiegowi w obydwu pokoleniach powinno pojawić się w okresie 12-23 dni po wprowadzeniu do naczyń larw w pierwszym stadium larwalnym; w odniesieniu do C. dilutus dopuszcza się okres 20-65 dni;
- średnia proporcja płci wśród w pełni przepoczwarzonych i żywych osobników dorosłych (jako odsetek samic lub samców) w próbie kontrolnej poddanej zabiegowi w obydwu pokoleniach powinna wynosić co najmniej 0,4, ale nie powinna przekraczać 0,6;
- w odniesieniu do każdej klatki hodowlanej liczba sznurów jaj w próbach kontrolnych pierwszego pokolenia powinna wynosić co najmniej 0,6 na samicę dodaną do klatki hodowlanej;
- w odniesieniu do każdej klatki hodowlanej odsetek sznurów zapłodnionych jaj w próbach kontrolnych pierwszego pokolenia powinien wynosić co najmniej 0,6;
- na końcu okresu narażenia obydwu generacji należy zmierzyć wartość pH oraz stężenie rozpuszczonego tlenu w każdym naczyniu. Stężenie tlenu powinno wynosić co najmniej 60 % wartości nasycenia powietrzem (ASV 16 ), a wartość pH w warstwie wody nadosadowej powinna we wszystkich naczyniach badawczych mieścić się w przedziale 6-9;
- temperatura wody nie powinna różnić się o więcej niż ± 1,0 °C. OPIS METODY
Naczynia badawcze i klatki hodowlane
11. Larwy poddaje się narażeniu na działanie danej substancji w szklanych zlewkach o pojemności 600 ml i średnicy około 8,5 cm (zob. dodatek 5). Inne naczynia także mogą nadawać się do badań, powinny jednak zapewniać odpowiednią grubość warstwy osadu i wody nadosadowej. Powierzchnia osadu powinna być wystarczająca, by zapewnić 2-3 cm2 na larwę. Stosunek grubości warstwy osadu do warstwy wody nadosadowej powinien wynosić około 1:4. Należy zastosować klatki hodowlane (minimum 30 cm dla wszystkich trzech wymiarów) z siatką (rozmiar oczek około 1 mm) na górze i należy wykorzystać co najmniej jedną stronę klatki (zob. dodatek 5). W każdej klatce umieszcza się krystalizator o pojemności 2 l do składnia jaj, zawierający wodę badawczą i osad. Również w przypadku krystalizatora stosunek grubości warstwy osadu do warstwy wody nadosadowej powinien wynosić około 1:4. Po zebraniu z krystalizatorów sznurów jaj umieszcza się je na 12-dołkowej mikropłytce (jeden sznur na dołek zawierający co najmniej 2,5 ml wody ze wzbogaconego krystalizatora), następnie płytki przykrywa się pokrywą, aby zapobiec znacznemu parowaniu. Wykorzystać można również inne naczynia nadające się do umieszczenia w nich sznurów jaj. Z wyjątkiem mikropłytek wszystkie naczynia badawcze i inne przyrządy mające kontakt z układem badawczym powinny być w całości wykonane ze szkła lub innego chemicznie obojętnego materiału (np. politetrafluoroetylenu).
Wybór gatunków
12. Gatunkiem wykorzystywanym w badaniu powinien być w miarę możliwości Chironomus riparius. Można także użyć C. yoshimatsui. C. dilutus jest także odpowiedni, ale jest trudniejszy w hodowli i wymaga dłuższego okresu badania. Szczegóły dotyczące metod hodowli w odniesieniu do C. riparius podano w dodatku 2. Informacje dotyczące warunków hodowli są także dostępne dla C. dilutus (5) i C. yoshimatsui (14). Przed przeprowadzeniem badania należy potwierdzić identyfikację gatunków, ale nie jest to wymagane przed każdym badaniem, jeśli organizmy pochodzą z hodowli wewnątrzlaboratoryjnej.
Osad
13. W miarę możliwości należy stosować osad preparowany (zwany także osadem regenerowanym, sztucznym lub syntetycznym). Jeśli jednak korzysta się z osadu naturalnego, należy go opisać (podając co najmniej pH, zawartość węgla organicznego, zaleca się także określenie innych parametrów, takich jak stosunek C/N i granulometrię). Osad taki powinien być wolny od zanieczyszczeń i innych organizmów, które mogłyby konkurować z ochotkowatymi lub zjadać ich larwy. Zaleca się również, aby osad przed badaniem był przez siedem dni kondycjonowany w warunkach badania. Zaleca się zastosowanie następującego osadu preparowanego (1) (20) (21), jak opisano w (1):
a. 4-5 % torfu (w przeliczeniu na suchą masę); pH jak najbardziej zbliżone do 5,5-6,0; ważne jest, by stosować torf w postaci sproszkowanej, drobno zmielony (wielkość cząstek ≤ 1 mm) i suszony wyłącznie powietrzem;
b. 20 % glinki kaolinowej (w przeliczeniu na suchą masę) (zawartość kaolinitu w miarę możliwości powyżej 30 %);
c. 75-76 % piasku kwarcowego (w przeliczeniu na suchą masę) (powinien przeważać drobny piasek, w którym ponad 50 % cząstek ma wielkość 50-200 μm);
d. w celu uzyskania wilgotności końcowej mieszaniny na poziomie od 30-50 % dodaje się wodę dejonizowaną;
e. w celu skorygowania pH końcowej mieszaniny osadu do wartości 7,0 ± 0,5 dodaje się do niej chemicznie czysty węglan wapnia (CaCO3);
f. zawartość węgla organicznego w końcowej mieszaninie powinna wynosić 2 % (± 0,5 %) i należy ją skorygować przy użyciu odpowiednich ilości torfu i piasku, zgodnie z lit. a) i c).
14. Źródło torfu, glinki kaolinowej i piasku powinno być znane. Składniki osadu należy sprawdzić pod kątem zanieczyszczenia chemicznego (np. metalami ciężkimi, związkami chloroorganicznymi, związkami fosforoorganicznymi). W dodatku 3 podano przykładowy sposób przygotowania osadu preparowanego. Dopuszczalne jest także mieszanie suchych składników, o ile zostanie wykazane, że po dodaniu warstwy wody nadosadowej składniki osadu nie rozdzielają się (np. nie unoszą się cząstki torfu) oraz że torf lub osad został poddany dostatecznemu kondycjonowaniu.
Woda
15. Jako wodę do badania można stosować każdy rodzaj wody, której charakterystyka zgodna jest z charakterystyką chemiczną wody rozcieńczającej, jak opisano w dodatkach 2 i 4. Do hodowli ochotkowatych i do badania może służyć każdy odpowiedni rodzaj wody, np. woda naturalna (powierzchniowa lub gruntowa), woda regenerowana (zob. dodatek 2) lub odchlorowana woda wodociągowa, pod warunkiem że ochotkowate przeżyją w niej przez okres hodowli i badania bez wykazywania oznak stresu. Na początku badania wartość pH wody użytej do badania powinna wynosić 6-9, a twardość ogółem wody w przeliczeniu na CaCO3 nie powinna być wyższa niż 400 mg/l. Jeżeli jednak zachodzi podejrzenie interakcji jonów powodujące twardość wody i badanej substancji chemicznej, należy użyć wody o mniejszej twardości (zatem nie należy w takim przypadku stosować roztworu Elendta M4). Przez okres całego badania należy stosować ten sam rodzaj wody. Cechy jakości wody wymienione w dodatku 4 należy mierzyć co najmniej dwa razy w roku lub każdorazowo kiedy zachodzi podejrzenie, że mogły ulec znacznej zmianie.
Roztwory podstawowe - wzbogacona woda
16.a. Badane stężenia oblicza się na podstawie stężeń w słupie wody, tj. w warstwie wody nadosadowej. Roztwory do badań o wybranych stężeniach są zwykle sporządzane przez rozcieńczenie roztworu podstawowego. Zaleca się przygotować roztwory podstawowe, rozpuszczając badaną substancję chemiczną w wodzie badawczej. W niektórych przypadkach wymagane może być stosowanie rozpuszczalników lub środków dyspergujących w celu uzyskania odpowiednio stężonego roztworu podstawowego. Przykładami odpowiednich rozpuszczalników są aceton, eter monoetylowy glikolu etylenowego, eter dimetylowy glikolu etylenowego, dimetyloformamid i glikol trójetylenowy. Dopuszczalne środki dyspergujące to Cremophor RH40, Tween 80, metyloceluloza 0,01 % i HCO-40. Stężenie środka rozpuszczającego w podłożu do badania końcowego powinno być minimalne (tj. ≤ 0,1 ml/l) i jednakowe we wszystkich badaniach. W przypadku zastosowania środka rozpuszczającego nie powinien on mieć żadnego znaczącego wpływu na przeżycie, co należy wykazać w próbie kontrolnej z rozpuszczalnikiem w porównaniu z ujemną próbą kontrolną (woda). Należy jednak dołożyć wszelkich starań, aby uniknąć stosowania takich substancji.
Roztwory podstawowe - wzbogacony osad
16.b. Wzbogacone osady o wybranym stężeniu substancji badanej są zwykle przygotowywane przez dodanie roztworu tej substancji chemicznej bezpośrednio do osadu. Roztwór podstawowy badanej substancji chemicznej rozpuszczonej w dejonizowanej wodzie miesza się z osadem preparowanym z użyciem rozdrabniacza, mieszalnika lub ręcznie. Jeżeli badana substancja chemiczna słabo rozpuszcza się w wodzie, można ją rozpuścić w odpowiednim rozpuszczalniku organicznym, w jak najmniejszej jego ilości (np. w heksanie, acetonie lub chloroformie). Roztwór taki następnie miesza się z drobnym piaskiem kwarcowym w ilości 10 gramów na każde naczynie badawcze. Pozostawia się go do całkowitego odparowania rozpuszczalnika, aby został całkowicie usunięty z piasku; następnie piasek miesza się z odpowiednią ilością osadu. Do rozpuszczenia, dyspergowania lub emulsyfikacji badanej substancji chemicznej mogą być użyte jedynie łatwo ulatniające się czynniki. Należy mieć na uwadze, że przy preparowaniu osadu należy uwzględniać piasek zawarty w mieszaninie badanej substancji chemicznej i piasku (czyli osad należy przygotować z mniejszą ilością piasku). Należy dopilnować, by badana substancja chemiczna dodana do osadu została w nim starannie i równomiernie rozprowadzona. W razie konieczności dla określenia jednorodności mieszaniny podpróbki należy poddać analizie.
PROJEKT BADANIA
17. Projekt badania obejmuje dobór liczby i rozstawienie badanych stężeń, dobór liczby naczyń zawierających każde badane stężenie, liczby larw na jedno naczynie, liczby krystalizatorów i klatek hodowlanych. Poniżej przedstawiono opisy projektów dla oszacowania wartości ECx, NOEC i badania granicznego.
Projekt analizy regresyjnej
18. Należy objąć badaniem stężenie efektywne (ECx,) i zakres stężeń, które są przedmiotem zainteresowania, tak aby punkt końcowy nie był ekstrapolowany poza zebrane dane. Należy unikać ekstrapolowania wyników znacznie poniżej najniższego lub powyżej najwyższego stężenia. Wstępne badanie ustalające zakres zgodne z metodami badań C.27 lub C.28 może być pomocne przy wyborze odpowiedniego zakresu badanych stężeń.
19. W przypadku podejścia opartego na ECx wymaganych jest co najmniej pięć stężeń, a dla każdego stężenia - osiem kontrprób. W przypadku każdego stężenia należy zastosować dwie klatki hodowlane (A i B). Osiem kontrprób dzieli się na dwie grupy po cztery kontrpróby każda na potrzeby każdej klatki hodowlanej. To połączenie kontrprób jest konieczne ze względu na liczbę muchówek w klatce niezbędnych do przeprowadzenia prawidłowej oceny rozmnażania. Drugie pokolenie ma jednak ponownie osiem kontrprób, które powstają z narażonych populacji w klatkach hodowlanych. Współczynnik rozstawienia stężeń nie powinien przekraczać dwóch (z wyjątkiem przypadków, gdy krzywa dawka-efekt ma łagodny przebieg). Liczbę kontrprób dla każdego zabiegu można zmniejszyć do sześciu (trzy na każdą hodowlę), jeśli zwiększy się liczbę badanych stężeń dających różne reakcje. Zwiększanie liczby kontrprób lub zmniejszanie rozstawienia badanych stężeń zwykle prowadzi do zawężenia przedziałów ufności wokół wartości ECx.
Projekt dotyczący oszacowania NOEC
20. W celu oznaczenia wartości NOEC należy zastosować pięć stężeń substancji badanej z co najmniej ośmioma kontrpróbami (4 dla każdej klatki hodowlanej, A i B), a rozstawienie stężeń nie powinno przekraczać dwóch. Liczba kontrprób powinna być na tyle duża, by zapewnić odpowiednią moc statystyczną dla wykrycia 20 % różnicy w stosunku do próby kontrolnej przy poziomie istotności wynoszącym 5 % (α = 0,05). W odniesieniu do tempa rozwoju, potencjału reprodukcyjnego i płodności zwykle stosuje się analizę wariancji (ANOVA), a następnie test Dunnetta i test Williamsa (22-25). W odniesieniu do wskaźnika wylęgu i proporcji płci można zastosować test Cochrana-Armitage'a, test dokładny Fishera (z korektą Bonferroniego) lub test Mantela-Haenszela.
Badanie graniczne
21. Jeśli w opcjonalnym wstępnym badaniu ustalającym zakres nie zaobserwowano żadnych zmian aż do poziomu maksymalnego stężenia, można przeprowadzić badanie graniczne (jedno badane stężenie i jedna próba kontrolna). Badanie graniczne ma na celu wskazanie, że toksyczne skutki badanej substancji chemicznej występują przy wyższych poziomach stężenia niż zbadane stężenie graniczne. W przypadku wody sugeruje się 100 mg/l, a w przypadku osadu 1 000 mg/kg (suchej masy). Zazwyczaj niezbędne jest co najmniej osiem kontrprób zarówno na potrzeby zabiegu, jak i próby kontrolnej. Należy wykazać odpowiednią moc statystyczną, która pozwala wykryć 20 % różnicę w porównaniu z próbą kontrolną przy 5 % poziomie istotności (α = 0,05). Przy odpowiedziach metrycznych (np. tempo rozwoju) odpowiednią metodą statystyczną jest test t-Studenta, jeżeli dane spełniają warunki tego testu (normalność rozkładu zmiennych, jednorodność wariancji). Jeśli te warunki nie są spełnione, można zastosować test t-Studenta dla nierównych wariancji lub test nieparametryczny, np. test Manna-Whitneya-Wilcoxona. W przypadku wskaźnika wylęgu odpowiedni jest test dokładny Fishera.
PROCEDURA
Warunki narażenia na działanie substancji
Przygotowanie układu woda-osad (wzbogacanie wody)
22.a) Do każdego z naczyń badawczych i krystalizatorów wprowadza się spreparowany osad (zob. pkt 13-14 i dodatek 3), tak aby powstała warstwa o grubości co najmniej 1,5 cm (w przypadku krystalizatora może ona być nieco mniejsza), ale nie większej niż 3 cm. Aby stosunek grubości warstwy osadu do warstwy wody nie przekraczał 1:4, należy dodać wody (zob. pkt 15). Po przygotowaniu naczyń badawczych układ osad-woda należy delikatnie napowietrzać przez około siedem dni przed dodaniem larw w pierwszym stadium larwalnym pierwszego i drugiego pokolenia (zob. pkt 14 oraz dodatek 3). Układ osad-woda złożony z krystalizatorów nie jest napowietrzany podczas badania, ponieważ nie ma potrzeby wspomagania przeżycia larw (przed wylęgiem sznury jaj zostały już zebrane). Podczas dodawania wody do badania, w celu uzyskania warstwy wody nadosadowej i aby uniknąć oddzielenia składników osadu i ponownego zawieszenia w wodzie drobnoziarnistego materiału, osad można nakryć krążkiem z tworzywa sztucznego. Następnie krążek należy bezzwłocznie usunąć. Właściwe może być także zastosowanie innych przyrządów.
Przygotowanie układu woda-osad (wzbogacony osad)
22. b) Wzbogacony osad sporządzony zgodnie z pkt 16b umieszcza się w naczyniach i krystalizatorze, a następnie dodaje się wodę nadosadową, aby uzyskać stosunek objętości osadu do wody równy 1:4. Grubość warstwy osadu powinna mieścić się w przedziale 1,5-3 cm (w przypadku krystalizatora może być nieco mniejsza). Podczas dodawania wody do badania, w celu uzyskania warstwy wody nadosadowej i aby uniknąć oddzielenia składników osadu i ponownego zawieszenia w wodzie drobnoziarnistego materiału, osad można nakryć krążkiem z tworzywa sztucznego, a następnie krążek bezzwłocznie usunąć. Właściwe może być także zastosowanie innych przyrządów. Po przygotowaniu wzbogaconego osadu z wodą nadosadową należałoby umożliwić rozdzielenie badanej substancji chemicznej między fazę wodną i osad (4) (5) (7) (18). W miarę możliwości powinno się to odbywać w takich samych warunkach temperatury i napowietrzenia, jakie zastosowano na potrzeby badania. Okres ustalania stanu równowagi zależy od osadu i substancji chemicznej i może trwać kilka godzin lub kilka dni, a w rzadkich przypadkach do pięciu tygodni. Ponieważ w tym czasie wiele substancji chemicznych może ulec rozkładowi, nie oczekuje się uzyskania stanu równowagi, ale zaleca się stosowanie 48-godzinnego okresu wyrównania stężeń. Jeżeli jednak połowiczny czas rozpadu substancji chemicznej w osadzie jest długi (zob. pkt 8), czas wyrównania stężeń można przedłużyć. Na zakończenie tego dodatkowego okresu wyrównywania stężeń należy zmierzyć stężenie badanej substancji chemicznej w wodzie nadosadowej, wodzie porowej i w osadzie co najmniej przy najwyższym stężeniu i przy niższym stężeniu (zob. pkt 38). Takie oznaczenia analityczne badanej substancji chemicznej umożliwiają obliczenie bilansu masy i wyrażenie wyników w oparciu o zmierzone stężenia.
23. Naczynia badawcze należy przykryć (np. szklanymi płytkami). W razie konieczności w czasie badania poziom wody można uzupełnić do pierwotnej objętości, aby wyrównać brak spowodowany parowaniem. Należy do tego celu użyć wody destylowanej lub wody dejonizowanej, aby zapobiec odkładaniu się soli. Krystalizatory w klatkach hodowlanych nie są przykrywane i mogą, choć nie muszą, być uzupełniane wodą, aby wyrównać straty wody w trakcie badania, ponieważ sznury jaj są w kontakcie z wodą w przybliżeniu tylko przez jeden dzień, a naczyń używa się tylko podczas krótkiej fazy badania.
Dodanie organizmów użytych do badania
24. Na cztery do pięciu dni przed dodaniem larw w pierwszym stadium larwalnym pierwszego pokolenia pakiety jaj należy wyjąć z hodowli i umieścić w małych naczyniach w pożywce hodowlanej. Można w tym celu zastosować pożywkę wykorzystywaną w hodowli wyjściowej lub świeżo przygotowaną pożywkę. W obu przypadkach do pożywki hodowlanej należy dodać niewielką ilość pokarmu, np. kilka kropel filtratu z drobno zmielonej zawiesiny pokarmu w płatkach dla ryb (zob. dodatek 2). Należy wykorzystać wyłącznie świeżo złożone pakiety jaj. Wylęg larw zaczyna się przeważnie kilka dni po złożeniu jaj (2-3 dni w przypadku C. riparius w temperaturze 20 °C oraz 1-4 dni w przypadku C. dilutus w temperaturze 23 °C i C. yoshimatsui w temperaturze 25 °C), a wzrost larw następuje w czterech stadiach larwalnych, z których każde trwa 4-8 dni. Do badania należy użyć larw w pierwszym stadium larwalnym (maksymalnie 48 h po wylęgu). Stadium larwalne larw można sprawdzić, mierząc szerokości puszki głowowej (7).
25. Dwadzieścia larw w pierwszym stadium larwalnym z pierwszego pokolenia przydziela się losowo do każdego naczynia doświadczalnego zawierającego układ osad-woda za pomocą tępo zakończonej pipety. Po umieszczeniu larw w naczyniach należy wstrzymać napowietrzanie wody i nie uruchamiać go przez dobę po ich wprowadzeniu (zob. pkt 32). Zgodnie z zastosowanym projektem badania (zob. pkt 19 i 20) w przypadku podejścia ECx należy użyć co najmniej 120 larw na stężenie, a w przypadku podejścia NOEC - 160 larw (8 kontrprób na stężenie). W projekcie ze wzbogaconym osadem narażenie zaczyna się w momencie dodania larw.
Wzbogacenie wody nadosadowej
26. Po upływie dwudziestu czterech godzin od dodania larw w pierwszym stadium rozwoju larwalnego z pierwszego pokolenia wodę nadosadową wzbogaca się badaną substancją chemiczną i ponownie uruchamia delikatne napowietrzanie (ewentualne zmiany w projekcie badania zostały opisane w pkt 7). Roztwory podstawowe badanej substancji chemicznej wprowadza się w małych ilościach pod powierzchnię wody za pomocą pipety. Wodę nadosadową należy następnie ostrożnie zamieszać, tak aby nie poruszyć osadu. W projekcie ze wzbogaconą wodą narażenie zaczyna się w momencie wzbogacenia wody (tj. po upływie jednego dnia od dodania larw).
Zbieranie przepoczwarzonych osobników dorosłych
27. Przepoczwarzone muchówki z pierwszego pokolenia zbiera się co najmniej raz, a najlepiej dwa razy dziennie (zob. pkt 36) z naczyń doświadczalnych za pomocą aspiratora, wentylatora wyciągowego lub podobnego urządzenia (zob. dodatek 5). Należy zachować szczególną uwagę, aby nie uszkodzić dorosłych osobników. Zebrane muchówki z czterech naczyń badawczych z jednego zabiegu uwalnia się do klatki hodowlanej, do której zostały uprzednio przypisane. W dniu pierwszego wylęgu (samców) do krystalizatora wprowadza się pod powierzchnię wody małą ilość roztworu podstawowego badanej substancji chemicznej za pomocą pipety (projekt ze wzbogaconą wodą). Wodę nadosadową należy następnie ostrożnie zamieszać, tak aby nie poruszyć osadu. Stężenie badanej substancji chemicznej w krystalizatorze jest nominalnie takie samo jak w naczyniach zabiegowych przypisanych do danej klatki hodowlanej. W przypadku projektu ze wzbogaconym osadem krystalizatory przygotowuje się w przybliżeniu w 11. dniu po rozpoczęciu narażenia (tj. dodaniu larw z pierwszego pokolenia), aby stabilizowały się przez około 48 godzin przed wytworzeniem pierwszych sznurów jaj.
28. Sznury jaj wybiera się z krystalizatora w klatce hodowlanej za pomocą pęsety lub tępo zakończonej pipety. Każdy sznur jaj umieszcza się w naczyniu zawierającym podłoże hodowlane z krystalizatora, z którego został on pobrany (np. w dołku mikropłytki 12-dołkowej z co najmniej 2,5 ml pożywki). Naczynia ze sznurami jaj przykrywa się pokrywą w celu uniknięcia znacznego parowania. Sznury jaj przechowuje się do celów obserwacji przez co najmniej sześć dni od ich powstania w celu ich sklasyfikowania jako zapłodnione lub niezapłodnione.
Aby zapoczątkować drugie pokolenie, z każdej klatki hodowlanej wybiera się co najmniej trzy, a najlepiej sześć sznurów zapłodnionych jaj i pozostawia do wylęgnięcia z pewną ilością pokarmu. Te sznury jaj powinny powstać w szczytowym momencie okresu składania jaj, co zwykle następuje około 19. dnia badania w próbach kontrolnych. Najlepiej byłoby, gdyby drugie pokolenie ze wszystkich zabiegów było zapoczątkowane tego samego dnia, czasami może się to jednak okazać niemożliwe ze względu na wpływ substancji chemicznej na rozwój larw. W takim przypadku stosowanie wyższych stężeń można zapoczątkować później niż zabiegi z niższymi dawkami i z próbą kontrolną (z rozpuszczalnikiem).
29.a) W projekcie ze wzbogaconą wodą układ osad-woda dla drugiego pokolenia przygotowuje się, wzbogacając warstwę wody nadosadowej substancją chemiczną na około 1 godzinę przed dodaniem larw w pierwszym stadium larwalnym do naczyń badawczych. Roztwory badanej substancji chemiczną wprowadza się w małych ilościach pod powierzchnię wody za pomocą pipety. Wodę nadosadową należy następnie ostrożnie zamieszać, tak aby nie poruszyć osadu. Po wzbogaceniu zapewnia się delikatne napowietrzanie.
29.b) W projekcie ze wzbogaconym osadem naczynia poddawane narażeniu, zawierające układ osad-woda dla drugiego pokolenia, przygotowuje się w taki sam sposób jak dla pierwszego pokolenia.
30. Dwadzieścia larw w pierwszym stadium larwalnym (maksymalnie 48 h po wykluciu) z drugiego pokolenia przydziela się losowo do każdego naczynia badawczego zawierającego wzbogacony układ osad-woda za pomocą tępo zakończonej pipety. Po wprowadzeniu larw w pierwszym stadium larwalnym do naczyń należy wstrzymać napowietrzanie wody i nie uruchamiać go przez dobę od ich wprowadzenia. Zgodnie z zastosowanym projektem badania (zob. pkt 19 i 20) w przypadku podejścia ECx należy użyć co najmniej 120 larw na stężenie (6 kontrprób na stężenie), a w przypadku podejścia NOEC - 160 larw (8 kontrprób na stężenie).
Pokarm
31. Larwy w naczyniach badawczych należy karmić w miarę możliwości codziennie lub co najmniej trzy razy w tygodniu. Do karmienia młodych larw przez pierwsze 10 dni rozwoju nadaje się pokarm dla ryb (zawiesina w wodzie lub drobno zmielony pokarm, np. Tetra-Min lub Tetra-Phyll; zob. szczegółowe informacje w dodatku 2) w ilości 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg w przypadku C. yoshimatsui) na larwę dziennie. Starsze larwy mogą potrzebować nieco więcej pokarmu: 0,5-1,0 mg na larwę dziennie powinno stanowić wystarczającą ilość przez pozostałą część badania. Jeśli zaobserwuje się wzrost grzybów lub śmiertelność w próbach kontrolnych, należy wówczas we wszystkich zabiegach i próbach kontrolnych ograniczyć dawki pokarmu. Jeśli nie można powstrzymać rozwoju grzybów, należy powtórzyć badanie.
Znaczenie toksykologiczne narażenia drogą pokarmową jest ogólnie wyższe w przypadku substancji chemicznych o wysokim powinowactwie do węgla organicznego lub substancji chemicznych tworzących wiązania kowalencyjne z osadem. W związku z tym przy badaniu substancji chemicznych o takich właściwościach ilość pokarmu niezbędną do zapewnienia przeżycia i naturalnego wzrostu larw można dodać do osadu preparowanego przed okresem stabilizacji, w zależności od zapotrzebowania przewidzianego przepisami. Aby zapobiec pogorszeniu jakości wody, zamiast pokarmu dla ryb należy użyć surowca roślinnego, np. dodatku 0,5 % (w przeliczeniu na suchą masę) drobno zmielonych liści pokrzywy zwyczajnej (Urtica dioica), morwy białej (Morus alba), koniczyny białej (Trifolium repens), szpinaku (Spinacia oleracea) lub innego surowca roślinnego (produktu Cerophyl lub alfa-celulozy). Dodanie pełnej dawki pokarmowej organicznego źródła pokarmu do osadu przed wzbogaceniem nie jest bez znaczenia w odniesieniu do jakości wody i działania biologicznego (21) ani nie jest metodą standardową, jednak ostatnie badania wskazują, że metoda ta jest skuteczna (19) (26). Dorosłe muchówki w klatce hodowlanej zwykle nie wymagają karmienia, jednak podanie tamponu z wełny bawełnianej nasączonego nasyconym roztworem sacharozy jako źródła pokarmu dla przepoczwarzonych osobników dorosłych zwiększa potencjał reprodukcyjny i płodność (34).
Warunki inkubacji
32. Po upływie 24 godzin od wprowadzenia larw w pierwszym stadium larwalnym obu generacji rozpoczyna się delikatnie napowietrzanie warstwy wody nadosadowej w naczyniach badawczych, które kontynuuje się przez cały okres badania (należy dbać, aby stężenie rozpuszczonego tlenu nie spadło poniżej 60 % ASV). Napowietrzanie prowadzi się z użyciem szklanej pipety Pasteura, której wylot znajduje się 2-3 cm nad warstwą osadu, w ilości kilku pęcherzyków powietrza/sek. Przy badaniu lotnych chemikaliów można rozważyć rezygnację z napowietrzania układu osad-woda, jednocześnie należy jednak spełnić kryterium ważności wynoszące co najmniej 60 % ASV (pkt 10). Dalsze wytyczne przedstawiono w (16).
33. Badanie z wykorzystaniem C. riparius przeprowadza się w stałej temperaturze 20 °C (± 2 °C). Zalecane temperatury w przypadku C. dilutus i C. yoshimatsui to odpowiednio 23 °C i 25 °C (± 2 °C). Stosuje się 16-godzinny fotoperiod, a natężenie światła powinno wynosić 500-1 000 luksów. W przypadku klatek hodowlanych można uwzględnić dodatkowo jednogodzinną fazę brzasku i zmierzchu.
Okres narażenia
34. Projekt ze wzbogaconą wodą: w odniesieniu do pierwszego pokolenia okres narażenia zaczyna się w momencie wzbogacenia wody nadosadowej w naczyniu badawczym (co ma miejsce następnego dnia po umieszczeniu larw - ewentualne zmiany w projekcie narażenia przedstawiono w pkt 7). Narażenie drugiego pokolenia larw zaczyna się natychmiast, ponieważ umieszcza się je w układzie osad-woda, który został już wzbogacony. W odniesieniu do C. riparius i C. yoshimatsui maksymalny okres narażenia dla pierwszego pokolenia wynosi 27 dni, zaś dla drugiego pokolenia - 28 dni (larwy z pierwszego pokolenia spędzają jeden dzień w naczyniu bez narażenia). Uwzględniając nakładanie się okresów, całkowity czas badania wynosi w przybliżeniu 44 dni. W odniesieniu do C. dilutus maksymalne okresy narażenia wynoszą 64 i 65 dni, odpowiednio, dla pierwszego i drugiego pokolenia. Całkowity czas trwania wynosi w przybliżeniu 100 dni.
Projekt ze wzbogaconym osadem: W projekcie ze wzbogaconym osadem narażenie zaczyna się z chwilą dodania larw i wynosi maksymalnie 28 dni dla obu pokoleń C. riparius i C. yoshimatsui oraz maksymalnie 65 dni dla obu pokoleń C. dilutus.
Uwagi
Wylęg
35. Należy określić czas rozwoju i całkowitą liczbę w pełni przepoczwarzonych i żywych samców i samic muchówek dla obu pokoleń. Samce można łatwo zidentyfikować dzięki ich pierzastym czułkom i smukłej budowie ciała.
36. Naczynia badawcze zwierające oba pokolenia należy obserwować co najmniej trzy razy w tygodniu w celu wizualnej oceny ewentualnego nietypowego zachowania larw (np. porzucanie osadu, nietypowy sposób pływania) w porównaniu z próbą kontrolną. Podczas okresu wylęgu, który w przypadku C. riparius i C. yoshimatsui zaczyna się około 12 dni po umieszczeniu larw (20 dni w odniesieniu do C. dilutus), wylęgnięte muchówki liczy się i określa się ich płeć co najmniej raz, a najlepiej dwa razy dziennie (wcześnie rano i późnym popołudniem). Po identyfikacji muchówki z pierwszego pokolenia usuwa się ostrożnie z naczyń i przenosi do klatki hodowlanej. Muchówki z drugiego pokolenia usuwa się i uśmierca po zidentyfikowaniu. Wszystkie sznury jaj złożonych w naczyniu badawczym z pierwszym pokoleniem należy osobno zebrać i przenieść wraz z 2,5 ml wody z tego naczynia do 12-dołkowej mikropłytki (lub innego odpowiedniego naczynia), które jest przykrywane pokrywą, aby zapobiec znacznemu parowaniu. Należy także odnotować liczbę martwych larw i widocznych poczwarek, z których nie wylęgły się muchówki. Przykłady klatki hodowlanej, naczynia badawczego i wentylatora wyciągowego podano w dodatku 5.
Rozmnażanie
37. Wpływ na rozrodczość ocenia się na podstawie liczby sznurów jaj złożonych przez pierwsze pokolenie muchówek i płodności tych jaj. Sznury jaj zbiera się raz dziennie z krystalizatora umieszczonego w pojemniku hodowlanym. Sznury jaj złożonych w naczyniu badawczym należy zebrać i przenieść z 2,5 ml wody z tego naczynia do 12-dołkowej mikropłytki (umieszczając po jednym sznurze w każdym dołku) lub innych odpowiednich naczyń, które przykrywa się pokrywą, aby zapobiec znacznemu parowaniu. W odniesieniu do każdego sznura jaj dokumentuje się następujące cechy charakterystyczne: dzień zniesienia, wielkość (typowe, tj. 1,0 ± 0,3 cm lub małe; zwykle ≤ 0,5 cm) i struktura (typowe= w kształcie banana ze spiralnie uformowanym sznurem jaj lub nietypowe, np. z niespiralnym sznurem jaj) oraz płodność (zapłodnione lub niezapłodnione). Zapłodnienie sznura jaj ocenia się w ciągu sześciu dni po ich złożeniu. Sznur jaj uznaje się za zapłodniony, jeżeli z co najmniej jednej trzeciej jaj wylęgają się larwy. Całkowitą liczbę samic umieszczonych w klatce hodowlanej wykorzystuje się do obliczenia liczby sznurów jaj przypadających na samicę i liczbę sznurów zapłodnionych jaj na samicę. Jeżeli jest to konieczne, można oszacować liczbę jaj w sznurze nie niszcząc go dzięki zastosowaniu metody zliczania pierścieni (przedstawionej szczegółowo w pkt 32 i 33).
Pomiary analityczne
Stężenie badanej substancji chemicznej
38. Na początku narażenia i na końcu badania trzeba przeanalizować co najmniej próbki wody nadosadowej, wody porowej i osadu (w przypadku wzbogacenia wody najlepiej godzinę po dodaniu substancji chemicznej) przy najwyższym i przy niższym stężeniu. Dotyczy to naczyń zawierających oba pokolenia. W odniesieniu do krystalizatorów w klatce hodowlanej analizuje się tylko wodę nadosadową, ponieważ z nią stykają się sznury jaj (w przypadku projektu ze wzbogaconym osadem można uwzględnić analityczne potwierdzenie stężenia substancji w osadzie). Dalsze pomiary stężenia substancji badanej w osadzie, wodzie porowej lub warstwie wody nadosadowej można przeprowadzić w trakcie badania, jeżeli uzna się je za konieczne. Takie oznaczenia stężenia badanej substancji chemicznej zapewniają informacje na temat zachowania/rozdziału badanej substancji w układzie woda-osad. Pobieranie próbek osadu i wody porowej na początku i w trakcie badania (zob. pkt 39) wymaga użycia dodatkowych naczyń badawczych w celu wykonania oznaczeń analitycznych. Pomiary stężenia w osadzie w projekcie ze wzbogaconą wodą mogą nie być konieczne, jeżeli rozdział badanej substancji chemicznej między wodę a osad został wyraźnie określony w badaniu wody/osadu w porównywalnych warunkach (np. stosunek osadu do wody, sposób dodania substancji, zawartość węgla organicznego w osadzie) albo jeżeli wykaże się, że mierzone stężenia w warstwie wody nadosadowej utrzymują się w przedziale 80-120 % nominalnych lub zmierzonych stężeń pierwotnych.
39. Gdy dokonuje się pomiarów pośrednich (np. w 7 lub 14 dniu) lub jeśli do analizy potrzeba dużych próbek, których nie można pobrać z naczyń badawczych bez zakłócenia układu badawczego, należy dokonać oznaczeń analitycznych próbek pochodzących z dodatkowych naczyń badawczych przygotowanych w ten sam sposób (zawierających także organizmy użyte do badań), ale nie wykorzystywanych do obserwacji biologicznych.
40. Aby oddzielić wodę porową, zaleca się odwirowanie osadu np. przy 10 000 g w temp. 4 °C przez 30 min. Jeśli jednak badana substancja chemiczna nie ulega adsorpcji na filtrze, dopuszczalna jest też filtracja. W niektórych przypadkach analiza stężeń w wodzie porowej może być niemożliwa do przeprowadzenia ze względu na zbyt małą objętość próbki.
Parametry fizykochemiczne
41. Wartość pH, stężenie rozpuszczonego tlenu w wodzie w naczyniach badawczych oraz temperaturę wody w naczyniach badawczych i krystalizatorach należy mierzyć w odpowiedni sposób (zob. pkt 10). Twardość wody i zawartość amoniaku należy zmierzyć w próbach kontrolnych oraz w jednym naczyniu badawczym i krystalizatorze przy najwyższym stężeniu na początku i na końcu badania.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Opracowanie wyników
42. Celem badania pełnego cyklu życia jest określenie wpływu badanej substancji chemicznej na rozmnażanie oraz tempo rozwoju i całkowitą liczbę w pełni przepoczwarzonych i żywych samców i samic muchówek z dwóch pokoleń. W celu obliczenia tempa wylęgu dane dotyczące osobników męskich i żeńskich powinny zostać połączone. Jeśli nie ma wskazań dotyczących statystycznie istotnych różnic wrażliwości w tempie rozwoju osobników każdej płci, wyniki dotyczące osobników męskich i żeńskich mogą zostać połączone do celów analizy statystycznej.
43. Stężenia efektywne, wyrażone jako stężenia w wodzie nadosadowej (w przypadku wzbogaconej wody) lub w osadzie (w przypadku wzbogaconego osadu), oblicza się zwykle w oparciu o zmierzone stężenia na początku narażenia (zob. pkt 38). W związku z tym w przypadku wzbogaconej wody stężenia mierzone zazwyczaj na początku narażenia w wodzie nadosadowej w naczyniach zwierających oba pokolenia i w krystalizatorach uśrednia się dla każdego zabiegu. W przypadku wzbogaconego osadu stężenia mierzone zwykle na początku narażenia w naczyniach zwierających oba pokolenia (i opcjonalnie w krystalizatorach) uśrednia się dla każdego zabiegu.
44. Aby dokonać oszacowania punktowego, np. ECx, jako prawdziwe kontrpróby można wykorzystywać dane statystyczne dotyczące poszczególnych naczyń i klatek hodowlanych. Przy obliczaniu przedziału ufności dla ECx należy uwzględnić zmienność między naczyniami lub należy wykazać, że zmienność ta jest na tyle niewielka, że można ją pominąć. Jeżeli model został dopasowany przy użyciu metody najmniejszych kwadratów, do danych statystycznych dotyczących poszczególnych naczyń należy zastosować przekształcenie, aby poprawić jednorodność wariancji. Wartości ECx należy jednak obliczać po przekształceniu odpowiedzi z powrotem na wartość pierwotną (31).
45. W przypadku gdy analiza statystyczna ma na celu określenie wartości NOEC metodą testowania hipotez, należy uwzględnić zmienność między naczyniami, co gwarantuje zastosowanie analizy wariancji ANOVA (np. procedur testu Williamsa i Dunnetta). Test Williamsa byłby odpowiedni w przypadkach, gdy teoretycznie oczekuje się monotonicznej zależności dawka-odpowiedź, a test Dunnetta - gdy hipoteza dotycząca monotoniczności nie jest spełniona. Ewentualnie w przypadkach, w których występują naruszenia zwykłych założeń analizy wariancji ANOA (31), odpowiednie mogą być bardziej odporne testy (27).
Tempo wylęgu
46. Tempa wylęgu są danymi binarnymi i można je analizować z wykorzystaniem testu Cochrana-Armitage'a stosowanego regresywnie w przypadku gdy oczekuje się monotonicznej zależności dawka-odpowiedź i dane te są zgodne z przewidywaniami. W innym przypadku można zastosować test dokładny Fishera lub test Mantela-Haenszela z wartościami p skorygowanymi metodą Bonferroniego-Holma. Jeśli są dowody na większą zmienność między kontrpróbami w ramach tego samego stężenia niż wskazywałby na to rozkład dwumianowy (co określa się często jako zmienność większą niż zmienność w rozkładzie dwumianowym), wówczas należy zastosować odporny test Cochrana-Armitage'a lub test dokładny Fishera, tak jak proponuje się w pozycji (27) w bibliografii.
Określa się sumę żywych przepoczwarzonych muchówek (samców i samic) na każde naczynie, ne, i dzieli przez liczbę wprowadzonych larw, na:
gdzie:
ER = współczynnik wylęgu
ne = liczba żywych przepoczwarzonych muchówek na każde naczynie
na = liczba wprowadzonych larw na każde naczynie (zwykle 20).
Kiedy wartość nejest większa niż na(tj. kiedy w niezamierzony sposób wprowadzono większą liczbę larw niż przewidziano), należy wyrównać na i ne.
47. Najwłaściwszą alternatywą w przypadku dużych próbek, w których występuje wariancja większa niż wariancja w rozkładzie dwumianowym, jest traktowanie współczynnika wylęgu jako odpowiedzi ciągłej i stosowanie procedur zgodnych z danymi dotyczącymi współczynnika wylęgu. Uznaje się, że próbka jest duża, gdy zarówno liczba przepoczwarzonych, jak i nieprzepoczwarzonych muchówek, przekracza pięć na każde naczynie stanowiące kontrpróbę.
48. Aby zastosować metody analizy wariancji ANOVA, wartości współczynnika wylęgu należy najpierw przekształcić, stosując przekształcenie pierwiastkowe i arcsin lub przekształcenie Freemana-Tukeya w celu otrzymania przybliżonego rozkładu normalnego i wyrównania wariancji. Przy użyciu częstości bezwzględnych można zastosować test Cochrana-Armitage'a, test dokładny Fishera (z korektą Bonferroniego) lub test Mantela-Haenszela. Przekształcenie pierwiastkowe i arcsin stosuje się, wyznaczając funkcję odwrotną względem sinusa (sin- 1) pierwiastka współczynnika wylęgu ER.
49. W odniesieniu do współczynników wylęgu wartości ECx oblicza się stosując analizę regresji (np. analizę probitową, logitową lub analizę Weibulla (28)). Jeśli analiza regresji zawodzi (np. w przypadku gdy występują mniej niż dwie częściowe odpowiedzi), stosuje się inne metody nieparametryczne, takie jak średnia krocząca lub prosta interpolacja.
Tempo rozwoju
50. Średni czas rozwoju to średni okres, jaki mija od wprowadzenia larw (dzień 0 badania) do wylęgu muchówek tworzących kohortę badaną (w celu policzenia rzeczywistego czasu rozwoju należy uwzględnić wiek larw w chwili wprowadzenia). Tempo rozwoju (jednostka: 1/dzień) stanowi odwrotność czasu rozwoju i przedstawia tę część rozwoju larwy, która następuje każdego dnia. Do celów oceny omawianych badań dotyczących toksyczności w osadzie preferowane jest tempo rozwoju, jako że jego wariancja jest mniejsza, jest bardziej jednorodne i bliższe normalnemu rozkładowi w porównaniu z czasem rozwoju. Dlatego silniejsze metody parametryczne badania można stosować raczej w odniesieniu do tempa rozwoju niż do czasu rozwoju. Dla tempa rozwoju jako odpowiedzi ciągłej można oszacować wartości ECx, stosując analizę regresji (zob. np. (29) (30)). Wartość NOEC dla średniego tempa rozwoju można określić przez zastosowanie metod analizy wariancji ANOVA, np. testu Williamsa lub Dunnetta. W związku z tym, że samce wylęgają się wcześniej niż samice, tj. ich tempo rozwoju jest szybsze, warto obliczyć tempo rozwoju oddzielnie dla każdej płci oprócz tempa dla wszystkich muchówek.
51. Do badań statystycznych przyjmuje się, że liczba muchówek zaobserwowanych w dniu kontroli x przepoczwarzyła się w średniej odstępu czasu między dniem x a dniem x-l (l = odstęp czasu między kontrolami, zwykle 1 dzień). naczynie (
) liczona jest według następującego wzoru:
gdzie:
: średnia tempa rozwoju na każde naczynie
i: wskaźnik odstępu czasowego między kontrolami
m: maksymalna liczba odstępów czasowych między kontrolami
fi: liczba muchówek przepoczwarzonych w odstępie czasu między kontrolami i
ne: całkowita liczba muchówek przepoczwarzonych na koniec doświadczenia (Σfi)
xi: tempo rozwoju muchówek przepoczwarzonych między kontrolami i
gdzie:
dayi: dzień kontroli (liczba dni od wprowadzenia larw)
li: odstęp czasu między kontrolami i (w dniach, zwykle 1 dzień)
Proporcja płci
52. Proporcje płci są danymi binarnymi i w związku z tym należy je oceniać za pomocą dokładnego testu Fischera lub innych odpowiednich metod. Naturalna proporcja płci w przypadku C. riparius wynosi jeden, tj. samce i samice występują tak samo licznie. Dane dotyczące proporcji płci należy traktować identycznie dla obu pokoleń. W związku z tym, że maksymalna liczba muchówek na naczynie (tj. 20) jest zbyt mała, by można było dokonać znaczącej analizy statystycznej, sumuje się całkowitą liczbę w pełni przepoczwarzonych i żywych muchówek każdej płci we wszystkich naczyniach użytych w jednym zabiegu. Te nieprzekształcone dane testuje się w odniesieniu do próby kontrolnej (z rozpuszczalnikiem) lub połączonych danych z prób kontrolnych w tablicy wielodzielczej 2 × 2.
Rozmnażanie
53. Rozmnażanie, podobnie jak potencjał reprodukcyjny, oblicza się jako liczbę sznurów jaj przypadającą na samicę. Konkretnie całkowitą liczbę sznurów jaj złożonych w klatce hodowlanej dzieli się przez całkowitą liczbę żywych i nieuszkodzonych samic dodanych do tej klatki. Wartość NOEC dla potencjału reprodukcyjnego można określić przez zastosowanie metod analizy wariancji ANOVA, np. testu Williamsa lub Dunnetta.
54. Płodność sznurów jaj służy do ilościowego określenia liczby sznurów zapłodnionych jaj na samicę. Całkowitą liczbę sznurów zapłodnionych jaj złożonych w klatce hodowlanej dzieli się przez całkowitą liczbę żywych i nieuszkodzonych samic dodanych do tej klatki. Wartość NOEC dla płodności można określić przez zastosowanie metod analizy wariancji ANOVA, np. testu Williamsa lub Dunnetta.
Sprawozdanie z badania
55. Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje: Badana substancja chemiczna:
- cechy fizyczne i, w stosownych przypadkach, właściwości fizykochemiczne (rozpuszczalność w wodzie, prężność par, log Kow, współczynnik podziału w glebie (lub w osadzie, jeśli jest dostępny), stabilność w wodzie itd.);
- tożsamość substancji chemicznej (nazwa zwyczajowa, nazwa systematyczna, wzór strukturalny, numer CAS itp.), w tym czystość i metoda analityczna oznaczania ilościowego badanej substancji chemicznej.
Badany gatunek:
- organizmy użyte do badań: gatunek, nazwa naukowa, źródło organizmów i warunki hodowli;
- informacje dotyczące postępowania z pakietami jaj i larwami;
- informacje dotyczące postępowania z przepoczwarzonymi osobnikami dorosłymi z pierwszego pokolenia za pomocą wentylatora wyciągowego itd. (zob. dodatek 5);
- wiek organizmów użytych do badania z pierwszego i drugiego pokolenia w momencie umieszczenia w naczyniu badawczym.
Warunki badania:
- użyty osad, tj. osad naturalny lub preparowany (sztuczny);
- w odniesieniu do osadu naturalnego - lokalizacja i opis miejsca pobrania próbki osadu, w tym, jeśli to możliwe, historia zanieczyszczeń; charakterystyka osadu: pH, zawartość węgla organicznego, stosunek C/ N i granulometria (w stosownych przypadkach);
- w odniesieniu do osadu preparowanego - przygotowanie, składniki i charakterystyka (zawartość węgla organicznego, pH, wilgotność itd. na początku badania);
- przygotowanie wody do badań (jeśli stosowana jest woda regenerowana) i jej charakterystyka (stężenie tlenu, pH, przewodność właściwa, twardość itd. na początku badania);
- grubość warstwy osadu i warstwy wody nadosadowej w odniesieniu do naczyń badawczych i krystalizatorów;
- objętość warstwy wody nadosadowej i wody porowej; masa mokrego osadu z wodą porową i bez niej w odniesieniu do naczyń badawczych i krystalizatorów;
- naczynia badawcze (materiał i wielkość);
- krystalizatory (materiał i wielkość);
- klatki hodowlane (materiał i wielkość);
- metody przygotowania roztworów podstawowych i badanych stężeń w odniesieniu do naczyń badawczych i krystalizatorów;
- umieszczenie badanej substancji chemicznej w naczyniach badawczych i krystalizatorach; badane stężenia, liczba kontrprób i rozpuszczalników, jeżeli były potrzebne;
- warunki inkubacji w odniesieniu do naczyń badawczych: temperatura, cykl i natężenie oświetlenia, napowietrzanie (pęcherzyki powietrza na sekundę);
- warunki inkubacji w odniesieniu do klatek hodowlanych i krystalizatorów: temperatura, cykl i natężenie oświetlenia;
- warunki inkubacji w odniesieniu do sznurów jaj na mikropłytkach (lub w innych naczyniach): temperatura, cykl i natężenie oświetlenia:
- szczegółowe informacje o żywieniu, w tym rodzaj pokarmu, przygotowanie, schemat żywienia i ilość pokarmu.
Wyniki:
- nominalne badane stężenia, zmierzone badane stężenia i wyniki wszystkich analiz ustalających stężenie badanej substancji chemicznej w naczyniach badawczych i krystalizatorach;
- jakość wody w naczyniach badawczych i krystalizatorach, tj. pH, temperatura, rozpuszczony tlen, twardość i zawartość amoniaku;
- uzupełnienie wyparowanej wody do badań, jeśli miało miejsce;
- liczba przepoczwarzonych samców i samic muchówek na każde naczynie na każdy dzień w pierwszym i drugim pokoleniu;
- stosunek płci w pełni przepoczwarzonych i żywych muchówek na zabieg w pierwszym i drugim pokoleniu;
- liczba nieprzepoczwarzonych larw, na każde naczynie w pierwszym i drugim pokoleniu;
- odsetek wylęgu na każdą kontrpróbę na każde badane stężenie (samice i samce muchówek łącznie) w pierwszym i drugim pokoleniu;
- średnie tempo rozwoju w pełni przepoczwarzonych i żywych muchówek na każdą kontrpróbę oraz zabieg (samice i samce muchówek oddzielnie i łącznie) w pierwszym i drugim pokoleniu;
- liczba sznurów jaj złożonych w krystalizatorach na klatkę hodowlaną na dzień;
- charakterystyka każdego sznura jaj (wielkość, kształt i płodność);
- potencjał reprodukcyjny - całkowita liczba sznurów jaj na całkowitą liczbę samic dodanych do klatki hodowlanej;
- płodność - całkowita liczba sznurów zapłodnionych jaj przypadająca na całkowitą liczbę samic dodanych do klatki hodowlanej;
- oszacowania toksycznych punktów końcowych, np. ECx (i powiązane przedziały ufności), wartość stężenia, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC) i metody statystyczne użyte do ich określenia;
- omówienie wyników, w tym ewentualny wpływ na wynik badania będący skutkiem odstępstw od niniejszej metody badawczej.
BIBLIOGRAFIA
(1) Rozdział C.28 niniejszego załącznika, Badanie toksyczności w układzie osad-woda na ochotkowatych z wykorzystaniem wzbogaconej wody.
(2) Shobanov, N.A., Kiknadze, I.I. i M.G. Butler (1999), Palearctic and Nearctic Chironomus (Camptochironomus) tentans Fabricius are different species (Diptera: Chironomidae). Entomologica Scandinavica, 30: 311-322.
(3) Fleming, R. et al. (1994), Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble Substances. Sprawozdanie końcowe dla Komisji Europejskiej. Nr sprawozdania: EC 3738. Sierpień 1994 r. WRc, Zjednoczone Królestwo.
(4) SETAC (1993), Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bioassays for Freshwater and Marine Environments, warsztaty WOSTA w Holandii.
(5) ASTM International (2009) E1706-05E01: Test Method for Measuring the Toxicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. W: Annual Book of ASTM Standards, tom 11.06, Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
(6) Environment Canada (1997), Test for Growth and Survival in Sediment using Larvae of Freshwater Midges (Chironomus tentans or Chironomus riparius), Biological Test Method, Report SPE 1/RM/32, grudzień 1997.
(7) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Wydanie 2. EPA 600/R-99/064, marzec 2000 r. Zmiana wydania 1 z czerwca 1994 r.
(8) US-EPA/OPPTS 850.1735 (1996), Whole Sediment Acute Toxicity Invertebrates.
(9) US-EPA/OPPTS 850.1790 (1996), Chironomid Sediment toxicity Test.
(10) Milani, D., Day, K.E., McLeay, D.J. and R.S. Kirby (1996), Recent intra- and inter-laboratory studies related to the development and standardisation of Environment Canada's biological test methods for measuring sediment toxicity using freshwater amphipods (Hyalella azteca) and midge larvae (Chironomus riparius), sprawozdanie techniczne, Environment Canada, National Water Research Institute, Burlington, Ontario, Kanada.
(11) Norberg-King, T.J., Sibley, P.K., Burton, G.A., Ingersoll, C.G., Kemble, N.E., Ireland, S., Mount, D.R. i C.D. Rowland (2006), Interlaboratory evaluation of Hyalella azteca and Chironomus tentans short-term and long-term sediment toxicity tests, Environ. Toxicol. Chem., 25: 2662-2674.
(12) Taenzler, V., Bruns, E., Dorgerloh, M., Pfeifle, V. i L. Weltje (2007), Chironomids: suitable test organisms for risk assessment investigations on the potential endocrine-disrupting properties of pesticides, Ecotoxicology, 16: 221-230.
(13) Sugaya, Y. (1997), Intra-specific variations of the susceptibility of insecticides in Chironomus yoshimatsui, Jp. J. Sanit. Zool., 48: 345-350.
(14) Kawai, K. (1986), Fundamental studies on chironomid allergy, I. Culture methods of some Japanese chironomids (Chironomidae, Diptera), Jp. J. Sanit. Zool., 37: 47-57.
(15) Rozdział C.27 niniejszego załącznika, Badanie toksyczności w układzie osad-woda na ochotkowatych z wykorzystaniem wzbogaconego osadu.
(16) OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Environment, Health and Safety Publications, Seria dotycząca badań i oceny, nr 23, ENV/JM/MONO(2000)6, OECD, Paryż.
(17) Weltje, L., Rufli, H., Heimbach, F., Wheeler, J., Vervliet-Scheebaum, M. and M. Hamer (2010), The chironomid acute toxicity test: development of a new test system, Integr. Environ. Assess. Management.
(18) Environment Canada. (1995), Guidance Document on Measurement of Toxicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant, sprawozdanie EPS 1/RM/30, wrzesień 1995 r.
(19) Oetken, M, Nentwig, G., Löffler, D, Ternes, T. and J. Oehlmann (2005), Effects of pharmaceuticals on aquatic invertebrates, Part I, The antiepileptic drug carbamazepine, Arch. Environ. Contam. Toxicol., 49: 353-361.
(20) Suedel, B.C. i J.H. Rodgers (1994), Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing, Environ. Toxicol. Chem., 13: 1163-1175.
(21) Naylor, C. i C. Rodrigues (1995), Development of a test method for Chironomus riparius using a formulated sediment, Chemosphere, 31: 3291-3303.
(22) Dunnett, C.W. (1964), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control. J. Amer. Statis. Assoc., 50: 1096-1121.
(23) Dunnett, C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics, 20: 482-491.
(24) Williams, D.A. (1971), A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics, 27: 103-117.
(25) Williams, D.A. (1972), The comparison of several dose levels with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531.
(26) Jungmann, D., Bandow, C., Gildemeister, T., Nagel, R., Preuss, T.G., Ratte, H.T., Shinn, C., Weltje, L. i H.M. Maes (2009), Chronic toxicity of fenoxycarb to the midge Chironomus riparius after exposure in sediments of different composition. J. Soils Sediments 9: 94-102.
(27) Rao, J.N.K. i A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data. Biometrics, 48: 577-585.
(28) Christensen, E.R. (1984), Dose-response functions in aquatic toxicity testing and the Weibull model, Water Res., 18: 213-221.
(29) Bruce, R.D. i D.J. Versteeg (1992), A statistical procedure for modelling continuous toxicity data, Environ. Toxicol. Chem., 11: 1485-1494.
(30) Slob, W. (2002), Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66: 298-312.
(31) OECD (2006), Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: a Guidance to Application, Seria OECD w sprawie badań i oceny Nr 54, 146 s., ENV/JM/MONO(2006)18, OECD, Paryż.
(32) Benoit, D.A., Sibley, P.K., Juenemann, J.L. i G.T. Ankley (1997), Chironomus tentans life-cycle test: design and evaluation for use in assessing toxicity of contaminated sediments, Environ. Toxicol. Chem., 16: 1165-1176.
(33) Vogt, C., Belz, D., Galluba, S., Nowak, C., Oetken, M. i J. Oehlmann (2007), Effects of cadmium and tributyltin on development and reproduction of the non-biting midge Chironomus riparius (Diptera) - baseline experiments for future multi-generation studies, J. Environ. Sci. Health Part A, 42: 1-9.
(34) OECD (2010), Validation report of the Chironomid full life-cycle toxicity test, publikacja w przygotowaniu, Seria dotyczaca badań i oceny, OECD, Paryż.
Dodatek 1
Definicje
Do celów niniejszej metody badawczej stosowane są następujące definicje:
Substancja chemiczna oznacza substancję lub mieszaninę.
Osad preparowany lub odtworzony, sztuczny lub syntetyczny stanowi mieszaninę materiałów używaną do symulowania fizycznych składników naturalnego osadu.
Woda nadosadowa to woda, którą zalano osad w naczyniu badawczym.
Woda porowa to woda wypełniająca przestrzeń między cząstkami osadu i gleby.
Woda wzbogacona to woda do badań, do której dodano badaną substancję chemiczną.
Badana substancja chemiczna oznacza dowolną substancję lub mieszaninę badaną za pomocą opisywanej metody badawczej.
Dodatek 2
Zalecenia dotyczące hodowli Chironomus riparius
1. Larwy ochotki (Chironomus) można hodować w krystalizatorach lub większych pojemnikach. Na dnie pojemnika rozprowadza się drobny piasek kwarcowy, tworząc cienką warstwę o grubości 5-10 mm. Odpowiednim substratem okazała się także ziemia okrzemkowa (np. Merck, Art 8117) (wystarczająca jest cieńsza warstwa grubości najwyżej kilku milimetrów). Następnie dodaje się odpowiednią wodę na wysokość kilku centymetrów. Poziomy wody należy uzupełniać, aby wyrównać stratę spowodowaną parowaniem i zapobiec wysychaniu. Wodę w razie konieczności można wymieniać. Należy zapewnić delikatne napowietrzanie. Naczynia do chowu larw należy przechowywać w odpowiedniej klatce, aby zapobiec ucieczce przepoczwarzonych osobników dorosłych. Klatka powinna być na tyle duża, by umożliwić rojenie przepoczwarzonych osobników dorosłych, w przeciwnym razie może nie dojść do kopulacji (co najmniej ok. 30 × 30 × 30 cm).
2. Klatki powinny być trzymane w temperaturze pokojowej lub w pomieszczeniu o stałych warunkach środowiska w temperaturze 20 ± 2 C z fotoperiodem wynoszącym 16 godzin światła (o natężeniu ok. 1 000 luksów) i 8 godzin ciemności. Odnotowywano, że wilgotność powietrza mniejsza niż 60 % wilgotności względnej może utrudniać rozmnażanie.
Woda rozcieńczająca
3. Można stosować każdy rodzaj wody naturalnej lub syntetycznej. Powszechnie stosowana jest woda studzienna, odchlorowana woda wodociągowa i sztuczne roztwory (np. Elendta "M4" lub "M7", zob. również poniżej). Woda przed użyciem powinna być napowietrzona. W miarę potrzeby woda do hodowli może być wymieniana przez ostrożne odlewanie lub syfonowanie zużytej wody z naczyń hodowlanych bez niszczenia rurek larw.
Karmienie larw
4. Larwom Chironomus należy podawać pokarm w płatkach dla ryb (Tetra Min®, Tetra Phyll® lub innej marki pokarm dla ryb) w ilości ok. 250 mg na każde naczynie dziennie. Można podawać pokarm w postaci suchego mielonego proszku lub zawiesiny w wodzie: 1,0 g pokarmu w płatkach dodaje się do 20 ml wody rozcieńczającej i rozdrabnia się w celu uzyskania jednorodnej mieszaniny. Preparat taki można stosować jako pokarm w ilości ok. 5 ml na każde naczynie na dzień (przed użyciem wstrząsnąć). Starsze larwy mogą dostawać go więcej.
5. Żywienie dostosowuje się do jakości wody. Jeśli podłoże hodowlane staje się mętne, należy ograniczyć karmienie. Podawanie pokarmu należy starannie monitorować. Zbyt mała ilość pokarmu spowoduje migrację larw w kierunku warstwy wody, a zbyt duża wywoła zwiększoną aktywność mikroorganizmów i zmniejszone stężenie tlenu. Oba rodzaje warunków mogą spowodować ograniczenie tempa wzrostu.
6. Przygotowując nowe naczyń do hodowli, można też dodać komórki niektórych gatunków zielenic (np. Scenedesmus subspicatus, Chlorella vulgaris).
Karmienie przepoczwarzonych osobników dorosłych
7. Niektórzy badacze sugerują, by do karmienia przepoczwarzonych osobników dorosłych używać tamponu z wełny bawełnianej nasączonego nasyconym roztworem sacharozy.
Wylęg
8. Przy temperaturze 20 ± 2 °C po ok. 13-15 dniach w naczyniach do hodowli larw uwalniają się z poczwarek osobniki dorosłe. Samce łatwo zidentyfikować dzięki pierzastym czułkom i smukłej budowie ciała.
Pakiety jaj
9. Z chwilą pojawienia się w klatce hodowlanej osobników dorosłych należy trzy razy w tygodniu sprawdzać we wszystkich naczyniach do chowu larw, czy nie zostały złożone galaretowate pakiety jaj. Jeśli zostały złożone, należy je ostrożnie usunąć. Należy przenieść je do niewielkiego naczynia zawierającego próbkę wody używanej do hodowli. Pakiety jaj wykorzystuje się do zapoczątkowania hodowli w nowym naczyniu (np. 2-4 pakietów jaj na naczynie) lub do badań toksyczności.
10. Larwy w pierwszym stadium larwalnym powinny wylęgnąć się po 2-3 dniach.
Przygotowanie hodowli w nowych naczyniach
11. Po założeniu hodowli powinno być możliwe założenie nowego naczynia z nową hodowlą larw raz na tydzień lub rzadziej, w zależności od wymogów badania, przy czym usuwa się starsze naczynia po pojawieniu się w nich dorosłych muchówek. Stosując ten system, uzyskuje się stałe źródło zaopatrzenia w dorosłe osobniki przy zminimalizowaniu zarządzania.
Przygotowanie roztworów do badań "M4" i "M7"
12. Roztwór "M4" został opisany przez Elendta (1990). Roztwór "M7" przygotowuje się jak roztwór "M4" z wyjątkiem substancji wskazanych w tabeli 1, których stężenie w "M7" jest czterokrotnie mniejsze niż w "M4". Roztwór do badań nie powinien być przygotowywany zgodnie z instrukcjami Elendta i Biasa (1990), ponieważ stężenia NaSiO3 5 H2O, NaNO3, KH2PO4 i K2HPO4 podane dla przygotowania roztworów podstawowych nie są odpowiednie.
Przygotowanie roztworu "M7"
13. Każdy roztwór podstawowy (I) przygotowuje się oddzielnie, a z roztworów podstawowych (I) przygotowuje się łączony roztwór podstawowy (II) (zob. tabela 1). W celu przygotowania roztworu "M7" 50 ml połączonego roztworu podstawowego (II) oraz podane w tabeli 2 ilości każdego roztworu podstawowego makroskładnika odżywczego dopełnia się do 1 litra wodą dejonizowaną. Roztwór podstawowy witamin przygotowuje się przez dodanie trzech witamin do wody dejonizowanej, jak wskazano w tabeli 3, a do końcowego roztworu "M7" na krótko przed użyciem dodaje się 0,1 ml łączonego roztworu podstawowego witamin. Roztwór podstawowy witamin przechowuje się zamrożony w małych podwielokrotnościach. Roztwór jest napowietrzany i stabilizowany.
Tabela 1
Roztwory podstawowe pierwiastków śladowych w odniesieniu do roztworów M4 i M7
| Roztwory podstawowe (I) | Ilość (mg) dopełniana do 1 litra wodą dejonizowaną | W celu przygotowania łączonego roztworu podstawowego (II): zmieszać następujące ilości (ml) roztworów podstawowych (I) i dopełnić do 1 litra wodą dejonizowaną | Końcowe stężenia w roztworach do badań (mg/l) | ||
| M4 | M7 | M4 | M7 | ||
| H3BO3 (1) | 57 190 | 1,0 | 0,25 | 2,86 | 0,715 |
| MnCl2∙ 4H2O (1) | 7 210 | 1,0 | 0,25 | 0,361 | 0,090 |
| LiCl (1) | 6 120 | 1,0 | 0,25 | 0,306 | 0,077 |
| RbCl (1) | 1 420 | 1,0 | 0,25 | 0,071 | 0,018 |
| SrCl2∙ 6H2O (1) | 3 040 | 1,0 | 0,25 | 0,152 | 0,038 |
| NaBr (1) | 320 | 1,0 | 0,25 | 0,016 | 0,004 |
| Na2MoO4∙ 2H2O (1) | 1 260 | 1,0 | 0,25 | 0,063 | 0,016 |
| CuCl2∙ 2H2O (1) | 335 | 1,0 | 0,25 | 0,017 | 0,004 |
| ZnCl2 | 260 | 1,0 | 1,0 | 0,013 | 0,013 |
| CaCl2∙ 6H2O | 200 | 1,0 | 1,0 | 0,010 | 0,010 |
| KI | 65 | 1,0 | 1,0 | 0,0033 | 0,0033 |
| Na2SeO3 | 43,8 | 1,0 | 1,0 | 0,0022 | 0,0022 |
| NH4VO3 | 11,5 | 1,0 | 1,0 | 0,00058 | 0,00058 |
| Na2EDTA∙ 2H2O (1) (2) | 5 000 | 20,0 | 5,0 | 2,5 | 0,625 |
| FeSO4∙ 7H2O (1) (2)1 991 | 1 991 | 20,0 | 5,0 | 1,0 | 0,249 |
| (1) Substancje te różnią się w odniesieniu do M4 i M7, jak określono powyżej. (2) Roztwory te są przygotowywane oddzielnie, następnie łączone ze sobą i niezwłocznie poddawane sterylizacji w autoklawie. |
Tabela 2
Roztwory podstawowe makroskładników odżywczych w odniesieniu do roztworów M4 i M7
| Ilość (mg) dopełniana do 1 litra wodą dejonizowaną (mg) | Ilość roztworów podstawowych makroskładników odżywczych w celu przygotowania roztworów M4 i M7 (ml/l) | Końcowe stężenia w roztworach do badań M4 i M7 (mg/l) | |
| CaCl2∙ 2H2O | 293 800 | 1,0 | 293,8 |
| MgSO4∙ 7H2O | 246 600 | 0,5 | 123,3 |
| KCl | 58 000 | 0,1 | 5,8 |
| NaHCO3 | 64 800 | 1,0 | 64,8 |
| NaSiO3∙ 9H2O | 50 000 | 0,2 | 10,0 |
| NaNO3 | 2 740 | 0,1 | 0,274 |
| KH2PO4 | 1 430 | 0,1 | 0,143 |
| K2HPO4 | 1 840 | 0,1 | 0,184 |
Tabela 3
Roztwór podstawowy witamin dla roztworów M4 i M7
Wszystkie trzy roztwory witamin łączy się, by otrzymać jeden roztwór podstawowy witamin.
| Ilość (mg) dopełniana do 1 litra wodą dejonizowaną (mg) | Ilość (ml/l) roztworu podstawowego witamin dodawanego w celu przygotowania roztworów M4 i M7 (ml/l) | Końcowe stężenia w roztworach do badań M4 i M7 (mg/l) | |
| Chlorowodorek tiaminy | 750 | 0,1 | 0,075 |
| Cyjanokobalamina (B12) | 10 | 0,1 | 0,0010 |
| Biotyna | 7,5 | 0,1 | 0,00075 |
BIBLIOGRAFIA
BBA (1995), Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and validation of a new test system, M. Streloke i H. Köpp (red.), Berlin. Berlin.
Elendt, B.P. (1990), Selenium deficiency in Crustacea, Protoplasma, 154: 25-33.
Elendt, B.P. i W.-R. Bias (1990), Trace nutrient deficiency in Daphnia magna cultured in standard medium for toxicity testing, Effects on the optimisation of culture conditions on life history parameters of D. magna, Water Research, 24: 1157-1167.
Dodatek 3
Przygotowanie osadu preparowanego
SKŁAD OSADU
Skład osadu preparowanego powinien być następujący:
| Składnik | Właściwości | % suchej masy osadu |
| Torf | Torf sfagnowy, w miarę możliwości o wartości pH równej 5,5-6,0, bez widocznych pozostałości roślin, drobno zmielony (wielkość cząstek ≤ 1 mm), suszony powietrzem | 4 - 5 |
| Piasek kwarcowy | Wielkość ziaren: > 50 % cząstek powinna mieścić się w przedziale 50-200 μm | 75 - 76 |
| Glinka kaolinowa | Zawartość kaolinitu ≥ 30 % | 20 |
| Węgiel organiczny | Korygowany przez dodanie torfu i piasku | 2 (± 0,5) |
| Węglan wapnia | CaCO3, sproszkowany, czysty chemicznie | 0,05 - 0,1 |
| Woda | Przewodność właściwa ≤ 10 μS/cm | 30 - 50 |
PRZYGOTOWANIE
Torf suszy się powietrzem i mieli na drobny proszek. Zawiesinę wymaganej ilości proszku torfowego w wodzie dejonizowanej przygotowuje się z użyciem wysokosprawnego urządzenia do homogenizacji. Wartość pH zawiesiny koryguje się do poziomu 5,5 ± 0,5, stosując CaCO3. W celu ustabilizowania pH i komponentu mikrobiologicznego zawiesinę kondycjonuje się przez co najmniej dwa dni w temperaturze 20 ± 2 °C, delikatnie mieszając. Ponownie mierzy się pH, którego wartość powinna wynosić 6,0 ± 0,5. Następnie zawiesinę torfową miesza się z innymi składnikami (piaskiem i glinką kaolinową) oraz wodą dejonizowaną, aby otrzymać jednorodny o zawartościi wody w przedziale 30-50 % suchej masy osadu. Ponownie mierzy się wartość pH końcowej mieszaniny i koryguje w miarę potrzeby za pomocą CaCO3 do poziomu 6,5 - 7,5. Próbki osadu pobiera się, aby określić suchą masę i zawartość węgla organicznego. Następnie, przed ich wykorzystaniem w badaniu toksyczności na ochotkowatych, zaleca się kondycjonowanie osadu preparowanego przez siedem dni w tych samych warunkach, w jakich zostanie przeprowadzone badanie.
PRZECHOWYWANIE
Suche składniki do przygotowywania sztucznego osadu mogą być przechowywane w suchym i chłodnym miejscu w temperaturze pokojowej. Nie należy przechowywać (mokrego) osadu preparowanego przed jego użyciem do badania. Osad należy wykorzystać natychmiast po 7-dniowym okresie kondycjonowania, kończącym proces jego przygotowania.
BIBLIOGRAFIA
OECD (1984), Earthworm, Acute Toxicity Test, wytyczna nr 207 w sprawie badań, Wytyczne dotyczące badania substancji chemicznych, OECD, Paryż.
Meller, M., Egeler, P., Roembke, J., Schallnass, H., Nagel, R. i B. Streit (1998), Short-term toxicity of lindane, hexachlo-robenzene and copper sulfate on tubificid sludgeworms (Oligochaeta) in artificial media, Ecotox. Environ. Safety 39: 10-20.
Dodatek 4
Właściwości chemiczne dopuszczalnej wody rozcieńczającej
| SKŁADNIK | STĘŻENIA |
| Cząstki stałe | < 20 mg/l |
| Całkowity węgiel organiczny | < 2 mg/l |
| Niezjonizowany amoniak | < 1 µg/l |
| Twardość wyrażona jako CaCO3 | < 400 mg/l (*) |
| Chlor resztkowy | < 10 µg/l |
| Pestycydy fosforoorganiczne ogółem | < 50 ng/l |
| Pestycydy chloroorganiczne ogółem plus polichlorowane bifenyle | < 50 ng/l |
| Całkowity chlor organiczny | < 25 ng/l |
| (*) Jeśli jednak zachodzi podejrzenie interakcji między jonami powodującymi twardość wody a badaną substancją chemiczną, należy stosować wodę o mniejszej twardości (w takim przypadku nie należy zatem stosować roztworu Elendta M4). |
Dodatek 5
Wytyczne dotyczące przeprowadzania badania
Przykład klatki hodowlanej:
A: siatka na górnej części i co najmniej na jednej ścianie klatki (wielkość oczek ok. 1 mm)
B: otwór do umieszczania przepoczwarzonych osobników dorosłych wewnątrz klatki hodowlanej i usuwania złożonych sznurów jaj z krystalizatorów (nie przedstawionych na rysunku)
C: minimalne wymiary klatki hodowlanej: długość 30 cm, wysokość 30 cm, szerokość 30 cm
Przykład naczynia badawczego:
A: pipeta Pasteura jako doprowadzenie powietrza do warstwy wody nadosadowej
B: szklana pokrywa zapobiegająca ucieczce muchówek
C: warstwa powierzchniowa wody
D: naczynie badawcze (szklana zlewka o pojemności min. 600 ml)
E: warstwa osadu
Przykład wentylatora wyciągowego d pozyskiwania dorosłych muchówek (strzałki wskazują kierunek przepływu powietrza):
A: rurka szklana (średnica wewnętrzna ok. 5 mm) połączona z pompą samozasysającą
B: korek z gumy z otworem na szklaną rurkę (A). Po stronie wewnętrznej, otwór szklanej rurki (A) jest zakryty bawełną i siatką (wielkość oczek ok. 1 mm), aby zapobiec uszkodzeniu muchówek podczas ich zasysania do wentylatora wyciągowego.
C: przezroczysty pojemnik (z tworzywa sztucznego lub szkła, długość ok. 15 cm) na schwytane muchówki
D: korek z gumy z otworem na rurkę (E). Aby wprowadzić muchówki do klatki hodowlanej, należy wyjąć korek D z pojemnika C.
E: rurka (z tworzywa sztucznego lub szkła, średnica wewnętrzna ok. 8 mm) do zbierania schwytanych muchówek z naczynia
Schematyczna prezentacja badania cyklu życia
A: 1. pokolenie - naczynia badawcze z układem osad-woda, osiem kontrprób, 20 larw w pierwszym stadium larwalnym na naczynie
B: cztery naczynia badawcze na każdą klatkę hodowlaną, A i B
C: klatki hodowlane (A i B) do rojenia, godów i składania jaj
D: krystalizatory do umieszczania sznurów jaj
E: mikropłytki, jeden dołek na każdy sznur jaj
F: 2. pokolenie - naczynia badawcze z układem osad-woda, osiem kontrprób, 20 larw w pierwszym stadium larwalnym na naczynie
C.41. Badanie rozwoju płciowego ryb
WPROWADZENIE
1. Opisywana metoda badawcza jest równoważna z wytyczną OECD nr 234 (2011 r.) w sprawie badań. Jej podstawą jest decyzja z 1998 r. mająca na celu opracowanie nowych lub aktualizację istniejących metod badawczych na potrzeby przeglądu i badania substancji potencjalnie zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego. Badanie rozwoju płciowego ryb zidentyfikowano jako obiecującą metodę badawczą, obejmującą wrażliwy etap życia ryb, na którym reagują na substancje chemiczne o charakterze zbliżonym zarówno do estrogenów, jak i androgenów. Wspomniana metoda badawcza przeszła proces weryfikacji międzylaboratoryjnej w latach 2006-2010, w ramach której sprawdzono ryżankę japońską (Oryzias latipes), danio pręgowanego (Danio rerio) i ciernika (Gasterosteus aculeatus), a Pimephales promelas zweryfikowano częściowo (41) (42) (43). Niniejszy protokół dotyczy ryżanki japońskiej, ciernika i danio pręgowanego. Zasadniczo protokół ten stanowi rozszerzenie wytycznej OECD nr 210 w sprawie badań "Badanie toksyczności ryb na wczesnym etapie życia" (Fish Early Life Stage Toxicity Test) (1), przy czym narażenie kontynuuje się do momentu zróżnicowania ryb pod względem płci, tj. około 60 dni po wykluciu w przypadku ryżanki japońskiej, ciernika i danio pręgowanego (okres narażenia może być krótszy lub dłuższy w przypadku innych gatunków, które zostaną zweryfikowane w przyszłości), i dodaje się punkty końcowe określające wrażliwość układu hormonalnego. W badaniu rozwoju płciowego ryb ocenia się wpływ i potencjalne niekorzystne skutki substancji chemicznych przypuszczalnie zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego (np. estrogenów, androgenów i inhibitorów steroido-genezy) dla rozwoju płciowego ryb na wczesnym etapie ich życia. Dzięki połączeniu dwóch podstawowych punktów końcowych określających wpływ na układ hormonalny, stężenia witellogeniny (VTG) i fenotypowej proporcji płci badanie umożliwia pokazanie sposobu działania badanej substancji chemicznej. Ze względu na zmianę fenotypowej proporcji płci istotną dla danej populacji badanie rozwoju płciowego ryb można wykorzystać do oceny zagrożenia i ryzyka. Jeżeli badanie stosuje się w celu oceny zagrożenia i ryzyka, nie należy wykorzystywać w nim ciernika, ponieważ dostępne do chwili obecnej dane weryfikacyjne wykazały, że w przypadku tego gatunku zmiany w fenotypowej proporcji płci wywołane przez badane substancje chemiczne występowały rzadko.
2. Protokół opiera się na badaniu ryb narażonych przez wodę na działanie substancji chemicznych podczas nietrwałego okresu płciowego, w którym oczekuje się, że ryby będą najbardziej wrażliwe na wpływ substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego. Dokonuje się pomiaru dwóch podstawowych punktów końcowych będących wskaźnikami aberracji rozwojowych związanych z układem hormonalnym, stężeń VTG i proporcji płci (proporcji między płciami) określonych na podstawie histologii gonad. Histopatologia gonad (ocena i określenie etapów rozwoju oocytów i komórek spermatogenetycznych) nie jest obowiązkowa. Dodatkowo określa się w miarę możliwości płeć genetyczną (np. w przypadku ryżanki japońskiej i ciernika). Obecność markera płci genetycznej stanowi znaczną zaletę, ponieważ zwiększa moc statystyk dotyczących proporcji płci i umożliwia wykrycie odwrócenia płci fenotypowej. Inne szczytowe punkty końcowe, które należy zmierzyć, obejmują wskaźnik wylęgalności, przeżywalność, długość i masę ciała. Niniejszą metodę badawczą można dostosować do gatunków innych niż wspomniane powyżej, pod warunkiem że:
(i) te inne gatunki zostaną poddane walidacji równorzędnej weryfikacji przeprowadzonej w przypadku ryżanki japońskiej, ciernika i danio pręgowanego;
(ii) próba kontrolna ryb jest zróżnicowana pod względem płci pod koniec badania;
(iii) poziomy VTG są na tyle wysokie, że umożliwiają wykrycie zmian związanych z substancją chemiczną; oraz
(iv) wrażliwość układu badawczego określa się, stosując substancje chemiczne odniesienia zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego ((anty)estrogeny, (anty)angrogeny, inhibitory aromatazy itd.). Ponadto każde sprawozdanie z weryfikacji odnoszące się do badania rozwoju płciowego ryb powinno zostać ocenione przez OECD, a wyniki weryfikacji powinny zostać uznane za satysfakcjonujące.
Uwagi wstępne i ograniczenia
3. VTG jest prawidłowo wytwarzana w wątrobie jajorodnych samic kręgowców w reakcji na endogenny estrogen w układzie krążenia (2). Jest ona prekursorem białek żółtka i po wytworzeniu w wątrobie jest przenoszona przez krew do jajnika, gdzie jest pobierana i modyfikowana przez rozwijające się komórki jajowe. Synteza VTG jest bardzo ograniczona, choć wykrywalna, u niedojrzałych płciowo ryb i dorosłych samców ryb, ponieważ nie mają wystarczającej ilości estrogenu w układzie krążenia. Wątroba ma jednak zdolność syntezy i wydzielania VTG w reakcji na egzogenną stymulację estrogenem (3) (4) (5).
4. Pomiar VTG służy wykrywaniu substancji chemicznych o estrogennym, antyestrogennym i androgennym charakterze działania oraz substancji chemicznych, które interferuja ze steroidogenezą, na przykład inhibitorów aromatazy. Wykrycie estrogennych substancji chemicznych jest możliwe dzięki pomiarowi indukcji VTG u samców ryb i zostało bogato udokumentowane w recenzowanej literaturze naukowej. Indukcję VTG wykazano również po narażeniu na aromatyzowalne androgeny (6) (7). Obniżenie poziomu estrogenu w układzie krążenia w przypadku samic, na przykład na skutek zahamowania aktywności aromatazy przekształcającej endogenny androgen w naturalny estrogen 17β-estradiol, powoduje zmniejszenie stężenia VTG, co wykorzystuje się do wykrywania substancji chemicznych działających jak inhibitory aromatazy lub, ogólniej, do wykrywania inhibitorów steroidogenezy (33). Biologiczne znaczenie reakcji VTG po zahamowania aktywności substancji estrogennej/aromatazy zostało ustalone i jest szeroko udokumentowane (8) (9). Możliwe jest jednak, że na wytwarzanie VTG u samic może również wpływać ogólna toksyczność i niehormonalne sposoby działania toksycznego.
5. Opracowano i znormalizowano z dobrym wynikiem kilka metod pomiaru w celu rutynowego wykorzystywania do ilościowego oznaczania VTG w próbkach krwi, wątroby, całego ciała lub homogenatów głowy/ogona pobranych od pojedynczych ryb. Dotyczy to danio pręgowanego, ciernika i ryżanki japońskiej oraz częściowo zweryfikowanego gatunku Pimephales promelas; dostępne są metody oparte na właściwym dla danego gatunku teście immunenzymatycznym (ELISA), w których do oznaczenia ilościowego VTG wykorzystuje się metody immunochemiczne (5) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). W przypadku ryżanki japońskiej i danio pręgowanego występuje dobra korelacja między VTG mierzoną w próbkach osocza krwi, wątroby i homogenatów, mimo że homogenaty zwykle wykazują nieco niższe wartości niż osocze (17) (18) (19). W dodatku 5 przedstawiono zalecane procedury pobierania próbek do celów analizy VTG.
6. Zmiana w fenotypowej proporcji płci stanowi parametr docelowy odzwierciedlający odwrócenie płci. W zasadzie estrogeny, antyestrogeny, androgeny, antyandrogeny i substancje chemiczne hamujące steroido-genezę mogą mieć wpływ na proporcję płci rozwijających się ryb (20). Wykazano, że odwrócenie płci jest częściowo odwracalne w przypadku danio pręgowanego (21) po narażeniu na działanie substancji chemicznej podobnej do estrogenu, natomiast odwrócenie płci po narażeniu na działanie substancji chemicznej podobnej do androgenu jest trwałe (30). Płeć definiuje się jako żeńską, męską, interseksualną (w jednej gonadzie znajdują się zarówno oocyty, jak i komórki spermatogenezy) lub niezróżnicowaną; u pojedynczych osobników określa się ją na podstawie histologicznego badania gonad. Wytyczne zostały zamieszczone w dodatku 7 i wytycznej OECD dotyczącej diagnozy histopatologii gonad ryb powiązanej z układem hormonalnym (Diagnosis of Endocrine-Related Histopathology of Fish Gonads) (22).
7. Płeć genetyczną bada się za pośrednictwem markerów genetycznych, jeżeli występują one u danego gatunku ryb. W przypadku ryżanki japońskiej geny żeńskie XX lub męskie XY można wykryć za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) lub analizy związanej z genem Y zawierającym domenę DM (DMY) zgodnie z opisem w (23) (24) (DMY negatywny lub pozytywny). W przypadku ciernika istnieje równoważna metoda PCR określania płci genetycznej, którą opisano w dodatku 10. W przypadku gdy płeć genetyczną można połączyć indywidualnie z płcią fenotypową, moc badania zwiększa się i w związku z tym płeć genetyczną należy określać u gatunków o udokumentowanych markerach płci genetycznej.
8. Dwa podstawowe punkty końcowe wpływające na układ hormonalny, VTG i proporcja płci, mogą łącznie wskazywać na hormonalny charakter działania substancji chemicznej (zob. tabela 1). Proporcja płci stanowi biomarker istotny dla populacji (25) (26), a w przypadku dobrze znanego charakteru działania niektórych substancji wyniki badania rozwoju płciowego ryb można wykorzystać do oceny zagrożenia i ryzyka, jeżeli organ regulacyjny uzna to za właściwe. Taki charakter działania mają obecnie estrogeny, androgeny i inhibitory steroidogenezy.
Tabela 1
Reakcja punktów końcowych wpływających na układ hormonalny na różne charaktery działania substancji chemicznych.
↑ = podwyższenie, ↓ = obniżenie, – = nie zbadano
| CHARAKTER DZIAŁANIA | VTG ♂ | VTG ♀ | Proporcja płci | Bibliografia |
| Słaby agonista estrogenu | ↑ | ↑ | ↑ ♀ lub ↑ Niezróżn. | (27) (40) |
| Silny agonista estrogenu | ↑ | ↑ | ↑ ♀ lub ↑ Nieróżn., Brak ♂ | (28) (40) |
| Antagonista estrogenu | – | – | ↓ ♀ , ↑ Niezróżn. | (29) |
| Agonista androgenu | ↓ lub – | ↓ lub – | ↑ ♂ Brak ♀ | (28) (30) |
| Agonista androgenu | - | - | ↑ ♀ ↑ Interseks. | (31) |
| Inhibitor aromatazy | ↓ | ↓ | ↓ ♀ | (33) |
9. Badanie rozwoju płciowego ryb nie obejmuje fazy rozmnażania ryb, w związku z czym substancje chemiczne, co do których zachodzi podejrzenie, że mają wpływ na rozmnażanie przy stężeniach niższych niż stężenia wpływające na rozwój płciowy, należy poddać badaniu, które obejmuje rozmnażanie.
10. Definicje dla potrzeb niniejszej metody badawczej przedstawiono w dodatku 1.
11. Badanie rozwoju płciowego ryb in vivo ma na celu wykrycie substancji chemicznych o właściwościach androgennych i estrogennych, jak również antyandrogennych, antyestrogennych i hamujących steroidogenezę. Etapy weryfikacji w badaniu rozwoju płciowego ryb (1 i 2) faktycznie obejmowały substancje chemiczne estrogenne, androgenne i hamujące steroidogenezę. Oddziaływania antagonistów estrogenu i androgenu na rozwój płciowy ryb przedstawiono w tabeli 1, jednak te charaktery działania są obecnie w mniejszym stopniu udokumentowane.
ZASADA BADANIA
12. Badanie polega na narażaniu ryb od zapłodnionej komórki jajowej do zakończenia różnicowania płci na co najmniej trzy stężenia badanej substancji chemicznej rozpuszczonej w wodzie. Badanie powinno się wykonywać w warunkach przepływu, chyba że jest to niemożliwe ze względu na dostępność lub charakter (np. ograniczoną rozpuszczalność) badanej substancji chemicznej. Badanie zaczyna się od umieszczenia świeżo zapłodnionych komórek jajowych (przed bruzdkowaniem tarczy zarodkowej) w komorach badawczych. Obciążenie komór opisano w pkt 27 w odniesieniu do każdego gatunku. W przypadku zweryfikowanych gatunków ryb, t.j. ryżanki japońskiej, ciernika i danio pręgowanego, badanie kończy się 60 dni po wykluciu. Na zakończenie badania wszystkie ryby poddaje się eutanazji w sposób humanitarny. Z każdej ryby pobiera się próbki biologiczne (osocza krwi, wątroby lub homogenatu głowy/ogona) do analizy stężenia witellogeniny (VTG), pozostałą część utrwala się natomiast w celu wykonania oceny histologicznej gonad i określenia płci fenotypowej; nieobowiązkowo można przeprowadzić histopatologię (np. określenie etapu rozwoju gonad, intensywność interseksualności). Biologiczną próbkę (płetwę odbytową lub grzbietową) na potrzeby określenia płci genetycznej pobiera się od gatunków posiadających odpowiednie markery (dodatki 9 i 10).
13. Przegląd właściwych warunków badania specyficznych dla zweryfikowanych gatunków, t.j. ryżanki japońskiej, ciernika i danio pręgowanego, podano w dodatku 2.
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ
14. Powinny być dostępne wyniki badania toksyczności ostrej lub innego krótkoterminowego badania toksyczności (np. metodą badania C.14 (34) w oparciu o wytyczną OECD 210 w sprawie badań (1)), najlepiej przeprowadzonego na gatunkach wybranych do tego badania. Oznacza to, że rozpuszczalność w wodzie i prężność par badanej substancji chemicznej powinny być znane, jak również powinna być dostępna niezawodna analityczna metoda oznaczania ilościowego substancji w komorach badawczych o udokumentowanej dokładności i granicy wykrywalności.
15. Inne użyteczne informacje obejmują wzór strukturalny, czystość substancji, stabilność w wodzie i pod wpływem światła, stałą dysocjacji, współczynnik podziału n-oktanol/woda oraz wyniki badania szybkiej biodegradadowalności (zob. metoda badania C.4) (35).
Kryteria akceptacji badania
16. Aby wyniki badania były akceptowalne, muszą zostać spełnione następujące warunki:
- stężenie tlenu rozpuszczonego musi wynosić co najmniej 60 % wartości nasycenia powietrzem (ASV) w trakcie badania;
- różnica temperatury wody między komorami badawczymi przez cały czas trwania badania nie może być większa niż ± 1,5 °C i musi być utrzymywana w zakresie temperatur określonym w odniesieniu do gatunków badanych (dodatek 2);
- powinna być dostępna zweryfikowana metoda analizy narażenia na działanie substancji chemicznej, której granica wykrywalności znajduje się znacznie poniżej najniższego nominalnego stężenia; należy również zebrać dowody, aby wykazać, że stężenia badanej substancji chemicznej w roztworze można było utrzymać w granicach ± 20 % średnich zmierzonych wartości;
- ogólna liczba zapłodnionych komórek jajowych, które przeżyły w próbach kontrolnych i, w uzasadnionych przypadkach, w próbach kontrolnych z rozpuszczalnikiem, powinna być większa niż wartości graniczne określone w dodatku 2 lub im równa;
- kryteria akceptacji związane z wzrostem i proporcjami płci na zakończenie badania są oparte na danych z grup kontrolnych (połączonych prób kontrolnych z rozpuszczalnikiem i wodą lub, jeśli znacznie się różnią, tylko z rozpuszczalnikiem):
| Ryżanka japońska | Danio pręgowany | Ciernik |
| Wzrost | Mokra masa ryb osuszonych na bibule | > 150 mg | > 75 mg | > 120 mg |
| Długość (długość standardowa) | > 20 mm | > 14 mm | > 20 mm |
| Proporcja płci (% samców i samic) | 30-70 % | 30-70 % | 30-70 % |
- W przypadku stosowania rozpuszczalnika nie powinien on mieć istotnego statystycznie wpływu na przeżywalność i nie powinien zaburzać równowagi układu hormonalnego lub wykazywać innych szkodliwych skutków na wczesnych etapach życia, jak wykazano w próbie kontrolnej z rozpuszczalnikiem.
Jeżeli zaobserwuje się odchylenie od kryteriów akceptacji badania, skutki należy zanalizować w odniesieniu do wiarygodności danych badania, a analizy te należy uwzględnić w sprawozdaniu.
OPIS METODY BADAWCZEJ
Komory badawcze
17. Można użyć komór wykonanych ze szkła, stali nierdzewnej lub innych obojętnych chemicznie materiałów. Wymiary komór muszą być na tyle duże, aby zapewnić zgodność z podanymi poniżej kryteriami wskaźnika obciążenia. Zaleca się losowe rozmieszczenie komór badawczych w obszarze badania. Projekt z blokowym układem losowym, przy czym w każdym bloku występuje każde stężenie, jest korzystniejszy niż całkowicie losowy układ. Komory badawcze powinny być zabezpieczone przed niepożądanymi zakłóceniami.
Wybór gatunków
18. Zalecane gatunki ryb wymieniono w dodatku 2. Procedury włączenia nowych gatunków podano w pkt 2.
Utrzymywanie ryb rodzicielskich
19. Szczegółowe informacje dotyczące utrzymania ryb rodzicielskich w zadowalających warunkach można znaleźć w wytycznej OECD nr 210 w sprawie badań (1). Ryby rodzicielskie należy karmić odpowiednim pokarmem raz lub dwa razy dziennie.
Postępowanie z zarodkami i larwami
20. Początkowo zarodki i larwy poddawane są narażeniu w obrębie głównej komory, w mniejszych komorach ze szkła lub stali nierdzewnej, wyposażonych w siatki po bokach lub na końcach, pozwalające na przepływ badanej substancji chemicznej przez komorę. Nieburzliwy przepływ przez te małe komory można uzyskać, zawieszając je na ramieniu przemieszczającym komory w górę i w dół, przy czym organizmy powinny być zawsze zanurzone.
21. W przypadku gdy do utrzymywania komórek jajowych wewnątrz głównej komory badawczej używane były pojemniki, kraty lub siatki, należy usunąć te ograniczenia po wylęgu larw, poza zachowaniem siatek zapobiegających ucieczce ryb. Jeśli zachodzi konieczność przeniesienia larw, nie można ich wystawiać na działanie powietrza i nie wolno używać siatek do wypuszczania ryb z pojemników z komórkami jajowymi. Moment takiego przeniesienia zależy od gatunku i przeniesienie nie zawsze jest konieczne.
Woda
22. Woda, w której badane gatunki w próbie kontrolnej przeżywają co najmniej w tak dobrym stopniu jak w wodzie opisanej w dodatku 3, może być stosowana jako woda do badań. Powinna mieć stałą jakość w okresie trwania badania. Aby upewnić się, że woda rozcieńczająca nie będzie wpływała zbytnio na wyniki badania (np. wchodząc w reakcję z badaną substancją chemiczną) lub nie mała niekorzystnego wpływu na stado macierzyste, należy okresowo pobierać próbki wody do analizy. W przypadku gdy wiadomo, że woda rozcieńczająca ma względnie stałą jakość, należy mierzyć, np. co trzy miesiące, zawartość całkowitego węgla organicznego, przewodność właściwą, pH i zawiesinę ogólną. Pomiary pod kątem zawartości metali ciężkich (takich jak Cu, Pb, Zn, Hg, Cd i Ni), głównych anionów i kationów (np. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, SO42-) i pestycydów należy wykonać, jeżeli jakość wody budzi wątpliwości. Szczegóły dotyczące analizy chemicznej i pobierania wody można znaleźć w pkt 34.
Roztwory do badań
23. Jeżeli jest to praktycznie możliwe, należy zastosować system przepływowy. W przypadku badań przepływowych niezbędny jest system ciągłego dozowania i rozcieńczania roztworu podstawowego badanej substancji chemicznej (np. pompa dozująca, układ rozcieńczania proporcjonalnego, układ saturatora) do przesyłania szeregu stężeń do komór badawczych. Natężenia przepływów roztworów podstawowych i wody rozcieńczającej muszą być sprawdzane okresowo w trakcie badania i nie mogą różnić się w trakcie badania o więcej niż o 10 %. Za odpowiedni uznano natężenie przepływu równoważne co najmniej pięciu objętościom komory badawczej na 24 godziny (1). Należy starać się unikać stosowania rur z tworzywa sztucznego lub innych materiałów, które mogą zwierać aktywne biologicznie substancje chemiczne lub mogą adsorbować badaną substancję chemiczną.
24. Zaleca się przygotowanie roztworu podstawowego bez stosowania rozpuszczalników przez zwykłe wymieszanie lub zbełtanie badanej substancji chemicznej w wodzie rozcieńczającej w sposób mechaniczny (np. za pomocą mieszadła lub ultradźwięków). Jeżeli badana substancja chemiczna trudno rozpuszcza się w wodzie, należy postępować zgodnie z procedurami opisanymi w wytycznej OECD dotyczącej badania toksyczności wodnej trudnych substancji i mieszanin (Guidance Document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures) (36). Należy unikać stosowania rozpuszczalników, choć czasem może to być niezbędne w celu uzyskania odpowiednio stężonego roztworu podstawowego. Przykłady odpowiednich rozpuszczalników podano w (36).
25. Należy unikać półstatycznych warunków badania, jeżeli nie przedstawi się uzasadnienia opartego na przekonujących powodach związanych z badaną substancją chemiczną (np. stabilność, ograniczona dostępność, wysokie koszty lub zagrożenie). W odniesieniu do techniki półstatycznej można przyjąć dwie różne procedury wymiany. Nowe roztwory do badań są przygotowywane w czystych komorach, a komórki jajowe i larwy, które przeżyły, są ostrożnie przenoszone do nowych komór, albo organizmy użyte do badań są utrzymywane w komorach badawczych, a część (co najmniej dwie trzecie) wody badawczej jest codziennie zmieniana.
PROCEDURA
Warunki narażenia na działanie substancji
Pobieranie komórek jajowych i czas trwania
26. Aby uniknąć błędu genetycznego, komórki jajowe pobiera się od co najmniej trzech par lub grup hodowlanych, zmieszanych i wybranych losowo w celu rozpoczęcia badania. W przypadku ciernika zobacz opis sztucznego zapłodnienia w dodatku 11. Badanie powinno rozpocząć się jak najszybciej po zapłodnieniu komórek jajowych i nie później niż 12 godzin po zapłodnieniu, przy czym zarodki powinny zostać zanurzone w roztworach do badań przed rozpoczęciem stadium bruzdkowania tarczek zarodkowych. Badanie należy kontynuować do momentu zakończenia różnicowania płci w grupie kontrolnej (60 dni po wykluciu w przypadku ryżanki japońskiej, ciernika i danio pręgowanego).
Obciążenie
27. Liczba zapłodnionych komórek jajowych na początku badania powinna wynosić co najmniej 120 na stężenie i powinna być rozdzielona na co najmniej 4 kontrpróby (dopuszcza się pierwiastkowy przydział do próby kontrolnej). Komórki jajowe należy rozmieścić losowo (z wykorzystaniem tabel statystycznych do randomizacji) między zabiegami. Wskaźnik obciążenia (zob. definicja w dodatku 1) powinien być wystarczająco niski, aby można było utrzymać stężenie rozpuszczonego tlenu na poziomie co najmniej 60 % ASV bez bezpośredniego napowietrzania komór. W odniesieniu do badań przepływowych zaleca się stosowanie wskaźnika obciążenia nieprzekraczającego 0,5 g/l na 24 godziny i nieprzekraczającego w żadnym momencie 5 g/l roztworu. Nie później niż po 28 dniach od zapłodnienia należy ponownie rozdzielić liczbę ryb przypadającą na kontrpróbę, tak aby każda kontrpróba zawierała jak najbardziej zbliżoną liczbę ryb. W przypadku wystąpienia śmiertelności związanej z narażeniem należy odpowiednio zmniejszyć liczbę kontrprób, aby utrzymywać jak najbardziej zbliżone zagęszczenie ryb między poziomami zabiegowymi.
Światło i temperatura
28. Fotoperiod i temperatura wody muszą być odpowiednie dla badanego gatunku (zob. dodatek 2 dotyczący warunków doświadczalnych w odniesieniu do badania rozwoju płciowego ryb).
Karmienie
29. Pokarm i karmienie mają decydujące znaczenie, a podanie odpowiedniej karmy na każdym etapie w odpowiednich odstępach czasu i w ilości wystarczającej do utrzymania prawidłowego wzrostu ma zasadnicze znaczenie. Należy podawać pokarm bez ograniczeń przy jednoczesnym minimalizowaniu nadwyżek. Aby uzyskać wystarczające tempo wzrostu, ryby należy karmić co najmniej dwa razy dziennie (dopuszczając podawanie karmy raz dziennie w weekendy) w co najmniej trzygodzinnych odstępach czasu. Nadwyżkę pokarmu i ekskrementy należy usuwać, aby zapobiec akumulacji odpadów. Pokarm i schemat żywienia są stale udoskonalane w miarę zdobywania doświadczenia, aby poprawić przeżywalność i zoptymalizować wzrost. Należy zatem podjąć starania, aby proponowany schemat został potwierdzony przez uznanych ekspertów. Na 24 godziny przed zakończeniem badania należy zaprzestać podawania pokarmu. Przykłady odpowiednich rodzajów pokarmu wymieniono w dodatku 2 (zob. również wytyczną OECD dotyczącą badania ryb (Fish Testing Framework) (39)).
Badane stężenia
30. Rozkład stężeń badanych substancji chemicznych powinien być zgodny z opisem w dodatku 4. Należy zastosować co najmniej trzy badane stężenia w co najmniej czterech kontrpróbach. Przy wyborze zakresu badanych stężeń w badaniach toksyczności ostrej należy wziąć pod uwagę krzywą zależności średniego śmiertelnego stężenia LC50 od okresu narażenia. Jeżeli dane mają być wykorzystane do oceny ryzyka, zaleca się użycie pięciu badanych stężeń.
31. Stężenia substancji chemicznej wyższe niż 10 % LC50 dla osobników dorosłych lub 10 mg/l, w zależności od tego, która z tych wartości jest niższa, nie wymagają badania. Maksymalne badane stężenie powinno wynosić 10 % LC50 w larwalnym/młodocianym stadium życia.
Próby kontrolne
32. Oprócz badanych stężeń należy wykonać próbę kontrolną z wodą rozcieńczającą (≥ 4 kontrpróby) i, w stosownych przypadkach, próbę kontrolną z rozpuszczalnikiem (≥ 4 kontrpróby). W badaniu należy wykorzystywać wyłącznie rozpuszczalniki, co do których sprawdzono, że nie mają istotnie statystycznego wpływu na badane punkty końcowe.
33. W przypadkach gdy używa się rozpuszczalnika, jego końcowe stężenie nie powinno być większe niż 0,1 ml/l (36) i powinno być takie samo we wszystkich komorach badawczych, z wyjątkiem próby kontrolnej z wodą rozcieńczającą. Należy jednak dołożyć wszelkich starań, aby uniknąć użycia takich rozpuszczalników lub utrzymać stężenie rozpuszczalnika na minimalnym poziomie.
Częstotliwość oznaczeń i pomiarów analitycznych
34. Analizę chemiczną stężenia badanej substancji chemicznej należy przeprowadzić przed rozpoczęciem badania, aby sprawdzić zgodność z kryteriami akceptacji. Wszystkie kontrpróby należy analizować oddzielnie na początku i na końcu badania. W trakcie badania należy analizować jedną kontrpróbę na każde badane stężenie co najmniej raz na tydzień, zmieniając systematycznie kontrpróby (1,2,3,4,1,2....). Jeżeli próbki przechowuje się w celu późniejszej analizy, należy wcześniej zweryfikować metodę przechowywania. Próbki należy przefiltrować (np. przez filtr z porami o średnicy 0,45 µm) lub odwirować, aby mieć pewność, że oznaczenia substancji chemicznej zostaną wykonane w prawdziwym roztworze.
35. Podczas badania we wszystkich komorach badawczych należy mierzyć stężenie rozpuszczonego tlenu, pH, twardość ogólną, przewodność właściwą, zasolenie (w stosownych przypadkach) i temperaturę. Stężenie rozpuszczonego tlenu, zasolenie (w stosownych przypadkach) i temperaturę należy mierzyć co najmniej raz w tygodniu, a pH, przewodność właściwą i twardość wody na początku i na końcu badania. Zalecane jest stałe monitorowanie temperatury w co najmniej jednej komorze badawczej.
36. Zaleca się, aby wyniki oparte były na mierzonych stężeniach. Jeżeli jednak stężenie badanej substancji chemicznej w roztworze można bez problemów utrzymywać w zakresie ± 20 % nominalnego stężenia przez okres badania, wówczas wyniki mogą być oparte albo na wartościach nominalnych, albo na mierzonych.
Monitorowanie i pomiary
Stadium rozwoju zarodkowego
37. Narażenie powinno rozpocząć się jak najszybciej po zapłodnieniu i przed rozpoczęciem stadium bruzdkowania tarczek zarodkowych oraz nie później niż 12 godzin po zapłodnieniu, aby zapewnić narażenie w trakcie wczesnego rozwoju zarodkowego.
Wylęg i przeżywalność
38. Obserwacje wylęgania i przeżywalności należy prowadzić co najmniej raz dziennie, a liczby należy odnotowywać. Martwe zarodki, larwy i młode ryby należy usunąć bezzwłocznie po ich zauważeniu, ponieważ mogą szybko ulec rozkładowi i rozdrobnieniu w wyniku działań innych ryb. Należy zachować najwyższą ostrożność przy usuwaniu martwych osobników, aby nie uderzyć lub nie uszkodzić fizycznie sąsiednich komórek jajowych/larw, które są bardzo delikatne i wrażliwe. Kryteria dotyczące zgonu zmieniają się stosownie do stadium życia:
- w odniesieniu do komórek jajowych: szczególnie we wczesnych stadiach znacząca utrata przezroczystości i zmiana w zabarwieniu spowodowane przez koagulację lub strącania białek, powodujące, że komórki jajowe przybierają białą barwę i stają się mętne;
- w odniesieniu do larw i młodych ryb: bezruch, brak ruchu oddechowego, brak bicia serca lub białe matowe zabarwienie ośrodkowego układu nerwowego, lub brak reakcji na bodźce mechaniczne.
Nietypowy wygląd
39. Należy odnotować liczbę larw lub ryb charakteryzujących się nietypową budową ciała oraz opisać wygląd i naturę anomalii. Należy zauważyć, że występowanie nietypowych zarodków i larw jest naturalne i w próbach kontrolnych ich udział może wynosić kilka procent u niektórych gatunków. Nietypowe zwierzęta należy usunąć z komór badawczych dopiero po ich śmierci. Zgodnie jednak z dyrektywą Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych, jeżeli anomalie prowadzą do bólu, cierpienia, stresu lub trwałego uszkodzenia, a śmierć można w wiarygodny sposób przewidzieć, zwierzęta należy znieczulić i uśmiercić zgodnie z opisem w pkt 44 i traktować jako przypadki śmiertelne do celów analizy danych.
Nietypowe zachowanie
40. Należy odnotować anomalie, np. hiperwentylację, nieskoordynowane pływanie, nietypowy spokój i nietypowe zachowania podczas pobierania pokarmu, z chwilą ich pojawienia się.
Masa
41. Na koniec badania wszystkie pozostałe przy życiu ryby należy uśmiercić (znieczulić jeżeli konieczne jest pobranie próbek krwi) oraz zważyć mokrą masę poszczególnych ryb (osuszonych na bibule).
Długość
42. Na końcu badania należy zmierzyć długość poszczególnych ryb (standardową długość).
43. Obserwacje te skutkować będą zebraniem niektórych lub wszystkich następujących danych do sprawozdania:
- skumulowana śmiertelność;
- liczba zdrowych ryb pod koniec badania;
- moment rozpoczęcia wylęgu i jego zakończenia;
- długość i waga zwierząt, które przeżyły;
- liczba zdeformowanych larw;
- liczba ryb cechujących się nietypowym zachowaniem.
Pobieranie próbek ryb
44. Próbki ryb pobiera się jest w momencie zakończenia badania. Ryby, z których pobiera się próbki, należy uśmiercić za pomocą np. MS-222 (100-500 mg na litr zbuforowanego 200 mg NaHCO3 na litr) lub FA-100 (2-metoksy-4-allilofenol: eugenol) oraz zmierzyć i zważyć mokrą masę poszczególnych ryb (osuszonych na bibule), lub je znieczulić, jeżeli konieczne jest pobranie próbek krwi (zob. pkt 49).
Pobieranie próbek w celu przeprowadzenia badania VTG i określenia płci metodą oceny histologicznej
45. Należy pobrać próbki wszystkich ryb i przygotować je do badania VTG i określenia płci. Wszystkie ryby należy poddać badaniu histologicznemu w celu określenia płci. W przypadku pomiarów VTG akceptuje się pobranie podpróbek z co najmniej 16 ryb z każdej kontrpróby. Jeżeli wyniki uzyskane z podpróbek okażą się niejasne, należy zbadać więcej ryb pod kątem VTG.
46. Procedura pobierania próbek w celu określenia VTG i płci zależy od metody analizy VTG:
Metoda z wykorzystaniem homogenatu głowy/ogona w celu analizy VTG
47. Rybę uśmierca się. Głowę i ogon każdej z ryb oddziela się od tułowia przez nacięcia wykonane bezpośrednio za płetwami piersiowymi i bezpośrednio za płetwą grzbietową za pomocą skalpela (zob. rys. 1). Głowę i ogon każdej z ryb waży się razem, nadaje indywidualny numer, zamraża w ciekłym azocie i przechowuje w temperaturze - 70 °C lub niższej w celu przeprowadzenia badania VTG. Część tułowia ryby numeruje się i umieszcza w odpowiednim środku utrwalającym w celu przeprowadzenia oceny histologicznej (22). Dzięki wykorzystaniu tej metody badanie VTG i histopatologię przeprowadza się w odniesieniu do każdej ryby, a ewentualne zmiany poziomu VTG można w związku z tym odnieść do płci fenotypowej lub płci genetycznej ryby (np. w przypadku ryżanki japońskiej i ciernika). W celu uzyskania dodatkowych informacji należy zapoznać się z wytycznymi dotyczącymi homogenizacji (dodatek 5) i wytycznymi dotyczącymi oznaczania ilościowego VTG (dodatek 6).
Metoda z wykorzystaniem homogenatu wątroby w celu analizy VTG
48. Rybę uśmierca się. Wątrobę wycina się i przechowuje w temperaturze - 70 °C lub niższej. Procedury zalecane przy wycinaniu wątroby i jej wstępnej obróbce można znaleźć w wytycznej OECD nr 229 w sprawie badań (37) lub rozdziale C.37 niniejszego załącznika (38). Wątroby poddaje się następnie oddzielnie procesowi homogenizacji opisanemu w wytycznej OECD nr 229 w sprawie lub rozdziale C.37 niniejszego załącznika. Zgromadzony supernatant wykorzystuje się w celu pomiaru VTG za pomocą homologicznej metody ELISA (zob. dodatek 6 zawierający przykład oznaczania ilościowego w odniesieniu do danio pręgowanego lub wytyczna OECD nr 229 w sprawie badań (37) w odniesieniu do ryżanki japońskiej). W przypadku zastosowania tego podejścia można również uzyskać dane dotyczące zarówno poziomu VTG, jak i histologii gonad w odniesieniu do poszczególnych ryb.
Metoda z wykorzystaniem osocza krwi w celu analizy VTG
49. Krew pobiera się od znieczulonej ryby przez nakłucie serca, nacięcie żyły ogonowej lub ogona i odwirowuje w temperaturze 4 °C w celu zgromadzenia osocza. Do momentu wykorzystania osocze przechowuje się w temperaturze - 70 °C lub niższej. Rybę uśmierca się i umieszcza w substancji utrwalającej w celu przeprowadzenia histologii. Zarówno próbkom osocza, jak i rybom nadaje się indywidualne numery w celu odniesienia poziomów VTG do płci ryby.
Rysunek 1
Sposób cięcia ryby w celu pomiaru VTG w homogenacie głowy/ogona i w celu histologicznej oceny części środkowej.
Określanie płci genetycznej
50. Biologiczną próbkę służącą do określenia płci genetycznej pobiera się od pojedynczych osobników z gatunku posiadającego odpowiednie markery. W przypadku ryżanki japońskiej pobiera się płetwę odbytową lub płetwę grzbietową. Szczegółowy opis, obejmujący pobieranie próbek tkanek i określanie płci metodą PCR przedstawiono w dodatku 9. Również w przypadku ciernika opis pobierania próbek tkanek i określania płci metodą PCR przedstawiono w dodatku 10.
Pomiar VTG
51. Pomiar VTG należy wykonać metodą zweryfikowaną pod względem ilościowym i analitycznym. Informacje powinny być dostępne po wykonaniu wewnątrz- i międzylaboratoryjnego oznaczenia zmienności metody stosowanej w danym laboratorium. Przyczyną wewnątrz- i międzylaboratoryjnej zmienności są (najprawdopodobniej) różne stadia rozwojowe populacji ryb. Biorąc pod uwagę zmienność w pomiarze VTG, NOEC określone w oparciu o tylko ten punkt końcowy należy traktować z wielką ostrożnością. Dostępne są różne metody oceny wytwarzania VTG w przypadku gatunków ryb zastosowanych w tym badaniu. Metodą pomiaru, która jest zarówno stosunkowo czuła, jak i swoista, jest oznaczenie stężeń białka za pośrednictwem testu immunoenzymatycznego (ELISA). Należy wykorzystać homologiczne przeciwciała (wytworzone w reakcji na VTG tego samego gatunku) i najważniejsze homologiczne standardy.
Określania płci
52. W zależności od procedury pobierania próbek w celu określenia VTG całą rybę lub pozostałą środkowa część każdej z ryb umieszcza się w specjalnie wcześniej oznakowanej kasetce i utrwala w środku utrwalającym w celu histologicznego określenia płci (opcjonalnie również w celu określenia etapu rozwoju gonad). Wytyczne dotyczące utrwalania i zatapiania przedstawione zostały w dodatku 7 i w wytycznej OECD dotyczącej diagnozowania histopatologii gonad ryb związanej z układem hormonalnym (Guidance Document on the Diagnosis of Endocrine-Related Histopathology of Fish Gonads) (22). Po zakończeniu tej procedury ryby zatapia się w blokach parafinowym. Poszczególne osobniki należy umieścić wzdłużnie w bloku parafinowym. Od każdego osobnika pobiera się co najmniej sześć skrawków wzdłużnych (grubości 3-5 µm) w płaszczyźnie przedniej, w tym tkankę z obydwu gonad. Odstęp między skrawkami powinien wynosić około 50 µm w przypadku samców i 250 µm w przypadku samic. Ponieważ jednak każdy blok będzie często zawierał samce i samice (w przypadku gdy więcej osobników niż jeden zostało zatopione w każdym bloku) odstęp między skrawkami w tych blokach powinien wynosić około 50 μm aż do uzyskania co najmniej sześciu wycinków gonad od każdego samca. Następnie odstęp między skrawkami można zwiększyć do około 250 μm w przypadku samic. Skrawki barwi się z zastosowaniem hematoksyliny i eozyny oraz bada przy użyciu mikroskopu świetlnego, w szczególności pod kątem płci (żeńska, męska, interseksualna lub brak zróżnicowania). Płeć interseksualną definiuje się jako obecność więcej niż jednego oocytu w jądrach na sześć zbadanych skrawków lub komórki spermatogenezy (tak/nie) w jajnikach. Histopatologia gonad oraz określenie etapów rozwoju jajników i jąder są nieobowiązkowe, ale w przypadku poddania ich badaniu wyniki należy przeanalizować statystycznie i zamieścić w sprawozdaniu. Należy zauważyć, że u niektórych gatunków ryb naturalnym zjawiskiem jest brak w pełni rozwiniętej pary gonad i może występować tylko jedna gonada (np. w przypadku ryżanki japońskiej i niekiedy w przypadku danio pręgowanego). Należy odnotowywać wszystkie tego typu obserwacje.
53. Określenie płci genetycznej w przypadku poszczególnych osobników ryżanki japońskiej opiera się na występowaniu lub braku genu określającego płeć męską DMY ryżanki, który jest zlokalizowany w chromosomie Y. Genetyczną płeć ryżanki można określić przez sekwencjonowanie genu DMY z DNA ekstrahowanego na przykład z kawałka płetwy odbytowej lub płetwy grzbietowej. Obecność DMY wskazuje na osobnika XY (samca) niezależnie od fenotypu, natomiast brak DMY wskazuje na osobnika XX (samicę) niezależnie od fenotypu (23). Wytyczne dotyczące preparowania tkanki i metody PCR przedstawiono w dodatku 9. Określanie płci genetycznej u poszczególnych osobników ciernika również wykonuje się z wykorzystaniem metody PCR opisanej w dodatku 10.
54. W sprawozdaniu należy podać występowanie osobników interseksualnych (zob. definicja w dodatku 1).
Drugorzędne cechy płciowe
55. U gatunków takich jak ryżanka japońska drugorzędne cechy płciowe są kontrolowane przez układ hormonalny, w związku z tym obserwacje fizycznego wyglądu ryb powinny, o ile to możliwe, zostać przeprowadzone pod koniec narażenia. W przypadku ryżanki japońskiej wykształcenie się brodawkowej zmiany na tylnej części płetwy odbytowej u samic jest spowodowane reakcją na androgeny. W rozdziale C.37 niniejszego załącznika (38) zamieszczone zostały odpowiednie zdjęcia drugorzędnych cech płciowych samców i androgenicznych samic.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Opracowanie wyników
56. Ważne jest, aby punkt końcowy został określony przez ważny test statystyczny o największej mocy. Jednostkę eksperymentalną stanowi kontrpróba, ale w teście statystycznym uwzględnić należy zmienność między kontrpróbami. Blokowy schemat decyzyjny przedstawiony w dodatku 8 ma pomóc w zastosowaniu najodpowiedniejszego testu statystycznego na podstawie charakterystyki danych uzyskanych w badaniu. Statystyczny poziom istotności wynosi 0,05 w odniesieniu do wszystkich punktów końcowych.
Proporcje płci i płeć genetyczna
57. Proporcje płci należy przeanalizować pod kątem istotnego wpływu (podejście NOEC/LOEC) spowodowanego narażeniem za pomocą testu Jonckheere'a-Terpstry (test trendu), jeżeli istnieje monotoniczna zależność dawka-odpowiedź. Jeżeli stwierdzony zostanie brak monotoniczności, wówczas należy zastosować badanie porównań par. Jeżeli można uzyskać normalność rozkładu zmiennych i jednorodną wariancję, wykorzystuje się badanie Dunnetta. Jeżeli występuje niejednorodna wariancja, stosuje się test Tamhane'a-Dunnetta. W przeciwnym razie wykorzystuje się test Manna-Whitney'a skorygowany metodą Bonferroniego-Holma. Schemat blokowy przedstawiający statystykę proporcji płci znajduje się w dodatku 8. Proporcje płci należy przedstawić w tabelach jako proporcje stężenia ± SD (odchylenie standardowe) w odniesieniu do płci męskiej, żeńskiej, interseksualnej i niezróżnicowanej. Należy podkreślić poziom istotności. Przykłady można znaleźć w sprawozdaniu z weryfikacji badania rozwoju płciowego ryb fazy 2 (42). Płeć genetyczną należy podać jako odsetek odwróconej płci fenotypowej w odniesieniu do płci męskiej, żeńskiej, interseksualnej i niezróżnicowanej.
Stężenia VTG
58. Stężenia VTG należy przeanalizować pod kątem istotnego wpływu wywołanego narażaniem (podejście NOEC/ LOEC). Lepiej jest zastosować test Dunnetta niż test t-Studenta z korektą Bonferroniego. W przypadku zastosowania korekty Bonferroniego zaleca się zastosowanie korekty metodą Bonferroniego-Holma. Należy uwzględnić przekształcenie logarytmiczne VTG w celu uzyskania normalności rozkładu zmiennych i jednorodności wariancji. Następnie, jeżeli zależność stężenie-odpowiedź jest stała i monotoniczna, lepiej jest zastosować test Jonckheere'a-Terpstry niż którykolwiek powyższych. Jeżeli zastosowano testy t-Studenta lub test Dunnetta, nie ma potrzeby stosowania analizy wariancji F w dalszym postępowaniu. Szczegóły opisano w schemacie znajdującym się w dodatku 8. Wyniki należy przedstawić w tabelach jako średnie stężenia ± SD (odchylenie standardowe) oddzielnie dla płci męskiej, żeńskiej, interseksualnej i niezróżnicowanej. Należy podkreślić poziom istotności w przypadku fenotypowych samic i fenotypowych samców. Przykłady można znaleźć w sprawozdaniu z weryfikacji badania rozwoju płciowego ryb fazy 2 (42).
Badana substancja chemiczna: stężenia rzeczywiste
59. Rzeczywiste stężenia badanej substancji chemicznej w komorach należy analizować z częstotliwościami opisanymi w pkt 34. Wyniki należy przedstawić w tabelach jako średnie stężenia ± SD (odchylenie standardowe) w odniesieniu do kontrprób, jak również w odniesieniu do stężeń z informacją dotyczącą liczby próbek i podkreśleniem wartości oddalonych od średniego stężenia zabiegu o ± 20 %. Przykłady można znaleźć w sprawozdaniu z weryfikacji badania rozwoju płciowego ryb fazy 2 (42).
Interpretacja wyników
60. Wyniki badania należy ostrożnie interpretować w przypadku, gdy mierzone stężenia badanej substancji chemicznej w roztworach do badań oscylują na poziomie granicy wykrywalności metody analitycznej.
Sprawozdanie z badania
61. Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:
Badana substancja chemiczna
- istotne właściwości fizykochemiczne; dane dotyczące tożsamości chemicznej, w tym czystości i metody analitycznej oznaczania ilościowego badanej substancji chemicznej.
Warunki badania
- zastosowana procedura badawcza (np. przepływowa, badanie półstatyczne/wymiana); projekt badania obejmujący badane stężenia, metodę przygotowywania roztworów podstawowych (w załączniku), częstotliwość wymiany (jeżeli został zastosowany środek rozpuszczający, należy podać jego stężenie);
- badane stężenia nominalne, średnie mierzonych wartości oraz ich odchylenia standardowe w komorach badawczych, a także metoda uzyskania takich wartości (zastosowaną metodę analityczną należy przedstawić w załączniku); dowody świadczące o tym, że pomiary odnoszą się do stężeń badanej substancji chemicznej w prawdziwym roztworze;
- jakość wody w komorach badawczych: pH, twardość, temperatura i stężenie rozpuszczonego tlenu;
- szczegółowe informacje dotyczące karmienia (np. rodzaj pokarmu, źródło, podana ilość i częstotliwość podawania oraz, w stosownych przypadkach, analiza pod kątem zanieczyszczeń (np. PCB, WWA oraz całkowita zawartość pestycydów chloroorganicznych)).
Wyniki
- dowody świadczące o tym, że próby kontrolne spełniają kryteria ważności: dane dotyczące wskaźnika wylęgu należy przedstawić w tabelach jako odsetek na kontrpróbę i na stężenie. Należy podkreślić wartości oddalone od kryteriów akceptacji (w próbach kontrolnych). Informacje dotyczące przeżywalności należy przedstawić jako odsetek przypadający na kontrpróbę i na stężenie. Należy podkreślić wartości oddalone od kryteriów ważności (w próbach kontrolnych);
- Jasno sformułowane informacje dotyczące wyników uzyskanych w odniesieniu do różnych zaobserwowanych punktów końcowych: przeżycie zarodków i skuteczny wylęg, anomalie w wyglądzie zewnętrznym, długość i masa, pomiary VTG (ng/g homogenatu, ng/ml osocza lub ng/mg wątroby), histologia gonad, proporcja płci, dane dotyczące płci genetycznej, przypadki wszystkich nietypowych reakcji ryb i wszystkie widoczne efekty spowodowane przez badaną substancję chemiczną.
62. Wyniki należy przedstawić jako średnie wartości ± odchylenie standardowe (SD) lub błąd standardowy (SE). Jako dane statystyczne należy podać co najmniej NOEC i LOEC oraz przedziały ufności. Należy postępować według statystycznego schematu blokowego (dodatek 8).
BIBLIOGRAFIA
(1) OECD (1992), Fish, Early Life Stage Toxicity Test, wytyczna nr 210 w sprawie badań, Wytyczne dotyczące badania substancji chemicznych, OECD, Paryż.
(2) Jobling, S., D. Sheahan, J.A. Osborne, P. Matthiessen i J.P. Sumpter, 1996, "Inhibition of testicular growth in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to estrogenic alkylphenolic chemicals", Environmental Toxicology and Chemistry 15, s. 194-202.
(3) Sumpter, J.P. i S. Jobling, 1995, Vitellogenesis As A Biomarker for Estrogenic Contamination of the Aquatic Environment, Environmental Health Perspectives 103, s. 173-178.
(4) Tyler, C.R., R.van Aerle, T.H. Hutchinson, S. Maddix i H. Trip (1999), "An in vivo testing system for endocrine disruptors in fish early life stages using induction of vitellogenin", Environmental Toxicology and Chemistry 18, s. 337-347.
(5) Holbech, H., L. Andersen, G.I. Petersen, B. Korsgaard, K.L. Pedersen i P. Bjerregaard (2001a), "Development of an ELISA for vitellogenin in whole body homogenate of zebrafish (Danio rerio)", Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 130, s. 119-131.
(6) Andersen, L., P. Bjerregaard i B. Korsgaard (2003), Vitellogenin induction and brain aromatase activity in adult male and female zebrafish exposed to endocrine disrupters, Fish Physiology and Biochemistry 28, s. 319-321.
(7) Orn, S., H. Holbech, T.H. Madsen, L. Norrgren i G.I. Petersen (2003), "Gonad development and vitellogenin production in zebrafish (Danio rerio) exposed to ethinylestradiol and methyltestosterone", Aquatic Toxicology 65, s. 397-411.
(8) Panter, G.H., T.H. Hutchinson, R. Lange, C.M. Lye, J.P. Sumpter, M. Zerulla, i C.R. Tyler (2002), "Utility of a juvenile fathead minnow screening assay for detecting (anti-)estrogenic substances", Environmental Toxicology and Chemistry 21, s. 319-326.
(9) Sun, L.W., J.M. Zha, P.A. Spear, i Z.J. Wang (2007), "Toxicity of the aromatase inhibitor letrozole to Japanese medaka (Oryzias latipes) eggs, larvae and breeding adults", Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, s. 533-541.
(10) Parks, L.G., A.O. Cheek, N.D. Denslow, S.A. Heppell, J.A. McLachlan, G.A. LeBlanc, and C.V.Sullivan (1999), "Fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin: purification, characterization and quantitative immunoassay for the detection of estrogenic compounds", Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 123, s. 113-125.
(11) Brion, F., B.M. Nilsen, J.K. Eidem, A. Goksoyr i J.M. Porcher (2002), Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure vitellogenin in the zebrafish (Danio rerio), Environmental Toxicology and Chemistry 21, s. 1 699-1 708.
(12) Nishi, K., M. Chikae, Y. Hatano, H. Mizukami, M. Yamashita, R. Sakakibara i E. Tamiya (2002), "Development and application of a monoclonal antibody-based sandwich ELISA for quantification of Japanese medaka (Oryzias latipes) vitellogenin", Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 132, s. 161-169.
(13) Hahlbeck, E., I. Katsiadaki, I. Mayer, M. Adolfsson-Erici, J. James i B.E. Bengtsson (2004), "The juvenile three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus L.) as a model organism for endocrine disruption - II - kidney hypertrophy, vitellogenin and spiggin induction", Aquatic Toxicology 70, s. 311-326.
(14) Tatarazako, N., M. Koshio, H. Hori, M. Morita i T. Iguchi (2004), Validation of an enzyme-linked immuno-sorbent assay method for vitellogenin in the medaka, Journal of Health Science 50, s. 301-308.
(15) Eidem, J.K., H. Kleivdal, K. Kroll, N. Denslow, R. van Aerle, C. Tyler, G. Panter, T. Hutchinson i A. Goksoyr (2006), "Development and validation of a direct homologous quantitative sandwich ELISA for fathead minnow (Pimephales promelas) vitellogenin. Aquatic Toxicology", 78, s. 202-206.
(16) Jensen, K.M. i G.T. Ankley (2006), "Evaluation of a commercial kit for measuring vitellogenin in the fathead minnow (Pimephales promelas)", Ecotoxicology and Environmental Safety 64, s. 101-105.
(17) Holbech, H., Petersen, G. I., Norman, A., Örn, S, Norrgren, L. i Bjerregaard, P (2001b), "Suitability of zebrafish as test organism for detection of endocrine disrupting chemicals. Comparison of vitellogenin in plasma and whole body homogenate from zebrafish (Danio rerio) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)", Nordic Council of Ministers, TemaNord 2001:597, s. 48-51.
(18) Nilsen, B.M., K. Berg, J.K. Eidem, S.I. Kristiansen, F. Brion, J.M. Porcher i A. Goksoyr (2004), "Development of quantitative vitellogenin-ELISAs for fish test species used in endocrine disruptor screening", Analytical and Bioanalytical Chemistry 378, s. 621-633.
(19) Orn, S., S. Yamani i L. Norrgren (2006), Comparison of vitellogenin induction, sex ratio, and gonad morphology between zebrafish and Japanese medaka after exposure to 17 alpha-ethinylestradiol and 17 beta-trenbolone, Archives of Environmental Contamination and Toxicology 51, s. 237-243.
(20) Scholz, S. i N. Kluver (2009), Effects of Endocrine Disrupters on Sexual, Gonadal Development in Fish, Sexual Development 3, s. 136-151.
(21) Fenske, M., G. Maack, C. Schafers i H. Segner (2005), An environmentally relevant concentration of estrogen induces arrest of male gonad development in zebrafish, Danio rerio, Environmental Toxicology and Chemistry 24, s. 1 088-1 098.
(22) OECD (2010), Guidance Document on the Diagnosis of Endocrine-related Histopathology in Fish Gonads, Seria dotycząca badań i oceny, nr 123, ENV/JM/MONO(2010)14, OECD, Paryż.
(23) Kobayashi, T., M. Matsuda, H. Kajiura-Kobayashi, A. Suzuki, N. Saito, M. Nakamoto, N. Shibata i Y. Nagahama (2004), "Two DM domain genes, DMY and DMRT1, involved in testicular differentiation and development in the medaka, Oryzias latipes", Developmental Dynamics 231, s. 518-526.
(24) Shinomiya, A., H. Otake, K. Togashi, S. Hamaguchi i M. Sakaizumi (2004), "Field survey of sex-reversals in the medaka, Oryzias latipes: genotypic sexing of wild populations", Zoological Science 21, s. 613-619.
(25) Kidd, K.A., P.J. Blanchfield, K.H. Mills, V.P. Palace, R.E. Evans, J.M. Lazorchak, i R.W. Flick (2007), "Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, s. 8897-8901.
(26) Palace,V.P., R.E. Evans, K.G. Wautier, K.H. Mills, P.J. Blanchfield, B.J. Park, C.L. Baron, i K.A. Kidd (2009), "Interspecies differences in biochemical, histopathological, and population responses in four wild fish species exposed to ethynylestradiol added to a whole lake", Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 66, s. 1920-1935.
(27) Panter, G.H., T.H. Hutchinson, K.S. Hurd, J. Bamforth, R.D. Stanley, S. Duffell, A. Hargreaves, S. Gimeno, i C.R. Tyler (2006), "Development of chronic tests for endocrine active chemicals - Part 1. An extended fish early-life stage test for oestrogenic active chemicals in the fathead minnow (Pimephales promelas)", Aquatic Toxicology 77, s. 279-290.
(28) Holbech, H., K. Kinnberg, G.I. Petersen, P. Jackson, K. Hylland, L. Norrgren i P. Bjerregaard (2006), "Detection of endocrine disrupters: Evaluation of a Fish Sexual Development Test (FSDT)", Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 144, s. 57-66.
(29) Andersen, L., K. Kinnberg, H. Holbech, B. Korsgaard i P. Bjerregaard (2004), Evaluation of a 40 day assay for testing endocrine disrupters: Effects of an anti-estrogen and an aromatase inhibitor on sex ratio and vitellogenin concentrations in juvenile zebrafish (Danio rerio), Fish Physiology and Biochemistry 30, s. 257-266.
(30) Morthorst, J.E., H. Holbech i P. Bjerregaard (2010), Trenbolone causes irreversible masculinization of zebrafish at environmentally relevant concentrations, Aquatic Toxicology 98, s. 336-343.
(31) Kiparissis,Y., T.L. Metcalfe, G.C. Balch i C.D. Metcalf (2003), "Effects of the antiandrogens, vinclozolin and cyproterone acetate on gonadal development in the Japanese medaka (Oryzias latipes)", Aquatic Toxicology 63, s. 391-403.
(32) Panter, G.H., T.H. Hutchinson, K.S. Hurd, A. Sherren, R.D. Stanley, i C.R. Tyler (2004), "Successful detection of (anti-) androgenic and aromatase inhibitors in pre-spawning adult fathead minnows (Pimephales promelas) using easily measured endpoints of sexual development", Aquatic Toxicology 70, s. 11-21.
(33) Kinnberg, K., H. Holbech, G.I. Petersen iP. Bjerregaard (2007), "Effects of the fungicide prochloraz on the sexual development of zebrafish (Danio rerio)", Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology 145, s 165-170.
(34) Rozdział C.14 niniejszego załącznika, Badanie wzrostu młodych ryb.
(35) Rozdział C.4 niniejszego załącznika, Szybka biodegradowalność.
(36) OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Seria dotycząca badań i oceny, nr 23, OECD, Paryż.
(37) OECD (2009), Fish Short Term Reproduction Assay, wytyczna nr 229 w sprawie badań, Wytyczne dotyczące badania substancji chemicznych, OECD, Paryż.
(38) Rozdział C.37 niniejszego załącznika, 21-dniowe badanie ryb: krótkoterminowa analiza przesiewowa aktywności estrogennej i androgennej oraz zahamowania aktywności aromatazy.
(39) OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Seria dotycząca badań i oceny, nr 171, OECD, Paryż.
(40) Schäfers, C., Teigeler, M., Wenzel, A., Maack, G., Fenske, M., Segner, H (2007), "Concentration- and time-dependent effects of the synthetic estrogen, 17 alpha-ethinylestradiol, on reproductive capabilities of the zebrafish, Danio rerio", Journal of Toxicology and Environmental Health-Part A, 70, 9-10, s. 768-779.
(41) OECD (2011), Validation Report (Phase 1) for the Fish Sexual Development Test, Seria dotycząca badań i oceny, nr 141, ENV/JM/MONO(2011)22, OECD, Paryż.
(42) OECD (2011), Validation Report (Phase 2) for the Fish Sexual Development Test, Seria dotycząca badań i oceny, nr 142, ENV/JM/MONO(2011)23, OECD, Paryż.
(43) OECD (2011), Peer Review Report of the validation of the Fish Sexual Development Test, Seria dotycząca badań i oceny, nr 143, ENV/JM/MONO(2011)24, OECD, Paryż.
(44) Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych. Dz.U. L 276 z 20.10.2010, s. 33.
Dodatek 1
Skróty i definicje
Szczytowy punkt końcowy: mający wpływ na poziomie populacji
ASV: wartość nasycenia powietrzem
Biomarker: mający wpływ na poziomie indywidualnym
Substancja chemiczna: oznacza substancję lub mieszaninę.
Dph: dni po wylęgu
DMY: gen Y domenny DM konieczny do rozwoju samców ryżanki japońskiej
ELISA: test immunoenzymatyczny
Masa ryb: mokra masa ryb (osuszonych na bibule)
FSDT: Badanie rozwoju płciowego ryb
Oś podwzgórze-przysadka-nadnercza: oś podwzgórze-przysadka-nadnercza
Ryba interseksualna: ryba posiadająca więcej niż jeden oocyt w jądrach na sześć zbadanych skrawków lub komórki spermatogeniczne w jajnikach (tak/nie)
Wskaźnik obciążenia: mokra masa ryb na objętość wody
MOA: charakter działania
RT-PCR: odwrotna transkrypcja z łańcuchową reakcją polimerazową
Badana substancja chemiczna: oznacza dowolną substancję lub mieszaninę badaną za pomocą opisywanej metody badawczej
Ryba niezróżnicowana: ryba z gonadami bez widocznych komórek zarodkowych
VTG: witellogenina
Dodatek 2
Warunki badania rozwoju płciowego ryb (gatunki słodkowodne)
| 1. Zalecane gatunki | Ryżanka japońska (Oryzias latipes) | Danio pręgowany (Danio re-rio) | Ciernik (Gasterostreus aculeatus) |
| 2. Rodzaj badania | Przepływowe lub półsta-tyczne | Przepływowe lub półsta-tyczne | Przepływowe lub półstatyczne |
| 3. Temperatura wody | 25 ± 2 °C | 27 ± 2 °C | 20 ± 2 °C |
| 4. Jakość oświetlenia | Fluorescencyjne żarówki (szerokie spektrum) | Fluorescencyjne żarówki (szerokie spektrum) | Fluorescencyjne żarówki (szerokie spektrum) |
| 5. Natężenie światła | 10-20 µE/m2/s, 540-1 080 luksów lub 50-100 ft-c (poziomy w laboratoryjnych warunkach otoczenia) | 10-20 µE/m2/s, 540-1 080 luksów lub 50-100 ft-c (poziomy w laboratoryjnych warunkach otoczenia) | 10-20 µE/m2/s, 540-1 080 luksów lub 50-100 ft-c (poziomy w laboratoryjnych warunkach otoczenia) |
| 6. Fotoperiod | 12-16 godzin światła, 8-12 godzin ciemności | 12-16 godzin światła, 8-12 godzin ciemności | 16 godzin światła, 8 godzin ciemności |
| 7. Minimalna wielkość komór | Pojedyncza komora powinna zawierać minimum 7 l wody | Pojedyncza komora powinna zawierać minimum 7 l wody | Pojedyncza komora powinna zawierać minimum 7 l wody |
| 8. Liczba wymian objętości roztworów do badań | Minimum 5 razy dziennie | Minimum 5 razy dziennie | Minimum 5 razy dziennie |
| 9. Wiek organizmów użytych do badania w momencie rozpoczęcia narażenia | Świeżo zapłodnione komórki jajowe (wczesne stadium blastuli) | Świeżo zapłodnione komórki jajowe (wczesne stadium blastuli) | Świeżo zapłodnione komórki jajowe (wczesne stadium blas-tuli) |
| 10. Liczba komórek jajowych na zabieg | Minimum 120 | Minimum 120 | Minimum 120 |
| 11. Liczba zabiegów | Co najmniej 3 (oraz odpowiednie próby kontrolne) | Co najmniej 3 (oraz odpowiednie próby kontrolne) | Co najmniej 3 (oraz odpowiednie próby kontrolne) |
| 12. Liczba kontrprób na zabieg | Co najmniej 4 (chyba że akceptuje się pierwiastkowy przydział do prób kontrolnych) | Co najmniej 4 (chyba że akceptuje się pierwiastkowy przydział do prób kontrolnych) | Co najmniej 4 (chyba że akceptuje się pierwiastkowy przydział do prób kontrolnych) |
| 13. Schemat żywienia | Żywe Artemia, zamrożone dorosłe solowce, pokarm w płatkach itd. Zaleca się karmienie dwa razy dziennie | Specjalny pokarm dla narybku, żywe Artemia, zamrożone dorosłe solowce, pokarm w płatkach itd. Zaleca się karmienie dwa razy dziennie | Żywe Artemia, zamrożone dorosłe solowce, pokarm w płatkach itd. Zaleca się karmienie dwa razy dziennie |
| 14. Napowietrzanie | Bez napowietrzania dopóki stężenie rozpuszczonego tlenu nie spadnie poniżej 60 % nasycenia | Bez napowietrzania dopóki stężenie rozpuszczonego tlenu nie spadnie poniżej 60 % nasycenia | Bez napowietrzania dopóki stężenie rozpuszczonego tlenu nie spadnie poniżej 70 % nasycenia |
| 15. Woda rozcieńczająca | Czysta woda powierzchniowa, woda ze studni lub woda regenerowana | Czysta woda powierzchniowa, woda ze studni lub woda regenerowana | Czysta woda powierzchniowa, woda ze studni lub woda regenerowana |
| 16. Czas trwania narażenia na badaną substancję chemiczną | 60 dni po wylęgu | 60 dni po wylęgu | 60 dni po wylęgu |
| 17. Biologiczne punkty końcowe | Pozytywny wynik wylęgu, morfologia makroskopowa po przeżyciu, VTG histologia gonad, płeć genetyczna Proporcja płci | Pozytywny wynik wylęgu, przeżywalność Morfologia makroskopowa, VTG histologia gonad, proporcja płci | Pozytywny wynik wylęgu, przeżywalność Morfologia makroskopowa, VTG histologia gonad, proporcja płci |
| 18. Kryteria dopuszczalności badania dla połączonych kontrprób prób kontrolnych | Pozytywny wynik wylęgu > 80 % | Pozytywny wynik wylęgu > 80 % | Pozytywny wynik wylęgu > 80 % |
| Przeżywalność po wylęgu ≥ 70 % | Przeżywalność po wylęgu ≥ 70 % | Przeżywalność po wylęgu ≥ 70 % | |
| Wzrost (mokra masa ryb osuszonych na bibule) > 150 mg | Wzrost (mokra masa ryb osuszonych na bibule) >75 mg | Wzrost (mokra masa ryb osuszonych na bibule) > 120 mg | |
| Długość (długość standardowa) > 20 mm | Długość (długość standardowa) > 14 mm | Długość (długość standardowa) > 20 mm | |
| Proporcja płci (% samców i samic) 30-70 % | Proporcja płci (% samców lub samic) 30-70 % | Proporcja płci (% samców lub samic) 30-70 % |
Dodatek 3
Właściwości chemiczne akceptowalnej wody rozcieńczającej
| SKŁADNIK | STĘŻENIE |
| Cząstki stałe | < 20 mg/l |
| Całkowity węgiel organiczny | < 2 mg/l |
| Niezjonizowany amoniak | < 1 mg/l |
| Chlor resztkowy | < 10 mg/l |
| Pestycydy fosforoorganiczne ogółem | < 50 ng/l |
| Pestycydy chloroorganiczne ogółem plus polichlorowane bifenyle | < 50 ng/l |
| Całkowity chlor organiczny | < 25 ng/l |
Dodatek 4
Na podstawie metody badawczej c.14 /wytyczne dotyczące badanych stężeń
| Kolumna (liczba stężeń między 100 i 10 lub między 10 i 1) (*) |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| 32 | 46 | 56 | 63 | 68 | 72 | 75 |
| 10 | 22 | 32 | 40 | 46 | 52 | 56 |
| 3,2 | 10 | 18 | 25 | 32 | 37 | 42 |
| 1,0 | 4,6 | 10 | 16 | 22 | 27 | 32 |
| 2,2 | 5,6 | 10 | 15 | 19 | 24 | |
| 1,0 | 3,2 | 6,3 | 10 | 14 | 18 | |
| 1,8 | 4,0 | 6,8 | 10 | 13 | ||
| 1,0 | 2,5 | 4,6 | 7,2 | 10 | ||
| 1,6 | 3,2 | 5,2 | 7,5 | |||
| 1,0 | 2,2 | 3,7 | 5,6 | |||
| 1,5 | 2,7 | 4,2 | ||||
| 1,0 | 1,9 | 3,2 | ||||
| 1,4 | 2,4 | |||||
| 1,0 | 1,8 | |||||
| 1,3 | ||||||
| 1,0 |
| (*) Z kolumny można wybrać serię trzech (lub więcej) kolejnych stężeń. Średnie wartości między stężeniami w kolumnie (x) zostały podane w kolumnie (2x + 1). Poszczególne wartości przedstawiają stężenia wyrażone jako ułamek objętościowy lub ułamek masowy (mg/l lub μg/l). Wartości mogą być zwielokrotniane lub dzielone przez każdą potęgę liczby 10, stosownie do okoliczności. Kolumnę 1 można zastosować, jeśli istniała znaczna niepewność dotycząca poziomu toksyczności. |
Dodatek 5
Wytyczne dotyczące homogenizacji głowy i ogona młodych osobników danio pręgowanego, Pimephales promelas, ciernika i ryżanki japońskiej
Celem niniejszej części jest opisanie procedur poprzedzających ilościowe oznaczenie stężenia VTG. Można stosować inne procedury, których wynikiem jest porównywalne oznaczanie ilościowe VTG. Istnieje możliwość określenia stężenia VTG w osoczu krwi lub wątrobie zamiast w homogenacie głowy/ogona.
Procedura
1. Ryby znieczula się i uśmierca zgodnie z opisem badania.
2. Głowę i ogon ryb odcina się zgodnie z opisem badania. Uwaga: przyrządy do przeprowadzania sekcji i deskę do krojenia należy wypłukać i odpowiednio wyczyścić (np. za pomocą 96 % etanolu) przed obróbką każdej pojedynczej ryby w celu uniknięcia przeniesienia "zanieczyszczenia VTG" z samic lub samców, u których VTG występuje, na samce, które jej nie posiadają.
3. Łączną masę głowy i ogona każdej z ryb mierzy się z dokładnością do pełnego miligrama.
4. Po zważeniu tych części umieszcza się je w odpowiednich probówkach (np. probówkach Eppendorfa o pojemności 1,5 ml) i zamraża w temperaturze - 80 °C do czasu homogenizacji lub bezpośrednio poddaje homogenizacji z lodem za pomocą dwóch tłuczków z tworzywa sztucznego. (Zastosować można również inne metody, pod warunkiem że stosując je, używa się lodu i można uzyskać jednorodną masę). Uwaga: probówki należy odpowiednio ponumerować, tak by głowa i ogon danej ryby mogły zostać przypisane do odpowiadających im części ciała wykorzystywanych do histologii gonad.
5. Po uzyskaniu homogenicznej masy dodaje się 4-10-krotność wagi tkanki lodowatego roztworu buforowego do homogenizacji (*) (zwrócić uwagę na rozcieńczenie). Mieszaninę należy dalej rozdrabniać za pomocą tłuczków dopóki nie stanie się jednorodna. Ważna uwaga: do każdej ryby wykorzystuje się nowe tłuczki.
6. Próbki umieszcza się z lodem aż do odwirowania w temp. 4 °C przy 50 000 g przez 30 min.
7. Użyć pipety do wprowadzenia porcji supernatantu o objętości 20-50 µl (zwrócić uwagę na ilość) do co najmniej dwóch probówek przez zanurzenie końcówki pipety pod znajdującą się na wierzchu warstwę tłuszczu i ostrożne zassanie supernatantu bez fragmentów tłuszczu lub grudek.
8. Do momentu wykorzystania probówki przechowuje się w temperaturze - 80 °C.
(*) Roztwór buforowy do homogenizacji:
50 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 % koktajlu inhibitorów proteaz (Sigma): 12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 µl koktajlu inhibitorów proteaz (lub odpowiednika koktajli inhibitorów proteaz).
TRIS: TRIS-ULTRA PURE (ICN)
Koktajl inhibitorów proteaz: firmy Sigma (w przypadku tkanki ssaków), numer produktu P 8340.
Uwaga: roztwór buforowy do homogenizacji należy wykorzystać w tym samym dniu, w którym został sporządzony. Podczas stosowania należy umieścić go w lodzie.
Dodatek 6
Wytyczne dotyczące oznaczania ilościowego witellogeniny w homogenacie głowy i ogona w odniesieniu do danio pręgowanego (Danio rerio) (METODA Holbecha i in., 2001, zmodyfikowana). można wykorzystać inne procedury z zastosowaniem homologicznych przeciwciał i standardów
1. Mikropłytki do miareczkowania (certyfikowane płytki Maxisorp F96, Nunc, Roskilde, Dania) powlekane wcześniej 5 μg/ml przeciwciał IgG przeciw lipowitelinie danio pręgowanego płucze się i czyści trzy razy za pomocą roztworu buforowego do przemywania (*).
2. Standardowa ilość oczyszczonej witellogeniny pochodzącej od danio pręgowanego 17 rozcieńcza się seriami po 0,2, 0,5, 1, 5, 10 i 20 20 ng/ml w roztworze buforowym do rozcieńczania (**), a próbki rozcieńcza się co najmniej 200 razy (aby nie dopuścić do efektu matrycy) w roztworze buforowym do rozcieńczania i nakłada na płytki. Stosuje się podwójną próbę kontrolną. W każdym dołku umieszcza się 150 μl. Stosuje się podwójne wzorce i potrójne próbki. Próbki inkubuje się przez całą noc w temperaturze 4 °C w wytrząsarce.
3. Płytki przemywa się pięć razy roztworem buforowym do przemywania (*).
4. HRP dołączona do łańcucha dekstranu (np. AMDEX A/S, Dania) i sprzężone przeciwciała rozcieńczane są w roztworze buforowym do przemywania; rzeczywisty stopień rozcieńczenia różni się w zależności od partii i wieku. W każdym dołku umieszcza się 150 μl i płytki inkubuje się przez godzinę w temperaturze pokojowej w wytrząsarce.
5. Płytki przemywa się pięć razy roztworem buforowym do przemywania (*), a dno płytek ostrożnie czyści się etanolem.
6. W każdym dołku umieszcza się 150 μl TMB plus (***). Należy chronić płytkę przed światłem za pomocą folii aluminiowej i obserwować zmianę koloru w wytrząsarce.
7. Po uzyskaniu pełnej krzywej wzorcowej działanie enzymów zatrzymuje się przez dodanie do każdego dołka 150 μl 0,2 M H2SO4.
8. Absorbancję mierzy się przy 450 nm (np. na czytniku płytek Molecular Devices Thermomax). Dane analizuje się za pomocą zintegrowanego oprogramowania (np. Softmax).
(*) Roztwór buforowy do przemywania:
roztwór podstawowy chlorku 500,0 ml
sodu buforowanego fosforanami (****)
Roztwór wzorcowy albuminy 5,0 g
surowicy bydlęcej (BSA)
Tween 20 5,0 ml
Należy wyregulować pH do 7,3 i dopełnić do 5 l H2O oczyszczoną w systemie Millipore. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
(**) Roztwór buforowy do rozcieńczania:
roztwór podstawowy chlorku 100,0 ml
sodu buforowanego fosforanami (****)
Roztwór wzorcowy albuminy 3,0 g
surowicy bydlęcej (BSA)
Tween 20 1,0 ml
Należy wyregulować pH do 7,3 i dopełnić do 1 l H2O oczyszczoną w systemie Millipore. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
(***) TMB plus to gotowy do zastosowania substrat wyprodukowany przez KemEnTec (Dania). Jest on wrażliwy na światło. Roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C.
(****) Roztwór podstawowy chlorku sodu buforowanego fosforanami
NaCl160,0 g
KH2PO44,0 g
Na2HPO4∙ 2H2O26,6 g
KCl 4,0 g
Należy wyregulować pH do 6,8 i dopełnić do 2 l H2O oczyszczonej w systemie Millipore. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
Dodatek 7
Wytyczne dotyczące sporządzania preparatów skrawków tkanek do określenia płci i etapu rozwoju gonad
Celem niniejszej części jest opisanie procedur poprzedzających ocenę skrawków histologicznych. Można stosować inne procedury, których wynikiem jest podobne określenie płci i etapu rozwoju gonad.
Z kilkoma wyjątkami procedury te mają podobny charakter w odniesieniu do ryżanki japońskiej i danio pręgowanego.
Uśmiercenie, autopsja i utrwalenie tkanek
Cele:
1. Zapewnienie humanitarnego uśmiercania ryb.
2. Uzyskanie niezbędnych wartości wagi i pomiarów ciała.
3. Ocena drugorzędnych cech płciowych.
4. Wycięcie tkanek do analizy VTG.
5. Utrwalenie gonad.
Procedury:
1. Ryby należy uśmiercać tuż przed autopsją. W związku z tym nie należy uśmiercać kilku ryb naraz, jeżeli nie ma wystarczającej liczby osób dokonujących autopsji.
2. Ryby wyjmuje się z komory badawczej za pomocą małej siatki i przenosi w pojemniku transportowym na miejsce autopsji.
3. Ryby umieszcza się w roztworze do uśmiercania. Wyjmuje się je z roztworu, gdy nastąpi zatrzymanie oddechu i ryby nie reagują na bodźce zewnętrzne.
4. Ryby waży się na mokro.
5. W celu przygotowania tkanek do analizy VTG można umieścić rybę na korkowej podkładce na stoliku mikroskopu preparacyjnego.
a) W przypadku danio pręgowanego głowę odcina się tuż za płetwą piersiową, a ogon tuż za płetwą grzbietową.
b) W przypadku ryżanki japońskiej jamę brzuszną otwiera się, wykonując ostrożnie nacięcie biegnące wzdłuż środkowej linii brzucha od obręczy barkowej do punktu znajdującego się tuż za odbytem. Ostrożnie usuwa się wątrobę za pomocą małych szczypczyków i małych nożyczek.
6. Próbkę do analizy VTG umieszcza się w probówkach Eppendorfa i natychmiast zamraża w ciekłym azocie.
7. Tuszę wraz z gonadami umieszcza się w oznakowanej wcześniej kasecie z tworzywa sztucznego przeznaczonej na tkanki, którą przenosi się do utrwalacza Davidsona lub Bouina. Objętość utrwalacza powinna być co najmniej 10 razy większa niż przybliżona objętość tkanek. Pojemnik ze środkiem utrwalającym wstrząsa się delikatnie przez pięć sekund w celu usunięcia bąbelków powietrza z kasety.
8. a) Wszystkie tkanki pozostawia się na noc w utrwalaczu Davidsona, a następnego dnia przenosi do pojedynczych
pojemników z 10 % obojętną zbuforowaną formaliną. Pojemniki z kasetami wstrząsa się delikatnie przez pięć sekund, aby formalina należycie przeniknęła do kasetek.
b) Tkanki pozostają w utrwalaczu Bouina przez 24 godziny, a następnie przenoszone są do 70 % etanolu.
Postępowanie z tkankami
Cele:
1. Odwodnić tkankę, aby umożliwić należyte nasączenie parafiną.
2. Zaimpregnować tkankę parafiną w celu utrzymania spójności tkanki i stworzenia stabilnej powierzchni na potrzeby mikrotomii.
Procedury:
3. Oznakowane kasety z tkankami wyjmuje się z formaliny/etanolu i umieszcza w koszyczkach do obróbki. Koszyczki do obróbki umieszcza się w procesorze tkankowym.
4. Wybiera się program obróbki.
5. Po zakończeniu cyklu obróbki w procesorze tkankowym można przenieść koszyczki do stacji do zatapiania.
Zatapianie
Cel:
Odpowiednie ułożenie próbki w zestalonej parafinie na potrzeby mikrotomii.
Procedury:
1. Koszyczki z kasetami wyjmuje się z procesora i zanurza w wypełnionej parafiną przedniej komorze modułu podgrzewającego stacji do zatapiania albo kasety przenosi się do oddzielnego podgrzewacza parafiny.
2. Pierwszą kasetę przeznaczoną do zatopienia wyjmuje się z przedniej komory modułu podgrzewającego stacji do zatapiania lub podgrzewacza parafiny. Zdejmuje się i odrzuca pokrywę kasety, a oznaczenie na kasecie porównuje się z danymi dotyczącymi zwierzęcia w celu wyjaśnienia ewentualnych rozbieżności przed zatopieniem.
3. Wybiera się formę do zatapiania o odpowiednich rozmiarach.
4. Formę podstawia się pod dozownik modułu dozującego i wypełnia roztopioną parafiną.
5. Próbkę wyjmuje się z kasety i umieszcza w roztopionej parafinie w formie. W odniesieniu do każdej formy z parafiną czynność tę powtarza się dla 4-8 próbek. Rozmieszczenie poszczególnych ryb oznacza się poprzez umieszczenie ryby numer jeden pod kątem 180 stopni w stosunku do ryb 2-4/8.
6. Dodaje się dodatkową parafinę w celu zakrycia próbki.
7. Formę z podstawą kasety umieszcza się na płycie chłodzącej modułu chłodzącego.
8. Po zestaleniu parafiny blok (tj. zastygniętą parafinę zawierającą tkanki i podstawę kasety) wyjmuje się z formy.
Mikrotomia
Cel:
Cięcie i przygotowanie skrawków histologicznych do barwienia.
Procedury:
1. Wstępny etap mikrotomii określany jako "licowanie" przebiega następująco:
a. blok parafiny umieszcza się w uchwycie mikrotomu.
b. Obracając pokrętłem mikrotomu, przesuwa się uchwyt i odcina grube skrawki parafinowej powierzchni bloku aż do momentu, gdy nóż dotrze do zatopionych tkanek.
c. mikrotom ustawia się tak, aby otrzymać skrawki o grubości 3-5 mikronów. Uchwyt przesuwa się i z bloku odcięty zostaje szereg skrawków w celu usunięcia wszelkich artefaktów powstałych na powierzchni cięcia tkanki podczas zgrubnego odcinania;
d. blok można wyjąć z uchwytu i umieścić na lodzie górną częścią w dół w celu nasączenia tkanki.
2. Następnym etapem mikrotomii jest końcowy podział i naciągnięcie skrawków tkanki na szkiełka. Procedury te przebiegają w następujący sposób:
a. Jeżeli blok umieszczono na lodzie, zdejmuje się go z lodu i ponownie umieszcza w uchwycie mikrotomu.
b. w przypadku gdy ustawiona w mikrotomie grubość skrawka wynosi 3-5 mikronów, uchwyt przesuwa się, obracając pokrętłem mikrotomu. Od bloku odcina się skrawki do momentu uzyskania "wstęgi" obejmującej co najmniej jeden odpowiedni skrawek zawierający gonady. (Jeżeli podczas odcinania skrawków zaistnieje taka konieczność, blok można wyjąć z uchwytu i umieścić na lodzie górną częścią w dół w celu nasączenia tkanki, a następnie ponownie umieścić w uchwycie).
c. Skrawki umieszcza się płasko na powierzchni wody w łaźni wodnej. Próbuje się uzyskać co najmniej jeden skrawek, pod którym nie ma żadnych nierówności ani pęcherzyków powietrza.
d. Szkiełko mikroskopowe zanurza się pod najlepszym skrawkiem i wyjmuje się skrawek z wody za pomocą szkiełka. Proces ten określa się jako naciągnie skrawka na szkiełko.
e. W przypadku zestawu ryb przygotowuje się trzy skrawki. Drugi i trzeci skrawek odcina się w odstępach 50 mikronów od pierwszego. Jeżeli ryby nie zostały osadzone w parafinie z gonadami na tym samym poziomie podziału, należy odciąć więcej skrawków, aby zapewnić uzyskanie z każdej ryby co najmniej sześciu skrawków zawierających gonady.
f. Za pomocą specjalnego pisaka na szkiełku zapisuje się numer bloku, z którego uzyskano szkiełko.
g. Szkiełko umieszcza się w stelażu do barwienia.
h. Blok wyjmuje się z uchwytu i umieszcza górną częścią w dół w celu przechowania;
Barwienie, zamykanie szkiełkiem nakrywkowym i opisywanie szkiełek
Cele:
- Barwienie skrawków na potrzeby oceny histologicznej.
- Trwałe uszczelnienie naciągniętych i zabarwionych tkanek.
- Trwałe oznaczenie zabarwionych skrawków w sposób umożliwiający pełną identyfikowalność.
Procedury:
1. Barwienie
a. Szkiełka przed barwieniem przez całą noc suszy się powietrzem.
b. Do barwienia skrawków stosuje się hematoksylinę i eozynę.
2. Zamknięcie szkiełkiem nakrywkowym
a. Szkiełka nakrywkowe można nakładać ręcznie lub automatycznie.
b. Szkiełko zanurza się w ksylenie lub w preparacie TissueClear, a nadmiar ksylenu/TissueClear delikatnie usuwa się ze szkiełka.
c. W pobliżu końca szkiełka, położonego przeciwlegle do zmatowionego końca, lub na szkiełko nakrywkowe nanosi się około 0,1 ml medium zamykającego.
d. Szkiełko nakrywkowe pochyla się pod niewielkim kątem w trakcie nakładania na szkiełko podstawowe.
3. Opisywanie
e. Etykieta na każdym szkiełku powinna zawierać następujące informacje.
i. Nazwa laboratorium ii. Gatunek
iii. Nr próbki / nr szkiełka
iv. Substancja chemiczna / grupa poddana zabiegowi
v. Data
Dodatek 8
Statystyczny schemat blokowy analizy poziomu witellogeniny
Statystyczny schemat blokowy analizy proporcji płci
Dodatek 9
Wytyczne dotyczące pobierania próbek tkanek w celu określenia płci genetycznej oraz w celu określenia płci genetycznej metodą PCR
Pobieranie, przygotowanie i przechowywanie próbek tkanek przed określaniem płci genetycznej metodą PCR w przypadku ryżanki (opracowanie: Laboratory for Aquatic Organisms of Bayer CropScience AG)
1. Za pomocą małych nożyczek odcina się płetwę odbytową lub grzbietową każdej ryby i umieszcza w probówce wypełnionej 100 µl ekstrakcyjnego roztworu buforowego 1 (szczegółowe informacje dotyczące przygotowania roztworu buforowego podano poniżej). Nożyczki po każdej rybie myje się do czysta w zlewce wypełnionej destylowaną H2O i osusza bibułą.
2. Następnie tkankę płetw poddaje się homogenizacji w probówce Eppendorfa za pomocą teflonowego tłuczka do lizy komórek. Do każdej probówki stosuje się nowy tłuczek, aby nie dopuścić do zanieczyszczenia. Tłuczki umieszcza się na noc w 0,5 M roztworze NaOH, płucze przez 5 minut w destylowanej H2O i przechowuje w etanolu lub w stanie sterylnym po sterylizacji w autoklawie do czasu kolejnego użycia.
3. Możliwe jest również przechowywanie tkanki płetwy bez ekstrakcyjnego roztworu buforowego 1 na suchym lodzie, a następnie w chłodziarkach w temperaturze - 80 °C, aby zapobiec degeneracji DNA. Ekstrakcja przebiega jednak w skuteczniejszy sposób, jeżeli w tym samym czasie przeprowadza się ekstrakcję DNA (postępowanie zob. powyżej; po przechowywaniu w temperaturze - 80 °C próbki należy rozmrozić na lodzie, zanim wypełni się probówki roztworem buforowym).
4. Po poddaniu homogenizacji wszystkie probówki umieszcza się w łaźni wodnej i gotuje przez 15 minut w temperaturze 100 °C.
5. Następnie do każdej probówki wkrapla się 100 µl roztworu buforowego 2 (szczegółowe informacje dotyczące przygotowania podano poniżej). Próbki pozostawia się w temperaturze pokojowej na 15 minut, od czasu do czasu delikatnie wstrząsając ręcznie.
6. Następnie wszystkie probówki ponownie umieszcza się w łaźni wodnej i gotuje przez kolejne 15 minut w temperaturze 100 °C.
7. Do czasu kolejnej analizy probówki zamraża się w temperaturze - 20 °C.
Przygotowanie roztworu buforowego
Roztwór buforowy 1 stosowany w metodzie PCR:
500 mg N-Lauroylsarcosine (np. Merck KGaA, Darmstadt, GE)
2 ml 5M NaCl
dodać 100 ml wody destylowanej
→ autoklaw Roztwór buforowy 2 stosowany w metodzie PCR:
20 g Chelex (np. Biorad, Munich, GE)
doprowadzić do spęcznienia w 100 ml wody destylowanej
→ autoklaw
Określanie płci genetycznej (metodą PCR) w przypadku ryżanki (przygotowane przez Laboratory for Aquatic Organisms of Bayer CropScience AG i Universität Würzburg Biozentrum)
Przygotowane i zamrożone probówki (opisane w poprzedniej części) rozmraża się na lodzie. Następnie odwirowuje się je wykorzystując wirówkę Eppendorfa (30 sekund przy maksymalnej prędkości w temperaturze pokojowej). W przypadku metody PCR wykorzystuje się czysty supernatant oddzielony od osadu. Nie wolno pod żadnym pozorem dopuścić do przeniesienia jakichkolwiek śladowych ilości Chelexu (znajdującego się w osadzie) do reakcji PCR, ponieważ mogłoby to zakłócić działanie polimerazy Taq. Supernatant wykorzystuje się bezpośrednio lub przechowuje zamrożony (w temperaturze - 20 °C) i ponownie rozmraża do późniejszej analizy w kilku cyklach bez negatywnego wpływu na DNA.
1. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej (25 µl na próbkę):
| Objętość | Końcowe stężenie | |
| Wzorzec DNA | 0,5 µl-2 µl | |
| 10x roztwór buforowy PCR z MgCl2 | 2,5 µl | 1x |
| Nukleotydy (każdy z serii dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | 4 µl (5 µM) | 200 µM |
| Primer lewy (10 µM) (zob. poniżej 3-5) | 0,5µl | 200 µM |
| Primer prawy (10 µM) (zob. poniżej 3-5) | 0,5µl | 200 µM |
| Sulfotlenek dimetylowy | 1,25 µl | 5 % |
| Woda (klasy PCR) | do 25 µl | |
| E-Polimeraza Taq | 0,3 µl | 1,5 U |
| 10xroztwór buforowy z MgCl2: 670 µM Tris/HCl (pH 8,8 w temperaturze 25 °C), 160 µM (NH4)2SO4, 25 µM MgCl2, 0,1-procentowy roztwór Tween 20 |
W odniesieniu do każdej PCR (zob. poniżej 3-5) niezbędny jest specjalny starter jako nowe połączenie mieszaniny reakcyjnej i odpowiednich niezbędnych ilości wzorca DNA dla każdej próbki (zob. powyżej). Odpowiednie ilości przenosi się do nowych probówek za pomocą pipet. Następnie wszystkie probówki zamyka się, a ich zawartość miesza (przez około 10 sekund) i odwirowuje (10 sekund w temperaturze pokojowej). Następnie można uruchomić odpowiednie programy PCR. Dodatkowo w każdym programie PCR stosuje się dodatnią próbę kontrolną (przykładowa próbka DNA o znanej aktywności i wyraźnych wynikach) oraz ujemną próbę kontrolną (1 µl wody destylowanej).
2. Przygotowanie żelu agarozowego (1 %) - podczas przeprowadzania programów PCR:
- rozpuścić 3 g agarozy w 300 ml 1 × roztworu buforowego TAE (1 % żel agarozowy)
- roztwór gotować w kuchence mikrofalowej (przez około 2-3 min.)
- przelać gorący roztwór do specjalnego pojemnika odlewniczego umieszczonego na lodzie
- po około 20 min. żel agarozowy jest gotowy do użycia.
- przechowywać żel agarozowy w 1 × roztworu buforowego TAE do końca programów PCR.
3. Program PCR z udziałem aktyny:
Ta reakcja PCR ma na celu wykazanie, że DNA w próbce nie jest uszkodzone.
- Specjalny starter:
"Mact1(górny/lewy)" TTC AAC AGC CCT GCC ATG TA "Mact2(dolny/prawy)" GCA GCT CAT AGC TCT TCT CCA GGG AG
- Program:
5 min. w temperaturze 95 °C Cykl (35-krotny):
Denaturacja → 45 sekund w temperaturze 95 °C
Hybrydyzacja → 45 sekund w temperaturze 56 °C
Wydłużenie → 1 min. w temperaturze 68 °C
15 min. w temperaturze 68 °C
4. Program PCR z udziałem genów X i Y:
W tej serii programu PCR zastosowane zostaną próbki z nieuszkodzonym DNA w celu wykrycia genów X i Y. Męskie DNA powinno zawierać jedną podwójną nić, a żeńskie DNA jedną pojedynczą (po barwieniu i elektroforezie w żelu). W tej serii programu należy uwzględnić jedną dodatnią próbę kontrolną dla samców (próbka XY) i jedną dla samic (próbka XX).
- Specjalny starter:
"PG 17.5" (górny/lewy) CCG GGT GCC CAA GTG CTC CCG CTG "PG 17.6" (dolny/prawy) GAT CGT CCC TCC ACA GAG AAG AGA
- Program:
5 min. w temperaturze 95 °C
Cykl (40-krotny):
Denaturacja → 45 sekund w temperaturze 95 °C
Hybrydyzacja → 45 sekund w temperaturze 55 °C
Wydłużenie → 1 min. 30 sekund w temperaturze 68 °C
15 min. w temperaturze 68 °C
5. Program PCR z udziałem genu Y jako próba kontrolna dla programu PCR z udziałem genów Y i X:
Ten program PCR pozwala zweryfikować wyniki "programu PCR z udziałem genu X i Y". Próbki "męskie" powinny zawierać jedną nić, a próbki "żeńskie" żadnej (po barwieniu i elektroforezie w żelu).
- Specjalny starter:
"DMTYa (górny/lewy)" GGC CGG GTC CCC GGG TG "DMTYd (dolny/prawy)" TTT GGG TGA ACT CAC ATG G
- Program:
5 min. w temperaturze 95 °C
Cykl (40-krotny):
Denaturacja → 45 sekund w temperaturze 95 °C
Hybrydyzacja → 45 sekund w temperaturze 56 °C
Wydłużenie → 1 min. w temperaturze 68 °C
15 min. w temperaturze 68 °C
6. Barwienie próbek PCR:
Roztwór barwiący:
50 % glicerolu
100 mM EDTA
1 % SDS
0,25 % błękitu bromofenolowego
0,25 % ksylenocyjanolu Wprowadzić za pomocą pipety 1 µl roztworu barwiącego do każdej pojedynczej probówki.
7. Rozpocząć elektroforezę na żelu:
- sporządzony 1 % żel agarozowy przenosi się do komory elektroforezy na żelu wypełnionej 1 × buforem TAE;
- do szczeliny w żelu agarozowym wprowadza się za pomocą pipety 10-15 µl każdej z zabarwionych próbek PCR;
- do oddzielnej szczeliny wprowadza się za pomocą pipety również 5-15 µl zestawu 1kb-"Ladder" (firma Invitrogen);
- Rozpocząć elektroforezę doprowadzając napięcie 200 V.
- Zakończyć po 30-45 min.
8. Oznaczenie nici
- Wyczyścić żel agarozowy w wodzie destylowanej.
- Następnie przenieść żel agarozowy na 15-30 min. do bromku etydyny.
- Następnie należy wykonać zdjęcie żelu agarozowego w komorze z oświetleniem UV.
- Ponadto próbki analizuje się, porównując je z nicią (lub nićmi) dodatniej próby kontrolnej i drabinką.
Dodatek 10
Wytyczne dotyczące pobierania próbek tkanek w celu określenia płci genetycznej metodą PCR w przypadku ciernika
Pobieranie próbek i ekstrakcja DNA
Ekstrakcję DNA można przeprowadzić wykorzystując różnorodne dostępne na rynku odczynniki oraz systemy ekstrakcji ręcznej lub automatycznej. Poniżej opisano protokół stosowany w laboratorium Cefas Weymouth, a w stosowanych przypadkach dodano metody alternatywne.
1. Za pomocą małych nożyczek z części grzbietowo-bocznej (po usunięciu głowy i ogona do analizy VTG) każdej ryby pobiera się mały fragment tkanki (10-20 mg). Tkankę umieszcza się w probówce i zanurza albo bezpośrednio w ciekłym azocie (do przechowywania w temperaturze - 80 °C), albo wypełnia roztworem 70 % etanolu (do transportu i późniejszego przechowywania w temperaturze 4 °C). Nożyczki myje się do czysta po każdej rybie w roztworze 70 % etanolu, a następnie w wodzie destylowanej i osusza bibułą.
2. Etanol (jeżeli jest obecny) usuwa się przez aspirację, a tkankę ekstrahuje się całą noc w obecności proteinazy K w 400 μl roztworu buforowego ATL (Qiagen). Podwielokrotność (200 μl) roztworu przenosi się do 96-dołkowego bloku S (Qiagen) i ekstrahuje DNA w formacie 96-dołkowym z wykorzystaniem zestawu Qiagen Universal BioRobot i QIamp Investigator BioRobot. DNA wymywa się w 50 µl wody wolnej od deoksyrybonu-kleazy i rybonukleazy. W przypadku wykorzystania twardych tkanek (takich jak kręgosłup lub płetwa piersiowa) do ekstrakcji DNA konieczna może być homogenizacja próbki w roztworze buforowym do lizy za pomocą aparatu FastPrep® lub równoważnego systemu rozbijania tkanek.
Alternatywnie
a) tkankę ekstrahuje się całą noc w obecności proteinazy K w 400 µl roztworu buforowego do lizy G2 (Qiagen) i ekstrahuje się DNA z 200 µl ekstraktu za pomocą zestawu EZ-1 DNA easy tissue i biorobota EZ-1 lub zestawu DNA easy mini tissue. DNA wymywa się w 50 µl objętości;
b) tkanki przetwarza się przy zastosowaniu odczynnika DNAzol. Jednym słowem próbki tkanek poddaje się procesowi lizy w 1ml odczynnika DNAzol przez 10 minut w 1,5 ml mikropróbówce do wirówki, a następnie odwirowuje z prędkością 13 000 obr./min. przez 5 minut w celu oddzielenia cząstek stałych. Po procesie lizy próbkę przenosi się do nowej mikropróbówki o pojemności 1,5 ml, zawierającej 500 µl 100 % etanolu do biologii molekularnej, a następnie odwirowuje z prędkością 13 000 obr./min. przez 10 minut w celu strącenia DNA. Etanol usuwa się i zastępuje 400 µl roztworu 70 % etanolu do biologii molekularnej, odwirowuje z prędkością 13 000 obr./min. przez 5 minut, a osad DNA rozpuszcza się w 50 µl wody wolnej od cząsteczkowej deoksyrybonukleazy i rybonukleazy. Podobnie jak poprzednio w przypadku wykorzystania twardych tkanek (płetwa piersiowa) przed ekstrakcją DNA konieczna może być homogenizacja próbki w roztworze buforowym do lizy za pomocą aparatu FastPrep® lub równoważnego systemu rozbijania tkanek.
3. DNA przechowuje się w temperaturze - 20 °C do czasu aż będzie potrzebne.
Ważna uwaga: podczas tego procesu należy używać rękawiczek.
Analiza łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR)
Amplifikacje zostały wykonane przy użyciu 2,5 μl ekstraktu DNA w 50 μl objętości reakcyjnej z wykorzystaniem starterów Idh locus (jak opisał Peichel i in., 2004. Current Biology 1:1416-1424):
Starter lewy 5' GGG ACG AGC AAG ATT TAT TGG 3'
Starter prawy 5' TAT AGT TAG CCA GGA GAT GG 3'
Istnieje szereg dostawców odpowiednich odczynników PCR. Opisana poniżej metoda jest obecnie stosowana w laboratorium Cefas Weymouth.
1. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej (50 µl na próbkę):
Mieszaninę główną sporządza się w opisany poniżej sposób. Można ją przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać zamrożoną w temperaturze - 20 °C do czasu wykorzystania. Sporządzić wystarczającą ilość mieszaniny głównej na potrzeby ujemnej próby kontrolnej (tylko woda do biologii molekularnej).
| Objętość (podstawowe stężenie)/ próbkę | Końcowe stężenie | |
| 5x roztwór buforowy do reakcji GoTaq® | 10 µl | 1x |
| MgCl2 | 5 µl (25 µM) | 2,5 µM |
| Nukleotydy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | 0,5 µl (25 µM każda) | 250 µM każda |
| Starter lewy | 0,5 µl (0,1 nmol/µl) | 2,0 µM |
| Starter prawy | 0,5 µl (0,1 nmol/µl) | 2,0 µM |
| Woda do biologii molekularnej | 30,75 µl | |
| Polimeraza GoTaq | 0,25 µl | 1,25 U |
- Umieścić 47,5 µl w oznakowanej, cienkościennej probówce do PCR o pojemności 0,5 ml.
- Dodać 2,5 µl oczyszczonego DNA do odpowiednio oznakowanej probówki. Powtarzać tę czynność w odniesieniu do wszystkich próbek i ujemnych prób kontrolnych.
- Wlać 2 krople oleju mineralnego. Ewentualnie użyć termocyklera z podgrzewaną pokrywą.
- Zamknąć pokrywki.
- Próbki poddano denaturacji w termocyklerze Peltiera PTC-225 w temperaturze 94 ± 2 °C przez 5 minut, następnie 39 cyklom w temperaturze 94 ± 2 °C przez minutę, w temperaturze 55 ± 2 °C przez 1 minutę, w temperaturze 72 ± 2 °C przez 1 minutę i na koniec w temperaturze 72 ± 2 °C przez 10 minut.
2. Przygotowanie żelu agarozowego (2 %):
Tradycyjnie produkty PCR rozpuszcza się na 20 % żelu agarozowym zawierającym bromek etydyny. Wykorzystać można również systemy elektroforezy kapilarnej.
- Zważyć 2 g agarozy w 100 ml 1 × roztworu buforowego TAE.
- Podgrzać w kuchence mikrofalowej (około 2-3 min.), aby rozpuścić agarozę.
- Dodać 2 krople bromku etydyny o stężeniu końcowym 0,5 µg/ml.
- Przenieść gorący roztwór do urządzenia do wylewania żelu.
- Pozostawić żel do zastygnięcia.
3. Elektroforeza żelowa:
- Przenieść żel agarozowy do urządzenia do elektroforezy i zatopić w 1 × roztworze buforowym TAE.
- Wprowadzić 20 µl każdej z próbek do oddzielnego dołka, dodając marker masy cząsteczkowej (100 bp DNA ladder, Promega) do zapasowego dołka.
- Elektroforezę przeprowadza się pod napięciem 120 V przez 30-45 minut.
4. Wizualizacja produktów amplifikacji
Jeżeli bromek etydyny został wprowadzony do żelu agarozowego, jak opisano powyżej, produkty DNA można zobrazować w źródle promieni UV. Można również zabarwić żel agarozowy pokrywając żel rozcieńczonym roztworem bromku etydyny (0,5 µg/ml w wodzie) na 30 minut przed wizualizacją.
Dodatek 11
Wytyczne dotyczące procedury sztucznego zapłodnienia w odniesieniu do ciernika
Celem niniejszej części jest opisanie procedur pozyskiwania zapłodnionych komórek jajowych od ciernika w celu wykorzystania ich do badania rozwoju płciowego ryb.
Procedury
Pozyskanie spermy od samców
1. Dobrze wybarwiony samiec z żądanej populacji jest uśmiercany.
2. Z każdej strony ryby wycina się jądra. Jądra są z reguły mocno ubarwionymi, podłużnymi organami dobrze widocznymi na bocznej środkowej linii ciała. Zastosować jedną z poniższych metod:
3. Za pomocą małych nożyczek wykonać pojedyncze nacięcie o długości 1-1,5 cm, biegnące od odbytu pod kątem około 45 stopni.
4. Użyć skalpela w celu wykonania małego nacięcia z boku ryby nieco za miednicą od strony brzucha w stosunku do łusek na bokach.
5. Jądra usuwa się za pomocą małej pęsety i umieszcza na płytce Petriego.
6. Każdej jądro pokrywa się 100 μl świeżo sporządzonego końcowego roztworu Hanka (*).
7. Jądra kroi się w drobną kostkę za pomocą żyletki lub skalpela. Pozwala to uwolnić spermę, która nada roztworowi Hanka mleczny kolor.
8. Płyn zawierający spermę dodaje się do probówki, jednocześnie starając się nie dodać podczas wkraplania żadnego kawałka tkanki jąder.
9. Do probówki dodaje się 800 μl końcowego roztworu Hanka i dokładnie miesza.
10. W razie potrzeby samca można zakonserwować poprzez utrwalenie w roztworze 100 % etanolu lub innej pożądanej substancji utrwalającej. Jest to szczególnie ważne, jeżeli w badaniu potomstwo przypisuje się danym rodzicom.
(*) Buforowany roztwór soli Hanka (HBSS):
HBSS jest niezbędny do konserwacji spermy podczas przygotowywania do zapłodnienia.
Ważna uwaga: chociaż większość niezbędnych roztworów podstawowych można przygotować wcześniej, roztwór podstawowy 5, i w związku z tym roztwór końcowy, należy sporządzić świeżo w dniu, w którym mają zostać wykorzystane.
Roztwór podstawowy 1
NaCl 8,00 g
KCl 0,40 g
Woda destylowana 100 ml
Roztwór podstawowy 2
Na2HPO4 (bezwodny) 0,358 g
KH2PO4 0,60 g
Woda destylowana 100 ml
Roztwór podstawowy 3
CaCl2 0,72 g
Woda destylowana 50 ml
Roztwór podstawowy 4
MgSO4 * 7H2O 1,23 g
Woda destylowana 50 ml
Roztwór podstawowy 5 (świeżo sporządzony)
NaHCO3 0,35 g
Woda destylowana 10 ml
Uwaga: jeżeli niektóre z powyższych soli są już w posiadaniu laboratorium, ale mają inną zwartość wody (tj. 2H2O zamiast bezwodników), można ich nadal używać, ale najpierw należy skorygować masę na podstawie masy cząsteczkowej).
W celu uzyskania końcowego roztworu Hanka połączyć ze sobą w następującej kolejności:
roztwór podstawowy 1 1,0 ml
roztwór podstawowy 2 0,1 ml
roztwór podstawowy 3 0,1 ml
Woda destylowana 8,6 ml
roztwór podstawowy 4 0,1 ml
roztwór podstawowy 5 0,1 ml
Dokładnie wymieszać przed użyciem.
Zapłodnienie
1. Z żądanej populacji wybiera się duże, ciężarne samice; samice są gotowe do wyciśnięcia komórek jajowych tylko w przypadku, gdy komórki jajowe wystają w sposób widoczny z kloaki. Gotowe samice przyjmują charakterystyczną pozycję z głową w górze.
2. Delikatnie przesunąć palec lub kciuk po boku ryby w dół w kierunku ogona, aby sprowokować wypuszczenie torebki z komórkami jajowymi na świeżą płytkę Petriego. Powtórzyć tę samą czynność po drugiej stronie i włożyć rybę z powrotem do jej zbiornika.
3. Komórki jajowe można rozprowadzić (tak aby utworzyły pojedynczą warstwę) za pomocą delikatnego pędzelka. Ważne jest, aby wystawić na działanie spermy jak najwięcej komórek jajowych, więc wskazane jest maksymalne zwiększenie powierzchni ikry. Ważna uwaga: ułożyć wokół komórek jajowych wilgotną tkaninę, aby cały czas były wilgotne (ważne jest, aby komórki jajowe nie stykały się bezpośrednio z wodą, ponieważ może to doprowadzić do przedwczesnego utwardzenia kosmówki, co uniemożliwi zapłodnienie). Poszczególne samice mogą produkować różną liczbę komórek jajowych, ale z pojedynczej ciężarnej samicy można z łatwością uzyskać przeciętnie około 150 komórek jajowych.
4. Po całej powierzchni komórek jajowych rozprowadza się równomiernie za pomocą pędzla 25 μl spermy umieszczonej w mieszaninie Hanka. Z chwilą rozpoczęcia procesu zapłodnienia komórki jajowe szybko twardnieją i zmieniają kolor (w ciągu minuty). Jeżeli szacowana liczba komórek jajowych wynosi więcej niż 150, powtórzyć procedurę. Również w przypadku gdy komórki jajowe nie stwardnieją w ciągu minuty, należy dodać jeszcze trochę spermy. Ważna uwaga: dodanie większej ilości spermy niekoniecznie poprawia wskaźnik zapłodnienia.
5. Komórki jajowe i roztwór spermy należy pozostawić w celu "interakcji" na co najmniej 15 minut, a zapłodnione komórki jajowe należy umieścić w akwariach do narażenia w ciągu 1,5 godziny od zapłodnienia.
6. Proces ten powtarza się z wykorzystaniem kolejnej samicy do momentu zebrania żądanej liczby komórek jajowych.
7. Zachować kilka komórek jajowych z ostatniej partii i utrwalić je w roztworze 10 % kwasu octowego.
Liczenie i rozdzielanie komórek jajowych na akwaria badawcze
1. Komórki jajowe należy równomiernie rozdzielać na każdym poziomie zabiegowym w celu uniknięcia genetycznego błędu systematycznego. Każdą partię zapłodnionych komórek jajowych należy podzielić na równe grupy (tyle, ile poziomów zabiegowych) za pomocą tępego narzędzia (szeroka pęseta entomologiczna lub pętla do inokulacji). Jeżeli zamierza się zastosować 4 kontrpróby na każdy zabieg, z 20 komórkami jajowymi w każdej kontrpróbie, wówczas należy rozdzielić 80 komórek jajowych na akwaria do badania narażenia. Ważna uwaga: zaleca się dodanie dodatkowych 20 % (tj. 96 komórek jajowych na każdy poziom zabiegowy), aż do momentu pewności uzyskania 100 % wskaźników zapłodnienia.
2. Komórki jajowe ciernika są bardzo podatne na infekcje grzybicze poza obrębem gniazda chronionego przez ojca. Z tego względu kluczowe znaczenie ma poddanie wszystkich komórek jajowych działaniu błękitu metylenowego w ciągu pierwszych pięciu dni badania. Podstawowy roztwór błękitu metylenowego sporządza się w stężeniu 1 mg/ml i dodaje do akwariów badawczych, aby zapewnić maksymalne końcowe stężenie wynoszące 2,125 mg/l. Ważna uwaga: cierniki nie powinny być narażone na działanie błękitu metylenowego po wylęgu, więc 6. dnia system powinien być wolny od błękitu metylenowego.
3. Komórki jajowe kontroluje się codziennie i odnotowuje się wszystkie martwe lub niezapłodnione komórki jajowe. Ważna uwaga: do momentu wyklucia komórki jajowe nie powinny w żadnym wypadku znaleźć się poza wodą nawet na bardzo krótkie okresy.
C.42 BIODEGRADOWALNOŚĆ W WODZIE MORSKIEJ
OGÓLNE WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna z wytyczną OECD nr 306 (1992 r.) w sprawie badań. Gdy opracowywano oryginalne metody badawcze, nie było wiadomo, do jakiego stopnia można byłoby zastosować do środowiska morskiego wyniki badań przesiewowych dotyczących szybkiej biodegradowalności z wykorzystaniem wody słodkiej i ścieków oczyszczonych lub osadu czynnego jako inokulum. Zgłaszano zróżnicowane wyniki w tej kwestii (np. (1)).
2. Do morza dociera wiele rodzajów ścieków przemysłowych zawierających różne substancje chemiczne, w wyniku bezpośrednich zrzutów albo przez ujścia rzek i rzeki, w przypadku których czas zalegania jest krótki w porównaniu z okresem niezbędnym dla całkowitej biodegradacji wielu występujących w nich substancji chemicznych. Ze względu na rosnącą świadomość potrzeby ochrony środowiska morskiego przed wzrastającym obciążeniem substancjami chemicznymi oraz konieczność oszacowania prawdopodobnego stężenia substancji chemicznych w morzu opracowano metody badawcze dotyczące biodegradowalności w wodzie morskiej.
3. W przypadku metod opisanych w niniejszym dokumencie naturalną wodę morską wykorzystywano jako fazę wodną i jako źródło mikroorganizmów. Podczas prób mających na celu potwierdzenie możliwości zastosowania metod szybkiej biodegradowalności w wodzie słodkiej badano możliwość wykorzystania wody morskiej poddanej ultrafiltracji i odwirowaniu oraz osadów morskich jako inokulum. Badania te zakończyły się niepowodzeniem. W związku z tym środowiskiem badania jest naturalna woda morska poddana wstępnemu oczyszczaniu w celu usunięcia cząstek gruboziarnistych.
4. W celu oceny ostatecznej biodegradowalności przy użyciu metody wytrząsania w kolbie należy zastosować stosunkowo wysokie stężenia badanej substancji ze względu na niską czułość metody analitycznej z rozpuszczonym węglem organicznym. To z kolei wymaga dodania do wody morskiej mineralnych składników odżywczych (N i P), których niskie stężenia mogłyby w przeciwnym razie ograniczyć usuwanie rozpuszczonego węgla organicznego. Również w przypadku metody "zamkniętej butli" konieczne jest dodanie składników odżywczych ze względu na stężenie dodanej badanej substancji.
5. W związku z tym metody nie są badaniami szybkiej biodegradowalności, ponieważ nie dodaje się żadnego inokulum w celu uzupełnienia mikroorganizmów już obecnych już w wodzie morskiej. Badania nie symulują również warunków panujących w środowisku morskim, ponieważ dodaje się składniki odżywcze, a stężenie badanej substancji jest dużo wyższe niż byłoby w morzu. Z tych względów metody te przedstawiono w nowym punkcie "Biodegradowalność w wodzie morskiej".
ZASTOSOWANIE
6. Wyniki badań, które zostałyby zastosowane, ponieważ wzorzec stosowania i usuwania substancji, o których mowa, wskazywał drogę do morza, dostarczają pierwszych informacji dotyczących biodegradowalności w wodzie morskiej. Jeżeli wynik jest pozytywny (> 70 % usuniętego rozpuszczonego węgla organicznego; > 60 % teoretycznego zapotrzebowanie na tlen (TZT)), można stwierdzić, że istnieje potencjał dla biodegradacji w środowisku morskim. Ujemny wynik nie wyklucza jednak istnienia takiego potencjału, ale wskazuje na konieczność przeprowadzenia dodatkowych badań, np. z zastosowaniem jak najniższego stężenia badanej substancji.
7. W obydwu przypadkach, jeżeli wymagana jest bardziej konkretna wartość w odniesieniu do tempa lub stopnia biodegradacji w wodach morskich w danym miejscu, należałoby zastosować bardziej złożone i wyrafinowane, a zatem bardziej kosztowne metody. Na przykład badanie symulacyjne przeprowadzić można z zastosowaniem stężenia badanej substancji bardziej zbliżonego do prawdopodobnego stężenia w środowisku. Wykorzystać można również niewzbogaconą, nieoczyszczoną wstępnie wodę morską pobraną z lokalizacji będącej przedmiotem zainteresowania i po wstępnej biodegradacji przeprowadzić szczegółową analizę chemiczną. W przypadku ostatecznej biodegradowalności konieczne byłoby zastosowanie substancji oznakowanych 14C, aby można było zmierzyć wskaźniki znikania rozpuszczalnego organicznego 14C i wytwarzania 14CO2 w warunkach rzeczywistych stężeń.
WYBÓR METOD
8. Wybór metody, którą należy zastosować, zależy od szeregu czynników; poniższa tabela ma służyć jako pomoc w wyborze metody. Chociaż substancji, których rozpuszczalność w wodzie jest niższa od wartości równoważnej około 5 mg C/l, nie można zbadać metodą wytrząsania w kolbie, słabo rozpuszczalne substancje można zasadniczo poddać przynajmniej badaniu metodą "zamkniętej butli".
Tabela
Zalety i wady metody wytrząsania w kolbie i metody "zamkniętej butli".
| METODA | ZALETY | WADY |
| WYTRZĄSANIE W KOLBIE | - prosta aparatura, z wyjątkiem analizatora węgla - czas trwania 60 dni nie stanowi problemu - brak interferencji w związku z nitryfikacją - można ją dostosować do substancji lotnych | - wymagany jest analizator węgla - wykorzystanie 5-40 mg rozpuszczonego węgla organicznego/1, może wykazywać działanie hamujące - oznaczenie rozpuszczonego węgla organicznego jest trudne w przypadku jego niskich stężeń w wodzie morskiej (wpływ chlorku) - zawartość rozpuszczonego węgla organicznego jest czasami wysoka w wodzie morskiej |
| ZAMKNIĘTA BUTLA | - prosta aparatura - łatwe końcowe określenie - stosowane jest niskie stężenie badanej substancji (2 mg/l), w związku z tym mniejsze jest prawdopodobieństwo zahamowania - łatwo można ją dostosować do substancji lotnych | - możliwe trudności z utrzymaniem szczelności butelek - rozwój bakterii na ściankach może prowadzić do fałszywych wartości - wartości absorpcji O2 w ślepych próbach mogą być wysokie, szczególnie po 28 dniach; można sobie z tym poradzić dzięki starzeniu wody morskiej - możliwa interferencja w związku z pobieraniem O2 w procesie nitryfikacji |
METODA WYTRZĄSANIA W KOLBIE
WPROWADZENIE
1. Metoda ta stanowi wariant zmodyfikowanego badania przesiewowego OECD dla wody morskiej, opisanego w rozdziale C.4B niniejszego załącznika (2). Prace nad metodą zostały ukończone w wyniku badania międzyla-boratoryjnego zorganizowanego dla Komisji Europejskiej przez Danish Water Quality Institute (3).
2. Podobnie jak w przypadku badania wody morskiej metodą "zamkniętej butli", wyniki tego badania nie mają zostać przyjęte jako wskaźniki szybkiej biodegradowalności, ale mają być konkretnie wykorzystywane do uzyskania informacji na temat biodegradowalności substancji w środowiskach morskich.
ZASADA METODY
3. Określoną uprzednio ilość badanej substancji rozpuszcza się w środowisku badania, tak aby uzyskać stężenie 5-40 mg rozpuszczonego węgla organicznego (DOC)/l. Jeżeli granice wrażliwości analiz węgla organicznego uległy poprawie, korzystne może być wykorzystanie niższych stężeń badanych substancji, w szczególności substancji hamujących. Roztwór badanej substancji w środowisku badania jest inkubowany w warunkach mieszania, bez dostępu światła lub w rozproszonym świetle w warunkach aerobowych w stałej temperaturze (regulowanej z dokładnością do ± 2 °C), która zazwyczaj mieści się w przedziale 15-20 °C. W przypadku gdy celem badania jest symulowanie sytuacji środowiskowych, można prowadzić badania poza powyższym normalnym zakresem temperatury. Zalecany maksymalny czas trwania badania wynosi około 60 dni. Po degradacji mierzy się zawartość rozpuszczonego węgla organicznego (degradacja ostateczna), a w niektórych przypadkach dokonuje szczegółowej analizy (degradacja pierwotna).
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI
4. Aby stwierdzić, czy badanie może zostać zastosowane w odniesieniu do konkretnej substancji, muszą być znane jej niektóre właściwości. Należy ustalić poziom zawartości węgla organicznego w substancji, lotność substancji musi uniemożliwiać znaczące straty substancji w trakcie badania, a jej rozpuszczalność w wodzie powinna być większa niż ekwiwalent 25-40 mg C/l. Ponadto badana substancja nie powinna ulegać znaczącej adsorpcji na powierzchniach szklanych. Wymagane są informacje na temat czystości lub względnych proporcji głównych składników badanej substancji, aby można było zinterpretować uzyskane wyniki, zwłaszcza gdy wynik jest zbliżony do poziomu akceptacji.
5. Informacje na temat toksyczności badanej substancji w stosunku do bakterii, mierzonej na przykład w krótkoterminowych badaniach szybkości oddychania (4), mogą być pomocne w wyborze odpowiednich badanych stężeń i mogą mieć zasadnicze znaczenie dla prawidłowej interpretacji niskich wartości biodegradacji. Informacje takie nie zawsze jednak wystarczą, aby dokonać interpretacji wyników uzyskanych w badaniu biodegradacji, więc procedura opisana w pkt 18 jest bardziej odpowiednia.
SUBSTANCJE ODNIESIENIA
6. W celu sprawdzenia aktywności mikroorganizmów w próbce wody morskiej należy zastosować właściwe substancje odniesienia. Przykładami substancji, których można użyć do tego celu, są benzoesan sodu, octan sodu i anilina. Substancje odniesienia muszą ulec rozkładowi w odpowiednio krótkim czasie, w przeciwnym razie zaleca się powtórzenie badania z wykorzystaniem innej próbki wody morskiej.
7. W badaniu międzylaboratoryjnym KE, w którym próbki wody morskiej pobierano z różnych lokalizacji i o różnych porach roku (3), faza zwłoki (tL) i czas potrzebny do 50 % degradacji (t50), z wyłączeniem fazy zwłoki, w przypadku benzoesanu sodu wynosiły odpowiednio 1-4 dni i 1-7 dni. W przypadku aniliny, tL wynosił 0-10 dni, zaś t50 wynosił 1-10 dni.
ODTWARZALNOŚĆ I CZUŁOŚĆ METODY
8. Odtwarzalność metody ustalono w badaniu międzylaboratoryjnym (3). Najniższe stężenie badanej substancji, w przypadku którego można zastosować tę metodę z analizą rozpuszczonego węgla organicznego, jest w dużej mierze wyznaczone granicą wykrywalności analizy węgla organicznego (obecnie około 0,5 mg C/l) i stężeniem węgla organicznego rozpuszczonego w wodzie morskiej (zwykle rzędu 3-5 mg/l w przypadku wody z otwartego morza). Po dodaniu badanej substancji stężenie tła rozpuszczonego węgla organicznego nie powinno przekroczyć około 20 % całkowitego stężenia rozpuszczonego węgla organicznego. Jeżeli nie jest to wykonalne, stężenie tła rozpuszczonego węgla organicznego można czasem zredukować, postarzając wodę morską przed badaniem. Jeżeli metodę tę stosuje się tylko ze szczegółową analizą chemiczną (umożliwiającą pomiar pierwotnej degradacji), badacz musi udokumentować, czy można oczekiwać ostatecznej degrado-walności, dostarczając dodatkowych informacji. Te dodatkowe informacje mogą obejmować wyniki innych badań dotyczących szybkiej lub naturalnej biodegradowalności.
OPIS METODY
Aparatura
9. Zwykła aparatura laboratoryjna oraz:
a. wytrząsarka, w której mieszczą się kolby Erlenmeyera o pojemności 0,5-2 litrów, z automatyczną kontrolą temperatury lub stosowana w stałej temperaturze pokojowej 15-20 °C regulowanej z dokładnością ± 2 °C;
b. kolby Erlenmeyera z wąską szyjką o pojemności 0,5-2 litra;
c. aparat do filtracji membranowej lub wirówka;
d. filtry membranowe, 0,2-0,45 μm;
e. analizator węgla;
f. urządzenia do szczegółowej analizy (nieobowiązkowe).
Woda morska
10. Próbkę wody morskiej należy pobrać do dokładnie oczyszczonego pojemnika i przetransportować do laboratorium, najlepiej w ciągu jednego lub dwóch dni od pobrania próbki. Podczas transportu nie wolno dopuścić, aby temperatura próbki znacząco przekroczyła temperaturę, w której będzie prowadzone badanie. Należy dokładnie zidentyfikować miejsce próbkowania i opisać je pod względem poziomu zanieczyszczenia i składników odżywczych. W szczególności w przypadku wód przybrzeżnych lub zanieczyszczonych należy uwzględnić w tej charakterystyce liczbę kolonii drobnoustrojów cudzożywnych i określenie stężeń rozpuszczonych azotanów, związków amonu i fosforanów.
11. W odniesieniu do samej próbki wody morskiej należy podać następujące informacje:
- data pobrania;
- głębokość pobrania;
- wygląd próbki - mętna itd.;
- temperatura w czasie pobrania;
- zasolenie;
- rozpuszczony węgiel organiczny;
- upływ czasu między pobraniem a wykorzystaniem w badaniu.
12. Jeżeli stwierdzone zostanie, że zawartość rozpuszczonego węgla organicznego w wodzie morskiej jest wysoka (pkt 8), zaleca się starzenie wody morskiej co najmniej przez tydzień przed jej wykorzystaniem w badaniu. Woda powinna być przechowywana w warunkach tlenowych w temperaturze badania i bez dostępu światła lub w rozproszonym świetle. W razie potrzeby należy utrzymać warunki tlenowe zapewniając delikatne napowietrzanie. Podczas starzenia wody zmniejsza się zawartość łatwo rozkładających się substancji organicznych. W badaniu międzylaboratoryjnym (3) nie wykazano żadnej różnicy między potencjałem degradacji postarzonych próbek wody morskiej i świeżo pobranych próbek. Przed użyciem wodę morską należy wstępnie oczyścić, usuwając duże cząstki, np. filtrując na filtrze nylonowym albo zgrubnym filtrze papierowym (nie stosować filtrów membranowych ani filtrów GF/C) lub w drodze sedymentacji i dekantacji. W sprawozdaniu należy podać zastosowaną procedurę. Wstępne oczyszczanie należy przeprowadzić po starzeniu wody, jeżeli poddano ją temu procesowi.
Roztwory podstawowe dla mineralnych składników odżywczych
13. Należy przygotować następujące roztwory podstawowe, stosując odczynniki do analiz:
a) Diwodoroortofosforan potasu, KH2PO48,50 g
Monowodoroortofosforan dipotasu, K2HPO421,75 g
Dwuwodny wodoroortofosforan disodu, Na2HPO4∙ 2H2O33,30 g
Chlorek amonu, NH4Cl0,50 g
Rozpuścić i dopełnić do 1 litra wodą destylowaną.
b) Chlorek wapnia, CaCl227,50 g
Rozpuścić i dopełnić do 1 litra wodą destylowaną.
c) Siedmiowodny siarczan magnezu, MgSO4∙ 7H2O22,50 g
Rozpuścić i dopełnić do 1 litra wodą destylowaną.
d) Sześciowodny chlorek żelaza(III), FeCl3∙ 6H2O0,25 g
Rozpuścić i dopełnić do 1 litra wodą destylowaną.
Można uniknąć strącania w roztworze (d), dodając jedną kroplę stężonego HCl albo 0,4 g kwasu etylenodiami-notetraoctowego (EDTA, sól dwusodowa) na litr. Jeżeli w roztworze podstawowym powstanie zawiesina, należy zastąpić go świeżo przygotowanym roztworem.
Przygotowanie środowiska badania
14. Należy dodać 1 ml każdego z powyższych roztworów podstawowych na każdy litr wstępnie oczyszczonej wody morskiej.
Inokulum
15. Nie dodawać konkretnego inokulum w celu uzupełnienia mikroorganizmów już obecnych w wodzie morskiej. Określić (nieobowiązkowo) liczbę organizmów cudzożywnych tworzących kolonie w wodzie morskiej stanowiącej środowisko badania (i najlepiej również w pierwotnych próbkach wody morskiej), np. na podstawie liczby kolonii na agarze morskim. Jest to szczególnie pożądane w przypadku próbek z terenów przybrzeżnych lub zanieczyszczonych. Sprawdzić aktywność mikroorganizmów cudzożywnych w wodzie morskiej, przeprowadzając badanie z substancją odniesienia.
Przygotowanie kolb
16. Upewnić się, czy wszystkie szklane naczynia zostały dokładnie wyczyszczone, chociaż niekoniecznie muszą być one sterylne (np. mieszaniną alkoholu i kwasu chlorowodorowego), opłukane i osuszone przed użyciem, aby uniknąć zanieczyszczenia pozostałościami z poprzednich badań. Kolby należy również oczyścić przed pierwszym użyciem.
17. Badane substancje należy ocenić, używając dwóch kolb równocześnie wraz z pojedynczą kolbą na substancję odniesienia. Wykonać podwójną ślepą próbę, nie zawierającą badanej substancji ani substancji odniesienia, w celu oznaczenia ślepych prób do analizy. Rozpuścić badane substancje w środowisku badania - praktycznie jest dodawać je stosując stężony roztwór podstawowy, aby zapewnić pożądane stężenia początkowe wynoszące normalnie 5-40 mg DOC/l. Zwykle należy badać substancję odniesienia przy początkowym stężeniu odpowiadającym 20 mg DOC/l. W przypadku stosowania roztworów podstawowych badanej substancji lub substancji odniesienia należy upewnić się, czy zasolenie użytej do badania wody morskiej nie uległo znacznej zmianie.
18. Jeżeli można spodziewać się skutków toksycznych lub nie można ich wykluczyć, zalecane byłoby włączenie do projektu badania dwukrotnego eksperymentu z zahamowaniem. Dodać badaną substancję i substancję odniesienia do tego samego naczynia, przy czym, aby umożliwić porównanie, stężenie substancji odniesienia normalnie powinno być takie samo jak w próbie kontrolnej (tj. 20 mg DOC/l).
19. Wprowadzić właściwe ilości roztworów do badań do kolbach Erlenmeyera (dogodna ilość wynosi do około połowy objętości kolby), a następnie każdą kolbę przykryć luźną pokrywą (np. folią aluminiową), która umożliwia wymianę gazów między kolbą a otaczającym ją powietrzem. (Tampony z waty nie są odpowiednie w przypadku stosowania analizy rozpuszczonego węgla organicznego). Naczynia należy umieścić w wytrząsarce i wytrząsać w sposób ciągły w wolnym tempie (np. 100 obrotów na minutę) przez cały czas trwania badania. Kontrolować temperaturę (15-20 °C z dokładnością ± 2 °C) oraz chronić naczynie przed światłem, aby uniknąć wzrostu glonów. Upewnić się, czy powietrze jest wolne od toksycznych substancji.
Fizykochemiczna próba kontrolna (nieobowiązkowa)
20. W przypadku gdy zachodzi podejrzenie degradacji abiotycznej lub występowania mechanizmów prowadzących do strat, takich jak hydroliza (problem dotyczy tylko szczegółowej analizy), parowanie lub adsorpcja, zaleca się wykonanie fizykochemicznej próby kontrolnej. Można ją wykonać dodając chlorek rtęci (II) (HgCl2) 18 (50- 100 mg/l) do naczyń zawierających badaną substancję w celu zatrzymania aktywności mikrobiologicznej. Znaczące obniżenie rozpuszczonego węgla organicznego lub specyficznego stężenia substancji w fizykochemicznym badaniu próby kontrolnej wskazuje na występowanie abiotycznych mechanizmów usuwania. (W przypadku zastosowania chlorku rtęci należy zwrócić uwagę na zakłócenia lub zatrucie katalizatorem w analizie rozpuszczonego węgla organicznego.)
Liczba kolb
21. W typowej analizie stosuje się następujące kolby:
Kolby 1 i 2 zawierające badaną substancję (badana zawiesina);
Kolby 3 i 4 zawierające wyłącznie wodę morską (ślepa próba);
Kolba 5 zawierająca substancję odniesienia (próba kontrolna procedury);
Kolba 6 zawierająca badaną substancję i substancję odniesienia (próba kontrolna toksyczności) - nieobowiązkowa;
Kolba 7 zawierająca badaną substancję i środek sterylizujący (abiotyczna sterylna próba kontrolna) - nieobowiązkowa.
Analiza rozpuszczonego węgla organicznego
22. W trakcie badania należy pobierać próbki do analizy rozpuszczonego węgla organicznego w odpowiednich odstępach czasu (zob. dodatek 1). Próbki należy pobierać zawsze na początku badania (dzień 0) i w 60. dniu badania. Aby opisać przebieg degradacji w czasie, należy pobrać łącznie co najmniej pięć próbek. Nie można określić żadnego ustalonego harmonogramu pobierania próbek, ponieważ tempo biodegradacji jest różne. Należy dwukrotnie wykonać oznaczenie rozpuszczonego węgla organicznego dla każdej próbki.
Pobieranie próbek
23. Wymagana objętość próbek zależy od metody analitycznej (analiza szczegółowa), zastosowanego analizatora węgla i od procedury (filtracja membranowa lub odwirowanie) wybranej w celu obróbki próbek przed oznaczeniem węgla (pkt 25 i 26). Przed pobraniem próbek należy upewnić się, czy środowisko badania jest dobrze wymieszane i czy wszelkie substancje przylegające do ściany kolby zostały rozpuszczone lub znalazły się w zawiesinie.
24. Natychmiast po pobraniu próbek należy je przefiltrować na filtrze membranowym lub odwirować. W razie potrzeby należy przechowywać odfiltrowane lub odwirowane próbki w temperaturze 2-4 °C przez okres do 48 godzin lub w temp. - 18 °C przez dłuższe okresy (jeżeli wiadomo, że w substancji nie nastąpią zmiany, należy zakwasić do pH 2 przed przechowywaniem).
25. Filtry membranowe (0,2-0,45 μm) są odpowiednie, w przypadku gdy upewniono się, że nie przepuszczają węgla ani nie adsorbują substancji podczas filtracji, np. membranowe filtry poliwęglanowe. Niektóre filtry membranowe są impregnowane środkami powierzchniowo czynnymi w celu hydrofilizacji i mogą uwalniać znaczne ilości rozpuszczonego węgla. Filtry takie należy przygotować, wygotowując je trzykrotnie w wodzie dejonizowanej, za każdym razem przez godzinę. Po wygotowaniu filtry należy przechowywać w wodzie dejonizowanej. Odrzucić pierwsze 20 ml filtratu.
26. Odwirowanie próbek można wybrać jako alternatywę dla filtracji mebranowej. Odwirowywać przy 40 000 m/s-2 (~ 4 000 g) przez 15 minut, najlepiej w schłodzonej wirówce.
Uwaga: zróżnicowanie zawartości całkowitego węgla organicznego (TOC) względem rozpuszczonego węgla organicznego (TOC/DOC) przez odwirowanie przy bardzo niskich stężeniach wydaje się nieskuteczne, ponieważ nie zostają usunięte wszystkie bakterie albo węgiel jako składnik plazmy bakteryjnej ponownie się rozpuszcza. Wydaje się, że przy wyższych badanych stężeniach (> 10 mg C na litr) błąd związany z odwirowywaniem jest stosunkowo mały.
Częstotliwość pobierania próbek
27. Jeżeli analizy przeprowadza się natychmiast po pobraniu próbek, czas następnego pobrania próbek należy oszacować na podstawie wyniku oznaczenia analitycznego.
28. Jeżeli próbki zachowuje się (pkt 24) do późniejszej analizy, należy pobrać więcej próbek niż minimalne pięć. Najpierw poddać analizie ostatnie próbki; stopniowa selekcja "wsteczna" właściwych próbek do analizy umożliwia uzyskanie dobrego opisu krzywej biodegradacji przy stosunkowo niewielkiej liczbie oznaczeń analitycznych. Jeżeli do zakończenia badania nie nastąpi żadna degradacja, nie ma potrzeby analizowania dalszych próbek; w tej sytuacji strategia "wsteczna" może przyczynić się do zaoszczędzenia znacznych kosztów związanych z analizami.
29. Jeżeli krzywa degradacji osiąga stan równowagi przed 60 dniem, należy zakończyć badanie. Jeżeli degradacja w oczywisty sposób rozpoczęła się przed 60. dniem, ale nie osiągnęła stanu równowagi, należy przedłużyć eksperyment na kolejny okres.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Opracowanie wyników
30. Wyniki analiz należy wpisać do załączonej karty charakterystyki (dodatek 2) i obliczyć wartości biodegradacji zarówno substancji badanej, jak i substancji odniesienia za pomocą równania:
gdzie:
Dt = degradacja w procentach rozpuszczonego węgla organicznego lub usunięcia konkretnej substancji w czasie t,
Co = stężenie początkowe rozpuszczonego węgla organicznego lub konkretnej substancji w środowisku badania,
Ct = stężenie rozpuszczonego węgla organicznego lub konkretnej substancji w środowisku badania w czasie t,
Cbl(0) = stężenie początkowe rozpuszczonego węgla organicznego lub konkretnej substancji w ślepej próbie,
Cbl(t) = stężenie rozpuszczonego węgla organicznego lub konkretnej substancji w ślepej próbie w czasie t.
31. Degradację podać jako wartość procentową usunięcia rozpuszczonego węgla organicznego (degradacja ostateczna) lub usunięcie konkretnej substancji (degradacja pierwotna) w czasie t. Stężenia rozpuszczonego węgla organicznego obliczać z dokładnością do 0,1 mg na litr, a średnie wartości Dt należy zaokrąglić z dokładnością do pełnego procenta.
32. Przebieg degradacji należy zilustrować graficznie na diagramie, jak pokazano na rys. "Ważność i interpretacja wyników". Jeżeli dostępne są wystarczające dane, z krzywej należy wyznaczyć fazę zwłoki (tL) i czas od zakończenia fazy zwłoki potrzebny do osiągnięcia 50 % usunięcia (t50).
Sprawozdanie z badania
33. Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje: Badana substancja:
- cechy fizyczne, oraz, w stosownych przypadkach, właściwości fizykochemiczne;
- dane dotyczące tożsamości.
Warunki badania:
- lokalizacja i opis pobrania próbki; ocena poziomu zanieczyszczenia i składników odżywczych (liczba drobnoustrojów, azotany, związki amonu, fosforany, w stosownych przypadkach);
- charakterystyka próbki (data pobrania próbki, głębokość, wygląd, temperatura, zasolenie, rozpuszczony węgiel organiczny (nieobowiązkowe), upływ czasu od pobrania do użycia w badaniu;
- metoda (jeśli została zastosowana) do starzenia wody morskiej;
- metoda wstępnego oczyszczania (filtracja/sedymentacja) wody morskiej;
- metoda zastosowana do oznaczenia rozpuszczonego węgla organicznego;
- metoda zastosowana do szczegółowej analizy (nieobowiązkowa);
- metoda zastosowana do oznaczania liczby organizmów cudzożywnych w wodzie morskiej (liczba kolonii lub inna procedura) (nieobowiązkowa);
- inne metody (nieobowiązkowe) zastosowane w celu scharakteryzowania wody morskiej (pomiary ATP itd.).
Wyniki:
- dane analityczne zamieszczone w karcie charakterystyki (dodatek 2);
- przebieg badania degradacji przedstawia się graficznie na wykresie pokazującym fazę zwłoki (tL), kąt nachylenia krzywej i czas (od zakończenia fazy zwłoki) potrzebny do osiągnięcia 50 % usunięcia (t50). Fazę zwłoki można oszacować graficznie, jak pokazano na rysunku w sekcji "Ważność i interpretacja wyników", lub dogodnie przyjąć jako czas potrzebny do osiągnięcia degradacji na poziomie 10 %;
- procentowa degradacja zmierzona po 60 dniach albo na koniec badania.
Omówienie wyników.
Ważność i interpretacja wyników
34. Wyniki otrzymane z zastosowaniem substancji odniesienia, np. benzoesanu sodu, octanu sodu i aniliny, powinny być porównywalne z wynikami otrzymanymi w badaniu międzylaboratoryjnym (3) (należy odnieść się do sekcji "Substancje odniesienia", pkt 7). Jeżeli wyniki otrzymane z zastosowaniem substancji odniesienia są nietypowe, badanie należy powtórzyć, wykorzystując inną próbkę wody morskiej. Choć wyniki badań zahamowania nie zawsze mogą być proste w interpretacji, ponieważ badana substancja stanowi dodatkowe źródło rozpuszczonego węgla organicznego, znaczący spadek tempa usuwania całkowitego rozpuszczonego węgla organicznego, w porównaniu z próbą kontrolną, stanowi dodatnią oznakę skutków toksycznych.
35. W związku z tym, że zastosowane badane stężenia są stosunkowo wysokie w porównaniu z większością naturalnych systemów (i w konsekwencji z niekorzystnym stosunkiem między stężeniem badanych substancji i innych źródeł węgla), metodę tę należy uważać za badanie wstępne, które można wykorzystać do wskazania, czy dana substancja łatwo ulega biodegradacji. Zatem niski wynik niekoniecznie oznacza, że badana substancja nie ulega biodegradacji w środowiskach morskich, lecz wskazuje, że potrzebny będzie większy wkład pracy, aby to ustalić.
Na poniższym rysunku pokazano przykład teoretycznego badania degradacji ilustrujący wykonalny sposób oszacowania wartości tL (długość "fazy zwłoki") i t50 (przedział czasowy, zaczynający się w momencie tL, potrzebny do osiągnięcia usunięcia na poziomie 50 %).
METODA "ZAMKNIĘTEJ BUTLI"
WPROWADZENIE
1. Metoda ta stanowi wariant badania "zamkniętej butli" (5) i została ostatecznie opracowana w wyniku badania międzylaboratoryjnego zorganizowanego dla Komisji Europejskiej przez Danish Water Quality Institute (3).
2. Podobnie jak w przypadku towarzyszącej metody wytrząsania w kolbie z wodą morską, wyniki tego badania nie mają zostać przyjęte jako wskaźniki szybkiej biodegradowalności, ale mają być konkretnie wykorzystywane do uzyskania informacji na temat biodegradowalności substancji w środowiskach morskich.
ZASADA METODY
3. Uprzednio określoną ilość badanej substancji rozpuszcza się w środowisku badania w stężeniu wynoszącym zwykle 2-10 mg badanej substancji na litr (można zastosować jedno stężenie lub więcej). Roztwór przechowuje się w napełnionej zamkniętej butli bez dostępu światła w łaźni stałotemperaturowej lub w obudowie o temperaturze kontrolowanej z dokładnością do ± 1 °C w zakresie 15-20 °C. W przypadkach, w których celem badania jest symulowanie sytuacji środowiskowych, można prowadzić badania poza normalnym zakresem temperatury, pod warunkiem że odpowiednio skoryguje się kontrolę temperatury. Po degradacji następuje 28 dniowy okres analiz tlenu.
4. Badanie międzylaboratoryjne wykazało, że w przypadku gdy badanie przedłużano powyżej 28 dni, nie można było uzyskać żadnych użytecznych informacji, w większości przypadków ze względu na poważne zakłócenia. Wartości biochemicznego zapotrzebowania na tlen (BZT) w ślepej próbie były nadmiernie wysokie, prawdopodobnie ze względu na porosty występujące na ściankach na skutek braku potrząsania, a także w wyniku nitryfikacji. W związku z tym zalecany czas wynosi 28 dni, jeżeli jednak wartość BZT w ślepej próbie pozostaje w granicach 30 % (pkt 15 i 40), badanie można przedłużyć.
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI
5. Aby stwierdzić, czy badanie może zostać zastosowane w odniesieniu do konkretnej substancji, muszą być znane jej niektóre właściwości. Aby obliczyć teoretyczne zapotrzebowanie na tlen (TZT), wymagany jest wzór empiryczny (zob. dodatek 3); w przeciwnym razie należy oznaczyć chemiczne zapotrzebowanie na tlen (ChZT) danej substancji, aby służyło jako wartość odniesienia. Wykorzystanie ChZT jest mniej zadowalające, ponieważ niektóre substancje nie utleniają się całkowicie w badaniu ChZT.
6. Rozpuszczalność substancji powinna wynosić co najmniej 2 mg/l, choć w zasadzie można badać substancje, które są rozpuszczalne w mniejszym stopniu, takie jak substancje lotne (np. stosując działanie ultradźwiękami). Wymagane są informacje na temat czystości lub względnych proporcji głównych składników badanej substancji, aby można było zinterpretować uzyskane wyniki, zwłaszcza gdy wynik jest zbliżony do poziomu akceptacji.
7. Informacje na temat toksyczności badanej substancji w stosunku do bakterii, np. mierzone w krótkich badaniach oddychania (4), mogą być bardzo użyteczne przy wyborze odpowiednich badanych stężeń i mogą mieć istotne znaczenie dla prawidłowej interpretacji niskich wartości biodegradacji. Informacje takie nie zawsze jednak wystarczą, aby dokonać interpretacji wyników uzyskanych w badaniu biodegradacji, więc procedura opisana w pkt 27 jest bardziej odpowiednia.
SUBSTANCJE ODNIESIENIA
8. W celu sprawdzenia aktywności mikroorganizmów w próbce wody morskiej należy zastosować właściwe substancje odniesienia. Anilina, octan sodu i benzoesan sodu to przykłady substancji, które można zastosować w tym celu. Degradacja tych substancji na poziomie co najmniej 60 % (ich TZT) musi zajść w odpowiednio krótkim czasie, w przeciwnym razie zaleca się powtórzenie badania z wykorzystaniem innej próbki wody morskiej.
9. W badaniu międzylaboratoryjnym KE, w którym próbki wody morskiej pobierano w różnych lokalizacjach i o różnych porach roku, faza zwłoki (tL) i czas potrzebny do osiągnięcia degradacji na poziomie 50 % (t50), z wyłączeniem fazy zwłoki, w przypadku benzoesanu sodu wynosiły odpowiednio 0-2 dni i 1-4 dni. W przypadku aniliny wartości tL i t50 wynosiły odpowiednio 0-7 i 2-12 dni.
ODTWARZALNOŚĆ
10. Odtwarzalność tych metod ustalono w badaniu międzylaboratoryjnym KE (3).
OPIS METODY
Aparatura
11. Zwykły sprzęt laboratoryjny oraz:
a) można wykorzystać butle do BZT o pojemności 250-300 ml ze szklanymi korkami lub butlę z cienką szyjką o pojemności 250 ml ze szklanym korkiem;
b) Kilka butli o pojemności 2, 3 i 4 litrów do przygotowania eksperymentu i napełniania butli do BZT;
c) łaźnia wodna lub stała temperatura pokojowa w celu utrzymania stałej temperatury butli (± 1 °C) z wyłączeniem światła;
d) wyposażenie do analizy rozpuszczonego tlenu;
e) Filtry membranowe, 0,2-0,45 μm (nieobowiązkowe);
f) urządzenia do szczegółowej analizy (nieobowiązkowe).
Woda morska
12. Należy pobrać próbkę wody morskiej do dokładnie oczyszczonego pojemnika i przetransportować do laboratorium, najlepiej w ciągu jednego lub dwóch dni od pobrania. Podczas transportu temperatura próbki nie powinna znacząco przekraczać temperatury stosowanej w badaniu.
13. Należy dokładnie zidentyfikować miejsce pobrania próbki i opisać je pod względem poziomu zanieczyszczenia i składników odżywczych. W szczególności w przypadku wód przybrzeżnych lub zanieczyszczonych należy uwzględnić w tej charakterystyce liczbę kolonii drobnoustrojów cudzożywnych i określenie stężeń rozpuszczonych azotanów, związków amonu i fosforanów.
14. W odniesieniu do samej próbki wody morskiej należy podać następujące informacje:
- data pobrania;
- głębokość pobrania;
- wygląd próbki - mętna itd.;
- temperatura w czasie pobrania;
- zasolenie;
- rozpuszczony węgiel organiczny (DOC);
- upływ czasu między pobraniem i wykorzystaniem w badaniu.
15. Jeżeli zawartość rozpuszczonego węgla organicznego w próbce okaże się duża lub jeżeli uzna się, że BZT ślepej próby po 28 dniach wynosiłoby więcej niż 30 % BZT substancji odniesienia, zaleca się starzenie wody morskiej co najmniej przez tydzień.
16. Podczas starzenia wodę przechowywać w warunkach tlenowych w temperaturze badania i bez dostępu światła lub w rozproszonym świetle. W razie potrzeby należy utrzymać warunki tlenowe zapewniając delikatne napowietrzanie. Podczas starzenia wody zmniejsza się zawartość łatwo rozkładających się substancji organicznych. W badaniu międzylaboratoryjnym (3) nie wykazano żadnej różnicy między potencjałem degradacji postarzonych próbek wody morskiej i świeżo pobranych próbek.
17. Przed użyciem należy wstępnie oczyścić wodę morską, usuwając duże cząstki, np. filtrując przez filtr nylonowy lub przez zgrubny filtr papierowy (nie przez filtry membranowe lub filtry GF/C) bądź stosując sedymentację i dekantację. Zastosowaną procedurę należy podać w sprawozdaniu. Wstępne oczyszczanie należy przeprowadzić po starzeniu wody, jeżeli ta procedura została zastosowana.
Roztwory podstawowe dla mineralnych składników odżywczych
18. Przygotować następujące roztwory podstawowe, stosując odczynniki do analiz.
a) Diwodoroortofosforan potasu, KH2PO48,50 g
Monowodoroortofosforan dipotasu, K2HPO421,75 g
Dwuwodny wodoroortofosforan disodu, Na2HPO4
2H2O33,30 g
Chlorek amonu, NH4Cl0,50 g
Rozpuścić i dopełnić do 1 litra wodą destylowaną.
b) Chlorek wapnia, CaCl227,50 g
Rozpuścić i dopełnić do 1 litra wodą destylowaną.
c) Siedmiowodny siarczan magnezu, MgSO47H2O22,50 g
Rozpuścić i dopełnić do 1 litra wodą destylowaną.
d) Sześciowodny chlorek żelaza(III), FeCl36H2O0,25 g
Rozpuścić i dopełnić do 1 litra wodą destylowaną.
Można uniknąć strącania w roztworze d), dodając jedną kroplę stężonego HCl albo 0,4 g kwasu etylenodiami-notetraoctowego (EDTA, sól dwusodowa) na litr. Jeżeli w roztworze podstawowym powstanie zawiesina, należy zastąpić go świeżo przygotowanym roztworem.
Przygotowanie środowiska badania
19. Należy dodać 1 ml każdego z powyższych roztworów podstawowych na każdy litr wstępnie oczyszczonej wody morskiej. Należy nasycić środowisko badania powietrzem o temperaturze badania, napowietrzając je w tym celu czystym sprężonym powietrzem przez około 20 minut. Należy oznaczyć stężenie rozpuszczonego tlenu do celów kontrolnych. Nasycone stężenie rozpuszczonego tlenu, będące funkcją zasolenia i temperatury, można odczytać z nomogramu dołączonego do niniejszej metody badawczej (dodatek 4).
Inokulum
20. Nie dodawać konkretnego inokulum w celu uzupełnienia mikroorganizmów już obecnych w wodzie morskiej. Należy określić (nieobowiązkowo) liczbę organizmów cudzożywnych tworzących kolonie w środowisku badania z wody morskiej (a najlepiej również w początkowej próbce wody morskiej), np. przez liczba kolonii na agarze morskim. Jest to szczególnie pożądane w przypadku próbek z terenów przybrzeżnych lub zanieczyszczonych. Sprawdzić aktywność mikroorganizmów cudzożywnych w wodzie morskiej, przeprowadzając badanie z substancją odniesienia.
Przygotowanie butelek badawczych
21. Przeprowadzić wszystkie niezbędne operacje, w tym starzenie i wstępne oczyszczanie wody morskiej w wybranej temperaturze badania wynoszącej 15-20 °C, zapewniając czystość, ale nie sterylność wszystkich naczyń szklanych.
22. Przygotować grupy butli do BZT w celu oznaczenia biochemicznego zapotrzebowania na tlen substancji badanej i substancji odniesienia w równoległych seriach doświadczalnych. Wszystkie analizy należy wykonywać w duplikacie (ślepe próby, substancja odniesienia i substancja badana), tj. dla każdego oznaczenia należy przygotować po dwie butle. Wykonać analizy co najmniej w dniach 0, 5, 15 i 28 (cztery oznaczenia). W przypadku analiz tlenu dla potrzeb czterech oznaczeń wymagana jest całkowita liczb butli 3 × 2 × 4 = 24 (ślepe próby, substancja odniesienia i substancja badana), czyli około 8 litrów środowiska badania (dla jednego stężenia badanej substancji).
23. Przygotować oddzielne roztwory substancji badanej i substancji odniesienia w dużych butlach o wystarczającej objętości (pkt 11), najpierw dodając substancję badaną i substancję odniesienia, bezpośrednio lub z wykorzystaniem stężonego roztworu podstawowego, do częściowo napełnionych dużych butli. Dodać większą ilość środowiska badania w celu uzyskania ostatecznego żądanego stężenia. Jeżeli stosuje się roztwory podstawowe badanej substancji lub substancji odniesienia, upewnić się, czy zasolenie środowisko wody morskiej nie uległo znacznej zmianie.
24. Wybrać stężenia badanej substancji i substancji odniesienia, uwzględniając:
a) rozpuszczalność tlenu w wodzie morskiej w warunkach występujących w badaniu temperatury i zasolenia (zob. nomogram w dodatku 4);
b) ślepą próbę BZT wody morskiej; oraz
c) oczekiwaną biodegradowalność badanej substancji.
25. W temperaturze 15 °C i 20 °C oraz przy zasoleniu (woda oceaniczna) wynoszącym 32 cząstki na 1 000 rozpuszczalność tlenu wynosi odpowiednio około 8,1 i 7,4 mg/l. Jeżeli woda morska nie jest postarzona, zapotrzebowanie na tlen w samej wodzie morskiej (oddychanie w ślepej próbie) może wynosić 2 mg O2/l lub więcej. W związku z tym, aby zapewnić znaczące stężenie tlenu po utlenieniu badanej substancji, należy wykorzystać stężenie początkowe badanej substancji, wynoszące około 2-3 mg/l (w zależności od TZT) w przypadku substancji, które mają ulec całkowitej degradacji w warunkach badania (takich jak substancje odniesienia). Słabo rozpuszczalne substancje należy badać w wyższych stężeniach, do około 10 mg/l, pod warunkiem że nie występują skutki toksyczne. Korzystne może być przeprowadzenie badań równoległych z niskim (około 2 mg/l) i wysokim (około 10 mg/l) stężeniem badanej substancji.
26. Należy równolegle oznaczyć ślepą próbę tlenową w butlach niezawierających ani substancji badanej, ani substancji odniesienia.
27. W celu oznaczenia działania hamującego należy przygotować następujące serie roztworów w oddzielnych dużych butlach (pkt 13):
a) 2 mg na litr substancji ulegającej łatwo degradacji, np. którejkolwiek ze wspomnianych substancji odniesienia;
b) x mg na litr badanej substancji (x zwykle wynosi 2);
c) 2 mg na litr łatwo rozkładającej się substancji plus x mg na litr badanej substancji.
Fizykochemiczna próba kontrolna (nieobowiązkowa)
28. Jeżeli wykorzystuje się opcję szczegółowych analiz, można przeprowadzić badanie fizykochemiczne w celu sprawdzenia, czy badana substancja jest usuwana w wyniku mechanizmów abiotycznych, takich jak hydroliza i adsorpcja. Fizykochemiczną próbę kontrolną można wykonać dodając chlorek rtęci(II) (HgCl2) 19 (50-100 mg/l) do kolb w duplikacie zawierających badaną substancję w celu zatrzymania aktywności mikrobiologicznej. Znaczące obniżenie specyficznego stężenia substancji w trakcie badania wskazuje na występowanie abiotycznych mechanizmów usuwania.
Liczba butli do badania BZT w typowej analizie
29. W typowej analizie stosuje się następujące butle:
- co najmniej 8 butli zawierających badaną substancję;
- co najmniej 8 butli zawierających samą wodę morską wzbogaconą o składniki odżywcze;
- co najmniej 8 butli zawierających substancję odniesienia oraz, w razie potrzeby,
- 6 butli zawierających substancję badaną i substancję odniesienia (próby kontrolne toksyczności).
PROCEDURA
30. Po przygotowaniu natychmiast zasyfonować każdy roztwór z dolnej ćwiartki (nie z dna) właściwej dużej butli w celu napełnienia odpowiedniej grupy butli do badania BZT. Należy natychmiast przeprowadzić analizę zerowych prób kontrolnych (czas zero) pod kątem zawartości rozpuszczonego tlenu (pkt 33) lub zachować je w celu dalszej analizy chemicznej przez strącenie za pomocą MnCl2 (chlorek manganu(II)) i NaOH (wodorotlenek sodu).
31. Pozostałe równoległe butle do badania BZT należy inkubować w temperaturze badania (15-20 °C), przechowywać bez dostępu światła i usuwać z miejsca inkubacji w odpowiednich odstępach czasu (np. co najmniej po 5, 15 i 28 dniach), wykonując analizę na zawartość rozpuszczonego tlenu (pkt 33).
32. W celu przeprowadzenia szczegółowych analiz (nieobowiązkowe) należy poddać próbki filtracji na filtrze membranowym (0,2-0,45 μm) lub odwirowywać je przez 15 minut. Przechowywać próbki przez okres nie dłuższy niż 48 godzin w temperaturze 2-4 °C lub przez dłuższe okresy w temperaturze - 18 °C, jeżeli analiza nie jest wykonywana natychmiast (jeżeli wiadomo, że w badanej substancji nie nastąpią zmiany, należy zakwasić ją do pH 2 przed przechowywaniem).
Oznaczenie rozpuszczonego tlenu
33. Stężenie rozpuszczonego tlenu należy oznaczyć metodą chemiczną lub elektrochemiczną, uznaną na poziomie krajowym lub międzynarodowym.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Opracowanie wyników
34. Wyniki analiz należy wpisać do załączonej karty charakterystyki (dodatek 5).
35. Obliczyć biochemiczne zapotrzebowanie na tlen jako różnicę w ubytku tlenu między ślepą próbą i roztworem badanej substancji w warunkach badania. Podzielić ubytek tlenu netto przez stężenie (w/v) substancji w celu wyrażenia biochemicznego zapotrzebowania na tlen jako mg BZT na mg badanej substancji. Degradację określa się jako stosunek biochemicznego zapotrzebowania na tlen najlepiej do teoretycznego zapotrzebowania na tlen (TZT) albo do chemicznego zapotrzebowaniem na tlen (ChZT) i wyraża jako procent (zob. pkt 36).
36. Obliczyć wartości biodegradacji dla każdego czasu pobrania próbek zarówno dla substancji badanej, jak i dla substancji odniesienia za pomocą jednego z równań:
% biodegradacji=
% biodegradacji=
gdzie:
TZT = teoretyczne zapotrzebowanie na tlen (obliczenia w dodatku 3)
ChZT = chemiczne zapotrzebowanie na tlen oznaczone doświadczalnie.
Uwaga: niekiedy te dwa sposoby obliczania (procent TZT lub procent ChZT) nie dają takich samych wyników; lepiej jest stosować TZT, ponieważ w badaniu ChZT niektóre substancje nie utleniają się całkowicie.
37. Przebieg degradacji należy zilustrować graficznie na diagramie (zob. przykład w sekcji "Ważność i interpretacja wyników"). Jeżeli dostępne są wystarczające dane, z krzywej biodegradacji należy wyznaczyć fazę zwłoki (tL) i czas od zakończenia fazy zwłoki (t50) potrzebny do osiągnięcia 50 % usunięcia.
38. Jeżeli stosuje się szczegółową analizę (nieobowiązkową), należy podać procent pierwotnej degradacji jako procent usuwania konkretnej substancji w czasie trwania badania (skorygowany dla celów analitycznej próby ślepej).
Sprawozdanie z badania
39. Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje: Badana substancja:
- cechy fizyczne, oraz, w stosownych przypadkach, właściwości fizykochemiczne;
- dane dotyczące tożsamośći. Warunki badania:
- lokalizacja i opis pobrania próbki; ocena poziomu zanieczyszczenia i składników odżywczych (liczba kolonii, azotany, związki amonu, fosforany, w stosownych przypadkach);
- charakterystyka próbki (data pobrania próbki, głębokość, wygląd, temperatura, zasolenie, rozpuszczony węgiel organiczny (nieobowiązkowe), upływ czasu od pobrania do użycia w badaniu);
- metoda (jeśli została zastosowana) do starzenia wody morskiej;
- metoda wstępnego oczyszczania (filtracja/sedymentacja) wody morskiej;
- metoda oznaczania ChZT (jeżeli zostało wykonane);
- metoda pomiarów tlenu;
- procedura dyspersji w przypadku substancji, które są trudno rozpuszczalne w warunkach badania;
- metoda zastosowana do oznaczania liczby organizmów cudzożywnych w wodzie morskiej (liczba drobnoustrojów lub inna procedura);
- metoda zastosowana do oznaczania rozpuszczonego węgla organicznego w wodzie morskiej (nieobowiązkowe);
- metoda zastosowana do szczegółowej analizy (nieobowiązkowa);
- inne nieobowiązkowe metody zastosowane w celu scharakteryzowania wody morskiej (pomiary ATP itd.). Wyniki:
- dane analityczne zamieszczone w karcie charakterystyki (załączonej w dodatku 5);
- przebieg badania degradacji przedstawiony graficznie na diagramie pokazującym fazę zwłoki (tL), kąt nachylenia krzywej i czas (od zakończenia fazy zwłoki) potrzebny do osiągnięcia 50 % ostatecznej absorpcji tlenu spowodowanej utlenianiem badanej substancji (t50). Fazę zwłoki można oszacować graficznie, jak pokazano na załączonym rysunku, lub odpowiednio przyjąć jako czas potrzebny do osiągnięcia degradacji na poziomie 10 %;
- procent degradacji zmierzony po 28 dniach. Omówienie wyników.
Ważność i interpretacja wyników
40. Samo oddychanie w ślepej próbie nie powinno przekroczyć zużycia 30 % tlenu w butelce badawczej. Jeżeli nie można spełnić tego kryterium przy użyciu świeżo pobranej wody morskiej, wodę morską należy przed wykorzystaniem poddać procesowi starzenia (ustabilizować).
41. Należy uwzględnić możliwość, że substancje zawierające azot mogą wpłynąć na wyniki.
42. Wyniki otrzymane w przypadku substancji odniesienia, tj. benzoesanu sodu i aniliny, powinny być porównywalne z wynikami otrzymanymi w badaniu międzylaboratoryjnym (3) (pkt 9). Jeżeli wyniki otrzymane z zastosowaniem substancji odniesienia są nietypowe, badanie należy powtórzyć, wykorzystując inną próbkę wody morskiej.
43. Badaną substancję można uznać za hamującą rozwój bakterii (przy zastosowanym stężeniu), jeżeli biochemiczne zapotrzebowanie na tlen w mieszaninie substancji odniesienia i substancji badanej wynosi mniej niż suma biochemicznego zapotrzebowania na tlen w oddzielnych roztworach tych dwóch substancji.
44. W związku z tym, że badane stężenia są stosunkowo wysokie w porównaniu do większości naturalnych systemów, a w konsekwencji stosunek stężenia badanych substancji do innych źródeł węgla jest niekorzystny, metodę tę należy uważać za badanie wstępne, które można wykorzystać jako wskazanie, czy dana substancja łatwo ulega biodegradacji. Zatem niski wynik niekoniecznie oznacza, że badana substancja nie ulega biodegradacji w środowiskach morskich, lecz wskazuje, że potrzeba będzie więcej pracy, aby to ustalić.
Poniżej podano przykład teoretycznego eksperymentu z degradacją, ilustrujący wykonalny sposób oszacowania wartości tL (długość "fazy zwłoki") i przedziału czasowego t50 (rozpoczynającego się w momencie tL) potrzebny do osiągnięcia 50 %, ostatecznej absorpcji tlenu spowodowanej utlenianiem badanej substancji:
BIBLIOGRAFIA
(1) de Kreuk J.F. i Hanstveit A.O. (1981). Determination of the biodegradability of the organic fraction of chemical wastes. Chemosphere, 10 (6); 561-573.
(2) Rozdział C.4-B niniejszego załącznika: Oznaczenie szybkiej biodegradowalności, część III zmodyfikowanego badania przesiewowego OECD.
(3) Nyholm N. i Kristensen P. (1987). Screening Test Methods for Assessment of Biodegradability of Chemical Substances in Seawater. Sprawozdanie końcowe z programu badań międzylaboratoryjnych 1984-1985, marzec 1987, Komisja Wspólnot Europejskich.
(4) Rozdział C.11 niniejszego załącznika: Biodegradacja - osad czynny, badanie hamowania oddychania.
(5) Rozdział C.4-E niniejszego załącznika: Oznaczenie szybkiej biodegradowalności, część VI. Badanie metodą zamkniętej butli.
Dodatek 1
Oznaczanie węgla organicznego w wodzie morskiej
METODA WYTRZĄSANIA W KOLBIE
W celu oznaczenia węgla organicznego w próbce wody związki organiczne w próbce utlenia się do dwutlenku węgla, stosując zwykle jedną z następujących trzech technik:
- utlenianie na mokro nadsiarczanem/promieniowaniem UV;
- utlenianie na mokro nadsiarczanem/w podwyższonej temperaturze (116-130 °C);
- spalanie.
Powstały CO2 oznacza się, stosując spektrofotometrię w podczerwieni lub miareczkowanie. Ewentualnie redukuje się CO2 do metanu, który oznacza się w detektorze płomienno-jonizacyjnym.
Metodę oznaczania nadsiarczanem/promieniowaniem UV stosuje się powszechnie do analizy "czystej" wody z małą zawartością cząstek stałych. Te dwie ostatnie metody można stosować w przypadku większości rodzajów próbek wody, przy czym metoda utleniania nadsiarczanem/w podwyższonej temperaturze jest najodpowiedniejsza w odniesieniu do próbek niskopoziomowych, a technikę spalania stosuje się do próbek o zawartości nielotnego węgla organicznego przewyższającej znacznie 1 mg C/l.
Zakłócenia
Wszystkie trzy metody są zależne od wydzielania lub kompensowania węgla nieorganicznego obecnego w próbce. Oczyszczanie zakwaszonej próbki z CO2 to najczęściej stosowana metoda eliminowania węgla nieorganicznego, choć prowadzi to również do straty lotnych związków organicznych (1). Należy zapewnić całkowite wyeliminowanie lub skompensowanie węgla nieorganicznego dla matrycy każdej próbki, a lotny węgiel organiczny należy oznaczyć wraz z nielotnym węglem organicznym, w zależności od rodzaju próbki.
Wysokie stężenia chloru prowadzą do obniżenia efektywności utleniania w przypadku stosowania metody z nadsiarczanem/promieniowaniem UV (2). Zastosowanie odczynnika utleniającego zmodyfikowanego dodatkiem azotanu rtęci(II) może jednak wyeliminować to zakłócenie. Zaleca się zastosowanie maksymalnej tolerowanej objętości próbki w celu dokonania oceny każdego rodzaju próbki zawierającej chlor. Wysokie stężenia soli w próbce poddanej analizie metodą spalania mogą spowodować pokrywanie katalizatora solą i nadmierne działanie żrące w rurze do spalań. Należy podjąć środki ostrożności zgodnie z instrukcją obsługi producenta.
Próbki o dużej mętności, jak również próbki zawierające cząstki stałe, można utlenić w sposób niepełny, stosując metodę z nadsiarczanem/promieniowaniem UV.
Przykład odpowiedniej metody
Nielotny węgiel organiczny oznacza się przez utlenianie nadsiarczanem/ promieniowaniem UV, a następnie ilościowe oznaczenie wydzielonego CO2 za pomocą bezdyspersyjnej spektrometrii w podczerwieni.
Odczynnik utleniający modyfikuje się zgodnie z sugestiami podanymi w (2), jak opisano w instrukcji obsługi producenta:
a) 8,2 g HgCl2 i 9,6 g Hg(NO3)2H2O rozpuszcza się w kilkuset mililitrach wody odczynnikowej o niskim stężeniu węgla;
b) 20 g K2S2O8 rozpuszcza się w roztworze z solą rtęci;
c) do mieszaniny dodaje się 5 ml HNO3 (stężonego);
d) odczynnik rozcieńcza się do 1 000 ml;
Zakłócenie spowodowane przez chlor eliminuje się, stosując objętość próbki 40 μl w przypadku 10 % chlorku i objętość próbki 200 μl w przypadku 1,9 % chlorku. Próbki o wysokich stężeniach chlorku lub większej objętości można analizować tą metodą, pod warunkiem że zapobiega się akumulacji chlorku w naczyniu do utleniania. Następnie można dokonać w razie potrzeby oznaczenia lotnego węgla organicznego w odniesieniu do danego typu próbki.
BIBLIOGRAFIA
(1) ISO, Water quality - determination of total organic carbon. Draft International Standard ISO/DIS 8245, 16 stycznia 1986 r.
(2) Amerykańskie Stowarzyszenia Zdrowia Publicznego (APHA), Standard Methods for the Estimation of Water and Wastewater. Amerykańskie Stowarzyszenie Przedsiębiorstw Wodnych (AWWA) oraz Federacja Kontroli Zanieczyszczeń Wód, wydanie 16., 1985.
Również istotne (przedstawia opis systemu autoanalizy):
(3) Schreurs W. (1978). An automated colorimetric method for the determination of dissolved organic carbon in seawater by UV destruction. Hydrobiological Bulletin 12, 137-142.
Dodatek 2
Biodegradacja w wodzie morskiej
METODA WYTRZĄSANIA W KOLBIE KARTA CHARAKTERYSTYKI
1. LABORATORIUM:
2. DATA ROZPOCZĘCIA BADANIA:
3. BADANA SUBSTANCJA: Nazwa:
Stężenie roztworu podstawowego: mg/l jako substancja
Początkowe stężenie, w pożywce t0: mg/l jako substancja
: mg rozpuszczonego węgla organicznego/l
4. WODA MORSKA:
Źródło:
Data pobrania:
Głębokość pobrania:
Wygląd w momencie pobrania (np. mętna itd.):
Zasolenie w momencie pobrania: ‰
Temperatura w momencie pobrania: °C
rozpuszczony węgiel organiczny po "x" godzinach od pobrania: mg/l
Wstępna obróbka przed badaniem (np. filtrowanie, sedymentacja, starzenie itp.):
Liczba kolonii - próbka oryginalna: kolonie/ml
- na początku badania: kolonie/ml Inne cechy charakterystyczne:
5. OZNACZENIA WĘGLA:
Analizator węgla:
| Kolba nr | rozpuszczony węgiel organiczny po n dniach (mg/l) | ||||||
| 0 | n1 | n2 | n3 | x | |||
| Badanie: woda morska wzmocniona składnikami odżywczymi z badaną substancją | 1 | a1 | |||||
| a2 | |||||||
| średnia, Ca(t) | |||||||
| 2 | b1 | ||||||
| b2 | |||||||
| średnia, Cb(t) | |||||||
| Ślepa próba: woda morska wzmocniona składnikami odżywczymi bez badanej substancji | 1 | c1 | |||||
| c2 | |||||||
| średnia, Cc(t) | |||||||
| 2 | d1 | ||||||
| d2 | |||||||
| średnia, Cd(t) | |||||||
średnia,  | |||||||
6. OCENA DANYCH PIERWOTNYCH:
| Nr kolby | Obliczanie wyników | % degradacji po n dniach | ||||
| 0 | n1 | n2 | n3 | nx | ||
| 1 |  | 0 | ||||
| 2 |  | 0 | ||||
| średnia arytmetyczna (*) |  | 0 | ||||
| (*) Nie należy uśredniać D1 i D2, jeżeli istnieje między nimi znacząca różnica. |
Uwaga: podobne wzory można zastosować, gdy po degradacji wykonywana jest szczegółowa analiza oraz w przypadku substancji odniesienia i prób kontrolnych toksyczności.
7. DEGRADACJA ABIOTYCZNA (nieobowiązkowa)
| Czas (dni) | ||
| 0 | t | |
| stężenie rozpuszczonego węgla organicznego (mg/l) w sterylnych próbach kontrolnych | CS(0) | CS(t) |
% degradacji abiotycznej = 
Dodatek 3
Obliczanie teoretycznego biochemicznego zapotrzebowania na tlen
METODA "ZAMKNIĘTEJ BUTLI"
TZT substancji CcHhClclNnNanaOoP Ss o masie cząsteczkowej MW oblicza się zgodnie z:
Obliczenie to sugeruje, że C ulega mineralizacji do CO2, H do H2O, P do P2O5 a Na do Na2O Halogen zostaje usunięty jako halogenowodór, a azot jako amoniak.
Przykład:
Glukoza C6H12O6, MW = 180
1,07 mgO2/mg glukozy
Masy cząsteczkowe soli innych niż sole metali alkalicznych oblicza się przy założeniu, że sole uległy hydrolizie.
Zakłada się, że siarka utlenia się do siarki sześciowartościowej.
Przykład:
n-dodecylobenzenosulfonian sodu C18H29SO3Na, MW = 348
2,34 mgO2/mg substancji
W przypadku substancji zawierających azot można go usunąć jako amoniak, azotyn lub azotan, odpowiadający różnym biochemicznym zapotrzebowaniom na tlen.
Załóżmy, że w przypadku amin drugorzędowych analiza wykazała pełne tworzenie się azotanów: (C12H25)2 NH, MW = 353
=3,44 mgO2/mg substancji
Dodatek 4
Dodatek 5
Biodegradacja w wodzie morskiej
METODA "ZAMKNIĘTEJ BUTLI"
KARTA CHARAKTERYSTYKI
1. LABORATORIUM:
2. DATA ROZPOCZĘCIA BADANIA:
3. BADANA SUBSTANCJA:
Nazwa:
Stężenie roztworu podstawowego: mg/l
Stężenie początkowe w środowisku wody morskiej: mg/l
TZT lub ChZT mg O2/mg substancji badanej
4. WODA MORSKA:
Źródło:
Data pobrania:
Głębokość pobrania:
Wygląd w momencie pobrania (np. mętna itd.):
Zasolenie w momencie pobrania: ‰
Temperatura w momencie pobrania: °C
rozpuszczony węgiel organiczny po "x" godzinach od pobrania: mg/l
Wstępna obróbka przed badaniem (np. filtrowanie, sedymentacja, starzenie itp.):
Liczba kolonii - próbka oryginalna: kolonie/ml
- na początku badania: kolonie/ml
Inne cechy charakterystyczne:
5. ŚRODOWISKO BADANIA:
Temperatura po napowietrzeniu: °C
Stężenie O2 po napowietrzeniu i sytuacja przed rozpoczęciem badania: mg O2/l
6. OZNACZENIE STĘŻENIA ROZPUSZCZONEGO TLENU:
Metoda: Winkler/elektrodowa
| Kolba nr | mg O2/l po n dniach | |||||
| 0 | 5 | 15 | 28 | |||
| Badanie: woda morska wzmocniona składnikami odżywczymi z badaną substancją | 1 | a1 | ||||
| 2 | a2 | |||||
| Średnia arytmetyczna badania |  | |||||
| Ślepa próba: składnik odżywczy - zanieczyszczona woda morska, bez badanej substancji | 1 | c1 | ||||
| 2 | c2 | |||||
| średnia arytmetyczna ślepej próby |  | |||||
Uwaga: podobny wzór może być stosowany dla substancji odniesienia i prób kontrolnych toksyczności.
7. ZANIKANIE STĘŻENIA ROZPUSZCZONEGO TLENU: % DEGRADACJI:
| Zanikanie stężenia rozpuszczonego tlenu po n dniach |
| 5 | 15 | 28 | |
| (mb - mt) (1) | |||
 |
| (1) Zakłada się, że mb(o) = mt(o), przy czym mb(o) = wartość ślepej próby w dniu 0, mt(o) = wartość badanej substancji w dniu 0. Jeżeli mb(o) nie jest równe mt(o), zastosować (mt(o) - mt(x)) - (mb(o) - mb(x)), przy czym mb(x) = wartość ślepej próby w dniu x, mt(x) = wartość badanej substancji w dniu x. |
C.43. BIODEGRADOWALNOŚĆ BEZTLENOWA SUBSTANCJI ORGANICZNYCH W PRZEFERMEN-TOWANYM OSADZIE: ZA POMOCĄ POMIARU WYTWARZANEGO GAZU
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna z wytyczną OECD nr 311 (2006 r.) w sprawie badań. Istnieje wiele badań umożliwiających ocenę biodegradowalności tlenowej substancji organicznych (metody badawcze C.4, C.9, C.10, i C.11 (1) oraz wytyczna OECD nr 302C w sprawie badań (2)), a wyniki ich stosowania wykorzystano z powodzeniem w celu przewidywania losów substancji w środowisku aerobowym, w szczególności podczas tlenowych etapów oczyszczania ścieków. Tlenowemu rozkładowi ulegają również w różnych proporcjach substancje nierozpuszczalne w wodzie, jak również te, które ulegają adsorbcji na substancjach stałych w ściekach, ponieważ występują w zdekantowanych ściekach. Większe frakcje tych substancji są jednak związane ze wstępnie osadzonym osadem, który jest oddzielony od surowych ścieków w osadnikach zanim zdekantowane ścieki, czyli supernatant, zostaną poddane oczyszczaniu w warunkach aerobowych. Osad zawierający niektóre substancje rozpuszczalne w płynie porowym przekierowuje się do podgrzewanych komór fermentacyjnych w celu poddania ich procesowi fermentacji beztlenowej. Na razie w tej serii nie ma badań umożliwiających ocenę biodegradowalności beztlenowej w beztlenowych komorach fermentacyjnych i niniejsze badanie zaprojektowano, aby wypełnić tę lukę; nie musi ono mieć zastosowania do innych beztlenowych elementów środowiska.
2. W celu oceny biodegradowalności beztlenowej zastosowano z powodzeniem metody respirometryczne wykorzystywane do pomiaru ilości wytworzonego gazu, głównie metanu (CH4) i dwutlenku węgla (CO2) w warunkach beztlenowych. Birch et al (3) dokonali przeglądu tych procedur i doszli do wniosku, że prace Sheltona i Tiedje (4) oparte na wcześniejszych badaniach (5)(6)(7) były najbardziej wyczerpujące. Metoda (4), nad którą inni kontynuowali prace (8) i która stała się amerykańską normą (9)(10), nie rozwiązywała problemów związanych z różną rozpuszczalnością CO2 i CH4 w środowisku badania i z obliczaniem teoretycznego wytwarzania gazu przez badaną substancję. W raporcie ECETOC (3) zalecono dodatkowy pomiar zawartości rozpuszczonego węgla nieorganicznego w supernatancie, co sprawiło, że technika ta znalazła szersze zastosowanie. Metoda ECETOC została poddana międzynarodowej próbnej kalibracji (badaniu międzylaborato-ryjnemu) i stała się normą ISO 11734 (11).
3. Niniejsza metoda badawcza, oparta na normie ISO 11734 (11), opisuje metodę badania przesiewowego mającego na celu ocenę potencjalnej beztlenowej biodegradowalności substancji organicznych w szczególnych warunkach (tj. w beztlenowej komorze fermentacyjnej w danym czasie i danym zakresie stężenia mikroorganizmów). Ponieważ rozcieńczony osad jest stosowany przy stosunkowo wysokim stężeniu badanej substancji, a czas trwania badania jest zwykle dłuższy niż czas retencji w beztlenowych komorach fermentacyjnych, warunki badania niekoniecznie muszą odpowiadać warunkom panującym w beztlenowych komorach fermentacyjnych i nie mają też zastosowania do oceny biodegradowalności beztlenowej substancji organicznych w innych warunkach środowiskowych. Osad poddaje się narażeniu na działanie badanej substancji przez okres do 60 dni, co przekracza zwykły czas retencji osadu (25-30 dni) w beztlenowych komorach fermentacyjnych, choć czas retencji w obiektach przemysłowych może być znacznie dłuższy. Nie można sformułować równie przekonujących prognoz na podstawie wyników tego badania jak w przypadku biodegradacji tlenowej, ponieważ zgromadzone dowody dotyczące zachowania substancji badanych w "szybkich" badaniach tlenowych i w badaniach symulacyjnych oraz w środowisku tlenowym wystarczają, aby mieć pewność, że istnieje powiązanie; w przypadku środowiska beztlenowego istnieje niewiele podobnych dowodów. Można założyć, że całkowita biodegradacja beztlenowa zachodzi wówczas, gdy teoretyczne wytwarzanie gazu osiągnie poziom 75-80 %. Wysokie wartości stosunku substancji do biomasy zastosowane w niniejszym badaniu oznaczają, że substancja, która przechodzi dalej, będzie bardziej podatna na degradację w beztlenowej komorze fermentacyjnej. Ponadto substancje, które nie przekształcą się w gaz podczas badania, nie muszą wcale utrzymywać się przy wartościach stosunku substancji do biomasy w bardziej realnych warunkach środowiskowych. Zachodzą również inne reakcje beztlenowe, w których substancje mogą ulec co najmniej częściowej degradacji, np. w wyniku odchlorowania, jednak w tym badaniu nie wykrywa się takich reakcji. Stosując specjalne metody analityczne w celu oznaczenia badanej substancji, można jednak monitorować jej zniknięcie (zob. pkt 6, 30, 44 i 53).
ZASADA BADANIA
4. Wypłukany przefermentowany osad 20 zawierający niskie (< 10 mg/l) stężenia węgla nieorganicznego rozcieńcza się w przybliżeniu dziesięciokrotnie do całkowitego stężenia zawiesiny ogólnej 1 g/l-3 g/l i inkubuje w temperaturze 35 °C ± 2 °C w szczelnie zamkniętych naczyniach z badaną substancją w stężeniu 20-100 mg C/l przez okres co najmniej 60 dni. Uwzględnia się pomiar aktywności osadu wykonując równoległe ślepe próby kontrolne, w których w środowisku badania znajduje się inokulum z osadu, ale bez badanej substancji.
5. Mierzy się wzrost ciśnienia fazy gazowej w naczyniach związany z wytwarzaniem dwutlenku węgla i metanu. W warunkach badania znaczna część wytworzonego CO2 zostanie rozpuszczona w fazie ciekłej albo przekształcona w węglan lub wodorowęglan. Na końcu badania mierzy się zawartość węgla nieorganicznego.
6. Ilość węgla (nieorganicznego plus metanu) powstałego w wyniku biodegradacji badanej substancji oblicza się na podstawie ilości netto wytworzonego gazu i ilości netto węgla nieorganicznego powstałego w fazie ciekłej przekraczającej wartości w ślepych próbach kontrolnych. Zakres biodegradacji oblicza się na podstawie całkowitej ilości wytworzonego węgla nieorganicznego i węgla metanowego wyrażonej jako procent zmierzonej lub obliczonej ilości węgla dodanego jako badana substancja. Można śledzić przebieg biodegradacji, wykonując pośrednie pomiary samego wytwarzania gazu. Ponadto pierwotną biodegradację można oznaczyć, wykonując szczegółowe analizy na początku i na końcu badania.
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI
7. Aby dokonać prawidłowej interpretacji wyników, należy znać cechy charakterystyczne badanej substancji, takie jak czystość, rozpuszczalność w wodzie, lotność i adsorpcja. Zawartość węgla organicznego (% w/w) badanej substancji musi być poznana na podstawie jej struktury chemicznej lub pomiaru. W przypadku lotnych badanych substancji przy podejmowaniu decyzji, czy badanie ma zastosowanie, pomocna jest zmierzona lub obliczona stała Henry'ego. Informacje na temat toksyczności badanej substancji dla bakterii beztlenowych są przydatne przy wyborze odpowiedniego badanego stężenia i przy interpretacji wyników wskazujących na słabą biodegradowalność. Zaleca się uwzględnienie próby kontrolnej z hamowaniem, chyba że wiadomo jest, że badana substancja nie jest inhibitorem aktywności mikroorganizmów beztlenowych (zob. pkt 21 i norma ISO 13641-1 (12)).
ZASTOSOWANIE METODY BADANIA
8. Metodę badawczą można stosować w przypadku substancji rozpuszczalnych w wodzie; można ją również stosować w przypadku substancji słabo rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych w wodzie, pod warunkiem że stosuje się metodę dokładnego dawkowania, zob. np. norma ISO 10634 (13). Na ogół w przypadku substancji lotnych konieczne jest podejmowanie decyzji indywidualnie dla każdego przypadku. Muszą zostać podjęte specjalne środki, na przykład nieuwalnianie gazu w trakcie badania.
SUBSTANCJE ODNIESIENIA
9. W celu sprawdzenia procedury bada się substancję odniesienia, przygotowując równolegle odpowiednie naczynia w ramach zwykłych serii badania. Przykładami użytych substancji są: fenol, benzoesan sodu i glikol polietylenowy 400, w stosunku do których oczekuje się, że ich degradacja nastąpi w wyniku teoretycznego wytwarzania gazu (tj. metanu i węgla nieorganicznego) w ilości ponad 60 % w ciągu 60 dni (3)(14).
ODTWARZALNOŚĆ WYNIKÓW BADAŃ
10. W międzynarodowym badaniu międzylaboratoryjnym (14) osiągnięto dobrą odtwarzalność pomiarów ciśnienia gazu między trzema naczyniami. Względne odchylenie standardowe (współczynnik zmienności) wynosił głównie poniżej 20 %, choć wartość ta często wzrastała do > 20 % w obecności substancji toksycznych lub pod koniec 60-dniowego okresu inkubacji. Wyższe odchylenia stwierdzono również w naczyniach o objętości < 150 ml. Ostateczne wartości pH środowiska badawczego znajdowały się w przedziale 6,5-7,0.
11. W badaniu międzylaboratoryjnym otrzymano następujące wyniki.
| Badana substancja | Łączne dane n1 | Średnia degradacja (łącznych danych) (%) | Względne odchylenie standardowe (łącznych danych) (%) | Dane ważne n2 | Średnia degradacja (danych ważnych) (%) | Względne odchylenie standardowe (danych ważnych) (%) | Dane > 60 % degradacja w badaniach ważnych n3 |
| Kwas palmitynowy | 36 | 68,7 ± 30,7 | 45 | 27 | 72,2 ± 18,8 | 26 | 19 = 70 % (*) |
| Glikol polietylenowy 400 | 38 | 79,8 ± 28,0 | 35 | 29 | 77,7 ± 17,8 | 23 | 24 = 83 % (*) |
| (*) Proporcja n2 |
12. Współczynniki zmienności średniej wszystkich wartości otrzymanych z wykorzystaniem kwasu palmitynowego i glikolu polietylenowego 400 wynosiły odpowiednio 45 % (n = 36) i 35 % (n = 38). Kiedy pominięto wartości < 40 % i > 100 % (uznano, że te pierwsze wynikały z warunków gorszych od optymalnych, zaś te drugie wynikały z nieznanych przyczyn), współczynniki zmienności obniżyły się odpowiednio do 26 % i 23 %. Odsetki "ważnych" wartości osiągających co najmniej 60 % degradacji wynosiły 70 % w przypadku kwasu palmitynowego i 83 % w przypadku glikolu polietylenowego 400. Proporcje procentowej biodegradacji z pomiarów zawartości rozpuszczonego węgla nieorganicznego były stosunkowo niskie, ale zmienne. W przypadku kwasu palmitynowego, zakres wynosił 0-35 %, średnia 12 %, a współczynnik zmienności 92 %, natomiast w przypadku glikolu polietylenowego 400 zakres wynosił 0-40 %, średnia 24 %, a współczynniku zmienności 54 %.
OPIS METODY BADAWCZEJ
Aparatura
13. Wymagany jest zwykły sprzęt laboratoryjny i następujące przyrządy:
a. Inkubator - iskrobezpieczny z regulacją temperatury 35 °C ± 2 °C;
b. Szklane naczynia badawcze odporne na ciśnienie o odpowiednich nominalnych wymiarach 21 , każde z nich wyposażone w gazoszczelny korek, który może wytrzymać ciśnienie około 2 barów. Faza gazowa powinna stanowić od około 10 % do 30 % całkowitej objętości. Jeżeli biogaz jest uwalniany regularnie, około 10 % objętości fazy gazowej jest odpowiednie, jednak jeżeli uwolnienie gazu zachodzi tylko na końcu badania, odpowiednie jest 30 %. Szklane butelki do surowicy o pojemności nominalnej 125 ml i objętości całkowitej około 160 ml, zamknięte szczelnymi korkami 22 i obciskanymi pierścieniami aluminiowymi zaleca się w przypadkach, gdy następuje spadek ciśnienia przy każdym pobieraniu próbek;
c. Urządzenie do pomiaru ciśnienia 23 dostosowane w sposób umożliwiający pomiar i upuszczanie wytworzonego gazu, na przykład ręczny precyzyjny ciśnieniomierz podłączony do odpowiedniej igły do strzykawki; gazoszczelny zawór 3-drogowy ułatwia obniżenie nadmiernego ciśnienia (dodatek 1). Wewnętrzna objętość przewodów przetwornika ciśnienia i zaworu powinna być jak najmniejsza, aby błędy wynikające z pominięcia objętości aparatury były niewielkie;
Uwaga - Odczyty ciśnienia stosuje się bezpośrednio do obliczenia ilości węgla wytworzonego w fazie gazowej (pkt 42-44). Ewentualnie można przeliczyć odczyty ciśnienia na objętości (w temperaturze 35 °C i ciśnieniu atmosferycznym) wytworzonego gazu z wykorzystaniem krzywej konwersji. Krzywą tą konstruuje się z danych uzyskanych przez wstrzykiwanie znanych objętości azotu do szeregu naczyń badawczych (np. butelek do surowicy) w temperaturze 35 ° +/- 2° i zapisywanie otrzymanych odczytów ustabilizowanego ciśnienia (zob. dodatek 2). Obliczenia te zostały przedstawione w uwadze w pkt 44.
Uwaga - Należy unikać skaleczeń igłą podczas używania mikrostrzykawek.
d. Analizator węglowy nadający się do bezpośredniego oznaczania węgla nieorganicznego w zakresie od 1 mg/l do 200 mg/l;
e. Strzykawki o dużej precyzji do pobierania próbek gazowych i ciekłych;
f. Mieszadła magnetyczne i krzywki (nieobowiązkowe);
g. Komora rękawicowa (zalecana).
Odczynniki
14. W całym badaniu należy stosować odczynniki do analiz.
Woda
15. Woda destylowana lub dejonizowana (odtleniona przez barbotaż azotem zawierającym mniej niż 5 µl/l tlenu), zawierająca mniej niż 2 mg/l rozpuszczonego węgla organicznego.
Środowisko badania
16. Należy przygotować czynnik rozcieńczający, zawierający następujące składniki w podanych ilościach;
| Bezwodny diwodoroortofosforan potasu (KH2PO4) | 0,27 |
| Dwunastowodny wodorofosforan disodu (Na2HPO412H2O) | 1,12 |
| Chlorek amonu (NH4Cl) | 0,53 |
| Dwuwodny chlorek wapnia (CaCl22H2O) | 0,075 g |
| Sześciowodny chlorek magnezu (MgCl26H2O) | 0,10 |
| Czterowodny chlorek żelaza(III) (FeCl24H2O) | 0,02 |
| Resazuryna (wskaźnik tlenu) | 0,001 g |
| Dziewięciowodny siarczek sodu (Na2S9H2O) | 0,10 |
| Roztwór podstawowy pierwiastków śladowych (nieobowiązkowy, pkt 18) | 10 ml |
| Dodać odtlenioną wodę (pkt 15) | do 1 litra |
Uwaga: aby zapewnić wystarczającą zdolność redukowania, należy stosować siarczek sodu, który jest świeżo dostarczony lub wypłukany i osuszony przed zastosowaniem. Badanie można prowadzić bez stosowania komory rękawicowej (zob. pkt 26). W tym przypadku końcowe stężenie siarczku sodu w środowisku należy zwiększyć do 0,20 g Na2S9H2O na litr. Siarczek sodu można też dodać z odpowiedniego beztlenowego roztworu podstawowego przez korki zamkniętych naczyń badawczych, ponieważ taka procedura zmniejsza ryzyko utleniania. Siarczek sodu można zastąpić cytrynianem tytanu(III), który dodaje się przez korki zamkniętych naczyń badawczych w końcowym stężeniu 0,8-1,0 mmol/l. Cytrynian tytanu(III) stanowi wysoce skuteczny środek redukujący o niskiej toksyczności, który przygotowuje się w następujący sposób: rozpuścić 2,94 g dwuwodnego cytrynianu trisodowego w 50 ml odtlenionej wody (uzyskując roztwór 200 mmol/l) i dodać 5 ml 15 % (m/v) roztworu chlorku tytanu(III). Zneutralizować do pH 7 ± 0,2 za pomocą mineralnych zasad i wlać do odpowiedniego naczynia w strumieniu azotu. Stężenie cytrynianu tytanu(III) w tym roztworze podstawowym wynosi 164 mmol/l.
17. Wymieszać składniki środowiska badania, z wyjątkiem środka redukującego (siarczku sodu, cytrynianu tytanu) i przez 20 minut tuż przed zastosowaniem przepuszczać przez roztwór azotu, aby usunąć tlen. Następnie należy dodać właściwą objętość świeżo przygotowanego roztworu środka redukującego (przygotowanego w odtlenionej wodzie) tuż przed zastosowaniem środowiska badawczego. W razie potrzeby skorygować pH środowiska, używając w tym celu rozcieńczonego kwasu mineralnego lub rozcieńczonej zasady mineralnej do 7 ± 0,2.
Roztwór podstawowy pierwiastków śladowych (nieobowiązkowy)
18. Zaleca się, aby środowisko badania zawierało następujące pierwiastki śladowe w celu poprawienia przebiegu procesów degradacji beztlenowej, w szczególności jeżeli stosuje się niskie stężenia inokulum (np. 1 g/l) (11).
Czterowodny chlorek manganu (MnCl24H2O)50 mg
Kwas borowy (H3BO3)5 mg
Chlorek cynku (ZnCl2)5 mg
Chlorek miedzi(II) (CuCl2)3 mg
Dwuwodny molibdenian sodu (II) (Na2MoO42H2O)1 mg
Sześciowodny chlorek kobaltu (CoCl26H2O)100 mg
Sześciowodny chlorek niklu (NiCl26H2O)10 mg
Selenian disodu (Na2SeO3)5 mg
Dodać odtlenioną wodę (pkt 15)do 1 litra
Badana substancja
19. Badaną substancję należy dodać jako roztwór podstawowy, zawiesinę, emulsję lub bezpośrednio w postaci stałej lub ciekłej, lub wchłoniętej na filtrze z włókna szklanego, aby wytworzyć stężenie węgla organicznego nie większe niż 100 mg/l. W przypadku użycia roztworów podstawowych, przygotować odpowiedni roztwór w wodzie (pkt 15) (uprzednio odtlenioną za pomocą barbotażu azotem) o takim stężeniu, aby dodana objętość wynosiła mniej niż 5 % całkowitej objętości mieszaniny reakcyjnej. W razie potrzeby skorygować pH roztworu podstawowego do 7 ± 0,2. W odniesieniu do badanych substancji, które są niewystarczająco rozpuszczalne w wodzie, zob. norma ISO 10634 (13). W przypadku zastosowania rozpuszczalnika należy przygotować dodatkową próbę kontrolną, w której rozpuszczalnik dodaje się tylko do zaszczepionego środowiska. Należy unikać rozpuszczalników organicznych, o których wiadomo, że hamują wytwarzanie metanu (takich jak chloroform i tetrachlorek węgla).
Uwaga - Zachować ostrożność w przypadku badanych substancji, które są toksyczne, lub których właściwości nie są znane.
Substancje odniesienia
20. Substancje odniesienia, takie jak benzoesan sodu, fenol i glikol polietylenowy 400, zostały zastosowane z powodzeniem w celu sprawdzenia procedury i uległy degradacji w ponad 60 % w ciągu 60 dni. Przygotować roztwór podstawowy (w odtlenionej wodzie) wybranej substancji odniesienia w taki sam sposób jak w przypadku substancji badanej i w razie potrzeby skorygować pH do 7 ± 0,2.
Próba kontrolna z hamowaniem (warunkowa)
21. Aby uzyskać informacje na temat toksyczności badanej substancji dla mikroorganizmów beztlenowych w celu ustalenia najbardziej odpowiedniego badanego stężenia, do naczynia zawierającego środowisko badania należy dodać badaną substancję i substancję odniesienia (zob. pkt 16), przy czym każda z nich ma mieć takie samo stężenie przy dodawaniu (zob. pkt 19 i 20 oraz norma ISO13641-1 (12)).
Przefermentowany osad
22. Przefermentowany osad należy pobrać z komory fermentacyjnej oczyszczalni ścieków, w której oczyszczane są głównie ścieki domowe. Należy w pełni scharakteryzować osad i zamieścić podstawowe informacje w sprawozdaniu (zob. pkt 54). Jeżeli przewiduje się zastosowanie zaadaptowanego inokulum, można brać pod uwagę wykorzystanie przefermentowanego osadu z oczyszczalni ścieków przemysłowych. Do pobierania przefermentowanego osadu używać butelek z szeroką szyjką, wykonanych z polietylenu o dużej gęstości lub podobnego materiału, który może się rozszerzać. Napełnić butelki osadem do wysokości około 1 cm od wylotu butelek i szczelnie zamknąć, najlepiej używając do tego celu zaworu bezpieczeństwa. Po przewiezieniu do laboratorium zebrany osad można użyć bezpośrednio lub umieścić w laboratoryjnej komorze fermentacyjnej. Uwolnić nadmiar biogazu, ostrożnie otwierając butle z osadem. Jako źródło inokulum można ewentualnie zastosować osad beztlenowy wytworzony w laboratorium, jednak jego zakres działania może ulec pogorszeniu.
Uwaga - Przefermentowany osad wytwarza łatwopalne gazy, które stwarzają ryzyko pożaru i wybuchu: zawiera również potencjalnie patogenne organizmy, dlatego mając do czynienia z osadem należy zachować właściwe środki ostrożności. Ze względów bezpieczeństwa do pobierania osadu nie stosować szklanych naczyń.
23. Aby ograniczyć wytwarzanie gazu w tle i zmniejszyć wpływ ślepych prób kontrolnych, można rozważyć wstępne fermentowanie osadu. Jeżeli wymagana jest wstępna fermentacja, należy osad fermentować w temperaturze 35 °C ± 2 °C przez okres do 7 dni, nie dodając do niego żadnych składników odżywczych ani substratów. Ustalono, że wstępna fermentacja prowadzona przez około 5 dni zwykle prowadzi do optymalnego zmniejszenia wytwarzania gazu w ślepej próbie bez niedopuszczalnego zwiększania okresów zwłoki lub inkubacji podczas fazy badania lub utraty działania w stosunku do niewielkiej liczby badanych substancji.
24. W przypadku badanych substancji, które są, lub co do których oczekuje się, że są słabo biodegradowalne, należy uwzględnić wstępne narażenie osadu na działanie badanej substancji w celu otrzymania lepiej dostosowanego inokulum. W takim przypadku należy dodać badaną substancję w stężeniu odpowiadającym stężeniu węgla organicznego na poziomie 5 mg/l-20 mg/l do przefermentowanego osadu i inkubować przez okres do 2 tygodni. Osad wstępnie narażony na działanie badanej substancji należy dokładnie opłukać przed użyciem (zob. pkt 25) i podać w sprawozdaniu z badania warunki wstępnego narażenia.
Inokulum
25. Opłukać osad (zob. pkt 22-24) tuż przed użyciem, aby obniżyć stężenie węgla nieorganicznego w końcowej zawiesinie do poziomu poniżej 10 mg/l. Odwirować osad w szczelnie zamkniętych probówkach (np. 3 000 g przez 5 min) i zlać supernatant. Otrzymany osad zawiesić w odtlenionym środowisku (pkt 16 i 17), ponownie odwirować zawiesinę i zlać supernatant. Jeżeli zawartość węgla nieorganicznego nie została wystarczająco obniżona, procedurę płukania osadu można powtórzyć maksymalnie dwa razy. Wydaje się, że nie ma to niekorzystnego wpływu na mikroorganizmy. Na koniec należy zawiesić osad w wymaganej objętości środowiska badania i oznaczyć zawiesinę ogólną [np. ISO 11923 (15)]. Końcowe stężenie zawiesiny ogólnej w naczyniach badawczych powinno mieścić się w zakresie 1 g/l-3 g/l (lub około 10 % tej wartości w nierozcieńczonym przefermentowanym osadzie). Powyższe operacje prowadzić w taki sposób, aby kontakt osadu z tlenem był minimalny (np. w atmosferze azotu).
PROCEDURA BADANIA
26. Wykonać następujące wstępne procedury z zastosowaniem technik mających na celu utrzymanie kontaktu między przefermentowanym osadem i tlenem na możliwie najniższym poziomie; może na przykład zajść konieczność pracy w komorze rękawicowej w atmosferze azotu lub oczyszczania butli azotem (4).
Przygotowanie prób badanych i prób kontrolnych
27. Przygotować co najmniej trzy egzemplarze naczyń badawczych (zob. pkt 13 b) na badaną substancję, ślepe próby kontrolne, substancje odniesienia, próby kontrolne z hamowaniem (warunkowe) i komory kontroli ciśnienia (procedura nieobowiązkowa) (zob. pkt 7, 19 i 21). Można również przygotować dodatkowe naczynia w celu oceny pierwotnej biodegradacji z zastosowaniem szczegółowych analiz badanej substancji. Można wykorzystać ten sam zestaw ślepych prób kontrolnych dla kilku badanych substancji w tym samym badaniu, pod warunkiem że objętości fazy gazowej są stałe.
28. Przygotować rozcieńczone inokulum przed dodaniem go do naczyń, np. za pomocą pipety z szerokim wylotem. Dodać podwielokrotności dobrze wymieszanego inokulum (pkt 25), tak aby stężenie zawiesiny ogólnej było takie samo we wszystkich naczyniach (między 1 g/l i 3 g/l). W razie potrzeby dodać roztwory podstawowe do substancji badanej i substancji odniesienia po skorygowaniu pH do 7 ± 0,2. Badaną substancję i substancję odniesienia należy dodać przy użyciu najbardziej odpowiedniej drogi wprowadzania (pkt 19).
29. Badane stężenie węgla organicznego powinno normalnie wynosić 20-100 mg/l (pkt 4). Jeżeli badana substancja jest toksyczna, badane stężenie należy obniżyć do 20 mg C/l, a nawet niższego poziomu, jeżeli ma być mierzona tylko pierwotna biodegradacja za pomocą szczegółowych analiz. Należy zauważyć, że zmienność wyników badania zwiększa się przy niższych badanych stężeniach.
30. W przypadku naczyń ze ślepymi próbami zamiast roztworu podstawowego zawiesiny lub emulsji należy dodać równoważną ilość nośnika stosowanego do dawkowania badanej substancji. Jeżeli badaną substancję wprowadzono wykorzystując filtry z włókna szklanego lub rozpuszczalniki organiczne, do ślepych prób należy dodać filtr lub równoważną objętość rozpuszczalnika, która została odparowana. Przygotować dodatkową kontrpróbę z badaną substancją w celu zmierzenia wartości pH. W razie potrzeby skorygować pH środowiska do 7 ± 0,2, używając rozcieńczonego kwasu mineralnego lub rozcieńczonej zasady mineralnej. Do wszystkich naczyń badawczych należy dodać takie same ilości substancji neutralizujących. Dodatki te nie powinny być konieczne, ponieważ wartości pH roztworów podstawowych badanej substancji i substancji odniesienia zostały już skorygowane (zob. pkt 19 i 20). Aby zmierzyć pierwotną biodegradację, należy pobrać właściwą próbkę z naczynia do kontroli pH lub z dodatkowego naczynia badawczego, a stężenie badanej substancji należy zmierzyć, stosując szczegółowe analizy. Jeżeli mieszaniny reakcyjne mają zostać wymieszane (nieobowiązkowo), do wszystkich naczyń można dodać powlekane magnesy.
31. Upewnić się, czy całkowita objętość cieczy V1 i objętość fazy gazowej Vh były takie same we wszystkich naczyniach; należy również zanotować i zapisać wartości V1 i Vh. Każde naczynie należy zamknąć gazoszczelnym korkiem i przenieść z komory rękawicowej (zob. pkt 26) do inkubatora (zob. pkt 13-a).
Nierozpuszczalne substancje badane
32. Dodać odważone ilości substancji, które słabo rozpuszczają się w wodzie, bezpośrednio do przygotowanych naczyń. Jeżeli niezbędne jest zastosowanie rozpuszczalnika (zob. pkt 19), przenieść roztwór badanej substancji lub zawiesinę do pustych naczyń. W miarę możliwości odparować rozpuszczalnik, przepuszczając przez naczynia azot, a następnie dodając inne składniki, mianowicie rozcieńczony osad (pkt 25) i odtlenioną wodę, jeśli zajdzie potrzeba. Należy również przygotować dodatkową próbę kontrolną z rozpuszczalnikiem (zob. pkt 19). W odniesieniu do innych metod dodawania nierozpuszczalnych substancji, zob. norma ISO 10634 (13). Płynne substancje badane można dawkować za pomocą strzykawki do całkowicie przygotowanych szczelnie zamkniętych naczyń, jeżeli przewiduje się, że początkowe pH nie przekroczy 7 ± 1, w przeciwnym razie należy dawkować je zgodnie z powyższym opisem (zob. pkt 19).
Inkubacja i pomiary ciśnienia gazu
33. Przygotowane naczynia należy inkubować w temperaturze 35 °C ± 2 °C przez około 1 h, aby je ustabilizować i uwolnić nadmiar gazu do atmosfery, na przykład potrząsając każdym naczyniem po kolei, wprowadzając igłę miernika ciśnienia (pkt 13-c) przez korek i otwierając zawór do momentu, gdy ciśnieniomierz wskaże zero. Jeżeli na tym etapie lub podczas dokonywania pomiarów pośrednich ciśnienie fazy gazowej jest niższe od atmosferycznego, należy wprowadzić azot w celu przywrócenia ciśnienia atmosferycznego. Zamknąć zawór (zob. pkt 13-c) i kontynuować inkubację bez dostępu światła, upewniając się, czy wszystkie części naczyń są utrzymywane w temperaturze fermentacji. Po inkubacji obserwować wszystkie naczynia przez 24-48 h. Odrzucić naczynia, których zawartość cechuje się wyraźnie różowym zabarwieniem supernatantu, tj. jeżeli resazuryna (zob. pkt 16) zmieniła kolor, wskazując na obecność tlenu (zob. pkt 50). Chociaż małe ilości tlenu mogą być tolerowane przez układ, wyższe stężenia mogą w znacznym stopniu uniemożliwić przebieg biodegradacji beztlenowej. Można zaakceptować sporadyczne odrzucenie pojedynczego naczynia z zestawu trzech naczyń, ale wystąpienie większej liczby nieprawidłowości musi pociągnąć za sobą zbadanie procedur doświadczalnych oraz powtórzeniem badania.
34. Ostrożnie wymieszać zawartość każdego z naczyń, mieszając lub wstrząsając przez kilka minut co najmniej 2 lub 3 razy w tygodniu oraz na krótko przed każdym pomiarem ciśnienia. Wstrząsanie prowadzi do ponownego uformowania się zawiesiny inokulum i zapewnia równowagę gazową. Wszystkie pomiary ciśnienia należy wykonywać szybko, ponieważ temperatura naczyń badawczych może ulec obniżeniu, co spowoduje fałszywe odczyty. Podczas pomiaru ciśnienia całe naczynie badawcze, w tym fazę gazową, należy utrzymywać w temperaturze fermentacji. Zmierzyć ciśnienie gazu, na przykład przekłuwając korek igłą strzykawki (pkt 13-c) połączoną z urządzeniem mierzącym ciśnienie. Należy zadbać, aby do igły strzykawki nie dostała się woda; w takim przypadku należy wysuszyć mokre części i podłączyć nową igłę. Ciśnienie należy mierzyć w milibarach (zob. pkt 42). Ciśnienie gazu w naczyniach można mierzyć okresowo, np. co tydzień, i ewentualnie wypuszczać nadmiar gazu do atmosfery. Ewentualnie ciśnienie mierzy się tylko na końcu badania w celu określenia ilości wyprodukowanego biogazu.
35. Zaleca się wykonywanie pośrednich odczytów ciśnienia gazu, ponieważ wzrost ciśnienia stanowi wskazówkę co do możliwego terminu zakończenia badania i umożliwia śledzenie kinetyki (zob. pkt 6).
36. Zazwyczaj zakończenie badania następuje po okresie inkubacji wynoszącym 60 dni, chyba że krzywa biodegradacji uzyskana w wyniku pomiarów ciśnienia wcześniej osiągnęła stan równowagi, czyli stan, w którym osiągnięto maksymalny rozkład, a krzywa biodegradacji ma poziomy przebieg. Jeżeli wartość stanu równowagi wynosi mniej niż 60 %, interpretacja jest problematyczna, ponieważ wskazuje to, że tylko część cząsteczki została zmineralizowana lub że popełniony został błąd. Jeżeli pod koniec zwykłego okresu inkubacji wytwarzany jest gaz, ale stan równowagi nie został najwyraźniej osiągnięty, wówczas należy rozważyć przedłużenie badania w celu sprawdzenia, czy stan równowagi (> 60 %) zostanie osiągnięty.
Pomiar węgla nieorganicznego
37. Na końcu badania po ostatnim pomiarze ciśnienia gazu pozostawić osad do ustania. Otworzyć po kolei każde naczynie i natychmiast pobrać próbkę w celu określenia stężenia (mg/l) węgla nieorganicznego w supernatancie. Supernatantu nie należy odwirowywać ani filtrować, ponieważ spowodowałoby to niedopuszczalną stratę rozpuszczonego dwutlenku węgla. Jeżeli nie można wykonać analizy próbki płynu przy pobieraniu, należy umieścić ją w szczelnie zamkniętej fiolce, nie pozostawiając nad płynem wolnej przestrzeni na fazę gazową, schłodzonej do temperatury 4 °C, i przechowywać maksymalnie przez 2 dni. Po wykonaniu pomiaru węgla nieorganicznego zmierzyć i zanotować wartość pH.
38. Ewentualnie węgiel nieorganiczny w supernatancie można oznaczyć pośrednio, uwalniając rozpuszczony węgiel nieorganiczny jako dwutlenek węgla, który można zmierzyć w fazie gazowej. Po ostatnim pomiarze ciśnienia gazu wyrównać ciśnienie w każdym naczyniu badawczym do ciśnienia atmosferycznego. Zakwasić zawartość każdego z naczyń do około pH 1 dodając stężonego kwasu mineralnego (np.H2SO4) przez korek każdego szczelnie zamkniętego naczynia. Inkubować wstrząśnięte naczynia w temperaturze 35 °C ± 2 °C przez około 24 godziny i mierzyć ciśnienie wydzielonego dwutlenku węgla za pomocą ciśnieniomierza.
39. Dokonać podobnych odczytów w przypadku ślepych prób, substancji odniesienia oraz, jeśli zostały zastosowane, naczyń z próbami kontrolnymi z hamowaniem (zob. pkt 21).
40. W niektórych przypadkach, zwłaszcza jeżeli te same naczynia z próbami kontrolnymi stosowane są w odniesieniu do kilku badanych substancji, w razie potrzeby należy rozważyć pomiary pośrednich stężeń węgla nieorganicznego w naczyniach badawczych i naczyniach z próbami kontrolnymi. W takim przypadku na potrzeby wszystkich pośrednich pomiarów należy przygotować wystarczającą liczbę naczyń. Zaleca się raczej takie postępowanie zamiast pobierania wszystkich próbek tylko z jednego naczynia. To ostatnie można stosować tylko wtedy, jeśli nie uzna się wymaganej objętości do analizy rozpuszczonego węgla nieorganicznego za zbyt dużą. Pomiar rozpuszczonego węgla nieorganicznego należy wykonać po zmierzeniu ciśnienia gazu bez uwalniania nadmiaru gazu jak opisano poniżej:
- pobrać jak najmniejszą objętość próbek supernatantu za pomocą strzykawki przez korek bez otwierania naczynia i oznaczyć węgiel nieorganiczny w próbce;
- po pobraniu próbki nadmiar gazu zostaje uwolniony lub nie;
- należy zauważyć, że nawet niewielkie zmniejszenie objętości supernatantu (np. około 1 %) może spowodować znaczny wzrost objętości gazu (Vh) w fazie gazowej;
- równania (zob. pkt 44) koryguje się w razie potrzeby zwiększając Vh w równaniu 3.
Szczegółowe analizy
41. Jeżeli ma zostać oznaczona pierwotna beztlenowa degradacja (zob. pkt 30), w celu przeprowadzenia szczgółowej analizy pobrać odpowiednią objętość próbki na początku i na końcu badania z naczyń zawierających badaną substancję. Po pobraniu należy pamiętać, że objętości fazy gazowej nad roztworem (Vh) i cieczy (Vl) ulegną zmianie, i uwzględnić ten fakt podczas obliczania wyników wytwarzania gazu. Ewentualnie próbki do celów szczegółowych analiz można pobrać z dodatkowych mieszanin sporządzonych wcześniej w tym celu (pkt 30).
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Opracowanie wyników
42. Z praktycznych względów ciśnienie gazu mierzy się w milibarach (1 mbar = 2 h Pa = 10 Pa; 1 Pa = 1 N/m2), objętość w litrach, a temperaturę w stopniach Celsjusza.
Węgiel w fazie gazowej
43. Ponieważ zarówno 1 mol metanu, jak i 1 mol dwutlenku węgla zawiera 12 g węgla, masa węgla w danej objętości wydzielonego gazu może być wyrażona jako:
m = 12 × 103 × n Równanie [1]
gdzie:
m = masa węgla (mg) w danej objętości wydzielonego gazu;
12 = względna masa atomowa węgla;
n = liczba moli gazu w danej objętości.
Jeżeli wytworzony został w znacznych ilościach gaz inny niż metan lub dwutlenek węgla (np. N2O), należy dostosować wzór [1] w celu uwzględnienia ewentualnych skutków wywołanych przez wytworzone gazy.
44. Na podstawie praw gazowych n można opisać jako:
n = 
Równanie [2]
gdzie:
p = ciśnienie gazu (w paskalach);
V = objętość gazu (m3);
R = stała molowa gazu [8,314J/(mol K)];
T = temperatura inkubacji (w kelwinach).
W wyniku połączenia równań [1] i [2] oraz wykasowania niewymierności, aby uwzględnić wytwarzania gazu w ślepej próbie kontrolnej:
Równanie [3]
gdzie:
mh = masa węgla netto wytworzonego jako gaz w fazie gazowej (mg);
Dp = średnia różnica między początkowym i końcowym ciśnieniem w naczyniach badawczych minus odpowiadająca im średnia w naczyniach ze ślepą próbą (milibary);
Vh = objętość fazy gazowej w naczyniu (l);
0,1 = zamiana newtonów/m2 na milibary, a m3 na litry.
Równanie [4] należy stosować w normalnej temperaturze inkubacji 35 °C (308 K):
mh = 0,468(ΔpVh) Równanie [4]
Uwaga: alternatywna metoda obliczenia objętości. Odczyty ciśnieniomierza są przeliczane na ml wytworzonego gazu ze standardowej krzywej utworzonej w wyniku wykreślenia zależności wstrzykniętej objętości (ml) od odczytu ciśnieniomierza (dodatek 2). Liczbę moli (n) gazu w fazie gazowej w każdym naczyniu oblicza się, dzieląc sumaryczną produkcję gazu (ml) przez 25 286 ml/mol, co stanowi objętość zajmowaną przez jeden mol gazu w temperaturze 35 °C i przy standardowym ciśnieniu atmosferycznym. Ponieważ zarówno 1 mol CH4, jak i 1 mol O2 zawiera 12 g węgla, masa węgla (mg) w fazie gazowej (mh) jest wyrażona Równaniem [5]:
mh= 12 × 103 × n Równanie [5]
Wykasowanie niewymierności w celu uwzględnienia wytwarzania gazu w ślepej próbie:
Równanie [6]
gdzie:
mh = masa węgla netto wytworzonego jako gaz w fazie gazowej (mg);
DV = średnia różnica między objętością gazu wytworzonego w fazie gazowej w naczyniach badawczych oraz w naczyniach ślepej próby;
25 286 = objętość zajmowana przez 1 mol gazu w temperaturze 35 °C, 1 atmosfera fizyczna.
45. W razie potrzeby przebieg biodegradacji można śledzić wykreślając skumulowany wzrost ciśnienia Δp (w milibarach) w funkcji czasu. Na podstawie tej krzywej można określić i zanotować fazę zwłoki (w dniach). Faza zwłoki jest to okres od rozpoczęcia badania do momentu rozpoczęcia znacznej degradacji (zob. np. dodatek 3). W przypadku pobrania i poddania analizie pośrednich próbek supernatantu (zob. pkt 40, 46 i 47) można uzyskać wykres całkowitego wytworzonego węgla (w gazie i w cieczy) zamiast samego sumarycznego ciśnienia.
Węgiel w cieczy
46. Nie uwzględnia się ilości metanu w cieczy, ponieważ jego rozpuszczalność w wodzie jest bardzo niska. Masę węgla nieorganicznego w cieczy w naczyniach badawczych oblicza się z równania [7]:
ml = Cnet× VlRównanie [7]
gdzie:
ml = masa węgla nieorganicznego w cieczy (mg);
Cnet = stężenie węgla nieorganicznego w naczyniach badawczych minus stężenie węgla nieorganicznego w naczyniach z próbą kontrolną na koniec badania (mg/l);
Vl = objętość cieczy w naczyniu (l).
Całkowity węgiel zgazowany
47. Obliczyć całkowitą masę zgazowanego węgla w naczyniu, wykorzystując równanie [8]:
mt = mh + mlRównanie [8]
gdzie:
mt = całkowita masa zgazowanego węgla (mg);
mhand mlzdefiniowane powyżej.
Węgiel w badanej substancji
48. Obliczyć masę węgla w naczyniach badawczych pochodzącego z dodanej substancji badanej z równania [9]:
mv = Cc × VlRównanie [9]
gdzie:
mv = masa węgla w badanej substancji (mg);
Cc = stężenie węgla w badanej substancji w naczyniu badawczym (mg/l)
Vl = objętość cieczy w naczyniu badawczym (l).
Zakres biodegradacji
49. Obliczyć procentową wartość biodegradacji w fazie gazowej, stosując równanie [10], i całkowitą procentową wartość biodegradacji, stosując równanie [11]:
Dh = (mh/mv) × 100 Równanie [10]
Dt = (mt/mv) × 100 Równanie [11]
gdzie:
Dh = biodegradacja w fazie gazowej (%);
Dt = całkowita biodegradacja (%);
mh, mvand mtzdefiniowane powyżej.
Stopień pierwotnej biodegradacji oblicza się na podstawie (nieobowiązkowych) pomiarów stężenia badanej substancji na początku i na końcu inkubacji z równania [12]:
D = (1 - Se/Si) × 100 Równanie [12]
gdzie:
D = pierwotna degradacja badanej substancji (%); Si = początkowe stężenie badanej substancji (mg/l); Se = końcowe stężenie badanej substancji (mg/l).
Jeżeli metoda analizy wykaże znaczne stężenia badanej substancji w nieskorygowanym, beztlenowym osadzie inokulum, stosuje się równanie [13]:
= [1 - (Se - Seb)/(Si - Sib)] × 100 Równanie [13]
gdzie:
= skorygowana pierwotna degradacja badanej substancji (%);
Sib = początkowe "widoczne" stężenie badanej substancji w ślepych próbach kontrolnych (mg/l);
Seb = końcowe "widoczne" stężenie badanej substancji w ślepych próbach kontrolnych (mg/l).
Ważność wyników
50. Należy wykorzystać jedynie odczyty ciśnienia z naczyń nie wykazujących różowego zabarwienia (zob. pkt 33). Zanieczyszczenie tlenem można zminimalizować, wykorzystując odpowiednie techniki postępowania z próbkami beztlenowymi.
51. Badanie należy uznać za ważne, jeżeli substancja odniesienia osiągnie stan równowagi, odpowiadający ponad 60 % biodegradacji 24 .
52. Jeżeli na koniec badania pH przekroczyło zakres 7 ± 1 i nie doszło do wystarczającej biodegradacji, powtórzyć badanie ze zwiększoną pojemnością buforową środowiska.
Hamowanie degradacji
53. Zarówno w naczyniach zawierających badaną substancją, jak i w naczyniach z substancją odniesienia ilość wytwarzanego gazu powinna być co najmniej taka sama jak w naczyniach zawierających tylko substancję odniesienia; przeciwna sytuacja wskazuje na hamowanie wytwarzania gazu. W niektórych przypadkach wytwarzanie gazu w naczyniach zawierających badaną substancję bez substancji odniesienia będzie niższe niż w ślepych próbach kontrolnych, co wskazuje na hamujące działanie badanej substancji.
Sprawozdanie z badania
54. Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje:
Badana substancja:
- nazwa zwyczajowa, nazwa systematyczna, numer CAS, wzór strukturalny i istotne właściwości fizykochemiczne;
- stopień czystości substancji badanej (zanieczyszczenia).
Warunki badania:
- objętość rozcieńczonej cieczy z komory fermentacyjnej (Vl) i fazy gazowej (Vh) w naczyniu;
- opis naczyń badawczych, główne cechy pomiaru biogazu (np. rodzaj ciśnieniomierza) i analizatora węgla nieorganicznego;
- dodanie badanej substancji i substancji odniesienia do układzu badawczego: zastosowane badane stężenie i każdorazowe zastosowanie rozpuszczalników;
- szczegółowe informacje dotyczące zastosowanego inokulum: nazwa oczyszczalni ścieków, opis źródła oczyszczonych ścieków (np. temperatura robocza, czas retencji osadu, głównie ścieki domowe itd.), stężenie, wszystkie informacje konieczne do uzasadnienia tych danych oraz informacje dotyczące wstępnego przygotowania inokulum (np. wstępna fermentacja, wstępne narażenie);
- temperatura inkubacji;
- liczba kontrprób.
Wyniki:
- poziomy pH i węgla nieorganicznego na końcu badania;
- stężenie badanej substancji na początku i na końcu badania, jeżeli wykonano szczegółowy pomiar;
- w razie potrzeby wszystkie dane zmierzone w naczyniach badawczych, naczyniach ze ślepą próbą, naczyniach z substancją odniesienia, próbach kontrolnych z hamowaniem (np. ciśnienie w milibarach, stężenie węgla nieorganicznego (mg/l)) w formie tabeli (dane mierzone w fazie gazowej i w cieczy należy podawać osobno);
- statystyczna obróbka danych, czas trwania badania i wykres biodegradacji badanej substancji, substancji odniesienia i kontroli hamowania;
- procent biodegradacji badanej substancji i substancji odniesienia;
- uzasadnienie w przypadku ewentualnego odrzucenia wyników badania,
- omówienie wyników.
BIBLIOGRAFIA
(1) Następujące rozdziały niniejszego załącznika: C.4 Oznaczanie szybkiej biodegradowalności; C.9 Biodegradacja - test Zahn-Wellensa;
C.10 Symulacyjne badanie - w warunkach tlenowych w oczyszczalniach ścieków:
A: Zestawy osadu czynnego, B: Biofilmy
C.11, Biodegradacja - Zahamowanie oddychania osadu czynnego
(2) OECD (2009) Inherent Biodegradability: Modified MITI Test (II), Wytyczna OECD w sprawie badania chemikaliów, No. 302C, OECD, Paryż
(3) Birch, R. R., Biver, C., Campagna, R., Gledhill, W.E., Pagga, U., Steber, J., Reust, H. i Bontinck, W.J. (1989) Screening of chemicals for anaerobic biodegradation. Chemosphere 19, 1 527-1 550. (opublikowane również jako sprawozdanie techniczne ECETOC nr 28 z czerwca 1988 r.).
(4) Shelton D.R. i Tiedje, J.M. (1984) General method for determining anaerobic biodegradation potential. Appl. Environ. Mircobiology, 47, 850-857.
(5) Owen, W.F., Stuckey, DC., Healy J.B., Jr, Young L.Y. i McCarty, P.L. (1979) Bioassay for monitoring biochemical methane potential and anaerobic toxicity. Water Res. 13, 485-492.
(6) Healy, J.B.Jr. i Young, L.Y. (1979) Anaerobic biodegradation of eleven aromatic compounds to methane. Appl. Environ. Microbiol. 38, 84-89.
(7) Gledhill, W.E. (1979) Proposed standard practice for the determination of the anaerobic biodegradation of organic chemicals. Dokument roboczy, projekt 2, nr 35.24, Amerykańskie Stowarzyszenie Badań i Materiałów (ASTM), Filadelfia.
(8) Battersby, N.S. i Wilson, V. (1988) Evaluation of a serum bottle technique for assessing the anaerobic biodegra-dability of organic chemicals under methanogenic conditions. Chemosphere, 17, 2441-2460.
(9) E1192-92. Standard Test Method for Determining the Anaerobic Biodegradation Potential of Organic Chemicals. ASTM, Filadelfia.
(10) US-EPA (1998) Fate, Transport and Transformation Test Guidelines OPPTS 835.3400 Anaerobic Biodegrada-bility of Organic Chemicals.
(11) Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (1995) ISO 11 734 Water Quality - Evaluation of the ultimate anaerobic biodegradation of organic compounds in digested sludge - Method by measurement of the biogas production.
(12) Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (2003) ISO 13 641-1 Water Quality - Determination of inhibition of gas production of anaerobic bacteria - Part 1 General Test.
(13) Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (1995) ISO 10 634 Water Quality - Guidance for the preparation and treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
(14) Pagga, U. i Beimborn, D.B., (1993) Anaerobic biodegradation test for organic compounds. Chemosphere, 27, 1499-1509.
(15) Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna (1997) ISO 11 923 Water Quality - Determination of suspended solids by filtration through glass-fibre filters.
Dodatek 1
Przykład aparatury do mierzenia wytwarzania biogazu na podstawie ciśnienia gazu
Legenda:
1 - Ciśnieniomierz
2 - Gazoszczelny zawór 3-drogowy
3 - Igła do strzykawki
4 - Gazoszczelna uszczelka (obciskana nasadka i korek)
5 - Faza gazowa nad cieczą (Vh)
6 - Inokulum z przefermentowanego osadu(Vl)
Naczynia badawcze w środowisku o temperaturze 35 °C ± 2 °C
Dodatek 2
Przeliczanie odczytów ciśnieniomierza
Odczyty z ciśnieniomierza można powiązać z objętościami gazu, wykorzystując w tym celu krzywą standardową powstałą w wyniku wstrzykiwania znanych objętości powietrza w temperaturze 35 °C ± 2 °C do butelek na surowicę, zawierających objętość wody równą objętości mieszaniny reakcyjnej VR:
- umieścić podwielokrotności VR ml wody, utrzymywane w temperaturze 35 °C ± 2 °C, w pięciu butelkach na surowicę. Butelki szczelnie zamknąć i pozostawić na godzinę w łaźni wodnej w temperaturze 35 °C do stabilizacji;
- włączyć ciśnieniomierz, poczekać aż się ustabilizuje, i ustawić wartość zerową;
- wprowadzić igłę strzykawki przez korek jednej z butelek, otworzyć zawór i odczekać, aż ciśnieniomierz wskaże zero, po czym zamknąć zawór;
- procedurę tę należy powtórzyć dla pozostałych butelek;
- do każdej butelki wstrzyknąć 1 ml powietrza o temperaturze 35 °C ± 2 °C. Wprowadzić igłę (na mierniku) przez korek jednej z butelek i poczekać, aż odczyt ciśnienia ustabilizuje się. Zanotować ciśnienie, otworzyć zawór i odczekać, aż miernik ciśnienia wskaże zero, po czym zamknąć zawór;
- powtórzyć procedurę dla butelek;
- powtórzy ć całą powyższą procedurę z zastosowaniem 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 8 ml, 10 ml, 12 ml, 16 ml, 20 ml i 50 ml powietrza;
- wykreślić krzywą konwersji ciśnienia (Pa) w funkcji objętości wstrzykniętego gazu Vb (ml). Dane wskazane przez instrument mają charakter liniowy w zakresie 0 Pa-70 000 Pa oraz 0 ml-50 ml wytwarzanego gazu.
Dodatek 3
Przykład krzywej degradacji (sumaryczny wzrost ciśnienia netto)
Dodatek 4
Przykład karty charakterystyki badania biodegradacji beztlenowej - Karta charakterystyki badanej substancji
| Laboratorium: ................................................................................. | Badana substancja: .................................................... | Badanie nr: ................................................................ |
| Temperatura badania: (°C): ............................................................. | Objętość fazy gazowej (Vh): ..................................(l) | Objętość cieczy (Vl): .............................................. (l) |
| Węgiel w badanej substancji Cc,v: ........................................... | (mg/l) mv (1): ............................................................... (mg) |
| Dzień | p1 (badanie) (mbar) | p2 (badanie) (mbar) | p3 (badanie) (mbar) | p (badanie) średnia (mbar) | p4 (ślepa próba) (mbar) | p5 (ślepa próba) (mbar) | p6 (ślepa próba) (mbar) | p (ślepa próba) średnia (mbar) | p (netto) badanie - ślepa próba średnia (mbar) | Δp (netto) sumarycznie (mbar) | mh faza gazowa C (2) (mg) | Dh Biodegradacja (3) (%) |
| CIC, 1 badanie (mg) | CIC, 2 badanie (mg) | CIC, 3 badanie (mg) | CIC średnia arytmetyczna badania (mg) | CIC, 4 ślepa próba (mg) | CIC, 5 ślepa próba (mg) | CIC, 6 ślepa próba (mg) | CIC średnia arytmetyczna ślepej próby (mg) | CIC, net badanie - ślepa próba średnia (mg) | ml C w cieczy (4) (mg) | mt C ogółem (5) (mg) | Dt Biodegradacja (6) (%) | |
| Węgiel nieorganiczny (koniec) | ||||||||||||
| pH (koniec) |
| (1) Węgiel w naczyniu badawczym, mv (mg): mv = CC,v × Vl (2) Węgiel w fazie gazowej, mh w normalnej temperaturze inkubacji (35 °C): mh = 0,468 × p × Vh (3) Biodegradacja obliczona na podstawie gazu w fazie gazowej, Dh (%): Dh = (mh × 100)/mv (4) Węgiel płynny, ml (mg): ml = CIC,net Vl (5) Całkowity węgiel zgazowany, mt (mg): mt + ml (6) Całkowita biodegradacja, Dt (%): Dt = (mt × 100)/mv |
| Laboratorium: ................................................................................. | Substancja odniesienia: .............................................. | Badanie nr: ................................................................ |
| Temperatura badania: (°C): ............................................................. | Objętość fazy gazowej (Vh): ..................................(l) | Objętość cieczy (Vl)(l): .............................................. |
| Węgiel w badanej substancji Cc,v(mg/l): ........................................... | mv (1) (mg): |
| Dzień | p1 (ref.) (mbar) | p2 (ref.) (mbar) | p3 (ref.) (mbar) | p (ref.) średnia (mbar) | p4 (zaham.) (mbar) | p5 (zaham.) (mbar) | p6 (zaham.) (mbar) | p (zaham.) średnia (mbar) | p (ref.) ref. - ślepa próba (mbar) | Δp (ref.) sumarycznie (mbar) | mh C (2) w fazie gazowej (mg) | Dh Biodegradacja (3) (%) |
| CIC, 1 ref. (mg) | CIC, 2 ref. (mg) | CIC, 3 ref. (mg) | CIC średnia ref. (mg) | CIC, 4 zaham. (mg) | CIC, 5 zaham. (mg) | CIC, 6 zaham. (mg) | CIC średnie zaham. (mg) | CIC, net ref. - zaham. (mg) | ml C w cieczy (4) (mg) | mt C ogółem (5) (mg) | Dt Biodegradacja (6) (%) | |
| Węgiel nieorganiczny (koniec) | ||||||||||||
| pH (koniec) |
| (1) Węgiel w naczyniu badawczym, mv (mg): mv = CC,v × Vl (2) Węgiel w fazie gazowej, mh w normalnej temperaturze inkubacji (35 °C): mh = 0,468 × p × Vh (3) Biodegradacja obliczona na podstawie gazu w fazie gazowej, Dh (%): Dh = (mh × 100)/mv (4) Węgiel w cieczy, ml (mg): ml = CIC,net × Vl (5) Całkowity węgiel zgazowany, mt (mg): mt + ml (6) Całkowita biodegradacja, Dt (%): Dt = (mt × 100)/mv |
C.44. WYMYWANIE W KOLUMNACH GLEBOWYCH
WPROWADZENIE
1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna z wytyczną OECD nr 312 (2004 r.) w sprawie badań. Sztuczne substancje chemiczne mogą docierać do gleby bezpośrednio w wyniku celowego wprowadzenia (np. agrochemikalia) lub drogami pośrednimi (np. przez ścieki → osady ściekowe → glebę lub powietrze → składowanie na mokro/sucho). Aby ocenić ryzyko związane z tymi substancjami chemicznymi, ważne jest oszacowanie ich potencjału w zakresie przemian w glebie oraz przemieszczania się (wymywania) do głębszych warstw gleby i ostatecznie do wód podziemnych.
2. Dostępnych jest kilka metod umożliwiających zmierzenie potencjału wymywania substancji chemicznych w glebie w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych, tj. chromatografia cienkowarstwowa gleby, chromatografia grubowarstwowa gleby, chromatografia cieczowa gleby oraz pomiary adsorpcji/desorpcji (1)(2). W przypadku niezjonizowanych substancji chemicznych współczynnik podziału n-oktanol/woda (Pow) umożliwia szybkie oszacowanie ich adsorpcji i potencjału wymywania (3)(4)(5).
3. Opisana tu metoda badawcza polega na chromatografii kolumnowej gleby o naruszonej strukturze (zob. definicja w dodatku 1). Przeprowadza się dwa rodzaje eksperymentów w celu oznaczenia (i) potencjału wymywania badanej substancji chemicznej, oraz (ii) potencjału wymywania produktów przemiany (badanie z zalegającymi pozostałościami) w glebach w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych 25 . Metoda badawcza oparta jest na istniejących metodach (6)(7)(8)(9)(10)(11).
4. W trakcie warsztatów OECD na temat selekcji gleb/osadów zorganizowanych w Belgirate we Włoszech w 1995 r. (12), ustalono ilość i rodzaj gleb, które mają być stosowane na potrzeby tej metody badawczej. Opracowano również zalecenia dotyczące pobierania, obróbki i przechowywania próbek gleby w celu przeprowadzenia eksperymentów dotyczących wymywania.
ZASADA METODY BADANIA
5. Kolumny wykonane z odpowiedniego obojętnego materiału (np. szkła, stali nierdzewnej, aluminium, teflonu, polichlorku winylu itd.) wypełnia się glebą, a następnie nasyca ją i stabilizuje roztworem w formie "sztucznego deszczu" (zob. definicja w dodatku 1) i pozostawia do odsączenia. Następnie na powierzchnię gleby w każdej kolumnie wprowadza się badaną substancję chemiczną lub zalegające pozostałości badanej substancji chemicznej. Następnie kolumny glebowe nawadnia się sztucznym deszczem i zbiera odciek. Po zakończeniu procesu wymywania glebę wyjmuje się z kolumn i dzieli na odpowiednią liczbę segmentów, w zależności od informacji, które trzeba uzyskać na podstawie badania. Każdy segment gleby i odciek analizuje się następnie pod kątem badanej substancji chemicznej oraz, w stosownych przypadkach, pod kątem produktów przemiany lub innych substancji chemicznych będących przedmiotem zainteresowania.
STOSOWANIE METODY BADAWCZEJ
6. Niniejsza metoda badawcza ma zastosowanie do badanych substancji chemicznych (nieoznakowanych lub oznakowanych izotopowo np. za pomocą 14C), w odniesieniu do których istnieje metoda analityczna o wystarczającej dokładności i czułości. Niniejszej metody badawczej nie należy stosować w przypadku substancji chemicznych, które ulatniają się z gleby lub wody i w związku z tym nie utrzymują się w glebie lub odcieku w eksperymentalnych warunkach niniejszej metody badawczej.
INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ
7. Do pomiaru działania wymywającego w kolumnach glebowych wykorzystać można nieoznakowane lub oznakowane izotopowo badane substancje chemiczne. Materiał oznakowany izotopowo jest wymagany w przypadku badania wymywania produktów przemiany (zalegających pozostałości badanej substancji chemicznej) i oznaczania bilansu masy. Do znkowania zaleca się stosowanie 14C, ale wykorzystać można również inne izotopy, takie jak 13C,15N, 3H, 32P. Na ile to możliwe, znacznik powinien być umieszczony w najbardziej stabilnych częściach cząsteczki. Czystość badanej substancji chemicznej powinna wynosić co najmniej 95 %.
8. Większość substancji chemicznych należy stosować jako substancje pojedyncze. W przypadku substancji czynnych zawartych w środkach ochrony roślin w celu zbadania wymywania macierzystej substancji badanej można jednak stosować postacie użytkowe, których zbadanie jest konieczne w szczególności wtedy, gdy mieszanina może wpłynąć na tempo uwalniania (np. postacie użytkowe granulowane lub o kontrolowanym uwalnianiu). Jeżeli chodzi o szczególne wymogi dotyczące projektu badania w odniesieniu do mieszanin, przed jego wykonaniem pomocna może okazać się konsultacja z organem regulacyjnym. W przypadku badań wymywania zalegających pozostałości, wykorzystać należy czystą macierzystą badaną substancję.
9. Przed przystąpieniem do wykonania badań wymywania w kolumnach glebowych, należałoby uzyskać następujące dane na temat badanej substancji chemicznej:
(1) rozpuszczalność w wodzie [metoda badawcza A.6] (13);
(2) rozpuszczalność w rozpuszczalnikach organicznych;
(3) prężność par [metoda badawcza A.4 (13) oraz] stała Henry'ego;
(4) współczynnik podziału n-oktanol/woda [metody badawcze A.8 i A.24] (13);
(5) współczynnik adsorpcji (Kd, Kf lub KOC) [metody badawcze C.18 lub C.19] (13);
(6) hydroliza [metoda badawcza C.7] (13);
(7) stała dysocjacji (pKa) [OECD TG 112] (25);
(8) tlenowa i beztlenowa przemiana w glebie [metoda badawcza C.23] (13).
Uwaga: temperaturę, w której pomiary te zostały wykonane, należy podać w odpowiednich sprawozdaniach z badania.
10. Ilość badanej substancji chemicznej wprowadzonej do kolumn glebowych powinna być wystarczająca, aby umożliwić wykrycie co najmniej 0,5 % zastosowanej dawki w każdym pojedynczym segmencie. W przypadku czynnych substancji chemicznych zawartych w środkach ochrony roślin ilość zastosowanych badanych substancji chemicznych może odpowiadać maksymalnej zalecanej dawce (pojedyncze zastosowanie).
11. Musi być dostępna odpowiednia metoda analityczna o znanej dokładności, precyzji i czułości do ilościowego oznaczania badanej substancji chemicznej oraz, w stosownych przypadkach, produktów jej przemiany w glebie i odcieku. Znana powinna być także analityczna granica wykrywalności badanej substancji chemicznej i jej istotnych produktów przemiany (zazwyczaj co najmniej wszystkich produktów przemiany ≥ 10 % zastosowanej dawki obserwowanej w badaniach dróg przemian, ale najlepiej wszystkich odnośnych istotnych produktów przemiany) (zob. pkt 17).
CHEMICZNA SUBSTANCJA ODNIESIENIA
12. Chemiczne substancje odniesienia o znanym działaniu wymywającym, takie jak atrazyna lub monuron, które uznać można za substancje o średniej skłonności do wymywania w glebie, należy stosować w celu oceny względnego przemieszczania się badanej substancji chemicznej w glebie (1)(8)(11). W celu potwierdzenia hydrodynamicznych właściwości kolumny glebowej użyteczna może być również polarna chemiczna substancja odniesienia nie ulegająca sorpcji ani degradacji (np. tryt, bromek, fluoresceina, eozyna), umożliwiająca śledzenie przemieszczanie się wody w kolumnie.
13. Wzorce analityczne również mogą być przydatne do określenia właściwości lub tożsamości produktów przemiany znajdujących się w segmentach gleby i odciekach przy wykorzystaniu chromatografii, spektroskopii lub innych odpowiednich metod.
DEFINICJE I JEDNOSTKI
14. Zob. dodatek 1.
KRYTERIA JAKOŚCI
Odzysk
15. Suma procentowych ilości badanej substancji chemicznej znajdujących się w segmentach gleby i w odcieku z kolumny po zakończeniu procesu wymywania stanowi odzysk z eksperymentu wymywania. Odzysk powinien mieścić się w zakresie 90-110 % w odniesieniu do substancji chemicznych oznakowanych izotopowo (11) i 70-110 % w odniesieniu do nieoznakowanych substancji chemicznych (8).
Powtarzalność i czułość metody analitycznej
16. Powtarzalność metody analitycznej mającej na celu ilościowe określenie badanej substancji chemicznej i produktów przemiany można sprawdzić, stosując podwójną analizę tego samego ekstraktu z segmentu gleby lub odcieku (zob. pkt 11).
17. Granica wykrywalności metody analitycznej w odniesieniu do badanej substancji chemicznej i produktów przemiany powinna wynosić co najmniej 0,01 mg kg- 1 w przypadku każdego segmentu gleby lub odcieku (jako badanej substancji chemicznej) lub 0,5 % ilości wprowadzonej do któregokolwiek pojedynczego segmentu, w zależności od tego, która z tych wartości jest niższa. Należy określić granicę oznaczalności.
OPIS METODY BADAWCZEJ
Układ badawczy
18. W badaniu wykorzystywane są kolumny do wymywania (podzielne lub niepodzielne) wykonane z odpowiedniego obojętnego materiału (np. szkła, stali nierdzewnej, aluminium, teflonu, polichlorku winylu itd.), których wewnętrzna średnica wynosi co najmniej 4 cm, a wysokość co najmniej 35 cm. Materiał, z którego są wykonane kolumny, należy zbadać pod kątem ewentualnych interakcji z badaną substancją chemiczną lub produktami jej przemiany. Przykłady odpowiednich podzielnych i niepodzielnych kolumn przedstawione zostały w dodatku 2
19. Do wypełniania kolumny i ubijania w nich gleby stosuje się łyżkę, tłok i urządzenie wibracyjne.
20. W celu nawilżenia kolumn glebowych sztucznym deszczem można zastosować tłok lub pompy perystaltyczne, sitka natryskowe, butle Mariotte'a lub zwykłe wkraplacze.
Wyposażenie laboratoryjne i substancje chemiczne
21. Wymagane jest standardowe wyposażenie laboratoryjne, w szczególności następujące urządzenia:
(1) sprzęt laboratoryjny, taki jak aparatura do GLC, HPLC i TLC, włącznie z odpowiednimi systemami detekcyjnymi do analizy oznakowanych i nieoznakowanych substancji chemicznych lub odwróconą metodą rozcieńczeń izotopowych;
(2) przyrządy do celów identyfikacji (np. MS, GC-MS, HPLC-MS, NMR itp.);
(3) scyntylator cieczowy dla badanych substancji chemicznych oznakowanych izotopowo;
(4) utleniacz do spalania oznakowanych materiałów
(5) aparatura do ekstrakcji (na przykład probówki wirówkowe do ekstrakcji na zimno i aparat ekstrakcyjny Soxhleta do ciągłej ekstrakcji z ogrzewaniem pod chłodnicą zwrotną);
(6) aparatura do zatężania roztworów i ekstraktów (np. wyparka rotacyjna),
22. Zastosowane substancje chemiczne obejmują: rozpuszczalniki organiczne do analizy, takie jak aceton, metanol itp.; ciecz scyntylacyjną; 0,01 roztwór M CaCl2 w destylowanej lub dejonizowanej wodzie (= sztuczny deszcz).
Badana substancja chemiczna
23. Aby wprowadzić badaną substancję chemiczną do kolumny glebowej, należy rozpuścić ją w wodzie (dejoni-zowanej lub destylowanej). Jeżeli badana substancja chemiczna jest słabo rozpuszczalna w wodzie, można ją wprowadzić w postaci użytkowej produktu (w stosownych przypadkach po zawieszeniu lub emulgacji w wodzie) albo w dowolnym rozpuszczalniku organicznym. W przypadku zastosowania rozpuszczalnika organicznego należy ograniczyć jego ilość do minimum i odparować z powierzchni kolumny glebowej przed rozpoczęciem procedury wymywania. Postacie użytkowe w formie stałej, takie jak granulki, należy wprowadzać jako ciało stałe bez dodawania wody; aby umożliwić lepsze rozmieszczenie na powierzchni kolumny glebowej użytkowej postaci produktu, przed wprowadzeniem można go wymieszać z niewielką ilością piasku kwarcowego (np. 1 g).
24. Ilość badanej substancji chemicznej wprowadzonej do kolumn glebowych powinna być wystarczająca, aby umożliwić wykrycie co najmniej 0,5 % zastosowanej dawki w każdym pojedynczym segmencie. W przypadku czynnych substancji chemicznych zawartych w środkach ochrony roślin ilość ta może odpowiadać maksymalnej zalecanej dawce (pojedyncze zastosowanie), a w przypadku wymywania zarówno substancji macierzystej, jak i zalegających pozostałości, powinna być powiązana z powierzchnią zastosowanej kolumny glebowej 26 .
Chemiczna substancja odniesienia
25. W badaniach wymywania należy zastosować chemiczną substancję odniesienia (zob. pkt 12). Należy ją wprowadzić na powierzchnię kolumny glebowej w podobny sposób jak badaną substancję chemiczną i w odpowiedniej dawce, umożliwiającej właściwe wykrycie albo jako wewnętrzny wzorzec znajdujący się w tej samej kolumnie glebowej, co badana substancja chemiczna, albo oddzielnie w oddzielnej kolumnie glebowej. Zaleca się wprowadzenie obydwu substancji chemicznych w tej samej kolumnie poza przypadkami, w których obydwie substancje chemiczne są oznakowane w podobny sposób.
Gleby
Wybór gleby
26. W celu zbadania wymywania w odniesieniu do macierzystej badanej substancji chemicznej zastosować należy 3-4 rodzaje gleby różniące się pH, zawartością węgla organicznego i teksturą (12). Wytyczne dotyczące wyboru gleb do eksperymentów wymywania przedstawione zostały poniżej w Tabeli 1. W przypadku badanych substancji chemicznych ulegających jonizacji wybrane rodzaje gleby powinny obejmować szereg pH w celu oceny przemieszczania się substancji chemicznej w jej formie zjonizowanej i niezjonizowanej; co najmniej 3 rodzaje gleby powinny posiadać pH, w przypadku którego badana substancja chemiczna znajduje się w swojej mobilnej postaci.
Tabela 1
Wytyczne dotyczące wyboru rodzajów gleby do badań wymywania
| Gleba nr | Wartość pH | Węgiel organiczny % | Zawartość gliny % | Tekstura (*) |
| 1 | >,.5 | 3,5 - 5,0 | 20 - 40 | glina ilasta |
| 2 | 5,5 - 7,0 | 1,5 - 3,0 | 15 - 25 | pył ilasty |
| 3 | 4,0 - 5,5 | 3,0 - 4,0 | 15 - 30 | glina zwykła |
| 4 | < 4,0 - 6,0 § | < 0,5 - 1,5 § ‡ | < 10 - 15 § | piasek gliniasty |
| 5 | < 4,5 | > 10 # | < 10 | piasek gliniasty/piasek |
| (*) Zgodnie z systemami FAO i Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (14). § Wartości odpowiednich zmiennych powinny w miarę możliwości mieścić się w podanym zakresie. Jeżeli jednak wystąpią trudności ze znalezieniem odpowiedniego materiału glebowego, akceptuje się wartości poniżej wskazanego minimum. ‡ Gleby o zawartości węgla organicznego wynoszącej mniej niż 0,3 % mogą zaburzyć korelację między organiczną zawartością a adsorpcją. W związku z tym zaleca się stosować gleby o minimalnej zawartości węgla organicznego wynoszącej 0,3 %. # Gleby o bardzo wysokiej zawartości węgla (np. > 10 %) mogą nie być akceptowane przez organy regulacyjny, np. w przypadku rejestracji pestycydów. |
27. Czasem niezbędne mogą być inne rodzaje gleb, aby reprezentowały chłodniejsze, umiarkowane i tropikalne regiony. W związku z tym, jeżeli zaleca się wykorzystanie innych rodzajów gleb, powinny one charakteryzować się takimi samymi parametrami i wykazywać podobne zmiany we właściwościach, jak opisane w wytycznych dotyczących wyboru gleby do badań wymywania (zob. tabela 1 powyżej), nawet jeżeli nie spełniają dokładnie kryteriów.
28. W przypadku badań wymywania z "zalegającymi pozostałościami" należy zastosować jedną glebę (12). Powinna ona zawierać > 70 % piasku i 0,5-1,5 % węgla organicznego (np. gleba nr 4 w Tabeli 1). Może być konieczne użycie większej liczby rodzajów gleby, jeżeli istotne są dane dotyczące produktów przemiany.
29. Wszystkie gleby należy scharakteryzować co najmniej w odniesieniu do tekstury [ % piasku, % mułu, % gliny zgodnie z systemami klasyfikacji FAO i Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (14)], pH, pojemności wymiany kationów, zawartości węgla organicznego, gęstości objętościowej (w przypadku gleby o naruszonej strukturze) oraz pojemności wodnej. Pomiar biomasy mikroorganizmów wymagany jest jedynie w przypadku gleby wykorzystywanej w okresie starzenia/inkubacji przed wykonaniem eksperymentu wymywania zalegających pozostałości. Przy interpretacji wyników tego badania mogą okazać się przydatne informacje dotyczące dodatkowych właściwości gleby (np. klasyfikacja gleby, mineralogia gliny, powierzchnia właściwa). W celu określenia właściwości gleby zastosować można metody zalecane w pozycjach bibliografii (15)(16)(17) (18)(19).
Gromadzenie i przechowywanie gleb
30. Gleby należy pobierać z górnej warstwy (A - poziom próchniczny) do maksymalnej głębokości 20 cm. Należy usunąć pozostałości roślinności, makrofauny i kamieni. Gleby (oprócz wykorzystanych do starzenia badanej substancji chemicznej) suszy się na powietrzu w temperaturze pokojowej (najlepiej 20-25 C). Rozdrobnienie powinno być przeprowadzane z minimalną siłą, tak aby pierwotna tekstura gleby uległa jak najmniejszym zmianom. Gleby przesiewa się przez sito o oczkach ≤ 2 mm. Zalecana jest staranna homogenizacja, gdyż poprawia ona odtwarzalność wyników. Przed użyciem gleby mogą być przechowywane w temperaturze otoczenia i suszone na powietrzu (12). Nie ma zalecanej granicy czasu przechowywania, lecz gleby przechowywane dłużej niż trzy lata powinny być ponownie przeanalizowane przed użyciem pod względem zawartości węgla organicznego i pH.
31. Powinny być dostępne szczegółowe informacje na temat historii obszarów, z których pobrana została badana próbka gleby. Szczegółowe informacje obejmują dokładną lokalizację [dokładnie określoną w układzie UTM (Universal Transverse Mercato-Projection/European Horizontal Datum) lub za pomocą współrzędnych geograficznych], pokrywę roślinną, zabiegi z użyciem środków ochrony roślin, stosowanie nawozów organicznych i nieorganicznych, dodatki materiału biologicznego lub przypadkowe zanieczyszczenia (12). Gleby, które były poddawane działaniu badanej substancji chemicznej lub jej strukturalnych analogów w ciągu ostatnich czterech lat, nie powinny być stosowane do badań wymywania.
Warunki badania
32. W trakcie badania kolumny glebowe wykorzystywane w badaniu wymywania należy przechowywać bez dostępu światła w temperaturze otoczenia, dopóki utrzymuje się ona w zakresie ± 2 °C. Zalecane temperatury mieszczą się w zakresie 18-25 °C.
33. Nawadnianie sztucznym deszczem (0,01 M CaCl2) należy stosować w sposób ciągły na powierzchni kolumn glebowych w ilości 200 mm przez okres 48 godzin 27 ; ilość ta stanowi ekwiwalent zastosowania 251 ml w kolumnie o wewnętrznej średnicy wynoszącej 4 cm. Jeżeli jest to konieczne dla celów badania, można dodatkowo zastosować inne ilości sztucznego deszczu lub dłuższy okres trwania.
Wykonanie badania
Wymywanie w przypadku macierzystej badanej substancji chemicznej
34. Co najmniej dwie kolumny do wymywania wypełnia się niepoddaną działaniu substancji chemicznej, wysuszoną na powietrzu i przesianą glebą (< 2 mm) do wysokości około 30 cm W celu uzyskania jednolitego wypełnienia glebę dodaje się do kolumn w małych porcjach za pomocą łyżki i dociska tłokiem, jednocześnie delikatnie wibrując kolumnę do momentu, kiedy górna część słupa gleby już się nie obniża. Jednolite rozmieszczenie jest wymagane ze względu na uzyskanie odtwarzalnych wyników z kolumn do wymywania. W celu uzyskania szczegółowych informacji o technikach wypełniania kolumn glebą, zob. pozycje bibliografii (20), (21) i (22). Aby kontrolować odtwarzalność procedury wypełniania, wyznacza się całkowitą masę gleby umieszczonej w kolumnach 28 ; masa w kolumnach stanowiących duplikaty powinna być podobna.
35. Po wypełnieniu kolumny glebowe wstępnie nawilża się sztucznym deszczem (0,01 M CaCl2) od dołu do góry w celu wyparcia powietrza z porów gleby przez wodę. Następnie kolumny glebowe pozostawia się do ustabilizowania, a nadmiar wody jest odprowadzany grawitacyjnie. Metody nasycenia kolumn przedstawione zostały w pozycji bibliografii (23).
36. Następnie do kolumn glebowych wprowadza się badaną substancję chemiczną lub chemiczną substancję odniesienia (zob. również pkt 23-25). W celu uzyskania równomiernego rozprowadzenia roztworów, zawiesin lub emulsji badanej substancji chemicznej lub substancji chemicznej odniesienia należy rozprowadzić ją równomiernie na powierzchni kolumn glebowych. Jeżeli w przypadku badanej substancji chemicznej zaleca się połączenie jej z glebą, należy wymieszać ją z niewielką ilością (np. 20 g) gleby i umieścić na powierzchni kolumny glebowej.
37. Powierzchnię kolumn glebowych przykrywa się następnie krążkiem ze spiekanego szkła, kulkami szklanymi, filtrami z włókna szklanego lub krążkami bibuły filtracyjnej w celu równomiernego rozmieszczenia sztucznego deszczu na całej powierzchni oraz uniknięcia naruszenia powierzchni gleby przez krople deszczu. Im większa średnica kolumny, tym większą ostrożność należy zachować przy nawadnianiu sztucznym deszczem kolumn glebowych, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie sztucznego deszczu na powierzchni gleby. Następnie nawadnia się kolumny glebowe sztucznym deszczem metodą kroplową za pomocą tłoka, pompy perystaltycznej lub wkraplacza. Zaleca się zbieranie odcieków we frakcjach oraz zapisywanie ich poszczególnych objętości 29 .
38. Po wymyciu i odsączeniu kolumn, kolumny glebowe dzieli się na odpowiednią liczbę segmentów, w zależności od informacji, które chce się uzyskać z badania; segmenty poddaje się ekstrakcji za pomocą odpowiednich rozpuszczalników lub mieszanin rozpuszczalników i analizuje pod kątem obecności badanej substancji chemicznej oraz, w stosownych przypadkach, pod kątem produktów przemiany, całkowitej promieniotwórczości i substancji chemicznej odniesienia. Odcieki i frakcje odcieków analizuje się bezpośrednio lub po ekstrakcji tych samych produktów. W przypadku zastosowania oznakowanych izotopowo badanych substancji chemicznych należy określić wszystkie frakcje zawierające ≥ 10 % zastosowanej promieniotwórczości.
Wymywanie w przypadku zalegających pozostałości
39. Świeża gleba (nie wysuszona wcześniej na powietrzu) poddawana jest działaniu badanej substancji chemicznej oznakowanej izotopowo w dawce odpowiadającej powierzchni kolumn glebowych (zob. pkt 24) i poddawana inkubacji w warunkach tlenowych zgodnie z metoda badawczą C.23 (13). Okres inkubacji (starzenia) powinien być wystarczająco długi, aby umożliwić wytworzenie znacznych ilości produktów przemiany; zaleca się zastosowanie okresu starzenia odpowiadającego czasowi połowicznego rozpadu badanej substancji chemicznej 30 , nie powinien on jednak przekraczać 120 dni. Przed wymywaniem należy przeanalizować postarzoną glebę pod kątem badanej substancji chemicznej i produktów jej przemiany.
40. Kolumny do wymywania wypełnia się do wysokości 28 cm tą samą glebą (ale suszoną na powietrzu), którą wykorzystano w doświadczeniu starzenia opisanym w pkt 34, a także oznacza się również całkowitą masę wypełnionych kolumn glebowych. Kolumny glebowe nawilża się wstępnie jak opisano w pkt 35.
41. Następnie badaną substancję chemiczną i produkty jej przemiany wprowadza się na powierzchnię kolumn glebowych w formie zalegających pozostałości glebowych (zob. pkt 39) jako segment gleby o grubości 2 cm. Całkowita wysokość kolumn glebowych (gleba nie poddana działaniu substancji chemicznej + postarzona gleba) nie powinna przekraczać 30 cm (zob. pkt 34).
42. Wymywanie przeprowadza się w sposób opisany w pkt 37.
43. Po wymyciu segmenty gleby i odcieki analizuje się, jak opisano w pkt 38, pod kątem badanej substancji chemicznej, produktów jej przemiany i nieekstrahowanej promieniotwórczości. W celu określenia, ile zalegających pozostałości zatrzymanych zostało w 2 cm górnej warstwie po wymyciu, należy ten segment przeanalizować odrębnie.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Opracowanie wyników
44. Ilości badanej substancji chemicznej, produktów przemiany, nieekstrahowalnych pozostałości oraz, jeżeli wykorzystana została w badaniu, chemicznej substancji odniesienia należy podać w % zastosowanej początkowej dawki w odniesieniu do każdego segmentu gleby i frakcji odcieku. W odniesieniu do każdej kolumny należy przedstawić wykres z naniesionymi uzyskanymi wartościami procentowymi w funkcji głębokości warstwy gleby.
45. Jeżeli w badaniach wymywania w kolumnie zastosowana została chemiczna substancja odniesienia, wymywanie substancji chemicznej może zostać ocenione we względnej skali z wykorzystaniem czynników względnej mobilności (RMF; zob. definicja w dodatku 3) (1)(11), co umożliwia porównanie danych dotyczących wymywania różnych substancji chemicznych uzyskanych w odniesieniu do różnych rodzajów gleby. Przykłady wartości czynników względnej mobilności w odniesieniu do różnych chemicznych środków ochrony roślin podane zostały w dodatku 3.
46. Szacunkowe wartości Koc (współczynnika adsorpcji znormalizowanego zawartością węgla organicznego) i Kom (współczynnika rozkładu znormalizowanego substancją organiczną) można również uzyskać na podstawie wyników wymywania w kolumnie, wykorzystując średnią drogę wymywania lub ustalone korelacje między czynnikiem względnej mobilności RMF oraz odpowiednio Kom i Koc (4), lub stosując teorię chromatografii (24). Jednak należy zachować ostrożność, stosując tę drugą metodę, biorąc zwłaszcza pod uwagę fakt, że proces wymywania nie obejmuje samych tylko warunków nasyconego przepływu, a raczej układy nienasycone.
Interpretacja wyników
47. Opisane w niniejszej metodzie badania wymywania w kolumnie umożliwiają określenie potencjału wymywania lub mobilności badanej substancji chemicznej w glebie (w badaniu wymywania substancji macierzystej) lub produktów jej przemiany (w badaniu wymywania zalegających pozostałości). Badania te nie pozwalają przewidzieć pod względem ilościowym działania wymywającego w warunkach terenowych, ale mogą zostać wykorzystane dla porównania "zdolności do wymywania" jednej substancji chemicznej z innymi substancjami chemicznymi o znanym działaniu wymywającym (24). Podobnie nie pozwalają określić ilościowo procentowej części zastosowanej substancji chemicznej, która może dotrzeć do wody gruntowej (11). Wyniki badań wymywania w kolumnie mogą jednak pomóc w podjęciu decyzji, czy należy wykonać dodatkowe badanie w warunkach terenowych lub zbliżonych do terenowych w odniesieniu do substancji chemicznych wykazujących wysoki potencjał mobilności w badaniach laboratoryjnych.
Sprawozdanie z badania
48. Sprawozdanie musi zawierać następujące informacje:
Badana substancja chemiczna oraz chemiczna substancja odniesienia (jeżeli została wykorzystana)
- nazwa zwyczajowa, nazwa systematyczna (nomenklatura IUPAC i CAS), numer CAS, struktura chemiczna (wskazanie pozycji znacznika w przypadku zastosowania materiału znakowanego izotopowo) oraz istotne właściwości fizykochemiczne;
- czystość (zanieczyszczenia) badanej substancji chemicznej;
- radiochemiczna czystość oznakowanej substancji chemicznej oraz aktywność właściwa (w razie potrzeby).
Badane gleby:
- szczegółowe informacje dotyczące miejsca pobrania;
- właściwości gleb, takie jak pH, zawartość węgla organicznego i gliny, tekstura oraz gęstość objętościowa (w przypadku gleby o naruszonej strukturze);
- aktywność mikroorganizmów w glebie (tylko w przypadku gleby wykorzystywanej do starzenia badanej substancji chemicznej);
- czas i warunki przechowywania gleby.
Warunki badania:
- daty wykonywania badań;
- długość i średnica kolumn do wymywania;
- całkowita masa gleby w kolumnach glebowych;
- ilość wprowadzanej badanej substancji chemicznej oraz, w stosownych przypadkach, chemicznej substancji odniesienia;
- ilość, częstotliwość i czas zastosowania sztucznego deszczu;
- temperatura prowadzenia eksperymentu;
- liczba powtórzeń (co najmniej dwa);
- metody analizy badanej substancji chemicznej, produktów przemiany oraz, w stosownych przypadkach, chemicznej substancji odniesienia w różnych segmentach gleby i odciekach;
- metody charakteryzowania i identyfikacji produktów przemiany w segmentach gleb i odciekach.
Wyniki badania:
- tabele wyników wyrażonych jako stężenia oraz jako % zastosowanej dawki w odniesieniu do segmentów gleby i odcieków;
- bilans masy, w stosownych przypadkach;
- objętości odcieku;
- długość dróg wymywania oraz, w stosownych przypadkach, czynniki względnej mobilności;
- graficzny wykres zawartości % w segmentach gleby w funkcji głębokości segmentu gleby;
- omówienie i interpretacja wyników.
BIBLIOGRAFIA
(1) Guth, J.A., Burkhard, N. i Eberle, D.O. (1976). Experimental Models for Studying the Persistence of Pesticides in Soil. Proc. BCPC Symposium: Persistence of Insecticides and Herbicides.
(2) Russel M.H. (1995). Recommended approaches to assess pesticide mobility in soil (w przygotowaniu). W: Pesticide Biochemistry and Toxicology, Vol. 9 (Environmental Behaviour of Agrochemicals - T.R. Roberts i P.C. Kearney, red.). J. Wiley & Sons.
(3) Briggs G.G. (1981). Theoretical and experimental relationships between soil adsorption, octanol-water partition coefficients, water solubilities, bioconcentration factors, and the parachor. J.Agric. Food Chem. 29, 1050-1059.
(4) Chiou, C.T., Porter, P.E. i Schmedding, D.W. (1983). Partition equilibria of non-ionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol. 17, 227-231.
(5) Guth, J.A. (1983). Untersuchungen zum Verhalten von Pflanzenschutzmitteln im Boden. Bull. Bodenkundliche Gesellschaft Schweiz 7, 26-33.
(6) Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (1982). Pesticide Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environmental Fate.
(7) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate Guidelines for registration of pesticides in Canada.
(8) Załącznik I do dyrektywy Komisji 95/36/WE z dnia 14 lipca 1995 r. zmieniającej dyrektywę Rady 91/414/EWG dotyczącą wprowadzania do obrotu środków ochrony roślin (Tekst mający znaczenie dla EOG), Dz.U. L 172 z 22.7.1995, s. 8.
(9) Niderlandzka Komisja ds. Rejestracji Pestycydów (1991). Application for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
(10) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflanzenschutzmitteln, Teil IV, 4-2. Versickerungsverhalten von Pflanzenschutzmitteln.
(11) SETAC (1995). Procedury oceny losów w środowisku i ekotoksyczności pestycydów. Mark R. Lynch, red.
(12) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Selection of Soils/Sediments. Belgirate, Włochy, 18-20 styczeń 1995 r.
(13) Następujące rozdziały niniejszego załącznika: Rozdział A.4, Prężność par
Rozdział A.6, Rozpuszczalność w wodzie
Rozdział A.8, Współczynnik podziału, metoda wytrząsania w kolbie
Rozdział A.24, Współczynnik podziału, wysokosprawna chromatografia cieczowa
Rozdział C.7, Degradacja - degradacja abiotyczna: hydroliza jako funkcja pH
Rozdział C.18, Adsorpcja/desorpcja z wykorzystaniem metody równowagi partii
Rozdział C.23, Tlenowa i beztlenowa przemiana w glebie
(14) Soil Texture Classification (systemy US i FAO). Weed Science, 33, suplement 1 (1985) oraz Soil Sci. Soc. Amer. Proc. 26, 305 (1962).
(15) Methods of Soil Analysis (1986). Część 1, Physical and Mineralogical Methods (A. Klute, red.). Agronomy Series Nr 9, wydanie 2.
(16) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Microbiological Properties (A.L. Page, R.H. Miller i D.R. Kelney (red.). Seria dotycząca agronomii, nr 9, wydanie 2.
(17) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality - General aspects; chemical and physical methods of analysis; biological methods of analysis. Wydanie 1.
(18) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt nad Menem.
(19) Scheffer, F. i P. Schachtschabel (1998). Lehrbuch der Bodenkunde. F. Enke Verlag, Stuttgart.
(20) Weber, J.B. i T.F. Peeper (1977). (1977). Research Methods in Weed Science, wydanie 2. (B. Truelove, red.). Soc. Weed Sci., Auburn, Alabama, 73-78.
(21) Weber, J.B., Swain, L.R., Strek, H.J. i Sartori, J.L. (1986). W: Research Methods in Weed Science, wydanie 3. (N. D. Camper, red.). Soc. Weed Sci., Champaign, IL, 190-200.
(22) Oliveira, et al. (1996). Packing of sands for the production of homogeneous porous media. Soil Sci. Soc. Amer. J. 60(1): 49-53.
(23) Shackelford C. D. (1991). Laboratory diffusion testing for waste disposal. - A review. J. Contam. Hydrol. 7, 177-217.
(24) (Hamaker, J.W. (1975). Interpretation of soil leaching experiments. W: Environmental Dynamics of Pesticides (R. Haque, V.H. Freed, red.), 115-133. Plenum Press, Nowy York.
(25) OECD (1981). Dissociation constants in water. Wytyczne OECD dotyczące badania substancji chemicznych, nr 4112, OECD, Paryż.
Dodatek 1
Definicje i jednostki
Zalegające pozostałości w glebie: badana substancja chemiczna i produkty przemiany obecne w glebie po zastosowaniu i po wystarczająco długim okresie umożliwiającym transport, adsorpcję, metabolizm i procesy rozproszenia, aby nastąpiła zmiana rozmieszczenia i chemicznego charakteru części zastosowanej substancji chemicznej (1).
Sztuczny deszcz: 0,01 M roztworu CaCl2 w destylowanej lub dejonizowanej wodzie.
Średnia droga wymywania: dolna część sekcji gleby, w której łączna ilość odzyskanej substancji chemicznej = 50 % odzyskanej badanej substancji chemicznej ogółem [zwykły eksperyment wymywania] lub (dolna część sekcji gleby, w której łączna ilość odzyskanej substancji chemicznej = 50 % odzyskanej substancji chemicznej ogółem) - ((grubość warstwy zalegających pozostałości)/2) [badanie wymywania zalegających pozostałości]
Substancja chemiczna: oznacza substancję lub mieszaninę.
Odciek: faza wodna przesączona przez profil glebowy lub kolumnę glebową (1).
Wymywanie: proces w wyniku którego substancja chemiczna przemieszcza się w dół profilu glebowego lub kolumny glebowej (1).
Droga wymywania: najgłębiej położony segment gleby, w którym po procesie wymywania wykryto ≥ 0,5 % zastosowanej badanej substancji chemicznej lub zalegających pozostałości (ekwiwalent głębokości przenikania).
Granica wykrywalności i granica oznaczalności: granica wykrywalności jest to stężenie substancji chemicznej, poniżej którego nie można odróżnić substancji chemicznej od artefaktów analitycznych. Granica oznaczalności jest to stężenie substancji chemicznej, poniżej którego nie można oznaczyć stężenia z zadowalającą dokładnością.
Czynnik względnej mobilności: (droga wymywania badanej substancji chemicznej (cm)) / (droga wymywania chemicznej substancji odniesienia (cm))
Badana substancja chemiczna: oznacza dowolną substancję lub mieszaninę badaną za pomocą opisywanej metody badawczej
Produkt przemiany: wszystkie substancje chemiczne powstałe w wyniku biotycznych lub abiotycznych reakcji przemiany badanej substancji chemicznej, w tym CO2 i produkty związane w pozostałościach.
Gleba: jest mieszaniną mineralnych i organicznych składników chemicznych, przy czym te ostatnie zawierają związki o wysokiej zawartości węgla i azotu oraz o dużych masach cząsteczkowych, zamieszkana przez drobne (najczęściej mikro-) organizmy. Gleba może być wykorzystana w dwóch stanach:
- niezakłóconym, w jakim powstawała z upływem czasu, z charakterystycznymi warstwami różnych rodzajów gleb;
- zakłóconym, jak to ma na ogół miejsce na polach uprawnych lub kiedy próbki są pobierane przez kopanie i stosowane w tej metodzie badawczej (2).
(1) Holland P.T. (1996). Glossary of Terms Relating to Pesticides. IUPAC Reports on Pesticide (36). Pure & Appl. Chem. 68, 1167-1193.
(2) OECD Test Guideline 304 A: Inherent Biodegradability in Soil (przyjęta 12 maja 1981 r.).
Dodatek 2
Rysunek 1
Przykład niepodzielnych kolumn do wymywania wykonanych ze szk o długości 35 cm i wewnętrznej średnicy 5 cm (1)
(1) Drescher N. (1985). Moderner Acker- und Pflanzenbau aus Sicht der Pflanzenschutzmittelindustrie. W: Unser Boden - 70 Jahre Agrarforschung der BASF AG, 225-236. Verlag Wissenschaft und Politik, Kolonia.
Rysunek 2
Przykład podzielnej kolumny z metalu o wewnętrznej średnicy 4 cm
(1) Burkhard, N., Eberle D.O. i Guth, J.A. (1975). Model systems for studying the environmental behaviour of pesticides. Environmental Quality and Safety, Suppl. Vol. III, 203-213.
Dodatek 3
Przykłady wartości czynników względnej mobilności (RMF) (*) chemicznych środków ochrony roślin (1)(2) i odpowiednie klasy mobilności +
| Zakres RMF | Substancja chemiczna (RMF) | Klasa mobilności |
| ≤ 0,15 | Paration (< 0,15), Flurodifen (0,15) | I niemobilna |
| 0,1 - 50,8 | Profenofos (0,18), Propikonazol (0,23), Diazynon (0,28), Diuron (0,38), Terbutylazyna (0,52), Metydation (0,56), Prometryn (0,59), Propazyna (0,64) Alachlor (0,66), Metolachlor (0,68) | II słabo mobilna |
| 0,8 - 1,3 | Monuron (**) (1,00), Atrazyna (1,03), Symazyna (1,04), Fluometuron (1,18) | III umiarkowanie mobilna |
| 1,3 - 2,5 | Prometon (1,67), Cyjanazyna (1,85), Bromacil (1,91) Karbutilat (1,98) | IV dość mobilna |
| 2,5 - 5,0 | Karbofuran (3,00), Dioksakarb (4,33) | V mobilna |
| > 5,0 | Monokrotofos (> 5,0), Dikrotofos (> 5,0) | VI bardzo mobilna |
| (*) Czynnik względnej mobilności wyprowadza się w następujący sposób (3):
|
| (**) Chemiczna substancja odniesienia + Podstawą innych systemów klasyfikacji mobilności substancji chemicznej w glebie są wartości Rf z chromatografii cienkowarstwowej gleby (4) i wartości Koc (5)(6). |
(1) Guth, J.A. (1985). Adsorption/desorption. Na wspólnym międzynarodowym sympozjum pt. "Physicochemical Properties and their Role in Environmental Hazard Assessment". Canterbury, Zjednoczone Królestwo, 1-3 lipca 1985 r.
(2) Guth, J.A. i Hörmann, W.D. (1987). Problematik und Relevanz von Pflanzenschutzmittel-Spuren im Grund (Trink-) Wasser. Schr.Reihe Verein WaBoLu, 68, 91-106.
(3) Harris C.I. (1967). Movement of herbicides in soil. Weeds 15, 214-216.
(4) Helling C.S. (1971). Pesticide mobility in soils. Soil Sci. Soc. Am. Proc. 35, 743-748.
(5) McCall, P.J., Laskowski, D.A., Swann, R.L. i Dishburger, H.J. (1981). Measurements of sorption coefficients of organic chemicals and their use in environmental fate analysis. W: Test Protocols for Environmental Fate and Movement of Toxicants. Materiały z sympozjum AOAC, AOAC, Waszyngton D.C.
(6) Hollis, J.M. (1991). Mapping the vulnerability of aquifers and surface waters to pesticide contamination at the national/regional scale. BCPC Monograph No. 47 Pesticides in Soil and Water, 165-174.
C.45. OSZACOWANIE EMISJI DO ŚRODOWISKA Z DREWNA PODDANEGO DZIAŁANIU ŚRODKÓW KONSERWUJĄCYCH: METODA LABORATORYJNA STOSOWANA W ODNIESIENIU DO PRODUKTÓW Z DREWNA. KTÓRE NIE SĄ POKRYTE I MAJĄ STYCZNOŚĆ Z WODĄ SŁODKĄ LUB WODĄ MORSKĄ
WPROWADZENIE
1. Opisywana metoda badawcza jest równoważna z wytyczną OECD nr 313 (2007 r.) w sprawie badań. Emisje do środowiska z drewna poddanego działaniu środka konserwującego należy określać ilościowo, aby umożliwić ocenę ryzyka środowiskowego, jakie stwarza zakonserwowane drewno. W niniejszej metodzie badawczej opisano laboratoryjną metodę szacowania emisji z drewna poddanego działaniu środka konserwującego w dwóch sytuacjach, w których zanieczyszczenia mogą przeniknąć do środowiska:
- emisje z zakonserwowanego drewna, mającego styczność z wodą słodką. Emisje z powierzchni zakonserwowanego drewna mogą przedostać się do wody.
- emisje z zakonserwowanego drewna, mającego styczność z wodą morską. Emisje z powierzchni zakonserwowanego drewna mogą przedostać się do wody morskiej.
2. Niniejsza metoda badawcza ma na celu zbadanie emisji z drewna i produktów z drewna, które nie są pokryte i mają styczność z wodą słodką lub morską. Klasy użytkowania stosowane są w skali międzynarodowej i służą do klasyfikacji zagrożeń biologicznych, na które narażony będzie towar poddany działaniu substancji. Klasy użytkowania definiują także sytuacje, w których zakonserwowany produkt jest użytkowany, oraz określają elementy środowiska (powietrze, woda, gleba), dla których drewno poddane działaniu środka konserwującego stanowi potencjalne ryzyko.
3. Metoda badawcza stanowi laboratoryjną procedurę pozyskiwania próbek (substancji emitowanych) z wody, w której zanurzone zostało drewno poddane działaniu substancji, w rosnących odstępach czasowych po narażeniu. Ilość emisji w substancji emitowanej powiązana jest z wielkością powierzchni drewna i długością narażenia w celu oszacowania przepływu w mg/m2/dzień. Przepływ (tempo wymywania) można zatem oszacować na podstawie rosnących okresów narażenia.
4. Ilość emisji może zostać wykorzystana do oceny ryzyka środowiskowego drewna poddanego działaniu substancji.
WSTĘPNE ROZWAŻANIA
5. Nie zakłada się identycznego charakteru i intensywności mechanizmu wymywania z powierzchni drewna przez wodę słodką i przez wodę morską. Zatem w przypadku wyrobów konserwujących do drewna lub ich mieszanin wykorzystywanych do zabezpieczania drewna wykorzystywanego w środowisku morskim konieczne jest przeprowadzenie badania wymywania w wodzie morskiej.
6. W przypadku drewna zakonserwowanego środkiem konserwującego należy wykorzystywać drewno reprezentatywne dla drewna znajdującego się w handlu. Drewno powinno być zakonserwowane zgodnie z instrukcją producenta środka konserwującego oraz zgodnie z odpowiednimi standardami i specyfikacjami. Przed rozpoczęciem badania ustalić należy parametry kondycjonowania drewna po konserwacji.
7. Próbki drewna powinny być reprezentatywne dla użytkowanych wyrobów (np. w odniesieniu do gatunku, gęstości i innych cech charakterystycznych).
8. Badanie można zastosować do drewna, stosując proces nasycania albo nakładania powierzchniowego, albo do drewna impregnowanego, którego powierzchnia została dodatkowo obowiązkowo zabezpieczona (np. farbą, którą stosuje się obowiązkowo w celach handlowych).
9. Skład, ilość, pH i fizyczna forma wody są istotne przy oznaczaniu ilości, zawartości i charakteru emisji z drewna.
ZASADA METODY BADANIA
10. Próbki drewna impregnowanego środkiem konserwującym przeznaczone do badań zanurzane są w wodzie. Wodę (próbkę substancji emitowanej) pobiera się i wielokrotnie analizuje pod względem chemicznym przez okres narażenia wystarczająco długi, aby wykonać obliczenia statystyczne. Poziomy emisji w mg/m2/dzień oblicza się na podstawie wyników badań. Należy odnotowywać okresy pobierania próbek. Badania z próbkami nie poddanymi działaniu środka można przerwać, jeżeli w trzech pierwszych punktach danych nie wykryto żadnego tła.
11. Włączenie do badania próbek drewna niezakonserwowanego umożliwia określenie poziomów tła w przypadku emisji z drewna innej niż wynikająca z zastosowanego środka konserwującego.
KRYTERIA JAKOŚCI
Dokładność
12. Dokładność metody badawczej służącej do oszacowania emisji zależy od reprezentatywności próbek do badań w odniesieniu do drewna impregnowanego obecnego w handlu, reprezentatywności wody w odniesieniu do wody w warunkach rzeczywistych oraz reprezentatywności systemu narażenia w stosunku do warunków naturalnych.
13. Dokładność, precyzję i powtarzalność metody analitycznej należy określić przed wykonaniem badania.
Odtwarzalność
14. Pobiera się i analizuje trzy próbki wody, a średnią wartość przyjmuje się jako wartość emisji. Odtwarzalność wyników w przypadku jednego laboratorium i w różnych laboratoriach zależy od schematu zanurzania oraz drewna wykorzystanego jako próbki do badań.
Akceptowalny zakres wyników
15. Za akceptowalny uznaje się taki zakres wyników badania, w przypadku którego różnica pomiędzy górną a dolną wartością wynosi mniej niż jeden rząd wielkości.
WARUNKI BADANIA
Woda
16. Scenariusz wymywania w wodzie słodkiej: w badaniach wymywania, w których przeprowadza się ocenę drewna narażonego na kontakt z wodą słodką, zaleca się stosowanie wody dejonizowanej (np. ASTM D 1193 Type II). Temperatura wody powinna wynosić 20 +/- 2 °C, a zmierzone pH i temperaturę wody należy podać w sprawozdaniu z badania. Analiza próbek użytej wody pobranych przed zanurzeniem badanych próbek drewna umożliwia oszacowanie zawartości analizowanej substancji chemicznej w wodzie. Stanowi ona próbę kontrolną do oznaczenia poziomów tła substancji chemicznych, które są następnie analizowane pod względem chemicznym.
17. Scenariusz wymywania z wodą morską: w badaniach wymywania, w których przeprowadza się ocenę drewna narażonego na kontakt z wodą morską, zaleca się zastosowanie syntetycznej wody morskiej (np. ASTM D 1141 Substitute Ocean Water, without Heavy Metals). Temperatura wody powinna wynosić 20 +/-2 °C, a zmierzone pH i temperaturę wody należy podać w sprawozdaniu z badania. Analiza próbek użytej wody pobranych przed zanurzeniem badanych próbek drewna umożliwia oszacowanie zawartości analizowanej substancji chemicznej w wodzie. Stanowi ona próbę kontrolną do oznaczania poziomów tła istotnych substancji chemicznych.
Próbki drewna użytego do badań
18. Gatunki drewna powinny być typowe dla gatunków drewna wykorzystywanych w badaniach skuteczności środków konserwujących do drewna. Do zalecanych gatunków zaliczają się Pinus sylvestris L. (sosna zwyczajna), Pinus resinosa Ait. (sosna czerwona) lub Pinus spp (sosna południowa). Można wykonać dodatkowe badania, wykorzystując inne gatunki.
19. Wykorzystać należy drewno o prostych włóknach bez sęków. Należy unikać stosowania materiału z widocznymi wyciekami żywicy. Drewno powinno być typowe dla drewna dostępnego w handlu. Należy zanotować źródło pochodzenia, gęstość i liczbę rocznych pierścieni przypadających na 10 mm.
20. Zaleca się, aby próbki drewna użyte do badań stanowiły zestawy pięciu bloków o wymiarach zgodnych z normą PN-EN 113:2000 (25 mm × 50 mm × 15 mm) z powierzchniami wzdłużnymi równoległymi do słojów drewna, chociaż można również stosować inne wymiary, np. 50 mm na 150 mm na 10 mm. Próbkę drewna użytą do badań należy całkowicie zanurzyć w wodzie. Próbki drewna użyte do badań powinny składać się w 100 % z bieli. Każdą próbkę drewna można oznakować w wyjątkowy sposób, tak aby można było ją identyfikować w trakcie badania.
21. Wszystkie próbki drewna użyte do badań powinny być oheblowane lub tarte, a ich powierzchnia nie powinna być oszlifowana.
22. W analizie wykorzystać należy co najmniej pięć zestawów próbek drewna użytych do badania: trzy zestawy próbek drewna należy poddać działaniu środka konserwującego, jednego zestawu próbek drewna nie należy poddawać działaniu tego środka, a jeden należy wykorzystać w celu oszacowania zawartości wilgoci próbek drewna użytych do badania po wysuszeniu w piecu przed ich impregnacją środkiem. Przygotowuje się wystarczającą liczbę próbek drewna do badań, aby umożliwić wybór trzech zestawów mieszczących się w zakresie 5 % średniej wartości retencji środka konserwującego grupy próbek do badań.
23. Wszystkie próbki drewna do badań zostają uszczelnione na końcach substancją chemiczną zapobiegającą przeniknięciu środka konserwującego do końcowego słoja próbki lub zapobiegającą wymywaniu środka z próbki przez końcowy słój. Konieczne jest odróżnianie próbek drewna użytych do powierzchniowego stosowania i do nasycania w odniesieniu do stosowania środka uszczelniającego końce próbki. Środek uszczelniający końce próbek drewna należy stosować przed rozpoczęciem zabiegu jedynie w przypadku powierzchniowego zastosowania środka konserwującego.
24. Usłojenie końcowej części musi pozostać dostępne do zabiegu nasycania. W związku z tym próbki drewna należy uszczelnić na końcach po zakończeniu okresu kondycjonowania. Emisję należy oszacować tylko w odniesieniu do wzdłużnej powierzchni. Substancje uszczelniające należy sprawdzić i w razie potrzeby ponownie zastosować przed rozpoczęciem wymywania; nie należy ich ponownie stosować po rozpoczęciu wymywania.
Pojemnik do zanurzania próbek
25. Pojemnik wykonany jest z obojętnego materiału i jest wystarczająco duży, aby pomieścić 5 próbek drewna, spełniających wymagania normy PN-EN 113:2000 w 500 ml wody, dając w rezultacie stosunek obszaru powierzchni do objętości wody 0,4 cm2/ml.
Konstrukcja do ułożenia próbek drewna
26. Próbki drewna do badań są umieszczane na konstrukcji umożliwiającej kontakt z wodą wszystkich odsłoniętych powierzchni próbki.
PROCEDURA KONSERWACJI ŚRODKAMI KONSERWUJĄCYMI
Przygotowanie zakonserwowanych próbek do badań
27. Próbkę drewna do badań, którą w ramach badania należy zakonserwować środkiem konserwującym, poddaje się procesowi konserwacji metodą określoną dla danego środka konserwującego, którą może być nasycanie lub nakładanie powierzchniowe przez zanurzanie, za pomocą urządzenia rozpylającego lub pędzla.
Środki konserwujące, które należy zastosować w przypadku konserwacji przez nasycanie
28. Należy przygotować roztwór środka konserwującego, który zapewni określoną absorpcję lub retencję, jeżeli zostanie zastosowany w procedurze konserwacji przez nasycanie. Próbka drewna do badań zostaje zważona i zmierzona. Proces konserwacji przez nasycanie powinien być zgodny z procesem określonym dla środków konserwujących do drewna przeznaczonych do użytku w klasie użytkowania 4 lub 5. Próbkę drewna ponownie waży się po jej zakonserwowaniu, a retencję środka konserwującego (kg/m3) oblicza się według równania:
29. Należy zauważyć, że w badaniu można wykorzystać drewno konserwowane w zakładzie konserwacji drewna (np. przy zastosowaniu impregnacji próżniowo - ciśnieniowej). Należy zanotować wykorzystane procedury, a retencję materiału zakonserwowanego w taki sposób należy przeanalizować i zapisać.
Środki konserwujące, które należy stosować w przypadku procesu stosowania powierzchniowego
30. Proces stosowania powierzchniowego obejmuje zanurzanie, natryskiwanie lub malowanie pędzlem próbek drewna. Proces i ilość środka (np. litry/m2) powinny być zgodne z wymogami dotyczącymi powierzchniowego stosowania środka konserwującego.
31. Należy również zauważyć, że w badaniu tym wykorzystać można drewno konserwowane w zakładzie konserwacji drewna. Należy zanotować wykorzystane procedury, a retencję materiału zakonserwowanego w taki sposób należy przeanalizować i zapisać.
Kondycjonowanie próbek do badań po konserwacji
32. Po zakonserwowaniu próbki do badań należy kondycjonować zgodnie z zaleceniami dostawcy badanego środka konserwującego, zgodnie z wymogami określonymi na etykiecie środka konserwującego lub zgodnie ze stosowanymi w handlu praktykami konserwacyjnymi, lub zgodnie z normą PN-EN 252:1994.
Przygotowanie i wybór próbek drewna do badań
33. Po kondycjonowaniu następującym po konserwacji oblicza się średnią retencję grupy próbek do badań, a trzy reprezentatywne zestawy próbek o retencji mieszczącej się w zakresie 5 % średniej grupy wybiera się losowo do pomiarów wymywania.
PROCEDURA POMIARÓW EMISJI ŚRODKÓW KONSERWUJĄCYCH
Metoda zanurzenia
34. Próbki drewna do badań waży się, a następnie całkowicie zanurza w wodzie, rejestrując datę i czas. Pojemnik przykrywa się, aby zmniejszyć parowanie.
35. Wodę wymienia się w następujących odstępach: 6 godzin, 1 dzień, 2 dni, 4 dni, 8 dni, 15 dni, 22 dni, 29 dni (uwaga: są to łączne okresy czasu, a nie odstępy czasu). Należy zarejestrować datę i czas wymiany wody oraz masę wody odzyskanej z pojemnika.
36. Po każdej wymianie wody próbkę wody, w której zanurzony został zestaw próbek do badań, zachowuje się w celu późniejszej analizy chemicznej.
37. Procedura pobierania próbek umożliwia obliczenie profilu ilości emisji w stosunku do czasu. Próbki należy przechowywać w warunkach chroniących analit, np. w chłodziarce bez dostępu światła w celu ograniczenia rozwoju mikroorganizmów w próbce przed analizą.
POMIARY EMISJI
Próbki zakonserwowane
38. W stosownych przypadkach pobraną wodę analizuje się pod względem chemicznym pod kątem substancji czynnych lub odnośnych produktów degradacji/przemiany.
Próbki niekonserwowane
39. Pobieranie wody (próbek substancji emitowanej) w tym układzie i późniejsza analiza substancji chemicznych, które zostały wymyte z próbek drewna niekonserwowanego, umożliwiają oszacowanie ewentualnego poziomu emisji środka konserwującego z drewna niekonserwowanego. Pobranie i analiza próbek substancji emitowanej po rosnących okresach narażenia umożliwia oszacowanie dynamiki zmian poziomu emisji w czasie. Analiza ta stanowi procedurę kontrolną, mającą na celu określenie poziomów tła badanej substancji chemicznej w drewnie niekonserwowanym w celu potwierdzenia, że drewno użyte jako źródło próbek nie zostało wcześniej poddane działaniu środka konserwującego.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Analizy chemiczne
40. Pobraną wodę analizuje się pod względem chemicznym, a wynik analizy wyraża się w odpowiednich jednostkach, np. w µg/l.
Przekazywanie danych
41. Wszystkie wyniki są rejestrowane. W dodatku przedstawiony został przykład formy zapisu dla jednego zestawu próbek do badań i tabela zestawieniowa do obliczania średnich wartości emisji dla każdego przedziału czasowego pobierania próbek.
42. Dobowy strumień emisji w mg/m2/dobę oblicza się, przyjmując średnią z trzech pomiarów trzech kontrprób i dzieląc ją przez liczbę dni zanurzenia.
Sprawozdanie z badania
43. Sprawozdanie z badania powinno zawierać co najmniej następujące informacje:
- nazwa dostawcy badanego środka do konserwacji;
- szczególna i niepowtarzalna nazwa lub niepowtarzalny kod badanego środka do konserwacji;
- nazwa handlowa lub nazwa zwyczajowa substancji czynnych z ogólnym opisem składników obojętnych (np. rozpuszczalnika obojętnego, żywicy) oraz zawartość składników wyrażona w % m/m;
- właściwa retencja lub obciążenie (odpowiednio w kg/m3 lub l/m2) określone w przypadku drewna zastosowanego w kontakcie z wodą;
- użyte gatunki drewna, gęstość i tempo wzrostu w pierścieniach na 10 mm;
- obciążenie lub retencja badanego środka konserwującego i wzór zastosowany do obliczenia retencji wyrażonej w l/m2 lub kg/m3;
- metoda zastosowania środka konserwującego, określająca zastosowany harmonogram narażania na działanie substancji w przypadku nasączania i metodę nakładania w przypadku konserwacji powierzchniowej;
- data zastosowania środka konserwującego i oszacowanie zawartości wilgoci w próbkach do badań wyrażonej w procentach;
- zastosowane procedury kondycjonowania z określeniem rodzaju, warunków i czasu trwania;
- specyfikacja zastosowanego końcowego uszczelniacza i liczba zastosowań;
- specyfikacja każdego późniejszego procesu konserwacji drewna, np. specyfikacja dostawcy, rodzaju, cech charakterystycznych i ilości farby;
- czas i data każdego zanurzenia, ilość wody zastosowana do zanurzenia próbek do badań przy każdym zanurzeniu i ilość wody wchłoniętej przez drewno podczas zanurzenia;
- wszelkie zmiany w stosunku do opisanej metody i wszelkie czynniki, które mogły wpływać na wyniki.
BIBLIOGRAFIA
(1) Norma europejska EN 84-1997. Środki do konserwacji drewna Przyspieszone starzenie drewna poddanego działaniu substancji przed testami biologicznymi. Procedura wymywania.
(2) Norma europejska EN 113/A1-2004. Środki do konserwacji drewna Metoda badawcza mająca na celu określenie efektywności ochrony przeciwko grzybom podstawkowym niszczącym drewno. Określenie toksycznych wartości.
(3) Norma europejska EN 252-1989. Metoda badań eksploatacyjnych w celu badania względnej efektywności ochrony środka do konserwacji drewna w styczności z ziemią.
(4) Norma europejska EN 335 - Część 1: 2006. Trwałość drewna i materiałów drewnopochodnych - Klasy użytkowania: definicje - Część 1: Postanowienia ogólne.
(5) Amerykańskie Stowarzyszenie Badań i Materiałów, ASTM D 1141-1998. Standard Practice for the Preparation of Substitute Ocean Water, Without Heavy Metals. Annual Book of ASTM Standards, tom 11.02.
(6) Amerykańskie Stowarzyszenie Badań i Materiałów, ASTM D 1193-77 Type II-1983. Specifications for Reagent Water. Annual Book of ASTM Standards, tom 11.01.
Dodatek 1
Formularz danych dla metody badawczej
Oszacowanie emisji do środowiska z drewna poddanego działaniu środków do konserwacji: metoda laboratoryjna stosowana w przypadku produktów z drewna. które nie są pokryte i mają styczność z wodą słodką lub wodą morską
| Laboratorium |
| Środek do konserwacji drewna |
| Dostawca środka do konserwacji | |
| Szczególna i niepowtarzalna nazwa lub niepowtarzalny kod środka do konserwacji | |
| Nazwa handlowa lub nazwa zwyczajowa środka do konserwacji | |
| Składniki obojętne | |
| Właściwa retencja w przypadku drewna zastosowanego w kontakcie z wodą |
| Zastosowanie |
| Metoda zastosowania | |
| Data zastosowania | |
| Wzór zastosowany do obliczenia retencji: | |
| Procedura kondycjonowania | |
| Czas trwania kondycjonowania | |
| Środek uszczelniający końce próbki/liczba zastosowań | |
| Kolejna konserwacja | w stosownych przypadkach |
| Próbki do badań |
| Gatunki drewna | |
| Gęstość drewna | (min. ... średnia ... maks.) |
| Tempo wzrostu (pierścienie na 10 mm) | (min. ... średnia ... maks.) |
| Zawartość wilgoci | |
| Konstrukcje do przeprowadzania badań (*) | Retencja (np. kg/m3) |
| Próbka "x" zakonserwowana środkiem do konserwacji | Średnia arytmetyczna i odchylenie standardowe lub zakres dla 5 próbek |
| Próbka "y" zakonserwowana środkiem do konserwacji | Średnia arytmetyczna i odchylenie standardowe lub zakres dla 5 próbek |
| Próbka "z" zakonserwowana środkiem do konserwacji | Średnia arytmetyczna i odchylenie standardowe lub zakres dla 5 próbek |
| Próbki niezakonserwowane | |
| Zmienność parametrów metody badawczej | np. jakość wody, wymiary próbek do badań itd. |
| (*) x, y, z reprezentują trzy kontrpróby |
| Czas | Wymiana wody | Masa próbki | Absorpcja wody | Próbka wody | ||||||
| Próbki zakonserwowane (średnia arytmetyczna) | Próbki niezakonserwowane | Próbki zakonserwowane (średnia arytmetyczna) | Próbki niezakonserwowane | Woda do badań | x | y | z | |||
| Data | g | g | g | g | nr | pH | pH | pH | pH | |
| rozpoczęcie | ||||||||||
| 6 h | 1 | |||||||||
| 24 h | 2 | |||||||||
| 2 d | 3 | |||||||||
| 4 d | 4 | |||||||||
| 8 d | 5 | |||||||||
| 15 d | 6 | |||||||||
| 22 d | 7 | |||||||||
| 29 d | 8 | |||||||||
Uwaga: ponieważ może zajść konieczność wykorzystania wyników uzyskanych z próbek niezakonserwowanych do korekty natężeń emisji z próbek zakonserwowanych, wyniki z próbek niekonserwowanych powinny być podane w pierwszej kolejności, zaś wszystkie wartości dla próbek zakonserwowanych stanowiłyby "wartości skorygowane". Możliwa jest również korekta wstępnej analizy wody.
Należy przygotować oddzielne tabele dla każdego składnika aktywnego
| Czas | Wymiana wody | Wyniki badania | ||||||||||||||
| Próbki niezakonserwowane | Próbki zakonserwowane | |||||||||||||||
| Stężenie składnika aktywnego w wodzie mg/l | Wyemitowana ilość mg/m2 | Natężenie emisji mg/m2/d | Stężenie składnika aktywnego w wodzie | Wyemitowana ilość | Natężenie emisji | |||||||||||
| x | y | z | Średnia | x | y | z | Średnia | x | y | z | Średnia | |||||
| Data | mg/l | mg/l | mg/l | mg/l | mg/m2 | mg/m2 | mg/m2 | mg/m2 | mg/m2/d | mg/m2/d | mg/m2/d | mg/m2/d | ||||
| 6 h | ||||||||||||||||
| 24 h | ||||||||||||||||
| 2 d | ||||||||||||||||
| 4 d | ||||||||||||||||
| 8 d | ||||||||||||||||
| 15 d | ||||||||||||||||
| 22 d | ||||||||||||||||
| 29 d | ||||||||||||||||
Dodatek 2
Definicje
Substancja chemiczna: oznacza substancję lub mieszaninę.
Badana substancja chemiczna: oznacza dowolną substancję lub mieszaninę badaną za pomocą opisywanej metody badawczej
C.46. BIOAKUMULACJA U BENTOSOWYCH SKĄPOSZCZETÓW ŻYJĄCYCH W OSADZIE
WPROWADZENIE
1. Opisywana metoda badawcza jest równoważna z wytyczną OECD nr 315 (2008 r.) w sprawie badań dotyczącą narażenia organizmów bentosowych żyjących w osadzie na zawarte w nim substancje (1). Wśród tych organizmów czerpiących pokarm z osadu znajdują się skąposzczety wodne, które odgrywają ważną rolę na dnie systemów wodnych. Żyją one w osadzie i często stanowią najliczniejszy gatunek, w szczególności w siedliskach, w których warunki środowiskowe są niekorzystne dla innych zwierząt. Przyczyniając się do bioturbacji osadu oraz stanowiąc żer dla innych organizmów, zwierzęta te mogą mieć silny wpływ na biodostępność takich substancji dla innych organizmów, np. ryb poszukujących pokarmu w osadzie. W przeciwieństwie do organizmów żyjących na powierzchni osadu, wodne skąposzczety żyjące w osadzie zakopują się w nim i zjadają cząstki osadu znajdujące się pod jego powierzchnią. Z tego powodu, organizmy te są narażone na działanie substancji przez wiele dróg absorpcji, w tym bezpośredni kontakt, zjadanie zanieczyszczonych cząstek osadu, wodę porową i warstwę wody nadosadowej. Niektóre gatunki skąposzczetów bentosowych żyjących w osadzie, wykorzystywane obecnie w badaniach ekotoksykologicznych, opisano w dodatku 6.
2. Parametry, które charakteryzują bioakumulację substancji, obejmują współczynnik bioakumulacji (BAF), stałą szybkości absorpcji osadu (ks) oraz stałą szybkości eliminacji (ke). Szczegółowe definicje tych parametrów podano w dodatku 1.
3. Aby dokonać ogólnej oceny potencjału bioakumulacji substancji i zbadać bioakumulację substancji, które zwykle ulegają rozdziałowi w lub na osadach, potrzebna jest metoda badawcza specyficzna dla danego przedziału (1)(2)(3)(4).
4. Niniejsza metoda badawcza została zaprojektowana w celu oceny bioakumulacji substancji związanych z osadem u skąposzczetów żyjących w osadzie. Osad wzbogaca się badaną substancją. Stosowanie wzbogaconego osadu ma na celu symulowanie zanieczyszczonego osadu.
5. Metoda ta opiera się na istniejących metodach badania toksyczności osadu i bioakumulacji (1)(4)(5)(6)(7)(8)(9). Inne przydatne dokumenty obejmują dyskusję wyników międzynarodowego warsztatu (11) i wynik międzynarodowego badania międzylaboratoryjnego (12).
6. Badanie to ma zastosowanie do stabilnych, neutralnych substancji organicznych, które na ogół są powiązane z osadami. Niniejsza metoda badawcza może być również stosowana do pomiaru bioakumulacji związanych z osadem, stabilnych związków metaloorganicznych (12). Nie ma ona zastosowania do metali ani innych pierwiastków śladowych (11), jeżeli projekt badania nie zostanie zmodyfikowany pod względem substratu i objętości wody, i ewentualnie wielkości próbki tkanki.
WARUNEK WSTĘPNY I INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI
7. Istnieje tylko kilka ugruntowanych ilościowych zależności struktura-aktywność (QSAR) dotyczących dostępnych obecnie procesów bioakumulacji (14). Najszerzej stosowaną zależnością jest korelacja między odpowiednio bioakumulacją i biokoncentracją stabilnych substancji organicznych oraz ich lipofilnością (wyrażona jako logarytm współczynnika podziału oktanol-woda (log Kow), którego definicja znajduje się w dodatku 1), którą opracowano w celu opisania rozdziału substancji między wodę i ryby. Zależność ta została również zastosowana do ustalenia korelacji dla osadowego przedziału środowiska wodnego (15)(16)(17)(18). Korelacja log Kow-log BCF jako istotna ilościowa zależność struktura-aktywność może być pomocna we wstępnym oszacowaniu potencjału bioakumulacji substancji związanych z osadem. Na BAF może jednak wpływać zawartość lipidów w organizmie użytym do badania i zawartość węgla organicznego w osadzie. W związku z tym współczynnik podziału węgiel organiczny-woda (Koc) można również zastosować jako główną determinantę bioakumulacji substancji organicznych związanych z osadem.
8. Badanie to ma zastosowanie do:
- stabilnych substancji organicznych o wartościach log Kow między 3,0 i 6,0 (5)(19) oraz substancji superlipo-filowych, które wykazują log Kow powyżej 6,0 (5);
- substancji, które należą do klasy substancji organicznych znanych z potencjału bioakumulacji w organizmach żywych, np. substancji powierzchniowo czynnych lub substancji o wysokiej adsorpcyjności (np. o wysokim Koc).
9. Informacje na temat badanej substancji, takie jak środki ostrożności, odpowiednie warunki przechowywania i stabilność oraz metody analityczne należy uzyskać przed rozpoczęciem badania. Wskazówki dotyczące badania substancji o własnościach fizykochemicznych, które utrudniają ich badanie, podano w (20) i (21). Przed rozpoczęciem badania bioakumulacji u skąposzczetów wodnych należy uzyskać następujące informacje o substancji badanej:
- nazwa zwyczajowa, nazwa systematyczna (najlepiej wg nomenklatury IUPAC), wzór strukturalny, numer CAS, czystość;
- rozpuszczalność w wodzie metoda badawcza A.6 (22) ];
- współczynnik podziału oktanol/woda, Kow [metody badawcze A.8, A.24 (22)];
- współczynnik podziału osad-woda, wyrażony jako Kd lub Koc [metoda badawcza C19 (22)];
- hydroliza [metoda badawcza C.7] (22);
- fototransformacja w wodzie (23);
- prężność par [metoda badawcza A.4 (22)];
- szybka biodegradowalność [metody badawcze C.4 i C.29 (22)];
- napięcie powierzchniowe [metoda badawcza A.5 (22)];
- krytyczne stężenie micelizacji (24).
Ponadto istotne mogą być następujące informacje, jeżeli są dostępne:
- biodegradacja w środowisku wodnym [metody badawcze C.24 i C.25 (22)];
- stała Henry'ego.
10. Oznakowane izotopowo substancje badane ułatwiają analizę wody, osadu i próbek biologicznych i mogą być wykorzystane do określenia, czy należy dokonywać identyfikacji i oznaczania ilościowego produktów degradacji. Opisana tu metoda została zweryfikowana w ramach międzynarodowego badania międzylaborato-ryjnego (12) substancji znakowanych 14C. Jeżeli mierzy się całkowitą ilość pozostałości radioaktywnych, współczynnik bioakumulacji (BAF) opiera się na substancji macierzystej, wraz ze wszystkimi zachowanymi produktami degradacji. Można również połączyć badanie metabolizmu z badaniem bioakumulacji, wykonując analizę i oznaczenie ilościowe procentowej zawartości substancji macierzystej i produktów jej degradacji w próbkach pobranych na końcu fazy absorpcji lub w szczytowym momencie bioakumulacji. W każdym razie zaleca się, aby obliczać współczynnik bioakumulacji na podstawie stężenia macierzystej substancji w organizmach, a nie tylko całkowitych pozostałości radioaktywnych.
11. Inne wymagane informacje oprócz właściwości badanej substancji to toksyczność substancji dla gatunków skąposzczetów użytych do badań, takie jak mediana stężenia śmiertelnego (LC50) w odniesieniu do czasu niezbędnego dla fazy absorpcji, aby upewnić się, czy wybrane stężenia ekspozycji są znacznie poniżej poziomów toksycznych. Preferowanymi wartościami dotyczącymi toksyczności są wartości pozyskane z długoterminowych badań nad subletalnymi punktami końcowymi (EC50), jeśli takie dane są dostępne. Jeśli jednak nie są dostępne, pomocnych informacji może dostarczyć badanie ostrej toksyczności w warunkach identycznych z warunkami badania bioakumulacji lub dane dotyczące toksyczności dla innych gatunków zastępczych.
12. Powinna istnieć odpowiednia metoda analityczna o znanej dokładności, precyzji oraz czułości w celu oznaczenia ilościowego substancji w roztworach do badań, w osadzie oraz w materiale biologicznym wraz ze szczegółowymi informacjami na temat przygotowania i przechowywania próbek oraz kartami charakterystyki bezpieczeństwa materiałów. Znane powinny być także analityczne granice wykrywalności badanej substancji w wodzie, osadzie i tkance organizmów. Jeśli stosuje się badaną substancję oznakowaną izotopowo, powinna być znana promieniotwórczość właściwa (np. Bq mol- 1), pozycja oznakowanego izotopowo atomu i odsetek promieniotwórczości związany z zanieczyszczeniami. Promieniotwórczość właściwa badanej substancji powinna być jak najwyższa, aby można było wykrywać jak najniższe badane stężenia (11).
13. Powinny być dostępne informacje na temat cech charakterystycznych zastosowanego osadu (np. pochodzenie osadu lub jego składników, pH i stężenie amoniaku w wodzie porowej (osady pobrane w terenie), zawartość węgla organicznego, rozkład wielkości cząstek (procent piasku, mułu i gliny) i procent suchej masy) (6).
ZASADA BADANIA
14. Badanie składa się z dwóch etapów: etapu absorpcji (narażenia) i etapu eliminacji (po narażeniu). Podczas etapu absorpcji organizmy zostają narażone przez kontakt z osadem, który wzbogacono badaną substancją, uzupełniono wodą regenerowaną i w razie potrzeby odstawiono do stabilizacji (11). Grupy organizmów kontrolnych przetrzymuje się w identycznych warunkach bez badanej substancji.
15. Na potrzeby etapu eliminacji organizmy przenosi się do układu osad-woda niezawierającego badanej substancji. Etap eliminacji jest niezbędny dla uzyskania informacji na temat tempa, w jakim badana substancja jest wydalana przez organizmy użyte do badań (19)(25). Etap eliminacji jest zawsze wymagany, chyba że absorpcja badanej substancji podczas etapu narażenia nie była znacząca (np. nie ma statystycznej różnicy między stężeniem badanej substancji w organizmach użytych do badania i kontrolnych). Jeśli podczas etapu absorpcji nie osiągnięto stanu ustalonego, w oparciu o wyniki uzyskane na etapie eliminacji można określić kinetykę - kinetyczny współczynnik bioakumulacji (BAFk), stałą lub stałe tempa absorpcji i eliminacji. Stężenie badanej substancji w/na organizmach monitoruje się w trakcie obydwu etapów badania.
16. Podczas etapu absorpcji pomiarów dokonuje się do momentu, w którym współczynnik bioakumulacji osiągnie stan równowagi, czyli stan ustalony. Standardowo czas trwania etapu absorpcji powinien wynosić 28 dni. Doświadczenie praktyczne wykazało, że etap absorpcji trwający 12-14 dni jest wystarczający do osiągnięcia stanu ustalonego przez szereg stałych, neutralnych substancji organicznych (6)(8)(9).
17. Jeżeli jednak stan ustalony nie zostanie osiągnięty w ciągu 28 dni, etap eliminacji zaczyna się od przeniesienia skąposzczetów narażonych na działanie substancji do naczyń zawierających to samo środowisko bez badanej substancji. Etap eliminacji kończy się albo gdy stężenie zmierzone u organizmów osiągnie 10 % poziomu stężenia zmierzonego 28. dnia etapu absorpcji, albo po upływie maksymalnego okresu 10 dni. Poziom pozostałości u organizmów pod koniec etapu eliminacji przedstawia się w sprawozdaniu jako dodatkowy punkt końcowy, np. niewyeliminowane pozostałości. Współczynnik bioakumulacji w stanie ustalonym (BAFss) należy obliczać jako stosunek stężenia w organizmach (Ca) i w osadzie (Cs) przy ewidentnym stanie ustalonym i jako kinetyczny współczynnik bioakumulacji BAFK, czyli stosunek stałej tempa absorpcji z osadu(ks) oraz stałej tempa eliminacji (ke) przy założeniu kinetyki reakcji pierwszego rzędu. Jeżeli stan ustalony nie zostanie osiągnięty w ciągu 28 dni, należy obliczyć BAFK na podstawie stałych tempa absorpcji i tempa eliminacji. Obliczenia zamieszczono w dodatku 2. Jeśli kinetyka reakcji pierwszego rzędu nie ma zastosowania, należy zastosować inne modele (dodatek 2 i pozycja bibliografii (25)).
18. Jeżeli stan ustalony nie zostanie osiągnięty w ciągu 28 dni, etap absorpcji można przedłużyć, poddając grupy organizmów narażonych na działanie substancji - jeżeli są dostępne - dalszym pomiarom do momentu osiągnięcia stanu ustalonego; równolegle należy jednak rozpocząć etap eliminacji w 28. dniu etapu absorpcji.
19. Stałą tempa absorpcji, stałą tempa eliminacji (lub stałe, jeśli zastosowano bardziej złożone modele), kinetyczny współczynnik bioakumulacji (BAFK) oraz, jeśli to możliwe, granice ufności każdego z tych parametrów oblicza się za pomocą komputerowych modeli równań (zob. dodatek 2 dotyczący modeli). Odpowiedniość dopasowania modelu można określić na podstawie współczynnika korelacji lub współczynnika determinacji (współczynniki o wartościach zbliżonych do 1 wskazują na dobre dopasowanie).
20. Aby zmniejszyć zróżnicowanie wyników badania w odniesieniu do substancji organicznych o wysokim poziomie lipofilności, współczynniki bioakumulacji należy dodatkowo wyrazić w odniesieniu do zawartości lipidów w organizmach użytych do badania oraz do węgla organicznego (TOC) w osadzie (współczynnik bioakumulacji organizmy żywe-osad (BASF) w kg całkowitego węgla organicznego w osadzie na kg- 1 zawartości lipidów w organizmach). Takie podejście jest oparte na doświadczeniach i teoretycznych zależnościach dla przedziału wodnego, w przypadku którego - w odniesieniu do niektórych klas substancji chemicznych - istnieje wyraźne powiązanie między zdolnością do bioakumulacji a lipofilnością, co zostało dobrze udowodnione w odniesieniu do ryb jako organizmów modelowych (14)(25)(27). Istnieje również związek między zawartością lipidów w badanych rybach a bioakumulacją takich substancji. W przypadku organizmów żyjących w osadzie stwierdzono podobne korelacje (15)(16)(17)(18). Jeśli dostępna jest wystarczająca ilość tkanek organizmów, zawartość lipidów w zwierzętach użytych do badania można określić z wykorzystaniem tego samego materiału biologicznego, który wykorzystano do określenia stężenia badanej substancji. Praktyczne jest wykorzystywanie zaaklimatyzowanych zwierząt z próby kontrolnej, przynajmniej na początku, lub - najlepiej - na końcu etapu absorpcji, w celu zmierzenia zawartości lipidów, która może następnie zostać wykorzystana do normalizowania wartości współczynnika bioakumulacji.
WAŻNOŚĆ BADANIA
21. Aby badanie było ważne, zastosowanie mają następujące warunki:
- łączna śmiertelność organizmów (w próbach kontrolnych i poddanych działaniu substancji) na koniec badania nie powinna przekraczać 20 % początkowej liczby.
- ponadto należy wykazać, że organizmy zakopują się w osadzie, co umożliwia maksymalne narażenie. Szczegółowe informacje podano w pkt 28.
OPIS METODY
Badane gatunki
22. W badaniu można wykorzystać kilka gatunków skąposzczetów wodnych. Najczęściej wykorzystywane gatunki wymieniono w dodatku 6.
23. Badania toksyczności (96 h, tylko w wodzie) należy wykonywać w regularnych odstępach czasu (np. co miesiąc), stosując toksyczną substancję odniesienia, taką jak chlorek potasu (KCl) lub siarczan miedzi (CuSO4), w celu wykazania stanu zdrowia zwierząt użytych do badania (1)(6). Jeżeli nie przeprowadza się referencyjnych badań toksyczności w regularnych odstępach czasu (np. co miesiąc), partię organizmów, które mają być wykorzystane w badaniu bioakumulacji osadu, należy sprawdzać z użyciem toksycznej substancji odniesienia. Pomiar zawartości lipidów może również dostarczyć przydatnych informacji na temat stanu zwierząt.
Hodowla organizmów użytych do badania
24. Aby zapewnić wystarczającą liczbę organizmów do wykonania badań bioakumulacji, może być konieczne przetrzymywanie ich w stałej hodowli laboratoryjnej jednego gatunku. Metody dotyczące hodowli laboratoryjnej wybranych badanych gatunków przedstawiono w dodatku 6. Szczegółowe informacje zob. pozycje bibliografii (8)(9)(10)(18)(28)(29)(30)(31)(32).
Aparatura
25. Należy dołożyć starań, aby w odniesieniu do wszystkich części sprzętu unikać stosowania materiałów, które mogą spowodować rozpuszczenie, wchłonięcie lub wypłukanie badanych substancji lub innych substancji i mają niekorzystny wpływ na zwierzęta użyte do badań. Można zastosować standardowe prostokątne lub cylindryczne naczynia, wykonane z chemicznie obojętnego materiału i posiadające odpowiednią pojemność, zgodnie ze wskaźnikiem obciążenia, tj. liczbą organizmów, jaką można wykorzystać w badaniu. Należy unikać stosowania rur z miękkiego tworzywa sztucznego do doprowadzania wody lub powietrza. Sprzęt mający kontakt z badanymi podłożami może być wykonany z politetrafluoroetylenu, ze stali nierdzewnej lub szkła. W przypadku substancji o wysokich współczynnikach adsorpcji, takich jak syntetyczne pyretroidy, konieczne może być zastosowanie szkła silanizowanego. W takich sytuacjach sprzęt po użyciu należy wyrzucić (5). W przypadku oznakowanych izotopowo substancji badanych i w przypadku substancji lotnych należy zachować ostrożność w celu uniknięcia odpędzenia i ucieczki odpędzanej substancji badanej. Należy zastosować pułapki (np. szklane płuczki gazowe) zawierające odpowiednie absorbenty zatrzymujące wszelkie pozostałości odparowujące z komór badawczych (11).
Woda
26. Warstwa wody nadosadowej powinna mieć jakość, która pozwoli na przetrwanie badanych gatunków przez okres trwania aklimatyzacji i okres badań oraz nie będzie powodowała pojawienia się u ich nietypowego wyglądu lub zachowania. Zgodnie z metodą badania C.1 (25), jako wodę nadosadową w badaniach oraz hodowlach laboratoryjnych organizmów zaleca się stosować wodę regenerowaną. Wykazano, że w takiej wodzie przeżyć, rozwijać się i rozmnażać może kilka gatunków badanych (8), a także zapewnia się w ten sposób maksymalną standaryzację warunków badania i hodowli. Wodę należy scharakteryzować przynajmniej pod względem pH, przewodności właściwej i twardości. Użytecznych informacji powinna dostarczyć także analiza wody pod kątem mikrozanieczyszczeń przeprowadzona przed zastosowaniem (dodatek 4).
27. W czasie badania jakość wody powinna być stała. pH wody nadosadowej powinno wynosić 6-9. Na początku badania całkowita twardość powinna wynosić 90-400 mg CaCO3 na litr (7). Zakresy pH i twardości wspomnianej wody regenerowanej podano w metodzie badania C.1 (25). Jeśli jednak zachodzi podejrzenie, że między jonami powodującymi twardość wody a substancją badaną dochodzi do interakcji, powinna być stosowana woda o mniejszej twardości. W dodatku 4 zestawiono dodatkowe kryteria dla wody nadającej się do rozcieńczania według wytycznej OECD nr 210 w sprawie badań (34).
Osad
28. Osad powinien być takiej jakości, która pozwoli na przeżycie, a także rozmnażanie się organizmów użytych do badania w okresie aklimatyzacji i badanych okresów, przy czym organizmy nie powinny charakteryzować się nietypowym wyglądem ani zachowaniem. Organizmy powinny zakopywać się w osadzie. Zakopywanie się może mieć wpływ na narażenie i w związku z tym na BAF. W związku z tym unikanie osadu i zachowania organizmów użytych do badania związane z zakopywaniem się w glebie należy obserwować i odnotowywać, jeżeli mętność warstwy wody nadosadowej umożliwia takie obserwacje. Organizmy (kontrolne i poddane działaniu substancji) powinny zakopać się w osadzie w ciągu 24 h po dodaniu do naczyń badawczych. Jeżeli zaobserwuje się, że organizmy nie zakopują się w osadzie lub unikają osadu (np. ponad 20 % organizmów przez ponad połowę etapu absorpcji), oznacza to, że warunki badania nie są odpowiednie lub organizmy użyte do badań nie są zdrowe, lub że zachowanie to jest wywoływane przez stężenie badanej substancji. W takim przypadku badanie należy przerwać i powtórzyć w poprawionych warunkach. Dodatkowe informacje na temat zjadania osadu można uzyskać stosując metody opisane w (35)(36), które określają zjadanie osadu lub wybór cząstek u organizmów użytych do badania. Jeżeli możliwe jest zaobserwowanie na powierzchni osadu co najmniej obecności lub braku obecności granulek odchodów, które wskazują na zjadanie osadu przez organizmy, należy to odnotować i uwzględnić w interpretacji wyników badania w związku z drogami narażenia.
29. W tym badaniu i w hodowlach laboratoryjnych organizmów zaleca się wykorzystanie sztucznego osadu opartego na sztucznej glebie opisanej w metodzie badawczej C.8 (40) (dodatek 5), ponieważ naturalne osady o właściwej jakości mogą nie być dostępne przez cały rok. Dodatkowo na badanie mogą mieć wpływ organizmy rodzime oraz obecność mikrozanieczyszczeń w naturalnym osadzie. W sztucznym osadzie przeżyć, rozwijać się i rozmnażać może szereg badanych gatunków (8).
30. Sztuczny osad należy scharakteryzować przynajmniej pod względem pochodzenia składników, rozkładu wielkości ziaren (procent piasku, mułu i gliny), zawartości węgla organicznego (TOC), zawartości wody i pH. Pomiar potencjału redoks jest nieobowiązkowy. Naturalne osady z niezanieczyszczonych miejsc mogą jednak również posłużyć jako osad badany lub jako osad do hodowli (1). Osady naturalne należy scharakteryzować, podając co najmniej ich pochodzenie (miejsce zebrania), pH i zawartość amoniaku w wodzie porowej, zawartość węgla organicznego (TOC), rozkład wielkości ziaren (procent piasku, iłu i gliny) oraz procentową zawartość wilgoci (6). Zaleca się także, aby przed wzbogaceniem badaną substancją naturalny osad był przez siedem dni kondycjonowany w tych samych warunkach, jakie panować będą następnie podczas badania, jeżeli przewiduje się powstawanie amoniaku. Na koniec okresu kondycjonowania należy usunąć i odrzucić wodę nadosadową. Użytecznych informacji powinna dostarczyć także analiza osadu lub jego składników pod kątem mikrozanieczyszczeń przeprowadzona przed zastosowaniem.
Przygotowanie
31. Postępowanie z naturalnymi osadami przed ich zastosowaniem w laboratorium opisano w (1)(6)(44). W dodatku 5 podano sposób przygotowania sztucznego osadu.
Przechowywanie
32. W przypadku osadów naturalnych okres ich przechowywania w laboratorium powinien być możliwie jak najkrótszy. U.S. EPA (6) zaleca, aby maksymalny okres przechowywania wynosił 8 tygodni i aby przechowywać osad bez dostępu światła w temperaturze 4 ± 2 °C. W pojemnikach do przechowywania nie powinno być żadnej fazy gazowej nad osadem. Zalecenia dotyczące przygotowania sztucznego osadu podano w dodatku 5.
Stosowanie substancji badanej
33. Osad wzbogaca się badaną substancją. Procedura wzbogacania obejmuje pokrycie badaną substancją jednego lub większej liczby składników osadu. Na przykład piasek kwarcowy lub jego część (np. 10 g piasku kwarcowego na naczynie badawcze) można namoczyć w roztworze badanej substancji w odpowiednim rozpuszczalniku, który następnie powoli odparuje do sucha. Taką powleczoną frakcję można następnie wymieszać z mokrym osadem. Należy mieć na uwadze, że przygotowując osad należy uwzględniać piasek zawarty w mieszance substancji badanej z piaskiem, tj. osad należy przygotować z mniejszą ilością piasku (6).
34. W przypadku zastosowania osadu naturalnego badaną substancję można dodać, wzbogacając wysuszoną na powietrzu część osadu, zgodnie z opisem dotyczącym sztucznego osadu powyżej, lub mieszając badaną substancję z mokrym osadem, następnie odparowując ewentualnie zastosowany środek rozpuszczający. Rozpuszczalniki nadające się do wzbogacania mokrego osadu to etanol, metanol, eter monometylowy glikolu etylenowego, eter dimetylenowy glikolu etylenowego, dimetyloformamid i glikol trietylenowy (5)(34). Toksyczność i lotność rozpuszczalnika oraz rozpuszczalność badanej substancji w wybranym rozpuszczalniku powinny być głównymi kryteriami branymi pod uwagę przy wyborze odpowiedniego środka rozpuszczającego. Dodatkowe wytyczne dotyczące procedur wzbogacania podano w Environment Canada (1995)(41). Należy dopilnować, by substancja badana dodana do osadu została w nim dokładnie i równo rozprowadzona. Stanowiące kontrpróby podpróbki wzbogaconego osadu należy poddać analizie w celu sprawdzenia stężeń badanej substancji w osadzie i oznaczenia stopnia jednorodności rozprowadzenia substancji.
35. Po przygotowaniu wzbogaconego osadu z warstwą wody nadosadowej należy umożliwić rozdzielenie substancji badanej między fazę wodną i osad. W miarę możliwości powinno się to odbywać w takich samych warunkach temperatury i napowietrzenia, jakie zastosowano na potrzeby badania. Okres ustalania stanu równowagi zależy od osadu i substancji i może być rzędu kilku godzin lub kilku dni, a w rzadkich przypadkach trwać do kilku tygodni (4-5 tygodni) (28)(42). W tym badaniu nie oczekuje się stanu równowagi, ale zaleca się stosowanie okresu ustalania równowagi trwającego od 48 godzin do 7 dni. W zależności od celu badania, na przykład, jeśli dąży się do odtworzenia warunków środowiskowych, wzbogacony osad może być "postarzany" przez dłuższy okres (11).
WYKONANIE BADANIA
Badanie wstępne
36. Może być ono przydatne dla wykonania wstępnego doświadczenia w celu zoptymalizowania warunków badania ostatecznego, np. jeżeli chodzi o wybór stężenia (stężeń) substancji i czas trwania fazy absorpcji i eliminacji. Zachowanie organizmów, na przykład unikanie osadu, tj. organizmy uciekają od osadu, co może być spowodowane przez badaną substancję lub sam osad, należy obserwować i odnotowywać w trakcie badania wstępnego. Unikanie osadu można również zastosować jako parametr subletalny w badaniu wstępnym w celu oszacowania stężeń badanej substancji, które mają być zastosowane w badaniu bioakumulacji.
Warunki narażenia
Czas trwania etapu absorpcji
37. Na etapie absorpcji organizmy użyte do badań są narażone na działanie badanej substancji. Pierwszą próbkę należy pobrać po 4-24 godzinach po rozpoczęciu etapu absorpcji. Etap absorpcji powinien trwać 28 dni (1)(6) (11), chyba że można udowodnić, że równowagę osiągnięto wcześniej. Stan ustalony ma miejsce wówczas, gdy:
(i) wykres współczynników bioakumulacji w każdym okresie pobierania próbek w funkcji czasu jest równoległy do osi czasu,
(ii) trzy następujące po sobie analizy współczynnika stężenia wykonane na próbkach pobranych w odstępach co najmniej dwóch dni nie różnią się od siebie więcej niż o ± 20 %,
(iii) nie ma istotnych różnic między trzema okresami pobierania próbek (na podstawie porównań statystycznych, np. analizy wariancji i analizy regresji). Jeżeli stan ustalony nie został osiągnięty w ciągu 28 dni, etap absorpcji można zakończyć, rozpoczynając etap eliminacji, a BAFK można obliczyć na podstawie stałych tempa absorpcji i eliminacji (zob. również pkt 16-18).
Czas trwania etapu eliminacji
38. Pierwszą próbkę należy pobrać po 4-24 godzinach od rozpoczęciu etapu eliminacji, ponieważ w okresie wstępnym mogą zachodzić gwałtowne zmiany w pozostałościach w tkankach. Zaleca się zakończyć etap eliminacji, gdy stężenie badanej substancji wynosi mniej niż 10 % stężenia w stanie ustalonym albo po maksymalnym czasie trwania wynoszącym 10 dni. Poziom pozostałości w organizmach pod koniec etapu eliminacji podaje się w sprawozdaniu jako drugorzędny punkt końcowy. Okres ten może jednak zależeć od okresu, przez który stężenie badanej substancji u organizmów pozostaje powyżej analitycznych granic wykrywalności.
Organizmy użyte do badań
Liczby badanych organizmów
39. Liczba organizmów w próbce musi zapewnić taką masę tkanki organizmów, aby masa badanej substancji w próbce odpowiednio na początku etapu absorpcji i na końcu etapu eliminacji była znacząco wyższa niż granica wykrywalności badanej substancji w materiale biologicznym. Na wspomnianych etapach absorpcji i eliminacji stężenie u zwierząt użytych do badania jest zazwyczaj stosunkowo niskie (6)(8)(18). W związku z tym, że masa ciała pojedynczych osobników u wielu gatunków wodnych skąposzczetów jest bardzo niska (5- 10 mg mokrej masy na osobnika w przypadku Lumbriculus variegatus i Tubifex tubifex), organizmy z danej komory badawczej stanowiącej kontrpróbę można połączyć w celu zważenia i wykonania analizy badanej substancji chemicznej. W przypadku badanych gatunków o wyższej masie pojedynczych osobników (np. Branchiura sowerbyi) można wykorzystywać kontrpróby zawierające jednego osobnika, jednak w takich przypadkach liczba kontrprób powinna zostać zwiększona do pięciu na punkt pobierania próbek (11). Należy jednak zauważyć, że B. sowerbyi nie został uwzględniony w badaniu międzylaboratoryjnym (12) i w związku z tym nie zaleca się wykorzystywania go jako gatunku preferowanego w tej metodzie.
40. Należy wykorzystywać organizmy o podobnej wielkości (w przypadku L. variegatus zob. dodatek 6). Powinny one pochodzić z tego samego źródła, a także powinny być dorosłymi lub dużymi zwierzętami należącymi do tej samej grupy wiekowej (zob. dodatek 6). W związku z tym, że masa i wiek zwierzęcia mogą mieć istotny wpływ na wartości współczynnika bioakumulacji (np. z powodu różnej zawartości lipidów lub obecności jaj), te parametry należy dokładnie zanotować. Zaleca się zważenie podpróbki organizmów przed rozpoczęciem badania w celu oszacowania ich średniej mokrej i suchej masy.
41. W przypadku Tubifex tubifex i Lumbriculus variegatus można spodziewać się, że będą się rozmnażać w czasie badania. Brak rozmnażania w badaniu bioakumulacji należy odnotować i uwzględnić podczas interpretacji wyników badania.
Obciążenie
42. Należy zastosować wysoki stosunek osadu do organizmów i wody do organizmów, aby ograniczyć do minimum spadek stężenia badanej substancji w osadzie na etapie absorpcji i uniknąć spadków stężenia rozpuszczonego tlenu. Wybrany wskaźnik obciążenia powinien również odpowiadać naturalnie występującym zagęszczeniom populacji wybranych gatunków (43). Na przykład dla Tubifex tubifex zaleca się, aby wskaźnik obciążenia wynosił 1-4 mg tkanki organizmów (mokra masa) na gram mokrego osadu (8)(11). W pozycjach bibliografii (1) i (6) w przypadku L. variegatus zaleca się poziom obciążenia ≤ 1 g suchej masy tkanki organizmów na 50 g węgla organicznego w osadzie.
43. Organizmy, które mają być użyte w badaniu, usuwa się z hodowli przesiewając osad hodowli. Zwierzęta (dorosłe lub duże organizmy bez oznak niedawnej fragmentacji) zostają przeniesione do szklanych naczyń (np. na płytki Petriego) zawierających czystą wodę. Jeśli warunki badania różnią się od warunków hodowli, etap aklimatyzacji trwający 24 godziny powinien być wystarczający. Przed ważeniem należy usunąć z organizmów nadmiar wody. Można to zrobić, delikatnie umieszczając organizmy na wstępnie nawilżonej bibule. Do osuszania organizmów nie zaleca się stosowania papieru chłonnego, ponieważ może to narazić je na stres lub uszkodzenie. Brunson i in. (1998) zalecali wykorzystywanie nieosuszonych organizmów o masie stanowiącej około 1.33-krotności biomasy docelowej. Te dodatkowe 33 % odpowiada różnicy między osuszonymi i nieosuszonymi organizmami (28).
44. Na początku etapu absorpcji (dzień 0 badania) organizmy użyte do badań wyjmuje się z komory aklimatyzacyjnej i rozmieszcza losowo w naczyniach (np. na płytkach Petriego) zawierających wodę regenerowaną, dodając do każdego naczynia po dwa organizmy, dopóki w każdym naczyniu nie znajdzie się dziesięć organizmów. Każdą z tych grup organizmów następnie przenosi się losowo do oddzielnych naczyń, np. za pomocą delikatnej stalowej pęsety. Naczynia badawcze następnie inkubuje się w warunkach badania.
Karmienie
45. W związku z niską zawartością składników odżywczych w sztucznym osadzie należy zmodyfikować osad, dodając do niego źródło pokarmu. Aby uniknąć niedoszacowania narażenia organizmów użytych do badania, np. na skutek wybiórczego żerowania na niezanieczyszczonym pokarmie, pokarm niezbędny do rozmnażania i wzrostu organizmów użytych do badania należy dodać do osadu jednorazowo przed dodaniem lub podczas dodawania badanej substancji (zob. dodatek 5).
Stosunek osad-woda
46. Zalecany stosunek osad-woda wynosi 1:4 (45). Stosunek ten uznaje się za właściwy do utrzymania stężenia tlenu na właściwych poziomach i uniknięcia odkładania się amoniaku w wodzie nadosadowej. Zwartość tlenu w wodzie nadosadowej należy utrzymać na poziomie ≥ 40 % nasycenia. Woda nadosadowa w naczyniu badawczym powinna być delikatnie napowietrzana (np. 2-4 pęcherzyki powietrza na sekundę) przez pipetę Pasteura, której koniec znajduje się około 2 cm nad powierzchnią osadu w celu zminimalizowania zakłóceń osadu.
Światło i temperatura
47. Fotoperiod w hodowli i w badaniu wynosi 16 godzin (1)(6). Natężenie światła w obszarze badania należy utrzymywać na poziomie około 500-1 000 lx. Temperatura powinna wynosić 20 ± 2 °C przez cały czas trwania badania.
Badane stężenia
48. Jedno badane stężenie (jak najniższe) wykorzystuje się do oznaczenia kinetyki absorpcji, można jednak wykorzystać drugie (wyższe) stężenie (np. (46)). W takim przypadku próbki pobiera się i analizuje w stanie ustalonym lub po 28 dniach w celu potwierdzenia współczynnika bioakumulacji zmierzonego przy niższym stężeniu (11). Należy wybrać wyższe stężenie, aby można było wykluczyć szkodliwe skutki (np. wybierając ok. 1 % najniższego znanego stężenia, przy którym obserwuje się przewlekłe zmiany ECx, przyjętego z badań przewlekłej toksyczności). Niższe badane stężenie powinno być znacznie wyższe niż granica wykrywalności w próbkach osadu i próbkach biologicznych z zastosowaniem metody analitycznej. Jeśli stężenie badanej substancji powodujące zmiany jest zbliżone do analitycznej granicy wykrywalności, zaleca się stosowanie badanej substancji oznakowanej izotopowo z wysokim poziomem promieniotwórczości właściwej.
Kontrpróby poddane działaniu substancji i kontrpróby kontrolne
49. Minimalna liczba kontrprób poddanych działaniu substancji na potrzeby pomiarów kinetycznych na etapach absorpcji i eliminacji powinna wynosić trzy na jeden punkt pobierania próbek (11). Należy wykorzystać dodatkowe kontrpróby, np. na potrzeby nieobowiązkowych dodatkowych dni pobierania próbek. W odniesieniu do etapu eliminacji przygotowuje się dopasowaną liczbę kontrprób z niewzbogaconym osadem i wodą nadosadową, aby pod koniec etapu absorpcji organizmy poddane działaniu substancji można było przenieść z oznaczonych naczyń z substancją do naczyń bez substancji. Całkowita liczba kontrprób poddanych działaniu substancji powinna być wystarczająca na potrzeby etapów absorpcji i eliminacji.
50. Ewentualnie organizmy wyznaczone do pobrania próbki podczas etapu eliminacji można poddać działaniu substancji w jednym dużym pojemniku, zawierającym wzbogacony osad z tej samej partii, którą wykorzystano do kinetyki absorpcji. Należy wykazać, że warunki badania (np. głębokość osadu, stosunek osad-woda, obciążenie, temperatura, jakość wody) są porównywalne z kontrpróbami wyznaczonymi do etapu absorpcji. Na zakończenie etapu absorpcji woda, osad i próbki organizmów należy pobrać z tego pojemnika do analizy, a wystarczającą liczbę dużych organizmów, które nie wykazują oznak niedawnej fragmentacji, należy ostrożnie wyjąć i przenieść do kontrprób przygotowanych do etapu eliminacji (np. po dziesięć organizmów na naczynie z kontrpróbą).
51. Jeżeli nie zastosowano żadnego innego rozpuszczalnika niż woda, należy zapewnić co najmniej 9 kontrprób ujemnej próby kontrolnej (co najmniej 3 pobrane na początku, 3 pobrane na końcu absorpcji i 3 pobrane na końcu eliminacji) w celu analizy biologicznej i analizy tła. Jeśli do zastosowania badanej substancji wykorzystano środek rozpuszczający, należy wykonać próbę kontrolną z rozpuszczalnikiem (co najmniej 3 kontrpróby należy pobrać na początku i 3 na końcu etapu absorpcji oraz 3 na końcu etapu eliminacji). W takim przypadku należy zapewnić także cztery kontrpróby ujemnej próby kontrolnej (bez rozpuszczalnika) na potrzeby pobierania próbek na koniec etapu absorpcji. Takie kontrpróby można porównać pod kątem parametrów biologicznych z próbą kontrolną z rozpuszczalnikiem w celu uzyskania informacji na temat ewentualnego wpływu rozpuszczalnika na organizmy użyte do badań. Szczegóły podano w dodatku 3.
Częstotliwość pomiarów jakości wody
52. Na etapach absorpcji i eliminacji należy wykonać pomiary co najmniej następujących parametrów jakości wody w warstwie wody nadosadowej:
Temperatura w jednym naczyniu na każdy poziom narażenia w dniach pobierania próbek i w jednym naczyniu kontrolnym raz na tydzień oraz na początku i na końcu okresu absorpcji i eliminacji; można również odnotować temperaturę otaczającego środowiska (powietrze atmosferyczne lub łaźnia wodna) lub w jednym reprezentatywnym naczyniu badawczym, np. w sposób ciągły lub co godzinę;
Zawartość rozpuszczonego tlenu w jednym naczyniu na każdy poziom narażenia i w jednym naczyniu kontrolnym w dniach pobrania próbek; wyrażona w mg/L i % ASV (wartości na- sycenia powietrzem);
Doprowadzenie powietrza kontrolowane co najmniej raz dziennie (w dni robocze) i w razie potrzeby korygowane; pH w jednym naczyniu na każdy poziom narażenia w dniach pobierania próbek i w jednym naczyniu kontrolnym raz na tydzień oraz na początku i na końcu okresu absorpcji i eliminacji;
Całkowita twardość wody co najmniej w jednym naczyniu poddanym narażeniu i w jednym naczyniu kontrolnym na początku i na końcu okresu absorpcji i eliminacji, wyrażona w mg/l CaCO3;
Całkowita zawartość amoniaku co najmniej w jednym naczyniu poddanym narażeniu i w jednym naczyniu kontrolnym na początku i na końcu okresu absorpcji i eliminacji, wyrażona w mg/l NH4+ lub NH3 lub jako amoniak całkowity.
Pobieranie próbek oraz analiza organizmów, osadu i wody
Harmonogram pobierania próbek
53. Przykłady harmonogramów pobierania próbek, dla etapu absorpcji trwającego 28 dni i etapu eliminacji trwającego 10 dni, przedstawiono w dodatku 3.
54. Pobrać próbki wody i osadu z komór badawczych w celu określenia stężenia badanej substancji przed dodaniem organizmów oraz na etapie absorpcji i etapie eliminacji. Podczas badania oznacza się stężenia substancji badanej w organizmach, osadzie i wodzie w celu monitorowania rozmieszczenia badanej substancji w przedziałach układu badawczego.
55. Próbki organizmów, osadu i wody należy pobrać co najmniej sześć razy na etapie absorpcji i eliminacji.
56. Kontynuować pobieranie próbek do momentu osiągnięcia stanu równowagi (stanu ustalonego) (zob. dodatek 1) lub przez 28 dni. Jeżeli stan równowagi nie zostanie osiągnięty przez 28 dni, należy rozpocząć etap eliminacji. Rozpoczynając etap eliminacji, przenieść oznaczone organizmy do stanowiących kontrpróby komór zawierających osad i wodę nie poddane działaniu substancji (zob. pkt 17 i 18).
Pobieranie i przygotowywanie próbek
57. Pobrać próbki wody, dekantując, syfonując lub pobierając pipetą objętość wystarczającą do zmierzenia ilości badanej substancji w próbce.
58. Pozostałą wodę nadosadową ostrożnie dekantuje się lub usuwa przez syfon z komory lub komór badawczych. Próbki osadu należy pobierać ostrożnie, tak aby w jak najmniejszym stopniu zakłócić spokój organizmów.
59. Wyjąć wszystkie organizmy z badanej kontrpróby w czasie pobierania próbek, np. zawieszając osad w warstwie wody nadosadowej i rozprowadzając zawartość każdej kontrpróby na płytkiej tacy i wybierając organizmy za pomocą delikatnych stalowych szczypczyków. Opłukać je szybko wodą na płytkiej szklanej lub stalowej tacy. Usunąć nadmiar wody. Następnie ostrożnie przenieść organizmy do zważonego uprzednio naczynia i zważyć je. Uśmiercić organizmy przez zamrożenie (np. w temperaturze ≤ - 18 °C). Należy zanotować obecność i liczbę kokonów lub młodych osobników.
60. Zasadniczo organizmy należy ważyć i uśmiercać natychmiast po pobraniu próbki z pominięciem etapu opróżniania przewodu pokarmowego w celu otrzymania konserwatywnego współczynnika bioakumulacji, który obejmuje zanieczyszczoną zawartość układu pokarmowego, i w celu uniknięcia strat pozostałości w ciele na etapie opróżniania przewodu pokarmowego w samej wodzie (8). Nie oczekuje się istotnego wyeliminowania substancji o wartości log Kow powyżej 5 na którymkolwiek etapie opróżniania przewodu pokarmowego w samej wodzie, chociaż substancje o wartości log Kow niższej niż 4 mogą być tracone w znacznych ilościach (47).
61. Na etapie eliminacji organizmy wypróżniają się do czystego osadu. Oznacza to, że pomiary wykonane bezpośrednio przed etapem eliminacji obejmują zanieczyszczoną zawartość układu pokarmowego, chociaż po pierwszych 4-24 h etapu eliminacji zakłada się, że większość zanieczyszczonej zawartości układu pokarmowego zostaje zastąpiona czystym osadem (11)(47). Stężenie w organizmach z tej próbki można wówczas uznać za stężenie w tkance po opróżnieniu układu pokarmowego. Aby uwzględnić rozcieńczenie stężenia badanej substancji przez niezanieczyszczony osad na etapie eliminacji, masę zawartości układu pokarmowego można oszacować na podstawie stosunku mokrej masy organizmu/masy popiołu z organizmu lub suchej masy organizmów/masy popiołu z organizmu.
62. Jeżeli celem szczegółowego badania jest zmierzenie biodostępności i faktycznej pozostałości w tkankach organizmów użytych do badania, wówczas należy pobrać podpróbkę organizmów wykorzystanych w badaniu (np. z trzech dodatkowych naczyń z kontrpróbami), najlepiej podczas stanu ustalonego, oraz zważyć je, oczyścić z zawartości układu pokarmowego w czystej wodzie przez okres 6 godzin (47) i ponownie zważyć przed analizą. Dane dotyczące masy organizmów i stężenia w ich ciele w przypadku tej podpróbki można następnie porównać z wartościami otrzymanymi z niewypróżnionych organizmów. Aby zminimalizować dodatkowy stres, na który narażone są zwierzęta, układy pokarmowe organizmów wyznaczonych do pomiaru eliminacji nie powinny być wypróżnione przed przeniesieniem do czystego osadu.
63. Najlepiej jest analizować wodę, osad i próbki organizmów bezpośrednio (tj. w ciągu 1-2 dni) po usunięciu, aby zapobiec rozkładowi lub innym stratom, a także w celu obliczenia przybliżonego tempa absorpcji i eliminacji w trakcie trwania badania. Bezpośrednia analiza pozwala również uniknąć opóźnień w określaniu momentu osiągnięcia stanu równowagi.
64. Jeżeli analizy nie wykona się bezpośrednio, próbki należy przechowywać we właściwych warunkach. Przed rozpoczęciem badania należy uzyskać informacje na temat stabilności i właściwych warunków przechowywania określonej substancji badanej (np. czasu i temperatury przechowywania, procedur ekstrakcji itd.). Jeżeli takie informacje nie są dostępne, a uznaje się je za niezbędne, można równolegle wykonać badanie wzbogaconych tkanek kontrolnych w celu ustalenia stabilności przechowywania.
Jakość metody analitycznej
65. Ze względu na to, że cała procedura uzależniona jest zasadniczo od dokładności, precyzji i czułości metody analitycznej wykorzystywanej w odniesieniu do badanej substancji, należy sprawdzić doświadczalnie, czy precyzja oraz powtarzalność analizy chemicznej, a także odzysk badanej substancji z wody, osadu i z organizmów są wystarczające w odniesieniu do danej metody. Należy także sprawdzić, czy badana substancja nie jest wykrywalna w komorach z próbami kontrolnymi w stężeniach wyższych niż tło. W razie konieczności należy skorygować wartości Cw, Cs i Ca w odniesieniu do odzysków i wartości tła prób kontrolnych. Przez cały czas trwania badania ze wszystkimi próbkami należy obchodzić się w taki sposób, by zminimalizować ich zanieczyszczenie i straty (np. wynikające z adsorpcji badanej substancji na przyrządzie do pobierania próbek).
66. Odzysk całkowity oraz odzysk badanej substancji w organizmach, osadzie, wodzie, a także, jeśli zastosowano, w pułapkach zawierających absorbenty umożliwiające zatrzymanie odparowującej badanej substancji, należy zanotować i zamieścić w sprawozdaniu.
67. W związku z tym, że zaleca się stosowanie substancji oznakowanej izotopowo, można przeprowadzić analizę całkowitej radioaktywności (np. substancji macierzystej i produktów degradacji). Jeżeli jednak jest to możliwe pod względem analitycznym, oznaczenie ilościowe substancji macierzystej i produktów degradacji w stanie ustalonym lub na końcu etapu absorpcji może dostarczyć ważnych informacji. Jeżeli zamierza się wykonać takie pomiary, próbki należy wówczas poddać właściwym procedurom ekstrakcji, aby można było oddzielnie przeprowadzić oznaczanie ilościowe substancji macierzystej. W przypadku gdy wykryty produkt degradacji stanowi znaczą procentową część (np. >10 %) radioaktywności mierzonej w organizmach użytych do badania w stanie ustalonym lub na koniec etapu absorpcji, zaleca się dokonanie identyfikacji takich produktów degradacji (5).
68. W związku z niską indywidualną biomasą często nie jest możliwe oznaczenie stężenia badanej substancji w każdym organizmie, chyba że jako gatunek badany wykorzystuje się Branchiura sowerbyi (40-50 mg mokrej masy na organizm) (11). Łączenie osobników pobranych z konkretnego naczynia badawczego jest dopuszczalne, ale ogranicza procedury statystyczne, które można zastosować do danych. Jeśli istotne jest zastosowanie konkretnej procedury statystycznej i mocy statystycznej, należy w badaniu zastosować odpowiednią liczbę zwierząt lub komór badawczych z kontrpróbami w celu pogodzenia pożądanego łączenia, procedury i mocy.
69. Zaleca się, by współczynnik bioakumulacji był wyrażony zarówno jako funkcja całkowitej mokrej masy, całkowitej suchej masy oraz, w razie konieczności (np. w przypadku wysoce lipofilnych substancji), jako funkcja zawartości lipidów i zawartości całkowitego węgla organicznego w osadzie. Do oznaczenia zawartości lipidów należy zastosować odpowiednie metody (48)(49). Jako standardową metodę (48) można zalecać metodę ekstrakcji chloroformem/metanolem (50). Aby jednak uniknąć stosowania rozpuszczalników chlorowanych, należy zastosować potwierdzoną w badaniu międzylaboratoryjnym metodę Bligha i Dyera (50) zgodnie z opisem w (51). Ponieważ różne metody nie dają identycznych wartości (48), ważne jest podanie szczegółów dotyczących wykorzystanej metody. Jeśli jest to możliwe, tj. jeśli jest dostępna wystarczająca ilość tkanki organizmów, pomiar zawartości lipidów należy przeprowadzić z użyciem tej samej próbki lub ekstraktu, których użyto do analizy badanej substancji, ponieważ lipidy często należy usuwać z ekstraktu przed jego analizą chromatograficzną (5). Praktyczne jest jednak wykorzystywanie zaaklimatyzowanych zwierząt z próby kontrolnej co najmniej na początku lub - najlepiej - na końcu etapu absorpcji do pomiaru zawartości lipidów, np. w trzech próbkach.
DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ
Opracowanie wyników
70. Krzywą absorpcji badanej substancji uzyskuje się, wykreślając w skali arytmetycznej jej stężenia w/na organizmach na etapie absorpcji w funkcji czasu. Jeżeli krzywa osiągnie stan równowagi, należy obliczyć BAFss dla stanu ustalonego:
71. Należy określić kinetyczny współczynnik bioakumulacji (BAFK) jako stosunek ks/ke. Stałą szybkości eliminacji (ke) określa się zazwyczaj na podstawie krzywej eliminacji (tj. wykresu stężenia badanej substancji w organizmach na etapie eliminacji). Stałą szybkości absorpcji ks oblicza się następnie na podstawie kinetyki krzywej absorpcji. Preferowaną metodą uzyskania BAFK oraz stałych szybkości, ks i ke, jest zastosowanie nieliniowych komputerowych metod estymacji parametrycznej (zob. dodatek 2). Jeśli w sposób ewidentny eliminacja nie jest procesem pierwszego rzędu, należy zastosować bardziej złożone modele (25)(27)(52).
72. Współczynnik bioakumulacji organizmy żywe-osad (BSAF) określa się przez normalizację BAFK dla zawartości lipidów w organizmach i zawartości całkowitego węgla organicznego w osadzie.
Interpretacja wyników
73. Wyniki powinny być interpretowane z rozwagą w przypadku, gdy mierzone badane stężenia występują na poziomach zbliżonych do granicy wykrywalności metody analitycznej.
74. Jasno określone krzywe absorpcji i eliminacji wskazują na dobrej jakości dane bioakumulacji. Ogólnie granice ufności dla wartości BAF uzyskanych w ramach dobrze zaprojektowanego podejścia badawczego nie powinny przekraczać 25 % (5).
Sprawozdanie z badania
75. Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje. Badana substancja
- cechy fizyczne i własności fizykochemiczne, np. log Kow" rozpuszczalność w wodzie;
- dane dotyczące tożsamości substancji chemicznej; źródło badanej substancji, nazwy i stężenie wszelkich zastosowanych rozpuszczalników;
- w przypadku zastosowania badanej substancji oznakowanej izotopowo, dokładne położenie oznakowanych atomów, promieniotwórczość właściwa oraz procent promieniotwórczości powiązany z zanieczyszczeniami.
Badane gatunki
- nazwa systematyczna, szczep, źródło, wszelkie przypadki wcześniejszych zabiegów, aklimatyzacja, wiek, rozmiar-zakres itp.
Warunki badania
- zastosowana procedura badawcza (np. statyczna, półstatyczna lub przepływowa);
- rodzaj i charakterystyka zastosowanego oświetlenia i fotoperiod(y);
- projekt badania (np. liczba i rozmiar komór badawczych, objętość wody, masa i objętość osadu, tempo wymiany objętości wody (w przypadku procedury przepływowej i półstatycznej), napowietrzanie zastosowane przed badaniem i podczas badania, liczba kontrprób, liczba organizmów w każdej kontrpróbie, liczba badanych stężeń, czas trwania etapów absorpcji i eliminacji, częstotliwość pobierania próbek);
- metoda przygotowania i zastosowania badanej substancji, a także uzasadnienie wyboru konkretnej metody;
- badane stężenia nominalne;
- źródło składników sztucznej wody lub osadu lub - w przypadku zastosowania naturalnego środowiska - pochodzenie wody i osadu, opis wszelkich wcześniejszych procesów, jakim została poddana, wyniki wykazania, że zwierzęta użyte do badań posiadają zdolność przeżycia i rozmnażania w zastosowanych środowiskach, charakterystyka osadu (pH, całkowita zawartość amoniaku w wodzie porowej, zawartość całkowitego węgla organicznego, rozkład wielkości cząstek (procent piasku, iłu i gliny), procentowa zawartość wody i wszelkie inne dokonane pomiary) oraz charakterystyka wody (pH, twardość, przewodność właściwa, temperatura, stężenie rozpuszczonego tlenu, poziomy chloru resztkowego (jeżeli zostały zmierzone) i wszelkie inne wykonane pomiary);
- nominalna i zmierzona sucha masa w % mokrej masy (lub stosunek suchej masy do mokrej masy) sztucznego osadu; zmierzona sucha masa w % mokrej masy (lub stosunek suchej masy do mokrej masy) w przypadku osadów pobranych w terenie;
- jakość wody wewnątrz komór badawczych scharakteryzowana przez temperaturę, pH, zawartość amoniaku, całkowitą twardość i stężenie rozpuszczonego tlenu;
- szczegółowe informacje na temat traktowania próbek wody, osadu i organizmów, w tym szczegółowe informacje na temat procedur przygotowania, przechowywania, wzbogacania, ekstrakcji oraz procedur analitycznych (i precyzji) zastosowanych w odniesieniu do badanej substancji oraz zawartości lipidów, a także odzysku badanej substancji.
Wyniki
- śmiertelność organizmów kontrolnych i organizmów w każdej komorze badawczej oraz wszelkie zaobserwowane skutki subletalne, w tym nietypowe zachowania (np. unikanie osadu, obecność lub brak obecności odchodów, brak rozmnażania się);
- zmierzona sucha masa w % mokrej masy (lub stosunek suchej masy do mokrej masy) osadu i organizmów użytych do badania (przydatne do normalizacji);
- zawartość lipidów w organizmach;
- krzywe pokazujące kinetykę absorpcji i eliminacji badanej substancji w organizmach, oraz okres konieczny do osiągnięcia stanu ustalonego;
- Ca, Cs i Cw (wraz z odchyleniem standardowym i zakresem, w stosownych przypadkach) dla wszystkich przypadków pobierania próbek (Ca wyrażone jako g na kg- 1 mokrej i suchej masy całego ciała, a Cs wyrażone jako g na kg- 1 mokrej i suchej masy osadu i Cw wyrażone w mg na l- 1). Jeśli wymagany jest współczynnik akumulacji organizmy żywe-osad (BASF; zob. definicja w dodatku 1) (np. na potrzeby porównania wyników z dwóch lub większej liczby badań przeprowadzonych z wykorzystaniem zwierząt o różnej zawartości lipidów), Ca można dodatkowo wyrazić w g na kg- 1 zawartości lipidów organizmu, a Cs należy wyrazić w g na kg- 1 węgla organicznego w osadzie;
- współczynnik bioakumulacji (BAF) (wyrażony w kg mokrego osaduna kg- 1 mokrych organizmów), stała tempa absorpcji osadu ks (wyrażona w g mokrego osadu na kg- 1 mokrych organizmów d- 1) oraz stała tempa eliminacji ke (wyrażona w d- 1); współczynnik BASF (wyrażony w kg zawartości węgla organicznego w osadzie na kg- 1 zawartości lipidów w organizmach) można dodatkowo przedstawić w sprawozdaniu;
- niewyeliminowane pozostałości na końcu etapu eliminacji;
- jeżeli zmierzono: procent macierzystej substancji, produktów degradacji oraz związanych substancji resztkowych (tj. procent badanej substancji, która nie może zostać poddana ekstrakcji za pomocą powszechnych metod ekstrakcji) wykryte w glebie i zwierzętach użytych do badania;
- metody statystyczne zastosowane do analizy danych. Ocena wyników
- zgodność wyników z kryteriami ważności wymienionymi w pkt 21;
- nieoczekiwane lub niestandardowe wyniki, np. niepełna eliminacja badanej substancji ze zwierząt użytych do badania; w takich przypadkach wyniki z dowolnych badań wstępnych mogą dostarczyć przydatnych informacji.
Dodatek 1
Definicje i jednostki
Sztuczny osad lub preparowany, odtworzony lub syntetyczny, stanowi mieszaninę materiałów używaną do naśladowania składników fizycznych naturalnego osadu.
Bioakumulacja to wzrost stężenia badanej substancji w organizmie lub na organizmie w stosunku do stężenia badanej substancji w otaczającym środowisku. Bioakumulacja wynika zarówno z procesu biokoncentracji, jak i z procesu biomagnifikacji (zob. poniżej).
Współczynnik bioakumulacji (BAF) w dowolnym momencie etapu absorpcji w trakcie opisanego tu badania bioakumulacji to stężenie badanej substancji w/na organizmie użytym do badania (Ca wyrażone w gna kg- 1 mokrej lub suchej masy organizmu) podzielone przez stężenie substancji w otaczającym środowisku (Cs wyrażone jako gna kg- 1 mokrej lub suchej masy osadu). Aby odnieść się do jednostek Ca i Cs, jednostką współczynnika bioakumulacji jest kg masy osadu na kg- 1 masy organizmu (15).
Współczynniki bioakumulacji obliczane bezpośrednio na podstawie stosunku stałej szybkości absorpcji osadu do stałych szybkości eliminacji (ks oraz ke, odpowiednio, zob. poniżej) nazywa się kinetycznym współczynnikiem bioakumulacji (BAFK).
Biokoncentracja to wzrost stężenia badanej substancji w lub na organizmie, wynikający wyłącznie z pobierania substancji przez powierzchnię ciała, w stosunku do stężenia badanej substancji w otaczającym środowisku.
Biomagnifikacja to wzrost stężenia badanej substancji w/na organizmie, wynikający głównie z pobierania zanieczyszczonego pokarmu lub żeru, w stosunku do stężenia badanej substancji w pokarmie lub żerze. Biomagnifikacja może prowadzić do przeniesienia lub akumulacji badanej substancji w ramach sieci pokarmowych.
Współczynnik akumulacji organizmy żywe-osad (BSAF) stanowi stężenie w stanie ustalonym badanej substancji o znormalizowanym poziomie lipidów w/na organizmie użytym do badania, podzielone przez stężenie w stanie ustalonym badanej substancji o znormalizowanym poziomie węgla organicznego w osadzie. Ca w takim przypadku wyraża się w gna kg- 1 zawartości lipidów w organizmie, a Cs w gna kg- 1 zawartości substancji organicznych w osadzie.
Okres kondycjonowania stosuje się w celu ustabilizowania komponentu mikrobiologicznego osadu i usunięcia np. amoniaku pochodzącego z komponentów osadu; ma miejsce przed wzbogaceniem osadu badaną substancją. Zwykle woda nadosadowa jest odrzucana po kondycjonowaniu.
Eliminacja badanej substancji to strata takiej substancji z tkanki organizmu użytego do badań w drodze czynnych lub biernych procesów, przy czym taka strata zachodzi niezależnie od obecności lub braku badanej substancji w otaczającym środowisku.
Etap eliminacji to okres następujący po przeniesieniu organizmów użytych do badania z zanieczyszczonego środowiska do środowiska niezawierającego badanej substancji, w którym bada się eliminację (lub stratę netto) substancji z badanych organizmów.
Stała szybkości eliminacji (ke) to wartość liczbowa określająca szybkość zmniejszania się stężenia badanej substancji w/na organizmie użytym do badania, po przeniesieniu organizmów użytych do badania ze środowiska zawierającego badaną substancję do środowiska niezawierającego substancji chemicznych; ke wyraża się w d- 1.
Etap ustalania stanu równowagi stosuje się w celu rozprowadzenia badanej substancji między fazę stałą, wodę porową i wodę nadosadową; ma miejsce po wzbogaceniu osadu badaną substancją i przed dodaniem organizmów użytych do badania.
Współczynnik podziału oktanol-woda (Kow) to stosunek rozpuszczalności substancji chemicznej w n-oktanolu i w wodzie w warunkach równowagi, określany czasami także jako współczynnik Pow. Logarytm Kow (log Kow) wykorzystuje się jako wskaźnik zdolności substancji chemicznej do bioakumulacji w organizmach wodnych.
Współczynnik podziału węgiel organiczny-woda (Koc) to stosunek stężenia substancji w/na frakcji węgla organicznego osadu i stężenia substancji chemicznej w wodzie w warunkach równowagi.
Warstwa wody nadosadowej to woda, którą zalano osad w naczyniu badawczym.
Stan równowagi lub stan ustalony określa się jako równowagę między procesem absorpcji a procesem eliminacji, które zachodzą równolegle podczas etapu narażenia. Stan ustalony zostaje osiągnięty na wykresie współczynnika bioakumulacji w każdym okresie pobierania próbek względem czasu w momencie, kiedy krzywa staje się równoległa do osi czasu, a trzy następujące po sobie analizy współczynnika bioakumulacji, wykonane na próbkach pobranych w odstępach co najmniej dwóch dni, różnią się od siebie nie więcej niż o 20 % i między trzema okresami pobierania próbek nie ma statystycznie istotnych różnic. W odniesieniu do badanych substancji, które wolno ulegają absorpcji, bardziej odpowiednie będą odstępy czasowe wynoszące siedem dni (5).
Woda porowa to woda wypełniająca przestrzeń między cząstkami osadu lub gleby.
Stała szybkości absorpcji osadu (ks) stanowi wartość liczbową określającą szybkość wzrostu stężenia badanej substancji w/na organizmie użytym do badania, wynikającego z etapu absorpcji substancji z osadu. ks wyraża się w g osadu na kg- 1 organizmu na d- 1.
Osad wzbogacony to osad, do którego dodano badaną substancję.
Współczynnik bioakumulacji w stanie ustalonym (BAFss) to współczynnik bioakumulacji w stanie ustalonym, który nie zmienia się w znaczący sposób przez długi okres czasu, a stężenie badanej substancji w otaczającym środowisku (Cs wyrażane w g na kg- 1 mokrej lub suchej masy osadu) jest w tym okresie stałe.
Etap absorpcji lub narażenia to okres, w którym organizmy użyte do badań poddaje się narażeniu na działanie badanej substancji.
Dodatek 2
Obliczanie parametrów absorpcji i eliminacji
Głównym punktem końcowym badania bioakumulacji jest współczynnik bioakumulacji. Zmierzony współczynnik bioakumulacji można obliczyć poprzez podzielenie stężenia w organizmie użytym do badań, Ca, przez stężenie badanej substancji w osadzie, Cs, w stanie ustalonym. Jeśli podczas etapu absorpcji nie osiągnięto stanu ustalonego, współczynnik bioakumulacji oblicza się w ten sam sposób na dzień 28. Należy jednak zwrócić uwagę, czy współczynnik bioakumulacji jest oparty na stężeniach w stanie ustalonym, czy też nie.
Kinetyczny współczynnik bioakumulacji (BAFK), stałą szybkości absorpcji osadu (ks) i stałą szybkości eliminacji (ke) uzyskuje się zazwyczaj, stosując komputerowe, nieliniowe metody estymacji parametrycznej. Mając szereg czasowy przeciętnych czynników akumulacji (Ca, średnie wartości na każdy dzień pobierania próbek/Cs, średnie wartości dla każdego dnia pobierania próbek = AF) dla etapu absorpcji na podstawie mokrej masy organizmów i osadu, oraz równanie modelowe
AF(t) = BAF × (1 - eke × t) [równanie 1]
w którym AF(t) to stosunek stężenia badanej substancji w organizmach i jej stężenia w osadzie w dowolnym punkcie czasowym (t) etapu absorpcji, wartości BAFK, ks i ke obliczane są za pomocą tych programów komputerowych.
W przypadku osiągnięcia stanu ustalonego podczas etapu absorpcji (tj. t = ∞ ) równanie 1 można zredukować do:
BAFK=
[równanie 2]
gdzie:
ks = stała szybkości absorpcji w tkance [g osadu na kg- 1 organizmu]
ke = stała szybkości eliminacji [d- 1]
Stężenie badanej substancji w tkance organizmu w stanie ustalonym (Ca,ss) oblicza się wtedy za pomocą ks/ke × Cs.
Współczynnik akumulacji organizmy żywe-osad można obliczyć w następujący sposób:
BSAF = BAFK
gdzie foc stanowi frakcję węgla organicznego w osadzie, a flip - frakcję lipidów w organizmie, przy czym wartości te należy określić na podstawie albo suchej masy, albo mokrej masy.
Mając czasowy szereg wartości stężenia można modelować kinetykę eliminacji, stosując następujące równania modelu i obliczenia komputerowe w oparciu o nieliniową metodę estymacji parametrycznej.
Średnia zmierzona ilość pozostałości w organizmie na końcu etapu absorpcji jest zalecana jako standardowy punkt początkowy. Wartości modelowane/oszacowane na podstawie etapu absorpcji należy wykorzystać, jeżeli np. zmierzona wartość znacznie odbiega od modelowanej wartości pozostałości w organizmie. Alternatywne wstępne narażenie organizmów wyznaczonych do eliminacji można znaleźć w pkt 50; w przypadku tego podejścia uważa się, że próbki tych wstępnie narażonych organizmów w dniu 0 etapu eliminacji dostarczają realistycznej ilości pozostałości w ciele, aby umożliwić rozpoczęcie kinetyki eliminacji.
Jeśli dane pomiarowe wykreślone w funkcji czasu wskazują na stały wykładniczy spadek stężenia badanej substancji w zwierzętach, do opisania przebiegu eliminacji w czasie można zastosować model jednoprzedziałowy (równanie 4).
[równanie 3]
Procesy eliminacji czasami okazują się dwufazowe, wykazując szybki spadek Ca na wczesnych etapach, który zmienia się w wolniejszą stratę badanych substancji na późniejszych etapach eliminacji (8)(19)(25)). Oba etapy można interpretować, zakładając, że w organizmie istnieją dwa różne przedziały, z których badana substancja jest eliminowana z różną szybkością. W takich przypadkach należy przeanalizować odnośną literaturę, np. (15)(16)(17) (25).
Eliminację z dwóch przedziałów opisuje np. następujące równanie (25):
[równanie 4]
A i B oznaczają wielkość przedziałów (w procentach całkowitych pozostałości w tkankach), przy czym A to przedział, w którym utrata substancji zachodzi szybko, zaś B to przedział, w którym utrata badanej substancji zachodzi powoli. Suma A i B wynosi 100 % całej objętości przedziału zwierzęcia w stanie ustalonym, ka i kb oznaczają odpowiadające im stałe eliminacji [d- 1]. Jeżeli model z dwoma przedziałami zostanie dopasowany do danych dotyczących oczyszczania, stałą szybkości absorpcji ks można wyznaczyć w następujący sposób (53)(54):
Niemniej jednak takie modelowe równania należy stosować z ostrożnością, zwłaszcza jeśli podczas badania zachodzą zmiany w biodostępności badanej substancji (42).
Zamiast przedstawionych powyżej modelowych równań można obliczyć parametry kinetyczne (ks i ke), stosując również model kinetyczny pierwszego rzędu do wszystkich danych z etapu absorpcji i eliminacji łącznie. Opis metody, która pozwala na takie połączone obliczanie stałych tempa absorpcji i eliminacji, można znaleźć w pozycjach bibliografii (55), (56) i (57).
Niewyeliminowane pozostałości należy obliczyć jako dodatkowy punkt końcowy, mnożąc stosunek średniego stężenia w organizmach (Ca) w 10. dniu etapu eliminacji i średniego stężenia w organizmach (Ca) w stanie ustalonym (28. dzień etapu absorpcji) przez 100:
Dodatek 3
Przykład harmonogramu pobierania próbek w 28-dniowym badaniu bioakumulacji
a) Etap absorpcji (obejmujący 4-dniowy etap ustalania stanu równowagi)
| Dzień | Czynności |
| - 6 | Przygotowanie zawiesiny torfu na osad; kondycjonowanie zawiesiny przez 48 h; |
| - 4 | wzbogacanie osadu lub części osadu; mieszanie wszystkich składników osadu; usunięcie próbek osadu poddanego działaniu substancji i osadu z próby kontrolnej rozpuszczalnika w celu oznaczenia stężenia badanej substancji; dodanie wody nadosadowej; inkubacja w warunkach badania (etap ustalania stanu równowagi); |
| - 3-2. | oddzielenie organizmów użytych do badania od hodowli w celu ich aklimatyzacji; |
| 0 | pomiar jakości wody (zob. pkt 52); usunięcie kontrprób w celu pobrania próbek wody i osadu na potrzeby ustalenia stężenia badanej substancji; losowe rozmieszczanie organizmów w komorach badawczych; zachowanie wystarczającej liczby podprób organizmów w celu oznaczenia analitycznych wartości tła; kontrola dopływu powietrza, jeżeli stosuje się zamknięty układ badawczy; |
| 1 | Usunięcie kontrpróby w celu pobrania próbek; kontrola dopływu powietrza, zachowań organizmów, jakości wody (zob. pkt 56); pobranie próbek wody, osadu i organizmów w celu oznaczenia stężenia badanej substancji; |
| 2 | kontrola dopływu powietrza, zachowań organizmów i temperatury; |
| 3 | jak w 1. dniu; |
| 4 - 6 | jak w 2. dniu; |
| 7 | jak w 1. dniu; w razie potrzeby uzupełnić odparowaną wodę; |
| 8 - 13 | jak w 2. dniu; |
| 14 | jak w 1. dniu; w razie potrzeby uzupełnić odparowaną wodę; |
| 15 - 20 | jak w 2. dniu; |
| 21 | jak w 1. dniu; w razie potrzeby uzupełnić odparowaną wodę; |
| 22 - 27 | jak w 2. dniu; |
| 28 | jak w 1. dniu; pomiar jakości wody (zob. pkt 52); koniec etapu absorpcji; zachowanie wystarczającej liczby podprób organizmów na potrzeby określenia analitycznych wartości dotyczących tła, mokrej i suchej masy oraz zawartości lipidów; przeniesienie organizmów z pozostałych kontrprób narażonych na działanie substancji do naczyń zawierających czysty osad w celu przeprowadzenia etapu eliminacji (bez opróżniania przewodu pokarmowego); pobranie próbek wody, osadu i organizmów z prób kontrolnych rozpuszczalnika; pobranie próbek roztworów do pułapek, jeżeli je zainstalowano. |
| Czynności wykonywane przed narażeniem (etap osiągania równowagi) należy zaplanować w czasie, uwzględniając właściwości badanej substancji. Jeżeli jest to wymagane, kondycjonowanie przygotowanego osadu poniżej wody nadosadowej w temperaturze 20 ± 2 °C przez 7 dni; w tym przypadku wcześniejsze przygotowanie osadu! | |
| Czynności opisane dla 2. dnia należy wykonywać codziennie (co najmniej w dni robocze). |
b) Etap eliminacji
| Dzień | Czynności |
| - 6 | Przygotowanie zawiesiny torfu na osad; kondycjonowanie zawiesiny przez 48 h; |
| - 4 | mieszanie wszystkich składników osadu; usunięcie próbek osadu poddanego działaniu substancji i osadu z próby kontrolnej rozpuszczalnika w celu oznaczenia stężenia badanej substancji; dodanie wody nadosadowej; inkubacja w warunkach badania; |
| 0 (28. dzień etapu absorpcji) | pomiar jakości wody (zob. pkt 52); należy przenieść organizmy z pozostałych kontrprób narażonych na działanie substancji do naczyń zawierających czysty osad; po 4-6 h usunięcie kontrprób w celu pobrania próbek wody, osadu i organizmów w celu ustalenia stężenia badanej substancji; losowe rozmieszczanie organizmów w komorach badawczych; |
| 1 | Usunięcie kontrpróby w celu pobrania próbek; kontrola dopływu powietrza, zachowań organizmów, jakości wody (zob. pkt 52); pobranie wody, osadu i próbek organizmów w celu oznaczenia stężenia badanej substancji; |
| 2 | kontrola dopływu powietrza, zachowań organizmów i temperatury; |
| 3 | jak w 1. dniu; |
| 4 | jak w 2. dniu; |
| 5 | jak w 1. dniu; |
| 6 | jak w 2. dniu; |
| 7 | jak w 1. dniu; w razie potrzeby uzupełnić odparowaną wodę; |
| 8 - 9 | jak w 2. dniu; |
| 10 | jak w 1. dniu; koniec etapu eliminacji; pomiar jakości wody (zob. pkt 52); pobranie próbek wody, osadu i organizmów z prób kontrolnych rozpuszczalnika; pobranie próbek roztworów do pułapek, jeżeli je zainstalowano. |
| Przygotowanie osadu przed rozpoczęciem etapu eliminacji należy przeprowadzać w taki sam sposób, w jaki miało to miejsce w przypadku etapu absorpcji. | |
| Czynności opisane dla 2. dnia należy wykonywać codziennie (co najmniej w dni robocze). |
Dodatek 4
Niektóre własności fizykochemiczne wody nadającej się do rozcieńczania
| SKŁADNIK | STĘŻENIA |
| Cząstki stałe | < 20 mg/l |
| Całkowity węgiel organiczny | < 2 µg/l |
| Niezjonizowany amoniak | < 1 µg/l |
| Chlor resztkowy | < 10 µg/l |
| Całkowita zawartość pestycydów fosforoorganicznych | < 50 ng/l |
| Pestycydy chloroorganiczne ogółem plus polichlorowane bifenyle | < 50 ng/l |
| Całkowity chlor organiczny | < 25 ng/l |
SKŁAD ZALECANEJ WODY REGENEROWANEJ
a) Roztwór chlorku wapnia
Rozpuścić 11,76 g CaCl2. 2H2O w wodzie dejonizowanej; dopełnić do 1 l wodą dejonizowaną.
b) Roztwór siarczanu magnezu
Rozpuścić 4,93 g MgSO4 7H2O w wodzie dejonizowanej; dopełnić do 1 l wodą dejonizowaną.
c) Roztwór wodorowęglanu sodu
Rozpuścić 2,59 g NaHCO3 w wodzie dejonizowanej; dopełnić do 1 l wodą dejonizowaną.
d) Roztwór chlorku potasu
Rozpuścić 0,23 g KCl w wodzie dejonizowanej; dopełnić do 1 l wodą dejonizowaną.
Wszystkie związki chemiczne muszą być przeznaczone do analiz.
Przewodność właściwa wody destylowanej lub dejonizowanej nie powinna przekraczać 10 µScm- 1.
Należy wymieszać 25 ml każdego z roztworów od a) do d) i dopełnić całkowitą objętość wodą dejonizowaną do 1 l. Suma jonów wapnia i magnezu w tym roztworze wynosi 2,5 mmol/l.
Stosunek jonów Ca:Mg wynosi 4:1, a jonów Na:K wynosi 10:1. Pojemność kwasowa KS4.3 w tym roztworze wynosi 0,8 mmol/l.
Wodę rozcieńczającą należy poddać napowietrzaniu do osiągnięcia nasycenia tlenem, a następnie przechowywać przez około dwa dni bez dalszego napowietrzania przed zastosowaniem.
pH wody nadającej się do rozcieńczania powinno mieścić się w zakresie 6-9.
Dodatek 5
Osad sztuczny - zalecenia dotyczące przygotowania i przechowywania
W przeciwieństwie do wymogów zawartych w metodzie badawczej C.8 (40) zaleca się, aby zawartość torfu w sztucznym osadzie wynosiła 2 % zamiast 10 % suchej masy, tak aby odpowiadała niskiej do średniej zawartości organicznych osadów naturalnych (58).
Procentowa zawartość suchych składników sztucznego osadu:
| Składnik | Właściwości | % suchego osadu |
| Torf | Torf sfagnowy, o "średnim" stopniu rozkładu, suszony na powietrzu, bez widocznych pozostałości roślin, drobno zmielony (wielkość cząstek ≤ 0,5 mm) | 2 ± 0,5 |
| Piasek kwarcowy Glinka kaolinowa | Wielkość ziaren: ≤ 2 mm, ale > 50 % cząstek powinna mieścić się w przedziale 50-200 μm | 76 |
| Zawartość kaolinitu ≥ 30 % | 22 ± 1 | |
| Źródło pokarmu | Folia urticae, sproszkowane liście Urtica sp. (pokrzywy zwyczajnej), drobno zmielone (wielkość cząstek ≤ 0,5 mm) lub mieszanina sproszkowanych liści Urtica sp. i alfa-celulozy (1:1); zgodna z farmaceutycznymi standardami dotyczącymi spożycia przez ludzi, jako dodatek do suchego osadu | 0,4 - 0,5 % |
| Węglan wapnia | Węglan wapnia CaCO3, sproszkowany, chemicznie czysty, jako dodatek do suchego osadu | 0,5 - 1 |
| Woda dejonizowana | Przewodność właściwa ≤ 10 µS/cm, jako dodatek do suchego osadu | 30 - 50 |
Jeżeli przewiduje się podwyższone stężenia amoniaku, np. jeżeli wiadomo, że badana substancja hamuje nitryfikację, użyteczne może być zastąpienie 50 % bogatego w azot sproszkowanej pokrzywy celulozą (np. chemicznie czystym proszkiem z celulozy, wielkość cząstek ≤ 0,5 mm).
Przygotowanie
Torf suszy się na powietrzu i mieli na drobny proszek (wielkość ziaren ≤ 0,5 mm, brak widocznych pozostałości roślin). Zawiesinę wymaganej ilości proszku torfowego przygotowuje się za pomocą wysokosprawnego urządzenia do homogenizacji, dodając porcję dejonizowanej wody do suchego osadu (objętość wody odpowiednia do przygotowania mieszalnego mułu torfowego wynosi 11,5 x suchej masy torfu (8)).
Wartość pH zawiesiny koryguje się do poziomu 5,5 ± 0,5 stosując CaCO3. W celu ustabilizowania pH i komponentu mikrobiologicznego zawiesinę kondycjonuje się przez co najmniej dwa dni w temperaturze 20 ± 2 °C, delikatnie ją mieszając. Wartość pH mierzy się ponownie i koryguje w miarę potrzeby za pomocą CaCO3 do poziomu 6,0 ± 0,5. Następnie całą zawiesinę miesza się z innymi suchymi składnikami, uwzględniając wszystkie części użyte do wzbogacenia. W celu uzyskania jednorodnego osadu dodaje się pozostałą dejonizowaną wodę. Ponownie mierzy się pH i koryguje w miarę potrzeby za pomocą CaCO3 do poziomu 6,5-7,5. Jeżeli jednak przewiduje się powstawanie amoniaku, przydatne może okazać się utrzymywanie pH w osadzie poniżej 7,0 (np. w zakresie 6,0-6,5). Próbki osadu pobiera się, aby określić suchą masę i zawartość węgla organicznego. Jeżeli przewiduje się powstawanie amoniaku, możliwe jest kondycjonowanie sztucznego osadu przez siedem dni w tych samych warunkach, jakie panować będą następnie podczas badania (np. stosunek osad-woda 1: 4, wysokość warstwy osadu jak w naczyniach badawczych) przed wzbogaceniem go badaną substancją, tj. należy uzupełnić go wodą, która powinna zostać napowietrzona. Na koniec okresu kondycjonowania należy usunąć i odrzucić wodę nadosadową. Próbki osadu pobiera się, aby określić suchą masę i zawartość całkowitego węgla organicznego (np. 3 próbki).
Następnie wzbogacony piasek kwarcowy miesza się z osadem na każdym poziomie zabiegu, osad rozdziela się do naczyń badawczych stanowiących kontrpróby i uzupełnia wodą do badania (np. wskaźnik osad-woda 1: 4, wysokość warstwy osadu jak w naczyniach badawczych). Naczynia są następnie inkubowane w takich samych warunkach, jakie panować będą następnie podczas badania. W tym momencie rozpoczyna się okres ustalania równowagi. Warstwa wody nadosadowej powinna być napowietrzona.
Wybrane źródło pokarmu należy dodać przed lub w trakcie wzbogacania osadu badaną substancją. Pokarm może zostać zmieszany z zawiesiną torfową (zob. powyżej). Można uniknąć nadmiernego rozkładu źródła pokarmu przed dodaniem organizmów użytych do badania, np. w przypadku długiego okresu ustalania równowagi, poprzez zastosowanie możliwie najkrótszego okresu między dodaniem pokarmu i rozpoczęciem narażenia. W celu zapewnienia wystarczającego kontaktu pokarmu z badaną substancją, źródło pożywienia należy wymieszać z osadem nie później niż w dniu wzbogacenia osadu badaną substancją. Jeżeli długość okresu ustalania równowagi prowadzi do nadmiernej degradacji mikrobiologicznej pokarmu przed dodaniem organizmów użytych do badania, dopuszcza się wyjątki. Próbki osadu pobiera się, aby określić suchą masę i zawartość całkowitego węgla organicznego (np. 3 próbki wzbogaconego lub kontrolnego osadu).
Suchą masę dodatków (torfu, piasku, kaolinu) należy zapisać w gramach i procentach całkowitej suchej masy.
Należy również zanotować w procentach całkowitej suchej masy objętość wody dodawanej do suchych składników podczas przygotowywania osadu (np. 100 % suchej masy + 46 % wody oznacza, że do 1 000 g suchej masy dodaje się łącznie 460 ml wody, w wyniku czego powstaje 1 460 g mokrego osadu).
Przechowywanie
Suche składniki sztucznego osadu mogą być przechowywane w suchym i chłodnym miejscu w temperaturze pokojowej. Przygotowany, mokry osad może być przechowywany (do późniejszego użytku tylko w hodowli) w temperaturze 4-2 °C bez dostępu światła przez 2-4 tygodni od dnia przygotowania (8).
Osad wzbogacony badaną substancją należy wykorzystać niezwłocznie, chyba że istnieją informacje wskazujące, że dany osad można przechowywać bez wpływu na toksyczność i biodostępność badanej substancji. Próbki wzbogaconego osadu można, do czasu ich analizy, przechowywać w warunkach zalecanych w odniesieniu do danej badanej substancji.
Dodatek 6
Gatunki skąposzczetów zalecane do badania bioakumulacji
Tubifex tubifex (MÜLLER), Tubificidae, Oligochaeta
Skąposzczety Tubificidae (Tubificidae, Oligochaeta) Tubifex tubifex (Müller) żyją w osadach wód słodkich w rurkach wypełnionych śluzem. W rurkach tych organizmy zawieszone są głową w dół, zjadając cząstki osadu, wykorzystując przebywające w nim mikroorganizmy i szczątki organiczne. Zazwyczaj tylna część unosi się w warstwie wody nadosadowej, umożliwiając oddychanie. Mimo że gatunek ten zamieszkuje wiele różnych rodzajów osadu na całej półkuli północnej, Tubifex tubifex woli osady o stosunkowo drobnym uziarnieniu (59). Przydatność tego gatunku do badań ekotoksykologicznych przedstawiona została na przykład w (8)(29)(31)(39)(60)(62)(63).
Metody hodowli
Aby zapewnić wystarczającą liczbę Tubifex tubifex do przeprowadzania badań bioakumulacji, konieczne jest prowadzenie stałych hodowli laboratoryjnych organizmów. W przypadku hodowli T. tubifex (8) zaleca się zastosowanie systemu składającego się ze sztucznego osadu na bazie sztucznej gleby zgodnie z metodą badawczą C.8 (40) oraz z wody regenerowanej zgodnie z metodą badawczą C.1.
Jako naczynia do hodowli wykorzystać można pojemniki wykonane ze szkła lub stali nierdzewnej o wysokości 12- 20 cm. Każdy pojemnik z hodowlą wypełnia się warstwą mokrego sztucznego osadu sporządzoną w sposób opisany w dodatku 5. Głębokość warstwy osadu powinna umożliwić organizmom zakopywanie się (głębokość minimum 2 cm w przypadku T. tubifex), co jest ich naturalnym zachowaniem. Do systemu dodaje się wodę regenerowaną. Należy dołożyć starań, by zminimalizować naruszenie osadu. Zbiornik z wodą delikatnie napowietrza się (np. 2 pęcherzyki powietrza na sekundę za pomocą powietrza filtrowanego 0,45 µm) przez pipetę Pasteura umieszczoną około 2 cm nad powierzchnią osadu. Zalecana temperatura hodowli wynosi 20 ± 2 °C.
Organizmy dodaje się do systemu hodowli do maksymalnego zagęszczenia 20 000 osobników na m2 powierzchni osadu. Większe zagęszczenie może spowodować zmniejszenie wzrostu i tempa rozmnażania (43).
W przypadku hodowli w sztucznym osadzie organizmy należy karmić. Dieta składająca się z drobno zmielonego pokarmu dla ryb np. TetraMin® może służyć jako dodatkowy pokarm (8); Klerks 1994, informacje własne. Porcje pokarmu powinny zapewniać wystarczający wzrost i rozmnażanie oraz powinny utrzymywać na minimalnym poziomie odkładanie się amoniaku i wzrost grzybów w hodowli. Pokarm można podawać dwa razy w tygodniu (np. 0,6-0,8 mg na cm2 powierzchni osadu). Praktyczne doświadczenie pokazało, że zastosowanie pokarmu w formie zawiesiny i poddanego homogenizacji w wodzie dejonizowanej może ułatwić jednorodne rozmieszczenie pożywienia na powierzchni osadu w pojemnikach z hodowlą.
Aby uniknąć odkładania się amoniaku, warstwę wody nadosadowej należy wymieniać, stosując układ przepływowy, lub manualnie, co najmniej raz w tygodniu. W kulturach wyjściowych osad należy wymieniać co trzy miesiące.
Pobieranie organizmów z hodowli można przeprowadzać, przesiewając osad kultury przez sito o wielkości oczek 1 mm, jeżeli potrzebne są tylko osobniki dorosłe. W celu oddzielenia pozostałych kokonów stosuje się sito o wielkości oczek 0,5 mm, a w przypadku młodych organizmów - sito o wielkości oczek 0,25 mm. Sita można umieścić w wodzie regenerowanej po przesianiu przez nie osadu. Organizmy opuszczają sito i mogą następnie być wyjmowane z wody za pomocą delikatnych stalowych pęset lub pipety z krawędziami nadtopionymi nad ogniem.
W celu rozpoczęcia badania lub założenia nowej hodowli stosuje się tylko nieuszkodzone i jednoznacznie zidentyfikowane osobniki Tubifex tubifex (np. (64)). Chore lub zranione organizmy, jak również kokony zakażone strzępkami grzybni, należy odrzucić.
Zsynchronizowana hodowla może stanowić źródło organizmów w określonym wieku i w odpowiednich odstępach czasu, kiedy zachodzi taka potrzeba. Nowe naczynia z hodowlą zakłada się w wybranych odstępach (np. co dwa tygodnie), rozpoczynając ze zwierzętami w określonym wieku (np. kokony). W opisanych w niniejszym dokumencie warunkach hodowli stosuje się dorosłe organizmy w wieku powyżej 8-10 tygodni. Z hodowli można zbierać osobniki, gdy organizmy złożą nowe kokony, np. po dziesięciu tygodniach. Pobrane dorosłe osobniki można wykorzystać w badaniach, a kokony można wykorzystać do zakładania nowych hodowli.
Lumbriculus variegatus (MÜLLER), Lumbriculidae, Oligochaeta
Lumbriculus variegatus (Lumbriculidae, Oligochaeta) również zamieszkują osady słodkich wód na całym świecie i są powszechnie wykorzystywana w badaniach ekotoksykologicznych. Informacje dotyczące biologii, warunków hodowli oraz wrażliwości gatunku przedstawione zostały w (1)(6)(9)(36). Lumbriculus variegatus mogą być również hodowane w sztucznym osadzie zalecanym dla T. tubifex zgodnie z (8) z pewnymi ograniczeniami. Ponieważ w przyrodzie L. variegatus wolą osad o grubszym uziarnieniu niż T. tubifex (59), hodowle laboratoryjne ze sztucznym osadem stosowanym w przypadku T. tubifex przestają istnieć po 4-6 miesiącach. Praktyczne doświadczenie pokazało, że L. variegatus mogą być utrzymywane w piaszczystym podłożu (np. piasek kwarcowy, drobny żwir) w układzie przepływowym, wykorzystując pokarm dla ryb jako źródło pokarmu, przez kilka lat bez odnawiania podłoża. Główną zaletę L. variegatus w stosunku do innych gatunków skąposzczetów wodnych stanowi ich szybkie rozmnażanie, prowadzące do szybkiego wzrostu biomasy populacji hodowanych w laboratoriach (1)(6)(9)(10).
Metody hodowli
Warunki hodowli w odniesieniu do Lumbriculus variegatus zostały szczegółowo przedstawione w Phipps i in. (1993) (10), Brunson i in. (1998) (28), ASTM (2000) (1), U.S. EPA (2000) (6). Poniżej przedstawione zostało krótkie streszczenie tych warunków.
Organizmy można hodować w dużych akwariach (57-80 l), w temperaturze 23 °C z fotoperiodem wynoszącym 16 godzin światła: 8 godzin ciemności (100-1 000 luksów) stosując codziennie odnawianą naturalną wodę (45-50 l na akwarium). Podłoże przygotowuje się poprzez pocięcie niebielonych brązowych papierowych ręczników na paski, które można następnie na kilka sekund wymieszać z wodą do hodowli, aby wytworzyć małe kawałki papierowego podłoża. Podłoże można następnie użyć bezpośrednio w akwariach do hodowli Lumbriculus, pokrywając dno zbiornika, lub przechowywać zamrożone w dejonizowanej wodzie do późniejszego wykorzystania. Nowe podłoże w zbiorniku zasadniczo zachowa trwałość przez około dwa miesiące.
Każdą hodowlę rozpoczyna się od 500-1 000 organizmów karmionych 10 ml zawiesiny zawierającej 6 g pokarmu dla młodych pstrągów 3 razy w tygodniu w warunkach wymiany lub przepływu. W przypadku hodowli statycznych lub pół-statycznych dostarczane porcje pokarmu powinny być mniejsze, aby zapobiec rozwojowi bakterii i grzybów. Podłoże składające się z pokarmu i papieru należy przeanalizować pod kątem substancji wykorzystywanych w badaniach bioakumulacji.
W tych warunkach liczba osobników w hodowli zasadniczo ulega podwojeniu w trakcie 10-14 dni.
Lumbriculus variegatus mogą zostać usunięte z hodowli do oddzielnej zlewki, np. przez przesianie podłoża za pomocą siatki o drobnych oczkach lub wyjęcie organizmów za pomocą szklanej pipety o szerokim wylocie (około 5 mm średnicy) z krawędzią nadtopioną nad ogniem. Jeżeli do zlewki zostało również przeniesione podłoże, zlewkę zawierającą organizmy i podłoże pozostawia się na noc w warunkach przepływu, dzięki czemu podłoże zostanie usunięte ze zlewki, natomiast organizmy pozostaną na dnie naczynia. Można je następnie wprowadzić do nowo przygotowanych zbiorników do hodowli lub poddać dalszej obróbce na potrzeby badania jak przedstawiono w (1) i (6). Należy zapobiegać zranieniom lub autotomii organizmów, np. stosując do ich przenoszenia pipety z krawędziami nadtopionymi nad ogniem lub narzędzia ze stali nierdzewnej.
Kwestią, do której należy podejść krytycznie w przypadku zastosowania L. variegatus w badaniach bioakumulacji osadu, jest ich sposób rozmnażania (architomia, po której następuje morfalaksja). Wynikiem takiego bezpłciowego rozmnażania są dwa fragmenty, które nie pobierają pokarmu przez pewien okres do momentu regeneracji części głowy lub ogona (np. (36)(37)). Oznacza to, że w przypadku L. variegatus pobieranie osadu i zanieczyszczenia z pożywieniem może nie odbywać się w sposób ciągły, jak w przypadku Tubificidae, które nie rozmnażają się przez fragmentację.
W związku z tym w celu zminimalizowania niekontrolowanego rozmnażania i odnawiania oraz późniejszej dużej zmienności w wynikach badań, należy dokonać synchronizacji. Zmienność taka może mieć miejsce w przypadku, gdy niektóre osobniki, które uległy fragmentacji i w związku z tym nie pobierają pokarmu przez pewien okres czasu, są w mniejszym stopniu narażone na działanie badanej substancji niż inne osobniki, które nie uległy fragmentacji podczas badania np. (38). Na 10-14 dni przed rozpoczęciem narażenia, organizmy należy sztucznie podzielić (synchronizacja) (65). Należy wykorzystać duże organizmy, które nie wykazują oznak niedawnego podziału. Organizmy te można umieścić na szklanym szkiełku w kropli wody do hodowli i rozciąć w okolicy środkowej części ciała za pomocą skalpela. Należy dopilnować, aby tylne końce były podobnej długości. Tylne końce należy następnie pozostawić w celu odtworzenia nowych głów w naczyniu do hodowli zawierającym to samo podłoże, co wykorzystane w hodowli, i wodę regenerowaną aż do momentu rozpoczęcia narażenia. Oznaką regeneracji nowych
głów jest zakopywanie się zsynchronizowanych organizmów w substracie (obecność zregenerowanych głów można potwierdzić, sprawdzając reprezentatywne podróbki pod dwuokularowym mikroskopem). Przewiduje się, że organizmy użyte do badań będą później w podobnym stanie fizjologicznym. Oznacza to, że jeśli podczas badania u zsynchronizowanych organizmów następuje regeneracja przez morfalaksję, praktycznie wszystkie zwierzęta będą w równym stopniu narażone na kontakt ze wzbogaconym osadem. Pierwsze karmienie zsynchronizowanych organizmów powinno zostać wykonane w momencie, gdy organizmy zaczną zakopywać się w podłożu lub 7 dni po rozcięciu. Schemat karmienia powinien wyglądać podobnie jak w przypadku zwykłych hodowli, ale zaleca się karmienie zsynchronizowanych organizmów tym samym pokarmem, które ma być wykorzystane w badaniu. Organizmy należy przechowywać w temperaturze badania wynoszącej 20 ± 2 °C. Po regeneracji w badaniu zastosować należy nienaruszone i kompletne organizmy podobnej wielkości, które pod wpływem delikatnych bodźców mechanicznych aktywnie pływają lub czołgają się. Należy zapobiegać zranieniom lub autotomii organizmów, np. stosując do ich przenoszenia pipety z krawędziami nadtopionymi nad ogniem lub narzędzia ze stali nierdzewnej.
W przypadku zastosowania w badaniu Lumbriculus variegatus, ze względu na specyficzny sposób rozmnażania się tego gatunku, powinien nastąpić wzrost liczby organizmów podczas badania, jeżeli warunki są sprzyjające (6). Brak rozmnażania w badaniu bioakumulacji z wykorzystaniem L. variegatus należy odnotować i uwzględnić podczas interpretacji wyników badania.
Branchiura sowerbyi (Beddard), Tubificidae, Oligochaeta (nie potwierdzone w badaniu międzylaborato-ryjnym)
Branchiura sowerbyi zamieszkują różne rodzaje osadów w zbiornikach, jeziorach, stawach i rzekach, pierwotnie w rejonach tropikalnych. Występują również w zbiornikach z ciepłą wodą półkuli północnej. Liczniej występują jednak w gliniasto-błotnych osadach o wysokiej zawartości związków organicznych. Ponadto organizmy te żyją w warstwie osadu. Nawet tylny koniec organizmów jest zazwyczaj zakopany. Gatunek ten łatwo jest zidentyfikować ze względu na listki skrzelowe znajdujące się w jego tylnej części. Osobniki dorosłe mogą osiągnąć długość 9-11 cm i mokrą masę wynoszącą 40-50 mg. Organizmy te cechują się wysokim wskaźnikiem rozrodczości, czas podwojenia populacji wynosi mniej niż 2 tygodnie w warunkach temperatury i karmienia opisanych poniżej (Aston i in., 1982, (65)). B. sowerbyi były stosowane zarówno w badaniach toksyczności, jak i bioakumulacji (odpowiednio Marchese i Brinkhurst 1996 (31), Roghair i in. 1996 (67)).
Metody hodowli
Streszczenie warunków hodowli gatunku Branchiura sowerbyi przedstawione zostało poniżej (przedłożone przez Mercedes R. Marchese, INALI, Argentyna i Carla J. Roghair, RIVM, Niderlandy).
Nie jest wymagane stosowanie jednej techniki hodowli organizmów użytych do badania. Organizmy można hodować w niezanieczyszczonym, naturalnym osadzie (31). Doświadczenie pokazuje, że pożywka składająca się z naturalnego osadu i piasku poprawia stan organizmów w porównaniu z czystym naturalnym osadem (32)(67). Do hodowli można użyć 3 zlewki w kształcie litery L, zawierające układ 1 500 ml osadu/wody, składający się z 375 ml naturalnego niezanieczyszczonego osadu (około 10 % całkowitego węgla organicznego; około 17 % cząsteczek ≤ 63 µm), 375 ml czystego piasku (M32) oraz 750 ml regenerowanej i odchlorowanej wody wodociągowej (31)(32) (67). Jako podłoże do hodowli można również wykorzystać papierowe ręczniki, ale wzrost populacji będzie niższy niż w przypadku naturalnego osadu. W układach pół-statycznych warstwę wody w zlewce powoli napowietrza się, a wodę nadosadową należy co tydzień wymieniać.
Na początku każda zlewka zawiera 25 młodych organizmów. Po dwóch miesiącach duże organizmy wyjmuje się z osadu za pomocą pęsety i umieszcza w nowej zlewce ze świeżo sporządzoną pożywką osadu/wody. Stara zlewka zawiera również kokony i młode organizmy. W ten sposób wyhodowanych może zostać do 400 młodych organizmów na zlewkę. Dorosłe osobniki mogą być wykorzystywane do celów reprodukcyjnych przez co najmniej rok.
Temperaturę hodowli należy utrzymywać w przedziale 21-25 °C. Temperatura nie powinna się zmieniać o więcej niż ± 2 °C. Czas konieczny do rozwoju embrionalnego od złożenia jaja do opuszczenia przez młodego osobnika kokonu wynosi w przybliżeniu trzy tygodnie w temperaturze 25 °C. Liczba jaj złożonych przez jednego osobnika gatunku B. sowerbyi mieści się w zakresie od 6,36 (31) do 11,2 (30) w mule w temperaturze 25 °C. Liczba jaj przypadających na kokon zawiera się w przedziale 1,8-2,8 (66)(69) lub do 8 (68).
Raz w tygodniu należy mierzyć stężenie rozpuszczonego tlenu, twardość wody, temperaturę i pH. Dwa lub trzy razy w tygodniu można dodać do osadu ad libitum pokarm dla ryb (np. TetraMin®). Organizmy można również karmić ad libitum rozmrożoną sałatą.
Główną zaletą tego gatunku jest wysoka indywidualna biomasa (do 40-50 mg mokrej masy na osobnika). W związku z tym gatunek ten może być wykorzystywany w badaniu bioakumulacji badanych substancji nieoznakowanych izotopowo. Może on zostać narażony w układach wykorzystywanych w przypadku T. tubifex lub L. variegatus z jednym osobnikiem na każdą kontrpróbę (11). Następnie należy jednak zwiększyć liczbę kontrprób, chyba że stosowane są większe komory badawcze (11). Należy również dostosować do tych gatunków kryterium ważności powiązane z zakopywaniem się.
BIBLIOGRAFIA
(1) ASTM International (2000). Standard guide for the determination of the bioaccumulation of sediment-associated contaminants by benthic invertebrates, E 1688-00a. W: ASTM International 2004 Annual Book of Standards. Tom 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; Pesticides. ASTM. International, West Conshohocken, PA.
(2) Komisja Europejska (WE) (2003). Wskazówki techniczne w sprawie oceny ryzyka uzupełniające dyrektywę Komisji 93/67/EWG w sprawie oceny ryzyka ze strony substancji notyfikowanych, rozporządzenie Komisji (WE) nr 1488/94 w sprawie oceny ryzyka stwarzanego przez istniejące substancje oraz dyrektywę 98/8/WE Parlamentu Europejskiego i Rady dotyczącą wprowadzania do obrotu produktów biobójczych; część I-IV. Urząd Publikacji Wspólnot Europejskich (Komisja Europejska), Luksemburg.
(3) OECD (1992a). Report of the OECD workshop on effects assessment of chemicals in sediment. Monografie OECD nr 60. Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD), Paryż.
(4) Ingersoll C.G., G.T. Ankley, D.A. Benoit, E.L. Brunson, G.A. Burton, F.J. Dwyer, R.A. Hoke, P. F. Landrum, T. J. Norberg-King i P.V. Winger. (1995). Toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants using freshwater invertebrates: A review of methods and applications. Environ. Toxicol. Chem. 14, 1885-1894.
(5) Rozdział C.13 niniejszego załącznika. Biokoncentracja: badanie ryb w warunkach przepływu.
(6) Stany Zjednoczone EPA (2000). Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates. Wyd. drugie. EPA 600/R-99/064, U.S. Environmental Protection Agency, Duluth, MN, marzec 2000.
(7) Rozdział C.27 niniejszego załącznika: Badanie toksyczności w układzie osad-woda na ochotkowatych z wykorzystaniem wzbogaconego osadu.
(8) Egeler, Ph., Römbke, J., Meller, M., Knacker, Th., Franke, C., Studinger, G. i Nagel, R. (1997). Bioaccumulation of lindane and hexachlorobenzene by tubificid sludgeworms (Oligochaeta) under standardised laboratory conditions. Chemosphere 35, 835-852.
(9) Ingersoll C.G., E.L. Brunson, N. Wang, F.J. Dwyer, G.T. Ankley, D.R. Mount, J. Huckins, J. Petty i P. F. Landrum (2003). Uptake and depuration of nonionic organic contaminants from sediment by the oligochaete, Lumbriculus variegatus. Environmental Toxicology and Chemistry 22: 872-885.
(10) Phipps, G.L., Ankley, G.T., Benoit, D.A. i Mattson, V.R. (1993). Use of the aquatic Oligochaete Lumbriculus variegatus for assessing the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants. Environ.Toxicol. Chem. 12, 269-279.
(11) Egeler Ph., J. Römbke, Th. Knacker, C. Franke i G. Studinger (1999). Warsztaty pt. "Bioaccumulation: Sediment test using benthic oligochaetes", 26-27.4.1999, Hochheim/Main, Niemcy. Sprawozdanie dotyczące projektu raportu na temat badań i rozwoju nr 298 67 419, Umweltbundesamt, Berlin.
(12) Egeler Ph., M. Meller, H.J. Schallnaß i D. Gilberg (2006). Validation of a sediment bioaccumulation test with endobenthic aquatic oligochaetes by an international ring test. Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Dessau), R&D No.: 202 67 437.
(13) Kelly, J.R., Levine, S.N., Buttel, L.A., Kelly, A.C., Rudnick, D.T. i Morton, R.D. (1990). Effects of tributyltin within a Thalassia seagrass ecosystem. Estuaries 13, 301-310.
(14) Nendza M. (1991). QSAR bioakumulacji: Validity assessment of log Kow/log BCF correlations. W: R. Nagel i R. Loskill (red.): Bioaccumulation in aquatic systems. Contributions to the assessment. Materiały z międzynarodowych warsztatów, Berlin 1990. VCH, Weinheim.
(15) Landrum P.F., H. Lee II i M.J. Lydy (1992). Toxicokinetics in aquatic systems: Model comparisons and use in hazard assessment. Environ. Toxicol. Chem. 11, 1709-1725.
(16) Markwell, R.D., Connell, D.W. i Gabric, A.J. (1989). Bioaccumulation of lipophilic compounds from sediments by oligochaetes. Wat. Res. 23, 1443-1450.
(17) Gabric, A.J., Connell, D.W. i Bell, P.R.F. (1990). A kinetic model for bioconcentration of lipophilic compounds by oligochaetes. Wat. Res. 24, 1225-1231.
(18) Kukkonen, J. i Landrum, P.F. (1994). Toxicokinetics and toxicity of sediment-associated Pyrene to Lumbriculus variegatus (Oligochaeta). Environ. Toxicol. Chem. 13, 1457-1468.
(19) Franke C., G. Studinger, G. Berger, S. Böhling, U. Bruckmann, D. Cohors-Fresenborg i U. Jöhncke (1994). The assessment of bioaccumulation. Chemosphere 29, 1501-1514.
(20) OECD (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures. Publikacje OECD na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, Seria dotycząca badań i oceny, nr 23.
(21) Stany Zjednoczone EPA (1996). Special Considerations for Conducting Aquatic Laboratory Studies. Ecological Effects Test Guidelines. OPPTS 850.1000. Public Draft. EPA 712-C-96-113. Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych.
(22) Następujące rozdziały niniejszego załącznika: Rozdział A.4, Prężność par
Rozdział A.5, Napięcie powierzchniowe
Rozdział A.6, Rozpuszczalność w wodzie
Rozdział A.8, Współczynnik podziału, metoda wytrząsania w kolbie
Rozdział A.24, Współczynnik podziału, wysokosprawna chromatografia cieczowa
Rozdział C.7, Degradacja - degradacja abiotyczna: hydroliza jako funkcja pH
Rozdział C.4 A-F, Oznaczanie szybkiej biodegradowalności
Rozdział C.19, Oszacowanie współczynnika adsorpcji (Koc) na glebie i w osadzie ściekowym przy zastosowaniu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)
Rozdział C.29, Szybka biodegradowalność CO2 w szczelnie zamkniętych naczyniach
(23) OECD (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Wytyczne na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, Seria dotycząca badań i oceny substancji chemicznych, nr 3, OECD, Paryż. OECD, Paryż.
(24) Antoine M.D., S. Dewanathan i G. Patonay (1991). Determination of critical micelles concentration of surfactants using a near-infrared hydrophobicity probe. Microchem. J. 43, 165-172.
(25) Beek B., S. Boehling, U. Bruckmann, C. Franke, U. Joehncke i G. Studinger (2000). The assessment of bioaccu-mulation. W: Hutzinger, O. (editor), The Handbook of Environmental Chemistry, Vol. 2 Part J (red. tomu: B. Beek): Bioaccumulation - New Aspects and Developments. Springer-Verlag Berlin Heidelberg: 235-276.
(26) Spacie A. i J.L. (1982). Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. Chem. 1, 309-320.
(27) Hawker, D.W. i Connell, D.W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcen-tration kinetics with fish. Wat. Res. 22, 701-707.
(28) Brunson, E.L., Canfield, T.J., Ingersoll, C.J. i Kemble, N.E. (1998). Assessing the bioaccumulation of contaminants from sediments of the Upper Mississippi river using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 35, 191-201.
(29) Reynoldson, T.B., Thompson, S.P. i Bamsey, J.L. (1991). A sediment bioassay using the tubificid oligochaete worm Tubifex tubifex. Environ. Toxicol. Chem. 10, 1061-1072.
(30) Aston R.J. i Milner, A.G.P. (1981). Conditions for the culture of Branchiura sowerbyi (Oligochaeta: Tubificidae) in activated sludge. Aquaculture 26, 155-160.
(31) Marchese M.R. i R.O. i Brinkhurst, R.O. (1996). A comparison of two tubificid species as candidates for sublethal bioassay tests relevant to subtropical and tropical regions. Hydrobiologia 334, 163-168.
(32) Roghair, C.J. i Buijze, A. (1994). Development of sediment toxicity tests. IV. A bioassay to determine the toxicity of field sediments to the oligochaete worm Branchiura sowerbyi. Sprawozdanie RIVM 719102027.
(33) Rozdział C.1 niniejszego załącznika, Ryby, badanie toksyczności ostrej.
(34) OECD (1992c). Wytyczne dotyczące badania substancji chemicznych nr 210. Badanie toksyczności na wczesnych etapach życia ryb. OECD, Paryż.
(35) Kaster J.L., J.V. Klump, J. Meyer, J. Krezoski i M.E. Smith (1984). Comparison of defecation rates of Limnodrilus hoffmeisteri using two different methods. Hydrobiologia 11, 181-184.
(36) Leppänen, M.T. i Kukkonen, J.V.K. Kukkonen 1998: Factors affecting feeding rate, reproduction and growth of an oligochaete Lumbriculus variegatus (Müller). Hydrobiologia 377: 183-194.
(37) Leppänen, M.T. i Kukkonen, J.V.K. Kukkonen 1998: Relationship between reproduction, sediment type and feeding activity of Lumbriculus variegatus (Müller): Implications for sediment toxicity testing. Environ. Toxicol. Chem., 17: 2196-2202.
(38) Leppänen M.T. i Kukkonen J.V.K. (1998). Relative importance of ingested sediment and porewater as bioaccu-mulation routes for pyrene to oligochaete (Lumbriculus variegatus, Müller). Environ. Sci. Toxicol. 32, 1503-1508.
(39) Martinez-Madrid, M., Rodriguez, P., Perez-Iglesias, J.I. i Navarro, E. (1999). Sediment toxicity bioassays for assessment of contaminated sites in the Nervion river (Northern Spain). 2. Tubifex tubifex (Müller) reproduction sediment bioassay. Ecotoxicology 8, 111-124.
(40) Rozdział C.8 niniejszego załącznika, Toksyczność dla dżdżownic.
(41) Environment Canada (1995). Guidance document on measurement of toxicity test precision using control sediments spiked with a reference toxicant. Environmental Protection Series Report EPS 1/RM/30.
(42) Landrum, P.F. (1989). Bioavailability and toxicokinetics of polycyclic aromatic hydrocarbons sorbed to sediments for the amphipod Pontoporeia hoyi. Environ. Sci. Toxicol. 23, 588-595.
(43) Poddubnaya, T.L. (1980). Life cycles of mass species of Tubificidae (Oligochaeta). W: R.O. Brinkhurst and D.G. Cook (red.): Aquatic Oligochaeta Biology, 175-184. Plenum Press, Nowy York.
(44) ASTM (1998). Standard guide for collection, storage, characterisation, and manipulation of sediment for toxico-logical testing. Amerykańskie Stowarzyszenie Badań i Materiałów, E 1391-94.
(45) Hooftman R.N., K. van de Guchte i C.J. Roghair (1993). (1993). Development of ecotoxicological test systems to assess contaminated sediments. Joint report no. 1: Acute and (sub)chronic tests with the model compound chlorpyrifos. RIVM-719102022.
(46) Franke C. (1996). How meaningful is the bioconcentration factor for risk assessment? Chemosphere 32, 1897-1905.
(47) Mount, D.R., Dawson, T.D. i Burkhard, L.P. (1999). Implications of gut purging for tissue residues determined in bioaccumulation testing of sediment with Lumbriculus variegatus. Environ. Toxicol. Chem. 18, 1244-1249.
(48) Randall, R.C., Lee II, H., Ozretich, R.J., Lake, J.L. i Pruell, R.J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Environ.Toxicol. Chem. 10, 1431-1436.
(49) Gardner, W.S., Frez, W.A., Cichocki, E.A. i Parrish, C.C. (1985). Micromethods for lipids in aquatic invertebrates. Limnology and Oceanography 30, 1 099-1 105.
(50) Bligh, E.G. i Dyer, W.J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917.
(51) De Boer J., F. Smedes, D. Wells i A. Allan (1999). Report on the QUASH interlaboratory study on the determination of total-lipid in fish and shellfish. Round 1 SBT-2. Exercise 1000. Unijny program norm, pomiarów i badań.
(52) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Instytut ds. Jakości Wód, Dania.
(53) Zok S., G. Görge, W. Kalsch, i R. Nagel (1991). Bioconcentration, metabolism and toxicity of substituted anilines in the zebrafish (Brachydanio rerio). Sci. Total Environment 109/110, 411-421
(54) Nagel, R. (1988). Umweltchemikalien und Fische - Beiträge zu einer Bewertung. Praca habilitacyjna, Uniwersytet Jana Gutenberga, Moguncja, Niemcy.
(55) Janssen, M.P.M., A Bruins, T.H. De Vries i Van Straalen, N.M. (1991). Comparison of cadmium kinetics in four soil arthropod species. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 20: 305-312.
(56) Van Brummelen T.C. i N.M. Van Straalen (1996). Uptake and elimination of benzo(a)pyrene in the terrestrial isopod Porcellio scaber. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 31: 277-285.
(57) Sterenborg, I., Vork, N.A., Verkade, S.K., Van Gestel, C.A.M. i Van Straalen, N.M. (2003). Dietary zinc reduces uptake but not metallothionein binding and elimination of cadmium in the springtail Orchesella cincta. Environ. Toxicol. Chemistry 22: 1167-1171.
(58) Suedel, B.C. and Rodgers, J.H. (1993). Development of formulated reference sediments for freshwater and estuarine sediment testing. Environ. Toxicol. Chem. 13, 1163-1175.
(59) Wachs B. (1967). Die Oligochaeten-Fauna der Fließgewässer unter besonderer Berücksichtigung der Beziehung zwischen der Tubificiden-Besiedlung und dem Substrat. Arch. Hydr. 63, 310-386.
(60) Oliver B. G. (1987). Biouptake of chlorinated hydrocarbons from laboratory-spiked and field sediments by oligochaete worms. Environ. Sci. Technol. 21, 785-790.
(61) Chapman P.M., M.A. Farrell i R.O. Brinkhurst (1982a). Relative tolerances of selected aquatic oligochaetes to individual pollutants and environmental factors. Aquatic Toxicology 2, 47-67.
(62) Chapman P.M., M.A. Farrell i R.O. Brinkhurst (1982b). Relative tolerances of selected aquatic oligochaetes to individual pollutants and environmental factors. Aquatic Toxicology 2, 69-78.
(63) Rodriguez, P. i Reynoldson, T.B. (1999). Laboratory methods and criteria for sediment bioassessment. W: A. Mudroch, J.M. Azcue & P. Mudroch (eds.): Manual of Bioassessment of aquatic sediment quality. Lewis Publishers, Boca Raton, CRC Press LLC.
(64) Brinkhurst, R.O. (1971). A guide for the identification of British aquatic oligochaeta. Freshw. Biol. Assoc., Sci. Publ. No. 22.
(65) Egeler Ph., M. Meller, H.J. Schallnaß i D. Gilberg (2005). Validation of a sediment toxicity test with the endobenthic aquatic oligochaete Lumbriculus variegatus by an international ring test. We współpracy z R. Nagel i B. Karaoglan. Report to the Federal Environmental Agency (Umweltbundesamt Berlin), R&D No.: 202 67 429.
(66) Aston, R.J., Sadler, K. i Milner, A.G.P. (1982). The effect of temperature on the culture of Branchiura sowerbyi (Oligochaeta: Tubificidae) on activated sludge. Aquaculture 29, 137-145.
(67) Roghair, C.J., Buijze, A., Huys, M.P.A., Wolters-Balk, M.A.H., Yedema, E.S.E. i Hermens, J.L.M. (1996). Toxicity and toxicokinetics for benthic organisms; II: QSAR for base-line toxicity to the midge Chironomus riparius and the tubificid oligochaete worm Branchiura sowerbyi. Sprawozdanie RIVM 719101026.
(68) Aston R.J. (1984). The culture of Branchiura sowerbyi (Tubificidae, Oligochaeta) using cellulose substrate. Aquaculture 40, 89-94.
(69) Bonacina C., A. Pasteris, G. Bonomi i D. Marzuoli (1994). Quantitative observations on the population ecology of Branchiura sowerbyi (Oligochaeta, Tubificidae). Hydrobiologia, 278, 267-274
- zmieniony przez art. 1 rozporządzenia nr 761/2009 z dnia 23 lipca 2009 r. (Dz.U.UE.L.09.220.1) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 27 sierpnia 2009 r.
- zmieniony przez art. 1 rozporządzenia nr 1152/2010 z dnia 8 grudnia 2010 r. (Dz.U.UE.L.10.324.13) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 12 grudnia 2010 r.
- zmieniony przez art. 1 rozporządzenia nr 640/2012 z dnia 6 lipca 2012 r. (Dz.U.UE.L.12.193.1) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 23 lipca 2012 r.
- zmieniony przez art. 1 rozporządzenia nr 260/2014 z dnia 24 stycznia 2014 r. (Dz.U.UE.L.2014.81.1) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 22 marca 2014 r.
- zmieniony przez art. 1 rozporządzenia nr 900/2014 z dnia 15 lipca 2014 r. (Dz.U.UE.L.2014.247.1) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 24 sierpnia 2014 r.
- zmieniony przez art. 1 rozporządzenia nr (UE) 2016/266 z dnia 7 grudnia 2015 r. (Dz.U.UE.L.2016.54.1) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 4 marca 2016 r.
- zmieniony przez art. 1 rozporządzenia nr (UE) 2017/735 z dnia 14 lutego 2017 r. (Dz.U.UE.L.2017.112.1) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 18 maja 2017 r. Zmiany nie zostały naniesione na tekst.
- zmieniony przez art. 1 rozporządzenia nr 1390/2019 z dnia 31 lipca 2019 r. (Dz.U.UE.L.2019.247.1) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 16 października 2019 r. Zmiany nie zostały naniesione na tekst.
- zmieniony przez art. 1 rozporządzenia nr 2023/464 z dnia 3 marca 2023 r. (Dz.U.UE.L.2023.68.37) zmieniającego nin. rozporządzenie z dniem 26 marca 2023 r.
- Zaleca się stosowanie powlekanych sept gazoszczelnych, a w przypadku lotnych substancji chemicznych istnieje obowiązek stosowania takich sept (niektóre dostępne w handlu septy są stosunkowo cienkie, ich grubość wynosi mniej niż 0,5 cm i nie zachowują gazoszczelności po przekłuciu igłą strzykawki);
- zaleca się stosowanie butylowych sept kauczukowych (około 1 cm), w przypadku gdy substancje badane nie są substancjami lotnymi (septy te zachowują zwykle gazoszczelność po przekłuciu);
- przed przetestowaniem zaleca się dokładne zbadanie sept pod kątem ich gazoszczelności po przekłuciu.
- 50 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 % koktajl inhibitorów proteaz (Sigma): 12 ml Tris-HCl pH 7,4 + 120 µl koktajlu inhibitorów proteaz.
- TRIS: TRIS-ULTRA PURE (ICN), np. firmy Bie & Berntsen, Dania.
- Koktajl inhibitorów proteaz: firmy Sigma (w przypadku tkanki ssaków), numer produktu P 8340.
- Uwaga: Roztwór buforowy do homogenizacji należy wykorzystać w tym samym dniu, w którym został wyprodukowany. Podczas stosowania należy umieścić go w lodzie.
gdzie:
M = ilość zastosowana na kolumnę [µg]
A = zastosowana dawka [kg ha- 1]
d = średnica kolumny glebowej [cm]
π = 3,14
dla gleby piaszczystej 1,66 gml-1
dla gleby piaszczysto-gliniastej 1,58 gml-1
dla gleby gliniastej 1,17 gml-1
dla gleby ilastej 1,11g ml-1